CN108753728B

CN108753728B - 一种用于检验car-t细胞杀伤效果的靶细胞及其制备方法和应用

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Publication number: CN108753728B
Application number: CN201810610851.6A
Authority: CN
Inventors: 焦顺昌; 张嵘; 张天赋
Original assignee: Beijing Dingcheng Taiyuan Biotechnology Co ltd
Current assignee: Beijing Dingcheng Taiyuan Biotechnology Co ltd
Priority date: 2018-06-14
Filing date: 2018-06-14
Publication date: 2021-02-02
Anticipated expiration: 2038-06-14
Also published as: CN108753728A

Abstract

本发明提供了一种用于检验CAR‑T细胞杀伤效果的靶细胞CCC‑3T3，属于细胞工程技术领域；所述靶细胞CCC‑3T3为表达CAR‑T细胞靶抗原基因以及Caveolin‑1和caspase‑3的融合蛋白基因的小鼠成纤维样细胞。所述靶细胞CCC‑3T3的制备方法为：用慢病毒转染法将所述Caveolin‑1和caspase‑3的融合蛋白基因转入小鼠成纤维样细胞获得表达融合蛋白的CC‑3T3细胞；然后用慢病毒转染法将CAR‑T细胞靶抗原基因转入CC‑3T3细胞，获得靶细胞CCC‑3T3。所述靶细胞CCC‑3T3，杀伤背景低，对杀伤信号敏感，能准确反应效应细胞的特异性杀伤能力。

Description

一种用于检验CAR-T细胞杀伤效果的靶细胞及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于细胞工程技术领域，尤其涉及一种用于检验CAR-T细胞杀伤效果的靶细胞及其制备方法和应用。

背景技术

杀伤功能是机体免疫功能的一个重要方面，免疫系统中有多种具有杀伤功能的靶细胞，如自然杀伤细胞(NK)、细胞毒性T细胞(CTL)、具有ADCC作用的单核细胞巨噬细胞等。CAR-T细胞全称为嵌合抗原受体T细胞，是目前较为有效的恶性肿瘤的治疗方式之一，和其它免疫疗法类似，它的基本原理就是利用病人自身的免疫细胞来清除癌细胞。

常规的杀伤实验靶细胞，多采用人类永生化细胞或者肿瘤细胞，如K562细胞、293T细胞等，由于这些细胞是人类的永生化细胞，会有很多除了靶抗原蛋白以外的突变蛋白表达到细胞表面，或者被HLA分子递呈到细胞表面，这就导致效应细胞对靶细胞进行杀伤时，除了针对靶抗原的特异性杀伤以外，还有对其他蛋白的非特异性杀伤，杀伤背景高，当效应细胞中特异性T细胞CAR-T细胞比例较低时，就会出现假阴性结果。另外，常规的靶细胞还存在对杀伤信号不敏感，自身增殖速度过快，无法进行长时间杀伤实验等问题。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种用于检验CAR-T细胞杀伤效果的靶细胞及其制备方法和应用，本发明提供的靶细胞杀伤背景低，对杀伤信号更敏感，能更准确的反应效应细胞的特异性杀伤能力，同时靶细胞自身增殖速度慢，能够进行较长时间的杀伤试验。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：一种用于检验CAR-T细胞杀伤效果的靶细胞CCC-3T3，所述靶细胞CCC-3T3为表达CAR-T细胞靶抗原基因以及Caveolin-1和caspase-3的融合蛋白基因的小鼠成纤维样细胞。

优选的，所述Caveolin-1和caspase-3的融合蛋白基因包括顺次连接的Caveolin-1基因、连接肽基因和caspase-3基因。

优选的，所述Caveolin-1基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

优选的，所述caspase-3基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

优选的，所述连接肽的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。

优选的，所述CAR-T细胞靶抗原基因为CD19基因、CD20基因、EGFR基因或Her2基因。

优选的，所述CAR-T细胞靶抗原CD19基因的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。

优选的，所述小鼠成纤维样细胞来源于ATCC细胞库，产品编号为

CRL-1658^TM。

本发明还提供了所述靶细胞CCC-3T3的制备方法，包括以下步骤：

1)用连接肽将Caveolin-1基因和caspase-3基因连接获得Caveolin-1和caspase-3的融合蛋白基因；

2)用慢病毒转染法将所述Caveolin-1和caspase-3的融合蛋白基因转入小鼠成纤维样细胞获得表达融合蛋白的CC-3T3细胞；

3)慢病毒转染法将CAR-T细胞靶抗原基因转入CC-3T3细胞，获得靶细胞CCC-3T3。

本发明还提供了所述靶细胞CCC-3T3在检验CAR-T细胞杀伤效果中的应用。

优选的，所述靶细胞CCC-3T3的浓度为(6～10)×10⁴个/mL，效靶比为(38～42)：1。

本发明的有益效果：本发明提供的用于检验CAR-T细胞杀伤效果的靶细胞CCC-3T3，是能够同时表达CAR-T细胞靶抗原基因以及Caveolin-1和caspase-3的融合蛋白基因的小鼠成纤维样细胞，由于靶细胞为小鼠成纤维样细胞而非人类细胞，自身不表达人类HLA分子和人类蛋白，可以避免常规靶细胞的非特异性杀伤；杀伤背景低，即使效应细胞中特异性T细胞(CAR-T细胞)比例较低时，也不会出现假阴性结果。另外，所述靶细胞CCC-3T3增殖速度适中，可进行长时间杀伤实验(48～72h)，并且对杀伤信号敏感，能更准确的反应效应细胞的特异性杀伤能力。

附图说明

图1为携带Caveolin-1和caspase-3的融合蛋白基因的质粒结构图；

图2为携带CAR-T细胞靶抗原CD19基因的质粒结构图；

图3为构建的CC-3T3细胞系流式检测结果；

图4为CCC-3T3细胞作为靶细胞进行杀伤实验结果图；

图5为使用Car-CD19-T细胞作为效应细胞，使用HEK-293T和HEK-293T-CD19作为靶细胞的杀伤率变化曲线图；

图6为使用Car-CD19-T细胞作为效应细胞，使用CC-3T3和CCC-3T3-CD19作为靶细胞的杀伤率变化曲线图；

图7为CAR-T细胞对不同靶细胞的杀伤率结果。

具体实施方式

本发明提供了一种用于检验CAR-T细胞杀伤效果的靶细胞CCC-3T3，所述靶细胞CCC-3T3为表达CAR-T细胞靶抗原基因以及Caveolin-1和caspase-3的融合蛋白基因的小鼠成纤维样细胞。

在本发明中，所述靶细胞CCC-3T3以小鼠成纤维样细胞为初始细胞；所述小鼠成纤维样细胞优选为Swiss小鼠胚胎中获得，并保存于ATCC细胞库中，所述小鼠成纤维样细胞的产品编号优选为

CRL-1658^TM。

在本发明中，所述靶细胞CCC-3T3表达Caveolin-1和caspase-3的融合蛋白基因。在本发明中，所述Caveolin-1和caspase-3的融合蛋白基因包括顺次连接的Caveolin-1基因、连接肽基因和caspase-3基因。本发明中，所述Caveolin-1基因的核苷酸序列优选的如SEQ ID No.1所示，所述Caveolin-1基因编码的氨基酸序列优选如SEQ ID No.5所示；所述caspase-3基因的核苷酸序列优选的如SEQ ID No.2所示，所述caspase-3基因编码的氨基酸序列优选如SEQ ID No.6；所述连接肽的核苷酸序列优选的如SEQ ID No.3所示，所述连接肽的氨基酸序列优选如SEQ ID No.7。本发明中，靶细胞CCC-3T3表达Caveolin-1和caspase-3的融合蛋白。

在本发明中，所述靶细胞CCC-3T3表达CAR-T细胞靶抗原基因。本发明对所述CAR-T细胞靶抗原基因的具体种类没有限定，只要能够实现靶细胞表面表达CAR-T细胞特异性识别的位点即可。在本发明中，所述CAR-T细胞靶抗原基因为CD19基因、CD20基因、EGFR基因或Her2基因。在本发明中，所述CAR-T细胞靶抗原CD19基因的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示，所述CAR-T细胞靶抗原CD 19基因编码的氨基酸序列如SEQ ID No.8所示。本发明中所述CAR-T细胞靶抗原CD20基因的核苷酸序列如SEQ ID No.9所示，所述CAR-T细胞靶抗原CD20基因编码的氨基酸序列如SEQ ID No.10所示。本发明中所述CAR-T细胞靶抗原EGFR基因的核苷酸序列如SEQ ID No.11所示，所述CAR-T细胞靶抗原EGFR基因编码的氨基酸序列如SEQID No.12所示。本发明中所述CAR-T细胞靶抗原Her2基因的核苷酸序列如SEQ ID No.13所示，所述CAR-T细胞靶抗原Her2基因编码的氨基酸序列如SEQ ID No.14所示。本发明中所述CAR-T细胞靶抗原CD19基因、CD20基因、EGFR基因或Her2基因能够使靶细胞表面表达CAR-T细胞特异性识别的抗原CD19，使CAR-T细胞能够快速、特异的识别靶细胞。

本发明还提供了所述靶细胞CCC-3T3的制备方法，包括以下步骤：1)用连接肽将Caveolin-1基因和caspase-3基因连接获得Caveolin-1和caspase-3的融合蛋白基因；2)用慢病毒转染法将所述Caveolin-1和caspase-3的融合蛋白基因转入小鼠成纤维样细胞获得表达融合蛋白的CC-3T3细胞；3)慢病毒转染法将CAR-T细胞靶抗原基因转入CC-3T3细胞，获得靶细胞CCC-3T3。

在本发明中，用连接肽将Caveolin-1基因和caspase-3基因连接获得Caveolin-1和caspase-3的融合蛋白基因；在本发明具体实施过程中，所述融合基因优选的通过人工合成的方法，合成顺次连接的Caveolin-1基因、连接肽基因和caspase-3基因为融合基因。

