CN111088280A - 打靶载体及白喉毒素调控清除单核细胞衍生树突状细胞的转基因小鼠的构建方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及动物模型构建领域，公开了一种打靶载体及白喉毒素调控清除单核细胞衍生树突状细胞的转基因小鼠的构建方法和应用，本发明克服了现有树突状细胞清除动物模型的不足，提供了一种能稳定传代的新型可诱导型的、白喉毒素调控清除单核细胞衍生DC的DC SIGN‑DTR转基因小鼠动物模型的制备、使用和检测方法。本发明构建得到的白喉毒素调控清除单核细胞衍生DC的DCSIGN‑DTR转基因小鼠动物模型单核细胞衍生DC清除效率达80％‑90％，能够较好地清除单核细胞衍生DC，且在不用白喉毒素诱导时单核细胞衍生DC功能不受影响，利用白喉毒素诱导清除单核细胞衍生DC时无副反应，提供了一种全新的单核细胞衍生DC清除的原理和方法，提供了一种全新的单核细胞衍生DC可诱导清除的动物模型。
Description
技术领域
本发明涉及动物模型构建领域，更具体地，涉及一种打靶载体及白喉毒素调控清除单核细胞衍生树突状细胞的转基因小鼠的构建方法和应用。
背景技术
树突状细胞(dendritic cells，MDC)是目前所知的机体内功能最强的抗原提呈细胞，是唯一能激活未致敏的初始T细胞的抗原体提呈细胞，是启动、调控、并维持免疫应答中心。树突状细胞起源于骨髓中的造血干细胞，一方面髓样干细胞可以分化为髓样DC，又称DC1，包括朗格汉斯细胞，间质DC以及单核细胞衍生DC；另一方面，淋巴样干细胞可以分化为淋巴样DC，又称DC2。当外周血中的单核细胞可以在GM-CSF和IL-4的刺激下分化为DC，组织中处于稳态的DC能自我更新，而不需要单核细胞衍生DC的补充。在外周血和骨髓中，单核细胞的数量大约是DC的20倍，并且单核细胞衍生DC作为DC的一个主要部分，其功能是不能被忽视的。为了研究单核细胞衍生DC的功能，一个重要的实验就是在体内清除单核细胞衍生DC，然而现在未有能够特异性清除单核细胞衍生DC的动物模型，所以开发能够特异性清除单核细胞衍生DC的动物模型具有重要作用。
白喉毒素受体-白喉毒素(DTR-DT)系统是近年来发展起来的一种用于诱导特定细胞群凋亡的系统。白喉毒素(DT)是白喉棒状杆菌产生的一种毒素，包含A和B两个亚基，而白喉毒素受体(DTR)又称人类肝素结合的表皮生长因子样生长因子(hbEGF)。当DT通过B亚基与DTR结合时，整个毒素将通过受体介导的内吞作用内化，毒素的亚单位A随后可抑制蛋白质的翻译，导致细胞凋亡而死亡。啮齿类动物的hbEGF因为3个氨基酸的变化，对DT的亲和力比人类低103-105倍，所以给小鼠注射DT可以特异性诱导表达DTR(即人类hbEGF)的细胞群体凋亡，从而特异性清除该细胞群体，并且无明显副反应。
树突状细胞特异性细胞间黏附分子-3结合非整合素因子(dendritic cellspecific intercellular-adherison-molecular-3grabbing non-integr，DC-SIGN)是一种主要表达于DC表面的模式识别受体，属于C型凝集素超分子家族。所以我们选择DC-SIGN作为驱动DTR表达的基因构建转基因小鼠，这样在表达DC-SIGN的单核细胞衍生DC中会表达DTR，而不表达DC-SIGN的组织中自我更新DC或其他非DC细胞中不表达DTR，注射合适剂量的DT就可以选择性地诱导单核细胞衍生DC凋亡。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是为了克服现有的树突状细胞清除动物模型的不足，提供一种打靶载体及白喉毒素调控清除单核细胞衍生树突状细胞的转基因小鼠的构建方法和应用。
本发明的目的是提供一种靶向整合外源基因IRES-DTR至DC-SIGN外显子7位点，构建白喉毒素调控清除单核细胞衍生树突状细胞的DC SIGN-DTR转基因小鼠的方法和应用。
本发明上述目的通过以下技术方案予以实现：一种带小鼠DC-SIGN长同源臂的整合外源基因IRES-DTR的打靶载体，所述靶向打靶载体序列如SEQ ID NO.8所示，命名为pL253-DCSIGN 5HA L-IRES-DTR-PEN-DCSIGN 3HAL-MCL-HSV TK。
一种提取载体，所述提取载体序列如SEQ ID NO.7所示，命名为载体pL253-retrieval 5HA-retrieval 3HA-MCL-HSV TK。
