JP2022519718A - 加齢および加齢性臓器不全に関連する疾患の処置のためのテロメラーゼ含有エキソソーム - Google Patents

Abstract

本明細書において、治療用のアンチエイジング剤を含む脂質に基づくナノ粒子（例えば、エキソソーム）の組成物が提供される。さらに、加齢関連障害を有する患者を処置するためのそのような組成物の使用方法も提供される。特に、テロメラーゼをコードしているＲＮＡを含むエキソソーム、ならびに加齢関連障害の処置におけるその使用方法が提供される。一実施形態において、本明細書において、テロメラーゼ複合体の活性を増強させる治療剤カーゴを含む脂質に基づくナノ粒子を含む組成物が提供される。いくつかの態様において、前記脂質に基づくナノ粒子は、その表面上にＣＤ４７を含む。いくつかの態様において、前記脂質に基づくナノ粒子は、その表面上に増殖因子を含む。いくつかの態様において、前記脂質に基づくナノ粒子は、リポソームまたはエキソソームである。

Description

関連出願への相互参照
本出願は、２０１９年２月８日に出願された米国仮出願第６２／８０３，０２３号に対する優先権を主張し、その内容全体が参照により本明細書に援用される。

本発明は、一般に医薬品および腫瘍学の分野に関する。より具体的には、本発明は、カーゴを運搬するエキソソームを投与してテロメラーゼ活性を向上させることによって加齢関連障害を処置するための組成物、および前記処置の方法に関する。

テロメラーゼ欠損は、全身性臓器機能不全に関連しており、また年齢依存的障害に関連している。加齢に伴い、細胞はテロメラーゼを失い、それが細胞機能障害および老化の一因となる。遺伝学的研究によって、テロメラーゼの再発現が、細胞寿命を延長し、加齢に伴う臓器機能を保護し得ることが示されている。しかしながら、全身的な治療戦略が必要とされている。

このようなことから、本明細書において、加齢関連障害（例えば、臓器の障害など）を逆転させるためにテロメラーゼｍＲＮＡまたは改変テロメラーゼｍＲＮＡを細胞に送達するように操作されたエキソソームを含む組成物、および前記エキソソームの投与方法が提供される。

一実施形態において、本明細書において、テロメラーゼ複合体の活性を増強させる治療剤カーゴを含む脂質に基づくナノ粒子を含む組成物が提供される。いくつかの態様において、前記脂質に基づくナノ粒子は、その表面上にＣＤ４７を含む。いくつかの態様において、前記脂質に基づくナノ粒子は、その表面上に増殖因子を含む。いくつかの態様において、前記脂質に基づくナノ粒子は、リポソームまたはエキソソームである。

いくつかの態様において、前記治療剤カーゴは、治療用タンパク質、抗体、阻害性ＲＮＡ、遺伝子編集システム、または小分子薬物である。いくつかの態様において、前記治療用タンパク質は、ＴＥＲＴタンパク質に相当する。いくつかの態様において、前記抗体は、細胞内抗原に結合する。いくつかの態様において、前記抗体は、完全長抗体、ｓｃＦｖ、Ｆａｂフラグメント、（Ｆａｂ）２、ダイアボディ、トリアボディ、またはミニボディである。いくつかの態様において、前記阻害性ＲＮＡは、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、またはｐｒｅ－ｍｉＲＮＡである。いくつかの態様において、前記ｓｉＲＮＡは、テロメラーゼ活性をダウンレギュレートするタンパク質の発現をノックダウンする。いくつかの態様において、前記遺伝子編集システムは、ＣＲＩＳＰＲシステムである。いくつかの態様において、前記ＣＲＩＳＰＲシステムは、エンドヌクレアーゼおよびガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含む。いくつかの態様において、前記エンドヌクレアーゼおよび前記ｇＲＮＡは、エキソソーム内の単一の核酸分子上にコードされている。いくつかの態様において、前記ＣＲＩＳＰＲシステムは、ＴＥＲＴまたはＴＥＲＣの変異を標的とする。

一実施形態において、本明細書において、本実施形態のいずれか１つの脂質に基づくナノ粒子と、賦形剤とを含む医薬組成物が提供される。いくつかの態様において、前記組成物は、非経口投与のために製剤化される。いくつかの態様において、前記組成物は、静脈内、筋肉内、皮下、または腹腔内注射のために製剤化される。いくつかの態様において、前記組成物は、抗微生物剤をさらに含む。いくつかの態様において、前記抗微生物剤は、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、ベンジルアルコール、ブロノポール、セトリミド（ｃｅｎｔｒｉｍｉｄｅ）、塩化セチルピリジニウム、クロルヘキシジン、クロロブタノール、クロロクレゾール、クロロキシレノール、クレゾール、エチルアルコール、グリセリン、ヘキセチジン（ｅｘｅｔｉｄｉｎｅ）、イミド尿素、フェノール、フェノキシエタノール、フェニルエチルアルコール（ｐｈｅｎｙｌｅｔｈｌ ａｌｃｏｈｏｌ）、硝酸フェニル水銀、プロピレングリコール、またはチメロサールである。

一実施形態において、本明細書において、それを必要とする患者における疾患または障害を処置する方法であって、本実施形態のいずれか１つの組成物を前記患者に投与することを含む方法が提供される。いくつかの態様において、投与によって、前記治療剤カーゴが、前記患者の細胞に送達される。

いくつかの態様において、前記疾患または障害は、加齢関連疾患または障害である。いくつかの態様において、前記疾患または障害は、肺線維症、先天性角化異常症、再生不良性貧血、筋ジストロフィー、アテローム性動脈硬化症、高血圧、心疾患、がん、脳卒中、糖尿病、糖尿病性潰瘍、アルツハイマー病、骨粗鬆症、黄斑変性、免疫老化、心筋梗塞、または血管性認知症である。

いくつかの態様において、前記投与は、全身投与である。いくつかの態様において、前記全身投与は、静脈内投与である。いくつかの態様において、前記組成物は、１回を超える回数投与される。

いくつかの態様において、前記方法は、少なくとも第２の療法を患者に施すことをさらに含む。いくつかの態様において、前記第２の療法は、外科療法、化学療法、放射線療法、凍結療法、ホルモン療法、または免疫療法を含む。

いくつかの態様において、前記患者は、ヒトである。いくつかの態様において、前記脂質に基づくナノ粒子は、エキソソームであり、前記エキソソームは、前記患者について自家性である。いくつかの態様において、前記エキソソームは、前記患者から得られる体液サンプルから得られる。いくつかの態様において、前記体液サンプルは、血液、リンパ、唾液、尿、脳脊髄液、骨髄吸引物、眼滲出液／涙、または血清である。いくつかの態様において、前記エキソソームは、間葉系細胞から得られる。いくつかの態様において、前記方法は、テロメラーゼ複合体の活性を増強させる治療剤カーゴを、患者の肝臓、脳、および／または膵臓に送達する方法とさらに定義される。

一実施形態において、本明細書において、治療剤を患者の肝臓組織、脳組織、および／または膵臓組織に送達する方法であって、前記治療剤を運搬する間葉系細胞由来エキソソームを前記患者に投与することを含む方法が提供される。いくつかの態様において、前記エキソソームは、前記患者について自家性である。いくつかの態様において、前記治療剤は、治療用タンパク質、抗体、阻害性ＲＮＡ、遺伝子編集システム、または小分子薬物である。いくつかの態様において、前記治療剤は、テロメラーゼ複合体の活性を増強させる。いくつかの態様において、前記治療剤は、ＴＥＲＴタンパク質である。いくつかの態様において、前記エキソソームは、１回を超える回数投与される。いくつかの態様において、前記エキソソームは、全身的に投与される。いくつかの態様において、前記エキソソームは、局所的に投与される。

本明細書で使用される場合、「本質的に含まない」は、特定のコンポーネントに関して、その特定のコンポーネントが、組成物中に意図的には一切配合されておらず、および／または、混入物としてのみ存在するか、もしくは痕跡量でのみ存在することを意味するために使用される。したがって、あらゆる意図しない組成物の混入物に由来する特定のコンポーネントの総量は、０．０５％より十分に少なく、好ましくは０．０１％より少ない。最も好ましいのは、前記特定のコンポーネントが、標準的な分析方法によって検出できない組成物である。

本明細書で使用される場合、「ａ」または「ａｎ」は、１またはそれを超えることを意味し得る。特許請求の範囲で使用される場合、語句「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」と組み合わせて使用される場合、語句「ａ」または「ａｎ」は、１、または１を超えることを意味し得る。

特許請求の範囲における用語「または（ｏｒ）」の使用は、代替物のみを指すことが明示されているか、または代替物が相互に排他的でない限り、「および／または」を意味するために使用されるが、本開示は、代替物のみ、ならびに「および／または」を指す定義をサポートする。本明細書で使用される場合、「別の（ａｎｏｔｈｅｒ）」は、少なくとも２番目、またはそれを超えるものを意味し得る。

本出願全体を通して、用語「約（ａｂｏｕｔ）」は、値が、その値を決定するために使用されるデバイス、方法の誤差に固有の変動、調査対象間に存在する変動、または示されている値の１０％以内の値を含むことを指すために使用される。

本発明のその他の目的、特徴、および利点が、以下の詳細な説明から明らかとなる。しかしながら、この詳細な説明および特定の実施例は、本発明の好ましい実施形態を示してはいるが、本発明の趣旨および範囲内の種々の変更および改変がこの詳細な説明から当業者に明らかになることから、単に例証の目的で示されているものであることを理解されたい。

以下の図面は、本明細書の一部を構成し、本発明のある特定の態様をさらに説明するために含められている。本発明は、本明細書に示されている特定の実施形態の詳細な説明と組み合わせてこれらの図面の１つまたは複数を参照することによって、よりよく理解され得る。

図１Ａ～Ｅは、サルにおける間葉系幹細胞由来エキソソームの体内分布である。図１Ａ～Ｂは、膵臓への局在を示す。図１Ｃ～Ｄは、肝臓への局在を示す。図１Ｅは、脳への局在を示す。 同上。

