CZ296617B6 - Farmaceutická kompozice, molekula nukleové kyseliny, virový vektor a jejich pouzití a pouzití polypeptidu - Google Patents

Farmaceutická kompozice, molekula nukleové kyseliny, virový vektor a jejich pouzití a pouzití polypeptidu Download PDF

Info

Publication number
CZ296617B6
CZ296617B6 CZ0309697A CZ309697A CZ296617B6 CZ 296617 B6 CZ296617 B6 CZ 296617B6 CZ 0309697 A CZ0309697 A CZ 0309697A CZ 309697 A CZ309697 A CZ 309697A CZ 296617 B6 CZ296617 B6 CZ 296617B6
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
polypeptide
neu
leu
amino acid
cells
Prior art date
Application number
CZ0309697A
Other languages
English (en)
Other versions
CZ309697A3 (cs
Inventor
A. Cheever@Martin
L. Disis@Mary
Original Assignee
University Of Washington
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by University Of Washington filed Critical University Of Washington
Publication of CZ309697A3 publication Critical patent/CZ309697A3/cs
Publication of CZ296617B6 publication Critical patent/CZ296617B6/cs

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • A61K39/001102—Receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A61K39/001103—Receptors for growth factors
    • A61K39/001106—Her-2/neu/ErbB2, Her-3/ErbB3 or Her 4/ErbB4
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/461—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
    • A61K39/4611—T-cells, e.g. tumor infiltrating lymphocytes [TIL], lymphokine-activated killer cells [LAK] or regulatory T cells [Treg]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
    • A61K39/4643—Vertebrate antigens
    • A61K39/4644—Cancer antigens
    • A61K39/464402—Receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A61K39/464403—Receptors for growth factors
    • A61K39/464406—Her-2/neu/ErbB2, Her-3/ErbB3 or Her 4/ ErbB4
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4702—Regulators; Modulating activity
    • C07K14/4705—Regulators; Modulating activity stimulating, promoting or activating activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/71—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for growth factors; for growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/06—Linear peptides containing only normal peptide links having 5 to 11 amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57407—Specifically defined cancers
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57484—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites
    • G01N33/57488—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites involving compounds identifable in body fluids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G01N2333/71—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants for growth factors; for growth regulators
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/82—Translation products from oncogenes
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
    • Y10S530/806—Antigenic peptides or proteins
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
    • Y10S530/827—Proteins from mammals or birds
    • Y10S530/828—Cancer

Abstract

Jsou popsány farmaceutické kompozice pro imunizaci teplokrevných zvírat, jejich pouzití a pouzití polypeptidu, molekuly nukleové kyseliny, jejich pouzití, virové vektory a jejich pouzití. Slouceniny i kompozice vyvolávají nebo posilují imunitní reaktivity na HER-2/neu protein a mohou být pouzity pro prevenci nebo lécbu malignit, se kterými je HER-2/neu onkogen asociován.