S1.构建带长同源臂的靶向整合外源基因IRES-DTR至DC-SIGN外显子7位点的打靶载体，命名为打靶载体pL253-DCSIGN 5HA L-IRES-DTR-PEN-DCSIGN 3HA L-MCL-HSV TK；
S2.电穿孔法将酶切线性化的打靶载体导入小鼠胚胎干细胞BALB/C ES细胞，得到靶向插入IRES-DTR至DC-SIGN外显子7位点的BALB/C ES细胞；
S3.利用靶向插入IRES-DTR至DC-SIGN外显子7位点的BALB/C ES细胞，囊胚注射法构建靶向插入IRES-DTR至DC-SIGN外显子7位点的DC SIGN-DTR转基因小鼠；
其中S1步骤所述构建带长同源臂的靶向整合外源基因IRES-DTR至DC-SIGN外显子7位点的打靶载体的具体方法如下：
(1)以RP23-12K14 BAC DNA为模板，利用序列如SEQ ID NO.1所示的正向引物和序列如SEQ ID NO.2所示的反向引物进行PCR，扩增出序列如SEQ ID NO.3所示的基因片段DC-SIGN 5’侧同源臂(retrieval 5HA)；以RP23-12K14 BAC DNA为模板，利用序列如SEQ IDNO.4所示的正向引物和序列如SEQ ID NO.5所示的反向引物进行PCR，扩增出序列如SEQ IDNO.6所示的基因片段DC-SIGN 3’侧同源臂(retrieval 3HA)；
(2)将retrieval 5HA和retrieval 3HA利用酶切位点NotI、SpeI、BamHI克隆至带阴性选择标记HSV TK的载体pL253-retrivied-empty(counter-Selection BACModification Kit,Genebridges)，得到序列如SEQ ID NO.7所示的提取载体pL253-retrieval 5HA-retrieval 3HA-MCL-HSV TK；
(3)电穿孔法将质粒pRED/ET转化入BAC Clone DCSIGN-IRES-DTR-PEN(由本实验室构建，正在申报专利，部分基因结构如附图1所示)，并用L-阿拉伯糖诱导Red/ET表达；
(4)电穿孔法将利用SpeI酶切线性化的pL253-retrieval 5HA-retrieval 3HA-MCL-HSV TK提取载体转化入上述表达RED/ET的BAC Clone DC SIGN-IRES-DTR-PEN，同源重组得到序列如SEQ ID NO.8所示的带有DC-SIGN 5’同源臂(～2kb)和3’同源臂(～20kb)的打靶载体，命名为打靶载体pL253-DCSIGN 5HA L-IRES-DTR-PEN-DCSIGN 3HA L-MCL-HSVTK；
(5)挑选单克隆，利用序列如SEQ ID NO.9所示的正向引物和序列如SEQ ID NO.10所示的反向引物作菌落PCR，成功提取IRES-DTR-PGK-EM7-NEO和DC-SIGN同源臂的载体能够得到约1.2kb的条带。
至此，我们得到打靶载体pL253-DCSIGN 5HA L-IRES-DTR-PEN-DCSIGN 3HA L-MCL-HSV TK。
上述打靶载体可用于靶向整合外源基因IRES-DTR至DC-SIGN外显子7位点，如小鼠胚胎干(ES)细胞DC-SIGN外显子7位点。
本发明还提供利用上述打靶载体靶向整合外源基因IRES-DTR至小鼠胚胎干细胞DC-SIGN外显子7位点的方法，即步骤S2。具体步骤如下：
(1)小鼠胚胎成纤维细胞(MEFs)用MEF培养基培养，经30Grayγ射线灭活处理后作为滋养层细胞。BALB/C ES细胞(以下简述为ES细胞)种在滋养层细胞上，用ES培养基培养；
(2)电穿孔法将利用NotI酶切线性化的打靶载体pL253-DCSIGN 5HA L-IRES-DTR-PEN-DCSIGN 3HA L-MCL-HSV TK转入ES细胞，使IRES-DTR-PGK-EM7-NEO同源重组至DC-SIGN外显子7位点；
(3)利用G418阳选和ganciclovir阴选，挑选得到靶向插入IRES-DTR-PGK-EM7-NEO至DC-SIGN外显子7位点的BALB/C ES细胞克隆；
(4)提取ES细胞基因组DNA为模板，利用序列为SEQ ID NO.11的正向引物和序列为SEQ ID NO.12的反向引物进行PCR鉴定，靶向插入IRES-DTR-PGK-EM7-NEO至DC-SIGN外显子7位点的ES细胞阳性克隆可见约4.1kb条带。
至此，我们得到靶向插入IRES-DTR至DC-SIGN外显子7位点的BALB/C ES细胞。