本发明在获得Caveolin-1和caspase-3的融合蛋白基因后，利用慢病毒转染法将所述Caveolin-1和caspase-3的融合蛋白基因转入小鼠成纤维样细胞获得表达融合蛋白的CC-3T3细胞。在本发明中，获得表达融合蛋白CC-3T3细胞的方法，包括以下步骤：S1)将携带融合基因的质粒、慢病毒包装质粒、DMEM培养基混合后获得预混质粒；S2)将所述预混质粒与PEI、DMEM混合后获得待包装质粒S3)将所述待包装质粒与细胞培养液混合培养，收集混合培养的上清液获得携带融合基因的慢病毒S4)将所述携带融合基因的慢病毒转染小鼠成纤维样细胞获得表达融合蛋白的CC-3T3细胞。

在本发明中所述携带融合基因的质粒的结构图谱如附图1所示。本发明对所述慢病毒包装质粒没有特殊限定，采用本领域常规的慢病毒包装质粒，能够实现慢病毒包装即可。在本发明中，所述携带融合基因的质粒与慢病毒包装质粒的质量比优选为1∶(2.5～3.5)，更优选为1∶3。在本发明中，步骤S1)中所述携带融合基因的质粒与DMEM培养基的质量体积比(μg/μl)优选为1∶220～280，更优选为1∶250。

本发明在获得预混质粒后，将所述预混质粒与PEI、DMEM培养基混合后获得待包装质粒。在本发明中，所述混合的时间优选为15～25min，更优选为20min。在本发明中，所述预混质粒与PEI、DMEM培养基混合的质量体积比(μg/μl·μl)优选为4∶(8～12)∶(220～280)，更优选为4∶10∶250。

本发明在获得获得待包装质粒后，将所述待包装质粒与细胞培养液混合培养，收集混合培养的上清液获得携带融合基因的慢病毒。在本发明中，所述细胞培养液优选为HEK-293T细胞培养液。在本发明中，所述HEK-293T细胞优选的来源于ATCC细胞库；所述HEK-293T细胞的产品货号为

CRL-11268^TM。在本发明中，所述混合培养的温度优选为36～38℃，更优选为37℃；所述混合培养优选在5％(体积)CO₂的环境中进行；本发明中所述混合培养的时间优选为48～72h。本发明在所述混合液培养后，收集混合培养的上清液获得携带融合基因的慢病毒。本发明在获得所述上清液后，优选的还包括浓缩步骤，得到携带融合基因的慢病毒，本发明中所述浓缩步骤优选为使用PEG-8000浓缩方法获得浓缩慢病毒。

本发明在获得携带融合基因的慢病毒，将所述携带融合基因的慢病毒转染小鼠成纤维样细胞获得表达融合蛋白的CC-3T3细胞。在本发明中，所述转染为将所述携带融合基因的慢病毒与小鼠成纤维样细胞混合后进行共培养；所述共培养的时间优选为2～3d，所述共培养的温度和环境与上述混合培养一致，在此不再赘述。本发明所述共培养过程中，携带融合基因的慢病毒转染小鼠成纤维样细胞，将融合基因整合到所述小鼠成纤维样细胞的基因组中获得表达融合蛋白的CC-3T3细胞。

本发明在获得所述表达融合蛋白的CC-3T3细胞后，优选的采用流式细胞仪筛选方法或抗生素筛选方法筛选CC-3T3细胞的稳转细胞系。在本发明中，所述流式细胞仪筛选方法具体为将细胞置于流式细胞仪中根据细胞GFP阳性表达率选择表达阳性率前10％的分群进行流式分选，筛选获得的CC-3T3细胞的纯度优选为99～100％之间。本发明中，所述抗生素筛选优选为采用含2～10μg/mL嘌呤霉素的新鲜DMEM培养基培养表达融合蛋白的CC-3T3细胞，每2～3天替换新鲜配制的含2～10μg/mL嘌呤霉素的新鲜DMEM培养基，连续培养25～35d获得CC-3T3细胞的稳转细胞系；筛选获得的CC-3T3细胞的纯度优选为99～100％之间。

本发明在获得表达融合蛋白的CC-3T3细胞后，采用慢病毒转染法将CAR-T细胞靶抗原基因转入CC-3T3细胞，获得靶细胞CCC-3T3。具体包括以下步骤：y1)将携带CAR-T细胞靶抗原基因的质粒、慢病毒包装质粒、DMEM培养基混合后获得预混质粒；y2)将所述预混质粒与PEI、DMEM混合后获得待包装质粒；y3)将所述待包装质粒与细胞培养液混合培养，收集混合培养的上清液获得携带CAR-T细胞靶抗原基因的慢病毒；y4)将所述携带CAR-T细胞靶抗原基因的慢病毒转染CC-3T3细胞获得靶细胞CCC-3T3。

在本发明中，所述携带CAR-T细胞靶抗原基因的质粒结构如图2所示；本发明中所述慢病毒转染法将CAR-T细胞靶抗原基因转入CC-3T3细胞的方法步骤和参数与上述用慢病毒转染法将融合蛋白基因转入小鼠成纤维样细胞中的一致，在此不再赘述。

本发明在获得所述靶细胞CCC-3T3后，优选的采用流式细胞仪筛选方法或抗生素筛选方法筛选CCC-3T3细胞的稳转细胞系；具体方法步骤与上述CC-3T3细胞的稳转细胞系一致，在此不再赘述。

本发明还提供了所述靶细胞CCC-3T3在检验CAR-T细胞杀伤效果中的应用。在本发明中，所述应用采用本领域常规的细胞杀伤试验方法即可；在本发明具体实施过程中，所述靶细胞CCC-3T3的浓度优选为(6～10)×10⁴个/mL，更优选为8×10⁴个/mL；所述CAR-T细胞的浓度优选为(2.8～3.6)×10⁶个/mL，更优选为3.2×10⁶个/mL；本发明中，所述靶细胞CCC-3T3与CAR-T细胞按照效靶比优选为(38～42)∶1，更优选为40∶1。在本发明具体实施过程中，将靶细胞CCC-3T3于效应细胞按照上述比例混合孵育后，加入Working Solution反应25～35min，用Stop Solution停止反应，采用酶标仪测定OD490，计算杀伤率。在本发明中，所述孵育的温度优选为36～38℃，更优选为37℃，所述孵育的时间优选为2.5～3.5h，更优选为3h。

下面结合实施例对本发明提供的一种用于检验CAR-T细胞杀伤效果的靶细胞及其制备方法和应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

1、构建慢病毒转染实验

(1)复苏培养HEK-293T(

CRL-11268^TM)，传1-2代。在转染前一天收集细胞并计数，稀释至5×105cells/mL后，铺20mL至15cm培养皿，放置于37℃，5％CO2培养箱培养。

(2)转染当天，取两支15mL离心管，按表1加入质粒及试剂。

表1转染用试剂

(3)室温静止5min。

(4)将A管液体转入到B管内，混匀。

(5)室温静止20min。

(6)细胞换液：用移液管吸去培养液，加入10mL DMEM后轻摇，之后吸去。加入18mLDMEM至培养皿，轻摇混匀后置于37℃，5％CO2培养。

(7)用5mL移液管枪头吸取A、B两管混合物后缓慢打出至培养液中，之后置于37℃，5％CO2培养。记为转染0h。

(8)转染6h后，加入2.75mL FBS，轻摇混匀，继续培养。

(9)转染48h后，吸出上清至离心瓶中，放于4℃保存。补加27mL 10％FBSDMEM至培养皿继续培养。

(10)转染72h后，进行二次病毒上清液收集，吸出液体与48h收集的上清液混合，50mL离心管分装，于4℃，4000g，离心10min，去除细胞碎片。

(11)使用慢病毒PEG-8000浓缩方法浓缩表达融合基因慢病毒。

使用相同方法获得表达CAR-T细胞靶抗原CD19基因的慢病毒。

(12)将表达融合基因慢病毒转染小鼠成纤维样细胞

CRL-1658^TM获得CC-3T3细胞；

(13)将表达CAR-T细胞靶抗原CD19基因的慢病毒转染CC-3T3细胞获得CCC-3T3细胞。

具体的慢病毒感染细胞方法包括以下步骤：

(1)将培养的待感染细胞消化计数后稀释至2×10⁵个/mL，加入10cm培养皿，每皿8mL，摇匀后置于培养箱培养。

(2)次日，将包装好的病毒加至培养皿，标记好之后摇匀并置于培养箱培养，2-3d后可根据细胞数量扩大培养。

3.流式细胞仪方法筛选稳转细胞系

(1)收集10cm培养皿中的细胞，300×g离心5min，同时收集未感染细胞作为对照。

(2)每管加入1mL PBS洗细胞一次，300×g离心5min。

(3)每管加入500μL PBS重悬细胞至

5mL Round Bottom PolystyreneTest Tube中(过滤膜)，在分选后细胞收集管中加入7mL培养基，根据慢病毒感染后细胞GFP阳性表达率选择表达阳性率前10％的分群进行流式分选。

(4)使用流式细胞仪方法筛选出稳转细胞系CC-3T3保证CC-3T3细胞纯度为99％。

流式细胞筛选仪的筛选结果如图3所示，其中作图为对照细胞的流式细胞筛选图，右图为CC-3T3细胞的流式细胞筛选图；从图3中可以看出经过流式分选后CC-3T3细胞的纯度都可以达到99％左右，说明靶细胞构建成功。

3、抗生素筛选稳转细胞系实验

(1)day 0∶24孔板内以5～8x 10⁴cells/孔的密度铺板，孵育过夜；

(2)制备筛选培养基：含2-10ug/mL嘌呤霉素的新鲜培养基DMEM培养基；

(3)day1：筛选第一天，去除旧的培养基，加入一定量MOI的病毒颗粒；(加入无血清培养基的总量必须充分覆盖住细胞。)

