CN107287163A

CN107287163A - 表达嵌合抗原受体的树突细胞及其用途

Info

Publication number: CN107287163A
Application number: CN201611232764.9A
Authority: CN
Inventors: 樊克兴; 陈青峰
Original assignee: When Biological Technology (beijing) Co Ltd
Current assignee: When Biological Technology (beijing) Co Ltd
Priority date: 2016-12-28
Filing date: 2016-12-28
Publication date: 2017-10-24
Anticipated expiration: 2036-12-28
Also published as: CN107287163B

Abstract

本发明涉及用于表达嵌合抗原受体的树突状细胞及其制备方法，以及所述树突状细胞在制备用于治疗肿瘤的制剂中的用途。

Description

表达嵌合抗原受体的树突细胞及其用途

技术领域

本发明属于肿瘤生物制品领域，具体地，涉及用于表达嵌合抗原受体的树突状细胞及其制备方法，以及所述树突状细胞在制备用于治疗肿瘤的制剂中的用途。

背景技术

树突状细胞(dendritic cells，DC)是一类成熟时具有许多树突样凸起的、能够识别、摄取和加工外源性抗原并将抗原肽提呈给初始T细胞并诱导T细胞活化增殖的、功能最强的抗原呈递细胞。

目前的DC细胞免疫治疗，是分离肿瘤患者自身的单核细胞，在体外培养、扩增、并诱导其生成DC，然后让DC负载相应的肿瘤抗原，经严格筛选后制备成负载肿瘤抗原的DC，然后将这些DC细胞回输到相应患者体内，刺激、激活人体内的天然抗肿瘤系统。DC免疫细胞治疗广泛适用于多种肿瘤的治疗，但是，单纯靠体外活化DC细胞取得的疗效有限，因此在DC细胞免疫治疗肿瘤的方法上仍需进一步改善。

嵌合抗原受体T细胞疗法(Chimeric antigen receptor T-cell immunotherapy，CAR-T)是目前最有发展前景的肿瘤免疫疗法之一。一般的，嵌合抗原受体CAR由一个肿瘤相关抗原结合区、胞外铰链区、跨膜区域以及胞内信号转导区组成。CAR-T细胞疗法通过把能特异性识别肿瘤相关抗原的单链抗体(Single chain fragment variable，scFv)和T细胞活化序列偶联，并使其表达到T细胞表面，使能特异性识别肿瘤相关抗原的scFv通过跨膜区与T细胞胞内的活化增殖信号域偶联。表达CAR的T细胞以抗原依赖、但非MHC限制的方式识别并结合肿瘤抗原，启动并活化特异性杀伤肿瘤反应；但CAR-T可产生一定的脱靶毒性，影响其细胞免疫疗效，因此，有需要开发一种新的方法和免疫治疗细胞来解决上述问题。

发明内容

为了克服现有技术中体外活化DC细胞对肿瘤的杀伤作用比较弱、特异杀伤活性有待提高的缺陷，本发明提供一种表达嵌合抗原受体的经改造树突状细胞，以及制备所述树突状细胞的方法。

在一个方面中，本发明提供了表达嵌合抗原受体的树突状细胞，其中所述嵌合抗原受体能够与肿瘤相关抗原特异性结合。

进一步地，所述肿瘤相关抗原包括但不限于：CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD123、CD138、CEA、cMet、EGFRvIII、IL-13Rα2、FAP、Her2、GD2、PSMA、MUC1、Mesothelin和FRα。

更进一步地，所述嵌合抗原受体与间皮素、EGFRvIII或α叶酸受体特异性结合。

在一些实施方案中，所述嵌合抗原受体含有抗间皮素的单链抗体、抗EGFRvIII的单链抗体或抗α叶酸受体的单链抗体。

进一步地，所述含有抗间皮素的单链抗体的嵌合抗原受体的氨基酸序列为SEQ IDNO.1，称为mesoCAR；所述含有抗EGFRvIII的单链抗体的嵌合抗原受体的氨基酸序列为SEQID NO.2；所述含有抗α叶酸受体的单链抗体的嵌合抗原受体的氨基酸序列为SEQ ID NO.3。

在另一个方面，本发明涉及所述表达嵌合抗原受体的树突状细胞在制备用于治疗肿瘤的制剂中的用途，其中所述肿瘤包括但不限于：间皮瘤、胰腺癌、卵巢癌、胃癌、鳞状细胞癌、前列腺癌、肺癌、胆管癌、脑胶质瘤、非小细胞肺癌和乳腺癌。

另一方面，本发明还提供了制备表达嵌合抗原受体的树突状细胞的方法，其包括：构建表达所述嵌合抗原受体的表达载体；将所述表达载体引入到树突状细胞中。

进一步地，所述表达载体为慢病毒表达载体，例如但不限于pCDH。

本发明将嵌合抗原受体在DC细胞中进行人工表达，得到了多种表达特定嵌合抗原受体的DC细胞，这些表达特定嵌合抗原受体的细胞对响应的癌症细胞表现出了卓越的效果，打破了传统上将细胞过继治疗的研究工作集中在T细胞和NK细胞的常规。

在一些实施方案中，本发明所述的CAR的结构是由单链抗体(scFv)、铰链区(Hinge)、跨膜区(transmembrane domain)、信号域(signal domain)组成。其中scfv区是由轻链可变区序列和重链可变区序列组成。轻链区和重链区之间通过(Gly4-Ser)n接头，n为大于0的正整数；嵌合抗原受体(scfv)结合序列为肿瘤相关抗原，如CEA、cMet、EGFRvIII、IL33Rα2、FAP、Her2、GD2、PSMA、MUC1、MUC16、Mesothelin和α-叶酸等中的一种或几种；铰链区序列为FcγRIIIαhinge、CD8αhinge、IgG1/4hinge中的一种；跨膜区序列为CD8αTM、FcεRIα-TM、CD40-TM中的一种；胞内信号域为CD40信号域。

附图说明

图1为本发明所使用的嵌合抗原受体mesoCAR的结构示意图。

图2为慢病毒表达载体pCDH-mesoCAR质粒信息图。

图3为荧光显微镜检测慢病毒pCDH-mesoCAR侵染DC细胞的荧光表达情况；A为未侵染的DC细胞，B为pCDH-CAR(Meso)病毒侵染的DC细胞

图4为体外mesoCAR-DC细胞与Mesothelin+A431细胞(人间皮素过表达的A431细胞)共培养后活化情况，通过流式检测MHC-I/MHC-II/CD86/CD40的表达水平分析DC细胞的活化程度。

A为mesoCAR-DC细胞；B为mesoCAR-DC细胞与Mesothelin+A431以3:1的比例共培养。

图5为效应细胞mesoCAR-DC，靶细胞A431-H9，CD8⁺T细胞以3:1:3比例共培养后，通过流式检测CD25的表达水平分析T细胞激活情况。

A：未处理的DC细胞与靶细胞A431，CD8⁺T细胞共培养；B：pCDH-空载体转导的DC细胞与靶细胞A431，CD8⁺T细胞共培养；C：pCDH-mesoCAR转导DC细胞与靶细胞A431，CD8⁺T细胞共培养