上述靶向插入IRES-DTR至DC-SIGN外显子7位点的ES细胞可用于培育DC SIGN-DTR转基因小鼠。
本发明还提供利用上述靶向插入IRES-DTR至DC-SIGN外显子7位点的ES细胞培育DC SIGN-DTR转基因小鼠的方法，即步骤S3。具体步骤如下：
(1)靶向插入IRES-DTR至DC-SIGN外显子7位点的ES细胞注射入C57BL/6J囊胚，再接种到假孕的KM母鼠子宫中，出生得到毛色为黑色和白色混杂嵌合体小鼠；
(2)提取转基因小鼠鼠尾DNA作为模板，利用序列为SEQ ID NO.13的正向引物和序列为SEQ ID NO.14的反向引物作PCR鉴定，带有IRES-DTR的阳性小鼠可见约1.2kb条带；
(3)利用白色占比最高的5只雄性转基因嵌合体小鼠(F0)与BALB/c雌鼠交配，得到毛色为白色的小鼠可能为DC SIGN-DTR转基因杂合小鼠。小白鼠经鼠尾PCR鉴定后得到DCSIGN-DTR转基因杂合小鼠，即为F1代小鼠，鼠尾PCR鉴定方法同步骤(2)。
(4)F1代小鼠与C57BL/6J母鼠杂交进行传代、培育，同时对所得的子代小鼠进行鼠尾PCR鉴定，方法同步骤(2)，得到F2代小鼠。按相同方法对小鼠进行传代。
至此，我们得到DC SIGN-DTR转基因小鼠。
上述DC SIGN-DTR转基因小鼠可用白喉毒素诱导，建立清除单核细胞衍生DC的小鼠模型。
本发明还提供利用上述DC SIGN-DTR转基因小鼠，经白喉毒素诱导建立清除单核细胞衍生DC的小鼠模型的方法。
白喉毒素调控清除单核细胞衍生DC的DC SIGN-DTR转基因小鼠模型使用方法：因单核细胞衍生DC表达DC-SIGN，故DC SIGN-DTR转基因小鼠的单核细胞衍生DC也表达DTR，白喉毒素(DT)能够结合DTR，特异性诱导单核细胞衍生DC凋亡，从而清除单核细胞衍生DC。优选地，在第1、第2、第4、第7天分别腹腔注射DT(20ng/g)，特异性清除小鼠单核细胞衍生DC。
本发明还提供利用流式细胞术检测小鼠组织中单核细胞衍生DC敲除效率的方法。
利用流式细胞术检测小鼠组织中单核细胞衍生DC：获取小鼠组织，制备成单细胞悬液，用Fc blocker封闭Fc受体后，利用CD11c、MHCII、CD11b流式抗体染色，其中CD11c、MHCII、CD11b均高表达的细胞为单核细胞衍生DC。
至此，本发明提供了白喉毒素调控清除单核细胞衍生DC的DC SIGN-DTR转基因小鼠制备、使用和检测方法。
本发明的有益效果为：
本发明克服了现有树突状细胞清除动物模型的不足，提供了一种能稳定传代的新型可诱导型的、白喉毒素调控清除单核细胞衍生DC的DC SIGN-DTR转基因小鼠动物模型的制备、使用和检测方法。
本发明建立了一种高效、安全靶向整合外源基因至小鼠胚胎干细胞基因组DC-SIGN外显子7位点的方法，并证实敲入的外源基因表达正常。
本发明提供了靶向小鼠DC-SIGN外显子7位点的打靶载体左、右同源臂DNA序列信息及构建方法。
本发明提供了筛选与鉴定阳性细胞株/克隆的方法和应用实例。
本发明提供了利用转基因ES细胞生产和培育转基因小鼠的方法和应用实例。
本发明构建得到的白喉毒素调控清除单核细胞衍生DC的DCSIGN-DTR转基因小鼠动物模型单核细胞衍生DC清除效率达80％-90％，能够较好地清除单核细胞衍生DC，且在不用白喉毒素诱导时单核细胞衍生DC功能不受影响，利用白喉毒素诱导清除单核细胞衍生DC时无副反应，提供了一种全新的单核细胞衍生DC清除的原理和方法，提供了一种全新的单核细胞衍生DC可诱导清除的动物模型。
附图说明
图1：外显子7位点插入IRES-DTR-PGK-EM7-Neo的BAC Clone DCSIGN-IRES-DTR-PEN的DCSIGN基因部分结构示意图，黑色片段代表外显子位点；
图2：带长同源臂的靶向DC-SIGN基因外显子7位点的打靶载体的构建，及同源重组从DC-SIGN BAC提取长同源臂和目的基因后进行PCR筛选与鉴定的引物(黑色箭头)示意图；
图3：靶向整合外源基因IRES-DTR至小鼠胚胎干细胞DC-SIGN外显子7位点，及PCR筛选与鉴定阳性克隆的引物(黑色箭头)示意图；
图4：PCR筛选与鉴定靶向DC-SIGN外显子7位点的小鼠胚胎干细胞单克隆，正确靶向的单克隆细胞出现约4.1kb条带；
图5：利用靶向插入IRES-DTR至DC-SIGN外显子7位点的ES细胞培育DC SIGN-DTR转基因小鼠流程图；
图6：DC SIGN-DTR转基因小鼠(F1)PCR鉴定结果图；
