CN116064677A - 表达trail和cd的间充质干细胞及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及:重组慢病毒载体,其包含编码TRAIL蛋白和CD蛋白的基因;和用使用该载体产生的慢病毒转染的细胞。用本发明的重组慢病毒转染的宿主细胞保持高细胞增殖率,并过表达TRAIL蛋白和CD蛋白。因此,用该慢病毒转染的间充质干细胞可以有用地用作细胞治疗剂。
Description
技术领域
本发明涉及包含编码TRAIL(TNF相关凋亡诱导配体)和CD(胞嘧啶脱氨酶)蛋白的基因的重组慢病毒载体,以及以使用该载体产生的慢病毒转染的细胞。
背景技术
全球范围内正在开发利用细胞的治疗,特别是干细胞治疗市场呈稳步上升趋势,并且年平均增长率为11.7%。
作为成体干细胞的间充质干细胞(MSCs)是可分化成骨、软骨、肌肉、脂肪和成纤维细胞等的多能细胞。另外,MSCs可以相对容易地从各种成体组织例如骨髓、脐带血和脂肪来获得。MSCs的特征在于其迁移到炎症或损伤部位的能力,这也是作为用于递送治疗药物的递送载体的巨大优势。此外,可以通过抑制免疫细胞如T细胞、B细胞、树突细胞和自然杀伤细胞的功能来调节人体的免疫功能。另外,MSCs具有可以相对容易地在体外培养的优势,因此,正在积极地对使用MSCs作为细胞治疗剂进行研究。
然而,尽管MSCs具有这些优势,但在生产可在临床上用作细胞治疗剂的MSCs中存在以下问题。首先,由于MSCs的增殖存在限制,因此难以大量生产MSCs。其次,由于所获得的MSCs是异源的,因此难以在每次生产中保持相同的效果。第三,单独使用MSCs在治疗上是无效的。
另一方面,韩国专利第1585032号公开了一种含有在水凝胶中培养的间充质干细胞的细胞治疗剂。上述文献提供了一种组合物,该组合物可以通过在分离间充质干细胞以用作细胞治疗剂的步骤中缩短预处理过程而直接给药。然而,完全没有提到上述的间充质干细胞的问题和解决所述问题的方法。因此,有必要研究可用作细胞治疗剂的间充质干细胞。
发明内容
技术问题
本发明的目的是提供包含编码TRAIL蛋白和CD蛋白的基因的重组慢病毒和用上述重组慢病毒转染的宿主细胞。
本发明的另一个目的是提供包含上述重组慢病毒或宿主细胞的药物组合物。
问题的解决方案
根据本发明的一个目的,提供一种重组慢病毒载体,其包含编码TRAIL蛋白和CD蛋白的基因。
此外,根据本发明的另一个目的,提供一种重组慢病毒,其包含编码TRAIL蛋白和CD蛋白的基因。
此外,根据本发明的另一个目的,提供用上述重组慢病毒转染的宿主细胞。
此外,根据本发明的另一个目的,提供用于预防或治疗癌症的药物组合物,所述药物组合物包含作为活性成分的上述重组慢病毒。
此外,根据本发明的另一个目的,提供用于预防或治疗癌症的药物组合物,所述药物组合物包含作为活性成分的上述宿主细胞。
发明的有益效果
用本发明的包含编码TRAIL蛋白和CD蛋白的基因的重组慢病毒转染的宿主细胞表达TRAIL蛋白和CD蛋白并保持高细胞增殖率。另外,可以抑制异常分化,并且可以阻止肿瘤形成的可能性,表明高安全性。因此,所述慢病毒和所述宿主细胞可用作细胞治疗剂。
附图说明
图1是比较永生化MSC和非永生化MSC的细胞增殖率的图:
imMSC:永生化MSC;
MSC:非永生化MSC;
X轴:潜伏期;和
Y轴:累积群体倍增水平(PDL)。
图2是插入pBD-4慢病毒载体中的基因构建体的结构的示意图:
TRE:包含四环素反应元件的启动子;
TRAIL:TNF相关凋亡诱导配体;
IRES:内部核糖体进入位点;和
CD:CD蛋白。
图3比较在对BM-03细胞系和骨髓衍生的MSC进行基因操作之后,作为MSC的固有特征的MSC表面抗原蛋白CD90、CD44、CD105、CD73等的表达。
图4示出在进行基因操作之后的BM-03细胞系的分化能力,其中在进行基因操作后对BM-03细胞系的脂肪形成、骨形成和软骨形成进行鉴定。
图5示出对BM-03(保藏的菌株)中的转基因(TRAIL和CD)的检测结果。泳道1显示标记,泳道2显示阴性对照,泳道3显示阳性对照,泳道4至6显示BM-03。
图6示出使用FACS检测多西环素依赖性TRAIL表达。