图6为mesoCAR-DC治疗间皮素阳性荷瘤小鼠后，肿瘤体积的变化情况。

A：小鼠尾静脉注射1x10^6DC细胞和1x10^6CD8⁺T细胞；

B：小鼠尾静脉注射1x10^6慢病毒空载体转导体外培养DC细胞和1x10^6CD8⁺T细胞；

C：小鼠尾静脉注射1x10^6pCDH-mesoCAR-DC细胞和1x10^6CD8⁺T细胞。

图7为mesoCAR-DC治疗间皮素阳性荷瘤小鼠后，小鼠的存活情况。

A：小鼠尾静脉注射1x10^6DC细胞和1x10^6CD8⁺T细胞；

C：小鼠尾静脉注射1x10^6pCDH-mesoCAR-DC细胞和1x10^6CD8⁺T细胞。

图8为本发明所使用的嵌合抗原受体EGFRvIIICAR的结构示意图，其由CD8α信号肽(CD8αSP)、EGFRvIII抗体轻链可变区(EGFR vIIIscfv-VL)、接头区、EGFRvIII抗体重链可变区(EGFRvIIIscfv-VH)、CD8α铰链区(CD8αHinge)、CD40跨膜区(CD40TM)和CD40胞内信号区组成。并设计其对照结构，其对照结构无CD40胞内信号区，简称EGFRvIIICAR’。

图9为pCDH-EGFRvIIICAR慢病毒表达载体质粒信息图。

图10为体外情况下，本发明的EGFRvIIICAR-DC细胞与EGFRvIII⁺肿瘤细胞U87(EGFRvIII⁺U87)共培养后活化情况。A：体外培养DC细胞；B：慢病毒空载体转导体外培养DC细胞；C：慢病毒pCDH-EGFRvIIICAR转导体外培养DC细胞；D：慢病毒pCDH-EGFRvIIICAR’转导体外培养DC细胞。如图所示，EGFRvIIICAR-DC细胞在EGFRvIII⁺U87细胞刺激下，在体外实现更高程度的活化成熟。

图11为T细胞活化情况。EGFRvIIICAR-DC细胞与T细胞共孵育，在EGFRvIII⁺U87细胞刺激下，促进了T细胞的活化。A：慢病毒pCDH-EGFRvIIICAR转导体外培养DC细胞(无T细胞)；B：慢病毒pCDH空载体转导体外培养DC细胞(+T细胞)；C：慢病毒pCDH-EGFRvIIICAR转导体外培养DC细胞细胞(+T细胞)；D：慢病毒pCDH-EGFRvIIICAR’转导体外培养DC细胞细胞(+T细胞)。

图12为小鼠脑胶质瘤模型中小鼠肿瘤体积变化。A：慢病毒EGFRvIIICAR转导体外培养DC细胞(无T细胞)；B：慢病毒空载体转导体外培养DC细胞(+T细胞)；C：慢病毒EGFRvIIICAR’转导体外培养DC细胞(+T细胞)；D：慢病毒EGFRvIIICAR转导体外培养DC细胞(+T细胞)。由图可得，注射EGFRvIIICAR-DC细胞+T细胞组的小鼠肿瘤得到明显抑制，随着时间延长，肿瘤体积明显缩小直至消失。

图13为小鼠脑胶质瘤模型中小鼠生存曲线图。A：慢病毒EGFRvIIICAR转导体外培养DC细胞(无T细胞)；B：慢病毒空载体转导体外培养DC细胞(+T细胞)；C：慢病毒EGFRvIIICAR’转导体外培养DC细胞(+T细胞)；D：慢病毒EGFRvIIICAR转导体外培养DC细胞(+T细胞)。

图14为编码MOv19CAR的DNA凝胶电泳图。

图15为本发明所使用的MOv19CAR结构示意图。

图16为本发明所使用的pCDH-CMV-MCS-MOv19scFv-CD40-EF1-copGFP-T2A-puro(简称pCDH-MOv19CAR)慢病毒表达载体质粒信息。

图17为pCDH-MOv19CAR慢病毒有效的转染DC细胞的荧光显微镜照片。

图18为流式细胞仪检测慢病毒转导DC细胞的效率的图片，筛选条件为GFP表达强度。

图19为DC细胞与靶细胞接触之后DC细胞的MHC-I/MHC-II/CD86/CD40的表达水平。

图20为静脉和腹腔注射pCDH-DC细胞和MOv19CAR-DC细胞治疗荷瘤小鼠的生存期比较。

具体实施方式

以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。

以下实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为本领域常规方法。下述实施例中所用的实验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到，其中：

DMEM培养基、X-VIVO 15培养基购自TaKaRa公司。

淋巴细胞分离液购自TBD公司。

总RNA提取试剂盒RNAiso Reagent、高保真DNA聚合酶(HS DNA Polymerase)、T4DNA连接酶购自TaKaRa公司。

RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit购自Fermentas公司。

所有限制性内切酶和连接酶均购自Fermentas公司。

琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒、普通DNA产物纯化试剂盒、质粒小提试剂盒均购自天根生化科技有限公司。

pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP-T2A-puro购自Addgene公司。

Trans1-T1Phage Resistant化学感受态细胞购自北京全式金生物技术有限公司。

LipofectamineTM 2000Transfection Reagent转染试剂购自Invitrogen公司。

原代培养的小鼠骨髓瘤细胞购自上海雨晨生物技术有限公司。

PEG6000和NaCl均购自上海索莱宝生物科技有限公司

所有细胞系均购自美国ATCC。

胎牛血清购自Gibco公司。

所有引物均由上海生工生物科技有限公司合成，所有序列均为上海生工生物科技有限公司测序。

免疫缺陷模式小鼠(NSG)购自北京维通达生物技术有限公司。

定义：

除非另有定义，否则本文中所用的所有技术和科学术语均具有本发明所属领域的普通技术人员通常理解含义。

术语“嵌合抗原受体”或“CAR”是指包含至少胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和胞内信号区的重组多肽构建体。

术语“单链抗体”或“scFv”指，包含至少一个含有轻链可变区的抗体片段和至少一个含有重链可变区的抗体片段的融合蛋白，其中轻链可变区和重链可变区通过短的柔性肽接头连续连接，能够表达为单链多肽，并且其中scFv保持其所源自的完整抗体的特异性。除非特别指出，否则在本文中scFv可以以任何一种顺序具有VL和VH可变区，例如相对于多肽的N端和C端，scFv可以包含VL-接头-VH或可以包含VH-接头-VL。

术语“抗体重链”指，天然构象的抗体分子中存在的两类多肽链中的较大者，其通常决定抗体所属的类别。

术语“抗体轻链”指，天然构象的抗体分子中存在的两类多肽链中的较小者。κ和λ轻链指两种主要的抗体轻链同种型。

术语“肿瘤”或“癌症”指特征在于快速且不受控的异常细胞生长的疾病。肿瘤或癌症细胞可以局部地或通过血流和淋巴系统而扩散到身体的其它部分。本文描述了各种癌症的例子，包括但不限于，胸腺癌(breast cancer)、前列腺癌、卵巢癌、宫颈癌、皮肤癌、胰腺癌、结直肠癌、肾癌、肝癌、脑癌、淋巴瘤、白血病、肺癌等。

术语“MOv19”是指针对α叶酸受体的抗体。

术语“自体”指，从个体获得并之后重新引入该同一个体中的任何物质。

在本文中，“胞内信号区”指分子在细胞内的部分。胞内信号区可以产生促进含CAR的细胞(例如CAR-DC细胞)的免疫效应功能的信号。

术语“CD40”是指是与T细胞和B细胞功能有关的一种表面抗原，包括并不限于，I型跨膜糖蛋白，由N端信号肽(20个氨基酸)、胞膜外区(193个氨基酸)、跨膜区(22个氨基酸)和胞浆区(62个氨基酸)。