图7：DC SIGN-DTR转基因小鼠腹腔注射DT特异性清除小鼠单核细胞衍生DC的流式细胞术检测敲除效率结果图。
具体实施方式
实施例1：构建带长同源臂的靶向整合外源基因IRES-DTR至DC-SIGN外显子7位点的打靶载体。
从genome.ucsc.edu网站检索并下载获得小鼠DC-SIGN基因组序列，结合小鼠DC-SIGN(Genbank No:NM_133238.5)序列，确定各外显子和内含子位置及序列。包含整个DC-SIGN基因的BAC Clone:RP23-12K14从Chieldren’hospotal Oakland Research Institute购买获得，BAC DNA 利用
HiPure Plasmid Filter Maxiprep Kit(Invitrogen)制备备用。
PCR扩增目的基因片段DC-SIGN 5’侧同源臂(retrieval 5HA)和DC-SIGN 3’侧同源臂(retrieval 3HA)：以RP23-12K14 BAC DNA为模板，利用正向引物DCSIGN-5HA-F(NotI)-ACCACCGCGGCCGCACATCTGCCCATAGCACACAG(SEQ ID NO.1)和反向引物DCSIGN-5HA-R(SpeI)-ACCACCACTAGTAGCATCAGGAGGGAGCTCTAC(SEQ ID NO.2)作PCR扩增DC-SIGN5’侧同源臂(retrieval 5HA)(SEQ ID NO.3)；以RP23-12K14 BAC DNA为模板，利用正向引物DCSIGN-3HA-F(SpeI)-ACCACCACTAGTTGTTTGCTCCTTTCTGACCAG(SEQ ID NO.4)和反向引物DCSIGN-3HA-R(BamHI)-ACCACCGGATCCGCATAGACTCTTGATGGTGCATATT(SEQ ID NO.5)作PCR扩增DC-SIGN 3’侧同源臂(retrieval 3HA)(SEQ ID NO.6)。下划线序列为酶切位点。
表1：PCR反应体系如下：
表2：PCR扩增条件如下：
将retrieval 5HA和retrieval 3HA克隆至带阴性选择标记基因的载体pL253-retrivied-empty：retrieval 5HA用NotI、SpeI(NEB)双酶切，retrieval 3HA用SpeI、BamHI(NEB)双酶切，带阴性选择标记基因的载体pL253-retrivied-empty(counter-SelectionBAC Modification Kit(Genebridges,USA))用NotI、BamHI(NEB)双酶切。酶切的PCR产物经AxyPrep PCR Clean-Up Kit(Axygen)纯化回收，酶切的质粒载体经琼脂糖凝胶电泳分离后切出目的条带并利用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit(Axygen)回收。利用T4 DNAligase(NEB)将载体与目的片段连接，接着转化至大肠杆菌DH5α，挑取单个菌落培养，提取质粒DNA，经酶切初步鉴定后送商业公司测序。测序结果显示retrieval 5HA和retrieval3HA插入成功并命名为提取载体pL253-retrieval 5HA-retrieval 3HA-MCL-HSV TK，载体序列如SEQ ID NO.7所示。
电穿孔法将质粒pRed/ET转化入BAC Clone DCSIGN-IRES-DTR-PEN：BAC Clone DCSIGN-DCSIGN-IRES-DTR-PEN(本实验室构建，正在申报专利)是将外源基因IRES-DTR-PGK-EM7-Neo靶向插入包含整个小鼠DC-SIGN基因的BAC Clone RP23-12K14得到，部分基因结构如附图1所示。将BAC Clone DCSIGN-IRES-DTR-PEN接种于含氯霉素(15μg/mL)、新霉素(15μg/mL)的LB平板，37℃培养16h。挑选1个克隆于有1mL LB培养基(含15μg/mL氯霉素,15μg/mL新霉素)的2mL离心管(盖子上戳一个洞使能够通气)，37℃200rpm培养过夜。取30μL培养过夜的大肠杆菌克隆于有1.4mL LB培养基(含15μg/mL氯霉素,15μg/mL新霉素)的2mL离心管，37℃1000RPM，培养2-3h扩增得对数期的大肠杆菌。扩增的大肠杆菌2℃11000rpm离心30s，吸弃上清。大肠杆菌沉淀用1mL冰上预冷的ddH20清洗3遍，最后留下约30μL ddH2O重悬大肠杆菌，加入1μL pRed/ET(20ng/μL,counter-Selection BAC Modification Kit(Genebridges,USA))，轻弹混匀，冰上静置。转移大肠杆菌悬液至冰上预冷的1mm电穿孔管，利用
