CN113881681A - Ccr8基因人源化非人动物及其构建方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种CCR8基因人源化的非人动物的构建方法、一种人源化CCR8蛋白、一种人源化CCR8基因、一种CCR8基因的靶向载体和其在生物医药领域的应用，利用同源重组的方式将编码人CCR8蛋白的核苷酸序列导入非人动物基因组中，该动物体内能正常表达人或人源化CCR8蛋白，可以作为人CCR8信号机理研究、炎症、肿瘤或自身免疫性疾病药物筛选的动物模型，对免疫靶点的新药研发具有重要的应用价值。

Description

CCR8基因人源化非人动物及其构建方法和应用

技术领域

本发明属于动物基因工程和基因遗传修饰领域，具体地说，涉及一种CCR8基因人源化的非人动物及其构建方法和在生物医药领域的应用。

背景技术

CCR8是一种CC类趋化因子受体，属于G蛋白偶联受体。该基因主要表达在淋巴器官的免疫细胞中，具体表达在Treg细胞、TH2细胞、单核细胞和NK细胞中。初期研究表明趋化因子CCL1为CCR8的唯一配体(CCR8也为CCL1的唯一受体)，但是后来也有报道人源CCL18(对应小鼠功能上的同源基因CCL8)也是CCR8的配体之一。

CCR8主要表达在Treg细胞中，对Treg细胞介导的免疫抑制功能具有重要作用。研究表明乳腺癌、结肠癌和肺癌等病人组织中的tumor-resident Treg细胞中的CCR8要比正常组织Treg细胞中的CCR8呈显著的增加表达以及在外周血Treg中可以忽略的表达，重要的是CCR8在肿瘤中的效应免疫细胞中都没有检测到表达，包括αβT细胞、NK细胞和γδT细胞以及髓样细胞，只是NKT细胞有降低50％的表达；同时tumor-resident Treg细胞中的CCR8的表达量与临床表现也具有很紧密的关联，表现在不因乳腺癌的亚型而变化，以及CCR8和Foxp3同时高表达的病人会出现disease free和overall survival的明显下降，这表明可能用抗体靶向CCR8蛋白可以有效的选择性耗尽tumor-resident Treg细胞，从而使免疫细胞更容易攻击肿瘤细胞，达到治疗肿瘤的效果。此外，CCR8还选择性地表达在TH2细胞、单核细胞和NK细胞中，主要通过诱导炎症细胞迁移，参与各种炎症性疾病。

鉴于CCR8可能在肿瘤疾病治疗中起着重要作用，为进一步的研究相关的生物学特性，提高临床前期的药效试验的有效性，提高研发成功率，使临床前期的试验更有效并使研发失败最小化，本领域亟需开发涉及CCR8信号通路的非人动物模型。

发明内容

本发明的第一方面，提供了一种CCR8基因人源化的非人动物，所述的非人动物体内表达人或人源化CCR8蛋白。

优选的，所述的非人动物的内源CCR8蛋白表达降低或缺失。

优选的，所述的人源化CCR8蛋白包含人CCR8蛋白的全部或部分。

优选的，所述的人源化CCR8蛋白包含人CCR8蛋白的跨膜区、胞质区和/或胞外区的全部或部分。

进一步优选的，所述的人源化CCR8蛋白包含人CCR8蛋白的跨膜区、胞质区和/或胞外区的全部。

优选的，所述的人源化CCR8蛋白包含跨膜区、胞质区和胞外区，其中，所述的人源化CCR8蛋白包含与SEQ ID NO:2具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或至少99％同一性的氨基酸序列或者包含SEQ ID NO:2所示氨基酸序列。

优选的，所述的人源化CCR8蛋白包含人CCR8基因的1号至2号外显子编码的氨基酸序列的全部或部分,进一步优选的，所述的人源化CCR8蛋白包含人CCR8基因的2号外显子编码的氨基酸序列的全部或部分；更优选的，包含从人CCR8基因的起始密码子至终止密码子编码的氨基酸序列。

优选的，所述的人源化CCR8蛋白至少包含SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:10编码的氨基酸序列，或包含与SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:10编码的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％同一性的氨基酸序列。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化CCR8蛋白中包含的人CCR8蛋白的部分氨基酸序列包含下列组中的一种：

A)包含SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的全部或部分；

B)包含SEQ ID NO:2所示氨基酸序列同一性至少为70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的氨基酸序列；

C)包含SEQ ID NO:2所示所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸的氨基酸序列；或

D)包含SEQ ID NO:2所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。

优选的，所述的非人动物体内包含人CCR8基因的部分或人源化CCR8基因。

优选的，所述的非人动物体内包含编码人CCR8蛋白的全部或部分核苷酸序列；进一步优选的，包含编码人CCR8蛋白的跨膜区、胞质区和/或胞外区的全部或部分核苷酸序列；进一步优选的，包含与编码SEQ ID NO:2的核苷酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或至少99％同一性的核苷酸序列或者包含编码SEQ ID NO:2的核苷酸序列。

优选的，所述的非人动物体内包含人CCR8基因的1号外显子至2号外显子的全部或部分，进一步优选的，包含人CCR8基因的2号外显子的全部或部分，其中，所述人CCR8基因的2号外显子的部分至少包含从起始密码子至终止密码子。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化CCR8基因中至少还包含SEQ IDNO:6、7、8、9所示核苷酸序列，或包含与SEQ ID NO:6、7、8、9具有至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％同一性的核苷酸序列。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的非人动物体内包含的人CCR8基因的部分选自下列组中的一种：

(A)包含SEQ ID NO:5所示核苷酸序列的全部或部分；

(B)包含与SEQ ID NO:5所示核苷酸序列的同一性至少为70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的核苷酸序列；

(C)包含与SEQ ID NO:5所示核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸的核苷酸序列；或，

(D)具有SEQ ID NO:5所示核苷酸序列的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化CCR8基因还包括非人动物CCR8基因的1号外显子的全部和/或2号外显子的部分。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化CCR8基因转录的mRNA选自下列组中的一种：

(a)包含SEQ ID NO:10所示核苷酸序列的全部或部分；

(b)包含与SEQ ID NO:10所示核苷酸序列的同一性至少为70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的核苷酸序列；

(c)包含与SEQ ID NO:10所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸的核苷酸序列；或，

(d)包含SEQ ID NO:10所示的核苷酸序列，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。

优选的，所述的人源化CCR8基因还包括特异性诱导物或阻遏物，进一步优选的，所述的特异性诱导物或阻遏物可以为常规可以诱导或阻遏的物质。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的特异性诱导物选自四环素系统(Tet-OffSystem/Tet-On System)或他莫昔芬系统(Tamoxifen System)。

优选的，所述的人CCR8基因的部分或人源化CCR8基因的核苷酸序列可操作的连接至内源调控元件后。

优选的，所述的非人动物基因组中还包含其他基因修饰，进一步优选的，所述的其他基因包含PD-1、PD-L1、CTLA4、B7H3、B7H4、CD47、IL2、IL23A和CCR2基因中的至少一种。

优选的，所述的非人动物可以选自啮齿类动物、猪、兔子、猴子等任何可以进行基因编辑制备基因人源化的非人动物。

优选的，所述的非人动物为非人哺乳动物，进一步优选的，所述的非人哺乳动物为啮齿类动物，更进一步优选的，所述的啮齿类动物为大鼠或小鼠。

优选的，所述的非人动物是免疫缺陷的非人哺乳动物，进一步优选的，所述的免疫缺陷的非人哺乳动物为免疫缺陷的啮齿类动物、免疫缺陷的猪、免疫缺陷的兔子或免疫缺陷的猴子，更优选的，所述的免疫缺陷的啮齿类动物为免疫缺陷的小鼠或大鼠，更进一步优选的，所述免疫缺陷鼠是NOD-Prkdc^scid IL-2rγ^null小鼠、NOD-Rag 1^-/--IL2rg^-/-(NRG)小鼠、Rag 2^-/--IL2rg^-/-(RG)小鼠、NOD/SCID小鼠或者裸鼠。

本发明的第二方面，提供了一种CCR8基因人源化的非人动物的构建方法，所述的非人动物体内表达人或人源化CCR8蛋白。

优选的，所述的非人动物为上述的CCR8基因人源化的非人动物。

优选的，所述的非人动物的内源CCR8蛋白表达降低或缺失。

优选的，所述的人源化CCR8蛋白包含人CCR8蛋白的全部或部分。

优选的，所述的人源化CCR8蛋白包含人CCR8蛋白的跨膜区、胞质区和/或胞外区的全部或部分。

进一步优选的，所述的人源化CCR8蛋白包含人CCR8蛋白的跨膜区、胞质区和/或胞外区的全部。

优选的，所述的人源化CCR8蛋白包含跨膜区、胞质区和胞外区，其中，所述的人源化CCR8蛋白包含与SEQ ID NO:2具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或至少99％同一性的氨基酸序列或者包含SEQ ID NO:2所示氨基酸序列。

优选的，所述的人源化CCR8蛋白包含人CCR8基因的1号至2号外显子编码的氨基酸序列的全部或部分，进一步优选的，所述的人源化CCR8蛋白包含人CCR8基因的2号外显子编码的氨基酸序列的全部或部分；更优选的，包含从人CCR8基因的起始密码子至终止密码子编码的氨基酸序列的全部或部分。

优选的，所述的人源化CCR8蛋白至少包含SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:10编码的氨基酸序列，或包含与SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:10具有至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％同一性的核苷酸编码的氨基酸序列。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化CCR8蛋白中包含的人CCR8蛋白的部分氨基酸序列包含下列组中的一种：

A)包含SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的全部或部分；

B)包含SEQ ID NO:2所示氨基酸序列同一性至少为70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的氨基酸序列；

C)包含SEQ ID NO:2所示所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸的氨基酸序列；或

D)包含SEQ ID NO:2所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。

优选的，所述的非人动物体内包含人或人源化CCR8基因。

优选的，所述的非人动物体内包含编码人CCR8蛋白的全部或部分核苷酸序列；进一步优选的，包含编码人CCR8蛋白的跨膜区、胞质区和/或胞外区的全部或部分核苷酸序列；进一步优选的，包含与编码SEQ ID NO:2的核苷酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或至少99％同一性的核苷酸序列或者包含编码SEQ ID NO:2的核苷酸序列。

优选的，所述的非人动物体内包含人CCR8基因的1号外显子至2号外显子的全部或部分，进一步优选的，包含人CCR8基因的2号外显子的全部或部分，其中，2号外显子的部分至少包含200bp的核苷酸序列，例如至少包含200、300、500、700、900、1000、1050、1060、1065、1066、1067、1068、1069、1070、1100、1200、1300、1350、1363bp的核苷酸序列；2号外显子的部分至少包含从起始密码子至终止密码子。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化CCR8基因中至少还包含SEQ IDNO:6、7、8、9所示核苷酸序列，或包含与SEQ ID NO:6、7、8、9具有至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％同一性的核苷酸序列。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的非人动物体内包含的人CCR8基因的部分选自下列组中的一种：

(A)包含SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6和/或SEQ ID NO:7所示核苷酸序列的全部或部分；

(B)包含与SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6和/或SEQ ID NO:7所示核苷酸序列的同一性至少为70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的核苷酸序列；

(C)包含与SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6和/或SEQ ID NO:7所示核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸的核苷酸序列；或，

(D)具有SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6和/或SEQ ID NO:7所示核苷酸序列的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化CCR8基因还包括非人动物CCR8基因的1号外显子的全部和/或2号外显子的部分。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化CCR8基因转录的mRNA选自下列组中的一种：

(a)包含SEQ ID NO:10所示核苷酸序列的全部或部分；

(b)包含与SEQ ID NO:10所示核苷酸序列的同一性至少为70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的核苷酸序列；

(c)包含与SEQ ID NO:10所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸的核苷酸序列；或，

(d)包含SEQ ID NO:10所示的核苷酸序列，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。

优选的，所述的人CCR8基因的部分或人源化CCR8基因的核苷酸序列可操作的连接至内源调控元件后。

优选的，所述的人源化CCR8基因在非人动物体内通过内源或外源调控元件进行调控。进一步优选的，所述的调控元件为启动子。

优选的，所述的构建方法包括用包含人CCR8基因的部分导入非人动物CCR8基因座；进一步优选的，用包含人CCR8基因的1号至2号外显子的全部或部分导入非人动物CCR8基因座，更优选的，用包含人CCR8基因的2号外显子的全部或部分导入非人动物CCR8基因座，更进一步优选的，用包含人CCR8基因的2号外显子的部分导入非人动物CCR8基因座；其中，2号外显子的部分至少包含200bp的核苷酸序列，例如至少包含200、300、500、700、900、1000、1050、1060、1065、1066、1067、1068、1069、1070、1100、1200、1300、1350、1363bp的核苷酸序列；2号外显子的部分至少包含从起始密码子至终止密码子，优选的，用包含SEQ IDNO:5或SEQ ID NO:10的核苷酸序列导入非人动物基因座。