实施例1

一、mesoCAR基因序列的确定

1.1从美国国立医学图书馆网站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez)GenBank数据库中搜索到人GM-CSF信号肽基因、人CD8α铰链区基因、人CD40跨膜区和胞内信号区基因序列。抗间皮素单链抗体(抗SS1scFv)基因序列。

1.2将上述基因序列依次按人GM-CSF信号肽基因、抗SS1scFv、人CD8α铰链区基因、人CD40跨膜区和胞内信号区序列进行连接，形成最终完整的GM-CSF-SS1scFv-CD8α-CD40(mesoCAR)基因序列SEQ ID NO.4。

二.pCDH-mesoCAR表达质粒的构建

2.1全基因合成：

由上海生工合成完整的mesoCAR基因序列，并在两端添加酶切位点Xba I/EcoR I。

2.2将上述序列克隆到pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP-T2A-puro(简称pCDH)慢病毒表达载体中，获得抗人间皮素-CAR的表达质粒。

分别将mesoCAR和慢病毒表达载体pCDH用XbaI/EcoRI进行酶切，酶切体系如下，37℃水浴>1小时。

将酶切产物琼脂糖凝胶电泳进行鉴定，对正确的产物进行胶回收。

将相应酶切产物用T4 DNA连接酶进行连接，连接体系如下：

16℃过夜连接，连接产物转化DH5a感受态细胞。

2.3从转化有pCDH-mesoCAR的平板中随机挑取4个单克隆，分别加入含有Ampicillin氨苄青霉素(100ug/ml)的4ml的LB培养基中进行扩培，6-8小时后进行质粒提取，并用XbaI/EcoRI进行酶切鉴定，回收大小正确的酶切片段，送上海生工进行测序进一步确定。测序正确的即为pCDH-mesoCAR。

三.慢病毒的包装、浓缩和滴度测定

3.1慢病毒的包装：

3.1.1细胞处理：转染前24小时收集处于对数生长期的第3-10代293T细胞，将5×10^6293T细胞接种于10cm培养板中，细胞在含有10ml 10％FBS的DMEM培养基中生长，置37℃5％CO2培养箱培养24小时，达60-80％密度时可进行转染。

3.1.2向细胞中以5:2:2:2的比例共转染慢病毒载体质粒(pCDH-mesoCAR或其空载体pCDH)及其包装质粒pLP1，pLP2，pLP/VSVG；转染体系如下：

6～8小时后将10cm培养盘中培养基换成完全培养基。

3.1.3转染后24小时，于荧光显微镜下观察293T细胞转染后GFP荧光表达情况。分别于转染24小时、48小时后收集293T培养上清，3000rpm离心15分钟，72小时后收集293T细胞和上清于15ml管，反复冻融三次裂解细胞，离心收集上清；

3.1.4用0.45μm滤器过滤病毒上清，分别获得pCDH-空载体和pCDH-mesoCAR病毒原液；-80℃保存。

3.2慢病毒浓缩

3.2.1分别收集细胞及培养上清，PEG6000浓缩病毒，向病毒溶液中加入1/4体积的PEG6000/NaCl溶液(25％PEG6000+4.4％NaCl)，混匀，4℃静置1小时；

3.2.24℃，5000rpm离心30分钟；

3.2.3弃上清，加入2ml病毒溶解液(10mM Tris-HCl(pH8.0)，2mM MgCl2，5％蔗糖)溶解慢病毒沉淀，并分装于-80℃储存。

3.3慢病毒滴度测定

3.3.1预先接种BHK21细胞至24孔板，10^5细胞/孔，置于37℃5％CO2细胞培养箱培养18小时；

3.3.2溶解病毒，准备从10^-2到10^-7做10倍梯度稀释病毒样品；

3.3.3去除细胞培养液，加入含有不同梯度的病毒细胞培养液，并在培养液中加入6ug/ml的聚凝胺(polybrene)，置于37℃5％CO2细胞培养箱培养2小时；

3.3.4去除细胞培养液，加入10％FBS的DMEM培养液，置于37℃5％CO₂细胞培养箱培养48小时；

3.3.5去除细胞培养液，加入含2ug/ml嘌呤霉素和1％FBS的DMEM培养液，置于37℃5％CO₂细胞培养箱培养72小时；

3.3.6去除细胞培养液，加入结晶紫染色液，计数被染色克隆数，并计算病毒滴度。

3.2.10将病毒稀释至10^7TU/ml，于-80℃储存。

四.DC细胞的体外培养、感染和扩增

1用CD14⁺分选试剂盒(购自STEM CELL公司)将CD14⁺细胞从PBMC中分选出来。

2用X-VIVO 15培养基重悬细胞，加入500U/ml的重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)溶液、500U/ml的IL-4溶液和一定量的自体血浆，诱导CD14⁺细胞向DC细胞分化。

3向培养6至8天的DC细胞中每孔分别加入pCDH-空载体或pCDH-mesoCAR病毒浓缩液(梯度设定，确定最佳感染滴度)，以及终浓度为6μg/ml的聚凝胺，混匀，置于37℃，5％CO₂培养箱培养，24小时内不换液；感染后24小时进行第二次感染；

4感染后96小时，用荧光显微镜观察DC细胞的绿色荧光表达情况并照相。结果见图3。

5收集细胞后，1000rpm离心10分钟，PBS洗涤1次，用适量PBS重悬细胞置于流式管中，用流式细胞仪检测GFP阳性率。

五.体外共培养测定CAR-DC细胞的活化及对T细胞的激活作用

5.1分析DC细胞活化，效应细胞mesoCAR-DC与靶细胞间皮素⁺A431(人间皮素转染A431细胞)细胞以不同比例共培养后，通过流式检测表明DC细胞活化的MHC-I/MHC-II I/CD86/CD40的表达水平。结果见图4。

5.2分析T细胞激活

5.2.1T细胞的分离培养，用CD8⁺T细胞分选试剂盒(购自STEM CELL公司)将T细胞从外周血单核细胞(PBMC)中分选出来；

5.2.2用含10％FBS的RPMI 1640培养基调整细胞浓度至1×10^6/ml，将细胞接种到预先用抗人CD3和CD28抗体包被的细胞培养瓶中，再加入200IU/ml重组人白细胞介素2(rhIL-2)，置于37℃5％CO2细胞培养箱培养；

5.2.3mesoCAR-DC，A431，CD8⁺T细胞以3:1:3比例共培养后，通过流式检测T细胞活化的CD25的表达水平，分析T细胞激活情况。结果见图5，与对照相比mesoCAR-DC对T细胞的刺激作用明显。

六.体内mesoCAR-DC细胞对间皮素⁺肿瘤的杀伤活性

6.1NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ(NSG)小鼠在皮下植入5x10^6原代A431-H9(人间皮素稳转A431)细胞，观察并测量肿瘤生长情况，直至肿瘤生长至40mm³,给予CAR-DC。

6.2mesoCAR-DC细胞治疗间皮素阳性荷瘤小鼠的效果测定：从小鼠尾静脉注射1x10^6mesoCAR-DC和1x10^6CD8⁺T细胞，观察并测量肿瘤的生长情况，结果见图6，同时记录小鼠存活情况，结果见图7。

