CN111088287A - 一种her2基因人源化小鼠肿瘤细胞模型、构建方法以及用途 - Google Patents

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Abstract

本发明属于动物细胞基因工程和基因遗传修饰领域，具体涉及一种HER2基因人源化小鼠肿瘤细胞模型的构建方法及其应用，本发明将采用CRISPR技术敲除小鼠HER2基因，同时利用慢病毒感染将人源化HER2基因插入到小鼠乳腺癌细胞4T1中。本发明构建的HER2人源化小鼠乳腺癌人源化肿瘤模型不仅可用于抗体肿瘤药效的评估，对药物开发的临床效果有着重要的指导意义。同时也是抗人HER2抗体药物安全性评价的理想模型，对HER2抗体药物&HER 2‑CAR T、HER 2‑CAR NK免疫细胞疗法的毒理学进行临床前体内评价，填补了市场空白。

Description

一种HER2基因人源化小鼠肿瘤细胞模型、构建方法以及用途
技术领域
本发明属于动物基因工程和基因遗传修饰技术领域，涉及基于CRISPR/Cas9技术的muHER2基因人源化动物肿瘤细胞模型的构建方法及其在生物医药的应用。
背景技术
HER2 又称之为 CerbB-2，中文名为人表皮生长因子受体-2。大约有 15-20% 的乳腺癌患者为Her-2阳性，即 Her-2 基因异常扩增，它是这种类型乳腺癌的发病原因之一。有研究证明 Her-2 阳性，表示该患者的癌细胞恶性程度较高，生存期较其他类型短。
乳腺癌目前是中国女性发病率第1位的恶性肿瘤，严重威胁着患者的健康。HER2阳性乳腺癌约占侵袭性乳腺癌的20%～30%，与肿瘤的高侵袭性、高复发风险、进展快速及不良预后相关。大量针对HER2靶点抗体药物、CAR T、CAR NK等的研发及临床应用，改变了这部分患者的预后。
HER2基因是原癌基因，位于人类第17号染色体长臂（17q21-q22），又称ErbB2，属于ERB家族中的一员，其他成员还包括ErbB1（EGFR）、ErbB3（HER3）和ErbB4（HER4），这个家族在许多正常和异常表皮细胞的生长、分化和转移过程中起着重要的调控作用，许多肿瘤的发生、发展和病情轻重与其活性大小密切相关。而HER2受体由胞外配体结合域（ECD）、亲脂的跨膜域（TMD）和带有调节羧基末端片段的胞内域（ICD）构成。HER2至今仍未发现高亲和力配体，必须与家族其他成员组成同源或异源二聚体，受体二聚化后构象发生改变，并与ATP结合激活胞内的酪氨酸激酶活性，为多种下游分子提供停泊位点，从而启动下游信号传导通路，继而传导入细胞核，激活核内一系列转录因子，在转录水平调控、合成供细胞生长、增殖、分化所需蛋白质，但许多肿瘤的发生、发展和病情轻重也与HER2活性大小密切相关，近几年大量针对HER2靶点抗体药物、CAR T、CAR NK等的研发及临床应用，使肿瘤患者看到了希望。
但复杂的生物过程通常需要进行体内分析，而人体内生物学的研究受到道德和技术的严重限制，因此越来越需要小鼠肿瘤细胞模型来进行人体细胞、组织和器官的体内研究。目前，科学家们已经开发了多种人源化小鼠肿瘤细胞来克服这些限制，并且现在已经成为人体细胞和组织体内研究的重要工具。
在临床药物的研发过程中，小鼠被广泛用于候选药物临床前的安全性及有效性评价，如新型抗病毒药物的体内有效性评价、肿瘤的免疫治疗和开发新型的化学治疗药物、新型抗自身免疫病药物的治疗效果、药物体内代谢和肝毒性、人源抗体的前期开发评估等。因此，在不改变小鼠免疫系统的前提下，构建人源化小鼠肿瘤细胞模型具有重要的意义，可以更好的反应预期临床数据。
HER2免疫检查点抑制剂突破了黑色素瘤的瓶颈，Ipilimumab(Yervoy)是靶向作用于HER2的全人源化单克隆抗体，于2011年被FDA批准治疗转移性黑色素瘤。临床前及临床试验结果表明，使用HER2抑制剂+PD1抑制剂的联合治疗时，黑色素瘤疗效高达75％(HER2抑制剂是30％，PD1是45％)。Ipilimumab在肺癌治疗中的临床试验中，与化疗药物紫杉醇/卡铂联合使用，用于NSCLC试验，毒副反应可很好的耐受。同时，目前有多个Ipilimumab联合其他免疫检查点或小分子化药等的临床正在推进，如Ipilimumab与PD-1抑制剂Opdivo(nivolumab)已合并用于黑色素瘤治疗。
Ipilimumab作为肿瘤免疫治疗先驱，开启了免疫治疗的先河。但同时，伴随着严重的临床毒副作用导致了临床试验的紧急叫停，Ipilimumab治疗的患者一半以上产生了3-4级严重的副作用，导致皮肤、垂体和肠道毒性反应，限制了抗人HER2抗体的研发与应用。尤其在免疫联合治疗的潮流下，Ipilimumab与其他靶点药物(如PD-1抗体Nivolumab)强强联合是未来的趋势，如何提高抗HER2抗体在肿瘤免疫治疗中的效果，并减少其诱发的免疫副作用，成一个亟待解决的课题。
利用基因改造技术，将小鼠肿瘤细胞模型muHER2基因的胞外区进行人源化，保留胞内区及跨膜区序列，构建人源化小鼠肿瘤细胞，具有可直接进行人hsHER2抑制剂的评价、小鼠自身免疫系统不受影响、因小鼠近交系特点实验数据高重复性的特点。利用HER2人源化的小鼠肿瘤细胞模型，可以有效的评价抗人HER2抗体及CAR T调动免疫系统对人源化肿瘤细胞的杀伤；模拟临床上Ipilimumab单用及联用造成的各个脏器的免疫副作用，可以用于评估抗人HER2抗体及CAR T的安全性。
因此，HER2人源化小鼠肿瘤细胞模型（4T1-huHER2）可以有效地推动抗体药物从体外筛选到临床试验的进程，并为药物临床前试验提供充足有力的数据(抗肿瘤药效分析及验证、免疫治疗与小分子药物、免疫治疗抗体药物与化疗联合用药的药效评价等)。综上所述，建立一种HER2基因人源化小鼠肿瘤细胞模型的构建方法非常必要。
发明内容
本发明的目的在于提供一种HER2基因人源化小鼠肿瘤细胞模型的构建方法；可用于建立抗人HER2抗体临床前筛选的HER2人源化小鼠肿瘤细胞模型及药效评价平台。
本发明的目的还在于提供一种HER2基因修饰人源化小鼠肿瘤细胞模型的应用。
本发明的第一个方面，提供了：
一种HER2基因人源化小鼠肿瘤细胞的构建方法，包括如下步骤：
第1步，确定HER2人源序列以及所述HER2人源序列在小鼠细胞模型HER2基因中的替换区域；
所述小鼠细胞模型HER2基因的胞外区替换为所述HER2人源序列，而胞内区保留小鼠细胞模型的原有序列；
第2步，在人源化替换区域设计并验证针对小鼠细胞模型序列的sgRNA；
第3步，设计并构建携带所述HER2人源序列的人源化载体；
第4步，将Cas9-sgRNA载体导入小鼠细胞中，对小鼠细胞模型HER2基因敲除，获得HER2基因敲除的细胞；
第5步，构建含有人源化HER2基因的载体，通过病毒包装过程将人源化的HER2基因包装到慢病毒中，经侵染敲除鼠源HER2的细胞，使小鼠细胞模型表达含有人源HER2基因的胞外区序列。
在一个实施方式中，HER2人源序列如SEQ ID NO.8所示。
在一个实施方式中，针对小鼠细胞模型序列的sgRNA的序列如SEQ ID NO.2或者SEQ ID NO.3所示。
在一个实施方式中，第3步中人源化打靶载体的构建方法包括：使用BsmbI酶切LentiCRISPR V2质粒，再将产物与sgRNA连接，转化至感受态细胞中。
在一个实施方式中，含有人源HER2基因的载体的构建方法是：将含有HER2人源胞外区、HER2鼠源跨膜区和胞内区的序列插入至pLVX慢病毒包装载体中，再包装至慢病毒中获得。
在一个实施方式中，人源胞外区的序列如SEQ ID NO.9所示。