优选的，本申请中所述的导入包括但不限于插入、替换或转基因。

优选的，所述的导入为替换或插入，具体地，所述的导入非人动物CCR8基因座为替换非人动物相应区域，优选为替换非人动物CCR8基因的1号至2号外显子的全部或部分；进一步优选为替换非人动物CCR8基因的2号外显子的全部或部分，其中，所述非人动物CCR8基因的2号外显子的部分至少包含从非人动物CCR8基因的起始密码子至终止密码子。

优选的，所述的构建方法包括用包含编码人CCR8蛋白的全部或部分核苷酸序列导入非人动物CCR8基因座，进一步优选的，包括用包含编码人CCR8蛋白的信号肽、跨膜区、胞质区和/或胞外区的全部或部分核苷酸序列导入非人动物CCR8基因座，更优选的，用包含与编码SEQ ID NO:2的核苷酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或至少99％同一性的核苷酸序列或者包含编码SEQ ID NO:2的核苷酸序列导入非人动物CCR8基因座。

优选的，所述的构建方法包括用包含所述人或人源化CCR8基因的核苷酸序列导入非人动物CCR8基因座。

优选的，所述人或人源化CCR8基因的核苷酸序列可操作地连接到至少一条染色体中内源性CCR8基因座处的内源调控元件。

优选的，所述的插入或替换位点为CCR8基因的内源调控元件之后。

优选的，所述的插入为首先破坏非人动物内源CCR8基因的编码框，随后进行插入操作，或者所述的插入步骤既可给内源CCR8基因造成移码突变又可以实现插入人源序列的步骤。

优选的，所述的人源化CCR8基因和/或所述其他基因对于被替换的内源基因座是纯合或者杂合的。

优选的，所述非人动物的基因组中至少一个染色体上包含人源化CCR8基因。

优选的，所述的非人动物中至少一个细胞表达人CCR8蛋白或人源化CCR8蛋白。

优选的，使用基因编辑技术进行非人动物的构建，所述的基因编辑技术包括利用胚胎干细胞的基因打靶技术、CRISPR/Cas9技术、锌指核酸酶技术、转录激活子样效应因子核酸酶技术、归巢核酸内切酶或其他分子生物学技术。

优选的，使用靶向载体进行非人动物的构建。

优选的，所述的靶向载体包含人CCR8基因的部分；进一步优选的，所述的人CCR8基因的部分包含人CCR8基因的1号至2号外显子的全部或部分；更优选的，所述的人CCR8基因的部分包含人CCR8基因的2号外显子的全部或部分，其中，2号外显子的部分至少包含200bp的核苷酸序列，例如至少包含200、300、500、700、900、1000、1050、1060、1065、1066、1067、1068、1069、1070、1100、1200、1300、1350、1363bp的核苷酸序列；所述人CCR8基因的2号外显子的部分至少包含从起始密码子至终止密码子，更进一步优选的，所述的靶向载体包含SEQID NO:5所示核苷酸序列。

优选的，所述的靶向载体还包含与待改变的转换区5’端同源的DNA片段，即5’臂，其选自非人动物CCR8基因基因组DNA的100-10000个长度的核苷酸；优选的，所述的5’臂与NCBI登录号为NC_000075.6至少具有90％同源性的核苷酸；进一步优选的，所述5’臂序列与SEQ ID NO:3至少具有90％同源性，或者如SEQ ID NO:3所示。

优选的，所述的靶向载体还包含与待改变的转换区3’端同源的DNA片段，即3’臂，其选自非人动物CCR8基因基因组DNA的100-10000个长度的核苷酸；优选的，所述的3’臂与NCBI登录号为NC_000075.6至少具有90％同源性的核苷酸；进一步优选的，所述的3’臂序列与SEQ ID NO:4至少具有90％同源性，或者如SEQ ID NO:4所示。

更优选的，所述靶向载体还包含SEQ ID NO:6、7、8、9所示核苷酸序列，或包含与SEQ ID NO:6、7、8、9具有至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％同一性的核苷酸序列。

优选的，所述的非人动物基因组中还包含其他基因修饰，进一步优选的，所述的其他基因包含PD-1、PD-L1、CTLA4、B7H3、B7H4、CD47、IL2、IL23A和CCR2基因中的至少一种。

本发明的第三方面，提供了一种靶向载体，所述的靶向载体包含人CCR8基因的部分。

优选的，所述的人CCR8基因的部分包含人CCR8基因的1号至2号外显子的全部或部分；进一步优选的，所述的人CCR8基因的部分包含人CCR8基因的2号外显子的全部或部分，更优选的，所述的人CCR8基因的部分包含人CCR8基因的2号外显子的部分，其中，2号外显子的部分至少包含200bp的核苷酸序列，例如至少包含200、300、500、700、900、1000、1050、1060、1065、1066、1067、1068、1069、1070、1100、1200、1300、1350、1363bp的核苷酸序列；所述人CCR8基因的2号外显子的部分至少包含从起始密码子至终止密码子，优选的，所述的靶向载体包含编码SEQ ID NO:2的核苷酸序列，进一步优选的，包含SEQ ID NO:5所示核苷酸序列。

优选的，所述的靶向载体还包含与待改变的转换区5’端同源的DNA片段，即5’臂，其选自非人动物CCR8基因基因组DNA的100-10000个长度的核苷酸；优选的，所述的5’臂与NCBI登录号为NC_000075.6至少具有90％同源性的核苷酸；进一步优选的，所述5’臂序列与SEQ ID NO:3至少具有90％同源性，或者如SEQ ID NO:3所示。

优选的，所述的靶向载体还包含与待改变的转换区3’端同源的DNA片段，即3’臂，其选自非人动物CCR8基因基因组DNA的100-10000个长度的核苷酸；优选的，所述的3’臂与NCBI登录号为NC_000075.6至少具有90％同源性的核苷酸；进一步优选的，所述的3’臂序列与SEQ ID NO:4至少具有90％同源性，或者如SEQ ID NO:4所示。

更优选的，所述靶向载体还包含SEQ ID NO:6、7、8、9所示核苷酸序列，或包含与SEQ ID NO:6、7、8、9具有至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％同一性的核苷酸序列。

优选的，所述的靶向载体还包含标记基因，进一步优选的，所述标记基因为负筛选标记的编码基因，更进一步优选的，所述负筛选标记的编码基因为白喉毒素A亚基的编码基因(DTA)。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的靶向载体中还包括阳性克隆筛选的抗性基因，进一步优选的，所述阳性克隆筛选的抗性基因为新霉素磷酸转移酶编码序列Neo。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的靶向载体中还包括特异性重组系统，进一步优选的，所述特异性重组系统为Frt重组位点(也可选择常规的LoxP重组系统)，所述的特异性重组系统为具有两个Frt重组位点，分别连接在抗性基因的两侧。

优选的，所述的待改变的转换区位于非人动物CCR8基因座上，进一步优选的，所述的待改变的转换区位于非人动物CCR8基因2号外显子上。

优选的，所述的非人动物可以选自啮齿类动物、猪、兔子、猴子等任何可以进行基因编辑制备基因人源化的非人动物。

优选的，所述的非人动物为非人哺乳动物，进一步优选的，所述的非人哺乳动物为啮齿类动物，更进一步优选的，所述的啮齿类动物为大鼠或小鼠。

优选的，所述的非人动物是免疫缺陷的非人哺乳动物，进一步优选的，所述的免疫缺陷的非人哺乳动物为免疫缺陷的啮齿类动物、免疫缺陷的猪、免疫缺陷的兔子或免疫缺陷的猴子，更优选的，所述的免疫缺陷的啮齿类动物为免疫缺陷的小鼠或大鼠，更进一步优选的，所述免疫缺陷鼠是NOD-Prkdc^scid IL-2rγ^null小鼠、NOD-Rag 1^-/--IL2rg^-/-(NRG)小鼠、Rag 2^-/--IL2rg^-/-(RG)小鼠、NOD/SCID小鼠或者裸鼠。

本发明的第四方面，提供了一种包含上述靶向载体的细胞。

本发明的第五方面，提供了上述靶向载体，或者上述的细胞在CCR8基因修饰中的应用，优选的，所述的应用包括但不限于插入、翻转、敲除或替换。

本发明的第六方面，提供了一种人源化CCR8基因，所述的人源化CCR8基因包含人CCR8基因的部分。

优选的，所述的人源化CCR8基因包含编码人CCR8蛋白的全部或部分核苷酸序列；优选的，包含编码人CCR8跨膜区、胞质区和/或胞外区的全部或部分核苷酸序列；进一步优选的，包含与编码SEQ ID NO:2的核苷酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或至少99％同一性的核苷酸序列或者包含编码SEQ ID NO:2的核苷酸序列。

优选的，所述的人源化CCR8基因包含人CCR8基因的1号外显子至2号外显子的全部或部分，进一步优选的，所述的人源化CCR8基因包含人CCR8基因的2号外显子的全部或部分，其中，2号外显子的部分至少包含200bp的核苷酸序列，例如至少包含200、300、500、700、900、1000、1050、1060、1065、1066、1067、1068、1069、1070、1100、1200、1300、1350、1363bp的核苷酸序列；所述人CCR8基因的2号外显子的部分至少包含从起始密码子至终止密码子。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化CCR8基因中至少包含SEQ ID NO:6、7、8、9所示核苷酸序列，或包含与SEQ ID NO:6、7、8、9具有至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％同一性的核苷酸序列。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化CCR8基因中包含的人CCR8基因的部分选自下列组中的一种：

(A)包含SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6和/或SEQ ID NO:7所示核苷酸序列的全部或部分；

(B)包含与SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6和/或SEQ ID NO:7所示核苷酸序列的同一性至少为70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的核苷酸序列；

(C)包含与SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6和/或SEQ ID NO:7示核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸的核苷酸序列；或，

(D)具有SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6和/或SEQ ID NO:7所示核苷酸序列的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化CCR8基因还包括非人动物CCR8基因的1号外显子的全部和/或2号外显子的部分。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化CCR8基因转录的mRNA选自下列组中的一种：

(a)包含SEQ ID NO:10所示核苷酸序列的全部或部分；

(b)包含与SEQ ID NO:10所示核苷酸序列的同一性至少为70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的核苷酸序列；

(c)包含与SEQ ID NO:10所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸的核苷酸序列；或，

(d)包含SEQ ID NO:10所示的核苷酸序列，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。

优选的，所述的人源化CCR8基因对于被替换的内源CCR8基因座是纯合或者杂合的。

优选的，所述的人源化CCR8基因还包括特异性诱导物或阻遏物，进一步优选的，所述的特异性诱导物或阻遏物可以为常规可以诱导或阻遏的物质。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的特异性诱导物选自四环素系统(Tet-OffSystem/Tet-On System)或他莫昔芬系统(Tamoxifen System)。

优选的，所述的非人动物可以选自啮齿类动物、猪、兔子、猴子等任何可以进行基因编辑制备基因人源化的非人动物。

优选的，所述的非人动物为非人哺乳动物，进一步优选的，所述的非人哺乳动物为啮齿类动物，更进一步优选的，所述的啮齿类动物为大鼠或小鼠。

优选的，所述的非人动物是免疫缺陷的非人哺乳动物，进一步优选的，所述的免疫缺陷的非人哺乳动物为免疫缺陷的啮齿类动物、免疫缺陷的猪、免疫缺陷的兔子或免疫缺陷的猴子，更优选的，所述的免疫缺陷的啮齿类动物为免疫缺陷的小鼠或大鼠，更进一步优选的，所述免疫缺陷鼠是NOD-Prkdc^scid IL-2rγ^null哺乳动物小鼠、NOD-Rag 1^-/--IL2rg^-/-(NRG)小鼠、Rag 2^-/--IL2rg^-/-(RG)小鼠、NOD/SCID小鼠或者裸鼠。

本发明的第七方面，提供了一种人源化CCR8蛋白，所述人源化CCR8蛋白是由上述的人源化CCR8基因编码的。

优选的，所述的人源化CCR8蛋白包含人CCR8蛋白的全部或部分。

优选的，所述的人源化CCR8蛋白包含人CCR8蛋白的跨膜区、胞质区和/或胞外区的全部或部分。

进一步优选的，所述的人源化CCR8蛋白包含人CCR8蛋白的跨膜区、胞质区和/或胞外区的全部。

优选的，所述的人源化CCR8蛋白包含跨膜区、胞质区和胞外区，进一步优选的，所述的人源化CCR8蛋白包含与SEQ ID NO:2具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或至少99％同一性的氨基酸序列或者包含SEQ ID NO:2所示氨基酸序列。

优选的，所述的人源化CCR8蛋白包含人CCR8基因的1号至2号外显子编码的氨基酸序列的全部或部分,进一步优选的，所述的人源化CCR8蛋白包含人CCR8基因的2号外显子编码的氨基酸序列的全部或部分；更优选的，包含从人CCR8基因的起始密码子至终止密码子编码的氨基酸序列。

优选的，所述的人源化CCR8蛋白至少包含SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:10编码的氨基酸序列，或包含与SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:10编码的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％同一性的氨基酸序列。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化CCR8蛋白中包含的人CCR8蛋白的部分氨基酸序列包含下列组中的一种：

A)包含SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的全部或部分；

B)包含SEQ ID NO:2所示氨基酸序列同一性至少为70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的氨基酸序列；

C)包含SEQ ID NO:2所示所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸的氨基酸序列；或，