图7示出通过用5FC处理表达TRAIL蛋白和CD蛋白的间充质干细胞导致的细胞死亡,这是通过FACS检测到的。
图8是示出通过传代培养获得的BM-03细胞的PDL的图。
图9示出导入了基因的BM-03细胞的核型的分析结果。
具体实施方式
下文将详细描述本发明。
本发明提供重组慢病毒载体,其包含编码TRAIL蛋白和CD蛋白的基因。
如本文所用,术语“TNF相关凋亡诱导配体(下文称为TRAIL)”蛋白质属于TNF家族中的2型跨膜细胞因子。作为自杀基因之一,TRAIL选择性地诱导转化细胞的凋亡。具体地,TRAIL结合存在于细胞表面上的死亡受体-4(DR-4)、DR-5、诱饵受体或诱饵受体-2以激活凋亡信号转导系统。TRAIL对正常细胞是无毒性的,并且已知仅特异性地诱导癌细胞凋亡。
根据本发明的TRAIL蛋白可以是人源蛋白。TRAIL蛋白以能够与三个受体结合的同三聚体形式存在。本发明的TRAIL蛋白可以是具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的多肽。TRAIL蛋白可以与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有约70%、80%、90%、95%或更高的同源性。同时,编码TRAIL蛋白的基因可以是具有SEQ ID NO:2的核苷酸序列的多核苷酸。此外,编码TRAIL蛋白的核苷酸序列可以与SEQ ID NO:2的核苷酸序列具有约70%、80%、90%、95%或更高的同源性。
如本文所用,术语“CD蛋白”是胞嘧啶脱氨酶蛋白,且可以为融合蛋白的形式,其中CD与尿嘧啶磷酸核糖基转移酶(UPRT)连接,并且如本文所用的术语“CD蛋白”可与“CD::UPRT”互换使用。
通过将5-氟胞嘧啶(5FC)转化为具有强细胞毒性的5-氟尿嘧啶(5FU),诱导表达上述CD蛋白的细胞的凋亡。因此,通过用5FC处理,可以诱导含有包含CD蛋白基因的慢病毒载体的细胞的凋亡。
根据本发明的编码CD蛋白的基因序列是通过将编码酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)的CDase的FCY1基因和编码UPRTase的FUR1Δ105基因融合产生的密码子优化序列,其中缺失从N末端起的35个氨基酸。这样的序列可以是美国专利第5,338,678号、国际专利公开第WO 96/16183号和国际专利公开第WO 99/54481号中描述的那些序列。根据一种实施方式,CD蛋白可以是具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的多肽。另外,CD蛋白可以与SEQID NO:3的氨基酸序列具有约70%、80%、90%、或95%、或更高的同源性。同时,编码CD蛋白的基因可以是具有SEQ ID NO:4的核苷酸序列的多核苷酸。此外,编码CD蛋白的核苷酸序列可以与SEQ ID NO:4的核苷酸序列具有约70%、80%、90%、或95%、或更高的同源性。
如本文所用的术语“慢病毒载体”是一种逆转录病毒,是单链RNA形式的载体,并且也可以称为“慢病毒转移载体”。慢病毒载体可以插入感染的靶细胞的基因组DNA中,以稳定表达基因,并可将该基因转移至有丝分裂和非有丝分裂细胞。由于载体不诱导人体的免疫应答,因此其表达继续。另外,与作为常规病毒载体的腺病毒载体相比,具有可以递送大尺寸的基因的优势。
慢病毒载体可以进一步包含编码胸苷激酶(TK)蛋白的基因。TK蛋白质是通过使ATP的γ-位的磷酸结合至胸苷来催化胸苷酸生成反应的酶,由此胸苷转化为三磷酸盐形式。经修饰的胸苷不能用于DNA复制,并且已知经修饰的胸苷诱导含有该经修饰的胸苷的细胞死亡。用于本文的TK蛋白可以是任何已知序列之一。根据一种实施方式,TK蛋白可以是具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的多肽。同时,编码TK蛋白的基因可以是具有SEQ ID NO:6的核苷酸序列的多核苷酸。