Electroporator 2510进行电穿孔，1350V 10μF 600 Ohms，将pRed/ET转化入BAC Clone DCSIGN-IRES-DTR-PEN。用1mL无抗生素LB培养基重悬大肠杆菌并转移至2mL离心管，30℃1000rpm培养70min使抗性基因表达。
L-阿拉伯糖诱导Red/ET表达：取100μL转入pRed/ET并诱导抗性基因表达的大肠杆菌于含四环素(3μg/mL)、氯霉素(15μg/mL)、新霉素(15μg/mL)的LB平板，涂布均匀，30℃避光培养16h。挑取1个单克隆于有1mL LB培养基(含3μg/mL四环素，15μg/mL氯霉素)的2mL盖子戳洞的离心管，30℃200rpm培养过夜。取30μL大肠杆菌于1个有1mL LB培养基(含3μg/mL四环素，15μg/mL氯霉素)的2mL盖子戳洞的离心管，30℃1100rpm培养2h，直到OD600大约0.3。加入50μL L-阿拉伯糖至终浓度为0.3-0.4％，37℃200rpm培养45-60min，诱导Red/ET表达。
电穿孔法将线性化的提取载体pL253-retrieval 5HA-retrieval 3HA-MCL-HSVTK转化入带pRED/ET的DCSIGN-IRES-DTR-PEN BAC Clone：表达Red/ET的大肠杆菌进行离心，2℃11000rpm 30s，吸弃上清。大肠杆菌沉淀用1mL冰上预冷的ddH20清洗3遍，最后留下约30μL ddH2O重悬大肠杆菌，加入1-2μl(100-200ng)用SpeI(NEB)酶切线性化的提取载体pL253-retrieval 5HA-retrieval 3HA-MCL-HSV TK，轻弹混匀，冰上静置。转移大肠杆菌悬液至冰上预冷的1mm电穿孔管，利用
Electroporator 2510进行电穿孔，1350V10μF 600Ohms，将线性化的提取载体pL253-retrieval 5HA-retrieval 3HA-MCL-HSV TK转化入BAC Clone DCSIGN-IRES-DTR-PEN。用1mL无抗生素LB培养基重悬大肠杆菌并转移至2mL离心管，30℃1000rpm培养70min使IRES-DTR-PGK-EM7-NEO及两侧长同源臂被同源重组提取至pL253-retrieval 5HA-retrieval 3HA-MCL-HSV TK，得到带有DC-SIGN 5’同源臂(～2kb)和3’同源臂(～20kb)的打靶载体，命名为pL253-DCSIGN 5HA L-IRES-DTR-PEN-DCSIGN 3HA L-MCL-HSV TK，序列如SEQ ID NO.8所示。取100μL大肠杆菌于含氯霉素(15μg/mL)的LB平板，涂布均匀，37℃培养过夜，pRed/ET在37℃时会丢失。
筛选和鉴定得到的含长同源臂的打靶载体pL253-DCSIGN 5HA L-IRES-DTR-PEN-DCSIGN 3HA L-MCL-HSV TK：挑选10个单克隆分别于有10μl ddH2O的1.5mL离心管，吹打混匀。取1μl菌液作为模板，利用正向引物DCSIGN-F-CAGAGGAAACCTTTTAGAAGTTGG(SEQ IDNO.9)和反向引物MCL-R-CCACACTGCTCGACTCTAGAGG(SEQ ID NO.10)作菌落PCR，剩余菌液4℃保存备用。
表3：菌落PCR反应体系如下：
表4：菌落PCR反应条件如下：
PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳鉴定，成功提取IRES-DTR-PGK-EM7-NEO及两侧长同源臂的大肠杆菌BAC阳性克隆可见约1.2kb条带。阳性克隆用含氯霉素(15μg/mL)的LB培养基扩增，用
HiPure Plasmid Filter Maxiprep Kit(Invitrogen)制备pL253-DCSIGN 5HA L-IRES-DTR-PEN-DCSIGN 3HA L-MCL-HSV TK备用。阳性BAC克隆菌液可离心后去上清，用20％甘油的LB培养基重悬，-80℃保存。