D)包含SEQ ID NO:2所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。

本发明的第八方面，提供了一种多基因修饰的非人动物的构建方法，包括如下步骤：

I)提供上述的CCR8基因人源化的非人动物或CCR8基因敲除的非人动物，或者采用上述的构建方法获得的CCR8基因人源化的非人动物；

II)将步骤I)提供的非人动物与其他基因修饰的非人动物交配、体外受精或直接进行基因编辑，并进行筛选，得到多基因修饰的非人动物。

优选的，所述的其他基因修饰的非人动物包括但不限于基因PD-1、PD-L1、CTLA4、B7H3、B7H4、CD47、IL2、IL23A或CCR2修饰的非人动物。

优选的，所述的多基因修饰的非人动物为双基因人源化非人动物、三基因人源化非人动物、四基因人源化非人动物、五基因人源化非人动物、六基因人源化非人动物、七基因人源化非人动物、八基因人源化非人动物或九基因人源化非人动物。

优选的，所述的多基因修饰的非人动物的基因组中人源化的多个基因中的每一个基因均可以是纯合或杂合的。

本发明的第九方面，提供了一种上述构建方法获得的非人动物或其子代，所述的非人动物或其子代选自CCR8基因人源化的非人动物、CCR8基因敲除的非人动物或者多基因修饰的非人动物。

本发明的第十方面，提供了一种动物的疾病模型，所述的疾病模型来源于上述的非人动物、上述的构建方法获得的非人动物，或者，上述的非人动物或其子代，优选的，所述的疾病包括自身免疫性疾病、肿瘤或炎症。

本发明的第十一方面，提供了一种动物的疾病模型的制备方法，所述的制备方法包括上述CCR8基因人源化的非人动物、CCR8基因敲除的非人动物或多基因修饰的非人动物的步骤；优选的，所述的疾病包括自身免疫性疾病、肿瘤或炎症，进一步优选的，还包括植入肿瘤细胞的步骤。

本发明的第十二方面，提供了上述CCR8基因人源化的非人动物、上述CCR8基因敲除的非人动物、上述构建方法获得的CCR8基因人源化的非人动物、上述CCR8基因敲除的非人动物或多基因修饰的非人动物或其子代在制备动物的疾病模型中的应用，优选的，所述的疾病包括自身免疫性疾病、肿瘤或炎症。

本发明的第十三方面，提供了上述的非人动物或其子代、上述的构建方法获得的非人动物或上述的疾病模型在制备治疗自身免疫性疾病、肿瘤和/或炎症的药物中的应用。

本发明的第十四方面，提供了一种细胞或细胞系或原代细胞培养物，所述细胞或细胞系或原代细胞培养物来源于上述的非人动物、上述的构建方法获得的非人动物、上述的非人动物或其子代或者上述的疾病模型。优选的，所述的细胞或细胞系或原代细胞培养物不能发育为动物个体。

本发明的第十五方面，提供了一种组织或器官或其培养物，所述组织或器官或其培养物来源于上述的非人动物、上述的构建方法获得的非人动物、上述的非人动物或其子代或者上述的疾病模型。优选的，所述的组织或器官或其培养物不能发育为动物个体。

本发明的第十六方面，提供了一种荷瘤后的瘤组织，所述的瘤组织来源于上述的非人动物、上述的构建方法获得的非人动物、上述的非人动物或其子代，或者上述的疾病模型。优选的，所述的荷瘤后的瘤组织不能发育为动物个体。

本发明的第十七方面，提供了一种CCR8基因人源化的细胞，所述的细胞表达人CCR8蛋白或人源化CCR8蛋白。

优选的，所述的人源化CCR8蛋白选自上述的人源化CCR8蛋白。

优选的，所述的细胞中内源CCR8蛋白的表达降低或缺失。

优选的，所述的细胞的基因组中包含人CCR8基因的部分，进一步优选的，所述的细胞包含上述的人源化CCR8基因。优选的，所述的细胞不能发育为动物个体。

本发明的第十八方面，提供了一种CCR8基因敲除的细胞，所述的细胞中缺失CCR8基因的全部或部分核苷酸序列。

优选的，所述的细胞缺失CCR8基因的2号外显子的全部或部分。

本发明的第十九方面，提供了一种表达上述的人源化CCR8蛋白的构建体，优选的，所述的构建体中包含上述人源化CCR8基因。

优选的，所述的构建体表达人或人源化CCR8蛋白，所述的人源化CCR8蛋白如上述的人源化CCR8蛋白。

本发明的第二十方面，提供了一种包含上述构建体的细胞。优选的，所述的细胞不能发育为动物个体。

本发明的第二十一方面，提供了一种包含上述细胞的组织。优选的，所述的组织不能发育为动物个体。

本发明的第二十二方面，提供了来源于上述的人源化CCR8蛋白、上述的人源化CCR8基因、上述的非人动物、上述的构建方法获得的非人动物、上述的非人动物或其子代、上述的疾病模型、上述的细胞或细胞系或原代细胞培养物、上述的组织或器官或其培养物、上述的荷瘤后的瘤组织、上述的细胞、上述的构建体、上述的细胞或上述的组织在需要涉及人类细胞的免疫过程的产品开发，制造抗体，或者作为药理学、免疫学、微生物学、医学研究的模型系统中的应用；或者在生产和利用动物实验疾病模型，用于开发新的诊断策略和/或治疗策略中的应用；或者在筛选、验证、评价或研究CCR8功能、人CCR8信号机理、靶向人的抗体、靶向人的药物、药效，免疫相关疾病药物以及抗肿瘤或抗炎症药物，筛选和评估人用药及药效研究方面的应用。

优选的，所述应用不是疾病的治疗和/或诊断方法。

本发明的第二十三方面，提供了上述CCR8基因人源化的非人动物、上述CCR8基因敲除的非人动物、上述构建方法获得的CCR8基因人源化的非人动物、上述CCR8基因敲除的非人动物或多基因修饰的非人动物或其子代在制备人CCR8特异性调节剂或者筛选人CCR8特异性调节剂的产品中的应用。

本发明的第二十四方面，提供了一种人CCR8特异性调节剂的筛选方法，所述的筛选方法包括向个体施加调节剂，检测调节效果；其中，所述的个体选自上述的非人动物、上述的构建方法获得的非人动物、上述的非人动物或其子代，或者上述的疾病模型。

优选的，所述的调节剂选自CAR-T、药物，进一步优选的，所述的药物为化学药、核苷类药物或抗体。

优选的，所述的调节剂为单抗或双特异性抗体或两种及两种以上药物的联合使用。

优选的，所述的筛选方法还包括向个体植入肿瘤的步骤。

优选的，所述检测包括测定肿瘤细胞的大小和/或增殖速率。

优选的，所述检测的方法包括游标卡尺测量、流式细胞检测和/或动物活体成像检测。

优选的，所述的检测包括评估个体体重、脂肪量、活化途径、神经保护活性或代谢变化，所述的代谢变化包括食物消耗或水消耗的变化。

优选的，所述的肿瘤细胞来源于人或非人动物。

优选的，所述人CCR8特异性调节剂的筛选方法不是治疗方法。该方法用来筛选或评价药物，对候选药物的药效进行检测和比较，以确定哪些候选药物可以作为药物，哪些不能作为药物，或者，比较不同药物的药效敏感程度，即治疗效果不是必然的，只是一种可能性。

本发明的第二十五方面，提供了一种干预方案的评价方法，所述的评价方法包括向个体施加干预方案，对施加干预方案后的个体进行调节效果检测和评价；其中，所述的个体选自上述的非人动物，上述的构建方法获得的非人动物，上述的非人动物或其子代，或者上述的疾病模型。

优选的，所述的评价方法还包括向个体植入肿瘤细胞。

优选的，所述的干预方案选自CAR-T、药物治疗，进一步优选的，所述的药物为抗原结合蛋白，所述的抗体结合蛋白为抗体。

优选的，所述的肿瘤细胞来源于人或非人动物。

优选的，所述干预方案的评价方法不是治疗方法，该评价方法对干预方案的效果进行检测和评价，以确定该干预方案是否有治疗效果，即治疗效果不是必然的，只是一种可能性。

本发明的第二十六方面，提供了一种来源于上述的非人动物、上述的构建方法获得的非人动物、上述的非人动物或其子代或疾病模型在制备治疗肿瘤、炎症或自身免疫性疾病的药物中的用途。

本发明所述的“肿瘤”包括但不限于淋巴瘤、B细胞肿瘤、T细胞肿瘤、骨髓/单核细胞肿瘤、非小细胞肺癌、白血病、卵巢癌、鼻咽癌、乳腺癌、子宫内膜癌、结肠癌、直肠癌、胃癌、膀胱癌、肺癌、支气管癌、骨癌、前列腺癌、胰腺癌、肝和胆管癌、食管癌、肾癌、甲状腺癌、头颈部癌、睾丸癌、胶质母细胞瘤、星形细胞瘤、黑色素瘤、骨髓增生异常综合征、以及肉瘤。其中，所述的白血病选自急性淋巴细胞性(成淋巴细胞性)白血病、急性骨髓性白血病、髓性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、多发性骨髓瘤、浆细胞白血病、以及慢性骨髓性白血病；所述淋巴瘤选自霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤，包括B细胞淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、边缘区B细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、和瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症；所述肉瘤选自骨肉瘤、尤文肉瘤、平滑肌肉瘤、滑膜肉瘤、软组织肉瘤、血管肉瘤、脂肪肉瘤、纤维肉瘤、横纹肌肉瘤、及软骨肉瘤。在本发明的一个具体实施方式中，所述的肿瘤选自B细胞肿瘤、T细胞肿瘤、骨髓/单核细胞肿瘤。优选包括B或T细胞急性淋巴细胞白血病(ALL)、急性髓细胞白血病(AML)、非霍奇金淋巴瘤(NHL)和多发性骨髓瘤(MM)、鼻咽癌、肺癌。

本发明所述的“自身免疫性疾病”包括但不限于过敏、哮喘、心肌炎、肾炎、肝炎、系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、硬皮病、甲状腺功能亢进、原发性血小板减少性紫癜、自身免疫性溶血性贫血、溃疡性结肠炎、自身免疫性肝病、糖尿病、疼痛或神经障碍等。

本发明所述的“炎症”包括急性炎症，也包括慢性炎症。具体的，包括但不限于变质性炎症、渗出性炎症(浆液性炎、纤维素性炎、化脓性炎、出血性炎、坏死性炎、卡他性炎)、增生性炎症、特异性炎症(结核、梅毒、麻疯、淋巴肉芽肿等)。

本发明保护的主题“细胞”、“细胞或细胞系或原代细胞培养物”、“组织”、“组织或器官或其培养物”均不能发育为动物，其中，所述的细胞不是干细胞或受精卵细胞，所述的细胞可以是体细胞、淋巴细胞(优选为T细胞或B细胞)或肿瘤细胞等等，所述的组织可以是脾脏、淋巴结、骨髓、肿瘤或其培养物等等。

本发明所述的CCR8基因人源化的非人动物体内可以正常表达人CCR8蛋白或人源化CCR8蛋白。可用于针对人CCR8靶位点的药物筛选、药效评估、心脑血管疾病、神经性疾病、自身免疫性疾病和肿瘤治疗，可以加快新药研发过程、节约时间和成本。对于研究CCR8蛋白功能及相关疾病药物筛选提供了有效的保障。

本发明所述的“全部或部分”，“全部”为整体，“部分”为整体中的局部，或者组成整体的个体。

本发明所述的“人源化CCR8蛋白”，包含来源于人CCR8蛋白的部分。其中，所述的“人CCR8蛋白”同“人CCR8蛋白的全部”，即其氨基酸序列与人CCR8蛋白的全长氨基酸序列一致。所述的“人CCR8蛋白的部分”，为连续或间隔的5-355个(优选为10-355个)氨基酸序列与人CCR8蛋白的氨基酸序列一致或与人CCR8蛋白的氨基酸序列具有70％以上同源性。

本发明所述的“人源化CCR8基因”，包含来源于人CCR8基因的部分和非人CCR8基因的部分。其中，所述的“人CCR8基因”同“人CCR8基因的全部”，即其核苷酸序列与人CCR8基因的全长核苷酸序列一致。所述的“人CCR8基因的部分”为连续或间隔的20-3972bp(优选为20-1068bp)个核苷酸序列与人CCR8基因一致或与人CCR8基因具有70％以上同源性。

本发明所述的“xx号至xxx号外显子”或“xx号至xxx号外显子的全部”包含外显子及其期间的内含子的核苷酸序列，例如所述的“1号至2号外显子”包含1号外显子、1-2号内含子、2号外显子的全部核苷酸序列。

本发明所述的“x-xx号内含子”表示x号外显子与xx号外显子之间的内含子。例如“1-2号内含子”表示1号外显子与2号外显子之间的内含子。

本发明所述的“外显子的部分”表示连续或间隔几个、几十个或几百个核苷酸序列与全部的外显子核苷酸序列一致。例如人CCR8基因的2号外显子的部分，包含连续或间隔的5-1363bp个，优选10-1068bp个核苷酸序列与人CCR8基因的2号外显子核苷酸序列一致。在本发明的一个具体实施方式中，所述的“人源化CCR8基因”中包含的“2号外显子的部分”至少包括从2号外显子编码氨基酸序列的起始密码子至终止密码子。