由图可知，mesoCAR-DC细胞组的荷瘤小鼠治疗后28天生存率为100％，而单DC细胞治疗及空载体DC细胞组小鼠全部死亡。说明mesoCAR-DC对于间皮素阳性荷瘤小鼠有很好的治疗效果。

实施例2

一、EGFRvIIICAR基因序列的确定

1.1从美国国立医学图书馆网站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez)GenBank数据库获得人CD8α信号肽基因、人CD8α铰链区基因、人CD40跨膜区和人CD40信号域基因序列。将人CD8α信号肽基因、EGFRvIIIscFv轻链基因、接头区(Gly4-Ser)₃、EGFRvIIIscFv重链基因、人CD8α铰链区基因、人CD40跨膜区和人CD40信号域基因序列进行连接，形成最终完整的EGFRvIIICAR基因序列(SEQ ID NO.5)信息。

二、EGFRvIIICAR表达质粒的构建

2.1全基因合成：

由上海生工生物科技有限公司合成完整的EGFRvIIICAR序列，并在其5’端添加XbaI酶切位点，3’端添加EcoR I酶切位点。

2.2通过PCR扩增不包含有人CD40胞内信号区的EGFRvIIICAR’区，5’端添加Xba I酶切位点，3’端添加EcoR I酶切位点。PCR正向引物：GCTCTAGAATGGCCCTGCCTGTG(SEQ IDNO.7)；PCR反向引物：GGAATTCTCAGGTATCAGAAACCCCTGTAG(SEQ ID NO.8)。扩增回收1005bp片段。

2.3将EGFRvIIICAR及EGFRvIIICAR’分别克隆到pCDH慢病毒表达载体中，构建pCDH-EGFRvIIICAR及pCDH-EGFRvIIICAR’质粒。具体如下：将pCDH载体、EGFRvIIICAR片段、EGFRvIIICAR’片段Xba I/EcoR I酶切，分别回收8192bp、1186bp、1000bp片段。分别使用T4DNA连接酶连接酶切后的pCDH载体与EGFRvIIICAR、pCDH载体与EGFRvIIICAR’，用连接产物转化Trans1-T1感受态过夜培养，挑取单克隆培养提取质粒并测序，获得pCDH-EGFRvIIICAR及pCDH-EGFRvIII质粒。EGFRvIIICAR及EGFRvIIICAR’结构见图8。pCDH-EGFRvIIICAR慢病毒表达载体的信息见图9。EGFRvIIICAR’基因序列及氨基酸序列见序列表SEQ ID NO.9和SEQID NO.10。

三、慢病毒的包装、浓缩和滴度测定

3.1慢病毒的包装：

3.1.1细胞处理：转染前24小时收集处于对数生长期的第3-10代293T细胞，将293T细胞接种于六孔细胞培养板中，接种量为5×10^5/孔，细胞在含有2ml 10％FBS的DMEM培养基中生长，置于37℃5％CO₂细胞培养箱培养18小时，细胞密度达到60-80％即可进行转染。

3.1.2向293T细胞中共转染慢病毒载体质粒(pCDH或pCDH-EGFRvIIICAR或pCDH-EGFRvIIICAR’)及其包装质粒(pLP1，pLP2，pLP/VSVG)；

3.1.3转染后24小时，于荧光显微镜下观察293T细胞转染后GFP荧光表达情况。分别于转染后48小时、72小时收集293T培养上清中，3000rpm离心15分钟，分别收集细胞及上清，反复冻融三次裂解细胞，离心收集上清；

3.1.4用0.45μm滤器过滤病毒上清，分别获得pCDH空载体病毒、pCDH-EGFRvIIICAR’病毒、pCDH-EGFRvIIICAR病毒溶液。

3.2慢病毒的浓缩及病毒滴度测定

3.2.1分别收集细胞及培养上清，使用PEG6000浓缩病毒，向病毒溶液中加入1/4体积的PEG6000/NaCl溶液(25％PEG6000+4.4％NaCl)，混匀，4℃静置1小时；

3.2.24℃，5000rpm离心30分钟；

3.2.3弃上清，加入2ml病毒溶解液(10mM Tris-HCl(pH8.0)，2mM MgCl₂，5％蔗糖)溶解慢病毒沉淀，并于-80℃储存。

3.2.4测定病毒滴度。预先接种BHK21细胞至24孔板，10^5/孔，置于37℃5％CO2细胞培养箱培养18小时；

3.2.5溶解病毒，准备从10^-2到10^-7的10倍稀释病毒样品；

3.2.6去除细胞培养液，加入含有不同病毒量的细胞培养液，并在培养液液中加入6ug/ml的聚凝胺(polybrene)，置于37℃5％CO2细胞培养箱培养2小时；

3.2.7去除细胞培养液，加入1％FBS的DMEM培养液，置于37℃5％CO₂细胞培养箱培养48小时；

3.2.8去除细胞培养液，加入含2ug/ml嘌呤霉素、1％FBS的DMEM培养液，置于37℃5％CO2细胞培养箱培养72小时；

3.2.9去除细胞培养液，加入结晶紫染色液，计数被染色克隆数，并计算病毒滴度。

2.10将病毒稀释至10^7TU/ml，于-80℃储存。

四、树突状细胞的体外培养、感染和扩增

4.1用树突状细胞分选试剂盒(购自STEM CELL公司)将CD14⁺细胞从外周血单核细胞(PBMC)中分选出来。

4.2用X-VIVO 15培养基重悬细胞，加入200U/ml的重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)溶液、500U/ml的IL-4溶液和5％的自体血浆，诱导CD14⁺细胞向树突状细胞分化。

4.3向培养6天的树突状细胞中分别加入pCDH或pCDH-EGFRvIIICAR’或pCDH-EGFRvIIICAR病毒浓缩液至病毒感染复数MOI＝10，以及终浓度为6μg/ml的聚凝胺，混匀，置于37℃5％CO₂细胞培养箱培养，24小时内不换液；感染后24小时进行第二次感染；

4.4感染后96小时，用荧光显微镜观察树突状细胞的绿色荧光的表达。

4.5收集细胞后，1000rpm离心10分钟，PBS洗涤1次，用200ul的PBS重悬细胞置于流式管中，用流式细胞仪检测GFP阳性率。阳性细胞即为所得的EGFRvIIICAR-树突状细胞。

五、体外共培养测定CAR-DC细胞的活化及激活T细胞作用

5.1分析树突状细胞活化

5.1.1细胞处理：分别对EGFRvIIICAR-DC细胞及EGFRvIII⁺U87细胞(简称U87vIII)进行计数；

5.1.2将EGFRvIIICAR-DC细胞与EGFRvIII⁺U87细胞按3：1比例混合，置于37℃5％CO₂细胞培养箱培养48小时；

5.1.3收集细胞后，1000rpm离心10min，PBS洗涤1次，用PBS重悬细胞，分别使用抗人MHC-I/MHC-II/CD86/CD80抗体染色，检测DC细胞表面的活化标志MHC-I/MHC-II/CD86/CD80的表达水平。结果见图10，EGFRvIIICAR-DC细胞的活化程度显著升高。