Description

Farmaceutická kompozice, molekula nukleové kyseliny, virový vektor a jejich použití a použití polypeptidu
Oblast techniky
Předkládaný vynález je zaměřen na farmaceutické kompozice pro imunizaci teplokrevných zvířat, jejich použití a použití polypeptidu, na molekulu nukleové kyseliny, její použití a na virový vektor a jeho použití.
Dosavadní stav techniky
Nehledě k enormním investicím finančních a lidských zdrojů zůstávají nádory hlavní příčinou úmrtí. Například, nádory jsou vedoucí příčinou úmrtí žen ve věku od 35 do 74 let. Rakovina prsu je nejčastější malignitou u žen a incidence vzniku karcinomu prsu vzrůstá. U jedné z devíti žen bude diagnostikováno onemocnění. Standardní přístupy pro léčbu rakoviny prsu jsou zaměřeny na kombinaci chirurgie, radioterapie a chemoterapie. Tyto přístupy vedly k určitým dramatickým úspěchům u jistých malignit. Nicméně, tyto přístupy nebyly úspěšné pro všechny malignity a rakovina prsu je nejčastěji nevyléčitelná, pokud jsou pokusy o léčení za jistým stadiem onemocnění. Alternativní přístupy pro prevenci a terapii jsou nezbytné.
Společnou charakteristickou vlastností malignit je nekontrolovatelný buněčný růst. Zdá se, že nádorové buňky podléhají procesu transformace z normálního fenotypu na maligní fenotyp schopný autonomního růstu. Amplifikace a nadměrná exprese somatických buněčných genů je považována za společnou primární událost, která vede k transformaci normálních buněk na maligní buňky. Maligní fenotypové charakteristiky kódované onkogenními geny jsou přeneseny během buněčného dělení na potomstvo transformovaných buněk.
Probíhající výzkum onkogenů identifikoval nejméně čtyřicet onkogenů operativních v maligních buňkách a odpovědných za, nebo asociovaných s, transformaci. Onkogeny byly klasifikovány do různých skupin na základě jejich putativní funkce nebo umístění jejich genových produktů (jako je protein exprimovaný onkogenem).
O onkogenech se soudí, že jsou zásadní pro jisté aspekty normální buněčné fyziologie. V tomto ohledu je HER-2/neu onkogen členem tyrosin proteinkinázové rodiny a vykazuje vysoký stupeň homologie s receptorem pro epidermální růstový faktor. HER-2/neu pravděpodobně hraje roli v buněčném růstu a/nebo diferenciaci. HER-2/neu pravděpodobně indukuje malignity kvantitativním mechanismem, který je následkem zvýšené nebo deregulované exprese v podstatě normálního genového produktu.
HER-2/neu (pl 85) je proteinový produkt HER-2/neu onkogenů. HER-2/neu gen je amplifikován a HER-2/neu protein je nadměrně exprimován u mnoha nádorů včetně nádorů prsu, vaječníku, tlustého střeva, plic a prostaty. HER-2/neu je ve vztahu k maligní transformaci. Je nacházen v 50 - 60 % duktálních karcinomů in šitu a 20 - 40 % všech nádorů prsu, stejně jako v podstatné frakci adenokarcinomů, vycházejících z vaječníků, prostaty, tlustého střeva a plic. HER-2/neu je těsně asociován nejen s maligním fenotypem, ale také s agresivitou malignity, nacházející se v jedné čtvrtině všech invazivních karcinomů prsu. HER-2/neu nadměrná exprese koreluje se špatnou prognózou jak karcinomu prsu, tak karcinomu vaječníků. HER-2/neu je transmembránový protein s relativní molekulovou hmotností 185 000, který má délku asi 1255 aminokyselin (aa). Má extracelulámí vazebnou doménu (ECD) o asi 645 aa, se 40 % homologií s receptorem pro epidermální růstový faktor (EGRF), vysoce hydrofobní transmembránovou kotvicí doménu (TMD) a karboxyterminální cytoplazmatickou doménu (CD) o asi 580 aa s 80 % homologií k EGRF.
Vzhledem k obtížím v nynějších přístupech k terapii rakoviny, se kterou je asociován HER-2/neu onkogen, v oboru existuje potřeba zlepšených sloučenin a kompozic. Tento vynález naplňuje tuto potřebu a dále poskytuje jiné příbuzné výhody.
Podstata vynálezu
Předmětem tohoto vynálezu je farmaceutická kompozice pro imunizaci teplokrevných zvířat proti malignitám, se kterými je asociován HER- 2/neu onkogen, jejíž podstata spočívá v tom, že obsahuje farmaceuticky přijatelný nosič nebo ředidlo v kombinaci s polypeptidem kódovaným DNA sekvencí vybranou z
a) nukleotidů 2 026 až 3765 SEQ ED NO: 1 a
b) DNA sekvencí, které hybridizují na nukleotidovou sekvenci komplementární k nukleotidům 2026 až 3765 SEQ ID NO: 1 za středně přísných podmínek, kde DNA sekvence kóduje polypeptid, který produkuje imunitní odpověď na HER-2/neu protein, přičemž hybridizační podmínky zahrnují předpromytí v roztoku 5 x SSC, 0,5 % SDS, 1,0 mM EDTA, pH 8,0, hybridizaci při 50 až 65 °C, 5 x SSC, přes noc a potom následuje dvojnásobné promytí při 65 °C po 20 minut každým z 2 x, 0,5 x a 0,2 x SSC s obsahem 0,1 % SDS, nebo s molekulou nukleové kyseliny nebo virovým vektorem řídicím expresi výše uvedeného polypeptidů kódovaného DNA sekvencí vybranou ze sekvencí podle bodu a) a b).
Předmětem vynálezu je také použití polypeptidů definovaného výše pro výrobu léčiva pro imunizaci teplokrevných zvířat proti malignitám, se kterými je HER-2/neu onkogen asociován.
Dále předmětem tohoto vynálezu je molekula nukleové kyseliny řídicí expresi polypeptidů kódovaného DNA sekvencí, která je vybrána z
a) nukleotidů 2 026 až 3 765 SEQ ID-NO: 1 a
b) DNA sekvencí, které hybridizují na nukleotidovou sekvenci komplementární k nukleotidům 2026 až 3765 SEQ ID NO: 1 za středně přísných podmínek, kde DNA sekvence kóduje polypeptid, který produkuje imunitní odpověď na HER-2/neu protein, přičemž hybridizační podmínky zahrnují předpromytí v roztoku 5 x SSC, 0,5 % SDS, 1,0 mM EDTA, pH 8,0, hybridizaci při 50 až 65 °C, 5 x SSC, přes noc a potom následuje dvojnásobné promytí při 65 °C po 20 minut každým z 2 x, 0,5 x a 0,2 x SSC s obsahem 0,1 % SDS, pro imunizaci buněk teplokrevných zvířat transfekcí.
Předmětem tohoto vynálezu je také použití molekuly nukleové kyseliny definované výše pro výrobu léčiva pro imunizaci teplokrevných zvířat proti malignitám, se kterými je asociován HER-2/neu onkogen.
Dále předmětem tohoto vynálezu je virový vektor řídicí expresi polypeptidů kódovaného DNA sekvencí vybranou z
a) nukleotidů 2 026 až 3 765 SEQ ID NO: 1 a
b) DNA sekvencí, které hybridizují na nukleotidovou sekvenci komplementární k nukleotidům 2026 až 3765 SEQ ID NO: 1 za středně přísných podmínek, kde DNA sekvence kóduje polypeptid, který produkuje imunitní odpověď na HER-2/neu protein,
- 2 CZ 296617 B6 přičemž hybridizační podmínky zahrnují předpromytí v roztoku 5 x SSC, 0,5 % SDS, 1,0 mM
EDTA, pH 8,0, hybridizaci při 50 až 65 °C, 5 x SSC, přes noc a potom následuje dvojnásobné promytí při 65 °C po 20 minut každým z 2 x, 0,5 x a 0,2 x SSC s obsahem 0,1 % SDS, pro imunizaci buněk teplokrevných živočichů infikováním.
Předmětem tohoto vynálezu je také použití virového vektoru definovaného výše pro výrobu léčiva pro imunizaci teplokrevných zvířat proti malignitám, se kterými je HER-2/neu onkogen asociován.
Výhodným provedením vynálezu je výše uvedená kompozice, kde polypeptid má aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 2 od lysinu, aminokyseliny 676, až do valinu, aminokyseliny 1255.
Výhodným provedením vynálezu je výše uvedená molekula nukleové kyseliny, kde polypeptid má aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 2 od lysinu, aminokyseliny 676, až do valinu, aminokyseliny 1255.
Výhodným provedením vynálezu je výše uvedený virový vektor, kde polypeptid má aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 2 od lysinu, aminokyseliny 676, až do valinu, aminokyseliny 1255.
Jiným výhodným provedením vynálezu je výše uvedená kompozice, kde polypeptid je vázán na druhý polypeptid nebo peptid mající imunogenní vlastnosti. V kompozici účelně první polypeptid je zkrácen a produkuje imunitní odpověď na HER-2/neu protein, výhodně polypeptid je vázán na peptid nebo polypeptid mající imunogenní vlastnosti. S výhodou kompozice obsahuje adjuvans.
Výhodným provedením vynálezu je použití výše uvedené kompozice pro výrobu léčiva pro imunizaci teplokrevných zvířat proti malignitám, se kterým je HER-2/neu onkogen asociován.
Tyto a jiné aspekty předkládaného vynálezu se stanou zřejmými s ohledem na následující podrobný popis a připojené obrázky.
Stručně řečeno, předkládaný vynález poskytuje polypeptidy, molekuly nukleových kyselin (řídicí expresi takových polypeptidů) a virové vektory (řídicí expresi takových polypeptidů) pro použití pro imunizaci nebo pro výrobu léčiv pro imunizaci, teplokrevných zvířat vůči malignitám, se kterými je HER-2/neu onkogen asociován. Polypeptid nebo molekula nukleové kyseliny podle předkládaného vynálezu může být přítomna v kompozici, která obsahuje farmaceuticky akceptovatelný nosič nebo ředidlo. Takový polypeptid, molekula nukleové kyseliny, virový vektor nebo farmaceutická kompozice mohou být použity pro imunizaci jednorázovou (např. pokud je předpokládána malignita) nebo opakovanou (např. u jednotlivců se zvýšeným rizikem vzniku nebo nového vzniku malignity). Léčiva pro imunizaci mohou být užitečná v léčbě existujících tumorů nebo pro ochranu před výskytem tumorů nebo jejich opětovným výskytem.
V jednom provedení předkládaný vynález poskytuje polypeptid kódovaný DNA sekvencí vybranou z: a) nukleotidů 2026 až 3765 SEQ ID NO: 1, a b) DNA sekvencí, které hybridizují s nukleotidovou sekvencí komplementární k nukleotidům 2 026 až 3 765 SEQ ID NO: 1 za středně přísných podmínek, kde DNA sekvence kóduje polypeptid, který produkuje imunitní reakci na HER-2/neu protein. V preferovaném provedení má polypeptid aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 2 od lysinu, aminokyseliny 676, do valinu, aminokyseliny 1255, nebo jeho varianta, která produkuje alespoň stejnou imunitní odpověď. Je poskytnuta kompozice, která obsahuje polypeptid podle předkládaného vynálezu v kombinaci s farmaceuticky akceptovatelným nosičem nebo ředidlem.
V jiném provedení je polypeptid nebo kompozice podle předkládaného vynálezu poskytnuta pro imunizaci teplokrevných zvířat proti malignitám, se kterými je HER-2/neu onkogen asociován.
- 3 CZ 296617 B6
V jiném provedení je takový polypeptid nebo kompozice použit pro výrobu léčiva pro imunizaci teplokrevných zvířat proti malignitám, se kterými je HER-2/neu onkogen asociován.
V jiném provedení je poskytnuta molekula nukleové kyseliny řídicí expresi polypeptidu podle předkládaného vynálezu pro imunizaci transfekcí buněk teplokrevných zvířat molekulou nukleové kyseliny. V jiném provedení je taková molekula nukleové kyseliny použita pro výrobu léčiva pro imunizaci teplokrevných zvířat proti malignitám, se kterými je HER-2/neu onkogen asociován.
V jiném provedení je poskytnut virový vektor řídicí expresi polypeptidu podle předkládaného vynálezu pro imunizaci infekcí buněk teplokrevných zvířat vektorem. V jiném provedení je takový virový vektor použit pro výrobu léčiva pro imunizaci teplokrevných zvířat proti malignitám, se kterými je HER-2/neu onkogen asociován.
Popis obrázků na připojených výkresech
Obrázek 1 ukazuje výsledky zaměření nativních T lymfocytů na HER-2/neu polypeptid prostřednictvím dendritických buněk. Z kostní dřeně odvozené DC byly generovány GM-CSF a IL6 z CD34+ kmenových buněk. DC pulzované HER-2/neu polypeptidem indukovaly protein specifickou proliferaci autologních CD4+/CD4SRA+ T lymfocytů po 7 dnech kultivace T buněk s DC. Z kostní dřeně odvozené CD34+ kmenové buňky, kultivované po dobu jednoho týdne v séra prostém médiu, obsahujícím GM-CSF a IL-6, byly použity jako APC. APC byly umístěny na 96 jamkovou plotnu s plochým dnem (Corning, Coming, NY, USA) v různým koncentracích a byly inkubovány po 16 až 18 hodin s 20 až 25 pg/ml rekombinantního HER-2/neu polypeptidu. CD4+ T lymfocyty byly izolovány z mononukleárních buněk autologní periferní krve pozitivní selekcí za použití imunoafínitních kolon (CellPro lne., Bothell, WA, USA). Antigenem pulzované APC buňky byly ozářeny (10 Gy) a byly přidány CD4+ T lymfocyty v množství 105 na jamku. Proliferativní odpověď T buněk byla měřena vychytáváním (3H) thymidinu (1 pCi/jamku) přidaného v den 7 na 16 - 18 hodin. Proliferační testy byly provedeny v médium prostém séra a cytokinů opakovaně v 5 jamkách. Symboly reprezentují: · - - DC + HER-2/neu polypeptid + CD4+/CD45RA+ T buňky; “ODC + CD4+/CD45RA+ T buňky; a DC + HER2/neu polypeptid.
Obrázek 2 reprezentuje odpověď CD4+ buněk na HER-2/neu polypeptid. Za použití priming testu popsaného pro obrázek 1 byly CD4+ T buňky od normálních dárců testovány na odpověď na rekombinantní lidský HER-2/neu polypeptid. Symboly reprezentují: SC + CD4; a ’ ' '+· · · SC + CD4 + HER-2/neu polypeptid. SC je kmenová buňka.
Obrázek 3 ukazuje, že u krys imunizovaných krysím HER-2/neu polypeptidem se vyvíjí krysí neu specifické protilátky. Krysy byly imunizované rekombinantním krysím HER-2/neu polypeptidem 25 pg v MPL nebo vakcinačním adjuvans. Byly podány tři imunizace, každá 20 dní od sebe. Dvacet dní po poslední imunizaci byly krysy hodnoceny na proti látkovou odpověď proti krysímu neu. Zvířata imunizovaná HER-2/neu polypeptidem a vakcinačním adjuvans vykazovala vysoký titr krysí neu specifických odpovědí. Kontrola byla zvířata imunizovaná lidským HER-2/neu polypeptidem (cizorodým proteinem). V oddělených pokusech se u krys imunizovaných 100 pg a 300 pg purifikováného kompletního krysího neu nevyvinuly detekovatelné neu specifické protilátky (data nejsou ukázána). Data reprezentují průměr a standardní odchylku od tri zvířat. Symboly reprezentují: ® krysí HER-2/neu polypeptid/MPL · -W· krysí
HER-2/neu polypeptid/vakcinační; -El·- MPL sám; vakcinační sám; a ¢-kontrola. MPL a vakcinační jsou adjuvans (Ribi, Bozeman, MT, USA), neu je zde
HER-2/neu protein.
- 4 CZ 296617 B6
Obrázek 4 ukazuje, že pacienti s rakovinou prsu mají preexistující imunitu k HER-2/neu polypeptidů. PBMC od pacienta byly hodnoceny inkorporací triciovaného thymidinu ve 24 jamkových plotnách. Jako odpovídající jamky jsou počítány ty, které mají o více než tři standardní odchylky vyšší hodnoty než kontrolní jamky. HER-2/neu pozitivní pacienti s rakovinou prsu stadia II měli signifikantní odpověď na rekombinantní lidský HER-2/neu polypeptid. Symboly p reprezentují peptidy pro HER-2/neu protein, tt reprezentují tetanický toxoid a hHNP reprezentuje rekombinantní lidský HER-2/neu polypeptid.
Před popisem vynálezu může být užitečné pro jeho pochopení vymezení jistých termínů, které jsou zde použity.
HER-2/neu polypeptid - jak je zde použito označuje část HER-2/neu proteinu (protein je také známý jako pl 85 nebo c-erbB2) mající aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 2 od lysinu, aminokyseliny 676, do valinu, aminokyseliny 1255; a může být přirozený, synteticky produkovaný, produkovaný genetickým inženýrstvím, nebo jeho funkčně ekvivalentní varianta, ve které je např. jedna nebo více aminokyselin nahrazeno jinými aminokyselinami nebo neaminokyselinami, které v podstatě neovlivňují vyvolání nebo posílení imunitní odpovědi na HER-2/neu protein (např. varianta stimuluje odpověď pomocných T buněk nebo cytotoxických T buněk).
Proliferace T buněk - jak je zde použito zahrnuje množení T buněk stejně jako stimulaci T buněk, která vede ke zmnožení, tj. iniciaci událostí vedoucích k mitóze a mitózu samotnou. Metody pro detekci proliferace T buněk jsou uvedeny dále.
Jak je uvedeno výše, předkládaný vynález je zaměřen na sloučeniny a kompozice pro vyvolání nebo posílení imunity k proteinovému produktu exprimovanému HER-2/neu onkogenů, včetně malignit u teplokrevných zvířat, u kterých je amplifikovaný HER-2/neu gen asociován s malignitami. Asociace amplifikovaného HER-2/neu genu s malignitami nevyžaduje, aby proteinový produkt exprese genu byl přítomen v tumoru. Například, nadměrná exprese proteinového expresního produktu může být zahrnuta v iniciaci tumoru, ale proteinová exprese může být následně ztracena. Použitím předkládaného vynálezu je vyvolání nebo posílení účinné autochtonní imunitní odpovědi pro konvertování HER-2/neu pozitivního tumoru na HER-2/neu negativní.
Přesněji, objev předkládaného vynálezu, v jednom aspektu, ukazuje, že polypeptid založený na určité části (HER-2/neu polypeptid) proteinového expresního produktu HER-2/neu genu může být rozpoznán na thymu závislými lymfocyty (zde T buňky) a proto může být autochtonní imunitní T buněčná odpověď využita proíylakticky nebo pro léčbu malignit, u kterých je takový protein nadměrně exprimován. Objev předkládaného vynálezu také ukazuje, v jiném aspektu, že molekuly nukleové kyseliny řídicí expresi takového peptidu mohou být použity samostatně nebo ve virovém vektoru pro imunizaci.
Obecně, o CD4+ T buňkách se soudí, že účinkují jako helper/inducery prostřednictvím uvolnění lymfokinů, pokud jsou stimulovány specifickým antigenem; nicméně, subpopulace CD4+ buněk může účinkovat jako cytotoxické T lymfocyty (CTL). Obdobně, o CD8+ T buňkách se soudí, že účinkují přímo lysou antigenních cílů; nicméně, za různých okolností mohou secernovat lymfokiny za poskytnutí helper nebo DTH funkce. Navzdory potenciálně se překrývající funkci jsou fenotypové CD4 a CD8 markéry vázány na rozpoznání peptidu vázaných na třídu II nebo na třídu I MHC antigenů. Rozpoznání antigenu v kontextu třídy II nebo třídy I MHC umožňuje CD4+ a CD8+ buňkám odpovídat na různé antigeny nebo na stejný antigen prezentovaný za různých okolností. Vazba imunogenních peptidů na třídu II MHC antigenů se nejčastěji vyskytuje u antigenů trávených antigen prezentujícími buňkami. Proto CD4+ T buňky obyčejně rozpoznávají antigeny, které byly externě od nádorové buňky. Oproti tomu, za normálních okolností, se vazba peptidů na třídu I MHC vyskytuje pouze u proteinů přítomných v cytosolu a syntetizovaných samotným cílem, proteiny v zevním prostředí jsou vyloučeny. Výjimkou z tohoto je vazba exogeních peptidů s přesným třída I vazebným motivem, které jsou přítomny mimo buňku ve
- 5 CZ 296617 B6 vysoké koncentraci. Tak CD4+ a CD8+ T buňky mají významně odlišné funkce a mají tendenci rozpoznávat různé antigeny s ohledem na to, kde jsou antigeny normálně umístěny.
Jak je popsáno v předkládaném vynálezu, polypeptidová část proteinového produktu exprimovaného HER-2/neu onkogenem je rozpoznávána T buňkami. Cirkulující HER-2/neu polypeptid je degradován na peptidové fragmenty. Peptidové fragmenty z polypeptidů se vážou na antigeny hlavního histokompatibilního komplexu (MHC). Předložením peptidu navázaného na MHC antigen na povrchu buňky a rozpoznáním kombinace peptidu plus vlastního MHC antigenů T buňkami hostitele se stane HER-2/neu polypeptid (včetně toho, který je exprimován maligními buňkami) imunogenním pro T buňky. Vynikající specifíta receptoru T buněk umožňuje jednotlivým T buňkám rozlišit peptidy, které se liší jedním aminokyselinovým zbytkem.
V průběhu imunitní odpovědi na peptidový fragment z polypeptidů se budou T buňky exprimující T buněčný receptor s vysokou vazebnou afinitou ke komplexu MHC- peptid vázat na komplex MHC - peptid a tak se stanou aktivovanými a indukuje se u nich proliferace. Při prvním setkání s peptidem bude malý počet imunitních T buněk secernovat lymfokiny, proliferovat a diferencovat na efektorové a paměťové T buňky. Primární imunitní odpověď proběhne in vivo, ale bude obtížné ji detekovat in vitro. Další setkání paměťových buněk se stejným antigenem povede k rychlejší a silnější imunitní odpovědi. Sekundární odpověď se vyskytne jak in vivo, tak in vitro. In vitro odpověď je snadno změřena měřením stupně proliferace, stupně produkce cytokinů nebo generování cytolytické aktivity populace T buněk re-exponovaných antigenů. Významná proliferace populace T buněk v odpovědi na určitý antigen je považována za ukazatel předešlé expozice nebo vystavení antigenů.
Sloučeniny podle předkládaného vynálezu obecně obsahují HER-2/neu polypeptidy nebo DNA molekuly, které řídí expresi takových peptidů, kde DNA molekuly mohou být přítomny ve virovém vektoru. Jak bylo uvedeno výše, polypeptidy podle předkládaného vynálezu zahrnují varianty polypeptidů SEQ ID NO: 2 od aminokyseliny 676 do aminokyseliny 1255, které si uchovávají schopnost stimulovat imunitní odpověď. Takové varianty obsahují různé strukturální formy nativního polypeptidů. Díky přítomnosti ionizovatelných amino a karboxylových skupin, například, může být HER-2/neu polypeptid ve formě soli kyseliny nebo zásady, nebo může být v neutrální formě. Jednotlivá aminokyselinová rezidua mohou také být modifikována oxidací nebo redukcí.
Varianty v rozsahu předkládaného vynálezu také zahrnují polypeptidy, ve kterých je primární aminokyselinová struktura nativního HER-2/neu polypeptidů modifikována vytvořením kovalentních nebo agregativních konjugátů s jinými peptidy nebo polypeptidy, nebo chemickými skupinami jako je glykosylová skupina, lipidy, fosfáty, acetyl skupiny a podobně. Kovalentní deriváty mohou být připraveny, například, navázáním určitých funkčních skupin na postranní aminokyselinové řetězce nebo na N-nebo C- konec.
Předkládaný vynález také obsahuje HER-2/neu polypeptidy s nebo bez glykosylace. Polypeptidy exprimované v kvasinkových nebo savčích expresních systémech mohou být podobné nebo mírně odlišné v molekulové hmotnosti a v glykosylaci od nativních molekul, v závislosti na expresním systému. Například, exprese DNA kódující polypeptidy v bakterii jako je E. coli typicky poskytuje neglykosylované molekuly. N-glykosylační místa eukaryotních proteinů jsou charakterizována tripletem aminokyselin Asn-Α,-Ζ, kde A] je jakákoliv aminokyselina s výjimkou Pro, a Z je Ser nebo Thr. Varianty HER-2/neu polypeptidů, které mají inaktivovaná N-glykosylační místa, mohou být produkovány technikami, které jsou odborníkům známé, jako je syntéza oligonukleotidů a ligace nebo technika místně specifické mutageneze, a jsou v rozsahu předkládaného vynálezu. Alternativně, N-vázaná glykosylační místa mohou být přidána k HER2/neu polypeptidů.
Polypeptidy podle předkládaného vynálezu také zahrnují varianty polypeptidů SEQ ID NO: 2 (tj. varianty polypeptidů majícího aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 2 od aminokyseliny
- 6 CZ 296617 B6
676 do aminokyseliny 1255), které mají aminokyselinovou sekvenci, která se liší od této sekvence v jedné nebo více delecích, inzercích, substitucích nebo jiných modifikacích. V jednom provedení jsou takové varianty v podstatě homologní k nativnímu HER-2/neu polypeptidu a uchovávají si schopnost stimulovat imunitní odpověď. V podstatě homologní jak je zde použito, označuje sekvenci aminokyselin, která může být kódována DNA sekvencemi, které jsou schopné hybridizace za středně přísných podmínek se sekvencí nukleotidů, která je komplementární k přirozeně se vyskytující DNA sekvenci, kódující specifickou část polypeptidu SEQ ID NO: 2 (tj. nukleotidy 2026 až 3765 SEQ ID NO: 1). Vhodné středně přísné podmínky zahrnují předpromytí v roztoku 5 x SSC, 0,5 % SDS, 1,0 mM EDTA (pH 8,0); hybridizaci při 50 °C-65 °C, 5 x SSC, přes noc; a potom následuje dvojnásobné promytí při 65 °C po 20 minut každým z 2 x, 0,5 x a 0,2 x SSC (obsahujícím 0,1 % SDS). Takové hybridi zující DNA sekvence jsou také v rozsahu tohoto vynálezu, účinek jakýchkoliv takových modifikací na schopnost HER-2/neu polypeptidu produkovat imunitní odpověď musí být možné snadno určit (např. analyzováním schopnosti imitovaného HER-2/neu polypeptidu indukovat odpověď T buněk za použití metod zde popsaných, například).
Obecně, aminokyselinové substituce mohou být provedeny množstvím způsobu pro poskytnutí jiných provedení předkládaného vynálezu. Za prvé, například, aminokyselinové substituce mohou být provedeny konzervativně, tj. substituovaná aminokyselina je nahrazena aminokyselinou, která má podobné vlastnosti, takže odborník v oboru peptidové chemie bude očekávat, že sekundární struktura a hydropatické vlastnosti polypeptidů zůstanou bez podstatných změn. Obecně, následující skupiny polypeptidů reprezentují konzervativní změny: 1) ala, pro, gly, glu, asp, gin, asn, ser, thr; 2) cys, ser, tyr, thr; 3) val, ile, leu, met, ala, phe; 4) lys, arg, his; 4) lys, arg, his; a 5) phe, tyr, trp, his. Příkladem nekonzervativní změny je nahrazení aminokyseliny z jedné skupiny aminokyselinou z jiné skupiny.
Jiným způsobem pro vytvoření aminokyselinových substitucí pro produkování variant podle předkládaného vynálezu je identifikace a nahrazení aminokyselin v motivech T buněk s potenciálem vazby třídy II MHC molekul (pro CD4+ T buněčnou odpověď) nebo třídy I MHC molekul (pro CD8+ T buněčnou odpověď). Peptidové segmenty (HER-2/neu polypeptidu) s motivem s teoretickým potenciálem pro vazbu třídy II MHC molekul mohou být identifikovány počítačovou analýzou. Například, program pro analýzu proteinové sekvence, T Sites, který obsahuje několik počítačových algoritmů pro odlišení potenciálních míst pro rozpoznání T buněk, může být použit (Feller and de la Cruz, Nátuře, 349: 720 - 721, 1991). Jsou použity dva vyhledávací algoritmy: 1) AMPHI algoritmus popsaný Margalitem (Feller and de la Cruz, Nátuře, 349: 720 721, 1991; Margalit et al., J. Immunol., 138: 2213 - 2229, 1987) identifikuje epitopové motivy podle alfa helikální periodicity a amfipaticity; 2) Rothbardův a Taylorův algoritmus, který identifikuje epitopové motivy podle náboje a polarity (Rothbard and Taylor, EMBO, 7: 93 - 100, 1988). Segmenty s oběma motivy jsou nejvhodnější pro vazbu na třídu II MHC molekul. Falk et al., určil, že vazba peptidů na jednotlivé MHC molekuly vykazuje rozpoznatelné sekvenční motivy (Falk et al., Nátuře, 351: 290 -296, 1991). Peptidový motiv pro vazbu v zářezu HLAA2.1 byl definován Edmanem degradací peptidů získaných z HLA-A2.1 molekul kultivované buněčné linie (Tabulka 2, od Falk et al., výše). Metoda identifikovala typické nebo průměrné na HLA-A2.1 se vázající peptidy v délce 9 aminokyselin s dominantními kotvícími zbytky v pozicích 2 (L) a 9 (V). Běžně se vyskytující silně se vázající zbytky byly identifikovány v pozicích 2 (M), 4 (E,K), 6 (V), a 8 (K). Identifikovaný motiv reprezentuje průměr mnoha vazebných peptidů.
- 7 CZ 296617 B6
HLA-A2.1 restrikční motiv
1 2 Aminokyselinová pozice 3 4 5 6 7 Bodové značení 8 9
Dominantní vazebný kotvicí zbytek L V +3
Silně se vázající zbytek M Ε V K K +2
Slabě se vázající I A G I I A E
zbytek L Y P K L Y S
F F D Y T H
K P T N
M M G
Y S V
H
Odvozený peptidový motiv jak je nyní definován není přísný. Některé HLA-A2.1 neobsahují oba dominantní kotevní zbytky a aminokyseliny sousedící s dominantními kotevními zbytky hrají hlavní roli v umožnění nebo neumožnění vazby. Ne všechny peptidy s nyní popsaným motivem se budou vázat a některé peptidy bez motivu se budou vázat. Nicméně, tento motiv je dostatečně hodnotný pro umožnění identifikace některých peptidů schopných vazby. Tento HLA-A2.1 motiv umísťuje 6 aminokyselin mezi dominantní kotevní aminokyseliny na zbytku 2 a 9.
Po identifikaci peptidových motivů v HER-2/neu polypeptidu může být aminokyselinová substituce provedena konzervativně nebo nekonzervativně. Druhý typ substituce je zamýšlen pro produkci polypeptidu, který je silnější a/nebo více zkříženě reaktivní (MHC polymorfismus). Příkladem silnějšího polypeptidu je ten, který se váže na stejnou MHC molekulu s vyšší afinitou, než nativní polypeptid, bez ovlivnění rozpoznání T buňkami specifickými pro přirozený polypeptid. Příkladem polypeptidu s širší zkříženou reaktivitou je ten, který indukuje šířeji zkříženě reaktivní imunitní odpovědi (tj. váže se na větší rozsah MHC molekul), než přirozený polypeptid. Podobně, jedna nebo více aminokyselin umístěných mezi peptidové motivy a majících prostorovou funkci (např. neinteragujících s MHC molekulou nebo receptorem T buněk) může být substituována konzervativně nebo nekonzervativně. Odborníkům bude jasné, že polypeptidy obsahující jednu nebo více aminokyselinových substitucí mohou být testovány na výhodné nebo nevýhodné imunologické interakce množstvím testů, včetně těch, které jsou zde popsány pro schopnost stimulovat rozpoznávání T buňkami.
Varianty v rozsahu předkládaného vynálezu mohou také, nebo alternativně, obsahovat jiné modifikace, včetně delecí nebo adicí aminokyselin, které mají minimální vliv na požadované imunologické vlastnosti polypeptidu. Odborníci ocení, že zkrácené formy nebo nepřirozeně rozsáhlé formy HER-2/neu polypeptidu mohou být použity, s tím, že poskytnuté imunologické vlastnosti jsou zhruba ekvivalentní jako u kompletního, nativního HER-2/neu polypeptidu. Cysteinové zbytky mohou být deletovány nebo nahrazeny jinými aminokyselinami pro zabránění tvorby nesprávných intramolekulárních disulfidových můstků při renaturaci. Jiné přístupy mutageneze vyžadují modifikaci sousedních dibazických aminokyselinových zbytků pro zvýšení exprese v kvasinkových systémech, ve kterých je přítomna aktivita KEX2 proteázy.
HER-2/neu polypeptid může být obecně získán za použití genomového nebo cDNA klonu kódujícího protein. Genomová sekvence, která kóduje kompletní HER-2/neu je ukázána v SEQ
ID NO: 1 a odvozená aminokyselinová sekvence je presentována v SEQ ID NO: 2. Takové klony mohou být izolovány vyšetřením vhodné expresní knihovny na klony, které exprimují HER2/neu protein. Příprava knihovny a vyšetření může být obecně provedeno za použití metod odborníkům v oboru známých, jako jsou metody popsané v Sambrook et al., Molecular Cloning:
A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, N. Y., 1989, což je
- 8 CZ 296617 B6 zde uvedeno jako odkaz. Stručně, bakteriofágová expresní knihovna může být umístěna a přenesena na filtry. Filtry mohou být potom inkubovány s detekčním reagens. V kontextu tohoto vynálezu je detekčním reagens jakákoliv sloučenina schopná vazby na HER-2/neu protein, která může být potom detekována množstvím prostředků, které jsou odborníkům známy. Typická detekční reagens obsahují vazebné agens, jako je Protein A, Protein G, IgG nebo lektin, navázané na reportérovou skupinu. Preferované reportérové skupiny obsahují enzymy, substráty, kofaktory, inhibitory, barviva, radionuklidy, luminiscentní skupiny, fluorescentní skupiny a biotin. Výhodněji, reportérovou skupinou je křenová peroxidáza, která může být detekována inkubací se substrátem jako je tetramethylbenzidin nebo 2,2'-azino-di-3-ethylbenz-thiazolin sulfonová kyselina. Plaky, které obsahují genomové nebo cDNA sekvence, které exprimují HER-2/neu protein, jsou izolovány a purifikovány technikami, které jsou odborníkům známé. Vhodné metody mohou být nalezeny, například, v Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor. N. Y., 1989.
Varianty polypeptidu, které si uchovávají schopnost stimulovat imunitní odpověď, mohou obecně být identifikovány modifikováním sekvence v jednom nebo ve více aspektech popsaných výše a testováním vzniklého polypeptidu na schopnost stimulovat imunitní odpověď, např. odpověď T buněk. Například, takové testy mohou být obecně provedeny kontaktováním T buněk s modifikovaným polypeptidem a testováním odpovědi. Přirozeně se vyskytující varianty polypeptidu mohou také být izolovány, například, vyšetřením vhodné cDNA nebo genomové knihovny s DNA sekvencí kódující polypeptid nebo jeho variantu.
Výše popsané modifikace sekvence mohou být zavedeny za použití standardních rekombinačních technik nebo automatizovanou syntézou modifikovaného polypeptidu. Například, mutace mohou být zavedeny do určitého místa syntetizováním oligonukleotidů obsahujících mutantní sekvenci, obklopenou restrikčními místy umožňujícími ligaci na fragmenty nativní sekvence. Po ligaci kóduje vzniklá rekonstruovaná sekvence analog mající požadovanou aminokyselinovou inzerci, substituci nebo deleci.
Alternativně, postupy na oligonukleotidy zaměřené místně specifické mutageneze mohou být použity pro poskytnutí genu, ve kterém jsou určité kodony alterovány požadovanou substitucí, deleci nebo inzercí. Příklady metod pro výrobu alterací uvedených výše jsou popsány ve Walder et al., Gene 42: 133, 1986; Bauer et al., Gene 37: 73, 1985; Craik, BioTechniques, Leden 1985, 12 - 19; Smith et al., Genetics Engineering: Principles and Methods, Plenům Press, 1981; a US patenty č. 4 518 584 a 4 737 462.
Mutace v nukleotidové sekvenci konstruované pro expresi takových HER-2/neu polypeptidu musí, samozřejmě, zachovávat čtecí rámeček kódujících sekvencí a preferovaně nevytvářet komplementární regiony, které by mohly hybridizovat za produkce sekundárních mRNA struktur, jako jsou smyčky a vlásenky, které mohou nežádoucím způsobem ovlivňovat translaci mRNA. Ačkoliv místo mutace může být předem určeno, není nezbytné, aby charakter mutace per se byl předem určen. Například, pro vybrání optimálních charakteristik mutantů v daném místě může být provedena náhodná mutageneze v cílovém kodonu a exprimovaný HER-2/neu polypeptid může být vyšetřován na požadovanou aktivitu.
Ne všechny mutace v nukleotidové sekvenci, která kóduje HER-2/neu polypeptid, budou exprimovaný v konečném produktu. Například, substituce nukleotidů mohou být provedeny pro posílení exprese, především pro vyloučení smyček sekundární struktury v transkribované mRNA (viz. např. Evropskou patentovou přihlášku EP 75 444 A), nebo pro poskytnutí kodonu, které jsou snadněji translatovány selektovaným hostitelem, jako jsou dobře známé E. coli preferenční kodony pro expresi v E. coli.
Polypeptidy podle předkládaného vynálezu, jak přirozeně se vyskytující, tak modifikované, jsou preferovaně produkovány rekombinantními DNA metodami. Takové metody zahrnují inzerci
DNA sekvence kódující HER-2/neu polypeptid do rekombinantního expresního vektoru a
- 9 CZ 296617 B6 expresi DNA sekvence v rekombinantním mikrobiálním, savčím nebo hmyzím buněčném expresním systému za podmínek navozujících expresi. DNA sekvence kódující polypeptidy poskytnuté tímto vynálezem mohou být sestaveny z cDNA fragmentů a krátkých oligonukleotidových linkerů, nebo ze série oligonukleotidů, za poskytnutí syntetického genu, který je schopen inzerce v rekombinantním expresním vektoru a exprese v rekombinantní transkripční jednotce.