本发明的重组慢病毒载体可以包括一个或两个启动子。启动子可以是巨细胞病毒(CMV)、呼吸道合胞病毒(RSV)、人延伸因子-1α(EF-1α)或四环素反应元件(TRE)启动子。根据一种实施方式,重组慢病毒载体可以通过一个启动子来调节TRAIL或CD蛋白的表达。该启动子可以与编码待表达蛋白质的基因可操作地连接。
根据一种实施方式,TRAIL和CD蛋白可以与TRE启动子连接。TRE启动子可以通过四环素反式激活因子(tTA)蛋白来激活与该启动子连接的基因的转录。具体地,当不存在四环素或多西环素时,tTA蛋白结合至TRE启动子并激活转录,而当存在四环素或多西环素时,tTA蛋白不能结合至TRE启动子并激活转录。因此,可以通过添加或消耗四环素或多西环素来调节TRAIL或CD蛋白的表达。
术语“可操作地连接”是指特定多核苷酸与另一多核苷酸连接,使得该特定多核苷酸可以发挥其功能。编码特定蛋白质的基因与启动子可操作地连接的措辞意味着该基因连接成使得该基因可以通过该启动子的作用转录成mRNA并翻译成蛋白质。
当两个或更多个基因连接成使得该两个或更多个基因由本发明的慢病毒载体中的一个启动子转录时,该载体可以包含核糖体进入位点(IRES),使得可以由单个转录物表达每个蛋白。
术语“核糖体进入位点(IRES)”是指在真核蛋白质合成期间起作用从而能够从转录物的中间区域而不是5'-帽结构开始翻译的核酸序列。通过使用IRES,可以从单个转录物产生多个发挥不同功能的蛋白质。根据一种实施方式,本发明的重组慢病毒载体可以转录成单个转录物,然后可以由该单个转录物产生每种蛋白质,所述重组慢病毒载体中TRAIL蛋白与CD蛋白通过IRES连接。
本发明提供一种重组慢病毒,其包含编码TRAIL蛋白和CD蛋白的基因。
该重组慢病毒可以通过以下步骤获得:用本发明的慢病毒载体、包装质粒和包膜质粒转化宿主细胞;从转化的宿主细胞中分离出慢病毒。
术语“包装质粒”和“包膜质粒”可以提供辅助构建体(例如,质粒或分离的核酸),用于由本发明的慢病毒载体产生慢病毒,以进行有效转染。这种构建体含有用于在宿主细胞中制备并包装慢病毒载体的有用元件。上述元件包括:结构蛋白,例如gag前体;加工蛋白,例如pol前体;蛋白酶;外壳蛋白;和在宿主细胞中制备蛋白质和产生慢病毒颗粒所必需的表达和调节信号等。
对于重组慢病毒的生产,可以使用由Clontech Laboratories Inc.提供的Lenti-X慢病毒表达系统(Lenti-X Lentiviral Expression System)、由Addgene提供的包装质粒(例如pRSV-Rev、psPAX、pCI-VSVG、pNHP等)或包膜质粒(例如pMD2.G、pLTR-G、pHEF-VSVG等)。
此外,本发明提供用上述重组慢病毒转染的宿主细胞。
术语“转染”是指通过病毒感染递送装载在重组慢病毒载体中的基因。
根据本发明的宿主细胞可以是人胚胎干细胞(hES)、骨髓干细胞(BMSC)、间充质干细胞(MSC)、人神经干细胞(hNSC)、角膜缘干细胞、或口腔粘膜上皮细胞。根据本发明的一种实施方式,该宿主细胞可以是间充质干细胞。
术语“间充质干细胞(MSC)”是指能够分化成包括骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞的各种细胞的多能基质细胞。间充质干细胞可以分化成特定器官的细胞,例如骨、软骨、脂肪、肌腱、神经组织、成纤维细胞和肌细胞。这些细胞可以从脂肪组织、骨髓、外周血、脐带血、骨膜、真皮、中胚层衍生的组织等中分离或纯化。
所述宿主细胞可通过以下方法制备:
1)用包含hTERT和c-myc基因的慢病毒对宿主细胞进行初次感染;
2)用包含tTA基因的慢病毒对初次感染的宿主细胞进行二次感染;和
3)用包含TRAIL基因和CD基因的慢病毒对二次感染的宿主细胞进行三次感染。
在步骤1)中,hTERT和c-myc是使宿主细胞永生化的基因。也可以使用除hTERT和c-myc之外的称为永生化基因的基因。根据一种实施方式,hTERT和c-myc蛋白可以分别是具有SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:7的氨基酸序列的多肽。同时,编码hTERT和c-myc蛋白的基因可以分别是具有SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:8的核苷酸序列的多核苷酸。