5.2分析T细胞激活

5.2.1T细胞的分离培养，用T细胞分选试剂盒(购自STEM CELL公司)将T细胞从外周血单核细胞(PBMC)中分选出来；

5.2.2用含10％FBS的RPMI 1640培养基调整细胞浓度至1×10^6/ml，将细胞接种到预先用抗人CD3和CD28抗体包被的细胞培养瓶中，再加入200IU/ml重组人白细胞介素2(rhIL-2)，置于37℃5％CO₂细胞培养箱培养；

5.2.3将EGFRvIIICAR-DC细胞、EGFRvIII⁺U87细胞和T细胞按3：1：3的比例混合，置于37℃5％CO₂细胞培养箱培养48小时；

5.2.4收集细胞后，1000rpm离心10分钟，PBS洗涤1次，用PBS重悬细胞，分别使用抗人CD3/CD25抗体染色，检测T细胞表面的活化标志CD25的表达水平。结果见图11，仅EGFRvIIICAR-DC细胞有效活化T细胞。

六、体内CAR-DC细胞的抗肿瘤作用

将20只6-8周龄的NSG小鼠在皮下植入5x10^5EGFRvIII⁺U87细胞，观察和测量肿瘤生长情况，直至肿瘤生长至200mm³，将小鼠随机分为4组，分别通过尾静脉注射10^6EGFRvIIICAR-DC细胞、pCDH空载体-DC细胞+T细胞、pCDH-EGFRvIIICAR’-DC细胞+T细胞、pCDH-EGFRvIIICAR-DC细胞+T细胞(T细胞数为10^6/只)。

CAR-DC细胞治疗脑胶质瘤小鼠模型效果测定：在用CAR-DC细胞治疗后，观察和测量肿瘤的生长，并记录小鼠存活率。肿瘤体积的测量结果参见图12，pCDH-EGFRvIIICAR-DC细胞+T细胞的实验组中，肿瘤体积增长缓慢，且一段时间后逐渐缩小直至消失。存活率参见图13，EGFRvIIICAR-DC细胞+T细胞组的荷瘤小鼠治疗后28天生存率为100％，只用DC细胞治疗及空载体DC细胞组小鼠全部死亡，EGFRvIIICAR’-DC细胞+T细胞组小鼠治疗后28天部分存活，肿瘤生长速度相对减缓。证实了CD40共刺激分子在DC细胞激活T细胞，启动免疫应答中的关键作用。

实施例3：

一、MOv19CAR表达质粒的构建

1.1从美国国立医学图书馆网站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez)GenBank数据库中搜索到人CD8α信号肽基因、人CD8α铰链区基因、人CD40跨膜区和胞内信号区基因序列。MOv19单链抗体(抗α叶酸受体scFv)基因序列。

1.2将上述基因序列依次按人CD8α信号肽基因、MOv19scFv、人CD8α铰链区基因、人CD40跨膜区和CD40胞内信号区序列形成完整的MOv19CAR基因序列(SEQ ID NO.6)；在序列5’端引入EcoRI酶切位点，在序列3’端引入BamHI酶切位点，交给上海生工生物科技有限公司合成，质粒合成回来后将MOv19-CAR从pUC57质粒上酶切下来，同时酶切pCDH空质粒，酶切体系如下：

37℃水浴2小时

聚丙烯酰胺凝胶电泳170V，20min，回收1170bp MOv19CAR-DC片段如图14所示和8200bp的pCDH载体，用于下一步的连接，连接体系如下：

16℃连接过夜

取5μL连接产物转化50μL DH5α感受态细胞，冰浴30分钟，42℃90秒，冰浴2分钟，加入1mL无抗性LB，37℃，250rpm 45分钟，集菌5000rpm 1分钟，弃掉800μL上清，用剩下上清将菌液悬浮起来全部涂布于LB+Amp平板上37℃生长12小时，挑取平板上的单克隆菌落于4mLLB+Amp液体培养基中37℃250rpm震荡培养10小时后，使用天根质粒小提试剂盒提质粒并使用EcoRI和BamHI双酶切鉴定，酶切体系如下：

酶切鉴定正确后送质粒去上海生工测序，保存测序正确的DH5αpCDH-MOv19CAR菌液，形成最终完整的MOv19CAR-DC基因序列信息，MOv19CAR结构如图15和pCDH-MOv19CAR质粒结构如图16所示。

二、慢病毒的包装、浓缩和滴度测定

1慢病毒的包装：

1.1细胞处理：转染前24小时收集处于对数生长期的293T细胞，将1×10⁶293T细胞接种于10cm培养板中，让细胞在含有10mL 10％FBS的DMEM培养基中生长，置于37℃5％CO2培养箱培养24小时，当融合率达到60-80％时可进行转染。

1.2向细胞中共转染慢病毒载体质粒(pCDH-CMV-MOv19-CD40-EF1-copGFP-T2A-puro或其空载体)及其包装质粒(pLP1、pLP2、pLP/VSVG)，加入比例为pCDH-MOv19CAR：pLP1：pLP2：pLP/VSVG＝5：2：2：2于1mL无血清无双抗37℃预热的完全培养基中混合均匀，室温培养育5分钟。将适量转染试剂LipofectamineTM 2000Transfection Reagent(与上述混合质粒按质量比为3：1)逐滴加入2mL无血清无抗生素的培养基中轻轻混匀，室温培养育5分钟。将质粒混合溶液逐滴加入含有转染剂的培养液中，轻弹Eppendorf(简称EP)管使其混匀，室温培养育30分钟。将上述混合液逐滴加入到融合度为60-70％293T细胞中，37℃，5％CO2培养箱中培养。

1.3转染后24小时，于荧光显微镜下观察293T细胞转染后GFP荧光表达情况。分别于转染后24小时、48小时收集293T培养上清中，3000rpm离心15分钟，分别收集细胞及上清，反复冻融三次裂解细胞，离心收集上清；

1.4用0.2μm滤器过滤病毒上清，分别获得pCDH-空载体和pCDH-MOv19CAR病毒原液。

2慢病毒的浓缩及病毒滴度测定

2.1分别收集病毒转染后的细胞及培养上清，PEG6000浓缩病毒，向病毒溶液中加入PEG6000/NaCl溶液(25％PEG6000+4.4％NaCl)，病毒溶液：PEG6000/NaCl溶液体积比为3：1，混匀，4℃静置1小时；

2.24℃，5000rpm离心30min；

2.3吸弃上清，加入2ml病毒溶解液(10mM Tris-HCl(pH＝8.0)，2mM MgCl₂，5％蔗糖)溶解慢病毒沉淀，并分装于-80℃储存。

3.1测定病毒滴度。预先接种BHK21细胞至24孔板，10⁵细胞/孔，置于37℃5％CO₂细胞培养箱培养18小时；

3.2融解病毒，准备从10^-2到10^-7，10倍梯度稀释病毒样品；

3.3去除细胞培养液，加入含有不同病毒量的细胞培养液，并在培养液中加入6ug/mL的polybrene，置于37℃5％CO₂细胞培养箱培养2小时；

3.4去除细胞培养液，加入10％FBS的DMEM培养液，置于37℃5％CO₂细胞培养箱培养48小时；

3.5去除细胞培养液，加入含2ug/mL的嘌呤霉素的1％FBS的DMEM培养液，置于37℃5％CO₂细胞培养箱培养72小时；

3.6去除细胞培养液，加入结晶紫染色液，计算被染色克隆数，并计算病毒滴度。

3.7将病毒稀释至10⁷TU/ml，于-80℃储存。

三、DC细胞的体外培养、感染和扩增

1、用CD14⁺分选试剂盒(购自STEM CELL公司)将CD14⁺细胞从PBMC中分选出来。

2、用X-VIVO 15培养基重悬细胞，加入GM-CSF溶液至终浓度为750U/mL、IL-4溶液至终浓度为750U/ml和自体血浆至终浓度为5％，诱导CD14⁺细胞向DC细胞分化。