Rekombinantní expresní vektory obsahují DNA sekvenci kódující HER-2/neu polypeptid, operativně vázanou na vhodné transkripční nebo translační regulační elementy odvozené od savčích, mikrobiálních, virových nebo hmyzích genů. Takové regulační elementy zahrnují transkripční promotor, volitelnou operátorovou sekvenci pro kontrolu transkripce, sekvenci kódující vhodná mRNA ribosomální vazebná místa a sekvence, které kontrolují ukončení transkripce a translace. Zdroj replikace a selektovatelný markér pro usnadnění rozpoznání transformantů mohou být dále inkorporovány.
DNA regiony jsou operativně vázány, pokud jsou jeden ke druhému ve funkčním vztahu. Například, DNA pro signální peptid (sekreční leader) je operativně navázán na DNA pro polypeptid pokud je exprimován jako prekurzor, který participuje na sekreci polypeptidu; promotor je operativně navázán na kódující sekvenci, pokud kontroluje transkripci sekvence; nebo ribosomové vazebné místo je operativně navázáno na kódující sekvenci, pokud je umístěno tak, že umožňuje translaci. Obecně, operativně vázaný znamená sousedící a, v případě sekrečních leaderů, ve čtecím rámečku. DNA sekvence kódující HER-2/neu polypeptid, které mají být exprimovaný v mikroorganismu, nebudou preferovaně obsahovat žádné introny, které by mohly předčasně ukončit transkripci DNA na mRNA.
Expresní vektory pro bakteriální použití mohou obsahovat selektovatelný markér a bakteriální zdroj replikace odvozené od komerčně dostupných plazmidů obsahujících genetické elementy dobře známého klonovacího vektoru pBR322 (ATCC 37017). Takové komerční vektory zahrnují, například, pKK223-3 (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Sweden) a pGEMl (Promega Biotec, Madison, WI, USA). Tyto pBR322 základní sekce jsou kombinovány s vhodným promotorem a sekvencemi, které mají být exprimovány. E. coli je typicky transformována za použití derivátů pBR322, plazmidů odvozeného od druhu E. coli (Bolivar et al., Gene, 2: 95, 1977). pBR322 obsahuje geny pro rezistenci na ampicilin a tetracyklin a tak poskytuje jednoduchý prostředek pro identifikaci transformovaných buněk.
Promotory běžně používané v rekombinantních mikrobiálních expresních vektorech zahrnují (β-laktamázový (penicilinázový) a laktózový promotorovy systém (Chang et al., Nátuře 275: 615, 1978; a Goeddel et al., Nátuře 281: 544, 1979), tryptofanový (trp) promotorovy systém (Goeddel et al., Nud. Acids Řes. 8: 4057, 1980; a Evropská patentová přihláška 36776) a tac promotor (Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, str. 412, 1982). Zejména užitečný bakteriální expresní systém využívá fág lambda PL promotor a cI857ts termolabilní represor. Plazmidové vektory dostupné od Američan Type Culture Collection, které inkorporují deriváty lambda Pl promotoru zahrnují plazmid pHUB2, umístěný v E. coli kmenu JMB9 (ATCC 37092) a pPLc28, umístěný v E. coli RR1 (ATCC 53082).
Vhodné promotorové sekvence ve kvasinkových vektorech obsahují promotory pro metallothionein, 3-fosfoglycerát kinázu (Hitzeman et al., J. Biol. Chem. 255: 2073, 1980) nebo jiné glykolytické enzymy (Hess et al., J. Adv. Enzyme Reg. 7: 149, 1968; a Holland et al., Biochem., 17: 4900, 1978), jako je enoláza, glyceraldehyd-3-fosfát dehydrogenáza, hexokináza, pyruvát dekarboxyláza, fosfofruktokináza, glukóza-6-fosfát izomeráza, -3-fosfoglycerát mutáza, pyruvát kináza, triosafosfát izomeráza, fosfoglukóza izomeráza a glukokináza. Vhodné vektory a promotory pro použití v kvasinkové expresi jsou dále popsány v R. Hitzeman et al., Evropská patentová přihláška 73657.
Preferované kvasinkové vektory mohou být sestaveny za použití DNA sekvencí z pBR322 pro selekci a replikaci v E. coli (Ampr gen a zdroj replikace) a kvasinkových DNA sekvencí
- 10 CZ 296617 B6 obsahujících glukózou represibilní ADH2 promotor a α-faktor sekreční leader. ADH12 promotor popsal Russell et al., (J. Biol. Chem. 258: 2674, 1982) a Beier et al., (Nátuře 300: 724, 1982). Kvasinkový α-faktor leader, který řídí sekreci heterologních proteinů, může být inzertován mezi promotor a strukturální gen, který má být exprimován (viz např. Kurjan etal., Cell 30: 933, 1982; a Bitter et al.. Proč. Nati. Acad. Sci. USA 81: 5330, 1984). Leader sekvence může být modifikována tak, aby obsahovala, v blízkosti svého 3'konce, jedno nebo více použitelných restrikčních míst pro usnadnění fúze leader sekvence na cizorodé geny. Transkripční a translační kontrolní sekvence v expresních vektorech pro použití v transformaci buněk obratlovců mohou být poskytnuty z virových zdrojů. Například, běžně používané promotory a enhancery jsou odvozeny od polyoma, adenoviru 2, opičího viru 40 (SV40) a lidského cytomegaloviru. DNA sekvence odvozené z SV40 virového genomu, například, SV40 zdroj, časný a pozdní promotor, enhancer, splice, a polyadenylační místa mohou být použity pro poskytnutí jiných genetických elementů vyžadovaných pro expresi heterologní DNA sekvence. Časné a pozdní promotory jsou zejména užitečné, protože jsou oba snadno získány z viru jako fragment, který také obsahuje SV40 virový zdroj replikace (Fiers et al., Nátuře, 273: 113, 1978). Menší nebo větší SV40 fragmenty mohou také být použity, takže přibližně 250 bp sekvence v rozsahu od Hind II místa k Bgl II místu umístěná ve virovém zdroji replikace je také obsažena. Dále, virový genomový promotor, kontrolní a/nebo signální sekvence mohou být využity, kde takové kontrolní sekvence jsou kompatibilní s vybranou hostitelskou buňkou. Příkladné vektory mohou být konstruovány jak popisuje Okayama a Berg, Mol. Cell Biol. 3: 280, 1983.
Užitečný systém pro stabilní vysokou hladinu exprese cDNA savčího receptoru v Cl27 myších savčích epiteliálních buňkách může být konstruován v podstatě tak, jak to popisuje Cosman et al., (Mol. Immunol. 23: 935, 1986). Preferovaným eukaryotním vektorem pro expresi DNALbeIF4A proteinu je pDC406 (McMahan et al., EMBO J., 10; 2821, 1991) a obsahuje regulační sekvence odvozené od SV40, viru lidské imunodefícience (HIV) a viru Epstein-Barrové (EBV). Jiné preferované vektory zahrnují pDC409 a pDC410, které jsou odvozeny od pDC406. pDC409 byl odvozen od pDC406 substitucí EBV zdroje replikace za sekvenci kódující SV40 velký T antigen. pDC409 se liší od pDC406 v tom, že Bgl II restrikční místo mimo mnohotné klonovací místo bylo deletováno, což činí Bgl II místo v mnohotném klonovacím místě jedinečným.
Použitelná buněčná linie, která umožňuje episomální replikaci expresních vektorů, jako je pDC406 a pDC409, které obsahují EBV zdroj replikace, je CV-l/EBNA (ATCC CRL 10478). CV-L/EBNA buněčná linie byla odvozena transfekcí CV-1 buněčné linie genem kódujícím nukleární antigen I viru Epstein - Barrové (EBNA-1) a konstitutivně exprimuje EBNA-1 řízený lidským CMV okamžitým-časným enhancerem/promotorem.
Transformované hostitelské buňky jsou buňky, které byly transformovány nebo transfektovány expresními vektory konstruovanými za použití rekombinantních DNA technik a které obsahují sekvence kódující HER-2/neu polypeptid podle předkládaného vynálezu. Transformované hostitelské buňky mohou exprimovat požadovaný HER-2/neu polypeptid, ale hostitelské buňky transformované za účelem klonování nebo amplifíkace HER-2/neu DNA nemusí exprimovat HER-2/neu polypeptid. Exprimované polypeptidy budou preferovaně secernovány do kultivačního supematantu, v závislosti na vybrané DNA, ale mohou také být deponovány v buněčné membráně.
Vhodné hostitelské buňky pro expresi rekombinantních proteinů zahrnují prokaryontní buňky, kvasinky nebo vyšší eukaryotní buňky pod kontrolou vhodných promotorů. Prokaryonty zahrnují gram negativní nebo gram pozitivní organismy, například E. coli nebo Bacilli. Vyšší eukaryotní buňky obsahují ustanovené buněčné linie savčího nebo hmyzího původu, jak jsou popsány dále. Buněk prosté translační systémy mohou být také využity pro produkci HER-2/neu polypeptidů za použití RNA derivovaných z DNA konstruktů. Vhodné klonovací a expresní vektory pro použití v bakteriálních, houbových, kvasinkových a savčích buněčných hostitelích jsou popsány například v Pouwels et al., Cloning Vectors: A Laboratory Manual, Elsevier, New York, 1985.
- 11 CZ 296617 B6
Prokaryotní expresní hostitelé mohou být použity pro expresi HER-2/neu polypeptidů, které nevyžadují extenzivní proteolytické a disulfidové zpracování. Prokaryotní expresní vektory obecně obsahují jeden nebo více fenotypových selektovatelných markérů, například, gen kódující proteiny udílející rezistenci na antibiotika nebo doplňující autotrofní požadavky a zdroj replikace rozpoznávaný hostitelem pro zajištění amplifikace v hostiteli. Vhodné prokaryotní hostitelé pro transformaci zahrnují E. coli, Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium a různé druhy rodu Pseudomonas, Streptomyces, a Staphylococcus, ačkoliv jiní hostitelé mohou být také použiti.
Rekombinantní HER-2/neu polypeptidy mohou také být exprimovaný ve kvasinkovém hostiteli, preferovaně druhu Saccharomyces, jako je S. cerevisiae. Kvasinky jiných rodů, jako je Pichia nebo Kluyveromyces, mohou také být použity. Kvasinkové vektory budou obecně obsahovat zdroj replikace z 2μ kvasinkového plazmidu nebo autonomně se replikující sekvenci (ARS), promotor, DNA kódující HER-2/neu polypeptid, sekvence pro polyadenylaci a terminaci transkripce a selekční gen. Preferovaně budou kvasinkové vektory obsahovat zdroj replikace a selektovatelný markér umožňující transformaci jak kvasinky, tak E. coli, např. gen rezistence na ampicilin E. coli a S. cerevisiae trpí gen, který poskytuje selekční markér pro mutantní kmen kvasinky postrádající schopnost růstu v tryptofanu, a promotor odvozený od vysoce exprimovaného kvasinkového genu pro indukci transkripce strukturálního genu downstream. Přítomnost trpí léze se v buněčném genomu hostitelské kvasinky potom poskytuje účinné prostředí pro detekci transformace růstem za absence tryptofanu.
Vhodné transformační protokoly pro kvasinky jsou odborníkům známé. Příkladná technika popsaná Hindem et al., (Proč. Nati. Acad. Sci. USA 75: 1929, 1978) vyžaduje selekci Trp+ transformantů v selektivním médiu, skládajícím se z 0,67 % kvasinkové dusíkaté báze, 0,5 % casaminokyselin, 2 % glukózy, 10 mg/ml adeninu a 20 mg/ml uracilu. Hostitelské kmeny transformované vektorem obsahujícím ADH2 promotor mohou být kultivovány pro expresi v bohatém médiu, skládajícím se z 1 % kvasinkového extraktu, 1 % peptonu, a 1 % glukózy, doplněném 80 mg/ml adeninu a 80 mg/ml uracilu. Dereprese ADH2 promotoru se vyskytne po vyčerpání glukózy v médiu. Surové kvasinkové supernatanty jsou získány filtrací a uchovávány při 4 °C před další purifikací.
Různé savčí nebo hmyzí (např. Spodoptera nebo Trichoplusia) buněčné kultivační systémy mohou také být použity pro expresi rekombinantního polypeptidů. Baculovirový systém pro produkci heterologních polypeptidů ve hmyzích buňkách je popsán, například, Luckowem a Summers, Bio/Technology 6: 47, 1988. Příklady vhodných savčích hostitelských buněčných linií zahrnují COS-7 linie buněk opičích ledvin, popsané Gluzmanem (Cell 23: 175, 1981) a jiné buněčné linie schopné exprese vhodných vektorů, včetně, například, CV-l/EBNA (ATCC CRL 10478), L buněk, Cl27, 3T3, ovaria čínských křečků (CHO), COS, NS-1, HeLa a BHK buněčné linie. Savčí expresní vektory mohou obsahovat netranskribované elementy, jako je zdroj replikace, vhodný promotor a enhancer navázaný na gen, který má být exprimován a jiné 5' a 3' sousedící netranskribované sekvence a 5' a 3' netranslatované sekvence, jako jsou nezbytná vazebná místa pro ribosomy, polyadenylační místo, střihový donor a akceptor místa a transkripční terminační sekvence.
Purifikované HER-2/neu polypeptidy mohou být připraveny kultivací vhodných systémů hostitel/vektor pro expresi rekombinantních translačních produktů DNA podle předkládaného vynálezu, které jsou potom purifikovány z kultivačního média nebo z buněčných extraktů. Například, supernatanty ze systémů, které secernují rekombinantní polypeptidy do kultivačního média, mohou být nejprve koncentrovány za použití komerčně dostupného proteinového koncentračního filtru, jako je Amicon nebo Millipore Pellicon ultrafiltrační jednotka. Po kroku koncentrování může být koncentrát aplikován na vhodnou purifikační matrix. Například, vhodná afinitní matrice může obsahovat počitatelný strukturální protein (tj. protein, na který se HER-2/neu polypeptid váže ve specifické interakci založené na struktuře) nebo lektin nebo molekulu protilátky navázanou na vhodný nosič. Alternativně může být využit aniontový výměnný resin, například matrix nebo substrát, který má zavěšené diethylaminoethyl (DEAE) skupiny. Matrice
- 12 CZ 296617 B6 mohou být akrylamidové, agarosové, dextranové, celulózové nebo jiných typů, běžně používaných v proteinové purifikaci. Alternativně může být využit krok výměny kationtů. Vhodné kationtové měniče zahrnují různé nerozpustné matrice, obsahující sulfopropylovou nebo karboxymethylovou skupinu. Sulfopropylové skupiny jsou preferovány. Gelová filtrační chromatografie také poskytuje prostředek pro purifikaci HER-2/neu.
Afinitní chromatografie je preferovanou metodou pro purifikaci HER-2/neu polypeptidů. Například, monoklonální protilátky proti HER-2/neu polypeptidů mohou být také užitečné při purifikaci afinitní chromatografíí, za použití metod, které jsou v oboru dobře známé.
Konečně, jeden nebo více kroků reverzní fázové vysoce účinné kapalinová chromatografie (RP-HPLC), využívající hydrofobního RP-HPLC média (např. silikagel mající zavěšenou methylovou nebo jinou alifatickou skupinu), mohou být využity pro další čištění HER-2/neu polypeptidové kompozice. Některé nebo všechny proběhlé kroky purifikace, v různých kombinacích, mohou být také využity pro poskytnutí homogenního rekombinantnho polypeptidů.
Rekombinantní HER-2/neu polypeptid produkovaný v bakteriální kultuře je preferovaně izolován iniciální extrakcí z buněčných pelet, po čemž následuje jedna nebo více koncetrací, vysolení, vodná iontová výměna nebo vyloučení podle velikosti kroky chromatografie. Vysoce účinná kapalinová chromatografie (HPLC) může být použita pro konečné kroky purifikace. Mikrobiální buňky použité v expresi rekombinantního LbeIF4A proteinu mohou být rozrušeny jakoukoliv vhodnou metodou, včetně cyklování mrazení tavení, sonikace, mechanického rozrušení nebo za použití agens způsobujících lýzu buňky.
Fermentace kvasinek, které exprimují HER-2/neu polypeptid jako secemovaný protein, značně zjednodušuje purifikaci. Secemovaný rekombinantní protein vzniklý z fermentace velkého rozsahu může být purifíkován metodami analogickými k těm, které popsal Urdal et al., (J. Chromatog. 296: 171, 1984). Tento odkaz popisuje dva sekvenční kroky reverzní fáze HPLC pro purifikaci rekombinantního lidského GM-CSF na preparativní HPLC koloně.
Přípravky HER-2/neu polypeptidů syntetizovaných v rekombinantní kultuře mohou obsahovat non-HER-2/neu buněčné složky, včetně proteinů v množství a charakteru, který závisí na krocích purifikace vybraných pro získání HER-2/neu polypeptidů z kultury. Tyto složky budou obyčejně kvasinkového, prokaryotního nebo non-lidského eukaryotního původu. Takové přípravky jsou obyčejně prosté od jiných proteinů, které mohou být normálně asociovány s HER-2/neu proteinem jak je tomu v přírodě a v druzích, ze kterých pochází.
Automatizované syntézy poskytují alternativní metodu pro přípravu polypeptidů podle předkládaného vynálezu. Například mohou být použity jakékoliv komerčně dostupné techniky pevné fáze, jako je Merrifield solid phase syntetická metoda, ve které jsou aminokyseliny sekvenčně přidávány k rostoucímu aminokyselinovému řetězci. (Viz Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85: 2149 - 2146, 1963). Vybavení pro automatizovanou syntézu polypeptidů je komerčně dostupné od dodavatelů, jako je Applied Biosystems, lne., z Foster City, CA, a může obecně pracovat podle návodu výrobce.
V jednom aspektu podle předkládaného vynálezu, použití HER-2/neu polypeptidů (nebo DNA molekuly, která řídí expresi takového peptidu) pro generování imunitní odpovědi na HER-2/neu protein (včetně toho, který je exprimován na malignitách, se kterými je HER-2/neu onkogen asociován) může být detekován. Reprezentativní vzorky takových malignit zahrnují rakovinu prsu, ovaria, tlustého střeva, plic a prostaty. Imunitní odpověď na HER-2/neu protein, generovaná HER-2/neu polypeptidem, může být dlouhodobá a může být detekována dlouho po imunizaci, nezávisle na tom, zda je protein přítomen nebo nepřítomen v těle v době testování. Imunitní odpověď na HER-2/neu protein generovaná HER-2/neu polypeptidem může být detekována vyšetřením přítomnosti nebo nepřítomnosti, nebo zvýšení, specifické aktivace CD4+ nebo CD8+ T buněk. Přesněji, T buňky izolované od imunizovaného jedince rutinním způsobem
- 13 CZ 296617 B6 (jako je Ficoll/Hypaque centrifugace podle gradientu denzity lymfocytů periferní krve) jsou inkubovány s HER-2/neu proteinem. Například, T buňky mohou být inkubovány in vitro po
2-9 dní (typicky 4 dny) při 37 °C s HER-2/neu proteinem (typicky 5 pg/ml celého proteinu nebo stupňovaného počtu buněk syntetizujících HER-2/neu protein). Může být žádoucí inkubovat jiný podíl vzorku T buněk za absence HER-2/neu proteinu pro kontrolu.
Specifická aktivace CD4+ nebo CD8+ buněk může být detekována různými způsoby, metody pro detekování specifické aktivace T buněk zahrnují detekci proliferace T buněk, produkce cytokinů (např. lymfokinů) nebo generování cytolytické aktivity (např. generování cytotoxických T buněk specifických pro HER-2/neu protein). Pro CD4+ T buňky je preferovanou metodou pro detekování specifické aktivace T buněk detekce proliferace T buněk. Pro CD8+ T buňky je preferovanou metodou pro detekování specifické aktivace T buněk detekce generování cytolytické aktivity.
Detekce proliferace T buněk může být provedena různými způsoby. Například, proliferace T buněk může být detekována měřením stupně DNA syntézy. T buňky, které byly stimulovány ke proliferaci, vykazují zvýšený stupeň syntézy DNA. Typickým způsobem pro měření stupně syntézy DNA jsou například pulzně značené kultury T buněk tritiovaným thymidinem, prekurzorem nukleotidů, který je inkorporován do nově syntetizované DNA. Množství inkorporovaného tritiovaného thymidinu může být určeno za použití kapalinového scintilačního spektrofotometru. Jiné způsoby pro detekování proliferace T buněk zahrnují měření zvýšení produkce interleukinu 2 (IL-2), Ca+ tok, nebo vychytávání barviva, jako je 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazolium. Alternativně, syntéza lymfokinů (jako je interferon gama) může být měřena a nebo může být kvantifikován relativní počet T buněk, které mohou odpovídat na intaktní pl85HER-2/neuprotein
Za použití nebo expresí HER-2/neu polypeptidu mohou být T buňky, které rozpoznávají HER-2/neu protein, proliferovány in vivo. Například, léčivo pro imunizaci s HER-2/neu peptidem (tj. jako je vakcína) může indukovat kontinuální expanzi počtu T buněk nezbytných pro terapeutický útok na tumor, se kterým je HER-2/neu onkogen asociován. Typicky, asi 0,01 pg/kg až lOOmg/kg tělesné hmotnosti bude podáno intradermálně, subkutánně nebo intravenózním způsobem. Preferovaná dávka je okolo 1 pg/kg do asi 1 mg/kg, a zejména preferováno je asi od 5 pg/kg do asi 200 pg/kg. Odborníkům bude jasné, že počet a frekvence podání bude záviset na odpovědi pacienta. Může být žádoucí podat HER-2/neu polypeptid opakovaně. Odborníkům v oboru bude jasné, že může být podán více než jeden HER-2/neu polypeptid, bud simultánně nebo sekvenčně. Preferované peptidy pro použití v léčivu pro imunizaci jsou ty, které obsahují aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: začínající asi lysinovým zbytkem v aminokyselinové pozici 676 a sahající asi k valinovému zbytku v aminokyselinové pozici 1255. Odborníky v oboru bude oceněno, že předkládaný vynález předpokládá použití intaktního HER-2/neu polypeptidu stejně jako dělení takového polypeptidu na množství peptidů. Ani intaktní pl85HER_2/neu protein, ani peptid mající aminokyselinovou sekvenci jeho celé extracelulámí domény (tj. peptid mající aminokyselinovou sekvenci SEQ ED NO: 2 od aminokyseliny v pozici 1 do aminokyseliny v pozicí 650, plus nebo minus jedna až pět pozic, a s nebo bez prvních 21 aminokyselinových pozic) nejsou použity samostatně pro imunizaci.
HER-2/neu polypeptid (nebo nukleová kyselina) je preferovaně formulován pro použití ve výše uvedených metodách jako farmaceutická kompozice (např. vakcína). Farmaceutická kompozice obecně obsahuje jeden nebo více polypeptidů v kombinaci s farmaceuticky akceptovatelným nosičem, excipientem nebo ředidlem. Takové nosiče budou netoxické pro příjemce v použitých dávkách a koncentracích. Použití HER-2/neu polypeptidu v konjunkci s chemoterapeutickým agens je také předpokládáno.
Kromě HER-2/neu polypeptidu (který účinkuje jako antigen) může být také žádoucí zahrnout jiné složky do vakcíny, jako je vehikulum pro podání antigenu a ímunostimulační substance pro zvýšení imunogenicity proteinu. Příklady vehikulí pro antigen obsahují soli hliníku, emulze voda
- 14 CZ 296617 B6 v oleji, biodegradovatelné olejová vehikula, emulze olej ve vodě, biodegradovatelné mikrokapsle a liposomy. Příklady imunostimulačních substancí (adjuvans) zahrnují N-acetylmuramyl-L-alanin-D-izoglutamin (MDP), lipopolysacharidy (LPS), glukan, IL-12, GM-CSF, interferon gama a IL-15. Odborníkům v oboru bude jasné, že HER-2/neu polypeptid pro vakcínu může být připraven synteticky nebo může být přirozeně odvozen.
Zatímco jakýkoliv vhodný odborníkům v oboru známý nosič může být využit ve farmaceutických kompozicích podle předkládaného vynálezu, typ nosiče bude velmi záviset na způsobu podání a na tom, zdaje požadováno trvalé uvolňování. Pro parenterální podání, jako je subkutánní injekce, nosič preferovaně obsahuje vodu, salinický roztok, alkohol, tuk, vosk nebo pufr. Pro orální podání může být použit jakýkoliv z výše uvedených nosičů nebo pevný nosič jako je manitol, laktóza, škrob, stearát horečnatý, sacharid sodný, talek, celulóza, glukóza, cukróza, a uhličitan horečnatý. Biodegradovatelné mikrosféry (např. polymléčný galaktid) mohou být také využity jako nosiče pro farmaceutické kompozice podle předkládaného vynálezu. Vhodné degradovatelné mikrosféry jsou popsány například v patentech US 4897286 a US 5075109. HER-2/neu polypeptid může být enkapsulován uvnitř biodegradovatelné mikrosféry nebo může být asociován s povrchem mikrosféry. Například, v preferovaném provedení, polypeptid mající aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 2 od aminokyseliny 676 do aminokyseliny 1255 je enkapsulován v biodegradovatelné mikrosféře. V tomto ohledu je preferováno, aby byla mikrosféra větší než přibližně 25 mikrometrů.
Farmaceutické kompozice (včetně vakcín) mohou také obsahovat ředidla jako jsou pufry, antioxidanty jako je kyselina askorbová, polypeptidy o nízké molekulové hmotnosti (menší než 10 zbytků), proteiny, aminokyseliny, uhlovodany jako je glukóza, sacharóza nebo dextriny, chelatační agens jako je EDTA, glutathion nebo jiné stabilizátory nebo excipiens. Neutrální pufrovaný salinický roztok nebo salinický roztok smíšený s nespecifickým sérovým albuminem jsou příklady vhodných ředidel. Preferovaně, produkt je formulován jako lyofilizát za použití vhodných excipientních roztoků (např. sacharózy) jako ředidel.
Jako alternativu pro prezentaci HER-2/neu polypeptidů obsahuje předmět vynálezu kompozice schopné dopravení molekul nukleové kyseliny kódujících HER-2/neu polypeptid. Takové kompozice zahrnují rekombinantní virové vektory (např. retrovirové (viz WO 90/07936, WO 91/02805, WO 93/25234, WO 93/25698 a WO 94/03622), adenovirové (viz Berkner, Biotechniques 6: 616 - 627, 1988; Li et al., Hum. Gen. Ther., 4: 403 - 409, 1993; Vincent et al., Nat. Genet., 5: 130 - 134, 1993; a Kolis et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 91: 215 - 219, 1994), pox virové (viz patent US 4769330; patent US 5017487; a WO 89/01973), naked DNA (viz WO 90/11092), molekula nukleové kyseliny komplexovaná na polykationtovou molekulu (viz WO 93/03709) a nukleová kyselina asociovaná s liposomy (viz Wang et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 84: 7851, 1987). V jistých provedeních může být DNA navázána na usmrcený nebo inaktivovaný adenovirus (viz Curiel et al., Hum. Gen. Ther., 3: 147 - 154, 1992; Cotton etal., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 89: 6094, 1992). Jiné vhodné kompozice obsahují DNA ligand (viz Wu et al., J. Biol. Chem., 264: 16985 - 16987, 1989) a lipid-DNA kombinace (viz Felgner et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 84: 7413 - 7417, 1989). Kromě toho, účinnost vychytávání naked DNA do buněk může být zvýšena potažením DNA na biodegradovatelné korálky.
Kromě přímých in vivo procedur mohou být použity ex vivo procedury, ve kterých jsou buňky odstraněny ze zvířete, modifikovány a umístěny do stejného nebo do jiného zvířete. Je jasné, že může být využita jakákoliv kompozice uvedená výše pro zavedení HER-2/neu molekuly nukleové kyseliny do buněk tkáně v ex vivo kontextu. Protokoly pro virové, fyzikální a chemické metody vychytávání jsou v oboru dobře známé.
V souladu s tím je předkládaný vynález užitečný pro posílení nebo vyvolání buněčné imunitní odpovědi (např. generování pro antigen specifických cytolytických T buněk) u pacienta nebo v buněčné kultuře. Jak je zde použito, termín pacient označuje jakékoliv teplokrevné zvíře, preferovaně člověk. Pacient může být postižen rakovinou, jako je rakovina prsu, nebo může být
- 15 CZ 296617 B6 normální (tj. bez detekovatelné choroby nebo infekce). Buněčná kultura je jakýkoliv přípravek T buněk nebo izolovaných složek buněk (včetně, ale nejenom, makrofágů, monocytů, B buněk a dendritických buněk). Takové buňky mohou být izolovány jakoukoliv z množství technik odborníkům dobře známých (jako je Ficoll-hypaque denzitní centrifugace. Buňky mohou (ale nemusí) být izolovány od pacienta postiženého s HER-2/neu asociovanou malignitou, a mohou být znovu zavedeny do pacienta po léčbě.
Předkládaný vynález také popisuje, že HER-2/neu polypeptid, kromě toho, zeje imunogenní pro T buňky, pravděpodobně stimuluje B buňky k produkci protilátek schopných rozpoznávat HER-2/neu polypeptid. Protilátky specifické (tj. ty, které vykazují vazebnou afinitu okolo 107 litrů/mol nebo vyšší) pro HER-2/neu protein mohou být nalezeny v mnoha tělesných tekutinách včetně séra a ascitu. Stručně, vzorek tělesné tekutiny je odebrán od teplokrevného zvířete, jako je člověk, u kterého je požadavek na určení přítomnosti protilátek specifických pro HER-2/neu polypeptid. Tělesná tekutina je inkubována s HER-2/neu polypeptidem za podmínek a po dobu dostatečnou pro umožnění tvorby imunokomplexů mezi polypeptidem a protilátkami specifickými pro protein. Například, tělesná tekutina a HER-2/neu polypeptid mohou být inkubovány při 4 °C po 24 - 48 hodin. Po inkubaci je reakční směs testována na přítomnost imunokomplexů. Detekce jednoho nebo více imunokomplexů vytvořených mezi HER-2/neu polypeptidem a protilátkou specifickou pro HER-2/neu polypeptid může být provedena množstvím různých technik, jako je radioimunotest (RIA) a enzymově vázaný imunosorbentní test (ELISA).
Vhodné imunotesty zahrnují sendvičovou imunotestovací techniku s použitím dvojích monoklonálních protilátek podle David et al., patent US 4376110); sendvičové testy s použitím monoklonální-polyklonální protilátky (Wide et al., v Kirkham and Hunter, eds., Radioimunoassay Methods, E. and S. Livingstone, Edinburgh, 1970); western blot metodu podle Gordon et al., (patent US 4452901); imunoprecipitací značeného ligandu (Brown et al., J. Biol. Chem. 255: 4980 - 4983, 1980); enzymově vázané imunosorbentní testy, popsané například, Raines and Ross (J. Biol. Chem. 257: 5154 -5160, 1982); imunocytochemické techniky, včetně použití fluorochromů (Brooks et al., Clin. Exp. Immunol., 39: 477, 1980); a neutralizace aktivity (Bowen Pope et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 81: 2396 - 2 400 (1984)), všechny jsou zde uvedeny jako odkaz. Kromě imunotestů popsaných výše je dostupný velký počet jiných imunotestů, včetně těch, které jsou popsány v patentech US 3817827; US 3850752; US 3901654; US 3935074; US 3984533; US 4034074; a US 4098876, kdy jsou zde všechny tyto uvedené jako odkaz.
Pro účely detekce může být HER-2/neu polypeptid (antigen) buď značený, nebo neznačený. Pokud je neznačený, pak nachází antigen uplatnění v aglutinačních testech. Kromě toho, neznačený antigen může být použit v kombinaci se značenými molekulami, které jsou reaktivní s imunokomplexy, nebo v kombinaci se značenými protilátkami (sekundárními protilátkami), které jsou reaktivní s protilátkou namířenou proti HER-2/neu polypeptidu, jako je protilátka specifická pro imunoglobulin. Alternativně může být antigen značen přímo. Pokud je značen, pak může značkovací skupina obsahovat radioizotopy, fluorofory, enzymy, luminiscenční agens, nebo částice barviva. Tyto a jiné značky jsou dobře známé v oboru a jsou popsány, například, v následujících patentech US 3766162; US 3791932; US 3817837; US 3996345; a US 4233402.
Typicky v ELISA testuje antigen adsorbován na povrch mikrotitrační jamky. Reziduální vazebná místa pro protein jsou potom blokována vhodným agens, jako je hovězí sérový albumin (BSA), teplem inaktivované normální kozí sérum (NGS), nebo BLOTTO (pufrovaný roztok netučného sušeného mléka, který také obsahuje ochranné látky, soli, a protipěnící agens). Jamka je potom inkubována se vzorkem, o kterém je předpokládáno, že obsahuje specifickou protilátku. Vzorek může potom být aplikován neředěný, nebo, častěji, může být ředěn, obvykle v pufrovacím roztoku který obsahuje malé množství (0,1 % - 5,0 % hmotnosti) proteinu, jako je BSA, NGS nebo BLOTTO. Po inkubaci po dostatečnou dobu pro to, aby mohla proběhnout specifická vazba, je jamka promyta pro odstranění nenavázaného proteinu a potom je inkubována se značenou protilátkou specifickou pro druh imunoglobulinu, která je značena značkovací skupinou. Značkovací skupina může být vybrána z množství enzymů, včetně křenové peroxidázy, beta galakto- 16 CZ 296617 B6 sidázy, alkalické fosfatázy a glukóza oxidázy. Je umožněna dostatečně dlouhá doba pro výskyt specifické vazby, potom je jamka znovu promyta pro odstranění nenavázaného konjugátu a je přidán substrát pro enzym. Je umožněn vývoj barvy a optická denzita obsahu jamky je měřena vizuálně nebo instrumentálně.
V jednom preferované provedení tohoto aspektu předkládaného vynálezu je značkovací skupina navázána na HER-2/neu protein. Krok detekce imunokomplexů vyžaduje odstranění v podstatě všeho nenavázaného HER-2/neu proteinu a detekování přítomnosti nebo nepřítomnosti značkovací skupiny.
V jiném preferovaném provedení je značkovací skupina navázána na druhou protilátku schopnou vazby na protilátky specifické pro HER-2/neu protein. Krok detekování imunokomplexů vyžaduje (a) odstranění v podstatě všech nenavázaných protilátek, (b) přidání druhé protilátky, (c) odstranění v podstatě všech nenavázaných druhých protilátek a potom (d) detekování přítomnosti nebo absence značkovací skupiny. Pokud je protilátka specifická pro HER-2/neu protein odvozena od lidské, pak je druhou protilátkou anti lidská protilátka.
Ve třetím preferovaném provedení pro detekování imunokomplexů je značkovací skupina navázána na molekulu schopnou vazby na imunokomplexy. Krok detekování vyžaduje (a) přidání molekuly, (b) odstranění v podstatě veškeré nenavázané molekuly, (c) detekování přítomnosti nebo absence značkovací skupiny. Příkladem molekuly schopné vazby na imunokomplexy je protein A.
Odborníkům v oboru je jasné, že množství metod pro detekování imunokomplexů může být použito v předkládaném vynálezu. Značkovací skupiny vhodné pro použití v jakékoliv z těchto metod zahrnují radioizotopy, fluorofory, enzymy, luminiscenční agens, a částice barviva.
V příbuzném aspektu předkládaného vynálezu může být detekce imunokomplexů tvořených mezi HER-2/neu polypeptidem a protilátkami v tělesných tekutinách specifickými pro HER-2/neu polypeptid použita pro monitorování účinnosti protinádorové terapie nádorů, které obsahují HER-2/neu polypeptid, malignit, se kterými je HER-2/neu onkogen asociován. Vzorky tělesné tekutiny od jedince odebrané před a po začátku terapie mohou být analyzovány na imunokomplexy metodami popsanými výše. Stručně, je srovnáván počet imunokomplexů detekovaných v obou vzorcích. Významná změna v počtu imunokomplexů ve druhém vzorku (po zahájení terapie) vzhledem k prvnímu vzorku (před terapií) odráží úspěšnou terapii.
Následující příklady jsou nabídnuty jako ilustrace a nikoliv jako omezení.
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1
Exprese a purifikace rekombinantního lidského HER-2/neu polypeptidu
Lidský HER-2/neu polypeptid byl získán PCR metodou (např. patent US 4683195; US 4683202; US 4800159) z plazmidů připraveného podle Di Fiore et al., (King et al., Science 229: 974-976, 1985; Di Fiore et al., Science 237: 178 - 182, 1987) za použití oligonukleotidových příměrů, které mají navíc zavedené BssHII restrikční místo a enterokinázové proteázové místo na 5' konci a EcoRI místo na 3' konci. Primer pro 5' konec byl 5-TCTGGCGCGCTGGATGACGATGACAAGAAACGACGGCAGCAGAAGATC-3' (SEQ ID NO: 3), zatímco primer pro 3' konec byl 5-TGAATTCTCGAGTCATTACACTGGCACGTCCAGACCCAG-3' (SEQ ID NO: 4). Vzniklý 1,8 kb PCR fragment byl subklonován do T-vektoru od Novagen (Madison, WI, USA) a sekvence vybraných klonů byla určena na ABI 373 automatizovaném DNA sekvenátoru (Applied Biosystems lne., Foster City, CA, USA) za použití překrývajících se sekvenčních primerů. PCR
- 17 CZ 296617 B6 fragmenty, které korespondovaly s publikovanou DNA sekvencí pro lidský HER-2/neu cDNA (SEQ ID NO: 1; Coussens et al., Science 230: 1132, 1985; Yamamoto et al., Nátuře 319: 230, 1986) byly potom připojeny v řádném čtecím rámečku přes BssHII místo do modifikované E. coli thioredoxin reduktázy. óXhistidin afínitní smyčka použitá v Ni-NTA afinitní purifikaci 5 exprimovaného fúzního proteinu byla inkorporována do thioredoxin reduktázového fúzního partnera. Tato cDNA pro trxA-lidský HER-2/neu polypeptid fúzní protein byla subklonována do modifikovaného pET expresního vektoru pro expresi v E. coli.