図２Ａは、ｉｎ ｖｉｔｒｏで転写されたｍＲＮＡまたはｍｏｄＲＮＡの構造を示す。図２Ｂは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでｈＴＥＲＴ ｍＲＮＡおよびリポフェクタミンで処理したＢＪ細胞における、ｈＴＥＲＴ ｍＲＮＡ発現を、ｑＰＣＲによって示す。図２Ｃ～Ｄは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでｈＴＥＲＴ ｍＲＮＡおよびリポフェクタミンで処理したＢＪ細胞のテロメラーゼ活性を示す。図２Ｅは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでｈＴＥＲＴ ｍｏｄＲＮＡおよびリポフェクタミンで処理したＢＪ細胞における、ｈＴＥＲＴ ｍｏｄＲＮＡ発現を、ｑＰＣＲによって示す。図２Ｆは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでｈＴＥＲＴ ｍｏｄＲＮＡおよびリポフェクタミンで処理したＢＪ細胞のテロメラーゼ活性を示す。図２Ｇは、ドミナントネガティブｈＴＥＲＴ ｍｏｄＲＮＡのトランスフェクションが、テロメラーゼ活性を上昇させないことを示す。図２Ｈは、ｈＴＥＲＴ ｍＲＮＡは細胞死を誘導するが、ｍｏｄＲＮＡは細胞死を誘導しないことを示す。図２Ｉは、細胞老化に対する、リポフェクタミンを用いたＢＪ細胞の長時間のｈＴＥＲＴ ｍｏｄＲＮＡ処理の効果を示す。図２Ｊは、ドミナントネガティブｈＴＥＲＴ ｍｏｄＲＮＡのトランスフェクションは、細胞老化を改善しないことを示す。図２Ｋは、テロメアシグナルに対する、リポフェクタミンを用いたＢＪ細胞の長時間のｈＴＥＲＴ ｍｏｄＲＮＡ処理の効果を示す。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。

図３Ａ～Ｂは、ｈＴＥＲＴ ｍＲＮＡのエキソソーム内へのエレクトロポレーションである。図３Ａは、エレクトロポレーション後のエキソソームにおけるｍｏｄＲＮＡ発現を示す。図３Ｂは、外来性および内在性ｈＴＥＲＴのためのプライマーの設計を示す。 同上。

図４Ａ～Ｅは、ｈＴＥＲＴ ｍＲＮＡを電気穿孔したエキソソームによるＢＪ細胞の処理である。図４Ａは、ｈＴＥＲＴエキソソーム処理後の、ＢＪ細胞におけるｍＲＮＡ発現を示す。図４Ｂは、テロメラーゼ活性に対する、ｈＴＥＲＴエキソソーム処理の効果を示す。図４Ｃは、老化に対する、ｈＴＥＲＴエキソソーム処理の効果を示す。図４Ｄは、ｈＴＥＲＴ過剰発現エキソソームが、Ｃ１２ＦＤＧシグナルを増加させることを示す。ＢＪ細胞は、ｈＴＥＲＴ過剰発現エキソソームで２回処理し、次いで採取し、蛍光基質（Ｃ１２ＦＤＧ）を用いてベータガラクトシダーゼシグナルについて評価した。Ｃ１２ＦＤＧ ＭＦＩの低下は、老化の程度がより低いことを示す。図４Ｅは、ＢＪ ｈＴＥＲＴ細胞が、より弱い老化シグナルを発することを示す。 同上。 同上。 同上。

図５Ａ～Ｂは、ｈＴＥＲＴエキソソームによるＵ２ＯＳ細胞の処理（Ｅｘｏｆｅｃｔトランスフェクション）である。図５Ａは、ｈＴＥＲＴエキソソームによる処理後のＵ２ＯＳ細胞におけるｈＴＥＲＴ ｍＲＮＡ発現を示す。図５Ｂは、ｈＴＥＲＴエキソソームによる処理後のＵ２ＯＳ細胞におけるテロメラーゼ活性を示す。

図６Ａ～Ｅは、ｈＴＥＲＴ過剰発現細胞株である。図６Ａは、２９３Ｔ ｈＴＥＲＴ過剰発現細胞が、より多くのｈＴＥＲＴタンパク質を発現することを示す。図６Ｂは、２９３Ｔ ｈＴＥＲＴ細胞が、高いテロメラーゼ活性を示すことを示す。図６Ｃは、２９３Ｔ ｈＴＥＲＴエキソソームが、より多くのｈＴＥＲＴ ｍＲＮＡを発現することを示す。図６Ｄは、ｈＴＥＲＴ過剰発現細胞が、より高いｈＴＥＲＴ ｍＲＮＡを有することを示す。図６Ｅは、ＢＪおよびＵ２ＯＳ ｈＴＥＲＴ過剰発現細胞が、より多くのｈＴＥＲＴタンパク質を発現することを示す。 同上。 同上。

図７は、２９３Ｔ ｈＴＥＲＴエキソソームによる細胞の処理である。データは、Ｕ２ＯＳ ｈＴＥＲＴ細胞が、より高いテロメラーゼシグナルを発することを示す。

図８Ａ～Ｊは、エキソソーム内への、ｔｄＴｏｍａｔｏ ｍＲＮＡ送達およびｔｄＴｏｍａｔｏ ｍＲＮＡのＥｘｏｆｅｃｔトランスフェクションである。図８Ａは、リポフェクタミンによる２９３Ｔ細胞内へのｔｄＴｏｍａｔｏプラスミドおよびｍＲＮＡのトランスフェクションを、ＦＡＣＳによって示す。図８Ｂは、リポフェクタミンによる２９３Ｔ細胞内へのｔｄＴｏｍａｔｏプラスミドおよびｍＲＮＡのトランスフェクションを、免疫蛍光によって示す。図８Ｃは、ｉｎ ｖｉｔｒｏで転写されたｔｄＴｏｍａｔｏ ｍＲＮＡまたはｍｏｄＲＮＡの構造を示す。図８Ｄは、エキソソームによる２９３Ｔ細胞へのｔｄＴｏｍａｔｏ ｍＲＮＡの送達をＦＡＣＳによって示す。図８Ｅは、ＥｘｏｆｅｃｔおよびｔｄＴｏｍａｔｏ ｍＲＮＡ／プラスミドで処理したエキソソームによる２９３Ｔ細胞の処理を、ＦＡＣＳによって示す。図８Ｆは、ＥｘｏｆｅｃｔおよびｔｄＴｏｍａｔｏ ｍＲＮＡで処理したエキソソームによる２９３Ｔ細胞の処理を、ＦＡＣＳによって示す。図８Ｇは、ＥｘｏｆｅｃｔおよびｔｄＴｏｍａｔｏ ｍＲＮＡで処理したエキソソームによる２９３Ｔ細胞の処理を、免疫蛍光によって示す。図８Ｈ～Ｉは、細胞生存率に対するＥｘｏｆｅｃｔおよびｔｄＴｏｍａｔｏ ｍＲＮＡ送達の効果を示す。図８Ｊは、Ｅｘｏｆｅｃｔを用いたエキソソームによるＵ２ＯＳ細胞へのｍＲＮＡ送達の可視化を示す。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。

細胞外ベシクル（ＥＶ）（エキソソームおよびマイクロベシクルを含む）は、いくつかの生理学的プロセスに関与する、ナノサイズの細胞内伝達ビヒクルである。細胞外ベシクル（ＥＶ）は、その生物学的特性およびマウスおよびサルに注入された場合に他の細胞に侵入する能力のために、治療用化合物（例えば、ｍＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９遺伝子編集構築物、治療用タンパク質、サイトカイン、化学療法薬、核酸、および細菌およびウイルスベクターなど）の全身送達に使用することができる。間葉系細胞または２９３Ｔ細胞由来のエキソソームを健常マウスおよびサルに腹腔内または静脈内注射することによって、いくつかの臓器（脳、肝臓、肺、および膵臓を含む）における治療用エキソソームの局在／蓄積がもたらされる。

本明細書において、エキソソームを使用して、機能的なｍＲＮＡ分子を細胞に送達する方法が提供される。エキソソームは、機能的な利益と共に、ｍＲＮＡを細胞内に送達する点で優れている。そうであるため、エキソソームは、加齢関連臓器機能不全を逆転させるために、テロメラーゼをコードしているｍＲＮＡを細胞に送達するために使用してもよい。

テロメアは、染色体末端にある反復性のＤＮＡ配列である。十分な長さを有するテロメアは、その染色体末端がＤＮＡ修復プロセスにおける基質として使用されることを防ぐループを形成する。しかしながら、テロメアは、時間と共に短くなり、その結果染色体末端が露出し、それによって染色体が不安定になり、それが細胞の老化、アポトーシス、またはがんをもたらし得る。
Ｉ．脂質に基づくナノ粒子

脂質に基づくナノ粒子は、リポソーム、エキソソーム、脂質調製物、または別の脂質に基づくナノ粒子、例えば、脂質ベースのベシクル（例えば、ＤＯＴＡＰ：コレステロールベシクル）であり得る。脂質に基づくナノ粒子は、正に荷電していてもよく、負に荷電していてもよく、中性であってもよい。脂質に基づくナノ粒子は、転写および翻訳、シグナル伝達、走化性、またはその他の細胞機能を可能にするために必要なコンポーネントを含んでいてもよい。

脂質に基づくナノ粒子は、その表面上にＣＤ４７を含んでいてもよい。ＣＤ４７（インテグリン関連タンパク質）は、ほとんどの組織および細胞上に発現している膜貫通タンパク質である。ＣＤ４７は、シグナル調節タンパク質アルファ（ＳＩＲＰ－α）のリガンドであり、このシグナル調節タンパク質アルファ（ＳＩＲＰ－α）は、マクロファージおよび樹状細胞などの貪食細胞上に発現している。活性化されたＣＤ４７－ＳＩＲＰ－αは、食作用を抑制するシグナル伝達カスケードを開始させる。したがって、理論に束縛されないが、エキソソームの表面上におけるＣＤ４７の発現は、マクロファージによる食作用を阻害し得る（ＷＯ２０１６／２０１３２３（参照によりその全体が本明細書に援用される）を参照のこと）。
Ａ．リポソーム