本发明的第二个方面，提供了：
由上述方法构建得到的HER2基因人源化小鼠肿瘤细胞。
本发明的第三个方面，提供了：
上述的肿瘤细胞在用于制备肿瘤疾病研究的模型中的应用。
在一个实施方式中，肿瘤疾病研究的模型是指以人HER2为靶点的CAR T、CAR NK、抗体药的靶细胞。
有益效果
本发明方法构建的HER2人源化小鼠肿瘤细胞，将小鼠HER2基因的胞外区替换为人源序列，而胞内区则保留完整的鼠源序列。制作成功的人源化小鼠肿瘤细胞模型拥有人源胞外区，可筛选人源免疫检查点药物(如抗体药；CAR T、CAR NK等)；而鼠源胞内区则保证其胞内信号传导不受影响，将外部刺激忠实地转化为胞内行为(激活或抑制)。
HER2人源化小鼠不仅可以用于抗体肿瘤药效的评估，对药物开发的临床效果有着重要的指导意义。同时也是抗人HER2抗体药物安全性评价的理想模型，对HER2抗体药物的毒理学进行临床前体内评价。
HER2人源化小鼠不仅可供于抗人HER2抗体单药评价，同时可用于HER2抗体联合其他药物(小分子或抗体药)抗肿瘤药效评价，CAR T、CAR NK细胞杀伤肿瘤评价，对临床前药效评价有着深远的指导意义。
附图说明
图1是muHER2基因敲除示意图；
敲除位点选在ATG后第三个外显子上
图2是cas9-sgRNA载体构建测序比对结果；
图3 sgRNA敲除效率；
muHER2-sgRNA 1切除效率为：85.1%
muHER2-sgRNA 2 切除效率为：71.5%
图4 pLVX-huHER2 PCR扩增
M：DL5000marker
1：huHER2 PCR产物
图5 pLVX-huHER2重组质粒测序比对结果；
图6 4T1细胞muHER2 & huHER2表达情况；
4T1-huHER2 cell pool中muHER2敲除效率为：80.1%；huHER2表达效率为：55.1%
图7 4T1-huHER2稳定细胞株muHER2 & huHER2表达情况；
A：4T1细胞中muHER2表达情况
B：4T1细胞中huHER2表达情况
C、E、G、I、K：4T1-huHER2稳定细胞株中muHER2表达情况
D、F、H、J、L：4T1-huHER2稳定细胞株中huHER2表达情况
具体实施方式
1.1 mu HER2 sgRNA设计
1.1.1 sgRNA寡核苷酸链合成
使用CRISPR在线设计工具(http://crispr .mit .edu/)根据评分系统，分别在HER2的3号外显子上设计2个20bp的sgRNA。根据这两条标准找到外显子上的核心序列：HER2sgRNA-1和HER2 sgRNA-2。编码链模板5′端添加CACCG，非编码链模板3′端添加AAAC……………….C，与BsmbI酶切后形成的粘性末端互补，设计2对CRISPR寡核苷酸链。
1.1.2 muHer2 3号外显子序列：
如下所示，其中下划线为靶向位置：
GACATCCAGGAAGTCCAGGGATACATGCTCATCGCTCACAACCGAGTGAAACACGTCCCA CTGCAGAGGTTG CGCATCGTGAGAGGGACTCAGCTCTTTGAGGACAAGTATGCCCTGGCTGTGCTAGACAACCGAGACCCTT TGGACAACGTCACCACCGCCGCCCCAGGCAGAACCCCAGAAGGGCTGCGGGAGCTGCAGCTTCGAAGTCTCACAG（SEQ IDNO.1）
1.1.3 muHER2sgRNA 序列
设计得到的两条sgRNA序列如下：
muHER2 sgRNA-1 guide sequence: ACGATGCGCAACCTCTGCAG TGG（SEQ ID NO.2）
muHER2 sgRNA-2 guide sequence: GCTAGACAACCGAGACCCTT TGG（SEQ ID NO.3）
1.1.4 HER2靶向位点及sgRNA寡核苷酸序列
设计2对CRISPR寡核苷酸链分别如下所示：
第一对：
HER2 sgRNA-1 oligo1：5’-caccGACGATGCGCAACCTCTGCAG-3’；（SEQ ID NO.4）
HER2 sgRNA-1 oligo2：5’-aaacCTGCAGAGGTTGCGCATCGTC-3’；（SEQ ID NO.5）
第二对：
HER2 sgRNA-2 oligo1：5’-caccGGCTAGACAACCGAGACCCTT-3’；（SEQ ID NO.6）
HER2 sgRNA-2 oligo2：5’-aaacAAGGGTCTCGGTTGTCTAGCC-3’；（SEQ ID NO.7）
1.2 cas9-muHER2 sgRNA载体构建
合成上述设计得到的sgRNA单链，形成双链DNA后构建于载体中。具体步骤如下：
1.2.1使用BsmbI酶切1μg LentiCRISPR V2质粒，30min，37℃；反应体系如下：
Figure 490063DEST_PATH_IMAGE001
1.2.2使用天根胶回收试剂盒纯化酶切质粒产物，按说明书进行操作。
1.2.3 sg RNA oligo退火及双链的形成
反应体系如下：
Figure 242118DEST_PATH_IMAGE002
退火程序如下：
Figure 245672DEST_PATH_IMAGE003
1.2.4 LentiCRISPR V2 & sgRNA连接，16℃孵育2h。
反应体系如下：
Figure 450388DEST_PATH_IMAGE004
1.2.5 将连接后的质粒转化至感受态细胞DH5α中，均匀涂至amp抗性LB固体培养基平板中，置于37℃培养箱中培养12-16小时，单个菌落即可出现。
1.2.6 挑取单个菌落扩大培养并质粒小提。
1.2.7 测序鉴定质粒构建成功，命名为LentiCRISPR V2-muHER2 sgRNA-1 &LentiCRISPR V2-muHER2 sgRNA-2。
1.2.8 结论：测序结果显示成功构建muHER2基因敲除载体：
LentiCRISPR V2-muHER2 sgRNA-1
LentiCRISPR V2-muHER2 sgRNA-2
1.3 脂质体法转染V2-muHER2 sgRNA
1.3.1预混试剂预混：A & B
A
Opti-MEM 125ul
Lipo3000R 3.75ul
B
Opti-MEM 125ul
质粒DNA 5ug
P3000<sup>TM</sup> 10ul
1.3.2提前一天用完全培养基（10％胎牛血清的高糖DMEM培养基）接种小鼠乳腺癌4T1细胞，于5％CO2，37℃恒温培养箱中培养
1.3.3细胞达到70-90% 汇合度时转染
1.3.4使用opti-MEM lipofectamine R 3000试剂充分混匀
1.3.5使用opti-MEM 培养基稀释DNA制备DNA预混液，然后添加P3000TM试剂充分混匀
1.3.6将稀释DNA与稀释的lipofectamine R 3000试剂混合（1:1）
1.3.7孵育5mins
1.3.8加入DNA-脂质体复合物至细胞中
1.3.9 48-72h用含1ng/ml嘌呤霉素（puro）完全培养基抗性筛选
1.3.10 待对照细胞完全死亡，改用完全培养基恢复培养2-3天
1.3.11 消化，收集细胞用于FACs法鉴定敲除效率
1.4 流式检测muHER2敲除效率
1.4.1 收集1.3中cell pool细胞，至15ml 离心管中，1000r/min，离心5 min 后弃液。