Ačkoliv u thioredoxin reduktázy bylo popsáno, že stabilizuje a solubilizuje jiné heterologní 10 proteiny exprimované v E.coli, nezdá se, že by nabízela jakoukoliv výhodu pro expresi lidského
HER-2/neu polypeptidu v E. coli. Ačkoliv signifikantní část trxA-HER-2/neu polypeptid fúzního proteinu byla solubilní, většina ho byla exprimována v inkluzních tělískách. Fúzní protein byl proto podroben degradaci během exprese v E. coli. Přítomnost thioredoxin reduktázového fúzního partnera může, nicméně, stabilizova protein v průběhu purifikace. Dostupnost monoklonálních 15 protilátek k thioredoxin reduktáze poskytuje vhodný markér pro sledování v průběhu purifikace.
Pro purifikaci lidského HER-2/neu polypeptidu s thiredoxin reduktáza fúzním partnerem obsahujícím 6XHis afínitní smyčku, byly E. coli pelety resuspendovány s inhibitory proteáz a lysozymem a sonikovány. Inkluzní tělíska byla izolována centrifugací a byla třikrát promyta deoxy20 cholátem, kdy poslední promytí bylo přes noc pro odstranění LPS. Promytá inkluzní tělíska byla solubilizována v GuHCI pro Ni purifikaci. Ni kolona byla eluována imidazolem v močovině a dialyzována proti 10 mM Tris pH 8. Získání HER-2/neu polypeptidu za použití tohoto protokolu bylo okolo asi 80 % - 95 % čistoty kompletního proteinu, kdy hlavním kontaminantem byl degradovaný protein. Z 500 ml fermentace bylo získáno 20 mg. To byl > 98 % HER-2/neu 25 polypeptid. Techniky zde použité jsou odborníkům dobře známé a byly popsány, například, v J. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, Cold Spring Harbor, New York. USA.
Příklad 2
Dendritické buňky mohou navodit lidský HER-2/neu polypeptid
A. Generování DC kultur z kostní dřeně
DC kultury byly generovány z CD34+ hematopoetických progenitorových buněk (HPC). CD34+ 35 buňky byly purifikovány z kostní dřeně normálních dárců za použití buněčného separačního systému Ceprate LC kit (CellPro, Bothell, WA, USA). Čistota získaných CD34+ buněk byla určena analýzou průtokovou cytometrií v séra prostém médiu (X-VIVO 10, Biowhittaker, lne., Walkersville, MD, USA) doplněném L-glutaminem (584 pg/l), penicilinem (10 IU/ml), streptomycinem (100pg/ml), 100pg/ml lidského rGM-CSF a 50ng/ml lidského rIL-6 (Immunex, 40 Seattle, WA, USA). Po 0ažl7 denní kultivační době byly buňky sklízeny a použity pro fenotypizační testy a pro testy stimulace T buněk. O GM-CSF samotném nebo v kombinaci s IL-4 nebo TNFa bylo popsáno, že indukují in vitro růst DC. V pokusech za použití KLH a OVA jako antigenů pro nastavení nativních T buněk dávaly GM-CSF plus IL-6 srovnatelnou celkovou stimulaci, ale s nižším pozadím, a proto vyšší stimulační index ve srovnání s GM-CSF 45 plus IL-4 nebo TNfa.
B. Test nastavení T buněk
Z kostní dřeně odvozené CD34+ HPC, kultivované v séra prostém médiu, obsahujícím GM-CSF a IL-6 byly použity jako APC po kultivační periodě 0-17 dní. Nastavovací (priming) schopnost
DC byla určena jejich kultivací s autologními, nativními T lymfocyty za přítomnosti nebo absence proteinového antigenů, kterým je lidský HER-2/neu polypeptid (hHNP) (10 pg/ml).
CD4+ T lymfocyty byly izolovány z mononukleárních buněk periferní krve pozitivní selekcí za použití imunoafinitních kolon (CellPro, Bothell, WA, USA). CD4+ CD45RA+ (nativní).
T lymfocyty byly selektovány z CD4+ T lymfocytů za použití anti-CD45RA mAb přímo
- 18 CZ 296617 B6 konjugované na FITC (Immunotech, Westbrook, ME, USA) tříděním průtokovou cytometrií. Získané CD4+ CD45RA+ T buňky byly 99 % čistoty. DC kultury byly umístěny do 96 jamkových ploten s plochým dnem (Corning, Corning, NY, USA) v různých koncentracích a byly inkubovány po 16 - 18 hodin s hHNP v konečné koncentraci 10 pg/ml. Antigenem pulzované DC byly ozářeny (10 Gy) a autologní CD4+ CD45RA+ T lymfocyty byly přidány (5 x 104/jamku). Proliferativní odpověď T buněk byla měřena vychytáváním (3H) thymidinu (1 pCi/jamku), který byl přidán v den 6 na 16 - 18 hodin. Proliferační testy byly provedeny v séra prostém a cytokinu prostém médiu. Výsledky jsou ukázány na obrázku 1. Obrázek 2 ukazuje výsledky testování CD4+ T buněk, od normálního dárce, na odpověď na hHNP. Podobná data byla získána s T buňkami od devíti z desíti normálních jedinců.
Příklad 3
Test pro detekci nízké frekvence lymfocytárních prekurzorů
Tři testy byly použity pro detekci CD4+ odpovědí: standardní proliferační test, vyšetřovací metoda pro události s nízkou frekvencí a test limitního ředění (LDA). Běžné proliferační testy jsou schopné snadno detekovat navozené odpovědi. Stimulační index proliferativní odpovědi poskytuje hrubou korelaci s frekvencí prekurzorů antigen reaktivních T buněk. Jakákoliv specifická proliferativní odpověď detekovaná z PBL je považována za navozenou odpověď.
Pro poskytnutí více kvantitativní interpretace odpovědí CD4+ T buněk byl použit testovací systém vyvinutý pro detekci odpovědí lymfocytárních prekurzorů o nízké frekvenci (popsaný dále). Tento test je jednoduchý a finančně výhodný. Za okolností, kdy je potřeba přesnější určení, je frekvence prekurzorů určena testem limitujícího ředění (Bishop and Orosz, Transplantation 47: 671 -677, 1989).
Odpovědi větší, než jsou detekovány u normálních jedinců jsou definovány jako navozená odpověď a naznačují existující imunitu. Nízké odpovědi, detekovatelné pouze LDA podmínkami, jsou považovány za nenavozené odpovědi. Absence odpovědi v LDA nebo odpovědi nižší, než jsou definovány pro normální populaci jsou považovány za toleranci/anergii.
Obecně, navozené odpovědi CD4+ T buněk mohou být detekovány v běžných testech proliferace, zatímco nenavozené odpovědi nejsou těmito testy detekovatelné. Detekce malého množství nenavozených T buněk je omezena matoucím pozadím vychytávání thymidinu, které obsahuje autologní smíšenou lymfocytární odpověď (AMLR) na vlastní MHC antigen plus odpovědi na zpracované proteiny vlastního séra a na exogenní přidané sérové proteiny.
Pro vyvolání a detekování nenavozených T buněk byl použit testovací systém pro odpovědi o nízké frakvenci, založený na Poissonově statistice vzorku (v: Pinnacles, Chiron Corporation, 1: 1-2, 1991). Tento typ analýzy se specificky používá na evy nízké frekvence v tom, že pokud je frekvence prekurzorů nižší než počet buněk v replikované kultuře, pak je požadováno mnoho replikátů pro detekování statisticky signifikantního počtu pozitivních. Teoreticky, bude opravena pro autologní odpovědi za zadání známé pozitivní kontroly (jakoje PHA nebo tetanický toxoid) a známé negativní kontroly (žádný antige) a hodnocení všech dat od nejnižších do nejvyšších bez ohledu na experimentální skupiny, ke kterým patří. Hraniční hodnota je vypočítána na základě rovnice = M + (F + SD), kde M = aritmetický průměr, F = 3,29, faktor z tabulek standardizované normální distribuce vybraný tak, aby ne více než 0,1 % správně negativních z normálně distribuovaného pozadí nebylo nad hraniční hodnotou, a SD = standardní odchylka. V tomto vyšetřovacím testu jsou jamky nad hraniční hodnotou považovány za pravdivě pozitivní v tom, že potenciálně obsahují lymfocyty, které jsou specificky proliferující proti požadovanému antigenu. Ačkoliv hodnocení frekvence prekurzorů lymfocytů je možné za použití této metody, přesné určení vyžaduje formální LDA analýzy.
- 19 CZ 296617 B6
Příklad 4
Vakcína založená na HER-2/neu polypeptidů zvyšuje imunitu vůči HER-2/neu proteinu
A. Zvířata
Krysy použité v této studii byly Fischer kmen 344 (CDF (F-344)/CrlBR) (Charles River Laboratories, Portage MI). Zvířata byla chována v University of Washington Animal facilities za specifických podmínek bez patogenů a rutinně byla používána pro studie ve věku 3 a 4 měsíce.
B. Imunizace
Fischer krysy byly imunizovány rekombinantním krysím HER-2/neu polypeptidem (rHNP) v různých adjuvans (MPL, Vaccel; Ribi, Bozeman, MT, USA). Zvířata dostala 50 pg rHNP smíšeného s adjuvans subkutánně. O dvacet dní později byla zvířatům podána dosycovací dávka v druhé imunizaci za podání 50 pg rHNP, podaného stejným způsobem. Dvacet dní po dosycovací imunizaci byla zvířata testována na přítomnost protilátek namířených proti krysímu HER2/neu proteinu (neu).
C. Buněčné linie
Dvě buněčné linie byly použity jako zdroj neu proteinů. SKBR3, lidská buněčná linie rakoviny prsu, která se vyznačuje nadměrnou expresí HER-2/neu (Američan Type Culture Collection, Rockville, MD) byla uchovávána v kultuře v 10 % fetálním hovězím séru (FBS) (Gemini Bioproducts, lne., Calabasas, CA) a RPMI. DHFR-G8, NIH(3T3 buněčná linie kotransfektovaná s cneu-p a pSV2-DHFR (Američan Type Culture Collection, Rockville, MD) byla použita jako zdroj, netransformujícího krysího neu proteinu (Bemards et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 84: 6854 - 6858, 1987). Tato buněčná linie byla uchovávána v 10 % FBS a Dulbecco modifikovaném Eaglově médiu s 4,5 g/1 glukózy. DHFR-G8 buňky byly pasážovány přes stejné médium doplněné 0,3 pM methotrexatem v každé třetí pasáži pro udržení neu transfektantů.
D. Příprava buněčných lyzátů
Lyzáty jak SKBR3, tak DHFR-G8, byly připraveny a použity jako zdroj neu proteinu. Stručně, byl připraven pufr pro lýzu, který se skládal z tris báze, chloridu sodného a Triton-X (1 %) pH 7,5. Byly přidány inhibitory proteáz; aprotinin (1 pg/ml), benzamidin (1 mM) a PMSF (1 mM). 1 ml pufru pro lýzu byl použit pro suspendování 107 buněk. Buňky byly vortexovány po 15 sekund každých 10 minut po jednu hodinu, dokud nebyly narušeny. Všechny postupy byly provedeny na ledu v místnosti s teplotou 4 °C. Po narušení byly buňky mikrofugovány při 4 °C po 20 minut. Ze supernatantu byla odstraněna buněčná drť a byl uskladněn v malých alikvotách při -70 °C do použití. Přítomnost lidského a krysího neu v lyzátech byla dokumentována Western blot analýzami.
E. ELISA na krysí neu proti látkovou odpověď jamkové Immulon 4 plotny (Baxter SP, Redmond, WA: Dynatech Laboratories) byly inkubovány přes noc při 4 °C s krysí neu specifickou monoklonální protilátkou (Oncogene Science), 7.16.4, v koncentraci 10 pg/ml ředěnou v karbonátovém pufru (ekvimolámí koncentrace Na2CO3 a NaHCO3, pH 9,6). Po inkubaci byly všechny jamky blokovány PBS-1 % BSA (Sigma Chemicals, St. Louis, MO, USA), 100 pg/jamku po 3 hodiny při pokojové teplotě. Plotna byla promyta PBS-0,5 % Tween a lyzáty DHFRG8, myší buněčné linie transfektované krysí neu DNA (Američan Type Culture Collection, Rockville, MD); zdroj krysího neu proteinu, byly přidány. Plotna byla inkubována přes noc při 4 °C. Plotna byla potom promyta PBS-0,5 % Tween a pokusné sérum bylo přidáno v následujících ředěních: 1 : 25 až 1 : 200. Sérum bylo ředěno v PBS-1 % BSA-1 % FBS-25 pg/ml myší IgG-0,01 % NaN3 a potom sériově do PBS-1 % BSA. 50 pl ředěného séra bylo přidáno na jamku a inkubováno po jednu hodinu při pokojové teplotě. Každé pokusné sérum bylo přidáno do jamky s krysím neu a do jamky bez krysího neu. Ovčí anti-krysí Ig F(ab')2 křenová peroxidáza (HRP) byla přidána do jamek v ředění
- 20 CZ 296617 B6 : 5 000 v PBS-1 % BSA a byla inkubována po 45 minut při pokojové teplotě (Amersham Co., Ariington Heights, IL, USA). Po konečném promytí bylo přidáno TMB (Kirkegaard and Perry Laboratories, Gaithersburg, MD) vývojové reagens. Byla čtena optická denzita barevné reakce při 450 nm. OD pro každé ředěné sérum byla kalkulována jako OD krysím neu potažených jamek minus OD PBS-1 % BSA potažených jamek. Sérum od zvířat imunizovaných samotným adjuvans a zvířat imunizovaných hHNP (cizorodým proteinem) byla také hodnocena obdobným způsobem. Výsledky jsou ukázány na obrázku 3.
F. Testy proliferace T buněk
Pro analýzu specifických odpovědí na HER-2/neu polypeptid: čerstvé buňky sleziny nebo lymfatické uzliny jsou získány mechanickým poškozením a pasáží přes drátěné síto a promytím. 2 x 105 buněk sleziny na jamku a 1 x 105 buněk Iymfatické uzliny na jamku bylo umístěno na 96 jamkovou mikrotitrační plotnu s plochým dnem (Corning, Corning,, NY) s šesti replikáty na pokusnou skupinu. Médium se skládalo z EHAA 120 (Biofluids) s L-glutaminem, penicilin/streptomycinem, 2-merkaptoethanolem a 5 % FBS. Buňky byly inkubovány s polypeptidy. Po 4 dnech byly jamky pulzovány 1 pCi (3H) thymidinu na 6 - 8 hodin a počítány. Data jsou vyjádřena jako stimulační index (SI), který je definován jako průměr pokusných jamek dělený průměrem kontrolních jamek (bez antigenů). Pro analýzu specifických odpovědí na HER-2/neu protein: čerstvé buňky sleziny nebo Iymfatické uzliny jsou kultivovány pro tři in vitro stimulace. V době analýz je 1 x 105 T buněk sleziny nebo Iymfatické uzliny umístěno na 96 jamkovou mikrotitrační plotnu jak je popsáno výše. Buňky jsou inkubovány s 1 pg/ml imunoafinitní kolonou purifíkovaného krysího neu (z DHFR-G8 buněk jako zdroje krysího neu). Po 4 dnech byly jamky pulzovány 1 pCi (3H) thymidinu na 6 - 8 hodin a počítány. Data jsou vyjádřena jako stimulační index, který je definován jako průměr pokusných jamek dělený průměrem kontrolních jamek (bez antigenů).
Příklad 5
Navozená odpověď k lidskému HER-2/neu polypeptidů může být detekována u pacientů s rakovinou prsu.
Heparinizovaná krev byla získána od pacientů se stadiem II rakoviny prsu s nadměrnou expresí HER-2/neu. Mononukleární buňky periferní krve (PBMC) byly separovány Ficoll Hypaque centrifugací podle denzity. PBMC byly umístěny v koncentraci 2 x 105/jamku na 96 jamkovou mikrotitrační plotnu s plochým dnem (Corning, Corning, NY). Pro každou pokusnou skupinu bylo provedeno 24 replikátů jamek. Antigeny skládající se z HER-2/neu odvozených peptidů (15 - 20 aminokyselin délky s uvedeným číslem první aminokyseliny v sekvenci) 25 pg/ml, lidský HER-2/neu polypeptid (hHNP) 1 pg/ml, tetanický toxoid 1 pg/ml, a p30 peptid odvozený od tetanu 25 pg/ml, byly přidány do každé z replikovatelných 24 jamek. Test byl proveden v médiu obsahujícím 10 % lidské sérum. Proliferativní odpověď T buněk byla měřena vychytáváním (3H) thymidinu (1 pCi/jamku) přidaným v den 4 na dobu 10 hodin. Pozitivní jamky, antigen reaktivní jamky, byly skórovány jako pozitivní, pokud bylo cpm vyšší než průměr a 3 standardní odchylky jamek bez antigenů. Výsledky jsou ukázány na obrázku 4. Tito pacienti se II. stadiem rakoviny prsu mají signifikantní odpověď na rekombinantní hHNP.
Z předešlého popisuje jasné, že ačkoliv specifická provedení vynálezu zde byla popsána za účelem ilustrace, mohou být provedeny různé modifikace bez narušení smyslu a rozsahu vynálezu.
- 21 CZ 296617 B6
Seznam sekvencí (1) Obecné informace:
(i) Přihlašovatel: University of Washington (ii) Název vynálezu: Sloučeniny pro vyvolání nebo posílení imunitní reaktivity k HER-2/neu proteinu pro prevenci nebo léčbu malignit, se kterými je HER-2/neu onkogen asociován (iii) Počet sekvencí: 4 (iv) Adresa pro korespondenci (A) Adresa: Seed and Berry LLP (B) Ulice: 6300 Columbia Center. 701 Fifth Avenue (C) Město: Seattle (D) Stát: Washington (E) Země: USA (F) ZIP: 98104-7092 (v) Počítačová čtecí forma:
(A) Typ média: Floppy disk (B) Počítač: IBM PC kompatibilní (C) Operační systém: PC-DOS/MS-DOS (D) Software: Patentln Release #1.0, verse #1.30 (vi) Údaje o současné přihlášce:
(A) Číslo přihlášky:
(B) Datum podání: 28.3.1996 (C) Klasifikace:
(viii) Zástupce/agent informace (A) Jméno: Sharkey, Richard G.
(B) Registrační číslo: 32629 (C) Reference/číslo rejstříku: 920010.448PC (ix) Telekomunikační informace:
(A) Telefon: (206) 622-4900 (B) Telefax: (206) 682-6031 (2) Informace pro SEQ ID NO: 1:
(i) Charakteristiky sekvence:
(A) Délka: 334 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ix) Vlastnosti:
(A) Jméno/klíč: CDS (B) Umístění: 1...3765
- 22 CZ 296617 B6 (ix) Popis sekvence: SEQ ID NO: 1:
ATG Met 1 GAG CTG GCG GCC Ala 5 TTG TGC CGC TGG GGG CTC CTC CTC GCC CTC TTG 48
Glu Leu Ala Leu Cys Arg Trp Gly 10 Leu Leu Leu Ala Leu 15 Leu
CCC CCC GGA GCC GCG AGC ACC CAA GTG TGC ACC GGC ACA GAC ATG AAG 96
Pro Pro Gly Ala Ala Ser Thr Gin Val Cys Thr Gly Thr Asp Met Lys
20 25 30
CTG CGG CTC CCT GCC AGT CCC GAG ACC CAC CTG GAC ATG CTC CGC CAC 144
Leu Arg Leu Pro Ala Ser Pro Glu Thr His Leu Asp Met Leu Arg His
35 40 45
CTC TAC CAG GGC TGC CAG GTG GTG CAG GGA AAC CTG GAA CTC ACC TAC 192
Leu Tyr Gin Gly Cys Gin Val Val Gin Gly Asn Leu Glu Leu Thr Tyr
50 55 60
CTG CCC ACC AAT GCC AGC CTG TCC TTC CTG CAG GAT ATC CAG GAG GTG 240
Leu Pro Thr Asn Ala Ser Leu Ser Phe Leu Gin Asp Ile Gin Glu Val
65 70 75 80
CAG GGC TAC GTG CTC ATC GCT CAC AAC CAA GTG AGG CAG GTC CCA CTG 288
Gin Gly Tyr Val Leu Ile Ala His Asn Gin Val Arg Gin Val Pro Leu
85 90 95
CAG AGG CTG CGG ATT GTG CGA GGC ACC CAG CTC TTT GAG GAC AAC TAT 336
Gin Arg Leu Arg Ile Val Arg Gly Thr Gin Leu Phe Glu Asp Asn Tyr
100 105 110
GCC CTG GCC GTG CTA GAC AAT GGA GAC CCG CTG AAC AAT ACC ACC CCT 384
Ala Leu Ala Val Leu Asp Asn Gly Asp Pro Leu Asn Asn Thr Thr Pro
- 23 CZ 296617 B6
115 120 125
GTC ACA GGG GCC TCC CCA GGA GGC Pro Gly Gly 135 CTG CGG GAG CTG CAG CTT CGA Arg AGC Ser 432
Val Thr 130 Gly Ala Ser Leu Arg Glu Leu 140 Gin Leu
CTC ACA GAG ATC TTG AAA GGA GGG GTC TTG ATC CAG CGG AA.C CCC CAG 480
Leu Thr Glu Ile Leu Lys Gly Gly Val Leu Ile- Gin Arg Asn Pro Gin
145 150 155 160
CTC TGC TAC CAG GAC ACG ATT KG TGG AAG GAC ATC TTC CAC AAG AAC 528
Leu Cys Tyr Gin Asp Thr Ile Leu Trp Lys Asp Ile Phe Hi s Lys Asn
165 170 175
AAC CAG CTG GCT CTC ACA CTG ATA GAC ACC AAC CGC TCT CGG GCC TGC 576
Asn Gin Leu Ala Leu Thr Leu Ile Asp Thr Asn Arg Ser Arg Ala Cys
180 185 190
CAC CCC TGT TCT CCG ATG TGT AAG GGC TCC CGC TGC TGG GGA GAG AGT 624
His Pro Cys Ser Pro Met Cys Lys Gly Ser Arg Cys Trp Gly Glu Ser
195 200 205
TCT GAG GAT TGT CAG AGC CTG ACG CGC ACT GTC TGT GCC GGT GGC TGT 672
Ser Glu Asp Cys Gin Ser Leu Thr Arg Thr Val Cys Ala Gly Gly Cys
210 215 220
GCC CGC TGC AAG GGG CCA CTG CCC ACT GAC TGC TGC- CAT GAG CAG TGT 720
Ala Arg Cys Lys Gly Pro Leu Pro Thr Asp Cys Cys His Glu Gin Cys
225 230 235 240
GCT GCC GGC TGC ACG GGC CCC AAG CAC TCT GAC TGC CTG GCC TGC CTC 763
Ala Al a Gly Cys Thr Gly Pro Lys His Ser Asp Cys Leu Ala Cys Leu
245 250 255
CAC TTC AAC CAC AGT GGC ATC TGT GAG CTG CAC TGC CCA GCC CTG GTC 816
His Phe Asn His Ser Gly Ile Cys Glu Leu His Cys Pro Al a Leu Val
260 265 270
ACC TAC AAC ACA GAC ACG TTT GAG TCC ATG CCC AAT CCC GAG GGC CGG 864
Thr Tyr Asn Thr Asp Thr Phe Glu Ser Met Pro Asn Pro Glu Gly Arg
275 280 285
TAT ACA TTC GGC GCC AGC TGT GTG ACT GCC TGT CCC TAC AAC TAC CTT 912
Tyr Thr Phe Gly Ala Ser Cys Val Thr Ala Cys Pro Tyr Asn Tyr Leu
290 295 300
- 24 CZ 296617 B6
TCT Ser 305 ACG GAC GTG GGA TCC TGC ACC Thr CTC GTC TGC CCC CTG CAC MC Asn CM Gin 320 960
Thr Asp Val Gly Ser Cys 310 Leu Val Cys 315 Pro Leu His
GAG GTG ACA GCA GAG GAT GGA ACA CAG CGG TGT GAG MG TGC AGC MG 1008
Glu Val Thr Ala Glu Asp Gly Thr Gin Arg Cys Glu Lys Cys Ser Lys
325 330 335
CCC TGT GCC CGA GTG TGC TAT GGT CTG GGC ATG GAG CAC KG CGA GAG 1056
Pro Cys Al a Arg Val Cys Tyr Gly Leu Gly Met Glu His Leu Arg Glu
340 345 350
GTG AGG GCA GTT ACC AGT GCC AAT ATC CAG GAG TTT GCT GGC TGC MG 1104
Val Arg Ala Val Thr Ser Ala Asn Ile Gin Glu Phe Ala Gly Cys Lys
355 360 365
AAG ATC ΤΤΓ GGG AGC CTG GCA τπ CTG CCG GAG AGC τπ GAT GGG GAC 1152
Lys Ile Phe Gly Ser Leu Ala Phe Leu Pro Glu Ser Phe Asp Gly Asp
370 375 380
CCA GCC TCC AAC ACT GCC CCG CTC CAG CCA GAG CAG CTC CM GTG πτ 1200
Pro Ala Ser Asn Thr Ala Pro Leu Gin Pro Glu Gin Leu Gin Val Phe
385 390 395 400
GAG ACT CTG GAA GAG ATC ACA GGT TAC CTA TAC ATC TCA GCA TGG CCG 1248
Glu Thr Leu Glu Glu Ile Thr Gly Tyr Leu Tyr Ile Ser Ala Trp Pro
405 410 415
GAC AGC CTG CCT GAC CTC AGC GTC TTC CAG AAC CTG CM GTA ATC CGG 1296
Asp Ser Leu Pro Asp Leu Ser Val Phe Gin Asn Leu Gin Val Ile Arg
420 425 430
GGA CGA ATT CTG CAC AAT GGC GCC TAC TCG CTG ACC CTG CM GGG CTG 1344
Gly Arg Ile Leu His Asn Gly Ala Tyr Ser Leu Thr Leu Gin Gly Leu
435 440 445
GGC ATC AGC TGG CTG GGG CTG CGC TCA CTG AGG GAA CTG GGC AGT GGA 1392
Gly Ile Ser Trp Leu Gly Leu Arg Ser Leu Arg Glu Leu Gly Ser Gly
450 455 460
CTG GCC CTC ATC CAC CAT AAC ACC CAC CTC TGC TTC GTG CAC ACG GTG 1440
Leu Ala Leu Ile His His Asn Thr His Leu Cys Phe Val His Thr Val
465 470 475 480
- 25 CZ 296617 B6
CCC TGG GAC CAG CTC Leu 485 ΓΤΤ Phe CGG AAC CCG CAC CAA GCT CTG CTC CAC His 495 ACT Thr 1488
Pro Trp Asp Gin Arg Asn Pro His 490 Gin Ala Leu Leu
GCC AAC CGG CCA GAG GAC GAG TGT GTG GGC GAG GGC CTG GCC TGC CAC 1536
AI a Asn Arg Pro Glu Asp Glu Cys Val Gly Glu Gly Leu Ala Cys His
500 505 510
CAG CTG TGC GCC CGA GGG CAC TGC TGG GGT CCA GGG CCC ACC CAG TGT 1584
Gin Leu Cys Ala Arg Gly His Cys Trp Gly Pro Gly Pro Thr Gin Cys
515 520 525
GTC AAC TGC AGC CAG TTC CTT CGG GGC CAG GAG TGC GTG GAG GAA TGC 1632
Vδ 1 Asn Cys Ser Gin Phe Leu Arg Gly Gin Glu Cys Val Glu Glu Cys
530 535 540
CGA GTA CTG CAG GGG CTC CCC AGG GAG TAT GTG AAT GCC AGG r λγ vrskz TGT 1680
Arg Val Leu Gin Gly Leu Pro Arg Glu Tyr Val Asn Ala Arg His Cys
545 550 555 560
TTG CCG TGC CAC CCT GAG TGT CAG CCC CAG AAT GGC TCA GTG ACC TGT 1728
Leu Pro Cys His Pro Glu Cys Gin Pro Gin Asn Gly Ser Val Thr Cys
565 570 575
TTT GGA CCG GAG GCT GAC CAG TGT GTG GCC TGT GCC CAC TAT AAG GAC 1776
Phe Gly Pro Glu Ala Asp Gin Cys Val Ala Cys Ala His Tyr Lys Asp
580 585 590
CCT CCC rrc i GC GTG GCC CGC TGC CCC AGC GGT GTG AAA CCT GAC CTC 1824
Pro Pro Phe Cys Val AI a Arg Cys Pro Ser Gly Val Lys Pro Asp Leu
595 600 605
TCC TAC ATG CCC ATC TGG AAG TTT CCA GAT GAG GAG GGC GCA TGC CAG 1872
Ser Tyr Met Pro Ile Trp Lys Phe Pro Asp Glu Glu Gly Ala Cys Gin
610 615 620
CCT TGC CCC ATC AAC TGC ACC CAC TCC TGT GTG GAC CTG GAT GAC AAG 1920
Pro Cys Pro Ile Asn Cys Thr Hi s Ser Cys Val Asp Leu Asp Asp Lys
625 630 635 640
GGC TGC CCC GCC GAG CAG AGA GCC AGC CCT CTG ACG TCC ATC ATC TCT 1968
Gly Cys Pro Ala Glu Gin Arg Ala Ser Pro Leu Thr Ser Ile Ile Ser
645 650 655
GCG GTG GTT GGC ATT CTG CTG GTC GTG GTC HG GGG GTG GTC TTT GGG 2016
- 26 CL 296617 B6
Ala Val Val Gly 660 Ile Leu Leu Val Val Val 665 Leu Gly Val Val 670 Phe Gly
ATC CTC ATC AAG CGA CGG CAG CAG AAG ATC CbG AAG TAC ACG ATG CGG 2064
Ile Leu Ile Lys Arg Arg Gin Gin Lys Ile Arg Lys Tyr Thr Met Arg
675 680 685
AGA CTG CTG CAG GAA ACG GAG CTG GTG GAG CCG,CTG ACA CCT AGC GGA 2112
Arg Leu Leu Gin Glu Thr Glu Leu Val Glu Pro Leu Thr Pro Ser Gly
690 695 700
GCG ATG CCC AAC CAG Guu CAG ATG CGG ATC CTG AAA GAG ACG GAG CTG 2160
Ala Met Pro Asn Gin Al a Gin Met Arg Ile Leu Lys Glu Thr Glu Leu
705 710 715 720
AGG AAG GTG AAG GTG CTT GGA TCT GGC GCT TTT GGC ACA GTC i al AAG 2208
Arg Lys Val Lys Val Leu Gly Ser Gly Ala Phe Gly Thr Val Tyr Lys
725 730 735
GGC ATC TGG ATC CCT GAT GGG GAG AAT GTG AAA ATT CCA GTG GCC ATC 2256
Gly Ile Trp Ile Pro Asp Gly Glu Asn Val Lys Ile Pro Val Ala Ile
740 745 750
AAA GTG TTG AGG GAA AAC ACA TCC CCC AAA GCC AAC AAA GAA ATC TTA 2304
Lys Val Leu Arg Glu Asn Thr Ser Pro Lys Ala Asn Lys Glu Ile Leu
755 760 765
GAC GAA GCA TAC GTG ATG GCT GGT GTG GGC TCC CCA TAT GTC TCC CGC 2352
Asp Glu Ala Tyr Val Met Ala Gly Val Gly Ser Pro Tyr Val Ser Arg
770 775 780
CTT CTG GGC ATC TGC CTG ACA TCC ACG GTG CAG CTG GTG ACA CAG CTT 2400
Leu Leu Gly Ile Cys Leu Thr Ser Thr Val Gin Leu Val Thr Gin Leu
785 790 795 800
ATG CCC TAT GGC TGC CTC ΓΓΑ GAC CAT GTC CGG GAA AAC CGC GGA CGC 2448
Met Pro Tyr Gly Cys Leu Leu Asp His Val Arg Glu Asn Arg Gly Arg
805 810 815
CTG GGC TCC CAG GAC CTG CTG AAC TGG TGT ATG CAG Απ GCC AAG GGG 2496
Leu Gly Ser Gin Asp Leu Leu Asn Trp Cys Met Gin Ile Ala Lys Gly
820 825 830
ATG AGC TAC CTG GAG GAT GTG CGG CTC GTA CAC AGG GAC KG GCC GCT 2544
Met Ser Tyr Leu Glu Asp Val Arg Leu Val Hi S Arg Asp Leu Ala Ala
- 27 CZ 296617 B6
835 840 845
CGG AAC GTG CTG GTC AAG AGT CCC AAC CAT GTC AAA ATT ACA GAC TTC 2592
Arg Asn Val Leu Val Lys Ser Pro Asn His Val Lys Ile Thr Asp Phe
850 855 860
GGG CTG GCT CGG CTG CTG GAC ATT GAC GAG ACA GAG TAC CAT GCA GAT 2640
Gly Leu Ala Arg Leu Leu Asp Ile Asp Glu Thr Glu Tyr His Ala Asp
865 870 875 880
GGG GGC AAG GTG CCC ATC AAG TGG ATG GCG CTG GAG TCC ATT CTC CGC 2688
Gly Gly Lys Val Pro Ile Lys Trp Met Ala Leu Glu Ser Ile Leu Arg
885 890 895
CGG CGG TTC ACC CAC CAG AGT GAT GTG TGG AGT TAT GGT GTG ACT GTG 2736
Arg Arg Phe Thr His Gin Ser Asp Val Trp Ser Tyr Gly Val Thr Val
900 905 910
TGG GAG CTG ATG ACT TTT GGG GCC AAA CCT TAC GAT GGG ATC CCA GCC 2784
Trp Glu Leu Met Thr Phe Gly Ala Lys Pro Tyr Asp Gly Ile Pro Ala
915 920 925
CGG GAG ATC CCT GAC CTG CTG GAA AAG GGG GAG CGG CTG CCC CAG CCC 2832
Arg Glu Ile Pro Asp Leu Leu Glu Lys Gly Glu Arg Leu Pro Gin Pro
930 935 940
CCC ATC TGC ACC ATT GAT GTC TAC ATG ATC ATG GTC AAA TGT TGG ATG 2880
Pro Ile Cys Thr Ile Asp Val Tyr Met Ile Met Val Lys Cys Trp Met
945 950 955 960
ATT GAC TCT GAA. TGT CGG CCA AGA TTC CGG GAG TTG GTG TCT G.AA HC 2928
Ile Asp Ser Glu Cys Arg Pro Arg Phe Arg Glu Leu Val Ser Glu Phe
965 970 975
TCC CGC ATG GCC AGG GAC CCC CAG CGC TTT GTG GTC ATC CAG AAT GAG 2976
Ser Arg Met Ala Arg Asp Pro Gin Arg Phe Val Val Ile Gin Asn Glu
980 985 990
GAC TTG GGC CCA GCC AGT CCC TTG GAC AGC ACC TTC TAC CGC TCA CTG 3024
Asp Leu Gly Pro Al a Ser Pro Leu Asp Ser Thr Phe Tyr Arg Ser Leu
995 100 0 100 5
CTG GAG GAC GAT GAC ATG GGG GAC CTG GTG GAT GCT GAG GAG TAT CTG 3072
Leu Glu Asp Asp Asp Met Gly Asp Leu Val Asp Ala Glu Glu Tyr Leu
1010 1015 1020
- 28 CZ 296617 B6
GTA CCC Val Pro 1025 CAG CAG GGC TTC TTC TGT CCA GAC CCT GCC CCG GGC GCT GGG Gly 1040 3120
Gin Gin Gly Phe Phe Cys Pro Asp Pro Ala Pro Gly Ala
1030 1035
GGC ATG GTC CAC CAC AGG CAC CGC AGC TCA TCT ACC AGG AGT GGC GGT 3168
Gly Met Val His His Arg Hi s Arg Ser Ser Ser Thr Arg Ser Gly Gly
1045 1050 1055
GGG GAC CTG ACA CTA GGG CTG GAG CCC TCT GAA GAG GAG GCC CCC AGG 3216
Gly Asp Leu Thr Leu Gly Leu Glu Pro Ser Glu Glu Glu Ala Pro Arg
1060 1065 1070
TCT CCA CTG GCA CCC TCC GAA GGG GCT GGC TCC GAT GTA τπ GAT GGT 3264
Ser Pro Leu Ala Pro Ser Glu Gly Ala Gly Ser Asp Val Phe Asp Gly
1075 1080 1085
GAC CTG GGA ATG GGG GCA GCC AA.G GGG CTG CAA AGC CTC CCC ACA CAT 3312
Asp Leu Gly Met Gly Ala Ala Lys Gly Leu Gin Ser Leu Pro Thr His
1090 1095 1100
GAC CCC AGC CCT CTA CAG CGG TAC AGT GAG GAC CCC ACA GTA CCC CTG 3360
Asp Pro Ser Pro Leu Gin Arg Tyr Ser Glu Asd Pro Thr Val Pro Leu
1105 1110 1115 1120
CCC TCT GAG ACT GAT GGC TAC GTT GCC CCC CTG ACC TGC AGC CCC CAG 3408
Pro Ser Glu Thr Asp Gly Tyr Val Ala Pro Leu Thr Cys Ser Pro Gin
1125 1130 1135
CCT GAA TAT GTG AAC CAG CCA GAT GTT CGG CCC CAG CCC CCT TCG CCC 3456
Pro Glu Tyr Val Asn Gin Pro Asp Val Arg Pro Gin Pro Pro Ser Pro
1140 1145 1150
CGA GAG GGC CCT CTG CCT GCT GCC CGA CCT GCT GGT GCC ACT CTG GAA. 3504
Arg Glu Gly Pro Leu Pro Ala Ala Arg Pro Ala Gly Ala Thr Leu Glu
1155 1160 1165
AGG CCC AAG ACT CTC TCC CCA GGG AAG AA.T GGG GTC GTC MA GAC Gn 3552
Arg Pro Lys Thr Leu Ser Pro Gly Lys Asn Gly Val Val Lys Asp Val
1170 1175 1180
TTT gcc τπ GGG GGT GCC GTG GAG AAC CCC GAG TAC kg ACA CCC CAG 3600
Phe Ala Phe Gly Gly Ala Val Glu Asn Pro Glu Tyr Leu Thr Pro Gin
1185 1190 1195 1200
- 29 CZ 296617 B6
GGA GGA GCT GCC CCT CAG CCC CAC CCT CCT CCT GCC TTC AGC CCA GCC 3648
Gly Gly Ala Ala Pro Gin Pro His Pro Pro Pro Ala Phe Ser Pro Ala
1205 1210 1215
TTC GAC AAC CTC TAT TAC TGG GAC CAG GAC CCA CCA GAG CGG GGG GCT 3696
Phe Asp Asn Leu Tyr Tyr Trp Asp Gin Asp Pro Pro Glu Arg Gly Ala
1220 1225 1230
CCA CCC AGC ACC TTC AAA GGG ACA CCT ACG GCA GAG AAC CCA GAG TAC 3744
Pro Pro Ser Thr Phe Lys Gly Thr Pro Thr Ala Glu Asn Pro Glu Tyr
1235 1240 1245
CTG GGT C i G GAC GTG CCA GTG TGA 3768
Leu Gly Leu Asp Val Pro Val
1250 1255 (2) Informace pro SEQ ID NO: 2:
(i) Charakteristiky sekvence:
(A) Délka: 1 255 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: protein (ix) Popis sekvence: SEQ ID NO: 2:
Met Glu Leu Ala Al a Leu Cys Arg Trp Gly Leu Leu Leu Ala Leu Leu
1 5 10 15
Pro Pro Gly A i a Al a Ser Thr Gin Val Cys Thr Gly Thr Asp Met Lys
20 25 30
Leu Arg Leu Pro Ala Ser Pro Glu Thr His Leu Asp Met Leu Arg His
35 40 45
Leu Tyr Gin G1 v Cys Gin Val Val Gin Gly Asn Leu Glu Leu Thr Tyr
50 55 60
Leu Pro Thr Asn Ala Ser Leu Ser Phe Leu Gin Asp Ile Gin Glu Val
65 70 75 80
Gin Gly Tyr Val Leu Ile Ala His Asn Gin Val Arg Gin Val Pro Leu
90 95
- 30 CZ 296617 B6
Gin Arg Leu Arg Ile Val Arg Gly Thr Gin Leu Phe Glu Asp Asn Tyr
100 105 110
Ala Leu Al a Val Leu Asp Asn Gly Asp Pro Leu Asn Asn Thr Thr Pro
115 120 125
Val Thr Gly Ala Ser Pro Gly Gly Leu Arg Glu Leu Gin Leu Arg Ser
130 135 140
Leu Thr Glu Ile Leu Lys Gly Gly Val Leu Ile Gin Arg Asn Pro Gin
145 150 155 160
Leu Cys Tyr Gin Asp Thr Ile Leu Trp Lys Asp Ile Phe His Lys Asn
165 170 175
Asn Gin Leu Al c Leu Thr Leu Ile Asp Thr Asn Arg Ser Arg Ala Cys
180 185 190
His Pro Cys Ser Pro Met Cys Lys Gly Ser Arg Cys Trp Gly Glu Ser
195 200 205
Ser Glu Asp Cys Gin Ser Leu Thr Arg Thr Val Cys Ala Gly Gly Cys
210 215 220
Ala Arg Cys Lys Gly Pro Leu Pro Thr Asp Cys Cys His Glu Gin Cys
ζί f~ 230 235 240
Al a Ala Gly Cys Thr Gly Pro Lys His Ser Asp Cys Leu Ala Cys Leu
245 250 255
His Phe Asn His Ser Gly Ile Cys Glu Leu His Cys Pro Ala Leu Val
260 265 270
Thr Tyr Asn Thr Asp Thr Phe Glu Ser Met Pro Asn Pro Glu Gly Arg
275 280 285
Tyr Thr Phe Gly Ala Ser Cys Val Thr Ala Cys Pro Tyr Asn Tyr Leu
290 295 300
Ser Thr Asp Val Gly Ser Cys Thr Leu Val Cys Pro Leu His Asn Gin
305 310 315 320
Glu Val Thr Ala Glu Asp Gly Thr Gin Arg Cys Glu Lys Cys Ser Lys
325 330 335
- 31 CZ 296617 B6
Pro Cys Ala Arg Val Cys Tyr Gly Leu Gly Met Glu His Leu Arg Glu
340 345 350
Val Arg Ala Val Thr Ser Ala Asn Ile Gin Glu Phe Ala Gly Cys Lys
355 360 365
Lys Ile Phe Gly Ser Leu Ala Phe Leu Pro Glu Ser Phe Asp Gly Asp
370 375 380
Pro Ala Ser Asn Thr Ala Pro Leu Gin Pro Glu Gin Leu Gin Val Phe
385 390 395 400
Glu Thr Leu Glu Glu Ile Thr Gly Tyr Leu Tyr Ile Ser Ala Trp Pro
405 410 415
Asp Ser Leu Pro Asp Leu Ser Val Phe Gin Asn Leu Gin Val Ile Arg
420 425 430
Gly Arg Ile Leu His Asn Gly Ala Tyr Ser Leu Thr Leu Gin Gly Leu
435 440 445
Gly Ile Ser Trp Leu Gly Leu Arg Ser Leu Arg Glu Leu Gly Ser Gly
450 455 460
Leu Al a Leu Ile His His Asn Thr His Leu Cys Phe Val His Thr Val
465 470 475 480
Pro Trp Asp. Gin Leu Phe Arg Asn Pro His Gin Ala Leu Leu His Thr
485 490 495
Ala Asn Arg Pro Glu Asp Glu Cys Val Gly Glu Gly Leu Ala Cys His
500 505 510
Gin Leu Cys Ala Arg Gly His Cys Trp Gly Pro Gly Pro Thr Gin Cys
515 520 525
Val Asn Cys Ser Gin Phe Leu Arg Gly Gin Glu Cys Val Glu Glu Cys
530 535 540
Arg Val Leu Gin Gly Leu Pro Arg Glu Tyr Val Asn Ala Arg His Cys
545 550 555 560
Leu Pro Cys His Pro Glu Cys Gin Pro Gin Asn Gly Ser Val Thr Cys
565 570 575
- 32 CZ 296617 B6
Phe Gly Pro Glu Ala Asp Gin Cys Val Ala Cys Ala His Tyr Lys Asp
580 585 590
Pro Pro Phe Cys Val Ala Arg Cys Pro Ser Gly Val Lys Pro Asp Leu
595 600 605
Ser Tyr Met Pro Ile Trp Lys Phe Pro Asp Glu Glu Gly Ala Cys Gin
610 615 620
Pro Cys Pro Ile Asn Cys Thr His Ser Cys Val Asp Leu Asp Asp Lys
625 630 635 640
Gly Cys Pro Ala Glu Gin Arg Ala Ser Pro Leu Thr Ser Ile Ile Ser
645 650 655
Ala Val Val Gly Ile Leu Leu Val Val Val Leu Gly Val Val Phe Gly
660 665 670
Ile Leu Ile Lys Arg Arg Gin Gin Lys Ile Arg Lys Tyr Thr Met Arg
675 680 685
Arg Leu Leu Gin Glu Thr Glu Leu Val Glu Pro Leu Thr Pro Ser Gly
690 695 700
Ala Met Pro Asn Gin Ala Gin Met Arg Ile Leu Lys Glu Thr Glu Leu
705 710 715 720
Arg Lys Val Lys Val Leu Gly Ser Gly Ala Phe Gly Thr Val Tyr Lys
725 730 735
Gly Ile Trp Ile Pro Asp Gly Glu Asn Val Lys Ile Pro Val Ala Ile
740 745 750
Lys Val Leu Arg Glu Asn Thr Ser Pro Lys Ala Asn Lys Glu Ile Leu
755 760 765
Asp Glu Ala Tyr Val Met Ala Gly Val Gly Ser Pro Tyr Val Ser Arg
770 775 780
Leu Leu Gly Ile Cys Leu Thr Ser Thr Val Gin Leu Val Thr Gin Leu
785 790 795 800
Met Pro Tyr Gly Cys Leu Leu Asp His . Val Arg i Glu i Asn i Arg Gly Arg
805 810 815
- 33 CZ 296617 B6
Leu Gly Ser Gin Asp Leu Leu Asn Trp Cys Met Gin Ile Ala Lys Gly
820 825 830
Met Ser Tyr Leu Glu Asp Val Arg Leu Val His Arg Asp Leu Ala Ala
835 840 845
Arg Asn Val Leu Val Lys Ser Pro Asn His Val Lys Ile Thr Asp Phe
850 855 860
Gly Leu Ala Arg Leu Leu Asp Ile Asp Glu Thr Glu Tyr His Ala Asp
865 870 875 880
Gly Gly Lys Val Pro Ile Lys Trp Met Ala Leu Glu Ser Ile Leu Arg
885 890 895
Arg Arg Phe Thr His Gin Ser Asp Val Trp Ser Tyr Gly Val Thr Val
900 905 910
Trp Glu Leu Met Thr Phe Gly Ala Lys Pro Tyr Asp Gly Ile Pro Ala
915 920 925
Arg Glu Ile Pro Asp Leu Leu Glu Lys Gly Glu Arg Leu Pro Gin Pro
930 935 940
Pro Ile Cys Thr Ile Asp Val Tyr Met Ile Met Val Lys Cys Trp Met
945 950 955 960
Ile Asp Ser Glu Cys Arg Pro Arg Phe Arg Glu Leu Val Ser Glu Phe
965 970 975
Ser Arg Met Ala Arg Asp Pro Gin Arg Phe Val Val Ile Gin Asn Glu
980 985 990
Asp Leu Gly Pro Ala Ser Pro Leu Asp Ser Thr Phe Tyr Arg Ser Leu
995 1001 3 100!
Leu Glu Asp Asp Asp Met Gly Asp Leu Val Asp Ala Glu Glu Tyr Leu
ion 0 101 5 102' 0
Val Pro Gin Gin Gly Phe Phe Cys Pro Asp Pro Ala Pro Gly Ala Gly
102! 5 103 0 103 5 1040
Gly Met Val His His Arg His Arg Ser Ser Ser Thr Arg Ser Gly Gly
1045 1050 1055
- 34 CZ 296617 B6
Gly Asp Leu Thr Leu Gly Leu Glu Pro Ser Glu Glu Glu Al a Pro Arg
1060 1065 1070
Ser Pro Leu Ala Pro Ser Glu Gly Ala Gly Ser Asp Val Phe Asp Gly
1075 1080 1085
Asp Leu Gly Met Gly Ala Ala Lys Gly Leu Gin Ser Leu Pro Thr Hi s
1090 1095 1100
Asp Pro Ser Pro Leu Gin Arg Tyr Ser Glu Asp Pro Thr Val Pro Leu
1105 1110 1115 1120
Pro Ser Glu Thr Asp Gly Tyr Val Ala Pro Leu Thr Cys Ser Pro Gin
1125 1130 1135
Pro Glu Tyr Val Asn Gin Pro Asp Val Arg Pro Gin Pro Pro Ser Pro
1140 1145 1150
Arg Glu Gly Pro Leu Pro Ala Ala Arg Pro Ala Gly Al a Thr Leu Glu
1155 1160 1165
Arg Pro Lys Thr Leu Ser Pro Gly Lys Asn Gly Val Val Lys Asp Val
1170 1175 1180
Phe Ala Phe Gly Gly Ala Val Glu Asn Pro Glu Tyr Leu Thr Pro Gin
1185 119( 1 1195 1200
Gly Gly Ala Ala Pro Gin Pro His Pro Pro Pro Ala Phe Ser Pro Ala
1205 1211 3 1215
Phe Asp Asn Leu lyr Tyr Trp Asp Gin Asp Pro Pro Glu Arg Gly Ala
1220 122! - 123i 3
Pro Pro Ser Thr Phe Lys Gly Thr Pro Thr Ala Glu Asn Pro Glu Tyr
123: 5 1241 3 124! 5
Leu Gly Leu Asp Val Pro Val
1250 1255 (2) Informace pro SEQ ID NO: 3:
(i) Charakteristiky sekvence:
(A) Délka: 48 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární
- 35 CZ 296617 B6 (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 3:
TCTGGCGCGC TGGATGACGA TGACAAGAAA CGACGGCAGC AGAAGATC 48 (2) Informace pro SEQ ID NO: 4:
(i) Charakteristiky sekvence:
(A) Délka: 39 párů basí (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 4:
TGAATTCTCG AGTCATTACA CTGGCACGTC CAGACCCAG 39