「リポソーム」は、封入脂質二重層または凝集体の生成によって形成される、種々の単層脂質ビヒクルおよび多重層脂質ビヒクルを包含する総称である。リポソームは、一般にリン脂質を含む二重層膜と、一般に水性組成物を含む内部の媒体とを含むベシクル状の構造を有するものとして特徴付けられる。本明細書で提供されるリポソームには、単層リポソーム、多重層リポソーム、および多小胞リポソームが含まれる。本明細書で提供されるリポソームは、正に荷電していてもよく、負に荷電していてもよく、中性に荷電していてもよい。ある特定の実施形態において、リポソームは、電荷が中性である。

多重層リポソームは、水性媒体で隔てられた複数の脂質層を有する。このようなリポソームは、リン脂質を含む脂質を過剰量の水溶液中で懸濁した場合、自発的に形成される。脂質コンポーネントは、閉じた構造を形成する前に自己再構成を起こし、脂質二重層の間に水および溶解した溶質を捕捉する。親脂性分子または親油性領域を有する分子は、同様に、脂質二重層内に溶解し得るか、または脂質二重層と会合し得る。

特定の態様において、ポリペプチド、核酸、または小分子薬物は、例えば、リポソームの水性内部に封入されてもよく、リポソームの脂質二重層内に分散されてもよく、リポソームとポリペプチド／核酸の両方に結合する連結分子によってリポソームに結合されてもよく、リポソーム内に捕捉されてもよく、リポソームと複合体を形成してもよい。

本実施形態に従って使用されるリポソームは、当業者に知られているように、様々な方法によって作製することができる。例えば、リン脂質（例えば、中性リン脂質であるジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）など）は、ＴＥＲＴ－ブタノールに溶解される。この脂質（単数または複数）は、次いでポリペプチド、核酸、および／またはその他のコンポーネント（単数または複数）と混合される。この脂質混合物に対して、Ｔｗｅｅｎ（登録商標） ２０が組成物重量の約５％になるように、Ｔｗｅｅｎ（登録商標） ２０を加える。この混合物に、ＴＥＲＴ－ブタノールの体積が少なくとも９５％になるように、過剰量のＴＥＲＴ－ブタノールを加える。この混合物を、ボルテックスし、ドライアイス／アセトン浴中で凍結させ、終夜凍結乾燥させる。凍結乾燥された調製物は、－２０℃で保存し、最大３か月間使用可能である。必要な場合、凍結乾燥されたリポソームは、０．９％食塩水中で再構成される。

あるいは、リポソームは、容器内、例えばガラスナシ型フラスコ内で、脂質を溶媒中で混合することによって調製することができる。容器は、リポソーム懸濁液の予期される体積に対して、１０倍の容量を有するべきである。溶媒は、ロータリーエバポレーターを使用して、陰圧下で、およそ４０℃で除去される。溶媒は、リポソームの所望の体積に応じて、通常約５分間～２時間以内で除去される。組成物は、真空下で、デシケーター内でさらに乾燥してもよい。乾燥させた脂質は、時間と共に劣化する傾向があるため、通常約１週間後に廃棄される。

乾燥させた脂質は、およそ２５～５０ｍＭのリン脂質を、滅菌パイロジェンフリー水中で、全ての脂質薄膜が再懸濁されるまで振盪することによって水和させることができる。次いで、その水性リポソームを、アリコートに分け、各アリコートをバイアル中に入れ、真空下で凍結乾燥および密封してもよい。

上記のように調製された、乾燥させた脂質または凍結乾燥したリポソームは、脱水し、タンパク質またはペプチドの溶液中で再構成し、適した溶媒、例えばＤＰＢＳで、適切な濃度に希釈してもよい。その混合物を、次いで、ボルテックスミキサー内で激しく振盪する。封入されていない余分な材料、例えば、それらに限定されないが、ホルモン、薬物、核酸構築物などを含む薬剤を、遠心分離によって２９，０００×ｇで除去し、得られたリポソームペレットを洗浄する。洗浄したリポソームを、適切な総リン脂質濃度、例えば約５０～２００ｍＭで再懸濁する。余分な材料または封入された活性薬剤の量は、標準的な方法に従って決定することができる。余分な材料、またはリポソーム調製物中に封入された活性薬剤の量を決定した後、リポソームを適切な濃度に希釈し、使用まで４℃で保存してもよい。リポソームを含む医薬組成物は、通常、無菌の医薬的に許容され得る担体または希釈剤、例えば水または食塩溶液を含有する。

本実施形態に有用であり得るさらなるリポソームとしては、例えば、ＷＯ０２／１００４３５Ａ１、米国特許第５，９６２，０１６号、米国特許出願第２００４／０２０８９２１号、ＷＯ０３／０１５７５７Ａ１、ＷＯ０４／０２９２１３Ａ２、米国特許第５，０３０，４５３号、および米国特許第６，６８０，０６８号（これらの全ては、ディスクレーマーなしに、参照によりその全体が本明細書に援用される）に記載されているような、カチオン性リポソームがあげられる。

そのようなリポソームの調製において、本明細書に記載されている任意のプロトコル、または当業者に知られている任意のプロトコルを使用することができる。リポソーム調製のさらなる非限定的な例は、米国特許第４，７２８，５７８号、米国特許第４，７２８，５７５号、米国特許第４，７３７，３２３号、米国特許第４，５３３，２５４号、米国特許第４，１６２，２８２号、米国特許第４，３１０，５０５号、および米国特許第４，９２１，７０６号；国際出願ＰＣＴ／ＵＳ８５／０１１６１および国際出願ＰＣＴ／ＵＳ８９／０５０４０（それぞれ、参照により本明細書に援用される）に記載されている。

ある特定の実施形態において、脂質に基づくナノ粒子は、中性リポソーム（例えば、ＤＯＰＣリポソーム）である。「中性リポソーム」または「非荷電リポソーム」は、本明細書で使用される場合、本質的に中性の正味電荷（実質的に非荷電）をもたらす１つまたはそれを超える脂質コンポーネントを有するリポソームと定義される。「本質的に中性」または「本質的に非荷電」とは、所与の集団（例えば、リポソームの集団）内の、別のコンポーネントの反対の電荷によって打ち消されない電荷を含む脂質コンポーネントが、あるとすれば、わずかである（すなわち、コンポーネントの１０％未満、より好ましくは５％未満、最も好ましくは１％未満が、打ち消されない電荷を有する）という意味である。ある特定の実施形態において、中性リポソームは、生理的条件下で（すなわち、約ｐＨ７において）それ自体が中性である脂質および／またはリン脂質を主として含んでいてもよい。

本実施形態のリポソームおよび／または脂質に基づくナノ粒子は、リン脂質を含んでいてもよい。ある特定の実施形態において、単一の種類のリン脂質をリポソームの作製に使用してもよい（例えば、ＤＯＰＣなどの中性リン脂質を、中性リポソームを生成させるために使用してもよい）。他の実施形態において、１種類を超えるリン脂質を、リポソームを作製するために使用してもよい。リン脂質は、天然物起源であってもよく、合成物起源であってもよい。リン脂質としては、例えば、ホスファチジルコリン、ホスファチジルグリセロール、およびホスファチジルエタノールアミンがあげられ；ホスファチジルエタノールアミンおよびホスファチジルコリンは、生理的条件下で（すなわち、約ｐＨ７において）非荷電であるため、これらの化合物は中性リポソームの生成のために特に有用であり得る。ある特定の実施形態において、非荷電リポソームを作製するために、リン脂質ＤＯＰＣが使用される。ある特定の実施形態において、リン脂質ではない脂質（例えば、コレステロール）を使用してもよい。

リン脂質には、グリセロリン脂質およびある特定のスフィンゴ脂質が含まれる。リン脂質としては、それらに限定されないが、ジオレオイルホスファチジルコリン（ｄｉｏｌｅｏｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｙｃｈｏｌｉｎｅ）（「ＤＯＰＣ」）、卵ホスファチジルコリン（「ＥＰＣ」）、ジラウロイルホスファチジルコリン（ｄｉｌａｕｒｙｌｏｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ）（「ＤＬＰＣ」）、ジミリストイルホスファチジルコリン（「ＤＭＰＣ」）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（「ＤＰＰＣ」）、ジステアロイルホスファチジルコリン（「ＤＳＰＣ」）、１－ミリストイル－２－パルミトイルホスファチジルコリン（「ＭＰＰＣ」）、１－パルミトイル－２－ミリストイルホスファチジルコリン（「ＰＭＰＣ」）、１－パルミトイル－２－ステアロイルホスファチジルコリン（「ＰＳＰＣ」）、１－ステアロイル－２－パルミトイルホスファチジルコリン（「ＳＰＰＣ」）、ジラウロイルホスファチジルグリセロール（ｄｉｌａｕｒｙｌｏｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｇｌｙｃｅｒｏｌ）（「ＤＬＰＧ」）、ジミリストイルホスファチジルグリセロール（「ＤＭＰＧ」）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（「ＤＰＰＧ」）、ジステアロイルホスファチジルグリセロール（「ＤＳＰＧ」）、ジステアロイルスフィンゴミエリン（「ＤＳＳＰ」）、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（「ＤＳＰＥ」）、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（「ＤＯＰＧ」）、ジミリストイルホスファチジン酸（「ＤＭＰＡ」）、ジパルミトイルホスファチジン酸（「ＤＰＰＡ」）、ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン（「ＤＭＰＥ」）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（「ＤＰＰＥ」）、ジミリストイルホスファチジルセリン（「ＤＭＰＳ」）、ジパルミトイルホスファチジルセリン（「ＤＰＰＳ」）、脳ホスファチジルセリン（「ＢＰＳ」）、脳スフィンゴミエリン（「ＢＳＰ」）、ジパルミトイルスフィンゴミエリン（「ＤＰＳＰ」）、ジミリスチルホスファチジルコリン（ｄｉｍｙｒｉｓｔｙｌ ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ）（「ＤＭＰＣ」）、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（「ＤＡＰＣ」）、１，２－ジアラキドイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（「ＤＢＰＣ」）、１，２－ジエイコセノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（「ＤＥＰＣ」）、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（「ＤＯＰＥ」）、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（ｐａｌｍｉｔｏｙｌｏｅｏｙｌ ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ）（「ＰＯＰＣ」）、パルミトイルオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ｐａｌｍｉｔｏｙｌｏｅｏｙｌ ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ）（「ＰＯＰＥ」）、リゾホスファチジルコリン、リゾホスファチジルエタノールアミン、およびジリノレオイルホスファチジルコリン（ｄｉｌｉｎｏｌｅｏｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ）があげられる。
Ｂ．エキソソーム