本发明所述的“基因座”广义上讲代表基因在染色体上所占的位置，狭义上讲代表某一基因上的一段DNA片段，即可以是一个基因也可以是一个基因的一部分。例如所述的“CCR8基因座”表示CCR8基因1号至2号外显子上的任选一段的DNA片段。优选为1号外显子、2号外显子或其期间的内含子中的任一个或两个或多个的组合，或一个或两个或多个的全部或部分，更优选为CCR8基因的2号外显子上。

本发明所述的“核苷酸序列”包含天然的或经过修饰的核糖核苷酸序列、脱氧核糖核苷酸序列。优选为DNA、cDNA、pre-mRNA、mRNA、rRNA、hnRNA、miRNAs、scRNA、snRNA、siRNA、sgRNA、tRNA。

本发明所述的“治疗”表示减缓、中断、阻止、控制、停止、减轻、或逆转一种体征、症状、失调、病症、或疾病的进展或严重性，但不一定涉及所有疾病相关体征、症状、病症、或失调的完全消除，且是指在疾病已开始发展后改善疾病或病理状态的体征、症状等等的治疗干预。

本发明所述的“同源性”，是指在使用氨基酸序列或核苷酸序列的方面，本领域技术人员在保证与已知序列相似结构或功能的前提下，可以根据实际工作需要对序列进行调整，使使用序列与现有技术获得的序列相比，具有(包括但不限于)1％，2％，3％，4％，5％，6％，7％，8％，9％，10％，11％，12％，13％，14％，15％，16％，17％，18％，19％，20％，21％，22％，23％，24％，25％，26％，27％，28％，29％，30％，31％，32％，33％，34％，35％，36％，37％，38％，39％，40％，41％，42％，43％，44％，45％，46％，47％，48％，49％，50％，51％，52％，53％，54％，55％，56％，57％，58％，59％，60％，70％，80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，99.1％，99.2％，99.3％，99.4％，99.5％，99.6％，99.7％，99.8％，99.9％的同一性。

在一个方面，所述非人动物是哺乳动物。优选的，所述非人动物是小型哺乳动物，例如跳鼠科。在一个实施方式中，所述非人动物是啮齿动物。在一个实施方式中，所述啮齿动物选自小鼠、大鼠和仓鼠。在一个实施方式中，所述啮齿动物选自鼠家族。在一个实施方式中，所述基因修饰的动物来自选自丽仓鼠科(例如小鼠样仓鼠)、仓鼠科(例如仓鼠、新世界大鼠和小鼠、田鼠)、鼠总科(真小鼠和大鼠、沙鼠、刺毛鼠、冠毛大鼠)、马岛鼠科(登山小鼠、岩小鼠、有尾大鼠、马达加斯加大鼠和小鼠)、刺睡鼠科(例如多刺睡鼠)和鼹形鼠科(例如摩尔大鼠、竹大鼠和鼢鼠)家族。在一个特定实施方式中，所述基因修饰的啮齿动物选自真小鼠或大鼠(鼠总科)、沙鼠、刺毛鼠和冠毛大鼠。在一个实施方式中，所述基因修饰的小鼠来自鼠科家族成员。在一个实施方式中，所述动物是啮齿动物。在一个特定实施方式中，所述啮齿动物选自小鼠和大鼠。在一个实施方式中，所述非人动物是小鼠。

在一个特定实施方式中，所述非人动物是啮齿动物，其为选自BALB/c、A、A/He、A/J、A/WySN、AKR、AKR/A、AKR/J、AKR/N、TA1、TA2、RF、SWR、C3H、C57BR、SJL、C57L、DBA/2、KM、NIH、ICR、CFW、FACA、C57BL/A、C57BL/An、C57BL/GrFa、C57BL/KaLwN、C57BL/6、C57BL/6J、C57BL/6ByJ、C57BL/6NJ、C57BL/10、C57BL/10ScSn、C57BL/10Cr和C57BL/Ola的C57BL、C58、CBA/Br、CBA/Ca、CBA/J、CBA/st、CBA/H品系的小鼠及NOD、NOD/SCID、NOD-Prkdcscid IL-2rgnull背景的小鼠。

本领域的技术人员能够确定并比较序列元件或同一性程度，以区分另外的小鼠和人序列。

除非特别说明，本发明的实践将采取细胞生物学、细胞培养、分子生物学、转基因生物学、微生物学、重组DNA和免疫学的传统技术。这些技术在以下文献中进行了详细的解释。例如：Molecular Cloning A Laboratory Manual，2ndEd.，ed.By Sambrook，FritschandManiatis(Cold Spring Harbor Laboratory Press：1989)；DNACloning，VolumesIand II(D.N.Glovered.，1985)；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gaited.，1984)；Mulliseta l.U.S.Pat.NO:4，683，195；Nucleic Acid Hybridization(B.D.Hames&S.J.Higginseds.1984)；Transcription And Translation(B.D.Hames&S.J.Higginseds.1984)；Culture Of Anima l Cells(R.I.Freshney，AlanR.Liss，Inc.，1987)；Immobilized Cells And Enzymes(IRL Press，1986)；B.Perbal，A PracticalGuide To Molecular Cloning(1984)；the series，Meth ods In ENZYMOLOGY(J.Abelsonand M.Simon，eds.inchief，Academic Press，Inc.，New York)，specifically，Vols.154and 155(Wuetal.eds.)and Vol.185，″Gene Expression Technology″(D.Goeddel，ed.)；Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells(J.H.Miller andM.P.Caloseds.，1987，Cold Spring Harbor Laboratory)；Immunochemical Methods InCell And Molecular Biology(Mayer and Walker，eds.，Academic Press，London，1987)；Handbook Of Experimental Immunology，Volumes V(D.M.Weir and C.C.Blackwell，eds.，1986)；and Manipulating the Mouse Embryo，(Cold Spring Harbor LaboratoryPress，Cold Spring Harbor，N.Y.，1986)。

以上只是概括了本发明的一些方面，不是也不应该认为是在任何方面限制本发明。

本说明书提到的所有专利和出版物都是通过参考文献作为整体而引入本发明的。本领域的技术人员应认识到，对本发明可作某些改变并不偏离本发明的构思或范围。

下面的实施例进一步详细说明本发明，不能认为是限制本发明或本发明所说明的具体方法的范围。

附图说明

以下，结合附图来详细说明本发明的实施例，其中：

图1：小鼠CCR8基因座和人CCR8基因座对比示意图(非按比例)；

图2：小鼠CCR8基因人源化改造示意图(非按比例)；

图3：CCR8基因打靶策略设计示意图(非按比例)；

图4：CCR8重组后细胞Southern blot结果，其中WT为野生型对照；

图5：人源化CCR8小鼠FRT重组过程示意图(非按比例)；

图6：CCR8人源化小鼠F1代基因型鉴定结果，其中，WT为野生型，H₂O为水对照，PC为阳性对照；

图7：人hCCR8和鼠mCCR8在CD4⁺T cells中流式检测结果，其中WT为野生型C57BL/6小鼠，H/H为CCR8人源化纯合子小鼠；

图8：人hCCR8和鼠mCCR8在Treg细胞中流式检测结果，其中WT为野生型C57BL/6小鼠，H/H为CCR8人源化纯合子小鼠。

图9：对比C57BL/6野生型鼠与CCR8基因人源化纯合子小鼠(H/H)，脾脏中免疫细胞情况，其中，免疫细胞包括B细胞(B cells)、T细胞(T cells)、NK细胞(NK cells)、CD4+细胞(CD4+cells)、CD8+细胞(CD8+cells)、粒细胞(Granulocytes)、DC细胞(DC cells)、巨噬细胞(Macrophages)、单核细胞(Monocytes)；

图10：对比C57BL/6野生型鼠与CCR8基因人源化纯合子小鼠(H/H)，胸腺中免疫细胞情况，其中，免疫细胞包括B细胞(B cells)、T细胞(T cells)、NK细胞(NK cells)、CD4+细胞(CD4+cells)、CD8+细胞(CD8+cells)、粒细胞(Granulocytes)、DC细胞(DC cells)、巨噬细胞(Macrophages)、单核细胞(Monocytes)；

图11：对比C57BL/6野生型鼠与CCR8基因人源化纯合子小鼠(H/H)，血液中免疫细胞情况，其中，免疫细胞包括B细胞(B cells)、T细胞(T cells)、NK细胞(NK cells)、CD4+细胞(CD4+cells)、CD8+细胞(CD8+cells)、粒细胞(Granulocytes)、DC细胞(DC cells)、巨噬细胞(Macrophages)、单核细胞(Monocytes)；

图12：对比C57BL/6野生型鼠与CCR8基因人源化纯合子小鼠，脾脏中T细胞亚群情况，其中，T细胞亚群包括CD4+细胞(CD4+cells)、CD8+细胞(CD8+cells)、Treg细胞(Tregs)；

图13：对比C57BL/6野生型鼠与CCR8基因人源化纯合子小鼠，胸腺中T细胞亚群情况，其中，T细胞亚群包括CD4+细胞(CD4+cells)、CD8+细胞(CD8+cells)、Treg细胞(Tregs)；

图14：对比C57BL/6野生型鼠与CCR8基因人源化纯合子小鼠，外周血中T细胞亚群情况，其中，T细胞亚群包括CD4+细胞(CD4+cells)、CD8+细胞(CD8+cells)、Treg细胞(Tregs)；

图15：将小鼠结肠癌细胞MC38植入CCR8人源化小鼠体内，并利用抗人CCR8抗体进行抗肿瘤药效试验(10mg/kg)，图为G1、G2组实验动物体重测量结果；

图16：将小鼠结肠癌细胞MC38植入CCR8人源化小鼠体内，并利用抗人CCR8抗体进行抗肿瘤药效试验(10mg/kg)，图为G1、G2组实验动物体重变化结果；

图17：将小鼠结肠癌细胞MC38植入CCR8人源化小鼠体内，并利用抗人CCR8抗体进行抗肿瘤药效试验(10mg/kg)，图为G1、G2组实验动物肿瘤体积测量结果；

图18：肿瘤中浸润的淋巴细胞占比情况示意图，其中，A为mCD3占比情况，B为mCD4占比情况，C为mCD8占比情况，D为Tregs占比情况；

图19：外周血中淋巴细胞占比情况示意图，其中，A为mCD3占比情况，B为mCD4占比情况，C为mCD8占比情况，D为Tregs占比情况；

图20：白细胞亚型分析结果示意图，其中，A为肿瘤，B为脾细胞，C为外周血，图标C57BL/6为野生型C57BL/6小鼠，CCR8为CCR8人源化纯合子小鼠；

图21：肿瘤细胞中CCR8(CD198)在白细胞亚型占比结果示意图，其中，A为人CCR8占比情况，B为鼠CCR8占比情况，图标C57BL/6为野生型C57BL/6小鼠，CCR8为CCR8人源化纯合子小鼠；

图22：脾细胞中CCR8(CD198)在白细胞亚型占比结果示意图，其中，A为人CCR8占比情况，B为鼠CCR8占比情况，图标C57BL/6为野生型C57BL/6小鼠，CCR8为CCR8人源化纯合子小鼠；

图23：外周血中CCR8(CD198)在白细胞亚型占比结果示意图，其中，A为人CCR8占比情况，B为鼠CCR8占比情况，图标C57BL/6为野生型C57BL/6小鼠，CCR8为CCR8人源化纯合子小鼠。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

在下述每一实施例中，设备和材料是从以下所指出的几家公司获得：

EcoNI、ScaI、DraIII酶购自NEB，货号分别为R0521、R3122、R3510；

Lipopolysaccharides from Escherichia coli O111:B4购自Sigma，货号：L2630；

AttuneNxtAcousticFocusingCytometer购自ThermoFisher，型号AttuneNxt；

PrimeScript 1stStrandcDNASynthesisKit购自TAKARA，型号6110A；

Heraeus^TMFresco^TM21Microcentrifuge购自ThermoFisher，型号Fresco 21；

PerCPanti-mouseCD45 Antibody购自Biolegend，型号03130；

BrilliantViolet 711^TManti-mouseTCRβchainAntibody购自Biolegend，型号109243；

BrilliantViolet 510^TManti-mouseCD4 Antibody购自Biolegend，型号100559；

FITCanti-MouseCD8aAntibody购自Biolegend，型号100706；

BrilliantViolet 421^TManti-mouseNK1.1 Antibody购自Biolegend，型号108732；

FITCanti-mouseF4/80Antibody购自Biolegend，型号123108；

FITCanti-humanCD3 Antibody购自Biolegend，型号300306；

APCanti-mouseCD198(CCR8)Antibody购自Biolegend，型号150309；

PEanti-humanCD198(CCR8)Antibody购自Biolegend，型号360603；

PerCPanti-mouse/humanCD11bAntibody购自Biolegend，型号101230。

实施例1 CCR8基因人源化小鼠

本实施例对非人动物(如小鼠)进行改造，使该非人动物体内包含编码人源化CCR8蛋白的核苷酸序列，得到经遗传修饰的非人动物体内可表达人源化CCR8蛋白。小鼠CCR8基因(NCBI Gene ID：12776，Primary source：MGI：1201402，UniProt ID：P56484，位于9号染色体NC_000075.6的第120092133至120094906位，基于转录本NM_007720.2及其编码蛋白NP_031746.1(SEQ ID NO:1)和人CCR8基因(NCBI Gene ID：1237，Primary source：HGNC:1609，UniProt ID：P51685，位于3号染色体NC_000003.12的第39329709至39333680位，基于转录本NM_005201.4及其编码蛋白NP_005192.1(SEQ ID NO:2)，小鼠CCR8基因座与人CCR8基因座对比示意图如图1所示。