Claims (14)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. Farmaceutická kompozice pro imunizaci teplokrevných zvířat proti malignitám, se kterými je asociován HER-2/neu onkogen, vyznačující se tím, že obsahuje farmaceuticky přijatelný nosič nebo ředidlo v kombinaci s polypeptidem kódovaným DNA sekvencí vybranou z
    a) nukleotidů 2026 až 765 SEQ ID NO: 1 a
    b) DNA sekvencí, které hybridizují na nukleotidovou sekvenci komplementární k nukleotidům 2026 až 3765 SEQ ID NO: 1 za středně přísných podmínek, kde DNA sekvence kóduje polypeptid, který produkuje imunitní odpověď na HER-2/neu protein, přičemž hybridizační podmínky zahrnují předpromytí v roztoku 5 x SSC, 0,5 % SDS, 1,0 mM EDTA, pH 8,0, hybridizaci při 50 až 65 °C, 5 x SSC, přes noc a potom následuje dvojnásobné promytí při 65 °C po 20 minut každým z 2 x, 0,5 x a 0,2 x SSC s obsahem 0,1 % SDS, nebo s molekulou nukleové kyseliny nebo virovým vektorem řídicím expresi výše uvedeného polypeptidu kódovaného DNA sekvencí vybranou ze sekvencí podle bodu a) a b).
  2. 2. Použití polypeptidu definovaného v nároku 1 pro výrobu léčiva pro imunizaci teplokrevných zvířat proti malignitám, se kterými je HER-2/neu onkogen asociován.
  3. 3. Molekula nukleové kyseliny řídicí expresi polypeptidu kódovaného DNA sekvencí, která je vybrána z
    a) nukleotidů 2 026 až 3 765 SEQ ID NO: 1 a
    b) DNA sekvenci, které hybridizují na nukleotidovou sekvenci komplementární k nukleotidům 2026 až 3765 SEQ ID NO: 1 za středně přísných podmínek, kde DNA sekvence kóduje polypeptid, který produkuje imunitní odpověď na HER-2/neu protein, přičemž hybridizační podmínky zahrnují předpromytí v roztoku 5 x SSC, 0,5 % SDS, 1,0 mM EDTA, pH 8,0, hybridizaci při 50 až 65 °C, 5 x SSC, přes noc a potom následuje dvojnásobné promytí při 65 °C po 20 minut každým z 2 x, 0,5 x a 0,2 x SSC s obsahem 0,1 % SDS, pro imunizaci buněk teplokrevných zvířat transfekcí.
  4. 4. Použití molekuly nukleové kyseliny definované v nároku 3 pro výrobu léčiva pro imunizaci teplokrevných zvířat proti malignitám, se kterými je asociován HER-2/neu onkogen.
    - 36 CZ 296617 B6
  5. 5. Virový vektor řídicí expresi polypeptidu kódovaného DNA sekvencí vybranou z
    a) nukleotidů 2 026 až 3 765 SEQ ID NO: 1 a
    b) DNA sekvencí, které hybridizují na nukleotidovou sekvenci komplementární k nukleotidům 2026 až 3765 SEQ ID NO: 1 za středně přísných podmínek, kde DNA sekvence kóduje polypeptid, který produkuje imunitní odpověď na HER-2/neu protein, přičemž hybridizační podmínky zahrnují předpromytí v roztoku 5 x SSC, 0,5 % SDS, 1,0 mM EDTA, pH 8,0, hybridizaci při 50 až 65 °C, 5 x SSC, přes noc a potom následuje dvojnásobné promytí při 65 °C po 20 minut každým z 2 x, 0,5 x a 0,2 x SSC s obsahem 0,1 % SDS, pro imunizaci buněk teplokrevných živočichů infikováním.
  6. 6. Použití virového vektoru definovaného v nároku 5 pro výrobu léčiva pro imunizaci teplokrevných zvířat proti malignitám, se kterým je HER-2/neu onkogen asociován.
  7. 7. Kompozice podle nároku 1, vyznačující se tím, že polypeptid má aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 2 od lysinu, aminokyseliny 676, až do valinu, aminokyseliny 1255.
  8. 8. Molekula nukleové kyseliny podle nároku 3, kde polypeptid má aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 2 od lysinu, aminokyseliny 676, až do valinu, aminokyseliny 1255.
  9. 9. Virový vektor podle nároku 5, kde polypeptid má aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 2 od lysinu, aminokyseliny 676, až do valinu, aminokyseliny 1255.
  10. 10. Kompozice podle nároku 1, vyznačující se tím, že polypeptid je vázán na druhý polypeptid nebo peptid mající imunogenní vlastnosti.
  11. 11. Kompozice podle nároku 7, vyznačující se tím, že první polypeptid je zkrácen a produkuje imunitní odpověď na HER-2/neu protein.
  12. 12. Kompozice podle nároku 11, vyznačující se tím, že polypeptid je vázán na peptid nebo polypeptid mající imunogenní vlastnosti.
  13. 13. Kompozice podle některého z nároků 1, 7, 10, 11 nebo 12, vyznačující se tím, že dále obsahuje adjuvans.
  14. 14. Použití kompozice podle některého z nároků 10, 11 12 nebo 13 pro výrobu léčiva pro imunizaci teplokrevných zvířat proti malignitám, se kterým je HER-2/neu onkogen asociován.
CZ0309697A 1995-03-31 1996-03-28 Farmaceutická kompozice, molekula nukleové kyseliny, virový vektor a jejich pouzití a pouzití polypeptidu CZ296617B6 (cs)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US08/414,417 US5801005A (en) 1993-03-17 1995-03-31 Immune reactivity to HER-2/neu protein for diagnosis of malignancies in which the HER-2/neu oncogene is associated