1.4.2 再加入10 ml 预冷的PBS重悬细胞，并用移液器轻轻吹打混合均匀，1000r/min，离心 5min 后弃液，再加入10 ml 预冷的PBS 同前述方法清洗1遍，细胞计数，最后用PBS重悬细胞制成1×106/ml 的单细胞悬液。
（3）用muHER2-APC（BD 340554）来标记表达经敲除的4T1细胞。取离心管标记为分析管向其中加入细胞悬液1ml，加入2 ul muHER2-APC（BD 340554）。
（4）避光，4℃孵育30min。1000r/min，离心10min，弃液，用预冷的PBS清洗2次，离心弃液。
（5）最后加入500μl PBS，轻柔地重悬细胞，使之成为单细胞悬液。将其对应移入标记好的流式上样管。
（6）另取一个上样管，加入0.1ml 初始细胞悬液，补加0.4ml PBS，作为阴性对照管。
（7）用流式细胞仪进行检测，操作如下：
a．用分析管中的细胞检测样品中的敲除muHER2 的4T1 细胞的比例。
b．用分析管中的细胞检测样品中的敲除muHER2 的4T1 细胞的比例。
检测结果如图3所示，切割效率如下所示：
sgRNA 名称 切割效率
muHER2 sgRNA-1 85.1%
muHER2 sgRNA-2 71.5%
由此可以看出，sgRNA 1具有更高的切割效率，后续实验将使用sgRNA-1进行基因敲除的细胞系。
2 muHER2人源化
2.1 muHER2人源化
2.1.1 人源胞外区、鼠源跨膜区、鼠源胞内区序列：
设计的人源化mu HER2的序列（SEQ ID NO.8）如下所示：其中人源胞外区为下划线所示（SEQ ID NO.9），鼠源跨膜区（SEQ ID NO.10）如斜体所示，鼠源胞内区（SEQ ID NO.11）如黑体所示：
ATGGAGCTGGCGGCCTTGTGCCGCTGGGGGCTCCTCCTCGCCCTCTTGCCCCCCGGAGCCGCGAGCACCCAAG TGTGCACCGGCACAGACATGAAGCTGCGGCTCCCTGCCAGTCCCGAGACCCACCTGGACATGCTCCGCCACCTCTAC CAGGGCTGCCAGGTGGTGCAGGGAAACCTGGAACTCACCTACCTGCCCACCAATGCCAGCCTGTCCTTCCTGCAGGA TATCCAGGAGGTGCAGGGCTACGTGCTCATCGCTCACAACCAAGTGAGGCAGGTCCCACTGCAGAGGCTGCGGATTG TGCGAGGCACCCAGCTCTTTGAGGACAACTATGCCCTGGCCGTGCTAGACAATGGAGACCCGCTGAACAATACCACC CCTGTCACAGGGGCCTCCCCAGGAGGCCTGCGGGAGCTGCAGCTTCGAAGCCTCACAGAGATCTTGAAAGGAGGGGT CTTGATCCAGCGGAACCCCCAGCTCTGCTACCAGGACACGATTTTGTGGAAGGACATCTTCCACAAGAACAACCAGC TGGCTCTCACACTGATAGACACCAACCGCTCTCGGGCCTGCCACCCCTGTTCTCCGATGTGTAAGGGCTCCCGCTGC TGGGGAGAGAGTTCTGAGGATTGTCAGAGCCTGACGCGCACTGTCTGTGCCGGTGGCTGTGCCCGCTGCAAGGGGCC ACTGCCCACTGACTGCTGCCATGAGCAGTGTGCTGCCGGCTGCACGGGCCCCAAGCACTCTGACTGCCTGGCCTGCC TCCACTTCAACCACAGTGGCATCTGTGAGCTGCACTGCCCAGCCCTGGTCACCTACAACACAGACACGTTTGAGTCC ATGCCCAATCCCGAGGGCCGGTATACATTCGGCGCCAGCTGTGTGACTGCCTGTCCCTACAACTACCTTTCTACGGA CGTGGGATCCTGCACCCTCGTCTGCCCCCTGCACAACCAAGAGGTGACAGCAGAGGATGGAACACAGCGGTGTGAGA AGTGCAGCAAGCCCTGTGCCCGAGTGTGCTATGGTCTGGGCATGGAGCACTTGCGAGAGGTGAGGGCAGTTACCAGT GCCAATATCCAGGAGTTTGCTGGCTGCAAGAAGATCTTTGGGAGCCTGGCATTTCTGCCGGAGAGCTTTGATGGGGA CCCAGCCTCCAACACTGCCCCGCTCCAGCCAGAGCAGCTCCAAGTGTTTGAGACTCTGGAAGAGATCACAGGTTACC TATACATCTCAGCATGGCCGGACAGCCTGCCTGACCTCAGCGTCTTCCAGAACCTGCAAGTAATCCGGGGACGAATT CTGCACAATGGCGCCTACTCGCTGACCCTGCAAGGGCTGGGCATCAGCTGGCTGGGGCTGCGCTCACTGAGGGAACT GGGCAGTGGACTGGCCCTCATCCACCATAACACCCACCTCTGCTTCGTGCACACGGTGCCCTGGGACCAGCTCTTTC GGAACCCGCACCAAGCTCTGCTCCACACTGCCAACCGGCCAGAGGACGAGTGTGTGGGCGAGGGCCTGGCCTGCCAC CAGCTGTGCGCCCGAGGGCACTGCTGGGGTCCAGGGCCCACCCAGTGTGTCAACTGCAGCCAGTTCCTTCGGGGCCA GGAGTGCGTGGAGGAATGCCGAGTACTGCAGGGGCTCCCCAGGGAGTATGTGAATGCCAGGCACTGTTTGCCGTGCC ACCCTGAGTGTCAGCCCCAGAATGGCTCAGTGACCTGTTTTGGACCGGAGGCTGACCAGTGTGTGGCCTGTGCCCAC TATAAGGACCCTCCCTTCTGCGTGGCCCGCTGCCCCAGCGGTGTGAAACCTGACCTCTCCTACATGCCCATCTGGAA GTTTCCAGATGAGGAGGGCGCATGCCAGCCTTGCCCCATCAACTGCACCCACTCCTGTGTGGACCTGGATGACAAGG GCTGCCCCGCCGAGCAGAGAGCCAGCCCTCTGACG TTCATCATTGCAACTGTGGTGGGCGTCCTGTTGTTCCTGATC ATAGTGGTGGTCATTGGAATCCTAATCAAACGAAGGCGACAGAAGATCCGGAAGTATACCATGCGTAGGCTGCTGCAGGAGACCGAGCTGGTGGAGCCGCTGACGCCCAGTGGAGCTGTGCCCAACCAGGCTCAGATGCGGATCCTAAAGGAGACAGAGCTAAGGAAGCTGAAGGTGCTTGGGTCAGGAGCCTTCGGCACTGTCTACAAGGGCATCTGGATCCCAGATGGGGAGAACGTGAAAATCCCCGTGGCCATCAAGGTGTTGAGGGAAAACACATCTCCTAAAGCTAACAAAGAAATCCTAGATGAAGCGTACGTCATGGCTGGTGTGGGTTCTCCATATGTGTCCCGCCTCCTGGGCATCTGCCTGACATCCACAGTGCAGCTGGTGACACAGCTTATGCCCTATGGCTGCCTTCTGGACCATGTCCGAGAACACCGAGGTCGCTTAGGCTCCCAGGACCTGCTCAACTGGTGTGTTCAGATTGCCAAGGGGATGAGCTACCTGGAGGAAGTTCGGCTTGTTCACAGGGACCTAGCTGCCCGAAACGTGCTAGTCAAGAGTCCCAACCACGTCAAGATTACCGACTTCGGGCTGGCACGGCTGCTGGACATTGATGAGACTGAATACCATGCAGATGGGGGCAAGGTGCCCATCAAGTGGATGGCATTGGAATCTATTCTCAGACGCCGGTTCACCCATCAGAGTGATGTGTGGAGCTATGGTGTGACTGTGTGGGAGCTGATGACCTTTGGGGCCAAACCTTACGATGGGATCCCAGCTCGGGAGATCCCTGATTTGCTGGAGAAGGGAGAACGCCTACCTCAGCCTCCAATCTGCACCATCGACGTCTACATGATCATGGTCAAATGTTGGATGATTGACTCCGAATGTCGCCCGAGATTCCGGGAGTTGGTATCAGAATTCTCCCGTATGGCAAGGGACCCCCAGCGCTTTGTGGTCATCCAGAACGAGGACTTAGGCCCCTCCAGCCCCATGGACAGCACCTTCTACCGTTCACTGCTGGAGGATGATGACATGGGGGAGCTGGTCGATGCTGAAGAGTACCTGGTACCCCAGCAGGGATTCTTCTCCCCAGACCCTGCCCTAGGTACTGGGAGCACAGCCCACCGCAGACACCGCAGCTCGTCGGCCAGGAGTGGCGGTGGTGAGCTGACACTGGGCCTGGAGCCCTCGGAAGAAGAGCCCCCCAGATCTCCACTGGCTCCCTCCGAAGGGGCTGGCTCCGATGTGTTTGATGGTGACCTGGCAGTGGGGGTAACCAAAGGACTGCAGAGCCTCTCTCCACATGACCTCAGCCCTCTACAGCGGTACAGTGAGGATCCCACATTACCTCTGCCCCCCGAGACTGATGGCTACGTTGCTCCCCTGGCCTGCAGCCCCCAGCCCGAGTATGTGAACCAGCCAGAGGTTCGGCCTCAGTCTCCCTTGACCCCAGAGGGTCCTCCGCCTCCCATCCGACCTGCTGGTGCTACTCTAGAAAGACCCAAGACTCTCTCTCCTGGGAAAAATGGGGTTGTCAAAGACGTTTTTGCCTTTGGGGGTGCTGTGGAGAACCCTGAATACTTAGCACCCAGAGCAGGCACTGCCTCTCAGCCCCACCCTTCTCCTGCCTTCAGCCCAGCCTTTGACAACCTCTATTACTGGGACCAGAACTCATCGGAGCAGGGTCCTCCACCAAGTACCTTTGAAGGGACCCCCACTGCAGAGAACCCTGAGTACCTAGGCCTGGATGTGCCAGTATGA
2.1.2 huHER2全长基因PCR扩增引物：
用于扩增hu HER2基因的PCR引物序列如下所示，直接获得相应的序列，可以通过基因合成的方法获得人源化序列。
huHER2-fl-Xho1- F：CCTCGAGATGGAGCTGGCGGCCTTGT（SEQ ID NO.12）
huHER2-fl-Xba1- R：CTCTAGATCATACTGGCACATCCAGGCCTA（SEQ ID NO.13）
2.1.3 huHER2 PCR鉴定 & 测序引物：
扩增后，通过如下的引物对产物进行鉴定和测序：
huHER2-jc- F：CAGAATGGCTCAGTGACCTGT（SEQ ID NO.14）
huHER2-jc- R：TCTTCTGTCGCCTTCGTTT（SEQ ID NO.15）
2.2 pLVX-huHER2构建
通过XbaI和Xho1酶切位点将huHER2基因克隆入pLVX慢病毒包装载体，经PCR扩增筛选阳性重组质粒如图，分别如图4和图5所示，测序验证正确。
反应体系如下：
H2O 31 ul
Buffer 5 ul
Q5（诺唯赞） 1 ul
Primer F 1 ul
Primer R 1 ul
Sample 1 ul
Total 50 ul
反应程序如下：
Figure 773922DEST_PATH_IMAGE006
2.3 lv-huHER2慢病毒制备
2.3.1 293T细胞接种
将生长状态良好的293T细胞用0.25%胰蛋白酶消化制备单细胞悬液并调整浓度为4x10^5/ml ，取10 ml接种于10 cm培养皿中。 37 ˚C，5% CO2 培养箱内培养过夜，第二天细胞汇合度将达到80%。
2.3.2 病毒包装
将8.5 µg pMD2G、17 µg psPAX2和plVX-huHER2 质粒34 µg加到3 ml OPTI-MEM内混匀，加入120 µl X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagent混匀，室温静置15 min。逐滴加入到培养瓶内，充分混匀。12 h后更换为含10% FBS的DMEM新鲜培养液。（质粒要求：浓度1µg/µl，纯度OD260/OD280的值在1.8~2.0范围内）
2.3.3收集上清浓缩病毒
细胞培养48 h后，收集培养基（含慢病毒），1500g，4 ˚C，离心10 min去细胞碎片。然后用0.45 µm滤膜过滤病毒上清液。过滤液，25000 g，4 ℃，离心2.5 h。弃去上清，用含5% FBS的DMEM培养液重悬病毒团块。200 µl/管分装，-80 ˚C保存，待用。
3 病毒感染 & 检测
3.1 LV-huHER2感染muHER2敲除的4T1细胞
muHER2敲除的4T1细胞的生长情况可以用倒置显微镜观察，当细胞生长状态良好，密度为70%左右时可进行感染（约10E6）。按照MOI=5:1准确计算好需要加LV-huHER2的量（病毒滴度10E8，约50ul），直接将病毒悬液加入到6孔板上的T细胞培养基中，同时以未感染细胞为空白对照。感染后将6孔板放入细胞培养箱中过夜培养，约16-18h 后换液。
3.2 流式细胞仪检测4T1细胞表面huHER2 & muHER2的表达
3.2.1 慢病毒感染 muHER2基因敲除的4T1细胞5d后，收集4T1细胞至15ml 离心管中，1000r/min，离心5 min 后弃液。
3.2.2 再加入10 ml 预冷的PBS重悬细胞，并用移液器轻轻吹打混合均匀，1000r/min，离心 5min 后弃液，再加入10 ml 预冷的PBS 同前述方法清洗1遍，细胞计数，最后用PBS重悬细胞制成1×106/ml 的单细胞悬液。
3.2.3 分别用hsHER2-PE（biolegend 324412）muHER2-APC（BD 340554）来标记表达huHER2 的4T1细胞。取离心管标记为分析管向其中加入细胞悬液1ml，加入2 ul hsHER2-PE（biolegend 324412）/ muHER2-APC（BD 340554）。
3.2.4 避光，4℃孵育30min。1000r/min，离心10min，弃液，用预冷的PBS清洗2次，离心弃液。
3.2.5 最后加入500μl PBS，轻柔地重悬细胞，使之成为单细胞悬液。将其对应移入标记好的流式上样管。
3.2.6 另取一个上样管，加入0.1ml 初始细胞悬液，补加0.4ml PBS，作为阴性对照管。
3.2.7 用流式细胞仪进行检测，操作如下：
a．用阴性对照管中的细胞调节阴性对照。
b．用分析管中的细胞检测样品中的表达muHER2 的4T1 细胞的比例。