用語「マイクロベシクル」および「エキソソーム」は、本明細書で使用される場合、直径（または、粒子が球状ではない場合は、最大の寸法）が、約１０ｎｍ～約５０００ｎｍ、より典型的には３０ｎｍ～１０００ｎｍ、最も典型的には約５０ｎｍ～７５０ｎｍである膜性の粒子を指し、ここで、エキソソームの膜の少なくとも一部は、細胞から直接得られる。最も一般的には、エキソソームは、ドナー細胞のサイズの、最大で５％までのサイズ（平均粒径）を有する。したがって、特に意図されるエキソソームとしては、細胞から排出されるエキソソームがあげられる。

エキソソームは、任意の適切なサンプルタイプ（例えば、体液など）において検出され得るか、またはそのようなサンプルタイプから単離され得る。本明細書で使用される場合、用語「単離される」は、その自然環境から分離されることを指し、少なくとも部分精製を含むことを意図し、実質的な精製を含んでもよい。本明細書で使用される場合、用語「サンプル」は、本発明によって提供される方法に適した任意のサンプルを指す。サンプルは、検出または単離に適したエキソソームを含む任意のサンプルであり得る。サンプルの起源としては、血液、骨髄、胸水、腹水、脳脊髄液、尿、唾液、羊水、悪性腹水、気管支肺胞洗浄液、滑液、母乳、汗、涙、関節液、および気管支洗浄液があげられる。１つの態様において、サンプルは、血液サンプルであり、血液サンプルには、例えば、全血、またはその任意のフラクションもしくはコンポーネントが含まれる。本発明と共に使用するために適した血液サンプルは、血液細胞またはそのコンポーネントを含むことが知られている任意の源（ｓｏｕｒｃｅ）、例えば、静脈源、動脈源、末梢源、組織源、臍帯源などから抽出することができる。例えば、サンプルは、周知かつ日常的な臨床的方法（例えば、全血を抜き取り、処理するための手順）によって取得し、処理することができる。１つの態様において、例示的なサンプルは、がんを有する対象から抜き取られた末梢血であり得る。

エキソソームは、また、組織サンプルから、例えば、外科的サンプル、生検サンプル、組織、糞便、および培養細胞から単離することもできる。組織源からエキソソームを単離する場合、単一の細胞懸濁液を得るために組織をホモジナイズし、次いで細胞を溶解させ、エキソソームを遊離させることが必要であり得る。組織サンプルからエキソソームを単離する場合、エキソソームを破壊させないホモジナイズ手順および溶解手順を選択することが重要である。本明細書において意図されているエキソソームは、好ましくは、生理学的に許容され得る溶液（例えば、緩衝食塩水、成長培地、種々の水性媒体など）中で体液から単離される。

エキソソームは、採取した新鮮なサンプルから単離してもよく、または冷凍もしくは冷蔵保存されたサンプルから単離してもよい。いくつかの実施形態において、エキソソームは、細胞培養培地から単離してもよい。必須ではないが、体積排除ポリマーによる沈殿の前に、液体サンプルが清澄化され、サンプルから任意のデブリが除去されている場合、より高い純度のエキソソームが得られ得る。清澄化の方法としては、遠心分離、超遠心分離、濾過、または限外濾過があげられる。最も典型的には、エキソソームは、当該技術分野において知られている数多くの方法によって単離することができる。好ましい方法の１つは、体液または細胞培養上清からの分画遠心分離である。エキソソームの単離のための例示的な方法は、（Ｌｏｓｃｈｅら、２００４；ＭｅｓｒｉおよびＡｌｔｉｅｒｉ、１９９８；Ｍｏｒｅｌら、２００４）に記載されている。あるいは、エキソソームは、また、（Ｃｏｍｂｅｓら、１９９７）に記載されているように、フローサイトメトリーによって単離することもできる。

エキソソームを単離するための確立したプロトコルの１つとしては、超遠心分離があげられ、比較的低密度のエキソソームを浮遊させるために、ショ糖密度勾配またはショ糖クッションと組み合わされることが多い。連続的分画遠心分離によるエキソソームの単離は、サイズ分布が他のマイクロベシクルまたは巨大分子複合体と重なり合っている可能性があるために、複雑である。さらに、遠心分離によって提供されるサイズに基づくベシクルの分離手段は、不十分であり得る。しかしながら、ショ糖勾配超遠心分離と組み合わせた場合、連続的遠心分離によって、エキソソームの高富化を実現し得る。

超遠心分離ルートの代替手段を用いた、サイズに基づくエキソソームの単離は、別の選択肢である。超遠心分離よりも時間がかからず、特別な機器を使用する必要がない、限外濾過手順を用いたエキソソームの精製が成功したことが報告されている。同様に、流体を押しやるために陽圧を利用して、１つのマイクロフィルター上で細胞、血小板、および細胞デブリを除去し、２番目のマイクロフィルター上に３０ｎｍより大きいベシクルを捕捉する、市販のキット（ＥＸＯＭＩＲ（商標）、Ｂｉｏｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）が利用可能である。しかしながら、このプロセスにおいては、エキソソームは回収されず、そのＲＮＡ内容物が、第２のマイクロフィルター上に捕捉された材料から直接抽出され、次いで、それがＰＣＲ分析に使用され得る。ＨＰＬＣベースのプロトコルによって、潜在的には、非常に純粋なエキソソームの取得が可能になり得るが、これらのプロセスは、専用の機器を必要とし、またスケールアップが困難である。重大な問題は、血液と細胞培養培地が、どちらも、エキソソームと同じサイズ範囲内のナノ粒子（ある程度非ベシクル性）を多数含有していることである。例えば、ある程度のｍｉＲＮＡは、エキソソームではなくて、細胞外タンパク質複合体内に含まれている場合があるが、プロテアーゼ（例えば、プロテイナーゼＫ）による処理を行い、「エキソソーム外」タンパク質による任意の起こり得る混入を排除することができる。

別の実施形態において、がん細胞由来エキソソームは、サンプルをエキソソームについて富化するために一般に使用される技術、例えば、免疫特異性相互作用を利用する技術（例えば、免疫磁気捕捉）によって捕捉してもよい。免疫磁気捕捉（免疫磁気細胞分離としても知られる）は、典型的には、特定の細胞タイプ上に見出されるタンパク質に対する抗体を、小さな常磁性ビーズに結合させることを含む。この抗体でコーティングしたビーズをサンプル（例えば、血液）と混合すると、ビーズはその特定の細胞に付着し、細胞を取り囲む。次いで、サンプルを強磁場に置き、それによってビーズを片側にペレット化させる。血液を取り除いた後、捕捉された細胞はビーズによって保持される。この一般的な方法の多くの変形が当該技術分野において周知であり、エキソソームを単離するための使用に適している。１つの例において、エキソソームを磁気ビーズ（例えば、アルデヒド／サルフェートビーズ）に付着させ、次いでその混合物に抗体を加え、ビーズに付着させたエキソソームの表面上のエピトープを認識させてもよい。がん細胞由来エキソソーム上に見出されることが知られている例示的なタンパク質としては、ＡＴＰ結合性カセットサブファミリーＡメンバー６（ＡＢＣＡ６）、テトラスパニン－４（ＴＳＰＡＮ４）、ＳＬＩＴおよびＮＴＲＫ様タンパク質４（ＳＬＩＴＲＫ４）、推定プロトカドヘリンベータ－１８（ＰＣＤＨＢ１８）、骨髄細胞表面抗原ＣＤ３３（ＣＤ３３）、およびグリピカン１（ＧＰＣ１）があげられる。がん細胞由来エキソソームは、例えば、これらのうちの１つまたはそれを超えるタンパク質に対する抗体またはアプタマーを使用して単離してもよい。

細胞において発現される全てのタンパク質が、その細胞によって分泌されるエキソソーム内に見出されるわけではないことに留意すべきである。例えば、カルネキシン、ＧＭ１３０、およびＬＡＭＰ－２は、全てＭＣＦ－７細胞内で発現されるタンパク質であるが、ＭＣＦ－７細胞が分泌するエキソソーム内には見出されない（Ｂａｉｅｔｔｉら、２０１２）。別の例として、１つの試験により、膵管腺癌患者１９０名中１９０名において、ＧＰＣ１＋エキソソームのレベルが健常対照よりも高いことが見出された（Ｍｅｌｏら、２０１５（参照によってその全体が本明細書に援用される））。注目すべきことに、ＧＰＣ１＋エキソソームを有する健常対照は、平均で、わずか２．３％であった。
１．細胞培養物からエキソソームを採取するための例示的なプロトコル

第１日に、Ｔ２２５フラスコ中で、１０％ＦＢＳを含む培地に、細胞が翌日に約７０％コンフルエントになるように、十分な細胞（例えば、約５００万個の細胞）を播種する。第２日に、細胞上の培地を吸引し、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、次いで２５～３０ｍＬの基本培地（すなわち、ＰｅｎＳｔｒｅｐもＦＢＳも含まない）を細胞に加える。細胞を２４～４８時間インキュベートする。４８時間のインキュベーションが好ましいが、いくつかの細胞株は無血清培地に対してより感受性が高く、そのため、インキュベーション時間を２４時間に短縮すべきである。ＦＢＳは、ＮａｎｏＳｉｇｈｔの結果を大きく歪めるエキソソームを含んでいることに留意されたい。