(4)病毒转导后约6-8h，再添加1ml完全培养基(10％FBS和1％双抗，如果已经使用双抗。)到细胞内，然后孵育过夜；

(5)病毒转导后48h，使用嘌呤霉素筛选培养基替换旧的完全培养基。孵育。

(6)约每2-3天替换新鲜配制的筛选培养基；

(7)每天检测细胞并观察活细胞生长比例。

(8)筛选持续进行30天，以确保筛选出的细胞纯度

(9)使用嘌呤霉素筛选出CCC-3T3细胞，纯度为99.5％。

4、杀伤实验

(1)收集靶细胞(CC-3T3、TCC-3T3)，PBS洗一遍后加入10mL PBS用细胞刮轻轻刮下细胞，离心后加入10mL PBS洗一遍后使用2％FBS-1640重悬细胞，计数并将浓度调整为8×10⁴/mL。

(2)收集效应细胞(CAR-T细胞为将抗CD19分子抗体的Fab区与CD8分子跨膜区和CD3胞内区组成融合蛋白，表达于T细胞表面)，PBS洗两遍后，使用2％FBS-1640重悬细胞。

(3)效靶比设40∶1，效应细胞按最大比例稀释，即浓度为3.2×10⁶/mL。

(4)96孔圆底板内依次加样，设6个复孔，加完后用封口膜封上，1000rpm离心1min，之后撕掉封口膜。

(5)镜下观察后，37℃、5％CO₂培养箱，孵育3h。

(6)在3x10⁴靶细胞孔及在只有培养基的空白孔中各加10μL Lysis Buffer，37℃孵育30min。

(7)各孔加入100μL Working Solution，并用铝箔包起来，室温反应30min。

(8)各孔加入50μL Stop Solution，立即酶标仪测定OD490。

(9)计算细胞杀伤率。

细胞杀伤率结果如图4所示，其中NIH/3T3为不经过基因改造的细胞；CC-3T3为稳定转染Caveolin-1和caspase-3融合基因的细胞；CCC-3T3-CD19细胞为稳定转染Caveolin-1和caspase-3融合基因和CD19基因的细胞；HEK-293T为常规靶细胞，HEK-293T-CD19为常规的稳定转染CD19基因的细胞。从图4中可以看出CAR-T细胞可以识别并杀伤拥有CD19分子的靶细胞CCC-3T3，而对不拥有CD19分子的CC-3T3细胞和NIH/3T3细胞没有杀伤效应。并且NTC细胞对CCC-3T3-CD19、CC-3T3细胞和NIH/3T3细胞都没有杀伤。说明CCC-3T3-CD19细胞可以作为靶细胞用于检测CAR-T细胞的杀伤能力。

使用Car-CD19-T细胞作为效应细胞，使用HEK-293T和HEK-293T-CD19作为靶细胞，效靶比在2∶1时的杀伤率变化曲线如图5所示，从图5看出，杀伤实验时间点在12h之前，由于杀伤背景太高，看不出杀伤差异；24h之后才能看到对照靶细胞HEK-293T和HEK-293T-CD19细胞的杀伤差异，但是，到96h时，效应细胞对HEK-293T-CD19细胞的杀伤率显著低于对CCC-3T3-CD19的杀伤，原因可能是HEK-293T-CD19细胞在杀伤过程中还在不断增殖，造成杀伤效率降低。

使用Car-CD19-T细胞作为效应细胞，使用CC-3T3和CCC-3T3-CD19作为靶细胞，效靶比在2∶1时的杀伤率变化曲线如图6所示，从图6可以看出，在6h～96h都能有显著性差异。

实施例2

CAR-T细胞靶抗原基因替换为CD20基因，其余步骤与实施例1一致。

实施例3

CAR-T细胞靶抗原基因替换为EGFR基因，其余步骤与实施例1一致。

实施例4

CAR-T细胞靶抗原基因替换为Her2基因，其余步骤与实施例1一致。

实施例5

实施例1～4中获得的靶细胞的杀伤实验

(1)收集靶细胞(实施例1～4中的靶细胞)，PBS洗一遍后加入10mL PBS用细胞刮轻轻刮下细胞，离心后加入10mL PBS洗一遍后使用2％FBS-1640重悬细胞，计数并将浓度调整为8×10⁴/mL。

(2)收集效应细胞(CAR-T细胞为将抗CD 19分子抗体的Fab区与CD8分子跨膜区和CD3胞内区组成融合蛋白，表达于T细胞表面)，PBS洗两遍后，使用2％FBS-1640重悬细胞。

(5)镜下观察后，37℃、5％CO₂培养箱，孵育3h。

(8)各孔加入50μL Stop Solution，立即酶标仪测定OD490。

(9)计算细胞杀伤率。

结果如图7所示，其中NIH/3T3为不经过基因改造的细胞；CC-3T3为稳定转染Caveolin-1和caspase-3融合基因的细胞；CCC-3T3-CD19细胞为稳定转染Caveolin-1和caspase-3融合基因和CD19基因的细胞；CCC-3T3-CD20细胞为稳定转染Caveolin-1和caspase-3融合基因和CD20基因的细胞；CCC-3T3-EGFR细胞为稳定转染Caveolin-1和caspase-3融合基因和EGFR基因的细胞；CCC-3T3-Her2细胞为稳定转染Caveolin-1和caspase-3融合基因和Her2基因的细胞。针对不同靶抗原的CAR-T细胞对其对应的靶细胞均有比较特异性的杀伤效应，而对不携带对应抗原的靶细胞没有杀伤效应。

由上述实施例可知，本发明提供的用于检验CAR-T细胞杀伤效果的靶细胞CCC-3T3，可以避免常规靶细胞的非特异性杀伤，杀伤背景低，即使效应细胞中特异性T细胞(CAR-T细胞)比例较低时，也不会出现假阴性结果。另外，所述靶细胞CCC-3T3增殖速度适中，可进行长时间杀伤实验，并且对杀伤信号敏感，能更准确的反应效应细胞的特异性杀伤能力。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 焦顺昌

北京鼎成肽源生物技术有限公司

<120> 一种用于检验CAR-T细胞杀伤效果的靶细胞及其制备方法和应用

<160> 14

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 534

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgtctgggg gcaaatacgt agactccgag ggacatctct acactgttcc catccgggaa 60

cagggcaaca tctacaagcc caacaacaag gccatggcag acgaggtgac tgagaagcaa 120

gtgtatgacg cgcacaccaa ggagattgac ctggtcaacc gcgaccccaa gcatctcaac 180

gacgacgtgg tcaagattga ctttgaagat gtgattgcag aaccagaagg gacacacagt 240

ttcgacggca tctggaaggc cagcttcacc accttcactg tgacaaaata ttggttttac 300

cgcttgttgt ctacgatctt cggcatccca atggcactca tctggggcat ttactttgcc 360

attctctcct tcctgcacat ctgggcggtt gtaccgtgca tcaagagctt cctgattgag 420

attcagtgca tcagccgcgt ctactccatc tacgtccata ccttctgcga tccactcttt 480

gaagctattg gcaagatatt cagcaacatc cgcatcagca cgcagaaaga gata 534

<210> 2

<211> 834

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atggagaaca acaaaacctc agtggattca aaatccatta ataattttga agtaaagacc 60

atacatggga gcaagtcagt ggactctggg atctatctgg acagtagtta caaaatggat 120

tatcctgaaa tgggcatatg cataataatt aataataaga acttccataa gagcactgga 180

atgtcatctc gctctggtac ggatgtggac gcagccaacc tcagagagac attcatgggc 240

ctgaaatacc aagtcaggaa taaaaatgat cttactcgtg aagacatttt ggaattaatg 300

gatagtgttt ctaaggaaga tcatagcaaa aggagcagct ttgtgtgtgt gattctaagc 360

catggtgatg aaggggtcat ttatgggaca aatgggcctg ttgaactgaa aaagttgact 420

agcttcttca gaggcgacta ctgccggagt ctgactggaa agccgaaact cttcatcatt 480

caggcctgcc ggggtacgga gctggactgt ggcattgaga cagacagtgg gactgatgag 540

gagatggctt gccagaagat accggtggag gctgacttcc tgtatgctta ctctacagca 600

cctggttact attcctggag aaattcaaag gacgggtcgt ggttcatcca gtccctttgc 660

agcatgctga agctgtacgc gcacaagcta gaatttatgc acattctcac tcgcgttaac 720

aggaaggtgg caacggaatt cgagtccttc tccctggact ccactttcca cgcaaagaaa 780

cagatcccgt gtattgtgtc catgctcacg aaagaactgt acttttatca ctag 834

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ggcggcggca gcggcggcag cggc 24