c．用分析管中的细胞检测样品中的表达hsHER2 的4T1 细胞的比例。
图64T1细胞muHER2 & huHER2表达情况；
4T1-huHER2 cell pool中muHER2敲除效率为：80.1%；huHER2表达效率为：55.1%。
4 有限稀释法挑选muHER2敲除 & huHER2稳定表达细胞系
4.1病毒感染 muHER2基因敲除的4T1细胞5d后，收集4T1细胞至15ml 离心管中，1000r/min，离心5 min 后弃废液。
4.2 从EP管中取10ul细胞悬液，加入10ul台盼蓝染液，混匀，计数。
4.3 通过计数结果计算需要铺板的细胞数，平均使每个孔里面的细胞个数为0.5-1个，如通过计算，从EP管中取出180个细胞加入到适量的培养基中，混匀后，均匀的铺入2块96孔板中，每孔150ul，即将这180个细胞均匀的铺入到2块96孔板中，理论上每个孔的细胞数为0.92个。
4.4 铺完板后可在显微镜下观察一下，若发现有些孔中的细胞大于1个，则可直接放弃该孔，然后放入二氧化碳培养箱中培养，后期观察。
5 4T1-huHER2稳定细胞系流式检测（huHER2插入 & muHER2敲除）
5.1 慢病毒感染 muHER2基因敲除的4T1细胞5d后，收集4T1细胞至15ml 离心管中，1000r/min，离心5 min 后弃液。
5.2 再加入10 ml 预冷的PBS重悬细胞，并用移液器轻轻吹打混合均匀，1000 r/min，离心 5min 后弃液，再加入10 ml 预冷的PBS 同前述方法清洗1遍，细胞计数，最后用PBS重悬细胞制成1×106/ml 的单细胞悬液。
5.3 分别用hsHER2-APC（biolegend 324412）/ muHER2-APC（BD 340554）来标记表达huHER2 的4T1细胞。取离心管标记为分析管向其中加入细胞悬液1ml，加入2 ul hsHER2-APC/ muHER2-APC（BD 340554）。
5.4 避光，4℃孵育30min。1000r/min，离心10min，弃液，用预冷的PBS清洗2次，离心弃液。
5.5 最后加入500μl PBS，轻柔地重悬细胞，使之成为单细胞悬液。将其对应移入标记好的流式上样管。
5.6 另取一个上样管，加入0.1ml 初始细胞悬液，补加0.4ml PBS，作为阴性对照管。
5.7 用流式细胞仪进行检测，操作如下：
a．用阴性对照管中的细胞调节阴性对照。
B．用分析管中的4T1稳定细胞系是否表达muHER2。
C．用分析管中的4T1稳定细胞系是否表达hsHER2。
5.8结果分析发现，4T1肿瘤细胞中未检测到huHER2表达，但可以检测到muHER2表达，而4T1-huHER2单克隆稳定细胞系中仅能检测到huHER2表达，未能检测到muHER2表达，表明本方法成功制备了4T1-huHER2人源化小鼠肿瘤细胞，可作为人HER2靶点CAR T、CAR NK、抗体药的靶细胞，可为CAR T、CAR NK、抗体药小鼠体内评价提供肿瘤细胞。
序列表
<110> 江苏浦珠生物医药科技有限公司
<120> 一种HER2基因人源化小鼠肿瘤细胞模型、构建方法以及用途
<130> 无
<160> 15
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 217
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gacatccagg aagtccaggg atacatgctc atcgctcaca accgagtgaa acacgtccca 60
ctgcagaggt tgcgcatcgt gagagggact cagctctttg aggacaagta tgccctggct 120
gtgctagaca accgagaccc tttggacaac gtcaccaccg ccgccccagg cagaacccca 180
gaagggctgc gggagctgca gcttcgaagt ctcacag 217
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
acgatgcgca acctctgcag tgg 23
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gctagacaac cgagaccctt tgg 23
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
caccgacgat gcgcaacctc tgcag 25
<210> 5
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
aaacctgcag aggttgcgca tcgtc 25
<210> 6
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
caccggctag acaaccgaga ccctt 25
<210> 7
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
aaacaagggt ctcggttgtc tagcc 25
<210> 8
<211> 3768
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
atggagctgg cggccttgtg ccgctggggg ctcctcctcg ccctcttgcc ccccggagcc 60
gcgagcaccc aagtgtgcac cggcacagac atgaagctgc ggctccctgc cagtcccgag 120
acccacctgg acatgctccg ccacctctac cagggctgcc aggtggtgca gggaaacctg 180
gaactcacct acctgcccac caatgccagc ctgtccttcc tgcaggatat ccaggaggtg 240
cagggctacg tgctcatcgc tcacaaccaa gtgaggcagg tcccactgca gaggctgcgg 300
attgtgcgag gcacccagct ctttgaggac aactatgccc tggccgtgct agacaatgga 360
gacccgctga acaataccac ccctgtcaca ggggcctccc caggaggcct gcgggagctg 420
cagcttcgaa gcctcacaga gatcttgaaa ggaggggtct tgatccagcg gaacccccag 480
ctctgctacc aggacacgat tttgtggaag gacatcttcc acaagaacaa ccagctggct 540
ctcacactga tagacaccaa ccgctctcgg gcctgccacc cctgttctcc gatgtgtaag 600
ggctcccgct gctggggaga gagttctgag gattgtcaga gcctgacgcg cactgtctgt 660
gccggtggct gtgcccgctg caaggggcca ctgcccactg actgctgcca tgagcagtgt 720
gctgccggct gcacgggccc caagcactct gactgcctgg cctgcctcca cttcaaccac 780