为了达到本发明的目的，可在小鼠内源CCR8基因座引入部分编码人CCR8蛋白的核苷酸序列，使得该小鼠表达人或人源化CCR8蛋白。具体来说，可以通过基因编辑技术将小鼠CCR8基因的部分2号外显子1062bp核苷酸序列用对应的人CCR8基因的部分2号外显子1068bp核苷酸序列替换，得到人源化CCR8基因序列(示意图如图2所示)，实现对小鼠CCR8基因的人源化改造。

如图3所示的打靶策略示意图中，显示了靶向载体上含有小鼠CCR8基因上游和下游的同源臂序列，以及包含人CCR8基因序列的A片段。其中，上游同源臂序列(5’同源臂，SEQID NO:3)与NCBI登录号为NC_000075.6的第120088585-120093820位核苷酸序列相同，下游同源臂序列(3’同源臂，SEQ ID NO:4)与NCBI登录号为NC_000075.6的第120095301-120099151位核苷酸序列相同；A片段上包含人CCR8基因的2号外显子部分序列的基因组DNA序列(人CCR8序列，SEQ ID NO:5)，该DNA序列与NCBI登录号为NC_000003.12的第39332332-39333399位核苷酸序列相同；A片段中人CCR8序列上游与小鼠CCR8基因的连接设计为5’-ACCTCTCACGTGCCTGCTTGACCAGGTCTTCCTGCCTCG

TTATACACTTGACCTCAGTGTGACAACAGTGACCGA-3’(SEQ ID NO:6)，其中序列“GCCTCG”中的最后一个“G”是小鼠的最后一个核苷酸，序列

中的第一个“A”是人的第一个核苷酸；人CCR8序列下游与小鼠CCR8基因的连接设计为5’-CTCCTCCCGTTCCTCCAGCGTAGACTACATTTTGTGA

GTGTGCAGGGCAGGCAGACTCCACCTGCATTGCCCTTCC-3’(SEQ ID NO:7)，其中序列“TGTGA”中的最后一个“A”是人的最后一个核苷酸，序列

中的第一个“G”是小鼠的第一个核苷酸。

靶向载体上还包括用于阳性克隆筛选的抗性基因，即新霉素磷酸转移酶编码序列Neo，并在抗性基因的两侧装上两个同向排列的位点特异性重组系统Frt重组位点，组成Neo盒(Neo cassette)。其中Neo盒5’端与小鼠基因的连接设计为：5’-AGATGGCTCTGCAGCTAAAGGCACTTGTTCTTACT

TGATATCGAATTCCGAAGTTCCTATTCTCTAGAAAGTATAGGAACTTC-3’(SEQID NO:8)，其中序列“TTACT”中的最后一个“T”是小鼠的最后一个核苷酸，序列

中的第一个“A”是NEO盒的第一个核苷酸；NEO盒3’端与小鼠基因的连接设计为5’-GAAGTTCCTATTCTCTAGAAAGTATAGGAACTTCATCAGTCAGGTACATAATTAGGTGGATCCACTAGTT

CTGAGAACTGGACCCAGGGGCTGGAGAGATGGCTCAGT-3’(SEQ ID NO:9)，其中序列

中的最后一个“A”是Neo盒的最后一个核苷酸，序列“CTGAG”中的“C”是小鼠的第一个核苷酸。此外，还在靶向载体3’同源臂下游构建了具有负筛选标记的编码基因(白喉毒素A亚基的编码基因(DTA))。改造后的人源化小鼠CCR8的mRNA序列如SEQ ID NO:10所示，表达的蛋白序列如SEQ ID NO:2所示。

靶向载体构建可采用常规方法进行，如酶切连接等。构建好的靶向载体通过酶切进行初步验证后，再送测序公司进行测序验证。将测序验证正确的靶向载体电穿孔转染入C57BL/6小鼠的胚胎干细胞中，利用阳性克隆筛选标记基因对得到的细胞进行筛选，并利用PCR(PCR引物详见表1)和Southern Blot技术进行检测确认外源基因的整合情况，筛选出正确的阳性克隆细胞，经PCR鉴定为阳性的克隆再进行Southern Blot(分别用SspI或SpeI或EcoNI消化细胞DNA并使用3个探针进行杂交，探针及目的片段长度如表2所示)检测，结果见如图4所示，检测结果表明4个经PCR验证为阳性的克隆，经测序发现除4-C02外，其余3个均为阳性克隆且无随机插入，具体编号为1-D04、1-D08、3-C12。

表1 PCR扩增引物序列

表2具体探针及目的片段长度

限制性内切酶	探针	野生型片段大小	重组序列片段大小
				SspI	5’Probe	17.7kb	14.4kb
SpeI	3’Probe-B	24.3kb	16.2kb
				EcoNI	Neo Probe(3’)	—	11.5kb

Southern Blot检测包括如下探针引物：

5’探针(5’Probe)：

5’Probe-F(SEQ ID NO:15)：5’-CTGCTCTCACACCATCCTGACTGAG-3’，

5’Probe-R(SEQ ID NO:16)：5’-TCTCACTGAACTTAGAGCCATCTGTGA-3’；

3’探针(3’Probe-B)：

3’Probe-B-F(SEQ ID NO:17)：5’-CTCAGCCAGTCACCCATTTCAAAAAGC-3’，

3’Probe-B-R(SEQ ID NO:18)：5’-GTCTCCACCGTGTCCTCTACATCCTG-3’；

Neo探针(Neo Probe(3’))：

Neo Probe(3’)-F(SEQ ID NO:19)：5’-GGATCGGCCATTGAACAAGAT-3’，

Neo Probe(3’)-R(SEQ ID NO:20)：5’-CAGAAGAACTCGTCAAGAAGGC-3’。

将筛选出的正确阳性克隆细胞(黑色鼠)按照本领域已知的技术导入已分离好的囊胚中(白色鼠)，得到的嵌合囊胚转移至培养液中短暂培养后移植至受体母鼠(白色鼠)的输卵管，可生产F0代嵌合体鼠(黑白相间)。将F0代嵌合鼠与野生型鼠回交获得F1代鼠，再将F1代杂合小鼠互相交配即可获得F2代纯合子鼠。还可将阳性鼠与Flp工具鼠交配去除阳性克隆筛选标记基因(该过程示意图见图5)后，再通过互相交配即可得到人源化CCR8基因纯合子小鼠。可通过PCR鉴定子代小鼠体细胞的基因型(引物如表2所示)，示例性的F1代小鼠(已去除Neo标记基因)的鉴定结果见图6的A-D，其中，编号为F1-01、F1-02、F1-03、F1-06、F1-07、F1-08和F1-09的7只小鼠均为阳性杂合小鼠。这表明使用本方法能构建出可稳定传代且无随机插入的人源化CCR8基因工程小鼠。

表3：引物名称及具体序列

通过将MC38接种到CCR8基因人源化纯合子小鼠体内，检测小鼠肿瘤中CCR8的表达情况。肿瘤长到约200mm³脱颈安乐死小鼠，取肿瘤组织，进行消化等一系列处理，重悬为单细胞悬液，进行流式细胞检测。用抗鼠CCR8抗体anti-mCD4-BV421(Brilliant Violet421^TManti-mouse CD4)、抗鼠CCR8抗体mCCR8-APC-A(APC anti-mouse CCR8Antibody)、anti-mFoxp3-PE/Cy7(Anti-Mo/Rt Foxp3PE/Cy^TM7)和抗人CCR8抗体hCCR8-PE-A(PE anti-human CD198(CCR8)Antibody)以及识别染色后进行流式检测，检测结果见图7和图8。如图7所示，在野生型C57BL/6小鼠体内在CD4+T细胞中能够检测到鼠CCR8蛋白(图7A)，检测不到人CCR8蛋白(图7C)；在CCR8基因人源化纯合子小鼠体内不能检测到鼠CCR8蛋白(图7B)，但能检测到人CCR8蛋白(图7D)。如图8所示，在野生型C57BL/6小鼠体内在Treg细胞中能够检测到鼠CCR8蛋白(图8A)，检测不到人CCR8蛋白(图8C)；在CCR8基因人源化纯合子小鼠体内，不能检测到鼠CCR8蛋白(图8B)，但能检测到人CCR8蛋白(图8D)。

进一步采用流式细胞术对CCR8人源化小鼠的免疫细胞进行分析。具体的，选取CCR8人源化纯合子小鼠(H/H)和野生型C57BL/6小鼠各3只(7-8周龄)，取脾脏、胸腺及外周血进行的免疫细胞和T细胞亚群分析，从图9、10、11中可以看出，CCR8基因人源化小鼠体内白细胞亚群表达谱与C57BL/6小鼠相似且无明显差异，具体表现C57BL/6小鼠与CCR8人源化小鼠B细胞(B cells)、T细胞(T cells)、NK细胞(NK cells)、CD4+细胞(CD4+cells)、CD8+细胞(CD8+cells)、粒细胞(Granulocytes)、DC细胞(DC cells)、巨噬细胞(Macrophages)、单核细胞(Monocytes)以及T细胞的各个亚群CD4+细胞(CD4+cells)、CD8+细胞(CD8+cells)、Treg细胞(Tregs)细胞含量接近(图12-14)。说明对CCR8人源化改造不影响免疫细胞发育。

实施例2双重人源化或多重双人源化小鼠的制备

利用本方法或制得的CCR8小鼠还可以制备双人源化或多人源化小鼠模型。如，前述实施例1中，囊胚显微注射使用的胚胎干细胞可选择来源于含有PD-1、PD-L1、CTLA4、B7H3、B7H4、CD47、IL2、IL23A、CCR2等其它基因修饰的小鼠，或者，也可在人源化CCR8小鼠的基础上，利用分离小鼠ES胚胎干细胞和基因重组打靶技术，获得CCR8与其它基因修饰的双基因或多基因修饰的小鼠模型。也可将本方法得到的CCR8小鼠纯合子或杂合子与其它基因修饰的纯合或杂合小鼠交配，对其后代进行筛选，根据孟德尔遗传规律，可有一定机率得到人源化CCR8与其它基因修饰的双基因或多基因修饰的杂合小鼠，再将杂合子相互交配可以得到双基因或多基因修饰的纯合子，利用这些双基因或多基因修饰的小鼠可以进行靶向人CCR8和其它基因调节剂的体内药效验证等。

实施例3 CCR8基因人源化动物模型的免疫检测分析

取8-9周龄的C57BL/6和CCR8纯合小鼠各3只，皮下接种小鼠结肠癌细胞MC38，待肿瘤长至1000mm³左右，安乐死处死小鼠，收集脾细胞、外周血和肿瘤，用抗鼠CD45抗体PerCPanti-mouse CD45 Antibody、抗鼠TCRβ抗体Brilliant Violet 711^TManti-mouse TCRβchain Antibody、抗鼠CD4抗体Brilliant Violet 510^TManti-mouse CD4 Antibody、抗鼠CD8a抗体FITC anti-Mouse CD8a Antibody、抗鼠NK1.1抗体Brilliant Violet 421^TManti-mouse NK1.1 Antibody、抗鼠F4/80抗体FITC anti-mouse F4/80Antibody、抗鼠CD3抗体FITC anti-human CD3 Antibody、抗鼠CD198抗体APC anti-mouse CD198(CCR8)Antibody、抗人CD198抗体PE anti-human CD198(CCR8)Antibody和抗鼠CD11b抗体PerCP anti-mouse/human CD11b Antibody进行染色后，进行流式检测，检测脾细胞、外周血和肿瘤中白细胞亚群占比情况。结果如图20所示，在CCR8基因人源化纯合小鼠和C57BL/6小鼠的肿瘤(图20A)、脾细胞(图20B)和外周血(图20C)中，mCD45的比例，mCD3εT细胞(mCD3e+T cell)、B细胞(B cell)、NK细胞(NK cell)和巨噬细胞(Macrophages)在mCD45+细胞中的占比，mCD4⁺T细胞(mCD4+T cell)、mCD8⁺T细胞(mCD8⁺T cell)、Treg细胞(mCD4+mFoxp3+)、mCD25+Treg细胞(mCD4+mFoxp3+mCD25+)和非Treg T细胞(mCD4+mFoxp3-)在mCD4⁺T细胞中的占比，以及M1型巨噬细胞(M1)和M2型巨噬细胞(M2)在巨噬细胞中的占比相似。