3、向6孔板中培养6-8天的DC细胞中每孔分别加入1mLpCDH-空载体或1mL pCDH-MOv19CAR病毒浓缩液，以及终浓度为4μg/ml的聚凝胺(polybrene)，混匀，置于培养箱培养，24小时内不换液；感染后24小时进行第二次感染；

4、感染后4天，用荧光显微镜观察DC细胞的绿色荧光表达情况并照相，结果如图17所示。

5、收集细胞后，1000rpm离心10分钟，PBS洗涤1次，用适量PBS重悬细胞置于流式管中，用流式细胞仪检测DC细胞的GFP阳性率，结果如图18所示。

四、T细胞体外激活

取新鲜健康供者血液使用RosetteSep T细胞分离试剂盒(STEMCELL)分离出人的CD4和CD8T细胞，置于24孔板中(5×10⁵/mL)。按说明书指导将包被抗CD3/CD28的磁珠用PBS洗涤3遍。将磁珠：细胞＝3：1加入T淋巴细胞，放置在37℃、5％CO₂培养箱中培养12-24小时备用。

五、体外共培养测定MOv19CAR-DC细胞的活化情况

T细胞扩增培养10天后，离心去抗CD3/CD28的磁珠，并在DMEM完全培养液中过夜培养。用胰酶消化卵巢癌细胞系SKOV3肿瘤细胞，调整细胞密度为10⁶/mL，取SKOV3肿瘤细胞25uL、50uL、100uL、200uL、400uL接种于96孔板中。按MOv19CAR-DC细胞/pCDH-DC细胞：T细胞：SKOV3细胞数目比为1：1：1向上述96孔板中加入MOv19CAR-DC细胞和T细胞，24小时后使用RNAiso Reagent提取试剂盒提取RNA，经DNA消化和反转录后使用实时荧光定量PCR检测DC细胞的MHC-I/MHC-II/CD86/CD40的表达水平，结果如图所示19，MOv19CAR-DC细胞显著活化。

六、体内MOv19CAR-DC细胞的抗肿瘤作用

将20只生长状况一致6-8周NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ(NSG)雌鼠随机分为4组，同时在雌鼠后背皮下植入1.5x10⁶SKOV3Luc细胞后，待肿瘤长到250mm³左右时，分别以静脉注射(intravenous injection，IV)和肿瘤瘤内注射(intratumor，IT)两种不同方式分别注射10⁶个MOv19CAR-DC细胞和10⁶个T细胞、10⁶个pCDH-DC细胞和10⁶个T细胞(此时记为第0天)后，用游标卡尺及成像系统检测肿瘤生长情况，记录不同组雌鼠的中位生存期。静脉和瘤内注射pCDH-DC细胞和T细胞后小鼠的存活时间为20天，静脉注射MOv19CAR-DC细胞和T细胞后小鼠60天的存活率为40％，瘤内注射MOv19CAR-DC细胞和T细胞后小鼠60天的存活率为60％，结果如图20所示，MOv19CAR-DC细胞有效抑制了异种移植物的增大，并极大的提高了荷瘤小鼠的存活。

综合以上的实施例，可以看出，表达与特定抗原特异性结合的嵌合抗原受体的DC细胞能有效的对表达该特定抗原的肿瘤细胞的杀伤，在体内和体外实验中都显示出了出人意料的卓越的效果，开启了一种细胞过继治疗的新思路，在肿瘤的治疗中具有巨大的潜力。

序列表

<110> 时力生物科技（北京）有限公司

<120> 表达嵌合抗原受体的树突细胞及其用途

<160> 10

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 394

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> mesoCAR的氨基酸序列

<400> 1

Met Val Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro

1 5 10 15

Ala Phe Leu Leu Ile Pro Asp Ile Gln Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser

20 25 30

Gly Pro Glu Leu Glu Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys

35 40 45

Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr Thr Met Asn Trp Val Lys Gln

50 55 60

Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile Gly Leu Ile Thr Pro Tyr Asn

65 70 75 80

Gly Ala Ser Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Arg Gly Lys Ala Thr Leu Thr

85 90 95

Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Asp Leu Leu Ser Leu Thr

100 105 110

Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys Ala Arg Gly Gly Tyr Asp Gly

115 120 125

Arg Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

130 135 140

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Gly Gly Gly Ser Asp

145 150 155 160

Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly Glu

165 170 175

Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met His

180 185 190

Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr Asp

195 200 205

Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Gly Arg Phe Ser Gly Ser Gly

210 215 220

Ser Gly Asn Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Val Glu Ala Glu Asp

225 230 235 240

Asp Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Lys His Pro Leu Thr Phe

245 250 255

Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg

260 265 270

Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg

275 280 285

Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly

290 295 300

Leu Asp Phe Ala Cys Asp Val Leu His Arg Ser Cys Ser Pro Gly Phe

305 310 315 320

Gly Val Lys Gln Ile Ala Thr Gly Val Ser Asp Thr Ile Cys Glu Pro

325 330 335

Cys Pro Val Gly Phe Ser Asn Val Ser Ser Ala Phe Glu Lys Cys His

340 345 350

Pro Trp Thr Arg Ser Pro Gly Ser Ala Glu Ser Pro Gly Gly Asp Pro

355 360 365

His His His Leu Arg Asp Pro Val Cys His Pro Leu Gly Ala Gly Leu

370 375 380

Ser Gln Lys Gly Gly Gln Glu Ala Asn Gln

385 390

<210> 2

<211> 391

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> EGFRvIIICAR的氨基酸序列

<400> 2

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro Glu Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val

20 25 30

Lys Lys Pro Gly Glu Ser Leu Arg Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Phe

35 40 45

Asn Ile Glu Asp Tyr Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys

50 55 60

Gly Leu Glu Trp Met Gly Arg Ile Asp Pro Glu Asn Asp Glu Thr Lys

65 70 75 80

Tyr Gly Pro Ile Phe Gln Gly His Val Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser

85 90 95

Ile Asn Thr Val Tyr Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr

100 105 110

Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Phe Arg Gly Gly Val Tyr Trp Gly Gln Gly

115 120 125

Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

130 135 140

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser

145 150 155 160

Leu Ala Val Ser Leu Gly Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser

165 170 175

Gln Ser Leu Leu Asp Ser Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Gln

180 185 190

Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Arg Leu Ile Ser Leu Val Ser Lys

195 200 205

Leu Asp Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr

210 215 220

Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val

225 230 235 240

Tyr Tyr Cys Trp Gln Gly Thr His Phe Pro Gly Thr Phe Gly Gly Gly

245 250 255

Thr Lys Val Glu Ile Lys Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr

260 265 270

Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala

275 280 285

Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe

290 295 300

Ala Cys Asp Val Leu His Arg Ser Cys Ser Pro Gly Phe Gly Val Lys

305 310 315 320

Gln Ile Ala Thr Gly Val Ser Asp Thr Ile Cys Glu Pro Cys Pro Val

325 330 335

Gly Phe Ser Asn Val Ser Ser Ala Phe Glu Lys Cys His Pro Trp Thr

340 345 350

Arg Ser Pro Gly Ser Ala Glu Ser Pro Gly Gly Asp Pro His His His

355 360 365

Leu Arg Asp Pro Val Cys His Pro Leu Gly Ala Gly Leu Ser Gln Lys

370 375 380

Gly Gly Gln Glu Ala Asn Gln

385 390

<210> 3

<211> 388

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> MOv19CAR的氨基酸序列

<400> 3

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu

20 25 30

Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr

35 40 45

Ser Phe Thr Gly Tyr Phe Met Asn Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys

50 55 60

Ser Leu Glu Trp Ile Gly Arg Ile His Pro Tyr Asp Gly Asp Thr Phe

65 70 75 80

Tyr Asn Gln Asn Phe Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser

85 90 95

Asn Thr Ala His Glu Leu Leu Ser Leu Thr Ser Glu Asp Phe Ala Val

100 105 110

Tyr Tyr Cys Thr Arg Tyr Asp Gly Ser Arg Ala Met Asp Tyr Trp Gly

115 120 125

Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

130 135 140

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Ala

145 150 155 160

Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly Gln Arg Ala Ile Ile Ser Cys Lys Ala

165 170 175

Ser Gln Ser Val Ser Phe Ala Gly Thr Ser Leu Met His Trp Tyr His

180 185 190

Gln Lys Pro Gly Gln Gln Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn

195 200 205

Leu Glu Ala Gly Val Pro Thr Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Lys Thr

210 215 220

Asp Phe Thr Leu Asn Ile His Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr

225 230 235 240

Tyr Tyr Cys His Gln Ser Arg Glu Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly

245 250 255

Thr Lys Leu Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro

260 265 270

Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro

275 280 285

Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp

290 295 300

Val Leu His Arg Ser Cys Ser Pro Gly Phe Gly Val Lys Gln Ile Ala

305 310 315 320

Thr Gly Val Ser Asp Thr Ile Cys Glu Pro Cys Pro Val Gly Phe Ser

325 330 335

Asn Val Ser Ser Ala Phe Glu Lys Cys His Pro Trp Thr Arg Ser Pro

340 345 350

Gly Ser Ala Glu Ser Pro Gly Gly Asp Pro His His His Leu Arg Asp

355 360 365

Pro Val Cys His Pro Leu Gly Ala Gly Leu Ser Gln Lys Gly Gly Gln

370 375 380

Glu Ala Asn Gln

385

<210> 4

<211> 1182

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> mesoCAR的核酸序列

<400> 4

atggttctgc tggtgacatc tctcctgctc tgtgaactgc ctcatcccgc ttttctgctc 60

attcccgaca ttcagcaggt ccagctccag cagtctggcc ctgaactcga aaaacctggc 120

gctagcgtga aaatttcctg taaagcctcc ggctactctt ttactggcta cacaatgaat 180

tgggtgaaac agtctcacgg caaatccctc gaatggatcg gactcatcac accctacaat 240

ggcgcctctt cctacaacca gaaattccgg ggcaaggcaa cactcactgt ggacaaatca 300

tcctctaccg cctacatgga tctgctctcc ctcacatctg aggactccgc tgtctacttt 360

tgtgcccgag gaggatacga cggacgagga ttcgattact ggggacaggg aacaactgtg 420

accgtgtcta gtggcggcgg agggagtgga ggcggaggat cttctggcgg gggatccgat 480

attgaactca cacagtctcc cgctatcatg tctgcttctc ccggcgagaa agtgactatg 540

acttgctctg cttcctcttc tgtgtcctac atgcactggt accagcagaa atctggcaca 600

tcccctaaac ggtggatcta cgatactagc aaactggcat ccggcgtgcc tgggcgattc 660

tctggctctg gctctggcaa ctcttactct ctcacaatct catctgtcga ggctgaggac 720

gatgccacat actactgtca gcagtggtct aaacacccac tcacattcgg cgctggcact 780

aaactggaaa taaaaaccac gacgccagcg ccgcgaccac caacaccggc gcccaccatc 840

gcgtcgcagc ccctgtccct gcgcccagag gcgtgccggc cagcggcggg gggcgcagtg 900

cacacgaggg ggctggactt cgcctgtgat gtcctgcacc gctcatgctc gcccggcttt 960

ggggtcaagc agattgctac aggggtttct gataccatct gcgagccctg cccagtcggc 1020

ttctccaatg tgtcatctgc tttcgaaaaa tgtcaccctt ggacaaggtc cccaggatcg 1080

gctgagagcc ctggtggtga tccccatcat catcttcggg atcctgtttg ccatcctctt 1140

ggtgctggtc tttctcaaaa aggtggccaa gaagccaacc aa 1182

<210> 5

<211> 1173

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> EGFRvIIICAR的核酸序列

<400> 5

atggccctgc ctgtgacagc cctgctgctg cctctggctc tgctgctgca tgccgctaga 60

cccgagattc agctcgtgca atcgggagcg gaagtcaaga agccaggaga gtccttgcgg 120

atctcatgca agggtagcgg ctttaacatc gaggattact acatccactg ggtgaggcag 180

atgccgggga agggactcga atggatggga cggatcgacc cagaaaacga cgaaactaag 240

tacggtccga tcttccaagg ccatgtgact attagcgccg atacttcaat caataccgtg 300

tatctgcaat ggtcctcatt gaaagcctca gataccgcga tgtactactg tgctttcaga 360

ggaggggtct actggggaca gggaactacc gtgactgtct cgtccggcgg aggcgggtca 420

ggaggtggcg gcagcggagg aggagggtcc gacgtcgtga tgacccagag ccctgacagc 480

ctggcagtga gcctgggcga aagagctacc attaactgca aatcgtcgca gagcctgctg 540

gactcggacg gaaaaacgta cctcaattgg ctgcagcaaa agcctggcca gccaccgaag 600

cgccttatct cactggtgtc gaagctggat tcgggagtgc ccgatcgctt ctccggctcg 660

ggatcgggta ctgacttcac cctcactatc tcctcgcttc aagcagagga cgtggccgtc 720

tactactgct ggcagggaac ccactttccg ggaaccttcg gcggagggac gaaagtggag 780

atcaagacca cgacgccagc gccgcgacca ccaacaccgg cgcccaccat cgcgtcgcag 840

cccctgtccc tgcgcccaga ggcgtgccgg ccagcggcgg ggggcgcagt gcacacgagg 900

gggctggact tcgcctgtga tgtcctgcac cgctcatgct cgcccggctt tggggtcaag 960

cagattgcta caggggtttc tgataccatc tgcgagccct gcccagtcgg cttctccaat 1020

gtgtcatctg ctttcgaaaa atgtcaccct tggacaaggt ccccaggatc ggctgagagc 1080

cctggtggtg atccccatca tcatcttcgg gatcctgttt gccatcctct tggtgctggt 1140

ctttctcaaa aaggtggcca agaagccaac caa 1173

<210> 6

<211> 1170

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> MOv19CAR的核酸序列

<400> 6

atggccctgc ctgtgacagc cctgctgctg cctctggctc tgctgctgca tgccgctaga 60

ccccaggtgc agctgcagca gtctggagct gagctggtga agcctggggc ttcagtgaag 120

atatcctgca aggcttctgg ttactcattt actggctact ttatgaactg ggtgaagcag 180

agccatggaa agagccttga gtggattgga cgtattcatc cttacgatgg tgatactttc 240

tacaaccaga acttcaagga caaggccaca ttgactgtag acaaatcctc taacacagcc 300