agtggcatct gtgagctgca ctgcccagcc ctggtcacct acaacacaga cacgtttgag 840
tccatgccca atcccgaggg ccggtataca ttcggcgcca gctgtgtgac tgcctgtccc 900
tacaactacc tttctacgga cgtgggatcc tgcaccctcg tctgccccct gcacaaccaa 960
gaggtgacag cagaggatgg aacacagcgg tgtgagaagt gcagcaagcc ctgtgcccga 1020
gtgtgctatg gtctgggcat ggagcacttg cgagaggtga gggcagttac cagtgccaat 1080
atccaggagt ttgctggctg caagaagatc tttgggagcc tggcatttct gccggagagc 1140
tttgatgggg acccagcctc caacactgcc ccgctccagc cagagcagct ccaagtgttt 1200
gagactctgg aagagatcac aggttaccta tacatctcag catggccgga cagcctgcct 1260
gacctcagcg tcttccagaa cctgcaagta atccggggac gaattctgca caatggcgcc 1320
tactcgctga ccctgcaagg gctgggcatc agctggctgg ggctgcgctc actgagggaa 1380
ctgggcagtg gactggccct catccaccat aacacccacc tctgcttcgt gcacacggtg 1440
ccctgggacc agctctttcg gaacccgcac caagctctgc tccacactgc caaccggcca 1500
gaggacgagt gtgtgggcga gggcctggcc tgccaccagc tgtgcgcccg agggcactgc 1560
tggggtccag ggcccaccca gtgtgtcaac tgcagccagt tccttcgggg ccaggagtgc 1620
gtggaggaat gccgagtact gcaggggctc cccagggagt atgtgaatgc caggcactgt 1680
ttgccgtgcc accctgagtg tcagccccag aatggctcag tgacctgttt tggaccggag 1740
gctgaccagt gtgtggcctg tgcccactat aaggaccctc ccttctgcgt ggcccgctgc 1800
cccagcggtg tgaaacctga cctctcctac atgcccatct ggaagtttcc agatgaggag 1860
ggcgcatgcc agccttgccc catcaactgc acccactcct gtgtggacct ggatgacaag 1920
ggctgccccg ccgagcagag agccagccct ctgacgttca tcattgcaac tgtggtgggc 1980
gtcctgttgt tcctgatcat agtggtggtc attggaatcc taatcaaacg aaggcgacag 2040
aagatccgga agtataccat gcgtaggctg ctgcaggaga ccgagctggt ggagccgctg 2100
acgcccagtg gagctgtgcc caaccaggct cagatgcgga tcctaaagga gacagagcta 2160
aggaagctga aggtgcttgg gtcaggagcc ttcggcactg tctacaaggg catctggatc 2220
ccagatgggg agaacgtgaa aatccccgtg gccatcaagg tgttgaggga aaacacatct 2280
cctaaagcta acaaagaaat cctagatgaa gcgtacgtca tggctggtgt gggttctcca 2340
tatgtgtccc gcctcctggg catctgcctg acatccacag tgcagctggt gacacagctt 2400
atgccctatg gctgccttct ggaccatgtc cgagaacacc gaggtcgctt aggctcccag 2460
gacctgctca actggtgtgt tcagattgcc aaggggatga gctacctgga ggaagttcgg 2520
cttgttcaca gggacctagc tgcccgaaac gtgctagtca agagtcccaa ccacgtcaag 2580
attaccgact tcgggctggc acggctgctg gacattgatg agactgaata ccatgcagat 2640
gggggcaagg tgcccatcaa gtggatggca ttggaatcta ttctcagacg ccggttcacc 2700
catcagagtg atgtgtggag ctatggtgtg actgtgtggg agctgatgac ctttggggcc 2760
aaaccttacg atgggatccc agctcgggag atccctgatt tgctggagaa gggagaacgc 2820
ctacctcagc ctccaatctg caccatcgac gtctacatga tcatggtcaa atgttggatg 2880
attgactccg aatgtcgccc gagattccgg gagttggtat cagaattctc ccgtatggca 2940
agggaccccc agcgctttgt ggtcatccag aacgaggact taggcccctc cagccccatg 3000
gacagcacct tctaccgttc actgctggag gatgatgaca tgggggagct ggtcgatgct 3060
gaagagtacc tggtacccca gcagggattc ttctccccag accctgccct aggtactggg 3120
agcacagccc accgcagaca ccgcagctcg tcggccagga gtggcggtgg tgagctgaca 3180
ctgggcctgg agccctcgga agaagagccc cccagatctc cactggctcc ctccgaaggg 3240
gctggctccg atgtgtttga tggtgacctg gcagtggggg taaccaaagg actgcagagc 3300
ctctctccac atgacctcag ccctctacag cggtacagtg aggatcccac attacctctg 3360
ccccccgaga ctgatggcta cgttgctccc ctggcctgca gcccccagcc cgagtatgtg 3420
aaccagccag aggttcggcc tcagtctccc ttgaccccag agggtcctcc gcctcccatc 3480