<210> 4

<211> 1674

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

atgccacctc ctcgcctcct cttcttcctc ctcttcctca cccccatgga agtcaggccc 60

gaggaacctc tagtggtgaa ggtggaagag ggagataacg ctgtgctgca gtgcctcaag 120

gggacctcag atggccccac tcagcagctg acctggtctc gggagtcccc gcttaaaccc 180

ttcttaaaac tcagcctggg gctgccaggc ctgggaatcc acatgaggcc cctggccatc 240

tggcttttca tcttcaacgt ctctcaacag atggggggct tctacctgtg ccagccgggg 300

cccccctctg agaaggcctg gcagcctggc tggacagtca atgtggaggg cagcggggag 360

ctgttccggt ggaatgtttc ggacctaggt ggcctgggct gtggcctgaa gaacaggtcc 420

tcagagggcc ccagctcccc ttccgggaag ctcatgagcc ccaagctgta tgtgtgggcc 480

aaagaccgcc ctgagatctg ggagggagag cctccgtgtc tcccaccgag ggacagcctg 540

aaccagagcc tcagccagga cctcaccatg gcccctggct ccacactctg gctgtcctgt 600

ggggtacccc ctgactctgt gtccaggggc cccctctcct ggacccatgt gcaccccaag 660

gggcctaagt cattgctgag cctagagctg aaggacgatc gcccggccag agatatgtgg 720

gtaatggaga cgggtctgtt gttgccccgg gccacagctc aagacgctgg aaagtattat 780

tgtcaccgtg gcaacctgac catgtcattc cacctggaga tcactgctcg gccagtacta 840

tggcactggc tgctgaggac tggtggctgg aaggtctcag ctgtgacttt ggcttatctg 900

atcttctgcc tgtgttccct tgtgggcatt cttcatcttc aaagagccct ggtcctgagg 960

aggaaaagaa agcgaatgac tgaccccacc aggagattct tcaaagtgac gcctccccca 1020

ggaagcgggc cccagaacca gtacgggaac gtgctgtctc tccccacacc cacctcaggc 1080

ctcggacgcg cccagcgttg ggccgcaggc ctggggggca ctgccccgtc ttatggaaac 1140

ccgagcagcg acgtccaggc ggatggagcc ttggggtccc ggagcccgcc gggagtgggc 1200

ccagaagaag aggaagggga gggctatgag gaacctgaca gtgaggagga ctccgagttc 1260

tatgagaacg actccaacct tgggcaggac cagctctccc aggatggcag cggctacgag 1320

aaccctgagg atgagcccct gggtcctgag gatgaagact ccttctccaa cgctgagtct 1380

tatgagaacg aggatgaaga gctgacccag ccggtcgcca ggacaatgga cttcctgagc 1440

cctcatgggt cagcctggga ccccagccgg gaagcaacct ccctggcagg gtcccagtcc 1500

tatgaggata tgagaggaat cctgtatgca gccccccagc tccgctccat tcggggccag 1560

cctggaccca atcatgagga agatgcagac tcttatgaga acatggataa tcccgatggg 1620

ccagacccag cctggggagg agggggccgc atgggcacct ggagcaccag gtga 1674

<210> 5

<211> 178

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

Met Ser Gly Gly Lys Tyr Val Asp Ser Glu Gly His Leu Tyr Thr Val

1 5 10 15

Pro Ile Arg Glu Gln Gly Asn Ile Tyr Lys Pro Asn Asn Lys Ala Met

20 25 30

Ala Asp Glu Val Thr Glu Lys Gln Val Tyr Asp Ala His Thr Lys Glu

35 40 45

Ile Asp Leu Val Asn Arg Asp Pro Lys His Leu Asn Asp Asp Val Val

50 55 60

Lys Ile Asp Phe Glu Asp Val Ile Ala Glu Pro Glu Gly Thr His Ser

65 70 75 80

Phe Asp Gly Ile Trp Lys Ala Ser Phe Thr Thr Phe Thr Val Thr Lys

85 90 95

Tyr Trp Phe Tyr Arg Leu Leu Ser Thr Ile Phe Gly Ile Pro Met Ala

100 105 110

Leu Ile Trp Gly Ile Tyr Phe Ala Ile Leu Ser Phe Leu His Ile Trp

115 120 125

Ala Val Val Pro Cys Ile Lys Ser Phe Leu Ile Glu Ile Gln Cys Ile

130 135 140

Ser Arg Val Tyr Ser Ile Tyr Val His Thr Phe Cys Asp Pro Leu Phe

145 150 155 160

Glu Ala Ile Gly Lys Ile Phe Ser Asn Ile Arg Ile Ser Thr Gln Lys

165 170 175

Glu Ile

<210> 6

<211> 277

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

Met Glu Asn Asn Lys Thr Ser Val Asp Ser Lys Ser Ile Asn Asn Phe

1 5 10 15

Glu Val Lys Thr Ile His Gly Ser Lys Ser Val Asp Ser Gly Ile Tyr

20 25 30

Leu Asp Ser Ser Tyr Lys Met Asp Tyr Pro Glu Met Gly Ile Cys Ile

35 40 45

Ile Ile Asn Asn Lys Asn Phe His Lys Ser Thr Gly Met Ser Ser Arg

50 55 60

Ser Gly Thr Asp Val Asp Ala Ala Asn Leu Arg Glu Thr Phe Met Gly

65 70 75 80

Leu Lys Tyr Gln Val Arg Asn Lys Asn Asp Leu Thr Arg Glu Asp Ile

85 90 95

Leu Glu Leu Met Asp Ser Val Ser Lys Glu Asp His Ser Lys Arg Ser

100 105 110

Ser Phe Val Cys Val Ile Leu Ser His Gly Asp Glu Gly Val Ile Tyr

115 120 125

Gly Thr Asn Gly Pro Val Glu Leu Lys Lys Leu Thr Ser Phe Phe Arg

130 135 140

Gly Asp Tyr Cys Arg Ser Leu Thr Gly Lys Pro Lys Leu Phe Ile Ile

145 150 155 160

Gln Ala Cys Arg Gly Thr Glu Leu Asp Cys Gly Ile Glu Thr Asp Ser

165 170 175

Gly Thr Asp Glu Glu Met Ala Cys Gln Lys Ile Pro Val Glu Ala Asp

180 185 190

Phe Leu Tyr Ala Tyr Ser Thr Ala Pro Gly Tyr Tyr Ser Trp Arg Asn

195 200 205

Ser Lys Asp Gly Ser Trp Phe Ile Gln Ser Leu Cys Ser Met Leu Lys

210 215 220

Leu Tyr Ala His Lys Leu Glu Phe Met His Ile Leu Thr Arg Val Asn

225 230 235 240

Arg Lys Val Ala Thr Glu Phe Glu Ser Phe Ser Leu Asp Ser Thr Phe

245 250 255

His Ala Lys Lys Gln Ile Pro Cys Ile Val Ser Met Leu Thr Lys Glu

260 265 270

Leu Tyr Phe Tyr His

275

<210> 7

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly

1 5

<210> 8

<211> 557

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

Met Pro Pro Pro Arg Leu Leu Phe Phe Leu Leu Phe Leu Thr Pro Met

1 5 10 15

Glu Val Arg Pro Glu Glu Pro Leu Val Val Lys Val Glu Glu Gly Asp

20 25 30

Asn Ala Val Leu Gln Cys Leu Lys Gly Thr Ser Asp Gly Pro Thr Gln

35 40 45

Gln Leu Thr Trp Ser Arg Glu Ser Pro Leu Lys Pro Phe Leu Lys Leu

50 55 60

Ser Leu Gly Leu Pro Gly Leu Gly Ile His Met Arg Pro Leu Ala Ile

65 70 75 80

Trp Leu Phe Ile Phe Asn Val Ser Gln Gln Met Gly Gly Phe Tyr Leu

85 90 95

Cys Gln Pro Gly Pro Pro Ser Glu Lys Ala Trp Gln Pro Gly Trp Thr

100 105 110

Val Asn Val Glu Gly Ser Gly Glu Leu Phe Arg Trp Asn Val Ser Asp

115 120 125

Leu Gly Gly Leu Gly Cys Gly Leu Lys Asn Arg Ser Ser Glu Gly Pro

130 135 140

Ser Ser Pro Ser Gly Lys Leu Met Ser Pro Lys Leu Tyr Val Trp Ala

145 150 155 160

Lys Asp Arg Pro Glu Ile Trp Glu Gly Glu Pro Pro Cys Leu Pro Pro

165 170 175

Arg Asp Ser Leu Asn Gln Ser Leu Ser Gln Asp Leu Thr Met Ala Pro

180 185 190

Gly Ser Thr Leu Trp Leu Ser Cys Gly Val Pro Pro Asp Ser Val Ser

195 200 205

Arg Gly Pro Leu Ser Trp Thr His Val His Pro Lys Gly Pro Lys Ser

210 215 220

Leu Leu Ser Leu Glu Leu Lys Asp Asp Arg Pro Ala Arg Asp Met Trp

225 230 235 240

Val Met Glu Thr Gly Leu Leu Leu Pro Arg Ala Thr Ala Gln Asp Ala

245 250 255

Gly Lys Tyr Tyr Cys His Arg Gly Asn Leu Thr Met Ser Phe His Leu

260 265 270

Glu Ile Thr Ala Arg Pro Val Leu Trp His Trp Leu Leu Arg Thr Gly

275 280 285

Gly Trp Lys Val Ser Ala Val Thr Leu Ala Tyr Leu Ile Phe Cys Leu

290 295 300

Cys Ser Leu Val Gly Ile Leu His Leu Gln Arg Ala Leu Val Leu Arg

305 310 315 320

Arg Lys Arg Lys Arg Met Thr Asp Pro Thr Arg Arg Phe Phe Lys Val

325 330 335

Thr Pro Pro Pro Gly Ser Gly Pro Gln Asn Gln Tyr Gly Asn Val Leu

340 345 350

Ser Leu Pro Thr Pro Thr Ser Gly Leu Gly Arg Ala Gln Arg Trp Ala

355 360 365

Ala Gly Leu Gly Gly Thr Ala Pro Ser Tyr Gly Asn Pro Ser Ser Asp