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CZ309697A3 CZ309697A3 (cs) 1998-01-14
CZ296617B6 true CZ296617B6 (cs) 2006-05-17

Family

ID=23641368

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ0309697A CZ296617B6 (cs) 1995-03-31 1996-03-28 Farmaceutická kompozice, molekula nukleové kyseliny, virový vektor a jejich pouzití a pouzití polypeptidu
CZ20040789A CZ296618B6 (cs) 1995-03-31 1996-03-28 Farmaceutická nebo polypeptidová kompozice, molekula nukleové kyseliny, virový vektor a lécivo pro imunizaci proti malignitám

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ20040789A CZ296618B6 (cs) 1995-03-31 1996-03-28 Farmaceutická nebo polypeptidová kompozice, molekula nukleové kyseliny, virový vektor a lécivo pro imunizaci proti malignitám

Country Status (19)

Country Link
US (9) US5801005A (cs)
EP (2) EP1418235A3 (cs)
JP (2) JP4510147B2 (cs)
KR (1) KR100554186B1 (cs)
CN (3) CN1597953A (cs)
AT (1) ATE299180T1 (cs)
AU (1) AU708237B2 (cs)
BR (1) BR9607889A (cs)
CA (1) CA2216601C (cs)
CZ (2) CZ296617B6 (cs)
DE (1) DE69634912T2 (cs)
DK (1) DK0817846T3 (cs)
ES (1) ES2245783T3 (cs)
HU (1) HUP9801826A3 (cs)
NO (2) NO321941B1 (cs)
NZ (1) NZ306616A (cs)
PT (1) PT817846E (cs)
RU (2) RU2236461C2 (cs)
WO (1) WO1996030514A1 (cs)