第３／４日に、培地を採取し、室温で５分間、８００×ｇで遠心分離して、死細胞と大きなデブリをペレット化する。上清を新しいコニカルチューブに移し、培地をさらに１０分間、２０００×ｇで遠心分離して、他の大きなデブリと大きなベシクルを除去する。培地を０．２μｍのフィルターに通し、次いで超遠心分離管（例えば、２５×８９ｍｍのＢｅｃｋｍａｎ Ｕｌｔｒａ－Ｃｌｅａｒ）に、遠心管あたり３５ｍＬずつ分注する。遠心管あたりの培地量が３５ｍＬ未満である場合、遠心管の残りをＰＢＳで満たし、３５ｍＬにする。培地を、ＳＷ３２Ｔｉローター（ｋファクターが２６６．７、最大ＲＣＦが１３３，９０７）を使用して、４℃で２～４時間、２８，０００ｒｐｍで超遠心分離する。上清を、液体の残量がおよそ１インチになるまで注意深く吸引する。遠心管を傾け、残りの培地がアスピレーターピペットにゆっくり入るようにする。所望により、エキソソームペレットをＰＢＳ中に再懸濁し、再度２８，０００ｒｐｍでの超遠心分離を１～２時間繰り返し、エキソソームの集団をさらに精製してもよい。

最後に、エキソソームペレットを２１０μＬのＰＢＳ中に再懸濁する。各サンプルにつき複数の超遠心分離管がある場合、同じ２１０μＬのＰＢＳを使用して、各エキソソームペレットを順次再懸濁する。各サンプルにつき、１０μＬを取り、９９０μＬのＨ_２Ｏに加えてナノ粒子トラッキング解析に使用する。残りの２００μＬのエキソソーム含有懸濁液を下流のプロセスに使用するか、またはすぐに－８０℃で保管する。
２．血清サンプルからエキソソームを抽出するための例示的なプロトコル

まず、血清サンプルを氷上で解凍する。次いで、２５０μＬの無細胞血清サンプルを１１ｍＬのＰＢＳ中に希釈し；ポアサイズ０．２μｍのフィルターを通して濾過する。希釈したサンプルを、４℃で終夜、１５０，０００×ｇで超遠心分離する。翌日、上清を注意深く除き、エキソソームペレットを１１ｍＬのＰＢＳ中で洗浄する。２回目の超遠心分離を、４℃で２時間、１５０，０００×ｇで実施する。最後に、上清を注意深く除き、エキソソームペレットを、分析のために、１００μＬのＰＢＳ中に再懸濁する。
Ｃ．エキソソームおよびリポソームのエレクトロポレーションのための例示的なプロトコル

１×１０^８のエキソソーム（ＮａｎｏＳｉｇｈｔ分析によって測定する）または１００ｎｍリポソーム（例えば、Ｅｎｃａｐｓｕｌａ ＮａｎｏＳｃｉｅｎｃｅｓから購入する）と、１μｇのｓｉＲＮＡ（Ｑｉａｇｅｎ）またはｓｈＲＮＡを、４００μＬのエレクトロポレーションバッファー（１．１５ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ７．２、２５ｍＭ塩化カリウム、２１％Ｏｐｔｉｐｒｅｐ）中で混合する。エキソソームまたはリポソームを、４ｍｍキュベットを使用して電気穿孔する（Ａｌｖａｒｅｚ－Ｅｒｖｉｔｉら、２０１１；Ｅｌ－Ａｎｄａｌｏｕｓｓｉら、２０１２を参照のこと）。エレクトロポレーション後、エキソソームまたはリポソームをプロテアーゼフリーＲＮＡｓｅで処理し、次いで１０倍濃縮のＲＮＡｓｅ阻害剤を加える。最後に、エキソソームまたはリポソームを、上記のように、超遠心分離下で、ＰＢＳで洗浄する。
ＩＩ．疾患の処置

本発明のある特定の態様は、細胞内のテロメラーゼ活性を増強させる治療剤を発現するか、またはそれを含むエキソソームによる、患者の処置を提供する。「治療剤」は、本明細書で使用される場合、加齢関連障害またはその他の状態の処置において有用な原子、分子、または化合物である。治療剤としては、それらに限定されないが、例えば、薬物、化学療法剤、治療用抗体および抗体フラグメント、毒素、放射性同位体、酵素、核酸、ヌクレアーゼ、ホルモン、免疫調節剤、アンチセンスオリゴヌクレオチド、遺伝子編集システム、キレート剤、ホウ素化合物、光活性剤、ならびに色素があげられる。

短くなったテロメアと関連する遺伝的疾患の例としては、特発性肺線維症、先天性角化異常症、および再生不良性貧血があげられる。短くなったテロメアと関連があることが知られている他の疾患としては、筋ジストロフィー、アテローム性動脈硬化症、高血圧、心疾患、がん、脳卒中、糖尿病、糖尿病性潰瘍、アルツハイマー病、骨粗鬆症、黄斑変性、免疫老化、心筋梗塞、および血管性認知症があげられる。

エキソソームはＤＩＣＥＲおよび活性なＲＮＡプロセシングＲＩＳＣ複合体を含むことが知られている通り（国際特許出願公開ＷＯ２０１４／１５２６２２（参照によりその全体が本明細書に援用される）を参照のこと）、エキソソーム内にトランスフェクトされたｓｈＲＮＡは、そのエキソソームの中で、ＲＩＳＣ複合体結合ｓｉＲＮＡへと成熟し得る。あるいは、成熟したｓｉＲＮＡ自体をエキソソームまたはリポソーム内にトランスフェクトしてもよい。よって、例として、阻害性ＲＮＡを、本発明の方法において、テロメラーゼ活性（例えば、Ｍｅｎｉｎ、ＳＩＰ１、ｐＲＢ、ｐ３８、ｐ５３、ｐ７３、ＭＫＲＮ１、ＣＨＩＰ、ＨＳＰ７０、アンドロゲン、ＴＧＦ－ベータ、Ａｒｃ１、ｃＡｂｌ、Ｐｉｎｘ１、ＣＲＭ１、ＰＯＴ１、ｐ１９／Ａｒｆ）をモジュレートするために使用してもよい。任意の阻害性核酸を、その阻害性核酸が目的のタンパク質の確かなダウンレギュレーターであることが任意のソースによって見出されていれば、本発明の組成物および方法に適用することができる。

ＲＮＡｉの設計において、ｓｉＲＮＡの性質、サイレンシング効果の持続性、および送達システムの選択など、いくつかの因子を考慮する必要がある。ＲＮＡｉ効果を生じさせるために、生物に導入されるｓｉＲＮＡは、典型的にはエクソン配列を含有する。さらに、ＲＮＡｉプロセスは相同性依存的であるため、その配列は、相同ではあるが遺伝子特異的ではない配列間の交差干渉の可能性を最小にしつつ、遺伝子特異性が最大になるように注意深く選択しなければならない。好ましくは、ｓｉＲＮＡは、そのｓｉＲＮＡの配列と阻害される遺伝子との間で、８０％超、８５％超、９０％超、９５％超、９８％超、または、さらには１００％の同一性を示す。標的遺伝子に対する同一性が約８０％未満の配列は、実質的に有効性が低い。よって、ｓｉＲＮＡと阻害される遺伝子との間の相同性が大きいほど、無関係な遺伝子の発現が影響を受ける可能性は低い。

エキソソームはｍＲＮＡ転写およびタンパク質翻訳を完成させるために必要な機構を含むことが知られているため（ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０６８６３０（参照によりその全体が本明細書に援用される）を参照のこと）、治療用タンパク質をコードしているｍＲＮＡまたはＤＮＡ核酸を、エキソソーム内にトランスフェクトしてもよい。あるいは、治療用タンパク質自体をエキソソーム内にエレクトロポレーションしてもよく、またはリポソーム内に直接組み込んでもよい。例示的な治療用ＲＮＡとしては、テロメラーゼＲＮＡコンポーネント（ＴＥＲＣ）があげられる。例示的な治療用タンパク質としては、それらに限定されないが、テロメラーゼ逆転写酵素（ＴＥＲＴ（ＮＰ＿９３７９８３．２またはＮＰ＿００１１８０３０５．１））、ＴＣＡＢ１、ジスケリン、Ｇａｒ１、Ｎｈｐ２、Ｎｏｐ１０、ＲＨＡＵ、ヘリカーゼ、ＵＰＦ１、ＨＳＰ９０、ＰＫＣ、Ｓｈｐ－２、ＮＦｋＢ ｐ６５、ＴＰＰ１、ＡＴＭ、ＤＡＴ、ＴＲＦ１、ＴＲＦ２、Ｒａｐ１、Ｒｉｆ１、ＴＩＮ２、ＮＢＳ、ＭＲＥ１７、ＲＡＤ５０、ＥＧＦ、ＩＧＦ－１、ＦＧＦ－２、ＶＥＧＦ、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－１３、ＩＬ－１５、およびＡｋｔがあげられる。

疾患細胞の細胞内空間内に導入することが望ましい場合があるある特定の種類のタンパク質は、細胞内抗原に特異的または選択的に結合し得る抗体（例えば、モノクローナル抗体）である。そのような抗体は、細胞内タンパク質の機能を破綻させ得、および／または細胞内タンパク質間相互作用を破綻させ得る。そのようなモノクローナル抗体の例示的な標的としては、それらに限定されないが、Ｍｅｎｉｎ、ＳＩＰ１、ｐＲＢ、ｐ３８、ｐ５３、ｐ７３、ＭＫＲＮ１、ＣＨＩＰ、ＨＳＰ７０、アンドロゲン、ＴＧＦ－ベータ、Ａｒｃ１、ｃＡｂｌ、Ｐｉｎｘ１、ＣＲＭ１、ＰＯＴ１、およびｐ１９／Ａｒｆがあげられる。モノクローナル抗体に加えて、その任意の抗原結合性フラグメント、例えば、ｓｃＦｖ、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’、Ｆ（Ａｂ’）２、Ｆｖ、ペプチボディ、ダイアボディ、トリアボディ、またはミニボディも意図されている。このような抗体または抗体フラグメントのいずれも、グリコシル化されていてもよく、またはグリコシル化されていなくてもよい。