370 375 380

Val Gln Ala Asp Gly Ala Leu Gly Ser Arg Ser Pro Pro Gly Val Gly

385 390 395 400

Pro Glu Glu Glu Glu Gly Glu Gly Tyr Glu Glu Pro Asp Ser Glu Glu

405 410 415

Asp Ser Glu Phe Tyr Glu Asn Asp Ser Asn Leu Gly Gln Asp Gln Leu

420 425 430

Ser Gln Asp Gly Ser Gly Tyr Glu Asn Pro Glu Asp Glu Pro Leu Gly

435 440 445

Pro Glu Asp Glu Asp Ser Phe Ser Asn Ala Glu Ser Tyr Glu Asn Glu

450 455 460

Asp Glu Glu Leu Thr Gln Pro Val Ala Arg Thr Met Asp Phe Leu Ser

465 470 475 480

Pro His Gly Ser Ala Trp Asp Pro Ser Arg Glu Ala Thr Ser Leu Ala

485 490 495

Gly Ser Gln Ser Tyr Glu Asp Met Arg Gly Ile Leu Tyr Ala Ala Pro

500 505 510

Gln Leu Arg Ser Ile Arg Gly Gln Pro Gly Pro Asn His Glu Glu Asp

515 520 525

Ala Asp Ser Tyr Glu Asn Met Asp Asn Pro Asp Gly Pro Asp Pro Ala

530 535 540

Trp Gly Gly Gly Gly Arg Met Gly Thr Trp Ser Thr Arg

545 550 555

<210> 9

<211> 891

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

atgacaacac ccagaaattc agtaaatggg actttcccgg cagagccaat gaaaggccct 60

attgctatgc aatctggtcc aaaaccactc ttcaggagga tgtcttcact ggtgggcccc 120

acgcaaagct tcttcatgag ggaatctaag actttggggg ctgtccagat tatgaatggg 180

ctcttccaca ttgccctggg gggtcttctg atgatcccag cagggatcta tgcacccatc 240

tgtgtgactg tgtggtaccc tctctgggga ggcattatgt atattatttc cggatcactc 300

ctggcagcaa cggagaaaaa ctccaggaag tgtttggtca aaggaaaaat gataatgaat 360

tcattgagcc tctttgctgc catttctgga atgattcttt caatcatgga catacttaat 420

attaaaattt cccatttttt aaaaatggag agtctgaatt ttattagagc tcacacacca 480

tatattaaca tatacaactg tgaaccagct aatccctctg agaaaaactc cccatctacc 540

caatactgtt acagcataca atctctgttc ttgggcattt tgtcagtgat gctgatcttt 600

gccttcttcc aggaacttgt aatagctggc atcgttgaga atgaatggaa aagaacgtgc 660

tccagaccca aatctaacat agttctcctg tcagcagaag aaaaaaaaga acagactatt 720

gaaataaaag aagaagtggt tgggctaact gaaacatctt cccaaccaaa gaatgaagaa 780

gacattgaaa ttattccaat ccaagaagag gaagaagaag aaacagagac gaactttcca 840

gaacctcccc aagatcagga atcctcacca atagaaaatg acagctctcc t 891

<210> 10

<211> 297

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

Met Thr Thr Pro Arg Asn Ser Val Asn Gly Thr Phe Pro Ala Glu Pro

1 5 10 15

Met Lys Gly Pro Ile Ala Met Gln Ser Gly Pro Lys Pro Leu Phe Arg

20 25 30

Arg Met Ser Ser Leu Val Gly Pro Thr Gln Ser Phe Phe Met Arg Glu

35 40 45

Ser Lys Thr Leu Gly Ala Val Gln Ile Met Asn Gly Leu Phe His Ile

50 55 60

Ala Leu Gly Gly Leu Leu Met Ile Pro Ala Gly Ile Tyr Ala Pro Ile

65 70 75 80

Cys Val Thr Val Trp Tyr Pro Leu Trp Gly Gly Ile Met Tyr Ile Ile

85 90 95

Ser Gly Ser Leu Leu Ala Ala Thr Glu Lys Asn Ser Arg Lys Cys Leu

100 105 110

Val Lys Gly Lys Met Ile Met Asn Ser Leu Ser Leu Phe Ala Ala Ile

115 120 125

Ser Gly Met Ile Leu Ser Ile Met Asp Ile Leu Asn Ile Lys Ile Ser

130 135 140

His Phe Leu Lys Met Glu Ser Leu Asn Phe Ile Arg Ala His Thr Pro

145 150 155 160

Tyr Ile Asn Ile Tyr Asn Cys Glu Pro Ala Asn Pro Ser Glu Lys Asn

165 170 175

Ser Pro Ser Thr Gln Tyr Cys Tyr Ser Ile Gln Ser Leu Phe Leu Gly

180 185 190

Ile Leu Ser Val Met Leu Ile Phe Ala Phe Phe Gln Glu Leu Val Ile

195 200 205

Ala Gly Ile Val Glu Asn Glu Trp Lys Arg Thr Cys Ser Arg Pro Lys

210 215 220

Ser Asn Ile Val Leu Leu Ser Ala Glu Glu Lys Lys Glu Gln Thr Ile

225 230 235 240

Glu Ile Lys Glu Glu Val Val Gly Leu Thr Glu Thr Ser Ser Gln Pro

245 250 255

Lys Asn Glu Glu Asp Ile Glu Ile Ile Pro Ile Gln Glu Glu Glu Glu

260 265 270

Glu Glu Thr Glu Thr Asn Phe Pro Glu Pro Pro Gln Asp Gln Glu Ser

275 280 285

Ser Pro Ile Glu Asn Asp Ser Ser Pro

290 295

<210> 11

<211> 3630

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

atgcgaccct ccgggacggc cggggcagcg ctcctggcgc tgctggctgc gctctgcccg 60

gcgagtcggg ctctggagga aaagaaagtt tgccaaggca cgagtaacaa gctcacgcag 120

ttgggcactt ttgaagatca ttttctcagc ctccagagga tgttcaataa ctgtgaggtg 180

gtccttggga atttggaaat tacctatgtg cagaggaatt atgatctttc cttcttaaag 240

accatccagg aggtggctgg ttatgtcctc attgccctca acacagtgga gcgaattcct 300

ttggaaaacc tgcagatcat cagaggaaat atgtactacg aaaattccta tgccttagca 360

gtcttatcta actatgatgc aaataaaacc ggactgaagg agctgcccat gagaaattta 420

caggaaatcc tgcatggcgc cgtgcggttc agcaacaacc ctgccctgtg caacgtggag 480

agcatccagt ggcgggacat agtcagcagt gactttctca gcaacatgtc gatggacttc 540

cagaaccacc tgggcagctg ccaaaagtgt gatccaagct gtcccaatgg gagctgctgg 600

ggtgcaggag aggagaactg ccagaaactg accaaaatca tctgtgccca gcagtgctcc 660

gggcgctgcc gtggcaagtc ccccagtgac tgctgccaca accagtgtgc tgcaggctgc 720

acaggccccc gggagagcga ctgcctggtc tgccgcaaat tccgagacga agccacgtgc 780

aaggacacct gccccccact catgctctac aaccccacca cgtaccagat ggatgtgaac 840

cccgagggca aatacagctt tggtgccacc tgcgtgaaga agtgtccccg taattatgtg 900

gtgacagatc acggctcgtg cgtccgagcc tgtggggccg acagctatga gatggaggaa 960

gacggcgtcc gcaagtgtaa gaagtgcgaa gggccttgcc gcaaagtgtg taacggaata 1020

ggtattggtg aatttaaaga ctcactctcc ataaatgcta cgaatattaa acacttcaaa 1080

aactgcacct ccatcagtgg cgatctccac atcctgccgg tggcatttag gggtgactcc 1140

ttcacacata ctcctcctct ggatccacag gaactggata ttctgaaaac cgtaaaggaa 1200

atcacagggt ttttgctgat tcaggcttgg cctgaaaaca ggacggacct ccatgccttt 1260

gagaacctag aaatcatacg cggcaggacc aagcaacatg gtcagttttc tcttgcagtc 1320

gtcagcctga acataacatc cttgggatta cgctccctca aggagataag tgatggagat 1380

gtgataattt caggaaacaa aaatttgtgc tatgcaaata caataaactg gaaaaaactg 1440

tttgggacct ccggtcagaa aaccaaaatt ataagcaaca gaggtgaaaa cagctgcaag 1500

gccacaggcc aggtctgcca tgccttgtgc tcccccgagg gctgctgggg cccggagccc 1560

agggactgcg tctcttgccg gaatgtcagc cgaggcaggg aatgcgtgga caagtgcaac 1620

cttctggagg gtgagccaag ggagtttgtg gagaactctg agtgcataca gtgccaccca 1680

gagtgcctgc ctcaggccat gaacatcacc tgcacaggac ggggaccaga caactgtatc 1740

cagtgtgccc actacattga cggcccccac tgcgtcaaga cctgcccggc aggagtcatg 1800

ggagaaaaca acaccctggt ctggaagtac gcagacgccg gccatgtgtg ccacctgtgc 1860

catccaaact gcacctacgg atgcactggg ccaggtcttg aaggctgtcc aacgaatggg 1920

cctaagatcc cgtccatcgc cactgggatg gtgggggccc tcctcttgct gctggtggtg 1980

gccctgggga tcggcctctt catgcgaagg cgccacatcg ttcggaagcg cacgctgcgg 2040

aggctgctgc aggagaggga gcttgtggag cctcttacac ccagtggaga agctcccaac 2100

caagctctct tgaggatctt gaaggaaact gaattcaaaa agatcaaagt gctgggctcc 2160

ggtgcgttcg gcacggtgta taagggactc tggatcccag aaggtgagaa agttaaaatt 2220

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tgcctcacct ccaccgtgca gctcatcacg cagctcatgc ccttcggctg cctcctggac 2400