进一步地，利用上述流式细胞术检测结果，对脾细胞、外周血和肿瘤中CCR8(CD198)在白细胞亚型占比情况进行分析，结果如图21-23所示，在CCR8纯合小鼠和C57BL/6小鼠的肿瘤细胞(图21)中，CCR8在CD3+ T细胞、B细胞、NK细胞、CD4+ T细胞、CD8+ T细胞、Treg细胞、mCD25+Treg细胞、非Treg T细胞和M1型巨噬细胞中的比例差异明显，CCR8在人源化CCR8纯合小鼠的肿瘤细胞中，人CCR8(hCD198)高表达，而鼠CCR8(mCD198)几乎不表达，在C57BL/6小鼠的肿瘤细胞中，鼠CCR8高表达，而人CCR8几乎不表达；在CCR8纯合小鼠和C57BL/6小鼠的脾细胞(图22)和外周血(图23)中，CCR8在上述白细胞亚型中几乎不表达，仅在C57BL/6小鼠脾细胞的Treg细胞中有一定表达。

上述结果表明CCR8基因的人源化改造没有影响小鼠体内白细胞和T细胞的分化、发育和在脾脏、淋巴组织和外周血中的分布，并且，在肿瘤浸润Treg细胞上高表达。

实施例4 CCR8基因人源化动物模型体内药效验证

取CCR8纯合小鼠(5周龄)，皮下接种小鼠结肠癌细胞MC38，待肿瘤体积生长到约100mm³后根据随机分为对照组或治疗组(n＝6/组)。治疗组使用抗人CCR8抗体CCR8 Ab1(10mg/kg)(CCR8 Ab1序列记载于专利WO20201384891A1)进行注射治疗。对照组注射(20mg/kg)的人IgG1。给药频率为每周给药2次，共给药6次。每周测量肿瘤体积2次并称量小鼠的体重，接种后单只小鼠肿瘤体积达到3000mm³时应执行安乐死结束试验。具体的给药或给药组合、剂量、给药方式和频率如表4所示。

表4具体给药组合、剂量、给药方式和频率

分组	药物	剂量/给药方式/频率
			G1	Human IgG1	20mg/kg；腹腔注射；每周给药两次(BIW)，共给药6次
G2	CCR8 Ab1	10mg/kg；腹腔注射；每周给药两次(BIW)，共给药6次

整体来看，实验过程中各组动物健康状态良好，在实验终点时(分组后第22天)，所有治疗组和对照组小鼠体重均出现增长，且在整个实验周期内小鼠体重和体重变化均无显著区别(P>0.05)(图15、16)；但从肿瘤体积测量结果上看(图17)，对照组小鼠肿瘤在实验周期内均持续生长，而所有治疗组小鼠与对照组相比，肿瘤体积增长收到抑制和/或缩小。表明这该CCR8抗体未对动物产生明显毒性作用，安全性较好，且具有一定的体内抑制肿瘤效果。

表5中列出了各个实验的主要数据和分析结果，具体包括分组时和分组后10天时的肿瘤体积、实验结束时(分组后第22天)的肿瘤体积、小鼠存活情况、肿瘤(体积)抑制率(Tumor Growth Inhibition value，TGI_TV)以及治疗组与对照组的小鼠体重、肿瘤体积之间的统计学差异(P值)。

表5各组小鼠的肿瘤体积、肿瘤体重

从表5可见，结合图15、图16可知在实验终点时(分组后第25天)，各组动物体重均出现增长且无显著性差异(p＞0.05)，表明动物对CCR8抗体耐受良好。从肿瘤体积测量结果来看(图17)，对照组(G1)平均肿瘤体积为2226±428mm³，治疗组平均肿瘤体积分别为1191±218mm³，治疗组(G2)小鼠肿瘤体积均不同程度的小于对照组(G1)，表明抗人CCR8抗体能够抑制肿瘤生长，在CCR8小鼠体具有一定的治疗和抑制肿瘤生长能力(TGI_TV＞48.7％)。

在实验终点，收集对照组G1和治疗组G2的小鼠的肿瘤和外周血，通过流式细胞术检测外周血中淋巴细胞占比情况和肿瘤中浸润的淋巴细胞占比情况，检测CD3+细胞(特征为mCD45+mCD3+)，CD4+细胞(特征为mCD45+mCD3+mCD4+mCD8-)，CD8+细胞(特征为mCD45+mCD3+mCD4-mCD8+)，Treg细胞(特征为mCD45+mCD3+mCD4+mCD8-mFOXP3+)的百分比。检测结果如图18和19所示，肿瘤(图18)和外周血(图19)中，G2组的各类细胞数与G1组均无显著差异。

上述研究结果证明人源化CCR8动物模型可作为体内药效研究的活体模型，用于CCR8信号通路调节剂的筛选、评估和治疗实验，并可用于在动物体内评估靶向人CCR8抗体的有效性，以及评估靶向CCR8的治疗效果等。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。

另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。

此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。

序列表

<110> 百奥赛图（北京）医药科技股份有限公司

<120> CCR8基因人源化非人动物及其构建方法和应用

<130> 1

<150> CN202010953820.8

<151> 2020-09-11

<150> CN202110238621.3

<151> 2021-03-04

<150> CN202110270555.8

<151> 2021-03-12

<160> 27

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 353

<212> PRT

<213> 小鼠(Mouse)

<400> 1

Met Asp Tyr Thr Met Glu Pro Asn Val Thr Met Thr Asp Tyr Tyr Pro

1 5 10 15

Asp Phe Phe Thr Ala Pro Cys Asp Ala Glu Phe Leu Leu Arg Gly Ser

20 25 30

Met Leu Tyr Leu Ala Ile Leu Tyr Cys Val Leu Phe Val Leu Gly Leu

35 40 45

Leu Gly Asn Ser Leu Val Ile Leu Val Leu Val Gly Cys Lys Lys Leu

50 55 60

Arg Ser Ile Thr Asp Ile Tyr Leu Leu Asn Leu Ala Ala Ser Asp Leu

65 70 75 80

Leu Phe Val Leu Ser Ile Pro Phe Gln Thr His Asn Leu Leu Asp Gln

85 90 95

Trp Val Phe Gly Thr Ala Met Cys Lys Val Val Ser Gly Leu Tyr Tyr

100 105 110

Ile Gly Phe Phe Ser Ser Met Phe Phe Ile Thr Leu Met Ser Val Asp

115 120 125

Arg Tyr Leu Ala Ile Val His Ala Val Tyr Ala Ile Lys Val Arg Thr

130 135 140

Ala Ser Val Gly Thr Ala Leu Ser Leu Thr Val Trp Leu Ala Ala Val

145 150 155 160

Thr Ala Thr Ile Pro Leu Met Val Phe Tyr Gln Val Ala Ser Glu Asp

165 170 175

Gly Met Leu Gln Cys Phe Gln Phe Tyr Glu Glu Gln Ser Leu Arg Trp

180 185 190

Lys Leu Phe Thr His Phe Glu Ile Asn Ala Leu Gly Leu Leu Leu Pro

195 200 205

Phe Ala Ile Leu Leu Phe Cys Tyr Val Arg Ile Leu Gln Gln Leu Arg

210 215 220

Gly Cys Leu Asn His Asn Arg Thr Arg Ala Ile Lys Leu Val Leu Thr

225 230 235 240

Val Val Ile Val Ser Leu Leu Phe Trp Val Pro Phe Asn Val Ala Leu

245 250 255

Phe Leu Thr Ser Leu His Asp Leu His Ile Leu Asp Gly Cys Ala Thr

260 265 270

Arg Gln Arg Leu Ala Leu Ala Ile His Val Thr Glu Val Ile Ser Phe

275 280 285

Thr His Cys Cys Val Asn Pro Val Ile Tyr Ala Phe Ile Gly Glu Lys

290 295 300

Phe Lys Lys His Leu Met Asp Val Phe Gln Lys Ser Cys Ser His Ile

305 310 315 320

Phe Leu Tyr Leu Gly Arg Gln Met Pro Val Gly Ala Leu Glu Arg Gln

325 330 335

Leu Ser Ser Asn Gln Arg Ser Ser His Ser Ser Thr Leu Asp Asp Ile

340 345 350

Leu

<210> 2

<211> 355

<212> PRT

<213> 人(human)

<400> 2

Met Asp Tyr Thr Leu Asp Leu Ser Val Thr Thr Val Thr Asp Tyr Tyr

1 5 10 15

Tyr Pro Asp Ile Phe Ser Ser Pro Cys Asp Ala Glu Leu Ile Gln Thr

20 25 30

Asn Gly Lys Leu Leu Leu Ala Val Phe Tyr Cys Leu Leu Phe Val Phe

35 40 45

Ser Leu Leu Gly Asn Ser Leu Val Ile Leu Val Leu Val Val Cys Lys

50 55 60

Lys Leu Arg Ser Ile Thr Asp Val Tyr Leu Leu Asn Leu Ala Leu Ser

65 70 75 80

Asp Leu Leu Phe Val Phe Ser Phe Pro Phe Gln Thr Tyr Tyr Leu Leu

85 90 95

Asp Gln Trp Val Phe Gly Thr Val Met Cys Lys Val Val Ser Gly Phe

100 105 110

Tyr Tyr Ile Gly Phe Tyr Ser Ser Met Phe Phe Ile Thr Leu Met Ser

115 120 125

Val Asp Arg Tyr Leu Ala Val Val His Ala Val Tyr Ala Leu Lys Val

130 135 140

Arg Thr Ile Arg Met Gly Thr Thr Leu Cys Leu Ala Val Trp Leu Thr

145 150 155 160

Ala Ile Met Ala Thr Ile Pro Leu Leu Val Phe Tyr Gln Val Ala Ser

165 170 175

Glu Asp Gly Val Leu Gln Cys Tyr Ser Phe Tyr Asn Gln Gln Thr Leu

180 185 190

Lys Trp Lys Ile Phe Thr Asn Phe Lys Met Asn Ile Leu Gly Leu Leu

195 200 205

Ile Pro Phe Thr Ile Phe Met Phe Cys Tyr Ile Lys Ile Leu His Gln

210 215 220

Leu Lys Arg Cys Gln Asn His Asn Lys Thr Lys Ala Ile Arg Leu Val

225 230 235 240

Leu Ile Val Val Ile Ala Ser Leu Leu Phe Trp Val Pro Phe Asn Val

245 250 255

Val Leu Phe Leu Thr Ser Leu His Ser Met His Ile Leu Asp Gly Cys

260 265 270

Ser Ile Ser Gln Gln Leu Thr Tyr Ala Thr His Val Thr Glu Ile Ile

275 280 285

Ser Phe Thr His Cys Cys Val Asn Pro Val Ile Tyr Ala Phe Val Gly

290 295 300

Glu Lys Phe Lys Lys His Leu Ser Glu Ile Phe Gln Lys Ser Cys Ser

305 310 315 320

Gln Ile Phe Asn Tyr Leu Gly Arg Gln Met Pro Arg Glu Ser Cys Glu

325 330 335

Lys Ser Ser Ser Cys Gln Gln His Ser Ser Arg Ser Ser Ser Val Asp

340 345 350

Tyr Ile Leu

355

<210> 3

<211> 5236

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

acactcaacc ttgttgtctt gtggttgtat cttcaatgat atgtggcaat atccctataa 60

acagcacttt ccctgggctg atctgtcaga ccttctgtaa cttatgtggg aaattaaact 120

gattagatgg caaagacttt tctgataggt tcgttctact attgataata caagagcttt 180

tagttaaatt ttatttattt atctctgtat gagcttttgt taaatacagg tttccatgtg 240

caaactcttg taagcaaatg ctaggagatt tgtagttgga agtgagagtg ttactgtaaa 300

taacaaacag aggtctactc caaagaaaag cagtgttgat ttgaaaagag tgcaatgtta 360

caacgtgcag cgagattcac agtaaccacc agtttataca atgagcatgg agcatggcaa 420

atccagaaac acaaaaatga aggttgagta agatactgag aaacagtatc cctggcctcg 480

aggattaatc caaatgttgc cagtctgagg ctgaggccat agtggaggga aagctgtccc 540

agagatgttt tctttgtaag gttgtggggg cattgtgtgg ggtgtggttt ggacagtggt 600

ttgttagcaa ggtttatttt atttaaggct acagagacaa ggcggggatt aagaaggctg 660

ttgctcttgc agaggcccca aggttaattc ccagcactca catggtggct cataactcca 720

gcttcagggc atcctatgcc ctctactggc ttctgtgggc actgcataca tgtgacattt 780

actctcgtac acaaatgtag agataaaaat aaaactgcat cccttattaa aagagtttat 840

ttgcgtgtga tgcgcaccca tgcgcgcgtg tttgcttatc tgagtggtcc tgtagaggtc 900

agtagaggca ggatgcatca gtctctgcct cctcctgaaa cagaggctct cacagaactc 960

atgatttctg tgatcggctg gactctagca aacctagaac cctgtcatct ttgctcttct 1020

tagagctggg gttacaagct tttgcaggaa cgtcggcttg ttacacaggt gctgggaacc 1080

aaattctggt cctcatgatt tataagggag tactcttcac tgctgagccg ttctttctat 1140

ctgtggcaga agttctgtgt cagtgccttt gggagtatgt gagaaccctt ccaatgcaac 1200

ctcatggttc atttgtttgt tcctcctttc ttggttcatt cattcattaa ttcttttttt 1260

tccccccatc cttcttcctc aggtggttct aacatgcctt gctttcaaag atttaaagat 1320

tttaaagatt tatttcgtgt gaacaggtct tttgcctgag tgtctgtctg tgcaccacat 1380

gcgtgctggg tactggagaa ggccagaaga gggcatagca tctcctaaac tggatttaaa 1440

gccagttgtg tgttgccagc cacgtggggg ctgggaatga acccaggtgc tttggaagca 1500

gagcagccgg tgacactctt acttgtggag ccactctccg gctcctttat gtcacatttg 1560

ggtcacacaa gccactccat ctcagttctg agaattttca taacagataa tcctaaaaga 1620

gttttttcta atgtcatctg tcttttagtt ttaatgcagg ttaataagag gggccccctg 1680

agctgtgctt caggaagctt cagtgtaggc tctggcctta ccaccaaata gctgtgtgtg 1740

tgtgtgtgtg tatgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tatgagagcg tgtgtgtgtg 1800

tactcgagtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgag agagagagag agagagagag agagagtgtg 1860

tgactgtgtg tgtgtatgtg tgtgactgtg tgattgtgtg tgtgtgcacg cccttgcccc 1920

tgtgtttctg tatgtgtgta ctttgcctgc ccagtctctc cccattgtgc tgtgatactg 1980

gagtgattca tttcacgtcc atggaactaa acattcagaa cgaaagaggt tgagtgtgag 2040

agaaagacag actggcaggc tgtcttagtt agggttttat tgctgtgaac agacaccatg 2100

accaaggcaa ctcttataag gacaacactt agtaggggct ggcttactgg gtcagaggtt 2160

cagtccatta tcatcatggt gggaagcatg gcagcatcca ggcaggcatg gtgcatgagc 2220

tgagatttct acatcttcat ctgaaggctg ctagtggaag actcacttcc aggcagctag 2280

gatgagggcc ttaaagccca cactcacagt gaatgacaca cctactccaa caaggccaca 2340

cctctcaata gtaccactcc ctgggccaag catataaaaa ccatcacaaa gtcatggata 2400

gatcccaaga cagtaattcc agtattcagg aggcagagtc aggcagacct ctaagtgcta 2460

ggccagccta gtctacatag ggaagtccag gctagcttaa tctacacaga ggggactaac 2520

acacagggag aggacagatt tgtgagtggc cctgctgggc aggggtggca gccagttgtc 2580

tctgacctgg cacatcaccg atggagttgg attcatactt tccattaccc cgacgagcat 2640

cagcagcacc tgagagtccg ctgttcacag tcagctcggc actgacattt tcttatcgct 2700

attctgtctt aaaggccggg gcttgcccca agctctgtta aaacctcttg gtgaggagaa 2760

tcataggcat gatctgaggt gtcagagatg cttctaaatg ataaactcac tcgttgtcag 2820

aagacagatt cacgggtcac agagcagaag ctgagaggaa catgctgtca cctgaatagt 2880

gagtgtccaa gtgccgaggc cagagagggg aacacatgcc tgcagctcta gttcccaggg 2940

aggcagagtt atgtggctcc ctggggctca ctggtaacca acctagccca tttcaggaga 3000

cccaaactag agagagacca catcaaaaca acagaagcaa atggtaagag acactaagag 3060

caaacgttct gctgagcagc agtggtgtac gcctttaatc ccagtattcc agaggcctag 3120

gcaggtggct ctcggagttc aaggccagcc tgctctacag aatgagttct aagacagcca 3180

ctgttctgca gagaaaccct gttttgaaca acaaaacaaa caaacaagca aacaaacaaa 3240

caggaactaa gagtagatgg acagattccc tcccatacca ccatccagag gaaaggtgat 3300

gccccctgct tatctctgcc ccagatctga ggtgaaaaga caggaagaag gtactgagag 3360

tcaaggagcc ctggttgcat agcacgctgt tccattgctc tggagacagg gtgggtctgt 3420

cccaaacagc agaggggttg gggctgtaag tcagaggtag ctcttactgt tccaaccttt 3480

ggattggctg aggcatggca tatagctgaa gtgctcagga ggaggagtca gcacagcaag 3540

cagacatgtg gcagaggagt gggcagctct gaaacctcag aagaaaggct cgctcagata 3600

attggtaaga atcatccttg gggttagggc tcagaggcag tgcgggcacc gttttcatct 3660

ccttacagag agatcaggag aaggctgata tttcgggatc ataagagttt tgagtgtctc 3720

caaagcctga gcccacaagc gcgtgtgtct cttggtggct gataggagca tgtcccttgt 3780

tctccaggac acagaaaggg ctgaaagctc tcacaggagt aaaaaaatta gacaagacag 3840

cattttctgg cgatcatcct ttctccacag aaaacttcca ttcaatccca cctccttgta 3900

tgtctgtcaa tggagtctta gactctgcat tgtgtggggt gtggggaacg ggacctagga 3960

cctggctcgg gtcctaagca tgtgctgtgc ccccaggccc tgtaatgttt tatttcgtgg 4020

tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgagaata tgtgagtgtg cgcatgtaca 4080

ggaggtcaga ggccagcctt ggtgctatgt ttcaggcgct ctcccctcgc tttgtgctca 4140

ccaagcaggc caggctggcc agggccacgg agctctgcct gtctctgcct cccctgcgtg 4200

ggcattgcga gcacacactg ccacgcatgg gtttaggggt ttgaactgag gtctccatgg 4260

ttgcttagca agcacctcgc ttacggagat atcccctcag ccccagtgtt tgacacgact 4320

gaattccagc ctttaccagg cttacctctg gcgaacccgg tgcttctcgt tttgagagga 4380

attgggatca tttttttttc ctattgcact ttaaatcgtt ttgagggggg ggggttatgg 4440

aagcaatgag tgaatgaact aaattcaaga atatcatagg atacatccga agcaaaatac 4500

aaaatgagac atcatatatg cagcatagga atgagtaagc aaatgttgtc tgttgaatac 4560

atatatactt tgtttgtttg agacagggct tctctgtgta gccctggctg tcctggaacc 4620

cactctgtag accaagctag cctcaaactc agagagccac cctcttctgc ctcccaagtg 4680

ctgggactaa agatgtgtat caacacacct ggcctgtatt ttgtttgtgg atccataaaa 4740

tgaaagagaa accaggcaga gtggcgcgtg cttttcatcc cagcacctgg gaagcagagg 4800

caggtgaatc tctgggagtt tgaggtcagc ttggtctata tagtaagttc caggacaact 4860

agggctatat agtgagacta tctaaaaata ccaaaattga ctaattacaa tgggggggtg 4920

ggggagagag agagagagag agaggccaag caaggtggta cagatctgta atacctccac 4980

tgagaaggct gaggcaggag gatcatgagt agtctgggct atgtagcaag ttccatacca 5040

gcccaaacca cttagtgaga ccttgtatga aggaagcaag gtctagggag aacagcttga 5100

tgggagagcg cttgccgcac actaacaccc tgacattgag ccgcagggag aaaggggagg 5160

tgtttaaggg cttcaatctg tgaatacagc cctcagcacc tctcacgtgc ctgcttgacc 5220

aggtcttcct gcctcg 5236

<210> 4

<211> 3851

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ctgagaactg gacccagggg ctggagagat ggctcagtgg ttaagagcac cgactgctct 60