实施例2：制备靶向插入IRES-DTR至DC-SIGN外显子7位点的小鼠胚胎干(ES)细胞
小鼠胚胎成纤维细胞(MEFs)培养：MEFs(ATCC)培养和维持于MEF培养基，适时传代和冻存。MEF培养基为DMEM培养基加入10％FBS、100U/ml青链霉素、0.05mM 2巯基乙醇、2mML-谷氨酰胺。
Balb/c ES细胞培养：MEFs细胞使用前用30Grayγ射线灭活处理作为滋养层细胞，将Balb/c ES细胞(Merck)接种至灭活的MEFs上，用ES培养基培养和维持。ES细胞长至70％丰度以1：3比例传代。ES培养基为DMEM培养基加入15％FBS、100U/ml青链霉素、1mM丙酮酸钠、0.1mM非必需氨基酸、0.05mM 2巯基乙醇、2mM L-谷氨酰胺、1μg/L白血病抑制因子(LIF)。
ES细胞电转：ES细胞经胰酶消化收集后，经PBS清洗1次，用电转缓冲液重悬(Millipore)，调整细胞密度至0.5X107/ml。打靶载体pL253-DCSIGN 5HA L-IRES-DTR-PEN-DCSIGN 3HA L-MCL-HSV TK经NotI酶切线性化，将50μg线性化的打靶载体加入0.6mL上述ES细胞悬液，并转移至Eppendorf电转仪配套电转杯中，室温静置5min。利用
Electroporator 2510电转仪320V 500μF电转，取出电转杯室温放置5min。转移至含30ml培养液的50ml离心管中混匀，再均匀分配至事先准备好含滋养层细胞的3个10cm培养皿中，37℃5％CO2培养箱中培养。
靶向插入IRES-DTR至DC-SIGN外显子7位点的ES细胞的筛选和鉴定：电转后的ES细胞在24小时后，换成含800μg/ml G418和200μM ganciclovir培养液，此后每天更换含药物的培养液。连续药物处理7天后，在尼康SMZ1500显微镜下用特制吸管挑取胚胎干细胞单克隆并转移至事先准备好的含滋养层细胞及培养液的48孔培养板中，每种打靶载体各挑取12个左右单克隆，于37℃5％CO2培养箱中培养。24小时后，用胰酶消化挑取的单克隆细胞并转移至新的事先准备好的含滋养层细胞及培养液的48孔培养板中，于37℃5％CO2培养箱中培养3-4天，每天换液。待单克隆细胞长至80％丰度，细胞经胰酶消化后，将细胞悬液均分转移至事先准备好的含滋养层细胞及培养液的24孔培养板中，并于37℃5％CO2培养箱中培养。待细胞丰度达70％，消化和收集ES细胞，利用QIAamp DNA Mini Kit(Qiagen)提取基因组DNA。以提取的小鼠ES细胞基因组DNA为模板，利用正向引物ES-screen-F-AATGAAGAGAAAGTGAAGTTGGGC(SEQ ID NO.11)和反向引物ES-screen-R-TGCACAAGAGTGAATGAGGTG(SEQ ID NO.12)进行PCR扩增。
表5：PCR反应体系如下：
表6：PCR扩增条件为：
PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳鉴定，靶向插入IRES-DTR至DC-SIGN外显子7位点的ES细胞阳性克隆可见约4.1kb条带，如附图4所示。阳性克隆ES细胞消化后用胚胎干细胞冻存液(Millipore)重悬，-80℃冻存备用。
实例3：繁育靶向插入IRES-DTR至DC-SIGN外显子7位点的DC SIGN-DTR转基因小鼠
囊胚注射ES细胞获得DC SIGN-DTR转基因嵌合体小鼠：选8周龄发育良好的C57BL/6J公鼠，与C57BL/6J母鼠按1：2合笼，次日清晨挑选阴栓阳性母鼠，若母鼠怀孕5天后可在子宫取得囊胚。将结扎KM公鼠与正常KM母鼠按1：2合笼，选取有阴栓且阴门肿胀、红润的母鼠，即为假孕KM母鼠。将靶向插入IRES-DTR至DC-SIGN外显子7位点的ES细胞注射到C57BL/6J小鼠囊胚中，再接种到假孕的KM母鼠子宫中，出生得到嵌合体小鼠(F0)，即C57来源的细胞和BALB/c来源的ES细胞共同存在于同一个体中，表现为动物毛色为黑色和白色混杂。
提取小鼠鼠尾DNA方法：小鼠鼠尾置于1.5mL离心管，加入300μL NaOH溶液(50mM)，金属浴100℃30min。冷却至室温，加入30μL Tris-HCl(1M,pH6.8)混匀调节pH。10000g离心1min，上清即为含小鼠鼠尾DNA的溶液，可直接用于PCR。