tatgtccggg aacacaaaga caatattggc tcccagtacc tgctcaactg gtgtgtgcag 2460

atcgcaaagg gcatgaacta cttggaggac cgtcgcttgg tgcaccgcga cctggcagcc 2520

aggaacgtac tggtgaaaac accgcagcat gtcaagatca cagattttgg gctggccaaa 2580

ctgctgggtg cggaagagaa agaataccat gcagaaggag gcaaagtgcc tatcaagtgg 2640

atggcattgg aatcaatttt acacagaatc tatacccacc agagtgatgt ctggagctac 2700

ggggtgactg tttgggagtt gatgaccttt ggatccaagc catatgacgg aatccctgcc 2760

agcgagatct cctccatcct ggagaaagga gaacgcctcc ctcagccacc catatgtacc 2820

atcgatgtct acatgatcat ggtcaagtgc tggatgatag acgcagatag tcgcccaaag 2880

ttccgtgagt tgatcatcga attctccaaa atggcccgag acccccagcg ctaccttgtc 2940

attcaggggg atgaaagaat gcatttgcca agtcctacag actccaactt ctaccgtgcc 3000

ctgatggatg aagaagacat ggacgacgtg gtggatgccg acgagtacct catcccacag 3060

cagggcttct tcagcagccc ctccacgtca cggactcccc tcctgagctc tctgagtgca 3120

accagcaaca attccaccgt ggcttgcatt gatagaaatg ggctgcaaag ctgtcccatc 3180

aaggaagaca gcttcttgca gcgatacagc tcagacccca caggcgcctt gactgaggac 3240

agcatagacg acaccttcct cccagtgcct gaatacataa accagtccgt tcccaaaagg 3300

cccgctggct ctgtgcagaa tcctgtctat cacaatcagc ctctgaaccc cgcgcccagc 3360

agagacccac actaccagga cccccacagc actgcagtgg gcaaccccga gtatctcaac 3420

actgtccagc ccacctgtgt caacagcaca ttcgacagcc ctgcccactg ggcccagaaa 3480

ggcagccacc aaattagcct ggacaaccct gactaccagc aggacttctt tcccaaggaa 3540

gccaagccaa atggcatctt taagggctcc acagctgaaa atgcagaata cctaagggtc 3600

gcgccacaaa gcagtgaatt tattggagca 3630

<210> 12

<211> 1210

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

Met Arg Pro Ser Gly Thr Ala Gly Ala Ala Leu Leu Ala Leu Leu Ala

1 5 10 15

Ala Leu Cys Pro Ala Ser Arg Ala Leu Glu Glu Lys Lys Val Cys Gln

20 25 30

Gly Thr Ser Asn Lys Leu Thr Gln Leu Gly Thr Phe Glu Asp His Phe

35 40 45

Leu Ser Leu Gln Arg Met Phe Asn Asn Cys Glu Val Val Leu Gly Asn

50 55 60

Leu Glu Ile Thr Tyr Val Gln Arg Asn Tyr Asp Leu Ser Phe Leu Lys

65 70 75 80

Thr Ile Gln Glu Val Ala Gly Tyr Val Leu Ile Ala Leu Asn Thr Val

85 90 95

Glu Arg Ile Pro Leu Glu Asn Leu Gln Ile Ile Arg Gly Asn Met Tyr

100 105 110

Tyr Glu Asn Ser Tyr Ala Leu Ala Val Leu Ser Asn Tyr Asp Ala Asn

115 120 125

Lys Thr Gly Leu Lys Glu Leu Pro Met Arg Asn Leu Gln Glu Ile Leu

130 135 140

His Gly Ala Val Arg Phe Ser Asn Asn Pro Ala Leu Cys Asn Val Glu

145 150 155 160

Ser Ile Gln Trp Arg Asp Ile Val Ser Ser Asp Phe Leu Ser Asn Met

165 170 175

Ser Met Asp Phe Gln Asn His Leu Gly Ser Cys Gln Lys Cys Asp Pro

180 185 190

Ser Cys Pro Asn Gly Ser Cys Trp Gly Ala Gly Glu Glu Asn Cys Gln

195 200 205

Lys Leu Thr Lys Ile Ile Cys Ala Gln Gln Cys Ser Gly Arg Cys Arg

210 215 220

Gly Lys Ser Pro Ser Asp Cys Cys His Asn Gln Cys Ala Ala Gly Cys

225 230 235 240

Thr Gly Pro Arg Glu Ser Asp Cys Leu Val Cys Arg Lys Phe Arg Asp

245 250 255

Glu Ala Thr Cys Lys Asp Thr Cys Pro Pro Leu Met Leu Tyr Asn Pro

260 265 270

Thr Thr Tyr Gln Met Asp Val Asn Pro Glu Gly Lys Tyr Ser Phe Gly

275 280 285

Ala Thr Cys Val Lys Lys Cys Pro Arg Asn Tyr Val Val Thr Asp His

290 295 300

Gly Ser Cys Val Arg Ala Cys Gly Ala Asp Ser Tyr Glu Met Glu Glu

305 310 315 320

Asp Gly Val Arg Lys Cys Lys Lys Cys Glu Gly Pro Cys Arg Lys Val

325 330 335

Cys Asn Gly Ile Gly Ile Gly Glu Phe Lys Asp Ser Leu Ser Ile Asn

340 345 350

Ala Thr Asn Ile Lys His Phe Lys Asn Cys Thr Ser Ile Ser Gly Asp

355 360 365

Leu His Ile Leu Pro Val Ala Phe Arg Gly Asp Ser Phe Thr His Thr

370 375 380

Pro Pro Leu Asp Pro Gln Glu Leu Asp Ile Leu Lys Thr Val Lys Glu

385 390 395 400

Ile Thr Gly Phe Leu Leu Ile Gln Ala Trp Pro Glu Asn Arg Thr Asp

405 410 415

Leu His Ala Phe Glu Asn Leu Glu Ile Ile Arg Gly Arg Thr Lys Gln

420 425 430

His Gly Gln Phe Ser Leu Ala Val Val Ser Leu Asn Ile Thr Ser Leu

435 440 445

Gly Leu Arg Ser Leu Lys Glu Ile Ser Asp Gly Asp Val Ile Ile Ser

450 455 460

Gly Asn Lys Asn Leu Cys Tyr Ala Asn Thr Ile Asn Trp Lys Lys Leu

465 470 475 480

Phe Gly Thr Ser Gly Gln Lys Thr Lys Ile Ile Ser Asn Arg Gly Glu

485 490 495

Asn Ser Cys Lys Ala Thr Gly Gln Val Cys His Ala Leu Cys Ser Pro

500 505 510

Glu Gly Cys Trp Gly Pro Glu Pro Arg Asp Cys Val Ser Cys Arg Asn

515 520 525

Val Ser Arg Gly Arg Glu Cys Val Asp Lys Cys Asn Leu Leu Glu Gly

530 535 540

Glu Pro Arg Glu Phe Val Glu Asn Ser Glu Cys Ile Gln Cys His Pro

545 550 555 560

Glu Cys Leu Pro Gln Ala Met Asn Ile Thr Cys Thr Gly Arg Gly Pro

565 570 575

Asp Asn Cys Ile Gln Cys Ala His Tyr Ile Asp Gly Pro His Cys Val

580 585 590

Lys Thr Cys Pro Ala Gly Val Met Gly Glu Asn Asn Thr Leu Val Trp

595 600 605

Lys Tyr Ala Asp Ala Gly His Val Cys His Leu Cys His Pro Asn Cys

610 615 620

Thr Tyr Gly Cys Thr Gly Pro Gly Leu Glu Gly Cys Pro Thr Asn Gly

625 630 635 640

Pro Lys Ile Pro Ser Ile Ala Thr Gly Met Val Gly Ala Leu Leu Leu

645 650 655

Leu Leu Val Val Ala Leu Gly Ile Gly Leu Phe Met Arg Arg Arg His

660 665 670

Ile Val Arg Lys Arg Thr Leu Arg Arg Leu Leu Gln Glu Arg Glu Leu

675 680 685

Val Glu Pro Leu Thr Pro Ser Gly Glu Ala Pro Asn Gln Ala Leu Leu

690 695 700

Arg Ile Leu Lys Glu Thr Glu Phe Lys Lys Ile Lys Val Leu Gly Ser

705 710 715 720

Gly Ala Phe Gly Thr Val Tyr Lys Gly Leu Trp Ile Pro Glu Gly Glu

725 730 735

Lys Val Lys Ile Pro Val Ala Ile Lys Glu Leu Arg Glu Ala Thr Ser

740 745 750

Pro Lys Ala Asn Lys Glu Ile Leu Asp Glu Ala Tyr Val Met Ala Ser

755 760 765

Val Asp Asn Pro His Val Cys Arg Leu Leu Gly Ile Cys Leu Thr Ser

770 775 780

Thr Val Gln Leu Ile Thr Gln Leu Met Pro Phe Gly Cys Leu Leu Asp

785 790 795 800

Tyr Val Arg Glu His Lys Asp Asn Ile Gly Ser Gln Tyr Leu Leu Asn

805 810 815

Trp Cys Val Gln Ile Ala Lys Gly Met Asn Tyr Leu Glu Asp Arg Arg

820 825 830

Leu Val His Arg Asp Leu Ala Ala Arg Asn Val Leu Val Lys Thr Pro

835 840 845

Gln His Val Lys Ile Thr Asp Phe Gly Leu Ala Lys Leu Leu Gly Ala

850 855 860

Glu Glu Lys Glu Tyr His Ala Glu Gly Gly Lys Val Pro Ile Lys Trp

865 870 875 880

Met Ala Leu Glu Ser Ile Leu His Arg Ile Tyr Thr His Gln Ser Asp

885 890 895

Val Trp Ser Tyr Gly Val Thr Val Trp Glu Leu Met Thr Phe Gly Ser

900 905 910

Lys Pro Tyr Asp Gly Ile Pro Ala Ser Glu Ile Ser Ser Ile Leu Glu

915 920 925

Lys Gly Glu Arg Leu Pro Gln Pro Pro Ile Cys Thr Ile Asp Val Tyr

930 935 940

Met Ile Met Val Lys Cys Trp Met Ile Asp Ala Asp Ser Arg Pro Lys

945 950 955 960

Phe Arg Glu Leu Ile Ile Glu Phe Ser Lys Met Ala Arg Asp Pro Gln

965 970 975

Arg Tyr Leu Val Ile Gln Gly Asp Glu Arg Met His Leu Pro Ser Pro