tccgaaggtc ctgagttcaa atcccagcaa ccacatggtg gctcacaacc atccataatg 120

agatctgacg ccctcttctg gtgcgtctga agatagctac agcgtactta gatataataa 180

taaataaatc ttaggaaaaa aaaaaagaaa aaaaaaaaga gaactggacc cagttctcag 240

cacccacatg gtggttcaaa ccatctgcaa ctccagtttc aggggatctg gcgtccccgt 300

ctggttctgt ggactctagg aacacatata gggagcatac ataactgcag gcaaaacact 360

tatacacata gaatagagta aaataaaatc tattctctga aatggtaaaa aaaaaaaggt 420

atttgtgtga aaaaatggca ttacttgctc tttgaaggtt tgatacaact tattaataaa 480

ccaatccagg gtacttctgt acaaagattt gcatttaatt accaaatgga agcgttcagc 540

ctttttatct gcttgtggtt tgtaagaaat tctgctattc tccttaagtt cacaagtaca 600

tgagtacgaa ttcttgacaa ttaattttgt tgaacaatct ttttgtagta tgagggtgtc 660

cctttctggt cctgatactg atcattgtgg ctcccccccc cacccccgtc tcctcctccc 720

ctccctccct cccctctcct agatcagttt tgtaggactt atctgttgct taaatctctg 780

catcgagcca gcctttggcc tcgctgactt cctgtctcct ctgctcgttg atttctgttt 840

ttattttcat ttcacctatt tgctttgagc ctggttttta tatgggctcc tggaatcgtc 900

tattgtctca gtattcactt ggggtgcatt ttacacattt taagtttggt cttagccaga 960

agtctgagaa gtagtcgtct actcctgcct tagccactgt tctactgctg tgaagagacg 1020

ccgtggctaa agcaacttat agaagaagac atttaactgg gggcttgttc aaagcttcag 1080

agggtttatc accatggcgg ggagcagggt ggcaggcagg gaggcatggt gagagaagca 1140

gctaggagct ttccatcctg atccacagcc aggagagaga gagagagaga gagagagaga 1200

gagagagaga gagacagaga cagagacaga gacacagagg agagacacag agagacagag 1260

agacagagag agacagagag acagcgcttc ttcaacaagg caacacacct tctaatcctt 1320

ttcaacactt caccaccaac tgggggctaa gtatgcaaat atatgagcct atggggctca 1380

cttaaaccac cacaaccagc agaaatgtta ttatatcaag aattcaaatt attctggaaa 1440

gtaaagaaga attcataaca ttgagaagaa aaaaaccacg acaacttcat acagtattta 1500

cttacactct tctcagagaa catacacata gggttttatt cctttaagat atatcaagaa 1560

ttattttatg atgcaagaca tggtttccat tcacccgtga aggtaacagg ttgcttctgc 1620

aggtagctag tcacgcagtt cgaggcttct gtgttctcgc tctttttctg attttttttt 1680

cctttctgca gctatcttgt tgcttttgtg aatcggggag tttaatgagg gttgctttca 1740

gaggtctgtg ggtgaagagc gttttgcagg aacaagagca actaccactg gtcacatcac 1800

tgaagaaaat gtctgcccac taagactttt gtactcttta tttgtttaaa acaactttta 1860

tttttatttt tatttttatt tattttttat ttttggtttt ttgagacaag gtttctctgt 1920

atagccctgg ctgtcctgga actcactttg ttgaccaagc tggcctcgaa ctcccaagta 1980

ctgggactaa aagtgtgtgc cgccaccacc cggcacaact gttatcttat tttttttttt 2040

taaatgtgat ttattatgag tgtagagatc agatcagagg acaacttgca agagttggcc 2100

ctgtcttccc agcgcatggg tctcagggat ggagtccagg caccttcccc tttgagcggc 2160

tgcacaggct gaatccttgg tgatttcccc ctggttgttt atcccatgag tcgataggag 2220

aggcactgca aaacacccaa ctctgattat ggcttattta ttttccattt taattctgtt 2280

tgtttttact gtatgttttg aagctgtttt tttttttaag atttttttat ttatatgagt 2340

actttgtagc tgtcttcaga cacaccagaa gaaggcatcg gatcccacta cagatggttg 2400

tgagccacca tgtggttgct gggaattgaa ctcaggacct ctggaagagc agttggtgtt 2460

cttaaccact gagccatctc tccagccact gaagctgtta ttagtatgga caaataaaga 2520

attgttctgc atgtttttaa accaaatagc ctcttttgtt attatgaaat ttcctttgtg 2580

ttctttttga gaggtaagta ggtgggtttg agacaggatc tatctatata gccctagcta 2640

tcctggaact cactgtgtag tccaggctag ccttgaactc acagagctcc acatacctct 2700

gccttcagag tgctaggatt aaaagcacga gtcaccatgt ctggccgaat aaatatttct 2760

acaaagcaag tttgaggtta gcctaggata cagaagaccc tgttcccccc cacacaaaaa 2820

aaaagtttaa ggaaagataa aattatttat tgttatggca agaggttgcc aagttggaat 2880

cttagagtag gatgttgccg aagccacagg ctcatagctc atcagttgta tcagctagca 2940

aggccaccat cttcctcaca gtctccatgc ttctctgact gaaccttgca agcacccagt 3000

gggcaacatg ctgtgtgggg tgggacaggc aactctgcag tgtgtgtgag acatggggag 3060

tggagagggg cttcctccga catttttcaa gactgtcagc ttccaggagt cctgctcaga 3120

tggttcttat ttagcaagag tcactcgggc atcttgagtc acactaagct ttctgatggg 3180

gcaaggacct gacttggtcc agctgcatcc cttacagctg gcctcaggta agctctctga 3240

actccaagag gccgtgggta agagggggtg gagtgagcgg agacagaggg accatctgtc 3300

ctgcctgccc acacagctgc ctgatatcct tacagaaccc gtcaactccc ttcatacatt 3360

taaacgaaaa atcttagtaa cgtgatgaaa taaacagcgg acaggttagg acttgtttgt 3420

ttgtttgtgc gtttgtttgt tttcttttgg ttatcacact tggggtaact gatataactg 3480

tttgctgctt ccaattcctt acccattaaa ggggactggg aatgaagcta gaaccgggtg 3540

aggaattggt tagaaccagg aagttgtgct ctatcgccac ctgctgttca ctgtctagcg 3600

gtaccaccag ctgcccacag ttgcaaagaa ctggaattcc ctgatgcttt gggttcatct 3660

ggcaaacccg catttggact atgtgattga atgcacatta acaagcaagc aggtaaacac 3720

ttgcaacagt ggggtacagt tgggatcccc tgcctgtctt gctcattgcc acatcccggg 3780

tcccagctgt tgtgtacttg ctgggtggat tgagaagcta gcccctgaag atcatgagaa 3840

ccagggagaa c 3851

<210> 5

<211> 1068

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

atggattata cacttgacct cagtgtgaca acagtgaccg actactacta ccctgatatc 60

ttctcaagcc cctgtgatgc ggaacttatt cagacaaatg gcaagttgct ccttgctgtc 120

ttttattgcc tcctgtttgt attcagtctt ctgggaaaca gcctggtcat cctggtcctt 180

gtggtctgca agaagctgag gagcatcaca gatgtatacc tcttgaacct ggccctgtct 240

gacctgcttt ttgtcttctc cttccccttt cagacctact atctgctgga ccagtgggtg 300

tttgggactg taatgtgcaa agtggtgtct ggcttttatt acattggctt ctacagcagc 360

atgtttttca tcaccctcat gagtgtggac aggtacctgg ctgttgtcca tgccgtgtat 420

gccctaaagg tgaggacgat caggatgggc acaacgctgt gcctggcagt atggctaacc 480

gccattatgg ctaccatccc attgctagtg ttttaccaag tggcctctga agatggtgtt 540

ctacagtgtt attcatttta caatcaacag actttgaagt ggaagatctt caccaacttc 600

aaaatgaaca ttttaggctt gttgatccca ttcaccatct ttatgttctg ctacattaaa 660

atcctgcacc agctgaagag gtgtcaaaac cacaacaaga ccaaggccat caggttggtg 720

ctcattgtgg tcattgcatc tttacttttc tgggtcccat tcaacgtggt tcttttcctc 780

acttccttgc acagtatgca catcttggat ggatgtagca taagccaaca gctgacttat 840

gccacccatg tcacagaaat catttccttt actcactgct gtgtgaaccc tgttatctat 900

gcttttgttg gggagaagtt caagaaacac ctctcagaaa tatttcagaa aagttgcagc 960

caaatcttca actacctagg aagacaaatg cctagggaga gctgtgaaaa gtcatcatcc 1020

tgccagcagc actcctcccg ttcctccagc gtagactaca ttttgtga 1068

<210> 6

<211> 80

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

acctctcacg tgcctgcttg accaggtctt cctgcctcga tggattatac acttgacctc 60

agtgtgacaa cagtgaccga 80

<210> 7

<211> 81

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ctcctcccgt tcctccagcg tagactacat tttgtgaggg gagtgtgcag ggcaggcaga 60

ctccacctgc attgcccttc c 81

<210> 8

<211> 88

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

agatggctct gcagctaaag gcacttgttc ttactaagct tgatatcgaa ttccgaagtt 60

cctattctct agaaagtata ggaacttc 88

<210> 9

<211> 113

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

gaagttccta ttctctagaa agtataggaa cttcatcagt caggtacata attaggtgga 60

tccactagtt ctagactgag aactggaccc aggggctgga gagatggctc agt 113

<210> 10

<211> 1162

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

tggcagagga gtgggcagct ctgaaacctc agaagaaagg ctcgctcaga taattggtct 60

tcctgcctcg atggattata cacttgacct cagtgtgaca acagtgaccg actactacta 120

ccctgatatc ttctcaagcc cctgtgatgc ggaacttatt cagacaaatg gcaagttgct 180

ccttgctgtc ttttattgcc tcctgtttgt attcagtctt ctgggaaaca gcctggtcat 240

cctggtcctt gtggtctgca agaagctgag gagcatcaca gatgtatacc tcttgaacct 300

ggccctgtct gacctgcttt ttgtcttctc cttccccttt cagacctact atctgctgga 360

ccagtgggtg tttgggactg taatgtgcaa agtggtgtct ggcttttatt acattggctt 420

ctacagcagc atgtttttca tcaccctcat gagtgtggac aggtacctgg ctgttgtcca 480

tgccgtgtat gccctaaagg tgaggacgat caggatgggc acaacgctgt gcctggcagt 540

atggctaacc gccattatgg ctaccatccc attgctagtg ttttaccaag tggcctctga 600

agatggtgtt ctacagtgtt attcatttta caatcaacag actttgaagt ggaagatctt 660

caccaacttc aaaatgaaca ttttaggctt gttgatccca ttcaccatct ttatgttctg 720

ctacattaaa atcctgcacc agctgaagag gtgtcaaaac cacaacaaga ccaaggccat 780

caggttggtg ctcattgtgg tcattgcatc tttacttttc tgggtcccat tcaacgtggt 840

tcttttcctc acttccttgc acagtatgca catcttggat ggatgtagca taagccaaca 900

gctgacttat gccacccatg tcacagaaat catttccttt actcactgct gtgtgaaccc 960

tgttatctat gcttttgttg gggagaagtt caagaaacac ctctcagaaa tatttcagaa 1020

aagttgcagc caaatcttca actacctagg aagacaaatg cctagggaga gctgtgaaaa 1080

gtcatcatcc tgccagcagc actcctcccg ttcctccagc gtagactaca ttttgtgagg 1140

ggagtgtgca gggcaggcag ac 1162

<210> 11

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

tgctagtgga agacagactt ccag 24

<210> 12

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

cagcaaggag caacttgcca tttg 24

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

gctcgactag agcttgcgga 20

<210> 14

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

ctcacgagcc atctgaaacc ctgtt 25

<210> 15

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

ctgctctcac accatcctga ctgag 25

<210> 16

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

tctcactgaa cttagagcca tctgtga 27

<210> 17

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

ctcagccagt cacccatttc aaaaagc 27

<210> 18

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

gtctccaccg tgtcctctac atcctg 26

<210> 19

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

ggatcggcca ttgaacaaga t 21

<210> 20

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

cagaagaact cgtcaagaag gc 22

<210> 21

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

acactaacac cctgacattg agccg 25

<210> 22

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

gatggtggct gtgacagcag cc 22

<210> 23

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

cagcaaggag caacttgcca tttg 24

<210> 24

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

tcagcctcct gaacgctgga cca 23

<210> 25

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

tagctatctt cagacgcacc ag 22

<210> 26

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

gacaagcgtt agtaggcaca tatac 25

<210> 27

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 27

gctccaattt cccacaacat tagt 24

Claims (18)

1.一种人源化CCR8基因，其特征在于，所述的人源化CCR8基因包含人CCR8基因的部分。

2.根据权利要求1所述的人源化CCR8基因，其特征在于，所述的人源化CCR8基因包含人CCR8基因的1号外显子至2号外显子的全部或部分，优选的，所述的人源化CCR8基因包含人CCR8基因的2号外显子的全部或部分，其中，2号外显子的部分至少包含200bp的核苷酸序列。

3.根据权利要求1或2所述的人源化CCR8基因，其特征在于，所述的人源化CCR8基因中包含下列组中的一种：

(A)包含SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6和/或SEQ ID NO:7所示核苷酸序列的全部或部分；

(B)包含与SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6和/或SEQ ID NO:7所示核苷酸序列的同一性至少为70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的核苷酸序列；

(C)包含与SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6和/或SEQ ID NO:7所示核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸的核苷酸序列；

(D)具有SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6和/或SEQ ID NO:7所示核苷酸序列的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。

4.根据权利要求1-3任一所述的人源化CCR8基因，其特征在于，所述的人源化CCR8基因转录的mRNA包含下列组中的一种：

(a)包含SEQ ID NO:10所示核苷酸序列的全部或部分；

(b)包含与SEQ ID NO:10所示核苷酸序列的同一性至少为70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的核苷酸序列；

(c)包含与SEQ ID NO:10所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸的核苷酸序列；或

(d)包含SEQ ID NO:10所示的核苷酸序列，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。

5.一种人源化CCR8蛋白，其特征在于，所述人源化CCR8蛋白是由权利要求1-4任一所述的人源化CCR8基因编码的。

6.一种靶向载体，其特征在于，所述的靶向载体包含人CCR8基因的部分，优选的，所述的人CCR8基因的部分包含人CCR8基因的1号至2号外显子的全部或部分；优选的，所述的人CCR8基因的部分包含人CCR8基因的2号外显子的全部或部分，其中，2号外显子的部分至少包含200bp的核苷酸序列，优选的，所述的靶向载体包含编码SEQ ID NO:2的核苷酸序列，进一步优选的，包含SEQ ID NO:5所示核苷酸序列。

7.根据权利要求6所述的靶向载体，其特征在于，所述的靶向载体还包含5’臂，其选自非人动物CCR8基因基因组DNA的100-10000个长度的核苷酸；优选的，所述的5’臂与NCBI登录号为NC_000075.6至少具有90％同源性的核苷酸；进一步优选的，所述5’臂序列与SEQ IDNO:3至少具有90％同源性，或者如SEQ ID NO:3所示；和/或，所述的靶向载体还包含3’臂，其选自非人动物CCR8基因基因组DNA的100-10000个长度的核苷酸；优选的，所述的3’臂与NCBI登录号为NC_000075.6至少具有90％同源性的核苷酸；进一步优选的，所述的3’臂序列与SEQ ID NO:4至少具有90％同源性，或者如SEQ ID NO:4所示。

8.一种CCR8基因人源化的非人动物的构建方法，其特征在于，所述的非人动物体内表达人或人源化CCR8蛋白，所述的非人动物基因组包含人或人源化CCR8基因。

9.根据权利要求8所述的构建方法，其特征在于，所述的人源化CCR8蛋白包含人CCR8蛋白的全部或部分，优选的，所述的人源化CCR8蛋白包含人CCR8蛋白的跨膜区、胞质区和/或胞外区的全部或部分。

10.根据权利要求8或9所述的构建方法，其特征在于，所述的人源化CCR8蛋白的氨基酸序列包含下列组中的一种：

A)包含SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的全部或部分；

B)包含SEQ ID NO:2所示氨基酸序列同一性至少为70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的氨基酸序列；

C)包含SEQ ID NO:2所示所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸的氨基酸序列；或

D)包含SEQ ID NO:2所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。

11.根据权利要求8-10任一所述的构建方法，其特征在于，所述的人源化CCR8基因为权利要求1-4任一所述的人源化CCR8基因。

12.根据权利要求8-11任一所述的构建方法，其特征在于，所述的构建方法包括用包含人CCR8基因的部分导入非人动物CCR8基因座；优选的，用包含人CCR8基因的1号至2号外显子的全部或部分导入非人动物CCR8基因座，进一步优选的，用包含人CCR8基因的2号外显子的全部或部分导入非人动物CCR8基因座，其中，2号外显子的部分至少包含200bp的核苷酸序列，进一步优选的，用包含SEQ ID NO:5的核苷酸序列导入非人动物CCR8基因座，

任选地，所述的构建方法包括将人CCR8基因的部分导入非人动物CCR8基因的2号外显子。

13.根据权利要求8-12任一所述的构建方法，其特征在于，所述人或人源化CCR8基因的核苷酸序列可操作地连接到至少一条染色体中内源性CCR8基因座处的内源调控元件。

14.根据权利要求8-13任一所述的构建方法，其特征在于，所述的非人动物基因组中还包含其他基因修饰。

15.根据权利要求14所述的构建方法，其特征在于，所述的其他基因包含PD-1、PD-L1、CTLA4、B7H3、B7H4、CD47、IL2、IL23A和CCR2基因中的至少一种。

16.根据权利要求14或15任一所述的构建方法，其特征在于，所述的人源化CCR8基因和/或所述其他基因对于被替换的内源基因座是纯合或者杂合。

17.一种细胞、组织或器官，其特征在于，所述组织或器官或其培养物来源于权利要求8-16任一所述的构建方法获得的非人动物，所述的细胞、组织或者器官包含权利要求1-4任一所述的人源化CCR8基因或表达权利要求5所述的人源化CCR8蛋白。

18.来源于权利要求1-4任一所述的人源化CCR8基因、权利要求5所述的人源化CCR8蛋白、权利要求8-16任一所述的构建方法获得的非人动物或权利要求17所述的细胞、组织或器官的应用，所述应用包括：

在需要涉及人类细胞的免疫过程的产品开发，制造抗体，或者作为药理学、免疫学、微生物学、医学研究的模型系统中的应用；

在生产和利用动物实验疾病模型，用于开发新的诊断策略和/或治疗策略中的应用；

或者，

在筛选、验证、评价或研究CCR8功能、人CCR8信号机理、靶向人的抗体、靶向人的药物、药效，免疫相关疾病药物以及抗肿瘤或抗炎症药物，开发和测试治疗性抗体和其它相关生物大分子药物，筛选和评估人用药及药效研究方面的应用。

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