cacatggagc tcctgagcct gacatctgag gactttgcag tctattattg tacaagatac 360

gacggtagtc gggctatgga ctactggggc caagggacca cggtcaccgt ctccggtgga 420

ggcggttcag gcggaggtgg ctctggcggt ggcggatcgg acatcgagct cactcagtct 480

ccagcttctt tggctgtgtc tctagggcag agggccatca tctcctgcaa ggccagccaa 540

agtgtcagtt ttgctggtac tagtttaatg cactggtacc accagaaacc aggacagcaa 600

cccaaactcc tcatctatcg tgcatccaac ctagaagctg gggttcctac caggtttagt 660

ggcagtgggt ctaagacaga cttcaccctc aatatccatc ctgtggagga ggaggatgct 720

gcaacctatt actgtcatca aagtagggaa tatccgtaca cgttcggagg ggggacaaag 780

ttgaccacga cgccagcgcc gcgaccacca acaccggcgc ccaccatcgc gtcgcagccc 840

ctgtccctgc gcccagaggc gtgccggcca gcggcggggg gcgcagtgca cacgaggggg 900

ctggacttcg cctgtgatgt cctgcaccgc tcatgctcgc ccggctttgg ggtcaagcag 960

attgctacag gggtttctga taccatctgc gagccctgcc cagtcggctt ctccaatgtg 1020

tcatctgctt tcgaaaaatg tcacccttgg acaaggtccc caggatcggc tgagagccct 1080

ggtggtgatc cccatcatca tcttcgggat cctgtttgcc atcctcttgg tgctggtctt 1140

tctcaaaaag gtggccaaga agccaaccaa 1170

<210> 7

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PCR正向引物

<400> 7

gctctagaat ggccctgcct gtg 23

<210> 8

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工引物

<220>

<223> PCR反向引物

<400> 8

ggaattctca ggtatcagaa acccctgtag 30

<210> 9

<211> 987

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> mesoCAR'的核酸序列

<400> 9

atggccctgc ctgtgacagc cctgctgctg cctctggctc tgctgctgca tgccgctaga 60

cccgagattc agctcgtgca atcgggagcg gaagtcaaga agccaggaga gtccttgcgg 120

atctcatgca agggtagcgg ctttaacatc gaggattact acatccactg ggtgaggcag 180

atgccgggga agggactcga atggatggga cggatcgacc cagaaaacga cgaaactaag 240

tacggtccga tcttccaagg ccatgtgact attagcgccg atacttcaat caataccgtg 300

tatctgcaat ggtcctcatt gaaagcctca gataccgcga tgtactactg tgctttcaga 360

ggaggggtct actggggaca gggaactacc gtgactgtct cgtccggcgg aggcgggtca 420

ggaggtggcg gcagcggagg aggagggtcc gacgtcgtga tgacccagag ccctgacagc 480

ctggcagtga gcctgggcga aagagctacc attaactgca aatcgtcgca gagcctgctg 540

gactcggacg gaaaaacgta cctcaattgg ctgcagcaaa agcctggcca gccaccgaag 600

cgccttatct cactggtgtc gaagctggat tcgggagtgc ccgatcgctt ctccggctcg 660

ggatcgggta ctgacttcac cctcactatc tcctcgcttc aagcagagga cgtggccgtc 720

tactactgct ggcagggaac ccactttccg ggaaccttcg gcggagggac gaaagtggag 780

atcaagacca cgacgccagc gccgcgacca ccaacaccgg cgcccaccat cgcgtcgcag 840

cccctgtccc tgcgcccaga ggcgtgccgg ccagcggcgg ggggcgcagt gcacacgagg 900

gggctggact tcgcctgtga tgtcctgcac cgctcatgct cgcccggctt tggggtcaag 960

cagattgcta caggggtttc tgatacc 987

<210> 10

<211> 329

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> mesoCAR'的氨基酸序列

<400> 10

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro Glu Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val

20 25 30

Lys Lys Pro Gly Glu Ser Leu Arg Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Phe

35 40 45

Asn Ile Glu Asp Tyr Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys

50 55 60

Gly Leu Glu Trp Met Gly Arg Ile Asp Pro Glu Asn Asp Glu Thr Lys

65 70 75 80

Tyr Gly Pro Ile Phe Gln Gly His Val Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser

85 90 95

Ile Asn Thr Val Tyr Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr

100 105 110

Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Phe Arg Gly Gly Val Tyr Trp Gly Gln Gly

115 120 125

Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

130 135 140

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser

145 150 155 160

Leu Ala Val Ser Leu Gly Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser

165 170 175

Gln Ser Leu Leu Asp Ser Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Gln

180 185 190

Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Arg Leu Ile Ser Leu Val Ser Lys

195 200 205

Leu Asp Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr

210 215 220

Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val

225 230 235 240

Tyr Tyr Cys Trp Gln Gly Thr His Phe Pro Gly Thr Phe Gly Gly Gly

245 250 255

Thr Lys Val Glu Ile Lys Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr

260 265 270

Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala

275 280 285

Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe

290 295 300

Ala Cys Asp Val Leu His Arg Ser Cys Ser Pro Gly Phe Gly Val Lys

305 310 315 320

Gln Ile Ala Thr Gly Val Ser Asp Thr

325

Claims

1.表达嵌合抗原受体的树突状细胞，其中所述嵌合抗原受体能够与肿瘤相关抗原特异性结合。

2.根据权利要求1所述的表达嵌合抗原受体的树突状细胞，其中所述肿瘤相关抗原包括但不限于：CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD123、CD138、CEA、cMet、EGFRvIII、IL-13Rα2、FAP、Her2、GD2、PSMA、MUC1、SS1、GPC3、间皮素(Mesothelin)和FRα。

3.根据权利要求2所述的表达嵌合抗原受体的树突状细胞，其中所述嵌合抗原受体与间皮素、EGFRvIII或α叶酸受体(FRα)特异性结合。

4.根据权利要求3所述的表达嵌合抗原受体的树突状细胞，其中所述嵌合抗原受体含有抗间皮素的单链抗体、抗EGFRvIII的单链抗体或抗α叶酸受体的单链抗体。

5.根据权利要求4所述的表达嵌合抗原受体的树突状细胞，其中所述含有抗间皮素的单链抗体的嵌合抗原受体的氨基酸序列为SEQ ID NO.1；所述含有抗EGFRvIII的单链抗体的嵌合抗原受体的氨基酸序列为SEQ ID NO.2；所述含有抗α叶酸受体的单链抗体的嵌合抗原受体的氨基酸序列为SEQ ID NO.3。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的表达嵌合抗原受体的树突状细胞在制备用于治疗肿瘤的制剂中的用途。

7.根据权利要求6所述的用途，其中所述肿瘤包括但不限于：间皮瘤、胰腺癌、卵巢癌、胃癌、鳞状细胞癌、前列腺癌、肺癌、胆管癌、脑胶质瘤、非小细胞肺癌和乳腺癌。

8.制备表达嵌合抗原受体的树突状细胞的方法，其包括：构建表达所述嵌合抗原受体的表达载体；将所述表达载体引入到树突状细胞中。

9.权利要求8所述的方法，其中所述表达载体为慢病毒表达载体。