在步骤2)中,tTA是能够调节靶蛋白表达的基因,所述靶蛋白意指四环素反式激活因子。如本文所用的Tet-off系统可以根据如上所述的存在或不存在四环素或多西环素来调节靶蛋白的表达。
步骤2)中的三次感染可以使用在单个载体中包含TRAIL基因和CD基因的本发明的载体进行。然而,在本发明的另一个方面,TRAIL基因和CD基因可以分别制备成各自的基因构建体并插入两个慢病毒载体。也就是说,可以将如下慢病毒载体用于三次感染:其中插入了制备成可以表达编码TRAIL蛋白的基因的基因构建体的慢病毒载体和其中插入了制备成可以表达编码CD蛋白的基因的基因构建体的慢病毒载体。
将通过上述方法制备的细胞命名为BM-03,并于2017年1月6日保藏在韩国生命科学与生物技术研究院(Korea Research Institute of Bioscience&Biotechnology,KRIBB)的韩国典型培养物保藏中心(Korean Collection for Type Cultures),保藏号为KCTC 13182BP。
本发明提供用于预防或治疗癌症的药物组合物,所述药物组合物包含作为活性成分的上述重组慢病毒或宿主细胞。
癌症是指涵盖血癌和实体癌的一般性癌症。癌症的例子可以包括胃癌、结肠癌、乳腺癌、肺癌、非小细胞肺癌、骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头颈癌、黑色素瘤、宫颈癌、卵巢癌、直肠癌、子宫内膜癌、霍奇金病、脑肿瘤、肉瘤、食道癌、小肠癌、甲状腺癌、前列腺癌、白血病、淋巴瘤、膀胱癌、中枢神经系统肿瘤、脊髓肿瘤等。
所述药物组合物是一种细胞治疗剂,并且可以进一步包含药学上可接受的运载体。所述运载体可以是通常用于制备药物的运载体,其可以包括乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、阿拉伯树胶、磷酸钙、海藻酸盐、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、糖浆、甲基纤维素、甲基羟基苯甲酸酯、丙基羟基苯甲酸酯、滑石、硬脂酸镁、矿物油等。
此外,本发明的药物组合物还可包含药学上可接受的添加剂,所述药学上可接受的添加剂选自润滑剂、润湿剂、甜味剂、调味剂、乳化剂、悬浮剂、防腐剂及其组合。
基于本发明的药物组合物的总重量,可以包括量为约1wt%至约99.99wt%,优选约90wt%至约99.99wt%的运载体,并且可以包括量为约0.1wt%至约20wt%的药学上可接受的添加剂。
所述药物组合物可以通过根据常规方法用药学上可接受的运载体和赋形剂配制而制备成单位剂量,或者可以通过填充到多剂量容器中来制备。本文中,所述制剂可以是溶液、悬浮液、糖浆或在油或水性介质中的乳液的形式,或者是提取物、粉剂、粉状药物、颗粒剂、片剂或胶囊的形式,并且可以另外含有分散剂或稳定剂。
本发明还提供了如上所述的用于预防或治疗癌症的方法,包括将本发明的药物组合物给药至对象的步骤。
所述对象可以是哺乳动物,特别是人。该药物组合物的给药途径和剂量可以根据患者的状况和副作用的存在以各种方式和量来调节以给药至对象,并且最佳给药方法和剂量可以由本领域技术人员在合适的范围内选择。此外,所述药物组合物可以与已知对要治疗的疾病具有治疗效果的其他药物或生理活性物质联合给药,或者可以与其他药物配制成组合制剂的形式。
当该药物组合物经胃肠外给药时,给药的实例包括皮下、眼、腹膜内、肌内、口服、直肠、眶内、脑内、颅内、脊柱内、脑室内、鞘内、鼻内、静脉内给药。
上述给药可以给药一次或多次,一至三次,特别是以两次分开的剂量给药。在重复给药的情况下,可以以12至48小时,24至36小时的间隔给药,更特别地,以24小时的间隔给药。在慢病毒的情况下,,可以以1.0×106至1.0×1012TU,特别是以1.0×108至1.0×1010TU的量对成人进行给药。另一方面,在细胞的情况下,可以以1.0×105至1.0×1011个细胞,特别地,以1.0×10 7至1.0×109个细胞的量对成人进行给药。当剂量高时,可以每天给药数次。