cgacctgctg gtgctactct agaaagaccc aagactctct ctcctgggaa aaatggggtt 3540
gtcaaagacg tttttgcctt tgggggtgct gtggagaacc ctgaatactt agcacccaga 3600
gcaggcactg cctctcagcc ccacccttct cctgccttca gcccagcctt tgacaacctc 3660
tattactggg accagaactc atcggagcag ggtcctccac caagtacctt tgaagggacc 3720
cccactgcag agaaccctga gtacctaggc ctggatgtgc cagtatga 3768
<210> 9
<211> 1956
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
atggagctgg cggccttgtg ccgctggggg ctcctcctcg ccctcttgcc ccccggagcc 60
gcgagcaccc aagtgtgcac cggcacagac atgaagctgc ggctccctgc cagtcccgag 120
acccacctgg acatgctccg ccacctctac cagggctgcc aggtggtgca gggaaacctg 180
gaactcacct acctgcccac caatgccagc ctgtccttcc tgcaggatat ccaggaggtg 240
cagggctacg tgctcatcgc tcacaaccaa gtgaggcagg tcccactgca gaggctgcgg 300
attgtgcgag gcacccagct ctttgaggac aactatgccc tggccgtgct agacaatgga 360
gacccgctga acaataccac ccctgtcaca ggggcctccc caggaggcct gcgggagctg 420
cagcttcgaa gcctcacaga gatcttgaaa ggaggggtct tgatccagcg gaacccccag 480
ctctgctacc aggacacgat tttgtggaag gacatcttcc acaagaacaa ccagctggct 540
ctcacactga tagacaccaa ccgctctcgg gcctgccacc cctgttctcc gatgtgtaag 600
ggctcccgct gctggggaga gagttctgag gattgtcaga gcctgacgcg cactgtctgt 660
gccggtggct gtgcccgctg caaggggcca ctgcccactg actgctgcca tgagcagtgt 720
gctgccggct gcacgggccc caagcactct gactgcctgg cctgcctcca cttcaaccac 780
agtggcatct gtgagctgca ctgcccagcc ctggtcacct acaacacaga cacgtttgag 840
tccatgccca atcccgaggg ccggtataca ttcggcgcca gctgtgtgac tgcctgtccc 900
tacaactacc tttctacgga cgtgggatcc tgcaccctcg tctgccccct gcacaaccaa 960
gaggtgacag cagaggatgg aacacagcgg tgtgagaagt gcagcaagcc ctgtgcccga 1020
gtgtgctatg gtctgggcat ggagcacttg cgagaggtga gggcagttac cagtgccaat 1080
atccaggagt ttgctggctg caagaagatc tttgggagcc tggcatttct gccggagagc 1140
tttgatgggg acccagcctc caacactgcc ccgctccagc cagagcagct ccaagtgttt 1200
gagactctgg aagagatcac aggttaccta tacatctcag catggccgga cagcctgcct 1260
gacctcagcg tcttccagaa cctgcaagta atccggggac gaattctgca caatggcgcc 1320
tactcgctga ccctgcaagg gctgggcatc agctggctgg ggctgcgctc actgagggaa 1380
ctgggcagtg gactggccct catccaccat aacacccacc tctgcttcgt gcacacggtg 1440
ccctgggacc agctctttcg gaacccgcac caagctctgc tccacactgc caaccggcca 1500
gaggacgagt gtgtgggcga gggcctggcc tgccaccagc tgtgcgcccg agggcactgc 1560
tggggtccag ggcccaccca gtgtgtcaac tgcagccagt tccttcgggg ccaggagtgc 1620
gtggaggaat gccgagtact gcaggggctc cccagggagt atgtgaatgc caggcactgt 1680
ttgccgtgcc accctgagtg tcagccccag aatggctcag tgacctgttt tggaccggag 1740
gctgaccagt gtgtggcctg tgcccactat aaggaccctc ccttctgcgt ggcccgctgc 1800
cccagcggtg tgaaacctga cctctcctac atgcccatct ggaagtttcc agatgaggag 1860
ggcgcatgcc agccttgccc catcaactgc acccactcct gtgtggacct ggatgacaag 1920
ggctgccccg ccgagcagag agccagccct ctgacg 1956
<210> 10
<211> 69
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
ttcatcattg caactgtggt gggcgtcctg ttgttcctga tcatagtggt ggtcattgga 60
atcctaatc 69
<210> 11
<211> 1743
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
aaacgaaggc gacagaagat ccggaagtat accatgcgta ggctgctgca ggagaccgag 60
ctggtggagc cgctgacgcc cagtggagct gtgcccaacc aggctcagat gcggatccta 120
aaggagacag agctaaggaa gctgaaggtg cttgggtcag gagccttcgg cactgtctac 180
aagggcatct ggatcccaga tggggagaac gtgaaaatcc ccgtggccat caaggtgttg 240