エキソソームは、また、テロメラーゼ複合体における遺伝的欠陥（例えば、ＴＥＲＴまたはＴＥＲＣの変異）を修正する遺伝子編集システム（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム）を含むように操作されていてもよい。一般に、「ＣＲＩＳＰＲシステム」は、ＣＲＩＳＰＲ関連（「Ｃａｓ」）遺伝子の発現に関与するか、またはその活性を指示する転写物およびその他のエレメントを総称的に指し、ＣＲＩＳＰＲ関連（「Ｃａｓ」）遺伝子には、Ｃａｓ遺伝子をコードする配列、ｔｒａｃｒ（トランス活性化ＣＲＩＳＰＲ）配列（例えば、ｔｒａｃｒＲＮＡまたは活性な部分ｔｒａｃｒＲＮＡ）、ｔｒａｃｒメイト配列（内在性ＣＲＩＳＰＲシステムの文脈において、「ダイレクトリピート」およびｔｒａｃｒＲＮＡ－ｐｒｏｃｅｓｓｅｄパーシャルダイレクトリピートを包含する）、ガイド配列（内在性ＣＲＩＳＰＲシステムの文脈において、「スペーサー」とも呼ばれる）、ならびに／またはＣＲＩＳＰＲ部位由来の他の配列および転写物が含まれる。いくつかの態様において、ＣａｓヌクレアーゼおよびｇＲＮＡ（標的配列に特異的なｃｒＲＮＡと、配列が決まっているｔｒａｃｒＲＮＡの融合物を含む）を細胞に導入する。一般に、ｇＲＮＡの５’末端にある標的サイトは、相補的塩基対合を用いて、Ｃａｓヌクレアーゼをその標的サイト（例えば、遺伝子）に向ける。標的サイトは、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列（例えば、典型的にはＮＧＧ、またはＮＡＧ）のすぐ５’側である、その位置に基づいて選択され得る。この点に関し、ｇＲＮＡは、そのガイドＲＮＡの最初の２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１４、１２、１１、または１０ヌクレオチドを、標的ＤＮＡ配列に対応するように改変することによって、所望の配列に向けられる。一般に、ＣＲＩＳＰＲシステムは、標的配列の部位におけるＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を促進するエレメントによって特徴付けられる。典型的には、「標的配列」は、一般に、それに対してガイド配列が相補性を有するように設計された配列を指し、ここで、標的配列とガイド配列の間のハイブリダイゼーションによって、ＣＲＩＳＰＲ複合体の形成が促進される。ハイブリダイゼーションを引き起こし、ＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を促進する十分な相補性がある限り、完全な相補性は必ずしも必要ではない。そのようなシステムを含むように操作されたエキソソーム内のＣＲＩＳＰＲシステムは、標的細胞内部のゲノムＤＮＡを編集するように機能することができ、またはそのようなシステムが、エキソソーム自体の内部のＤＮＡを編集することができる。遺伝子編集システムを送達する手段としてのエキソソームの使用に関するさらなる態様については、米国特許出願番号第６２／５９９，３４０号（参照によりその全体が本明細書に援用される）を参照のこと。

タンパク質ベースの治療薬および核酸ベースの治療薬に加えて、エキソソームは、小分子薬物を、単独で、またはタンパク質ベースの治療薬もしくは核酸ベースの治療薬と組み合わせて送達するために使用してもよい。本実施形態における使用が意図される例示的な小分子薬物としては、それらに限定されないが、ＴＡ－６５（Ｈａｒｌｅｙら、Ｒｅｊｕｖｅｎａｔｉｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１４：４５－５６，２０１１）、エストロゲン、エリスロポエチン、レスベラトロール、シクロアストラゲノール（ＴＡＴ２）、ＴＡ－６５、ＴＡＴ１５３、およびオカダ酸があげられる。

用語「対象」は、本発明で使用される場合、対象となる方法が行われる任意の個体または患者を指す。一般に、対象はヒトであるが、当業者に理解されているように、対象は動物であってもよい。よって、哺乳類、例えばげっ歯類（マウス、ラット、ハムスター、およびモルモットを含む）、ネコ、イヌ、ウサギ、農場動物（ウシ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、ブタなどを含む）、および霊長類（サル、チンパンジー、オランウータン、およびゴリラを含む）を含む他の動物は、対象の定義に含まれる。

「処置（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」および「処置すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」は、疾患もしくは健康に関連する状態の治療的利益を得ることを目的として、対象に対して治療剤を投与もしくは適用すること、または対象に対して手順もしくはモダリティを実施することを指す。例えば、処置は、カーゴ運搬エキソソームを投与すること、化学療法、免疫療法、もしくは放射線療法を施すこと、外科手術を実施すること、またはそれらの組み合わせを含み得る。

用語「治療的利益」または「治療的に有効」は、本出願全体を通して使用される場合、この状態の医学的処置に関して、対象の福祉（ｗｅｌｌ－ｂｅｉｎｇ）を促進または増強するあらゆるものを指す。これには、それらに限定されないが、疾患の徴候もしくは症状の頻度もしくは重症度の低下が含まれる。例えば、がんの処置は、例えば、腫瘍の侵襲性の低下、がんの成長速度の低下、または転移の防止を含んでもよい。がんの処置は、また、がんを有する対象の生存期間を延長することを指してもよい。

用語「接触させる」および「曝露させる」は、細胞に適用する場合、本明細書において、それによって治療剤が標的細胞に送達されるプロセス、または治療剤が標的細胞に対して直接並置して配置されるプロセスを記述するために使用される。テロメアの伸長を実現するために、例えば、テロメラーゼの機能を増強するために有効な量の１つまたはそれを超える薬剤が、細胞に送達される。

処置に対する患者の有効な応答、または患者の「応答性」とは、疾患または障害のリスクがあるか、または疾患または障害に罹患している患者にもたらされる臨床的もしくは治療的利益を指す。そのような利益には、細胞応答または生物学的応答、完全奏効、部分奏効、安定病態（増悪も再発もない）、または後に再発がある応答が含まれる。本明細書に記載された方法によって、処置の成績を予測およびモニタリングすることができ、および／またはそのような処置から利益を受ける患者を同定または選択することができる。

疾患の処置について、治療用組成物の適切な投与量は、上で定義した処置される疾患の種類、疾患の重症度および経過、患者の臨床歴および薬剤に対する応答、および主治医の裁量によって決まるう。薬剤は、一度に、または一連の処置にわたって、患者に適切に投与される。

治療および予防の方法ならびに組成物は、所望の効果を実現するために効果的な、組み合わせた量で提供してもよい。組織、腫瘍、または細胞は、１つまたはそれを超える薬剤を含む１つまたはそれを超える組成物もしくは薬理学的製剤（単数または複数）と接触させてもよく、または組織、腫瘍、および／または細胞を、２つまたはそれを超える別々の組成物もしくは製剤と接触させることによって接触させてもよい。また、このような併用療法は、化学療法、放射線療法、外科療法、または免疫療法と組み合わせて使用できることが意図されている。

併用投与は、２つまたはそれを超える薬剤の、同じ剤形での同時投与、別々な剤形での同時投与、および別々の投与を含み得る。すなわち、対象とする治療用組成物と別の治療剤を、同じ剤形中に一緒に製剤化して、同時に投与してもよい。あるいは、対象とする治療用組成物と別の治療剤を、両方の薬剤が別々の製剤中に存在する状態で、同時に投与してもよい。別の選択肢において、対象とする治療剤を投与した直後に別の治療剤を投与してもよく、またはその逆であってもよい。別々の投与プロトコルにおいて、対象とする治療用組成物と別の治療剤は、数分間の間隔で、数時間の間隔で、または数日間の間隔で投与してもよい。
ＩＩＩ．医薬組成物

治療剤を発現するか、または含むエキソソームは、テロメラーゼ活性を増強するために、全身的または局所的に投与できることが意図されている。それらのエキソソームは、静脈内、髄腔内、および／または腹腔内に投与することができる。それらのエキソソームは、単独で投与してもよく、第２の薬物と組み合わせて投与してもよい。

本発明は、治療用調製物の特定の性質によって限定されることは意図されていない。例えば、このような組成物は、生理学的に忍容性がある液体、ゲル、固体担体、希釈剤、または賦形剤と一緒になった製剤で提供することができる。これらの治療用調製物は、哺乳類に対して、獣医学的用途（例えば飼育動物に対して）で、およびヒトにおける臨床用途で、他の治療剤と同様のやり方で投与してもよい。一般に、治療的有効性のために必要とされる投与量は、使用の種類および投与のモード、ならびに個々の対象の特定の必要性によって変わる。

臨床適用が意図される場合、意図する適用のために適切な形態でエキソソームを含む医薬組成物を調製することが必要となり得る。一般に、医薬組成物は、医薬的に許容され得る担体に溶解または分散させた、有効量の１つまたはそれを超えるエキソソーム、および／または追加の薬剤を含んでいてもよい。語句「医薬的または薬理学的に許容され得る」は、動物（例えば、適切であれば、ヒトなど）に投与した場合に、有害な反応、アレルギー性の反応、またはその他の不都合な反応を生じさせない分子的実体または組成物を指す。本明細書に開示されたエキソソームを含む医薬組成物の調製、または追加の活性成分は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、１８版、１９９０年（参照により本明細書に援用される）に例示されているように、本開示を考慮して、当業者によって理解される。さらに、動物（例えば、ヒト）への投与のためには、調製物は、ＦＤＡ Ｏｆｆｉｃｅ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｔａｎｄａｒｄｓによって要求される無菌性、発熱性、一般的な安全性、および純度の基準を満たすべきであることが理解されよう。