本发明的实施方式
下文参考实施例详细地描述本发明。然而,以下实施例旨在说明本发明,且本发明不限于此。
实施例1.永生化间充质干细胞(MSCs)的制备
1-1.含有永生化基因的慢病毒载体的制备
为了使MSC永生化,制备分别含有永生化基因c-Myc和hTERT的慢病毒载体。在此,将表达tTA蛋白的基因构建体一起插入以使用Tet-off系统。
首先,通过用CMV启动子代替pWPT载体(Addgene,USA)表达盒中的EF启动子并将RSV启动子添加到其下游,制备pBD慢病毒载体。
c-Myc基因(SEQ ID NO:8)和胸苷激酶(TK)基因(SEQ ID NO:6)通过IRES连接,并插入pBD慢病毒载体中,从而可以通过CMV启动子来调节表达。该构建的载体命名为pBD-1。
另一方面,将hTERT基因(SEQ ID NO:10)插入pBD慢病毒载体中,从而可以通过CMV启动子来调节表达。向其中插入对zeomycin具有抗性的基因(ZeoR;SEQ ID NO:16),从而可以通过RSV启动子来调节表达。该构建的载体命名为pBD-2。
另外,将tTA(四环素反式激活因子)基因(SEQ ID NO:12)插入pBD慢病毒载体中,从而可以通过CMV启动子来调节表达。向其中插入对嘌呤霉素具有抗性的基因(PuroR;SEQID NO:14),从而可以通过RSV启动子来调节表达。该构建的载体命名为pBD-3。
1-2.含有永生化基因的慢病毒的产生
使用实施例1-1中构建的慢病毒载体,通过以下方法产生含有永生化基因的慢病毒。
首先,使用补充有10%胎牛血清的DMEM,在150mm培养皿中培养Lenti-X细胞(Clontech Laboratories,USA)。同时,使用EndoFree Plasmid Maxi试剂盒(Qiagen,USA)从DH5α大肠杆菌细胞中提取并定量慢病毒载体。
用PBS洗涤培养的Lenti-X细胞,然后向其中添加3ml TrypLETMSelect CTSTM(Gibco,USA)。将细胞在37℃下放置约5分钟,然后验证其脱落。通过向其中添加7ml补充有10%胎牛血清的DMEM来中和脱离的细胞。将中和的细胞收集在50ml管中,并以1,500rpm离心5分钟。移除所得上清液,通过向其中添加10ml补充有10%胎牛血清的DMEM来重悬细胞。用血细胞计数器对悬浮细胞计数,然后以1.2×107个细胞的量分配到150mm的培养皿中。当将分配的细胞培养至细胞饱和度为约90%时,用12μg的慢病毒载体、12μg的psPAX(Addgene;表达gag-pol,包装质粒)和2.4μg的pMD.G质粒(Addgene;表达VSVG,包膜质粒)的混合物转化细胞。为了促进转化,使用脂质体(Invitrogen,USA)和PLUS试剂(Invitrogen,USA)。转化6小时后,用补充有10%胎牛血清的DMEM更换培养基。在另外培养48小时后,收集上清液。
将获得的上清液与慢病毒浓缩试剂盒(Lenti-X浓缩器,Clontech Laboratories,USA)混合,然后在4℃下培养过夜。在4℃和4,000rpm的条件下离心2小时以获得病毒,然后将病毒重悬于0.5ml不含FBS的DMEM中。结果,分别制备由pBD-1、pBD-2和pBD-3慢病毒载体产生的浓度为4.0×108TU/ml、2.0×108TU/ml和1.2×109TU/ml的慢病毒。
1-3.永生化间充质干细胞的制备
使用含有实施例1-2中产生的永生化基因的慢病毒制备永生化MSCs。
首先,通过以下方法来制备骨髓衍生的MSCs。具体地,从健康供体的髂嵴获得骨髓抽出物。将抽出物与20IU/ml肝素在无菌容器中混合以抑制凝结。将骨髓混合物溶液在4℃,739g的条件下离心7分钟,然后移除上清液,将所得物与10倍量(按体积计)的无菌水混合。将得到的混合物在相同条件下再次离心,得到细胞团块。将获得的团块悬浮于补充有20%FBS和5ng/ml的b-FGF(100-18B,Peprotech,USA)的DMEM-低葡萄糖(11885-084,Gibco,USA)中,然后将其分配到培养瓶内。在37℃,5%CO2的条件下将细胞培养24至48小时,然后更换新培养基。将细胞传代培养,同时以3至4天的间隔用新培养基更换培养基。培养2周后,使用荧光细胞分析仪证实MSCs。