鼠尾PCR鉴定转基因嵌合体小鼠：以转基因小鼠鼠尾DNA作为模板，利用正向引物DCSIGN-screen-F-CCAATCAAGGTGGAGAATGTC(SEQ ID NO.13)和反向引物DCSIGN-screen-R-AGACCCCTAGGAATGCTCGT(SEQ ID NO.14)作PCR扩增，PCR反应体系同表5，PCR扩增条件同表6。PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳鉴定，插入IRES-DTR的阳性小鼠可见约1.2kb条带。
繁育DC SIGN-DTR转基因小鼠：白色占比越高的嵌合体小鼠，ES细胞发育成生殖细胞的可能性越大，利用白色占比最高的5只雄性转基因嵌合体小鼠与BALB/c雌鼠交配，得到的DC SIGN-DTR转基因杂合小鼠应为白色。小白鼠经鼠尾PCR鉴定后得到DC SIGN-DTR转基因杂合小鼠，即为F1代小鼠。鼠尾PCR鉴定方法同[提取小鼠鼠尾DNA方法,鼠尾PCR鉴定转基因嵌合体小鼠步骤]。F1代小鼠与C57BL/6J母鼠杂交进行传代，培育。培养方法按照常规小鼠饲养模式进行。
实施例4：DC SIGN-DTR转基因小鼠经白喉毒素诱导建立清除单核细胞衍生DC的小鼠模型
本实施例采用腹腔注射白喉毒素(DT)，检测小鼠淋巴结中单核细胞衍生DC的占比来检测单核细胞衍生DC的敲除效率，理论上小鼠全身的单核细胞衍生DC都能被敲除。
DC SIGN-DTR转基因小鼠单核细胞衍生DC清除：DC SIGN-DTR转基因小鼠在第1、第2、第4、第7天分别腹腔注射DT(20ng/g)，小鼠生长状态无明显变化。对照组小鼠在第1、第4天用4.5Grayγ射线照射4小时。第8天用脱颈椎法处死小鼠，取小鼠淋巴结，用流式细胞术检测淋巴结中单核细胞衍生DC的表达情况。
流式细胞术检测淋巴结中单核细胞衍生DC的表达：获取小鼠淋巴结，制备成单细胞悬液，用2％FCS-PBS重悬细胞，经Fc blocker封闭Fc受体后，利用anti-mouse-CD11c、anti-mouse-MHCII、anti-mouse-CD11b、anti-mouse-CD103流式抗体染色，染色完毕洗去多余抗体，单细胞悬液用CytoFLEX LX Flow Cytometer上机检测。其中CD11c、MHCII、CD11b均高表达的细胞为单核细胞衍生DC。经DT诱导后小鼠单核细胞衍生DC敲除率约达80-90％，如附图7所示(LPS作用是诱导单核细胞分化为单核细胞衍生DC)。
可以理解的是，对本领域技术人员来说，对本发明的技术方案及发明构思加以等同替换或改变都应属于本发明所附的权利要求的保护范围。
序列表
<110> 浙江大学医学院附属第一医院
<120> 打靶载体及白喉毒素调控清除单核细胞衍生树突状细胞的转基因小鼠的构建方法和应用
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 35
<212> DNA
<213> 引物DCSIGN-5HA-F(NotI)
<400> 1
<210> 2
<211> 33
<212> DNA
<213> 引物DCSIGN-5HA- R(SpeI)
<400> 2
<210> 3
<211> 186
<212> DNA
<213> 基因片段retrieval 5HA()
<400> 3
<210> 4
<211> 33
<212> DNA
<213> 引物DCSIGN-3HA-F(SpeI)
<400> 4
<210> 5
<211> 37
<212> DNA
<213> 引物DCSIGN-3HA-R(BamHI)
<400> 5
<210> 6
<211> 240
<212> DNA
<213> 基因片段retrieval 3HA()
<400> 6
<210> 7
<211> 5706
<212> DNA
<213> 提取载体retrieval 5HA- retrieval 3HA-MCL-HSV TK()
<400> 7
<210> 8
<211> 30136
<212> DNA
<213> 打靶载体pL253-DCSIGN 5HA L-IRES-DTR-PEN-DCSIGN 3HA L-MCL-HSV TK()
<400> 8
Claims (6)
1.一种带小鼠DC-SIGN长同源臂的整合外源基因IRES-DTR的打靶载体，其特征在于，所述靶向打靶载体序列如SEQ ID NO.8所示，命名为pL253-DCSIGN 5HA L-IRES-DTR-PEN-DCSIGN 3HA L-MCL-HSV TK。