agggaaaaca catctcctaa agctaacaaa gaaatcctag atgaagcgta cgtcatggct 300
ggtgtgggtt ctccatatgt gtcccgcctc ctgggcatct gcctgacatc cacagtgcag 360
ctggtgacac agcttatgcc ctatggctgc cttctggacc atgtccgaga acaccgaggt 420
cgcttaggct cccaggacct gctcaactgg tgtgttcaga ttgccaaggg gatgagctac 480
ctggaggaag ttcggcttgt tcacagggac ctagctgccc gaaacgtgct agtcaagagt 540
cccaaccacg tcaagattac cgacttcggg ctggcacggc tgctggacat tgatgagact 600
gaataccatg cagatggggg caaggtgccc atcaagtgga tggcattgga atctattctc 660
agacgccggt tcacccatca gagtgatgtg tggagctatg gtgtgactgt gtgggagctg 720
atgacctttg gggccaaacc ttacgatggg atcccagctc gggagatccc tgatttgctg 780
gagaagggag aacgcctacc tcagcctcca atctgcacca tcgacgtcta catgatcatg 840
gtcaaatgtt ggatgattga ctccgaatgt cgcccgagat tccgggagtt ggtatcagaa 900
ttctcccgta tggcaaggga cccccagcgc tttgtggtca tccagaacga ggacttaggc 960
ccctccagcc ccatggacag caccttctac cgttcactgc tggaggatga tgacatgggg 1020
gagctggtcg atgctgaaga gtacctggta ccccagcagg gattcttctc cccagaccct 1080
gccctaggta ctgggagcac agcccaccgc agacaccgca gctcgtcggc caggagtggc 1140
ggtggtgagc tgacactggg cctggagccc tcggaagaag agccccccag atctccactg 1200
gctccctccg aaggggctgg ctccgatgtg tttgatggtg acctggcagt gggggtaacc 1260
aaaggactgc agagcctctc tccacatgac ctcagccctc tacagcggta cagtgaggat 1320
cccacattac ctctgccccc cgagactgat ggctacgttg ctcccctggc ctgcagcccc 1380
cagcccgagt atgtgaacca gccagaggtt cggcctcagt ctcccttgac cccagagggt 1440
cctccgcctc ccatccgacc tgctggtgct actctagaaa gacccaagac tctctctcct 1500
gggaaaaatg gggttgtcaa agacgttttt gcctttgggg gtgctgtgga gaaccctgaa 1560
tacttagcac ccagagcagg cactgcctct cagccccacc cttctcctgc cttcagccca 1620
gcctttgaca acctctatta ctgggaccag aactcatcgg agcagggtcc tccaccaagt 1680
acctttgaag ggacccccac tgcagagaac cctgagtacc taggcctgga tgtgccagta 1740
tga 1743
<210> 12
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
cctcgagatg gagctggcgg ccttgt 26
<210> 13
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
ctctagatca tactggcaca tccaggccta 30
<210> 14
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
cagaatggct cagtgacctg t 21
<210> 15
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
tcttctgtcg ccttcgttt 19

Claims (9)

1.一种HER2基因人源化小鼠肿瘤细胞的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
第1步，确定HER2人源序列以及所述HER2人源序列在小鼠细胞模型HER2基因中的替换区域；所述小鼠细胞模型HER2基因的胞外区替换为所述HER2人源序列，而胞内区保留小鼠细胞模型的原有序列；
第2步，在人源化替换区域设计并验证针对小鼠细胞模型序列的sgRNA；
第3步，设计并构建携带所述HER2人源序列的人源化载体；
第4步，将Cas9-sgRNA载体导入小鼠细胞中，对小鼠细胞模型HER2基因敲除，获得HER2基因敲除的细胞；
第5步，构建含有人源化HER2基因的载体，通过病毒包装过程将人源化的HER2基因包装到慢病毒中，经侵染敲除鼠源HER2的细胞，使小鼠细胞模型表达含有人源HER2基因的胞外区序列。
2.根据权利要求1所述的HER2基因人源化小鼠肿瘤细胞的构建方法，其特征在于，在一个实施方式中，HER2人源序列如SEQ ID NO.8所示。
3.根据权利要求1所述的HER2基因人源化小鼠肿瘤细胞的构建方法，其特征在于，在一个实施方式中，针对小鼠细胞模型序列的sgRNA的序列如SEQ ID NO.2或者SEQ ID NO.3所示。
4.根据权利要求1所述的HER2基因人源化小鼠肿瘤细胞的构建方法，其特征在于，在一个实施方式中，第3步中人源化打靶载体的构建方法包括：使用BsmbI酶切LentiCRISPR V2质粒，再将产物与sgRNA连接，转化至感受态细胞中。
5.根据权利要求1所述的HER2基因人源化小鼠肿瘤细胞的构建方法，其特征在于，在一个实施方式中，含有人源HER2基因的载体的构建方法是：将含有HER2人源胞外区、HER2鼠源跨膜区和胞内区的序列插入至pLVX慢病毒包装载体中，再包装至慢病毒中获得。
6.根据权利要求1所述的HER2基因人源化小鼠肿瘤细胞的构建方法，其特征在于，在一个实施方式中，人源胞外区的序列如SEQ ID NO.9所示。
7.权利要求1所述的构建方法得到的HER2基因人源化小鼠肿瘤细胞。
8.权利要求7所述的肿瘤细胞在用于制备肿瘤疾病研究的模型中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，肿瘤疾病研究的模型是指以人HER2为靶点的CAR T、CAR NK、抗体药的靶细胞。
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