使用Retronectin(Clontech Laboratories,USA)用实施例1-2中产生的pBD-1慢病毒以100MOI感染上述制备的MSCs。通过相同的方法用pBD-2慢病毒载体以100MOI感染已感染的细胞。感染后,通过向稳定化细胞的培养基中添加500μg/ml的zeomycin来选择用pBD-2慢病毒感染的细胞。
用pBD-3慢病毒载体以100MOI感染选择的细胞。感染后,通过向稳定化细胞的培养基中添加1μg/ml嘌呤霉素来选择用pBD-3慢病毒感染的细胞。
结果,含有永生化基因的MSCs和不含永生化基因的MSCs的细胞增殖率如图1所示。如图1所示,用含有永生化基因c-myc和hTERT的慢病毒感染的MSCs即使在培养120天后仍保持高细胞增殖率。另一方面,非永生化MSCs(MSC)的细胞增殖率在培养40天后迅速下降。
实施例2.含有TRAIL和CD基因的慢病毒的构建
2-1.含有TRAIL和CD基因的慢病毒载体的构建
将TRAIL基因(SEQ ID NO:2)和CD基因(SEQ ID NO:4)插入制备的pBD慢病毒载体中。在此,插入的TRAIL和CD基因通过IRES(内部核糖体进入位点)连接,并且将表达被设计为由TRE启动子调节。IRES是使翻译在没有5'-帽结构的情况下开始的核糖体结合位点,从而使得两种蛋白能够通过单个mRNA来表达。另一方面,TRE启动子可以根据有无添加多西环素来调节与启动子连接的基因的表达。
构建的载体命名为pBD-4,基因构建体的结构如图2所示。
2-2.含有TRAIL和CD基因的慢病毒的产生
使用实施例2-1中构建的含有TRAIL和CD基因的慢病毒载体,通过与实施例1-2中所述相同的方法来产生慢病毒。将产生的慢病毒制备为7.6×108TU/ml的浓度。
实施例3.用含有TRAIL和CD基因的慢病毒感染的MSC的制备
3-1.用含有TRAIL和CD基因的慢病毒感染的MSC的制备
通过用实施例2-2中产生的含有TRAIL和CD基因的慢病毒感染实施例1-3中制备的永生化MSCs来制备表达TRAIL和CD基因的细胞。通过与实施例1-3中所述相同的方法进行感染。感染后,将1μg/ml多西环素(631311,Clontech,USA)添加至稳定化细胞的培养基中,在抑制TRAIL和CD表达的状态下培养细胞。在细胞稳定后,通过在移除了多西环素的细胞培养基中培养细胞72小时来诱导TRAIL和CD表达,然后使用FACS来分离表面上表达有TRAIL的细胞。
特别地,将用含有TRAIL和CD基因的慢病毒感染的细胞以5×105个细胞/管分配至FACS管中,在4℃和1,500rpm的条件下离心5分钟,移除所得的上清液。通过向其中添加1ml的FACS缓冲液(含有2%胎牛血清的PBS)来重悬细胞,然后在相同的条件下离心,并移除所得的上清液。再进行一次上述洗涤程序之后,将细胞重悬于1ml的FACS缓冲液中。重悬的细胞添加通过将0.3μl的Fixable Near-IR Dead Cell Stain((LifeTechnologies-Molecular Probes,USA)、5μl的APC抗人CD253抗体(BioLegend,Cat#.308210,USA)、抗TRAIL抗体添加至200μl的FACS缓冲液而制备的混合物,使所得的混合物在4℃下反应30分钟。反应后,通过与上述相同的方法将细胞洗涤两次,并移除所得的上清液。将300μl固定缓冲液(含有2%甲醛和1%胎牛血清的PBS)添加至洗涤的细胞并在4℃下放置至少15分钟。通过FACS(LSRFortessa,BD biosciences,USA)装置分析细胞,并分离表达TRAIL的细胞。
培养分离的细胞以形成克隆。培养从形成的克隆中获得的单克隆细胞以建立细胞系,将该细胞系命名为BM-03。细胞系BM-03于2017年1月6日保藏于韩国生命科学与生物技术研究院(KRIBB)的韩国典型培养物保藏中心,保藏号为KCTC 13182BP。
3-2.检测建立的细胞系中表面抗原蛋白的表达