2.一种用于构建如权利要求1所述打靶载体的提取载体，其特征在于：所述提取载体序列如SEQ ID NO.7所示，命名为载体pL253-retrieval 5HA-retrieval 3HA-MCL-HSV TK。
3.一种提取载体的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
(1)以RP23-12K14 BAC DNA为模板，利用序列如SEQ ID NO.1所示的正向引物和序列如SEQ ID NO.2所示的反向引物进行PCR，扩增出序列如SEQ ID NO.3所示的基因片段DC-SIGN5’侧同源臂；以RP23-12K14 BAC DNA为模板，利用序列如SEQ ID NO.4所示的正向引物和序列如SEQ ID NO.5所示的反向引物进行PCR，扩增出序列如SEQ ID NO.6所示的基因片段DC-SIGN 3’侧同源臂；
(2)将retrieval 5HA和retrieval 3HA利用酶切位点NotI、SpeI、BamHI克隆至带阴性选择标记HSV TK的载体pL253-retrivied-empty，得到序列如SEQ ID NO.7所示的提取载体pL253-retrieval 5HA-retrieval 3HA-MCL-HSV TK。
4.一种打靶载体的制备方法，其特征在于：所述方法包括如下步骤：
(1)电穿孔法将质粒pRED/ET转化入BAC Clone DCSIGN-IRES-DTR-PEN，并用L-阿拉伯糖诱导Red/ET表达；
(2)电穿孔法将利用SpeI酶切线性化的pL253-retrieval 5HA-retrieval 3HA-MCL-HSV TK提取载体转化入上述表达RED/ET的BAC Clone DC SIGN-IRES-DTR-PEN，同源重组得到序列如SEQ ID NO.8所示的带有DC-SIGN 5’同源臂(～2kb)和3’同源臂(～20kb)的打靶载体，命名为打靶载体pL253-DCSIGN 5HA L-IRES-DTR-PEN-DCSIGN 3HA L-MCL-HSV TK；
(3)挑选单克隆，利用序列如SEQ ID NO.9所示的正向引物和序列如SEQ ID NO.10所示的反向引物作菌落PCR，成功提取IRES-DTR-PGK-EM7-NEO和DC-SIGN同源臂的载体能够得到约1.2kb的条带。
5.一种打靶载体在靶向整合外源基因IRES-DTR至DC-SIGN外显子7位点构建DC SIGN-DTR转基因小鼠的应用。
6.根据权利要求5所述的打靶载体在靶向整合外源基因IRES-DTR至DC-SIGN外显子7位点构建DC SIGN-DTR转基因小鼠的应用，其特征在于，转基因小鼠的构建方法包括以下步骤：
(1)构建靶向整合外源基因IRES-DTR至DC-SIGN外显子7位点构建小鼠胚胎干细胞株；
(1.1)电穿孔法将利用NotI酶切线性化的打靶载体pL253-DCSIGN 5HA L-IRES-DTR-PEN-DCSIGN 3HA L-MCL-HSV TK转入ES细胞，使IRES-DTR-PGK-EM7-NEO同源重组至DC-SIGN外显子7位点；
(1.2)利用G418阳选和ganciclovir阴选，挑选得到靶向插入IRES-DTR-PGK-EM7-NEO至DC-SIGN外显子7位点的BALB/C ES细胞克隆；
(1.3)提取ES细胞基因组DNA为模板，利用序列为SEQ ID NO.11的正向引物和序列为SEQ ID NO.12的反向引物进行PCR鉴定，靶向插入IRES-DTR-PGK-EM7-NEO至DC-SIGN外显子7位点的ES细胞阳性克隆可见4.1kb条带；
(2)靶向插入IRES-DTR至DC-SIGN外显子7位点的ES细胞注射入C57BL/6J囊胚，再接种到假孕的KM母鼠子宫中，出生得到毛色为黑色和白色混杂嵌合体小鼠；
(3)提取转基因小鼠鼠尾DNA作为模板，利用序列为SEQ ID NO.13的正向引物和序列为SEQ ID NO.14的反向引物作PCR鉴定，带有IRES-DTR的阳性小鼠可见1.2kb条带；
(4)利用白色占比最高的5只雄性转基因嵌合体小鼠与BALB/c雌鼠交配，得到毛色为白色的小鼠可能为DC SIGN-DTR转基因杂合小鼠，小白鼠经鼠尾PCR鉴定后得到DC SIGN-DTR转基因小鼠。
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-
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