980 985 990

Thr Asp Ser Asn Phe Tyr Arg Ala Leu Met Asp Glu Glu Asp Met Asp

995 1000 1005

Asp Val Val Asp Ala Asp Glu Tyr Leu Ile Pro Gln Gln Gly Phe Phe

1010 1015 1020

Ser Ser Pro Ser Thr Ser Arg Thr Pro Leu Leu Ser Ser Leu Ser Ala

1025 1030 1035 1040

Thr Ser Asn Asn Ser Thr Val Ala Cys Ile Asp Arg Asn Gly Leu Gln

1045 1050 1055

Ser Cys Pro Ile Lys Glu Asp Ser Phe Leu Gln Arg Tyr Ser Ser Asp

1060 1065 1070

Pro Thr Gly Ala Leu Thr Glu Asp Ser Ile Asp Asp Thr Phe Leu Pro

1075 1080 1085

Val Pro Glu Tyr Ile Asn Gln Ser Val Pro Lys Arg Pro Ala Gly Ser

1090 1095 1100

Val Gln Asn Pro Val Tyr His Asn Gln Pro Leu Asn Pro Ala Pro Ser

1105 1110 1115 1120

Arg Asp Pro His Tyr Gln Asp Pro His Ser Thr Ala Val Gly Asn Pro

1125 1130 1135

Glu Tyr Leu Asn Thr Val Gln Pro Thr Cys Val Asn Ser Thr Phe Asp

1140 1145 1150

Ser Pro Ala His Trp Ala Gln Lys Gly Ser His Gln Ile Ser Leu Asp

1155 1160 1165

Asn Pro Asp Tyr Gln Gln Asp Phe Phe Pro Lys Glu Ala Lys Pro Asn

1170 1175 1180

Gly Ile Phe Lys Gly Ser Thr Ala Glu Asn Ala Glu Tyr Leu Arg Val

1185 1190 1195 1200

Ala Pro Gln Ser Ser Glu Phe Ile Gly Ala

1205 1210

<210> 13

<211> 3765

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

atggagctgg cggccttgtg ccgctggggg ctcctcctcg ccctcttgcc ccccggagcc 60

gcgagcaccc aagtgtgcac cggcacagac atgaagctgc ggctccctgc cagtcccgag 120

acccacctgg acatgctccg ccacctctac cagggctgcc aggtggtgca gggaaacctg 180

gaactcacct acctgcccac caatgccagc ctgtccttcc tgcaggatat ccaggaggtg 240

cagggctacg tgctcatcgc tcacaaccaa gtgaggcagg tcccactgca gaggctgcgg 300

attgtgcgag gcacccagct ctttgaggac aactatgccc tggccgtgct agacaatgga 360

gacccgctga acaataccac ccctgtcaca ggggcctccc caggaggcct gcgggagctg 420

cagcttcgaa gcctcacaga gatcttgaaa ggaggggtct tgatccagcg gaacccccag 480

ctctgctacc aggacacgat tttgtggaag gacatcttcc acaagaacaa ccagctggct 540

ctcacactga tagacaccaa ccgctctcgg gcctgccacc cctgttctcc gatgtgtaag 600

ggctcccgct gctggggaga gagttctgag gattgtcaga gcctgacgcg cactgtctgt 660

gccggtggct gtgcccgctg caaggggcca ctgcccactg actgctgcca tgagcagtgt 720

gctgccggct gcacgggccc caagcactct gactgcctgg cctgcctcca cttcaaccac 780

agtggcatct gtgagctgca ctgcccagcc ctggtcacct acaacacaga cacgtttgag 840

tccatgccca atcccgaggg ccggtataca ttcggcgcca gctgtgtgac tgcctgtccc 900

tacaactacc tttctacgga cgtgggatcc tgcaccctcg tctgccccct gcacaaccaa 960

gaggtgacag cagaggatgg aacacagcgg tgtgagaagt gcagcaagcc ctgtgcccga 1020

gtgtgctatg gtctgggcat ggagcacttg cgagaggtga gggcagttac cagtgccaat 1080

atccaggagt ttgctggctg caagaagatc tttgggagcc tggcatttct gccggagagc 1140

tttgatgggg acccagcctc caacactgcc ccgctccagc cagagcagct ccaagtgttt 1200

gagactctgg aagagatcac aggttaccta tacatctcag catggccgga cagcctgcct 1260

gacctcagcg tcttccagaa cctgcaagta atccggggac gaattctgca caatggcgcc 1320

tactcgctga ccctgcaagg gctgggcatc agctggctgg ggctgcgctc actgagggaa 1380

ctgggcagtg gactggccct catccaccat aacacccacc tctgcttcgt gcacacggtg 1440

ccctgggacc agctctttcg gaacccgcac caagctctgc tccacactgc caaccggcca 1500

gaggacgagt gtgtgggcga gggcctggcc tgccaccagc tgtgcgcccg agggcactgc 1560

tggggtccag ggcccaccca gtgtgtcaac tgcagccagt tccttcgggg ccaggagtgc 1620

gtggaggaat gccgagtact gcaggggctc cccagggagt atgtgaatgc caggcactgt 1680

ttgccgtgcc accctgagtg tcagccccag aatggctcag tgacctgttt tggaccggag 1740

gctgaccagt gtgtggcctg tgcccactat aaggaccctc ccttctgcgt ggcccgctgc 1800

cccagcggtg tgaaacctga cctctcctac atgcccatct ggaagtttcc agatgaggag 1860

ggcgcatgcc agccttgccc catcaactgc acccactcct gtgtggacct ggatgacaag 1920

ggctgccccg ccgagcagag agccagccct ctgacgtcca tcatctctgc ggtggttggc 1980

attctgctgg tcgtggtctt gggggtggtc tttgggatcc tcatcaagcg acggcagcag 2040

aagatccgga agtacacgat gcggagactg ctgcaggaaa cggagctggt ggagccgctg 2100

acacctagcg gagcgatgcc caaccaggcg cagatgcgga tcctgaaaga gacggagctg 2160

aggaaggtga aggtgcttgg atctggcgct tttggcacag tctacaaggg catctggatc 2220

cctgatgggg agaatgtgaa aattccagtg gccatcaaag tgttgaggga aaacacatcc 2280

cccaaagcca acaaagaaat cttagacgaa gcatacgtga tggctggtgt gggctcccca 2340

tatgtctccc gccttctggg catctgcctg acatccacgg tgcagctggt gacacagctt 2400

atgccctatg gctgcctctt agaccatgtc cgggaaaacc gcggacgcct gggctcccag 2460

gacctgctga actggtgtat gcagattgcc aaggggatga gctacctgga ggatgtgcgg 2520

ctcgtacaca gggacttggc cgctcggaac gtgctggtca agagtcccaa ccatgtcaaa 2580

attacagact tcgggctggc tcggctgctg gacattgacg agacagagta ccatgcagat 2640

gggggcaagg tgcccatcaa gtggatggcg ctggagtcca ttctccgccg gcggttcacc 2700

caccagagtg atgtgtggag ttatggtgtg actgtgtggg agctgatgac ttttggggcc 2760

aaaccttacg atgggatccc agcccgggag atccctgacc tgctggaaaa gggggagcgg 2820

ctgccccagc cccccatctg caccattgat gtctacatga tcatggtcaa atgttggatg 2880

attgactctg aatgtcggcc aagattccgg gagttggtgt ctgaattctc ccgcatggcc 2940

agggaccccc agcgctttgt ggtcatccag aatgaggact tgggcccagc cagtcccttg 3000

gacagcacct tctaccgctc actgctggag gacgatgaca tgggggacct ggtggatgct 3060

gaggagtatc tggtacccca gcagggcttc ttctgtccag accctgcccc gggcgctggg 3120

ggcatggtcc accacaggca ccgcagctca tctaccagga gtggcggtgg ggacctgaca 3180

ctagggctgg agccctctga agaggaggcc cccaggtctc cactggcacc ctccgaaggg 3240

gctggctccg atgtatttga tggtgacctg ggaatggggg cagccaaggg gctgcaaagc 3300

ctccccacac atgaccccag ccctctacag cggtacagtg aggaccccac agtacccctg 3360

ccctctgaga ctgatggcta cgttgccccc ctgacctgca gcccccagcc tgaatatgtg 3420

aaccagccag atgttcggcc ccagccccct tcgccccgag agggccctct gcctgctgcc 3480

cgacctgctg gtgccactct ggaaaggccc aagactctct ccccagggaa gaatggggtc 3540

gtcaaagacg tttttgcctt tgggggtgcc gtggagaacc ccgagtactt gacaccccag 3600

ggaggagctg cccctcagcc ccaccctcct cctgccttca gcccagcctt cgacaacctc 3660

tattactggg accaggaccc accagagcgg ggggctccac ccagcacctt caaagggaca 3720

cctacggcag agaacccaga gtacctgggt ctggacgtgc cagtg 3765

<210> 14

<211> 1255

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

Met Glu Leu Ala Ala Leu Cys Arg Trp Gly Leu Leu Leu Ala Leu Leu

1 5 10 15

Pro Pro Gly Ala Ala Ser Thr Gln Val Cys Thr Gly Thr Asp Met Lys

20 25 30

Leu Arg Leu Pro Ala Ser Pro Glu Thr His Leu Asp Met Leu Arg His

35 40 45

Leu Tyr Gln Gly Cys Gln Val Val Gln Gly Asn Leu Glu Leu Thr Tyr

50 55 60

Leu Pro Thr Asn Ala Ser Leu Ser Phe Leu Gln Asp Ile Gln Glu Val

65 70 75 80

Gln Gly Tyr Val Leu Ile Ala His Asn Gln Val Arg Gln Val Pro Leu

85 90 95

Gln Arg Leu Arg Ile Val Arg Gly Thr Gln Leu Phe Glu Asp Asn Tyr

100 105 110

Ala Leu Ala Val Leu Asp Asn Gly Asp Pro Leu Asn Asn Thr Thr Pro

115 120 125