使用人MSC测定试剂盒(StemflowTM,Cat No 562245,BD)分析插入基因前的骨髓衍生的MSCs的表面抗原表达和插入了TRAIL和CD基因的BM-03细胞系的表面抗原蛋白表达。根据每个试剂盒中包含的手册进行实验,实验结果如图3所示。
如图3所示,证实了在进行了基因操作以表达TRAIL和CD治疗基因的BM-03细胞系中作为MSCs的固有特征的表面抗原蛋白CD90、CD44、CD105、CD73的表达与在骨髓衍生的MSCs中的表达是相同的。
3-3.检测BM-03细胞系分化的能力
将BM-03细胞系以1×104个细胞/cm2的浓度接种在12孔板中以检查脂肪形成。使用一般培养基,将细胞在5%CO2和37℃的条件下在培养箱中培养2至3天,然后替换为脂肪形成分化培养基(脂肪形成分化试剂盒,Thermo fisher Scientific,A10070-01)。将细胞培养21天,同时每3或4天更换培养基。培养完成后,用油红O(Oil Red O)溶液将细胞染色并用显微镜检查。
为了检测骨形成,将细胞以5×103个细胞/cm2的浓度接种在12孔板中。使用一般培养基,将细胞在5%CO2和37℃的条件下在培养箱中培养2至3天,然后替换为骨形成分化培养基(骨形成分化试剂盒,Thermo fisher Scientific,A10072-01)。将细胞培养21天,同时每3或4天更换培养基。培养完成后,用茜素红S(Alizarin Red S)将细胞染色并用显微镜检查。
为了检测软骨形成,使细胞以1.6×107个细胞/ml的浓度悬浮,并将5μl悬浮液接种在24孔板中并培养2小时。向其中添加500μl软骨形成分化培养基(软骨形成分化试剂盒,Thermo fisher Scientific,A10071-01),将细胞培养14天,同时每3天更换培养基。培养后,吸出培养基,并用DPBS漂洗细胞,取出团块。冰冻切片后,用阿尔新蓝(Alcianblue)将细胞染色并用显微镜检查。结果如图4所示。
如图4所示,验证了经过基因操作以表达TRAIL和CD治疗基因的BM-03细胞系具有作为MSCs的固有特征的分化能力。
3-4.检测导入BM-03细胞系中的基因的测试
将建立的细胞系BM-03的样品在37℃的恒温水浴中解冻约1分钟,转移至含有9mlPBS的15ml管中,并以1,500rpm/分钟进行细胞沉降处理5分钟。在完全移除PBS后,使团块悬浮于1.5ml管中的200μl PBS中,并转移。用Tissue(MN,740952.250)制备gDNA,如下表1所示制备混合物,然后通过如下表2所示的步骤进行PCR。在此,加入100ng的BM-03质粒DNA作为阳性对照,并用1μl的dW作为阴性对照。
[表1]
正向引物(SEQ ID NO:17)(10pmol/μl,GX535) | 1μl |
反向引物(SEQ ID NO:18)(10pmol/μl,GX534) | 1μl |
样品(100ng/μl) | 1μl |
dW | 17μl |
总体积 | 20μl |
[表2]
将1%琼脂糖凝胶置于电泳试剂盒中。将10μl的DNA大小标记物载入第一个孔中,并将10μl的阴性对照、阳性对照和BM-03样品(x3)各自分别以上述顺序载入后面的孔中。此后,以100V电泳20分钟,并拍摄凝胶照片。结果如图5所示。
如图5所示,所有三个BM-03细胞系样品显示与阳性对照相同大小(1.2kb)的PCR产物。
3-5.建立的细胞系中TRAIL和CD蛋白表达的鉴定
在实施例3-1中建立的BM-03细胞系中,通过与实施例3-1中相同的方法来诱导TRAIL和CD蛋白的表达,进行FACS以鉴定TRAIL根据多西环素存在或不存在进行的表达。然后,在鉴定出表达了TRAIL的细胞系中鉴定CD蛋白的表达。