Families Citing this family (336)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7252829B1 (en) * 1998-06-17 2007-08-07 Idm Pharma, Inc. HLA binding peptides and their uses
AU712441B2 (en) * 1994-12-14 1999-11-04 Scripps Research Institute, The In vivo activation of tumor-specific cytotoxic T cells
US6514942B1 (en) * 1995-03-14 2003-02-04 The Board Of Regents, The University Of Texas System Methods and compositions for stimulating T-lymphocytes
US6685940B2 (en) 1995-07-27 2004-02-03 Genentech, Inc. Protein formulation
US6267958B1 (en) 1995-07-27 2001-07-31 Genentech, Inc. Protein formulation
US8038994B2 (en) 1996-05-15 2011-10-18 Quest Pharmatech Inc. Combination therapy for treating disease
US20080220012A1 (en) * 1996-05-15 2008-09-11 Ragupathy Madiyalakan Therapeutic Compositions that alter the immune response
ATE233102T1 (de) * 1996-05-15 2003-03-15 Altarex Inc Verfahren und zusammensetzung zur umgestaltung multi-epitopischer antigene um die immunantwort einzuleiten
US7371376B1 (en) * 1996-10-18 2008-05-13 Genentech, Inc. Anti-ErbB2 antibodies
AU6020998A (en) 1997-01-08 1998-08-03 Life Technologies, Inc. Methods for production of proteins
US6884435B1 (en) * 1997-01-30 2005-04-26 Chiron Corporation Microparticles with adsorbent surfaces, methods of making same, and uses thereof
DK0991403T3 (da) * 1997-01-30 2003-07-28 Chiron Corp Anvendelse af mikropartikler med adsorberet antigen til stimulering af immunresponser
US20040202680A1 (en) * 1997-01-30 2004-10-14 O'hagan Derek Microparticles with adsorbent surfaces, methods of making same, and uses thereof
ZA9811162B (en) 1997-12-12 2000-06-07 Genentech Inc Treatment with anti-ERBB2 antibodies.
JP2002514573A (ja) * 1998-05-08 2002-05-21 スローン − ケッタリング インスティチュート フォー キャンサー リサーチ 能動的なワクチン接種のための組成物および方法
GB9810040D0 (en) 1998-05-11 1998-07-08 Univ Nottingham Blood borne tumour markers
MY136203A (en) * 1998-08-11 2008-08-29 Idec Pharma Corp Combination therapies for b-cell lymphomas comprising administration of anti-cd20 antibody
US6573043B1 (en) * 1998-10-07 2003-06-03 Genentech, Inc. Tissue analysis and kits therefor
CA2350064C (en) * 1998-11-09 2012-05-08 Idec Pharmaceuticals Corporation Chimeric anti-cd20 antibody treatment of patients receiving bmt or pbsc transplants
EP1616572B1 (en) * 1998-11-09 2010-09-01 Biogen Idec Inc. Chimeric anti-CD20 antibody, rituxan, for use in the treatment of chronic lymphocytic leukemia
US6541214B1 (en) * 1998-11-13 2003-04-01 Oregon Heath Science University N-terminally truncated HER-2/neu protein as a cancer prognostic indicator
GB9827228D0 (en) 1998-12-10 1999-02-03 Univ Nottingham Cancer detection method and reagents
US7396810B1 (en) 2000-08-14 2008-07-08 Oregon Health Sciences University Compositions and methods for treating cancer by modulating HER-2 and EGF receptors
US7625859B1 (en) 2000-02-16 2009-12-01 Oregon Health & Science University HER-2 binding antagonists
US7393823B1 (en) 1999-01-20 2008-07-01 Oregon Health And Science University HER-2 binding antagonists
ATE425749T1 (de) 1999-01-27 2009-04-15 Cornell Res Foundation Inc Behandlung von mit her-2/neu-uberexprimierung einhergehendem krebs
MXPA01007721A (es) * 1999-01-29 2003-07-14 Corixa Corp Proteinas de fusion her-2/neu.
US7198920B1 (en) 1999-01-29 2007-04-03 Corika Corporation HER-2/neu fusion proteins
AU3755800A (en) * 1999-03-15 2000-10-04 Introgen Therapeutics, Inc. Dendritic cells transduced with a wild-type self gene elicit potent antitumor immune responses
EP1754488A1 (en) 1999-05-24 2007-02-21 Introgen Therapeutics, Inc. Methods and compositions for non-viral gene therapy for treatment of hyperproliferative diseases
EP1187849A1 (en) * 1999-05-25 2002-03-20 Human Genome Sciences, Inc. Meth1 and meth2 polynucleotides and polypeptides
CA2383493C (en) * 1999-06-25 2010-08-10 Genentech, Inc. Treating prostate cancer with anti-erbb2 antibodies
US20030086924A1 (en) * 1999-06-25 2003-05-08 Genentech, Inc. Treatment with anti-ErbB2 antibodies
US6949245B1 (en) * 1999-06-25 2005-09-27 Genentech, Inc. Humanized anti-ErbB2 antibodies and treatment with anti-ErbB2 antibodies
US7041292B1 (en) 1999-06-25 2006-05-09 Genentech, Inc. Treating prostate cancer with anti-ErbB2 antibodies
US20040013667A1 (en) * 1999-06-25 2004-01-22 Genentech, Inc. Treatment with anti-ErbB2 antibodies
WO2001008636A2 (en) * 1999-08-03 2001-02-08 The Ohio State University Polypeptides and polynucleotides for enhancing immune reactivity to her-2 protein
US8557244B1 (en) 1999-08-11 2013-10-15 Biogen Idec Inc. Treatment of aggressive non-Hodgkins lymphoma with anti-CD20 antibody
DE60042693D1 (de) * 1999-08-27 2009-09-17 Genentech Inc Dosierung für die behandlung mit anti erbb2-antikörpern
US20030157119A1 (en) * 1999-09-22 2003-08-21 Corixa Corporation Methods for diagnosis and therapy of hematological and virus-associated malignancies
AU7710300A (en) * 1999-09-22 2001-04-24 Corixa Corporation Methods for diagnosis and therapy of hematological and virus-associated malignancies
US7378096B2 (en) 1999-09-30 2008-05-27 Health Research, Inc. Stress protein compositions and methods for prevention and treatment of cancer and infectious disease
JP2003510334A (ja) * 1999-09-30 2003-03-18 コリクサ コーポレイション 癌及び感染症の予防及び治療のためのストレスタンパク質組成物及び方法
FR2801106B1 (fr) * 1999-11-12 2007-10-05 Commissariat Energie Atomique Procede de diagnostic d'une esst provoquee par une souche d'atnc dans un echantillon biologique et son utilisation dans le diagnostic differentiel des differentes souches d'atnc
CA2393738A1 (en) * 1999-12-10 2001-06-14 Epimmune Inc. Inducing cellular immune responses to her2/neu using peptide and nucleic acid compositions
WO2001048205A2 (en) * 1999-12-29 2001-07-05 Corixa Corporation Murine neu sequences and methods of use therefor
CA2398102A1 (en) * 2000-01-21 2001-07-26 Corixa Corporation Compounds and methods for prevention and treatment of her-2/neu associated malignancies
US6528060B1 (en) * 2000-03-16 2003-03-04 Genzyme Corporation Therapeutic compounds
EP1272633B1 (en) * 2000-03-30 2011-04-27 Dendreon Corporation Compositions and methods for dendritic cell-based immunotherapy
WO2001078766A1 (de) * 2000-04-13 2001-10-25 Bio Life Science Forschungs Und Entwicklungsgesellschaft Mbh Vakzine gegen krebserkrankungen, die sich auf mimotope von auf tumorzellen exprimierte antigenen stützt
EP1280923A2 (en) * 2000-04-28 2003-02-05 Millennium Pharmaceuticals, Inc. 14094, a human trypsin family member and uses thereof
JP2003534292A (ja) * 2000-05-19 2003-11-18 ジェネンテック・インコーポレーテッド Ｅｒｂｂアンタゴニスト癌治療に対する有効な応答の可能性を向上させるための遺伝子検出アッセイ
US10293056B1 (en) 2000-05-24 2019-05-21 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods and compositions for non-viral gene therapy for treatment of hyperproliferative diseases
US20030232399A1 (en) * 2000-06-14 2003-12-18 Robertson John Forsyth Russell Cancer detection methods and reagents
FR2812087B1 (fr) * 2000-07-21 2007-05-11 Inst Nat Sante Rech Med Procede de criblage de peptides utilisables en immunotherapie
US7229623B1 (en) 2000-08-03 2007-06-12 Corixa Corporation Her-2/neu fusion proteins
AU2001283360A1 (en) * 2000-08-14 2002-02-25 Corixa Corporation Methods for diagnosis and therapy of hematological and virus-associated malignancies
US20020193329A1 (en) * 2000-08-14 2002-12-19 Corixa Corporation Compositions and methods for the therapy and diagnosis of Her-2/neu-associated malignancies
PT1889630E (pt) 2000-10-18 2012-02-29 Glaxosmithkline Biolog Sa Vacinas compreendendo o antigénio mage ligado a um fragmento da proteína d
CA2429769C (en) * 2000-12-07 2016-04-26 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods of treatment involving human mda-7
US20040121946A9 (en) * 2000-12-11 2004-06-24 John Fikes Inducing cellular immune responses to her2/neu using peptide and nucleic acid compositions
US7906492B2 (en) * 2001-01-16 2011-03-15 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Therapy-enhancing glucan
US7507724B2 (en) * 2001-01-16 2009-03-24 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Therapy-enhancing glucan
US20040071671A1 (en) * 2001-02-20 2004-04-15 Leturcq Didier J. Cell therapy method for the treatment of tumors
EA013944B1 (ru) * 2001-02-20 2010-08-30 Орто-Макнейл Фармасьютикал, Инк. Способ получения неприродной антигенпрезентирующей клеточной линии и применение линии для лечения опухолей
EP1236740B1 (de) * 2001-02-28 2012-07-18 Bio Life Science Forschungs- und Entwicklungsges.m.b.H. Vakzine gegen Krebserkrankungen, die mit dem HER-2/neu Onkogen assoziiert sind
US7547759B2 (en) 2001-03-09 2009-06-16 Board Of Regents, The University Of Texas System Induction of tumor immunity by variants of folate binding protein
GB0109297D0 (en) 2001-04-12 2001-05-30 Glaxosmithkline Biolog Sa Vaccine
EP2305299B1 (en) 2001-05-31 2017-03-01 GlaxoSmithKline Biologicals SA Chimeric alphavirus replicon particles
ATE345812T1 (de) * 2001-09-03 2006-12-15 Bio Life Science Forschungs & Entwicklungsgesellschaft Mbh Antigen-mimotope und vakzine gegen krebserkrankungen
EP2131198B1 (en) 2001-09-20 2013-03-27 Board of Regents, The University of Texas System Measuring circulating therapeutic antibody, antigen and antigen/antibody complexes using ELISA assays
US20040009939A1 (en) * 2002-03-05 2004-01-15 Board Of Regent, The University Of Texas System Methods of enhancing immune induction involving MDA-7
EP1482963A4 (en) * 2002-03-08 2010-06-09 Univ Texas CONTROLLED MODULATION OF LATERAL CHAIN LENGTH OF AMINO ACIDS OF ANTIGENS PEPTIDES
US20050260208A1 (en) * 2002-04-11 2005-11-24 Altarex Medical Corp. Binding agents and their use in targeting tumor cells
US20050276812A1 (en) 2004-06-01 2005-12-15 Genentech, Inc. Antibody-drug conjugates and methods
US20040132097A1 (en) * 2002-06-19 2004-07-08 Bacus Sarah S. Method for predicting response to epidermal growth factor receptor-directed therapy
US20090110702A1 (en) 2002-07-12 2009-04-30 The Johns Hopkins University Mesothelin Vaccines and Model Systems and Control of Tumors
EP1575500A4 (en) 2002-07-12 2007-01-03 Univ Johns Hopkins MESOTHELIN VACCINE AND MODEL SYSTEMS
US9200036B2 (en) 2002-07-12 2015-12-01 The Johns Hopkins University Mesothelin vaccines and model systems
EP2269619A1 (en) 2002-08-12 2011-01-05 Jennerex Biotherapeutics ULC Methods and compositions concerning poxviruses and cancer
US20080019992A1 (en) * 2002-09-02 2008-01-24 Christoph Zielinski Antigen mimotopes and vaccine against cancerous diseases
CN1497255A (zh) * 2002-10-02 2004-05-19 ���µ�����ҵ��ʽ���� 被检测体用取样元件、被检测体处理装置及其处理方法
AU2003267077A1 (en) * 2002-11-12 2004-06-03 Millipore Corporation Evaporation control device for multiwell plates
GB2395270B (en) * 2002-11-14 2006-08-16 Univ Nottingham Tumour marker proteins and uses thereof
JP2006516117A (ja) * 2002-11-21 2006-06-22 ジェネンテック・インコーポレーテッド 抗ＥｒｂＢ２抗体を用いた非悪性疾病または疾患の治療
AU2003294023B2 (en) 2003-01-03 2008-01-31 Istituto Di Ricerche Di Biologia Molecolare P. Angeletti Spa Rhesus HER2/neu, nucleotides encoding same, and uses thereof
CA2514058C (en) * 2003-01-24 2014-05-13 Agensys, Inc. Nucleic acids and corresponding proteins entitled 254p1d6b useful in treatment and detection of cancer
CA2518150C (en) * 2003-03-03 2015-08-11 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods and compositions involving mda-7
CA2522812C (en) 2003-04-18 2012-08-21 Idm Pharma, Inc. Hla-a2 tumor associated antigen peptides and compositions
US20050239088A1 (en) * 2003-05-16 2005-10-27 Shepard H M Intron fusion proteins, and methods of identifying and using same
US7178491B2 (en) * 2003-06-05 2007-02-20 Caterpillar Inc Control system and method for engine valve actuator
ATE546153T1 (de) * 2003-06-17 2012-03-15 Mannkind Corp Kombinationen von tumor-assoziierten antigenen zur behandlung von verschiedenen krebstypen
CA2532460C (en) * 2003-07-21 2012-04-24 Istituto Di Ricerche Di Biologia Molecolare P. Angeletti S.P.A. Synthetic gene encoding human epidermal growth factor 2/neu antigen and uses thereof
GB0321615D0 (en) 2003-09-15 2003-10-15 Glaxo Group Ltd Improvements in vaccination
AU2004285477A1 (en) 2003-10-22 2005-05-12 Fred Hutchinson Cancer Research Center Methods, compositions and devices for inducing stasis in tissues and organs
BR122018071968B8 (pt) 2003-11-06 2021-07-27 Seattle Genetics Inc conjugado de anticorpo-droga, composição farmacêutica, artigo de manufatura e uso de um conjugado de anticorpo-droga
US8034790B2 (en) * 2003-12-01 2011-10-11 Introgen Therapeutics Use of MDA-7 to inhibit pathogenic infectious organisms
US20070281041A1 (en) * 2004-03-02 2007-12-06 Introgen Therapeutics, Inc. Compositions and Methods Involving MDA-7 for the Treatment of Cancer
JP2008506366A (ja) * 2004-05-14 2008-03-06 レセプター バイオロジックス インコーポレイテッド 細胞表面受容体アイソフォームならびにその同定および使用方法
EP2471924A1 (en) 2004-05-28 2012-07-04 Asuragen, INC. Methods and compositions involving microRNA
JP2008504292A (ja) 2004-06-24 2008-02-14 ノバルティス ヴァクシンズ アンド ダイアグノスティクス， インコーポレイテッド 免疫増強用の化合物
EP1768662A2 (en) 2004-06-24 2007-04-04 Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. Small molecule immunopotentiators and assays for their detection
US20100111856A1 (en) 2004-09-23 2010-05-06 Herman Gill Zirconium-radiolabeled, cysteine engineered antibody conjugates
NZ580115A (en) 2004-09-23 2010-10-29 Genentech Inc Cysteine engineered antibody light chains and conjugates
WO2006042002A2 (en) * 2004-10-05 2006-04-20 Oregon Health And Science University Compositions and methods for treating disease
MX2007004079A (es) * 2004-10-06 2007-06-15 Wellstat Biologics Corp Detecci??n de niveles elevados de prote??na her-2/neu en celulas cancerosas circulantes y tratamiento.
EP2302055B1 (en) 2004-11-12 2014-08-27 Asuragen, Inc. Methods and compositions involving miRNA and miRNA inhibitor molecules
US20060115862A1 (en) * 2004-11-17 2006-06-01 Duke University Anti-tenascin monoclonal antibody immunoassays and diagnostic kits
CN100381460C (zh) * 2004-11-30 2008-04-16 北京市肿瘤防治研究所 Her-2模拟抗原表位及含有该表位的肽
AU2005321904B2 (en) * 2004-12-29 2012-07-12 Mannkind Corporation Methods to elicit, enhance and sustain immune responses against MHC class I-restricted epitopes, for prophylactic or therapeutic purposes
CA2597329C (en) * 2005-02-08 2016-10-11 Board Of Regents, The University Of Texas System Compositions and methods involving mda-7 for the treatment of cancer
AU2006236150A1 (en) * 2005-04-20 2006-10-26 Fred Hutchinson Cancer Research Center Methods, compositions and articles of manufacture for enhancing survivability of cells, tissues, organs, and organisms
CN100398558C (zh) * 2005-05-10 2008-07-02 中国人民解放军军事医学科学院基础医学研究所 HER2/neu与Herstatin相互作用的活性片段及其编码基因与应用
WO2006124700A2 (en) * 2005-05-12 2006-11-23 Introgen Therapeutics, Inc. P53 vaccines for the treatment of cancers
US20090170769A1 (en) * 2005-05-13 2009-07-02 Pei Jin Cell surface receptor isoforms and methods of identifying and using the same
SI1889059T1 (sl) 2005-05-27 2009-12-31 Oncimmune Ltd Izboljšani imunotestni postopek
GB2426581A (en) * 2005-05-27 2006-11-29 Univ Nottingham Immunoassay methods
CA2612394C (en) * 2005-06-15 2017-02-21 The Ohio State University Research Foundation Her-2 peptides
JP5416968B2 (ja) 2005-06-17 2014-02-12 マンカインド コーポレイション 癌細胞及び腫瘍間質上に発現される優勢及び亜優勢エピトープに対する多価免疫応答を誘発するための方法及び組成物
GB0512751D0 (en) * 2005-06-22 2005-07-27 Glaxo Group Ltd New adjuvant
US8980246B2 (en) 2005-09-07 2015-03-17 Sillajen Biotherapeutics, Inc. Oncolytic vaccinia virus cancer therapy
CA2662798A1 (en) * 2005-09-07 2007-03-15 Receptor Logic, Ltd. Antibodies as t cell receptor mimics, methods of production and uses thereof
CA2621982C (en) * 2005-09-07 2017-11-28 Jennerex Biotherapeutics Ulc Systemic treatment of metastatic and/or systemically-disseminated cancers using gm-csf-expressing poxviruses
US8945573B2 (en) 2005-09-08 2015-02-03 The Henry M. Jackson Foundation For The Advancement Of Military Medicine, Inc. Targeted identification of immunogenic peptides
JP5424640B2 (ja) * 2005-09-08 2014-02-26 ザ ヘンリー エム．ジャクソン ファウンデイション フォー ザ アドバンスメント オブ ミリタリー メディスン，インコーポレイティド 免疫源性ペプチドの標的特異的同定方法
JP2009511636A (ja) 2005-10-18 2009-03-19 ノバルティス ヴァクシンズ アンド ダイアグノスティクス， インコーポレイテッド アルファウイルスレプリコン粒子による粘膜免疫および全身免疫
TWI457133B (zh) 2005-12-13 2014-10-21 Glaxosmithkline Biolog Sa 新穎組合物
US20090053221A1 (en) * 2006-01-17 2009-02-26 Cheung Nai-Kong V Immune response enhancing glucan
US8323644B2 (en) * 2006-01-17 2012-12-04 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Therapy-enhancing glucan
WO2007084661A2 (en) * 2006-01-17 2007-07-26 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Therapy-enhancing glucan
WO2007092944A2 (en) * 2006-02-08 2007-08-16 Introgen Therapeutics, Inc. Compositions and methods involving gene therapy and proteasome modulation
CA2647100A1 (en) * 2006-03-23 2007-09-27 Novartis Ag Methods for the preparation of imidazole-containing compounds
CA2646539A1 (en) * 2006-03-23 2007-09-27 Novartis Ag Imidazoquinoxaline compounds as immunomodulators
US8063063B2 (en) * 2006-03-23 2011-11-22 Novartis Ag Immunopotentiating compounds
US7517270B2 (en) * 2006-05-30 2009-04-14 Minds-I, Inc. Construction system
WO2008042495A2 (en) 2006-07-21 2008-04-10 Life Technologies Corporation Sharply resolving labeled protein molecular weight standards
US7972602B2 (en) * 2006-08-11 2011-07-05 Dendreon Corporation Promiscuous HER-2/Neu CD4 T cell epitopes
CN101632020B (zh) 2006-09-13 2013-11-27 昂西免疫有限公司 改进的免疫测定方法
CN102026645B (zh) 2006-09-15 2016-01-27 渥太华医院研究机构 溶瘤弹状病毒
AU2007299748A1 (en) 2006-09-19 2008-03-27 Asuragen, Inc. miR-15, miR-26, miR -31,miR -145, miR-147, miR-188, miR-215, miR-216 miR-331, mmu-miR-292-3p regulated genes and pathways as targets for therapeutic intervention
US20080075528A1 (en) * 2006-09-22 2008-03-27 Michael Marzetta Construction system
EP2084267B1 (en) * 2006-09-26 2018-04-11 Cedars-Sinai Medical Center Cancer stem cell antigen vaccines and methods
US8097256B2 (en) 2006-09-28 2012-01-17 Cedars-Sinai Medical Center Cancer vaccines and vaccination methods
US20080131878A1 (en) * 2006-12-05 2008-06-05 Asuragen, Inc. Compositions and Methods for the Detection of Small RNA
AU2007333106A1 (en) * 2006-12-08 2008-06-19 Asuragen, Inc. miR-20 regulated genes and pathways as targets for therapeutic intervention
US7935350B2 (en) * 2006-12-14 2011-05-03 Antigen Express, Inc. Ii-key/Her-2/neu hybrid cancer vaccine
US8889143B2 (en) 2006-12-14 2014-11-18 Antigen Express, Inc. Ii-key/HER-2/neu hybrid cancer vaccine
US7410225B1 (en) * 2007-03-14 2008-08-12 Minds-I, Inc. Multi-part links for endless track
KR20080084528A (ko) * 2007-03-15 2008-09-19 제네렉스 바이오테라퓨틱스 인크. 종양살상형 백시니아 바이러스 암 치료
JP2010525326A (ja) * 2007-04-19 2010-07-22 ウェルスタット バイオロジックス コーポレイション 分離されていない循環癌細胞由来のＨｅｒ−２／ｎｅｕタンパク質の上昇したレベルの検出および治療
MX2009012858A (es) 2007-06-01 2010-02-03 Jackson H M Found Military Med Vacuna para la prevencion de recaidas de cancer de seno.
US20090017716A1 (en) * 2007-07-11 2009-01-15 Michael Marzetta Construction system
US20090061456A1 (en) * 2007-08-30 2009-03-05 Allard William J Method for predicting progression free and overall survival at each follow-up time point during therapy of metastatic breast cancer patients using circulating tumor cells
EP2198050A1 (en) 2007-09-14 2010-06-23 Asuragen, INC. Micrornas differentially expressed in cervical cancer and uses thereof
US20090117532A1 (en) * 2007-11-01 2009-05-07 Doyle Gerald V Pre-clinical method for monitoring serial changes in circulating breast cancer cells in mice
WO2009059450A1 (en) * 2007-11-05 2009-05-14 Shanghai Jiaotong University Peptide ligand directed drug delivery
US7841923B2 (en) * 2007-11-13 2010-11-30 Minds-I, Inc. Vehicle axle joint for a toy vehicle
CA2706442C (en) * 2007-11-27 2017-07-11 Veridex, Llc Automated enumeration and characterization of circulating melanoma cells in blood
WO2009070805A2 (en) 2007-12-01 2009-06-04 Asuragen, Inc. Mir-124 regulated genes and pathways as targets for therapeutic intervention
US20090191535A1 (en) * 2007-12-22 2009-07-30 Mark Carle Connelly Method of assessing metastatic carcinomas from circulating endothelial cells and disseminated tumor cells
GB0725239D0 (en) * 2007-12-24 2008-02-06 Oncimmune Ltd Calibrator for autoantibody assay
US8258111B2 (en) 2008-05-08 2012-09-04 The Johns Hopkins University Compositions and methods related to miRNA modulation of neovascularization or angiogenesis
JP2010006705A (ja) * 2008-06-13 2010-01-14 Atlas Antibodies Ab Ｈｅｒ２サブセット
US9068020B2 (en) * 2008-09-02 2015-06-30 Cedars-Sinai Medical Center CD133 epitopes
WO2010068647A1 (en) 2008-12-10 2010-06-17 The Henry M. Jackson Foundation For The Advancement Of Military Medicine, Inc. Vaccine for the prevention of breast cancer recurrence
US20100234283A1 (en) 2009-02-04 2010-09-16 The Ohio State University Research Foundation Immunogenic epitopes, peptidomimetics, and anti-peptide antibodies, and methods of their use
US20110045080A1 (en) * 2009-03-24 2011-02-24 William Marsh Rice University Single-Walled Carbon Nanotube/Bioactive Substance Complexes and Methods Related Thereto
CA2761777A1 (en) * 2009-05-14 2010-11-18 Prometheus Laboratories Inc. Biomarkers for determining sensitivity of breast cancer cells to her2-targeted therapy
US20110065643A1 (en) 2009-06-12 2011-03-17 University Of Southern California Clusterin Pharmaceuticals and Treatment Methods Using the Same
AU2010292172A1 (en) 2009-09-09 2012-05-03 Centrose, Llc Extracellular targeted drug conjugates
ES2848650T3 (es) 2009-09-14 2021-08-11 Sillajen Biotherapeutics Inc Terapia combinada contra el cáncer con virus vaccinia oncolítico
AU2010329551B2 (en) 2009-12-10 2016-02-11 Turnstone Limited Partnership Oncolytic rhabdovirus
WO2011107100A1 (en) 2010-03-03 2011-09-09 Aarhus Universitet Methods and compositions for regulation of herv4
PE20130342A1 (es) 2010-04-15 2013-04-20 Spirogen Sarl Pirrolobenzodiacepinas y conjugados de las mismas
CN102933267B (zh) 2010-05-28 2015-05-27 泰特里斯在线公司 交互式混合异步计算机游戏基础结构
CA2798837A1 (en) 2010-06-07 2011-12-15 Pfizer Inc. Her-2 peptides and vaccines
CN114246952A (zh) 2010-06-08 2022-03-29 基因泰克公司 半胱氨酸改造的抗体和偶联物
JP5889912B2 (ja) 2010-11-17 2016-03-22 ジェネンテック， インコーポレイテッド アラニニルメイタンシノール抗体コンジュゲート
CN103429258B (zh) 2011-01-04 2016-03-09 新罗杰公司 通过施用溶瘤痘苗病毒生成针对肿瘤抗原的抗体和生成肿瘤特异性补体依赖性细胞毒性
WO2012106586A1 (en) 2011-02-03 2012-08-09 Mirna Therapeutics, Inc. Synthetic mimics of mir-124
JP2014506791A (ja) 2011-02-03 2014-03-20 マーナ セラピューティクス インコーポレイテッド ｍｉＲ−３４の合成模倣体
JP5987053B2 (ja) 2011-05-12 2016-09-06 ジェネンテック， インコーポレイテッド フレームワークシグネチャーペプチドを用いて動物サンプルにおける治療抗体を検出するための多重反応モニタリングｌｃ−ｍｓ／ｍｓ法
WO2012167382A1 (en) 2011-06-08 2012-12-13 Children's Hospital Of Eastern Ontario Research Institute Inc. Compositions and methods for glioblastoma treatment
AU2012294814A1 (en) 2011-08-05 2014-02-27 Research Development Foundation Improved methods and compositions for modulation of Olfml3 mediated angiogenesis
WO2013036201A1 (en) 2011-09-06 2013-03-14 Agency For Science, Technology And Research Polypeptide vaccine
WO2013040251A2 (en) 2011-09-13 2013-03-21 Asurgen, Inc. Methods and compositions involving mir-135b for distinguishing pancreatic cancer from benign pancreatic disease
PT2750713E (pt) 2011-10-14 2016-01-20 Genentech Inc Pirrolobenzodiazepinas e conjugados das mesmas
CA2864841C (en) * 2012-02-17 2020-07-07 Keith L. Knutson Methods and materials for generating cd8+ t cells having the ability to recognize cancer cells expressing a her2/neu polypeptide
WO2013130093A1 (en) 2012-03-02 2013-09-06 Genentech, Inc. Biomarkers for treatment with anti-tubulin chemotherapeutic compounds
US20150283233A1 (en) 2012-06-15 2015-10-08 Gencia Corporation Compositions and Methods for Enhancing Immune Responses
UA114108C2 (uk) 2012-07-10 2017-04-25 Борд Оф Ріджентс, Дзе Юніверсіті Оф Техас Сістем Моноклональне антитіло для застосування в діагностиці і терапії злоякісних пухлин і аутоімунного захворювання
JP6270859B2 (ja) 2012-10-12 2018-01-31 エイディーシー・セラピューティクス・エス・アー・エール・エルＡｄｃ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ Ｓａｒｌ ピロロベンゾジアゼピン−抗体結合体
KR101995621B1 (ko) 2012-10-12 2019-07-03 에이디씨 테라퓨틱스 에스에이 피롤로벤조디아제핀-항-cd22 항체 컨주게이트
RS53818B1 (en) 2012-10-12 2015-06-30 Spirogen Sàrl PIROLOBENZODIAZEPINI I NJIHOVI conjugated
WO2014057120A1 (en) 2012-10-12 2014-04-17 Adc Therapeutics Sàrl Pyrrolobenzodiazepine-antibody conjugates
CA2887895C (en) 2012-10-12 2019-10-29 Adc Therapeutics Sarl Pyrrolobenzodiazepine-anti-cd19 antibody conjugates
PT2906296T (pt) 2012-10-12 2018-06-01 Medimmune Ltd Conjugados de pirrolobenzodiazepina-anticorpo
ES2680153T3 (es) 2012-10-12 2018-09-04 Adc Therapeutics Sa Conjugados de anticuerpos anti-PSMA-pirrolobenzodiazepinas
DK2912064T3 (da) 2012-10-24 2019-07-22 Res Found Dev Jam-c-antistoffer og fremgangsmåder til behandling af cancer
CN105246894A (zh) 2012-12-21 2016-01-13 斯皮罗根有限公司 用于治疗增殖性和自身免疫疾病的非对称吡咯并苯并二氮杂卓二聚物
CN110452242A (zh) 2012-12-21 2019-11-15 麦迪穆有限责任公司 吡咯并苯并二氮杂卓及其结合物
WO2014127296A1 (en) 2013-02-14 2014-08-21 Immunocellular Therapeutics, Ltd Cancer vaccines and vaccination methods
RU2684211C2 (ru) 2013-02-21 2019-04-04 Тёрнстоун Лимитед Партнершип Композиция вакцины
CA2905181C (en) 2013-03-13 2020-06-02 Medimmune Limited Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof for providing targeted therapy
KR102057755B1 (ko) 2013-03-13 2019-12-19 메디뮨 리미티드 피롤로벤조디아제핀 및 그의 컨쥬게이트
JP6340019B2 (ja) 2013-03-13 2018-06-06 メドイミューン・リミテッドＭｅｄＩｍｍｕｎｅ Ｌｉｍｉｔｅｄ ピロロベンゾジアゼピン及びそのコンジュゲート
KR20160042080A (ko) 2013-08-12 2016-04-18 제넨테크, 인크. 1-(클로로메틸)-2,3-디히드로-1H-벤조[e]인돌 이량체 항체-약물 접합체 화합물, 및 사용 및 치료 방법
CA2921401A1 (en) 2013-08-14 2015-02-19 William Marsh Rice University Derivatives of uncialamycin, methods of synthesis and their use as antitumor agents
EP3036005A4 (en) 2013-08-21 2017-04-26 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Compositions and methods for targeting connexin hemichannels
EP3039137B1 (en) 2013-08-29 2019-07-31 Board of Regents, The University of Texas System Engineered primate cystine/cysteine degrading enzymes as antineogenic agents
CN105722522B (zh) 2013-08-30 2021-10-19 得克萨斯大学体系董事会 用于肿瘤疗法的犬尿氨酸耗竭酶的施用
US9956299B2 (en) 2013-10-11 2018-05-01 Medimmune Limited Pyrrolobenzodiazepine—antibody conjugates
US9950078B2 (en) 2013-10-11 2018-04-24 Medimmune Limited Pyrrolobenzodiazepine-antibody conjugates
EP3054983B1 (en) 2013-10-11 2019-03-20 Medimmune Limited Pyrrolobenzodiazepine-antibody conjugates
GB201317982D0 (en) 2013-10-11 2013-11-27 Spirogen Sarl Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof
SI3076949T1 (sl) 2013-12-04 2020-01-31 Board Of Regents, The University Of Texas System Postopek za izoliranje eksosomov, ki izvirajo iz rakavih celic
JP6671292B2 (ja) 2013-12-16 2020-03-25 ジェネンテック， インコーポレイテッド ペプチド模倣化合物及びその抗体−薬物コンジュゲート
WO2015095212A1 (en) 2013-12-16 2015-06-25 Genentech, Inc. 1-(chloromethyl)-2,3-dihydro-1h-benzo[e]indole dimer antibody-drug conjugate compounds, and methods of use and treatment
MX2016007826A (es) 2013-12-16 2017-03-31 Genentech Inc Compuestos peptidomimeticos y sus conjugados de anticuerpo-farmaco.
JP7080053B2 (ja) 2014-08-29 2022-06-03 ボード オブ リージェンツ，ザ ユニバーシティ オブ テキサス システム 腫瘍の治療のための、キヌレニンを枯渇させる酵素の投与
WO2016033105A1 (en) 2014-08-29 2016-03-03 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Novel capsazepine analogs for the treatment of cancer and other proliferative diseases
WO2016037644A1 (en) 2014-09-10 2016-03-17 Medimmune Limited Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof
KR20170052600A (ko) 2014-09-12 2017-05-12 제넨테크, 인크. 시스테인 가공된 항체 및 콘주게이트
GB201416112D0 (en) 2014-09-12 2014-10-29 Medimmune Ltd Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof
EP3191134B1 (en) 2014-09-12 2019-11-20 Genentech, Inc. Anthracycline disulfide intermediates, antibody-drug conjugates and methods
CA2959689A1 (en) 2014-09-17 2016-03-24 Genentech, Inc. Pyrrolobenzodiazepines and antibody disulfide conjugates thereof
EP3223854A1 (en) 2014-11-25 2017-10-04 ADC Therapeutics SA Pyrrolobenzodiazepine-antibody conjugates
CN107206101B (zh) 2014-12-03 2021-06-25 基因泰克公司 季铵化合物及其抗体-药物缀合物
JP6724023B2 (ja) 2015-02-09 2020-07-15 リサーチ ディベロップメント ファウンデーション 改善された補体活性化を示す操作された免疫グロブリンｆｃポリペプチド
AU2016226133B2 (en) 2015-03-04 2021-12-02 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods of treating cancer harboring hemizygous loss of TP53
CA2979676A1 (en) * 2015-03-13 2016-09-29 Brian J. Czerniecki Methods for monitoring cd4+ t-helper type 1 response in cancer and immune restoration
US20180171294A1 (en) * 2015-03-26 2018-06-21 The Trustees Of The University Of Pennsylvania In vitro artificial lymph node method for sensitization and expansion of t cells for therapy and epitope mapping
GB201506402D0 (en) 2015-04-15 2015-05-27 Berkel Patricius H C Van And Howard Philip W Site-specific antibody-drug conjugates
GB201506411D0 (en) 2015-04-15 2015-05-27 Bergenbio As Humanized anti-axl antibodies
CN107206061A (zh) * 2015-05-22 2017-09-26 布莱恩·J·赫尔尼奇 多剂量注射用树突状细胞疫苗的制备,用于阻断her2和her3的联合治疗和雌激素受体阳性her2乳腺癌治疗
US9993538B2 (en) 2015-05-29 2018-06-12 Galena Biopharma, Inc. Peptide vaccine therapy for treatment of FRα-expressing tumors
JP2018520125A (ja) 2015-06-10 2018-07-26 ボード・オブ・リージエンツ，ザ・ユニバーシテイ・オブ・テキサス・システム 疾患の処置のためのエキソソームの使用
RU2612015C2 (ru) * 2015-06-29 2017-03-01 Общество с ограниченной ответственностью "Сибинтех" Пептид-иммуноген, используемый в терапевтической вакцине для лечения метастатического рака молочной железы у кошек и собак
WO2017019829A1 (en) 2015-07-28 2017-02-02 Board Of Regents, The University Of Texas System Implant compositions for the unidirectional delivery of therapeutic compounds to the brain
WO2017040380A2 (en) 2015-08-28 2017-03-09 Research Development Foundation Engineered antibody fc variants
MA43345A (fr) 2015-10-02 2018-08-08 Hoffmann La Roche Conjugués anticorps-médicaments de pyrrolobenzodiazépine et méthodes d'utilisation
US9744187B2 (en) 2015-10-14 2017-08-29 Bio-Path Holdings, Inc. p-Ethoxy nucleic acids for liposomal formulation
MA43354A (fr) 2015-10-16 2018-08-22 Genentech Inc Conjugués médicamenteux à pont disulfure encombré
RU2624862C2 (ru) * 2015-10-20 2017-07-07 Общество с ограниченной ответственностью "Эпитек" Пептид-иммуноген, используемый в терапевтической вакцине для лечения метастатического рака молочной железы
MA45326A (fr) 2015-10-20 2018-08-29 Genentech Inc Conjugués calichéamicine-anticorps-médicament et procédés d'utilisation
WO2017079746A2 (en) 2015-11-07 2017-05-11 Multivir Inc. Methods and compositions comprising tumor suppressor gene therapy and immune checkpoint blockade for the treatment of cancer
CA3004438A1 (en) 2015-11-09 2017-05-18 The Children's Hospital Of Philadelphia Glypican 2 as a cancer marker and therapeutic target
EP3383908A1 (en) 2015-12-02 2018-10-10 Stsciences, Inc. Antibodies specific to glycosylated btla (b- and t- lymphocyte attenuator)
EP3909983A1 (en) 2015-12-02 2021-11-17 STCube & Co. Inc. Antibodies and molecules that immunospecifically bind to btn1a1 and the therapeutic uses thereof
GB201601431D0 (en) 2016-01-26 2016-03-09 Medimmune Ltd Pyrrolobenzodiazepines
GB201602359D0 (en) 2016-02-10 2016-03-23 Medimmune Ltd Pyrrolobenzodiazepine Conjugates
GB201602356D0 (en) 2016-02-10 2016-03-23 Medimmune Ltd Pyrrolobenzodiazepine Conjugates
US10889637B2 (en) 2016-02-26 2021-01-12 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Methods of treating an osteolytic tumor and spinal cord injury by administering connexin (Cx) 43 hemichannel-binding antibodies
JP2019511483A (ja) 2016-03-02 2019-04-25 ザ ボード オブ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティー オブ テキサス システム 免疫療法のためのｓｔｉｎｇ活性化ナノワクチン
JP6943872B2 (ja) 2016-03-25 2021-10-06 ジェネンテック， インコーポレイテッド 多重全抗体及び抗体複合体化薬物定量化アッセイ
WO2017172517A1 (en) 2016-03-29 2017-10-05 Stcube & Co., Inc. Methods for selecting antibodies that specifically bind glycosylated immune checkpoint proteins
US11660352B2 (en) 2016-03-29 2023-05-30 Stcube, Inc. Dual function antibodies specific to glycosylated PD-L1 and methods of use thereof
WO2017176076A1 (en) 2016-04-06 2017-10-12 Ewha University - Industry Collaboration Foundation A peptide with ability to penetrate cell membrane
GB201607478D0 (en) 2016-04-29 2016-06-15 Medimmune Ltd Pyrrolobenzodiazepine Conjugates
JP7131773B2 (ja) 2016-04-29 2022-09-06 ボード オブ リージェンツ，ザ ユニバーシティ オブ テキサス システム ホルモン受容体に関連する転写活性の標的尺度
PL3458101T3 (pl) 2016-05-20 2021-05-31 F. Hoffmann-La Roche Ag Koniugaty PROTAC-przeciwciało i sposoby ich stosowania
US20170370906A1 (en) 2016-05-27 2017-12-28 Genentech, Inc. Bioanalytical analysis of site-specific antibody drug conjugates
EP3463438B1 (en) 2016-05-31 2022-04-06 The Henry M. Jackson Foundation for the Advancement of Military Medicine, Inc. Vaccine therapy for treatment of endometrial and ovarian cancer
KR20190034160A (ko) * 2016-06-03 2019-04-01 이투빅스 코포레이션 Her2/neu 가 관련되는 종양 백신화 및 면역요법을 위한 조성물 및 방법
US10639378B2 (en) 2016-06-06 2020-05-05 Genentech, Inc. Silvestrol antibody-drug conjugates and methods of use
CA3028771A1 (en) 2016-07-06 2018-01-11 Board Of Regents, The University Of Texas System Human-enzyme mediated depletion of cystine for treating patients with cystinuria
KR20190031299A (ko) 2016-07-20 2019-03-25 주식회사 에스티큐브 글리코실화된 pd-l1에 결합하는 항체의 조합을 사용하는 암 치료 방법
CN109689111B (zh) 2016-08-11 2024-04-05 基因泰克公司 吡咯并苯并二氮杂䓬前药及其抗体缀合物
WO2018035429A1 (en) 2016-08-18 2018-02-22 Wisconsin Alumni Research Foundation Peptides that inhibit syndecan-1 activation of vla-4 and igf-1r
MX2019003070A (es) 2016-09-16 2019-10-14 Bio Path Holdings Inc Terapia de combinacion con oligonucleotidos antisentido liposomales.
CN110139674B (zh) 2016-10-05 2023-05-16 豪夫迈·罗氏有限公司 制备抗体药物缀合物的方法
GB201617466D0 (en) 2016-10-14 2016-11-30 Medimmune Ltd Pyrrolobenzodiazepine conjugates
CA3043356A1 (en) 2016-11-09 2018-05-17 Musc Foundation For Research Development Cd38-nad+ regulated metabolic axis in anti-tumor immunotherapy
WO2018111902A1 (en) 2016-12-12 2018-06-21 Multivir Inc. Methods and compositions comprising viral gene therapy and an immune checkpoint inhibitor for treatment and prevention of cancer and infectious diseases
GB201702031D0 (en) 2017-02-08 2017-03-22 Medlmmune Ltd Pyrrolobenzodiazepine-antibody conjugates
US11160872B2 (en) 2017-02-08 2021-11-02 Adc Therapeutics Sa Pyrrolobenzodiazepine-antibody conjugates
WO2018156973A1 (en) 2017-02-24 2018-08-30 Board Of Regents, The University Of Texas System Assay for detection of early stage pancreatic cancer
CN110582505B (zh) 2017-04-18 2021-04-02 免疫医疗有限公司 吡咯并苯并二氮杂*缀合物
CN110536703A (zh) 2017-04-20 2019-12-03 Adc治疗有限公司 使用抗axl抗体-药物缀合物的组合疗法
WO2018209211A1 (en) 2017-05-12 2018-11-15 Board Of Regents, The University Of Texas System Engineered primate cystine/cysteine degrading enzymes for therapeutic uses
MX2019013458A (es) 2017-05-12 2020-01-15 Univ Texas Disminucion de homocisteina mediada por enzimas humanas para el tratamiento de pacientes con hiperhomocisteinemia y homocistinuria.
JP2020522512A (ja) 2017-05-31 2020-07-30 ストキューブ アンド シーオー．， インコーポレイテッド Ｂｔｎ１ａ１に免疫特異的に結合する抗体及び分子を用いて癌を治療する方法
JP7369038B2 (ja) 2017-05-31 2023-10-25 ストキューブ アンド シーオー．， インコーポレイテッド Ｂｔｎ１ａ１に免疫特異的に結合する抗体及び分子並びにその治療的使用
JP2020522562A (ja) 2017-06-06 2020-07-30 ストキューブ アンド シーオー．， インコーポレイテッド Ｂｔｎ１ａ１又はｂｔｎ１ａ１リガンドに結合する抗体及び分子を用いて癌を治療する方法
US11318211B2 (en) 2017-06-14 2022-05-03 Adc Therapeutics Sa Dosage regimes for the administration of an anti-CD19 ADC
SI3668874T1 (sl) 2017-08-18 2022-04-29 Medimmune Limited Pirolobenzodiazepinski konjugati
RU2020113749A (ru) 2017-09-20 2021-10-20 пиЭйч ФАРМА Ко., ЛТД. Аналоги таиланстатина
US11525002B2 (en) 2017-10-11 2022-12-13 Board Of Regents, The University Of Texas System Human PD-L1 antibodies and methods of use therefor
GB201803342D0 (en) 2018-03-01 2018-04-18 Medimmune Ltd Methods
EP3768698A4 (en) 2018-03-19 2022-03-30 MultiVir Inc. METHODS AND COMPOSITIONS COMPRISING TUMOR SUPPRESSIVE GENE THERAPY AND CD122/CD132 AGONISTS FOR THE TREATMENT OF CANCER
WO2019182896A1 (en) 2018-03-23 2019-09-26 Board Of Regents, The University Of Texas System Dual specificity antibodies to pd-l1 and pd-l2 and methods of use therefor
EP3773551A4 (en) 2018-03-27 2022-03-23 Board of Regents, The University of Texas System COMPOUNDS WITH ANTITUMOR ACTIVITY AGAINST CANCER CELLS CARRYING HER2 EXON 19 MUTATIONS
GB201806022D0 (en) 2018-04-12 2018-05-30 Medimmune Ltd Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof
CN108624589B (zh) * 2018-04-17 2021-12-17 广州永诺生物科技有限公司 环状RNA circ-ERBB2及其检测试剂与应用
CN108715603A (zh) * 2018-06-08 2018-10-30 天津亨佳生物科技发展有限公司 一种治疗肿瘤的抗原肽链组及其在药物中的应用
CN108484732A (zh) * 2018-06-08 2018-09-04 天津亨佳生物科技发展有限公司 一种治疗肿瘤的抗原肽链组及其在药物中的应用
GB201814281D0 (en) 2018-09-03 2018-10-17 Femtogenix Ltd Cytotoxic agents
AU2019365238A1 (en) 2018-10-24 2021-05-13 F. Hoffmann-La Roche Ag Conjugated chemical inducers of degradation and methods of use
US20220033848A1 (en) 2018-11-19 2022-02-03 Board Of Regents, The University Of Texas System A modular, polycistronic vector for car and tcr transduction
WO2020113029A2 (en) 2018-11-28 2020-06-04 Board Of Regents, The University Of Texas System Multiplex genome editing of immune cells to enhance functionality and resistance to suppressive environment
BR112021010248A2 (pt) 2018-11-29 2021-08-17 Board Of Regents, The University Of Texas System métodos para expansão ex vivo de células naturais killer e uso dos mesmos
EP3894427A1 (en) 2018-12-10 2021-10-20 Genentech, Inc. Photocrosslinking peptides for site specific conjugation to fc-containing proteins
GB201901197D0 (en) 2019-01-29 2019-03-20 Femtogenix Ltd G-A Crosslinking cytotoxic agents
JP2022519718A (ja) 2019-02-08 2022-03-24 ボード オブ リージェンツ，ザ ユニバーシティ オブ テキサス システム 加齢および加齢性臓器不全に関連する疾患の処置のためのテロメラーゼ含有エキソソーム
CA3138348A1 (en) 2019-05-09 2020-11-12 FUJIFILM Cellular Dynamics, Inc. Methods for the production of hepatocytes
TW202110431A (zh) 2019-05-17 2021-03-16 美商癌症預防製藥股份有限公司 治療家族性腺瘤性瘜肉症之方法
JP2022541538A (ja) 2019-07-19 2022-09-26 ザ・チルドレンズ・ホスピタル・オブ・フィラデルフィア グリピカン２結合ドメインを含有するキメラ抗原受容体
WO2021050953A1 (en) 2019-09-13 2021-03-18 Elektrofi, Inc. Compositions and methods for the delivery of therapeutic biologics for treatment of disease
CN114729045A (zh) 2019-09-26 2022-07-08 斯特库比公司 对糖基化的ctla-4特异性的抗体及其使用方法
EP4041768A1 (en) 2019-10-09 2022-08-17 StCube & Co. Antibodies specific to glycosylated lag3 and methods of use thereof
US20220380765A1 (en) 2019-11-02 2022-12-01 Board Of Regents, The University Of Texas System Targeting nonsense-mediated decay to activate p53 pathway for the treatment of cancer
WO2021113644A1 (en) 2019-12-05 2021-06-10 Multivir Inc. Combinations comprising a cd8+ t cell enhancer, an immune checkpoint inhibitor and radiotherapy for targeted and abscopal effects for the treatment of cancer
KR20220124718A (ko) 2020-01-07 2022-09-14 더 보드 오브 리젠츠 오브 더 유니버시티 오브 텍사스 시스템 암 치료를 위한 개선된 인간 메틸 티오아데노신/아데노신 고갈 효소 변이체
EP4107173A1 (en) 2020-02-17 2022-12-28 Board of Regents, The University of Texas System Methods for expansion of tumor infiltrating lymphocytes and use thereof
EP4153301A2 (en) 2020-05-21 2023-03-29 Board of Regents, The University of Texas System T cell receptors with vgll1 specificity and uses thereof
WO2021247836A1 (en) 2020-06-03 2021-12-09 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods for targeting shp-2 to overcome resistance
EP4172370A1 (en) 2020-06-30 2023-05-03 Lunglife Ai, Inc. Methods for detecting lung cancer
GB2597532A (en) 2020-07-28 2022-02-02 Femtogenix Ltd Cytotoxic compounds
WO2022104109A1 (en) 2020-11-13 2022-05-19 Catamaran Bio, Inc. Genetically modified natural killer cells and methods of use thereof
US20220162288A1 (en) 2020-11-25 2022-05-26 Catamaran Bio, Inc. Cellular therapeutics engineered with signal modulators and methods of use thereof
CN117529338A (zh) 2021-01-19 2024-02-06 威廉马歇莱思大学 多肽的骨特异性递送
GB2603166A (en) 2021-01-29 2022-08-03 Thelper As Therapeutic and Diagnostic Agents and Uses Thereof
IL310550A (en) 2021-08-04 2024-03-01 Univ Colorado Regents LAT-activating chimeric antigen receptor T cells and methods of using them
CN115925875A (zh) * 2021-08-20 2023-04-07 百奥赛图(北京)医药科技股份有限公司 Her2基因人源化非人动物及其构建方法和应用
CA3234457A1 (en) 2021-10-05 2023-04-13 Cytovia Therapeutics, Llc Natural killer cells and methods of use thereof
CN113699221B (zh) * 2021-10-19 2023-10-10 广州吉赛医疗科技有限公司 HER2 mRNA及环状RNA多重荧光定量PCR检测引物探针及其应用
WO2023068382A2 (en) 2021-10-20 2023-04-27 Takeda Pharmaceutical Company Limited Compositions targeting bcma and methods of use thereof
WO2023076880A1 (en) 2021-10-25 2023-05-04 Board Of Regents, The University Of Texas System Foxo1-targeted therapy for the treatment of cancer
CN114262689A (zh) * 2021-12-17 2022-04-01 上海纳米技术及应用国家工程研究中心有限公司 一种快速检测cd19/cd20-car-t细胞活性的方法
GB202201137D0 (en) 2022-01-28 2022-03-16 Thelper As Therapeutic and diagnostic agents and uses thereof
WO2023172514A1 (en) 2022-03-07 2023-09-14 Catamaran Bio, Inc. Engineered immune cell therapeutics targeted to her2 and methods of use thereof
WO2023192976A1 (en) 2022-04-01 2023-10-05 Board Of Regents, The University Of Texas System Dual specificity antibodies to human pd-l1 and pd-l2 and methods of use therefor
WO2023211972A1 (en) 2022-04-28 2023-11-02 Medical University Of South Carolina Chimeric antigen receptor modified regulatory t cells for treating cancer
WO2023220083A1 (en) 2022-05-09 2023-11-16 Flagship Pioneering Innovations Vi, Llc Trem compositions and methods of use for treating proliferative disorders
WO2023230531A1 (en) 2022-05-24 2023-11-30 Lunglife Ai, Inc. Methods for detecting circulating genetically abnormal cells
US20240010742A1 (en) 2022-06-10 2024-01-11 Research Development Foundation Engineered fcriib selective igg1 fc variants and uses thereof