Val Thr Gly Ala Ser Pro Gly Gly Leu Arg Glu Leu Gln Leu Arg Ser

130 135 140

Leu Thr Glu Ile Leu Lys Gly Gly Val Leu Ile Gln Arg Asn Pro Gln

145 150 155 160

Leu Cys Tyr Gln Asp Thr Ile Leu Trp Lys Asp Ile Phe His Lys Asn

165 170 175

Asn Gln Leu Ala Leu Thr Leu Ile Asp Thr Asn Arg Ser Arg Ala Cys

180 185 190

His Pro Cys Ser Pro Met Cys Lys Gly Ser Arg Cys Trp Gly Glu Ser

195 200 205

Ser Glu Asp Cys Gln Ser Leu Thr Arg Thr Val Cys Ala Gly Gly Cys

210 215 220

Ala Arg Cys Lys Gly Pro Leu Pro Thr Asp Cys Cys His Glu Gln Cys

225 230 235 240

Ala Ala Gly Cys Thr Gly Pro Lys His Ser Asp Cys Leu Ala Cys Leu

245 250 255

His Phe Asn His Ser Gly Ile Cys Glu Leu His Cys Pro Ala Leu Val

260 265 270

Thr Tyr Asn Thr Asp Thr Phe Glu Ser Met Pro Asn Pro Glu Gly Arg

275 280 285

Tyr Thr Phe Gly Ala Ser Cys Val Thr Ala Cys Pro Tyr Asn Tyr Leu

290 295 300

Ser Thr Asp Val Gly Ser Cys Thr Leu Val Cys Pro Leu His Asn Gln

305 310 315 320

Glu Val Thr Ala Glu Asp Gly Thr Gln Arg Cys Glu Lys Cys Ser Lys

325 330 335

Pro Cys Ala Arg Val Cys Tyr Gly Leu Gly Met Glu His Leu Arg Glu

340 345 350

Val Arg Ala Val Thr Ser Ala Asn Ile Gln Glu Phe Ala Gly Cys Lys

355 360 365

Lys Ile Phe Gly Ser Leu Ala Phe Leu Pro Glu Ser Phe Asp Gly Asp

370 375 380

Pro Ala Ser Asn Thr Ala Pro Leu Gln Pro Glu Gln Leu Gln Val Phe

385 390 395 400

Glu Thr Leu Glu Glu Ile Thr Gly Tyr Leu Tyr Ile Ser Ala Trp Pro

405 410 415

Asp Ser Leu Pro Asp Leu Ser Val Phe Gln Asn Leu Gln Val Ile Arg

420 425 430

Gly Arg Ile Leu His Asn Gly Ala Tyr Ser Leu Thr Leu Gln Gly Leu

435 440 445

Gly Ile Ser Trp Leu Gly Leu Arg Ser Leu Arg Glu Leu Gly Ser Gly

450 455 460

Leu Ala Leu Ile His His Asn Thr His Leu Cys Phe Val His Thr Val

465 470 475 480

Pro Trp Asp Gln Leu Phe Arg Asn Pro His Gln Ala Leu Leu His Thr

485 490 495

Ala Asn Arg Pro Glu Asp Glu Cys Val Gly Glu Gly Leu Ala Cys His

500 505 510

Gln Leu Cys Ala Arg Gly His Cys Trp Gly Pro Gly Pro Thr Gln Cys

515 520 525

Val Asn Cys Ser Gln Phe Leu Arg Gly Gln Glu Cys Val Glu Glu Cys

530 535 540

Arg Val Leu Gln Gly Leu Pro Arg Glu Tyr Val Asn Ala Arg His Cys

545 550 555 560

Leu Pro Cys His Pro Glu Cys Gln Pro Gln Asn Gly Ser Val Thr Cys

565 570 575

Phe Gly Pro Glu Ala Asp Gln Cys Val Ala Cys Ala His Tyr Lys Asp

580 585 590

Pro Pro Phe Cys Val Ala Arg Cys Pro Ser Gly Val Lys Pro Asp Leu

595 600 605

Ser Tyr Met Pro Ile Trp Lys Phe Pro Asp Glu Glu Gly Ala Cys Gln

610 615 620

Pro Cys Pro Ile Asn Cys Thr His Ser Cys Val Asp Leu Asp Asp Lys

625 630 635 640

Gly Cys Pro Ala Glu Gln Arg Ala Ser Pro Leu Thr Ser Ile Ile Ser

645 650 655

Ala Val Val Gly Ile Leu Leu Val Val Val Leu Gly Val Val Phe Gly

660 665 670

Ile Leu Ile Lys Arg Arg Gln Gln Lys Ile Arg Lys Tyr Thr Met Arg

675 680 685

Arg Leu Leu Gln Glu Thr Glu Leu Val Glu Pro Leu Thr Pro Ser Gly

690 695 700

Ala Met Pro Asn Gln Ala Gln Met Arg Ile Leu Lys Glu Thr Glu Leu

705 710 715 720

Arg Lys Val Lys Val Leu Gly Ser Gly Ala Phe Gly Thr Val Tyr Lys

725 730 735

Gly Ile Trp Ile Pro Asp Gly Glu Asn Val Lys Ile Pro Val Ala Ile

740 745 750

Lys Val Leu Arg Glu Asn Thr Ser Pro Lys Ala Asn Lys Glu Ile Leu

755 760 765

Asp Glu Ala Tyr Val Met Ala Gly Val Gly Ser Pro Tyr Val Ser Arg

770 775 780

Leu Leu Gly Ile Cys Leu Thr Ser Thr Val Gln Leu Val Thr Gln Leu

785 790 795 800

Met Pro Tyr Gly Cys Leu Leu Asp His Val Arg Glu Asn Arg Gly Arg

805 810 815

Leu Gly Ser Gln Asp Leu Leu Asn Trp Cys Met Gln Ile Ala Lys Gly

820 825 830

Met Ser Tyr Leu Glu Asp Val Arg Leu Val His Arg Asp Leu Ala Ala

835 840 845

Arg Asn Val Leu Val Lys Ser Pro Asn His Val Lys Ile Thr Asp Phe

850 855 860

Gly Leu Ala Arg Leu Leu Asp Ile Asp Glu Thr Glu Tyr His Ala Asp

865 870 875 880

Gly Gly Lys Val Pro Ile Lys Trp Met Ala Leu Glu Ser Ile Leu Arg

885 890 895

Arg Arg Phe Thr His Gln Ser Asp Val Trp Ser Tyr Gly Val Thr Val

900 905 910

Trp Glu Leu Met Thr Phe Gly Ala Lys Pro Tyr Asp Gly Ile Pro Ala

915 920 925

Arg Glu Ile Pro Asp Leu Leu Glu Lys Gly Glu Arg Leu Pro Gln Pro

930 935 940

Pro Ile Cys Thr Ile Asp Val Tyr Met Ile Met Val Lys Cys Trp Met

945 950 955 960

Ile Asp Ser Glu Cys Arg Pro Arg Phe Arg Glu Leu Val Ser Glu Phe

965 970 975

Ser Arg Met Ala Arg Asp Pro Gln Arg Phe Val Val Ile Gln Asn Glu

980 985 990

Asp Leu Gly Pro Ala Ser Pro Leu Asp Ser Thr Phe Tyr Arg Ser Leu

995 1000 1005

Leu Glu Asp Asp Asp Met Gly Asp Leu Val Asp Ala Glu Glu Tyr Leu

1010 1015 1020

Val Pro Gln Gln Gly Phe Phe Cys Pro Asp Pro Ala Pro Gly Ala Gly

1025 1030 1035 1040

Gly Met Val His His Arg His Arg Ser Ser Ser Thr Arg Ser Gly Gly

1045 1050 1055

Gly Asp Leu Thr Leu Gly Leu Glu Pro Ser Glu Glu Glu Ala Pro Arg

1060 1065 1070

Ser Pro Leu Ala Pro Ser Glu Gly Ala Gly Ser Asp Val Phe Asp Gly

1075 1080 1085

Asp Leu Gly Met Gly Ala Ala Lys Gly Leu Gln Ser Leu Pro Thr His

1090 1095 1100

Asp Pro Ser Pro Leu Gln Arg Tyr Ser Glu Asp Pro Thr Val Pro Leu

1105 1110 1115 1120

Pro Ser Glu Thr Asp Gly Tyr Val Ala Pro Leu Thr Cys Ser Pro Gln

1125 1130 1135

Pro Glu Tyr Val Asn Gln Pro Asp Val Arg Pro Gln Pro Pro Ser Pro

1140 1145 1150

Arg Glu Gly Pro Leu Pro Ala Ala Arg Pro Ala Gly Ala Thr Leu Glu

1155 1160 1165

Arg Pro Lys Thr Leu Ser Pro Gly Lys Asn Gly Val Val Lys Asp Val

1170 1175 1180

Phe Ala Phe Gly Gly Ala Val Glu Asn Pro Glu Tyr Leu Thr Pro Gln

1185 1190 1195 1200

Gly Gly Ala Ala Pro Gln Pro His Pro Pro Pro Ala Phe Ser Pro Ala

1205 1210 1215

Phe Asp Asn Leu Tyr Tyr Trp Asp Gln Asp Pro Pro Glu Arg Gly Ala

1220 1225 1230

Pro Pro Ser Thr Phe Lys Gly Thr Pro Thr Ala Glu Asn Pro Glu Tyr

1235 1240 1245

Leu Gly Leu Asp Val Pro Val

1250 1255

Claims

1.一种用于检验CAR-T细胞杀伤效果的靶细胞CCC-3T3，其特征在于，所述靶细胞CCC-3T3为表达CAR-T细胞靶抗原基因以及Caveolin-1和caspase-3的融合蛋白基因的小鼠成纤维样细胞；

所述CAR-T细胞靶抗原基因为CD19基因、CD20基因、EGFR基因或Her2基因。

2.根据权利要求1所述的靶细胞CCC-3T3，其特征在于，所述Caveolin-1和caspase-3的融合蛋白基因包括顺次连接的Caveolin-1基因、连接肽基因和caspase-3基因。

3.根据权利要求1或2所述的靶细胞CCC-3T3，其特征在于，所述Caveolin-1基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

4.根据权利要求1或2所述的靶细胞CCC-3T3，其特征在于，所述caspase-3基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

5.根据权利要求2所述的靶细胞CCC-3T3，其特征在于，所述连接肽的核苷酸序列如SEQID No.3所示。

6.根据权利要求1所述的靶细胞CCC-3T3，其特征在于，所述CAR-T细胞靶抗原CD19基因的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。

7.权利要求1～6任意一项所述靶细胞CCC-3T3的制备方法，包括以下步骤：

8.权利要求1～6任意一项所述的靶细胞CCC-3T3或者权利要求7所述制备方法制备获得的靶细胞CCC-3T3在检验CAR-T细胞杀伤效果中的应用。

9.权利要求8所述的应用，其特征在于，所述靶细胞CCC-3T3的浓度为(6～10)×10⁴个/mL，效靶比为(38～42):1。