さらに、本発明のある特定の態様に従って、投与に適した組成物は、不活性な希釈剤を含むか、または含まない、医薬的に許容され得る担体中で提供され得る。本明細書で使用される場合、「医薬的に許容され得る担体」は、当業者に知られているように、あらゆる全ての水性溶媒（例えば、水、アルコール性／水性溶液、エタノール、食塩溶液、非経口ビヒクル（例えば、塩化ナトリウム、リンゲルデキストロース）など）、非水性溶媒（例えば、脂肪、油、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、植物油、および注射可能な有機エステル（例えば、オレイン酸エチル（ｅｔｈｙｌｏｌｅａｔｅ））、脂質、リポソーム、分散媒、コーティング（例えば、レシチン）、界面活性剤、抗酸化剤、保存剤（例えば、抗細菌剤または抗真菌剤、抗酸化剤、キレート剤、不活性ガス、パラベン（例えば、メチルパラベン、プロピルパラベン）、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサール、またはそれらの組み合わせ）、等張化剤（例えば、糖および塩化ナトリウム）、吸収遅延剤（例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチン）、塩、薬物、薬物安定剤、ゲル、樹脂、フィラー、結合剤、賦形剤、崩壊剤、滑沢剤、甘味剤、着香料、染料、流体および栄養補給剤、これらと同様の材料、およびそれらの組み合わせを含む。担体は、吸収可能であるべきであり、担体としては、液体、半固体（すわなち、ペースト）、または固体担体があげられる。加えて、所望により、組成物は、少量の補助的な物質、例えば、湿潤剤もしくは乳化剤、安定化剤、またはｐＨ緩衝剤を含んでいてもよい。ｐＨおよび医薬組成物中の種々のコンポーネントの正確な濃度は、周知のパラメーターに従って調整される。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングを使用することによって維持することができ、分散物のケースでは必要とされる粒径を維持することによって維持することができ、また界面活性剤を使用することによって維持することができる。

医薬的に許容され得る担体は、特にヒトへの投与のために配合されるが、ある特定の実施形態においては、非ヒト動物への投与のために配合されるが、ヒトへの投与のためには（例えば、政府の規制によって）許容できない医薬的に許容され得る担体の使用が望ましい場合がある。活性成分に対して非適合性である（例えば、レシピエントに対して不利益であるか、またはそれに含まれる組成物の治療的有効性に対して不利益である）場合を除き、任意の従来の担体は、治療用組成物または医薬組成物における使用が意図される。本発明のある特定の態様に従って、組成物は、任意の便宜で実際的なやり方、すなわち、溶解、懸濁、乳化、混合、カプセル化、吸収などによって、担体と混ぜ合わされる。このような手順は、当業者にとって日常的な作業である。

本発明のある特定の実施形態には、投与が固体、液体、またはエアロゾルの形態で行われるかどうか、および投与経路（例えば注射）のために無菌である必要があるかどうかに応じて、異なる種類の担体が含まれ得る。組成物は、当業者に知られているように、静脈内に、皮内に、経皮的に、髄腔内に、動脈内に、腹腔内に、鼻腔内に、腟内に、直腸内に、筋肉内に、皮下に、経粘膜的に、経口的に、局所的に、局部的に、吸入（例えば、エアロゾル吸入）によって、注射によって、注入によって、持続注入によって、標的細胞を直接浸す局部的な灌流によって、カテーテルによって、洗浄によって、脂質組成物（例えば、リポソーム）中で、もしくはその他の方法、または前述のものの任意の組み合わせによって投与することができる（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、１８版、１９９０年（参照により本明細書に援用される）を参照のこと）。

エキソソームは、非経口投与のために製剤化してもよく、例えば、静脈内注射、筋肉内注射、皮下注射のために、さらには腹腔内経路による注射のために製剤化してもよい。典型的には、このような組成物は、液体の液剤もしくは懸濁剤のいずれかとして調製してもよく；注射の前に液体を加えて液剤または懸濁剤を調製するための使用に適した固体形態で調製してもよく；また、調製物は乳化させてもよい。

注射での使用に適した医薬製剤としては、無菌の水性液剤または分散液剤；ゴマ油、ピーナッツ油、または水性プロピレングリコールを含む製剤；および滅菌された注射用液剤または分散液剤の即時調製用の無菌の粉剤・散剤（ｐｏｗｄｅｒ）があげられる。全てのケースにおいて、製剤は、無菌でなければならず、容易に注射できる程度に流体でなければならない。また、製造および保存条件下で安定であるべきであり、かつ微生物（例えば、細菌および真菌）の汚染作用に対して保護されていなければならない。

製剤化したら、液剤は、投与剤形に適合するやり方で、かつ治療的に有効な量で投与される。製剤は、例えば非経口投与のために製剤化した剤形（例えば、注射用液剤、または肺に送達するためのエアロゾル剤など）、または消化管投与のために製剤化した剤形（例えば、薬物放出カプセル剤など）などの種々の剤形で容易に投与される。

用語「単位用量」または「投与量」は、対象において使用するために適した物理的に別々の単位を指し、各単位は、その投与（すなわち、適切な経路および処置レジメン）に関連して上記で述べた、所望の応答を生じさせるように計算された所定量の治療用組成物を含む。投与される量（処置の回数と単位用量の両方による）は、所望の効果に依存する。患者または対象に投与される本発明の組成物の実際の投与量は、物理的因子および生理的因子、例えば、対象の体重、年齢、健康状態、および性別、処置される疾患の種類、疾患の浸透の程度、過去の治療的介入または並行する治療的介入、患者の特発性疾患、投与経路、ならびにその特定の治療用物質の力価、安定性、および毒性によって決定することができる。例えば、用量は、また、投与あたり約１μｇ／ｋｇ／体重～約１０００ｍｇ／ｋｇ／体重（このような範囲は、中間の用量を含む）またはそれを超える量、およびその中で導き出せる任意の範囲を含み得る。本明細書に列挙された数から導き出せる範囲の非限定的な例において、約５μｇ／ｋｇ／体重～約１００ｍｇ／ｋｇ／体重、約５μｇ／ｋｇ／体重～約５００ｍｇ／ｋｇ／体重などの範囲で投与することができる。別の例として、用量は、また、投与あたり約１０億～約５０００億のエキソソーム（このような範囲は、中間の用量を含む）またはそれを超えるエキソソーム、およびその中で導き出せる任意の範囲を含み得る。本明細書に列挙された数から導き出せる範囲の非限定的な例において、約１００万のエキソソーム～約５０００億のエキソソーム、約５００万のエキソソーム～約２５００億のエキソソームなどの範囲で投与することができる。１つの例において、用量は、体積５ｍＬ中に約１５００億のエキソソームを含んでいてもよく、そのような用量は、体重７０ｋｇのヒト患者に投与されてもよい。いずれにせよ、投与に責任を有する従事者が、組成物中の活性成分（単数または複数）の濃度、および個々の対象に対する適切な用量（単数または複数）を決定する。

動物患者に投与される組成物の実際の投与量は、物理的因子および生理的因子、例えば、体重、状態の重症度、処置される疾患の種類、過去の治療的介入または並行する治療的介入、患者の特発性疾患、および投与経路によって決定することができる。投与量および投与経路に応じて、好ましい投与量および／または有効量の投与回数は、対象の応答によって変更してもよい。いずれにせよ、投与に責任を有する従事者が、組成物中の活性成分（単数または複数）の濃度、および個々の対象に対する適切な用量（単数または複数）を決定する。

ある特定の実施形態において、医薬組成物は、例えば、少なくとも約０．１％の活性化合物を含んでいてもよい。他の実施形態において、活性化合物は、例えば、単位の重量の約２％～約７５％、または約２５％～約６０％、およびその中で導き出せる任意の範囲を構成し得る。当然ながら、治療的に有用な各組成物中の活性化合物（単数または複数）の量は、化合物の任意の所与の単位用量中で適切な投与量が得られるように調製してもよい。溶解性、バイオアベイラビリティ、生物学的半減期、投与経路、製品の貯蔵寿命などの因子、ならびにその他の薬理学的な考慮事項が、そのような医薬製剤調製の技術分野における当業者によって意図され、そうであるから、種々の投薬量および処置レジメンが望ましい場合がある。

他の非限定的な例において、用量は、また、投与あたり、約１マイクログラム／ｋｇ／体重から、約５マイクログラム／ｋｇ／体重から、約１０マイクログラム／ｋｇ／体重から、約５０マイクログラム／ｋｇ／体重から、約１００マイクログラム／ｋｇ／体重から、約２００マイクログラム／ｋｇ／体重から、約３５０マイクログラム／ｋｇ／体重から、約５００マイクログラム／ｋｇ／体重から、約１ミリグラム／ｋｇ／体重から、約５ミリグラム／ｋｇ／体重から、約１０ミリグラム／ｋｇ／体重から、約５０ミリグラム／ｋｇ／体重から、約１００ミリグラム／ｋｇ／体重から、約２００ミリグラム／ｋｇ／体重から、約３５０ミリグラム／ｋｇ／体重から、約５００ミリグラム／ｋｇ／体重から、約１０００ミリグラム／ｋｇ／体重まで、またはそれを超える量、およびその中で導き出せる任意の範囲を含み得る。本明細書に列挙された数から導き出せる範囲の非限定的な例において、上記の数に基づき、約５ミリグラム／ｋｇ／体重～約１００ミリグラム／ｋｇ／体重、約５マイクログラム／ｋｇ／体重～約５００ミリグラム／ｋｇ／体重などの範囲で投与することができる。
ＩＶ．エキソソームカーゴ
Ａ．核酸およびベクター

本発明のある特定の態様において、治療用タンパク質または抗体をコードする核酸配列が開示され得る。どの発現系が使用されるかに応じて、核酸配列は、従来の方法に基づいて選択することができる。例えば、それぞれの遺伝子またはそのバリアントは、ある特定の系における発現に対してコドン最適化され得る。種々のベクターもまた、目的のタンパク質を発現させるために使用することができる。例示的なベクターとしては、それらに限定されないが、プラスミドベクター、ウイルスベクター、トランスポゾン、またはリポソームベースのベクターがあげられる。
Ｂ．組換えタンパク質