Family Cites Families (24)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
NL154600B (nl) * 1971-02-10 1977-09-15 Organon Nv Werkwijze voor het aantonen en bepalen van specifiek bindende eiwitten en hun corresponderende bindbare stoffen.
NL154598B (nl) * 1970-11-10 1977-09-15 Organon Nv Werkwijze voor het aantonen en bepalen van laagmoleculire verbindingen en van eiwitten die deze verbindingen specifiek kunnen binden, alsmede testverpakking.
US3817837A (en) * 1971-05-14 1974-06-18 Syva Corp Enzyme amplification assay
US3901654A (en) * 1971-06-21 1975-08-26 Biological Developments Receptor assays of biologically active compounds employing biologically specific receptors
US3766162A (en) * 1971-08-24 1973-10-16 Hoffmann La Roche Barbituric acid antigens and antibodies specific therefor
US3935074A (en) * 1973-12-17 1976-01-27 Syva Company Antibody steric hindrance immunoassay with two antibodies
US3996345A (en) * 1974-08-12 1976-12-07 Syva Company Fluorescence quenching with immunological pairs in immunoassays
US4034074A (en) * 1974-09-19 1977-07-05 The Board Of Trustees Of Leland Stanford Junior University Universal reagent 2-site immunoradiometric assay using labelled anti (IgG)
US3984533A (en) * 1975-11-13 1976-10-05 General Electric Company Electrophoretic method of detecting antigen-antibody reaction
US4098876A (en) * 1976-10-26 1978-07-04 Corning Glass Works Reverse sandwich immunoassay
US4233402A (en) * 1978-04-05 1980-11-11 Syva Company Reagents and method employing channeling
US4452901A (en) * 1980-03-20 1984-06-05 Ciba-Geigy Corporation Electrophoretically transferring electropherograms to nitrocellulose sheets for immuno-assays
US7838216B1 (en) * 1986-03-05 2010-11-23 The United States Of America, As Represented By The Department Of Health And Human Services Human gene related to but distinct from EGF receptor gene
US5401638A (en) * 1986-06-04 1995-03-28 Oncogene Science, Inc. Detection and quantification of neu related proteins in the biological fluids of humans
CA2055441C (en) * 1989-05-19 2003-01-07 Robert M. Hudziak Her2 extracellular domain
EP0444181B2 (en) * 1989-08-04 2010-11-24 Bayer Schering Pharma Aktiengesellschaft C-erbb-2 external domain: gp75
JP2552047B2 (ja) * 1990-01-26 1996-11-06 ワシントン リサーチ ファウンデーション 悪性腫瘍の検査方法
US5958784A (en) * 1992-03-25 1999-09-28 Benner; Steven Albert Predicting folded structures of proteins
ATE466869T1 (de) * 1993-03-05 2010-05-15 Epimmune Inc Verfahren zur herstellung von immunogenen hla- a2.1-bindenden peptiden
US5550214A (en) * 1994-02-10 1996-08-27 Brigham And Women's Hospital Isolated antigenic oncogene peptide fragments and uses
AU712441B2 (en) * 1994-12-14 1999-11-04 Scripps Research Institute, The In vivo activation of tumor-specific cytotoxic T cells
US6514942B1 (en) * 1995-03-14 2003-02-04 The Board Of Regents, The University Of Texas System Methods and compositions for stimulating T-lymphocytes
US5840839A (en) * 1996-02-09 1998-11-24 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Alternative open reading frame DNA of a normal gene and a novel human cancer antigen encoded therein
FR2812087B1 (fr) * 2000-07-21 2007-05-11 Inst Nat Sante Rech Med Procede de criblage de peptides utilisables en immunotherapie

Also Published As

Publication number Publication date
MX9707501A (es) 1998-06-30
RU2236461C2 (ru) 2004-09-20
US5801005A (en) 1998-09-01
US7247703B2 (en) 2007-07-24
NZ306616A (en) 2001-03-30
CA2216601C (en) 2002-10-22
US6664370B2 (en) 2003-12-16
AU5522296A (en) 1996-10-16
JP4510147B2 (ja) 2010-07-21
EP0817846B1 (en) 2005-07-06
CN1150318C (zh) 2004-05-19
EP1418235A2 (en) 2004-05-12
JP2008056679A (ja) 2008-03-13
CN1597953A (zh) 2005-03-23
PT817846E (pt) 2005-11-30
KR19980703453A (ko) 1998-11-05
NO321941B1 (no) 2006-07-24
US20020055614A1 (en) 2002-05-09
DE69634912T2 (de) 2006-04-20
AU708237B2 (en) 1999-07-29
US6075122A (en) 2000-06-13
EP1418235A3 (en) 2004-08-11
ES2245783T3 (es) 2006-01-16
DE69634912D1 (de) 2005-08-11
US20080076904A1 (en) 2008-03-27
HUP9801826A2 (hu) 1998-11-30
BR9607889A (pt) 1999-08-10
CN1183117A (zh) 1998-05-27
US7655239B2 (en) 2010-02-02
ATE299180T1 (de) 2005-07-15
KR100554186B1 (ko) 2007-04-11
NO974502D0 (no) 1997-09-29
CA2216601A1 (en) 1996-10-03
EP0817846A1 (en) 1998-01-14
HUP9801826A3 (en) 2000-12-28
US5726023A (en) 1998-03-10
DK0817846T3 (da) 2005-11-07
NO974502L (no) 1997-11-27
US5876712A (en) 1999-03-02
RU2004115492A (ru) 2005-11-10
CZ309697A3 (cs) 1998-01-14
CN1951398A (zh) 2007-04-25
JPH11502710A (ja) 1999-03-09
US20040082758A1 (en) 2004-04-29
NO20061723L (no) 1996-10-01
WO1996030514A1 (en) 1996-10-03
CZ296618B6 (cs) 2006-05-17
US5846538A (en) 1998-12-08
US20100087621A1 (en) 2010-04-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CA2216601C (en) Intracellular domain of the her-2/neu protein for prevention or treatment of malignancies
US5869445A (en) Methods for eliciting or enhancing reactivity to HER-2/neu protein
JP5164300B2 (ja) ＨＥＲ−２／ｎｅｕ融合タンパク質
CA2349442C (en) Compositions and methods for wt1 specific immunotherapy
US7063854B1 (en) Composition and methods for WTI specific immunotherapy
US20020039573A1 (en) Compounds and methods for prevention and treatment of HER-2/neu associated malignancies
JP2004521609A (ja) Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ融合タンパク質
MXPA03002983A (es) Composiciones y metodos `para la inmunoterapia especifica de wt1.
KR20020007348A (ko) 유방암의 치료 및 진단용 조성물 및 이의 사용 방법
US7901693B2 (en) Compositions and methods for WT1 specific immunotherapy
US8524491B2 (en) Compounds for eliciting or enhancing immune reactivity to HER-2/neu protein for prevention or treatment of malignancies in which the HER-2/neu oncogene is associated
JP2002540789A (ja) 乳癌の処置および診断のための組成物ならびにそれらの使用方法
US20030228325A1 (en) Isolated peptides which bind to HLA-B18 molecules and uses thereof
MXPA97007501A (en) Intracellular domain of protein her-2 / neu for the prevention or treatment of malignida

Legal Events

Date Code Title Description
PD00 Pending as of 2000-06-30 in czech republic
MM4A Patent lapsed due to non-payment of fee

Effective date: 20090328