特别地,使用补充有含2μg/ml多西环素的10%FBS的DMEM和补充有不含2μg/ml多西环素的10%FBS的DMEM将BM-03细胞系以5×105个细胞的数量接种在T75瓶中。培养3天后移除细胞。测量细胞的数目后,将每组5×105个细胞用PE抗人CD253(TRAIL)抗体(BioLegend,308206)和PE小鼠IgG1,κ同种型对照抗体(BioLegend,400112)染色。另外,为了在排除死细胞后鉴定表达,使用Fixable Near-IR死细胞染色试剂盒(Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit,Thermos Fisher ScientificL34976)抗体。使用FACS(LSRFortessa,BD Biosciences)装置分析样品。通过相同的方法培养细胞后,通过去除多西环素来诱导CD的表达。向其中加入浓度为100μg/ml的5-FC(5-氟胞嘧啶,Sigma)48小时后,观察到凋亡。结果如图6和图7所示。
如图6所示,发现当添加多西环素时TRAIL不表达,但在去除多西环素的培养基中培养的BM-03细胞系中表达TRAIL。此外,发现如图7所示,如果表达CD蛋白,则细胞被5FC杀伤。也就是说,由于CD蛋白的表达导致细胞死亡。因此,发现在制备的由Tet-off系统调节的间充质干细胞中表达TRAIL蛋白和CD蛋白。
3-6.细胞群体倍增水平(PDL)分析
使用含有2μg/ml多西环素的培养基将BM-03细胞系以4×105个细胞接种于T75瓶中。通过进行约3或4天传代培养来获得细胞,并对细胞总数进行计数。接种相同数量的细胞,每3天或4天测量PDL。使用以下等式1计算PDL,结果示于图8中。在等式1中,X代表初始PDL,I代表接种在培养基中的细胞的初始数量,Y代表最终细胞产量或生长期结束时的细胞数量。
[等式1]
PDL=X+3.222(log Y-log I)
如图8所示,在长期传代培养中观察到稳定的生长。
3-7.细胞核型分析
为了检测在BM-03细胞系中导入了基因的细胞的染色体异常,委托EONE生命科学研究所(韩国)进行分析,并且该分析按照方案进行。分析结果如图9所示。
如图9所示,在导入了基因的BM-03细胞的染色体中未观察到异常,因此确定为正常核型。
Claims (15)
1.一种重组慢病毒载体,其包含编码TNF相关凋亡诱导配体(TRAIL)蛋白和胞嘧啶脱氨酶(CD)蛋白的基因。
2.根据权利要求1所述的重组慢病毒载体,其特征在于,所述TRAIL蛋白包括氨基酸序列SEQ ID NO:1。
3.根据权利要求1所述的重组慢病毒载体,其特征在于,所述CD蛋白包括氨基酸序列SEQ ID NO:3。
4.根据权利要求1所述的重组慢病毒载体,其特征在于,所述重组慢病毒载体包含一个或两个启动子。
5.根据权利要求4所述的重组慢病毒载体,其特征在于,所述启动子选自由巨细胞病毒启动子、呼吸道合胞病毒启动子、人延伸因子-1α启动子和四环素反应元件启动子组成的组。
6.根据权利要求1所述的重组慢病毒载体,其特征在于,所述重组慢病毒载体包含内部核糖体进入位点。
7.一种重组慢病毒,其包含编码TRAIL蛋白和CD蛋白的基因。
8.根据权利要求7所述的重组慢病毒,其特征在于,所述慢病毒通过以下步骤获得:
用根据权利要求1所述的慢病毒载体、包装质粒和包膜质粒转化宿主细胞;以及
从转化的宿主细胞中分离出所述慢病毒。
9.一种宿主细胞,其用根据权利要求7所述的重组慢病毒感染。
10.根据权利要求9所述的宿主细胞,其特征在于,所述宿主细胞为间充质干细胞。
11.一种用于预防或治疗癌症的药物组合物,所述药物组合物包含作为活性成分的根据权利要求7所述的重组慢病毒。
12.根据权利要求11所述的药物组合物,其特征在于,所述癌症选自由胃癌、结肠癌、乳腺癌、肺癌、非小细胞肺癌、骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头颈癌、黑色素瘤、宫颈癌、卵巢癌、直肠癌、子宫内膜癌、霍奇金病、脑肿瘤、肉瘤、食道癌、小肠癌、甲状腺癌、前列腺癌、白血病、淋巴瘤、膀胱癌、中枢神经系统肿瘤和脊髓肿瘤组成的组。
13.一种用于预防或治疗癌症的药物组合物,所述药物组合物包含作为活性成分的根据权利要求9所述的宿主细胞。
14.根据权利要求7所述的重组慢病毒在制备用于预防或治疗癌症的药物上的用途。
15.根据权利要求9所述的宿主细胞在制备用于预防或治疗癌症的药物上的用途。
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