いくつかの実施形態は、組換えタンパク質およびポリペプチド、例えば、治療用抗体などに関する。いくつかの態様において、治療用抗体は、細胞内タンパク質に対して特異的または選択的に結合する抗体であってもよい。さらなる態様において、タンパク質またはポリペプチドは、血清安定性を増加させるために改変されていてもよい。よって、本出願において「改変タンパク質」または「改変ポリペプチド」の機能または活性に言及する場合、当業者は、例えば、改変されていないタンパク質またはポリペプチドに対してさらなる利点を有するタンパク質またはポリペプチドが含まれることを理解する。「改変タンパク質」に関する実施形態は、「改変ポリペプチド」について実施することができ、その逆も同じであることが特に意図されている。

本明細書で使用される場合、タンパク質またはペプチドは、一般に、それらに限定されないが、約２００アミノ酸より大きく、最大で遺伝子から翻訳される完全長配列までのタンパク質；約１００アミノ酸より大きいポリペプチド；および／または約３～約１００アミノ酸のペプチドを指す。便宜のために、用語「タンパク質」、「ポリペプチド」、および「ペプチド」は、本明細書において、互換的に使用される。

本明細書で使用される場合、「アミノ酸残基」は、当該技術分野で知られている任意の天然に存在するアミノ酸、任意のアミノ酸誘導体、または任意のアミノ酸模倣物を指す。ある特定の実施形態において、タンパク質またはペプチドの残基は、連続的であり、アミノ酸残基の配列を中断するいかなる非アミノ酸も含まない。他の実施形態において、配列は、１つまたはそれを超える非アミノ酸部分を含んでいてもよい。特定の実施形態において、タンパク質またはペプチドの残基の配列は、１つまたはそれを超える非アミノ酸部分によって中断されていてもよい。

したがって、用語「タンパク質またはペプチド」は、天然に存在するタンパク質中に見出される２０種類の一般的なアミノ酸の少なくとも１つ、または少なくとも１つの改変または普通でないアミノ酸を含むアミノ酸配列を包含する。
Ｃ．阻害性ＲＮＡ

ｓｉＲＮＡ（例えば、ｓｉＮＡ）は、当該技術分野において周知である。例えば、ｓｉＲＮＡおよび二本鎖ＲＮＡは、米国特許第６，５０６，５５９号および米国特許第６，５７３，０９９号、ならびに米国特許出願第２００３／００５１２６３号、第２００３／００５５０２０号、第２００４／０２６５８３９号、第２００２／０１６８７０７号、第２００３／０１５９１６１号、および第２００４／００６４８４２（これらの全ては、参照によりその全体が本明細書に援用される）に記載されている。

ｓｉＲＮＡ内において、核酸のコンポーネントは、全体を通して同じタイプまたは相同のタイプ（ｔｈｅ ｓａｍｅ ｔｙｐｅ ｏｒ ｈｏｍｏｇｅｎｏｕｓ）である必要はない（例えば、ｓｉＲＮＡは、ヌクレオチドおよび核酸またはヌクレオチドアナログを含んでいてもよい）。典型的には、ｓｉＲＮＡは、二本鎖構造を形成し；この二本鎖構造は、部分的または完全に相補的な２つの別個の核酸に起因していてもよい。本発明のある特定の実施形態において、ｓｉＲＮＡは、単一の核酸（ポリヌクレオチド）または核酸アナログのみを含み、それ自体で補完することによって二本鎖構造を形成（例えば、ヘアピンループを形成）してもよい。ｓｉＲＮＡの二本鎖構造は、１６個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、６０個、６５個、７０個、７５個、８０個、８５個、９０個、１００個、１５０個、２００個、２５０個、３００個、３５０個、４００個、４５０個、５００個、またはそれを超える個数の連続した核酸塩基（それらの中の全ての範囲を含む）を含んでいてもよい。ｓｉＲＮＡは、相補的核酸（同じ核酸の別の部分であってもよく、または別個の相補的核酸であってもよい）とハイブリダイズして二本鎖構造を形成する、１７～３５個の連続した核酸塩基、より好ましくは１８～３０個の連続した核酸塩基、より好ましくは１９～２５個の核酸塩基、より好ましくは２０～２３個の連続した核酸塩基、もしくは２０～２２個の連続した核酸塩基、または２１個の連続した核酸塩基を含んでいてもよい。

本発明の方法を実施するために有用な本発明の薬剤としては、それらに限定されないが、ｓｉＲＮＡがあげられる。典型的には、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）（本明細書において、別称として低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）と呼ばれることがある）の導入により、強力で特異的な遺伝子サイレンシング（ＲＮＡ干渉またはＲＮＡｉと呼ばれる現象）が誘導される。ＲＮＡ干渉は、「共抑制」、「転写後遺伝子サイレンシング」、「センス抑制」、および「クエリング（ｑｕｅｌｌｉｎｇ）」と呼ばれてきた。ＲＮＡｉは、特定の遺伝子の活性をノックアウトする手段を提供するため、魅力的なバイオテクノロジーツールである。

ＲＮＡｉの設計において、ｓｉＲＮＡの性質、サイレンシング効果の持続性、および送達システムの選択など、いくつかの因子を考慮する必要がある。ＲＮＡｉ効果を生じさせるために、生物に導入されるｓｉＲＮＡは、典型的にはエクソン配列を含有する。さらに、ＲＮＡｉプロセスは相同性依存的であるため、その配列は、相同ではあるが遺伝子特異的ではない配列間の交差干渉の可能性を最小にしつつ、遺伝子特異性が最大になるように注意深く選択しなければならない。好ましくは、ｓｉＲＮＡは、そのｓｉＲＮＡの配列と阻害される遺伝子との間で、８０％超、８５％超、９０％超、９５％超、９８％超、または、さらには１００％の同一性を示す。標的遺伝子に対する同一性が約８０％未満の配列は、実質的に有効性が低い。よって、ｓｉＲＮＡと阻害される遺伝子との間の相同性が大きいほど、無関係な遺伝子の発現が影響を受ける可能性は低い。

さらに、ｓｉＲＮＡのサイズは、重要な考慮事項である。いくつかの実施形態において、本発明は、少なくとも約１９～２５個のヌクレオチドを含有し、かつ遺伝子発現をモジュレートすることができるｓｉＲＮＡ分子に関する。本発明の文脈において、ｓｉＲＮＡは、好ましくは、長さが５００ヌクレオチド未満、２００ヌクレオチド未満、１００ヌクレオチド未満、５０ヌクレオチド未満、または２５ヌクレオチド未満である。より好ましくは、ｓｉＲＮＡは、長さが約１９ヌクレオチド～約２５ヌクレオチドである。

標的遺伝子は、一般に、ポリペプチドをコードする領域を含むポリヌクレオチド、または、複製、転写、もしくは翻訳、もしくはポリペプチドの発現に重要な他のプロセスを調節するポリヌクレオチド領域、または、ポリペプチドをコードする領域とそこに作動可能に連結された、発現を調節する領域の両方を含むポリヌクレオチド、を意味する。細胞内で発現している任意の遺伝子が標的とされ得る。好ましくは、標的遺伝子は、疾患に重要な細胞活性の増悪に関与または関係するもの、または研究目的として特に興味深いものである。

ｓｉＲＮＡは、商業的供給源から得ることができ、天然源から得ることができ、または当業者に周知の多数の技術のいずれかを用いて合成することができる。例えば、予め設計されたｓｉＲＮＡの商業的供給源の１つは、Ａｍｂｉｏｎ（登録商標）（Ａｕｓｔｉｎ、Ｔｅｘ）である。別の１つは、Ｑｉａｇｅｎ（登録商標）（Ｖａｌｅｎｃｉａ、Ｃａｌｉｆ．）である。本発明の組成物および方法において適用することができる阻害性核酸は、目的のタンパク質の確かなダウンレギュレーターであることが任意のソースによって確認されている、任意の核酸配列であり得る。過度な実験を行うことなく、本発明の開示を用いて、本発明の方法を実施するために、さらなるｓｉＲＮＡを設計し、使用できることが理解される。

ｓｉＲＮＡは、また、１つまたはそれを超えるヌクレオチドの変更を含んでいてもよい。このような変更は、例えば、１９～２５ヌクレオチドのＲＮＡの末端（単数または複数）への非ヌクレオチド材料の追加、または内部的な（ＲＮＡの１つまたはそれを超えるヌクレオチドにおける）追加を含んでいてもよい。ある特定の態様において、ＲＮＡ分子は、３’－ヒドロキシル基を含有する。本発明のＲＮＡ分子中のヌクレオチドは、また、非標準的なヌクレオチド（天然に存在しないヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドが含まれる）を含んでいてもよい。二本鎖オリゴヌクレオチドは、修飾されたバックボーン、例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、もしくは当該技術分野で知られているその他の修飾されたバックボーンを含んでいてもよく、または非天然のヌクレオシド間結合を含んでいてもよい。ｓｉＲＮＡのさらなる改変（例えば、２’－Ｏ－メチルリボヌクレオチド、２’－デオキシ－２’－フルオロリボヌクレオチド、「ユニバーサル塩基」ヌクレオチド、５－Ｃ－メチルヌクレオチド、１つまたはそれを超えるホスホロチオエートヌクレオチド間結合、および逆位デオキシ無塩基残基の組み込み）は、米国特許出願公開第２００４／００１９００１号および米国特許第６，６７３，６１１号（これらは、それぞれ参照によりその全体が援用される）中に見出すことができる。上記の変更された核酸またはＲＮＡの全てを総称して、改変ｓｉＲＮＡと呼ぶ。
Ｄ．遺伝子編集システム

一般に、「ＣＲＩＳＰＲシステム」は、ＣＲＩＳＰＲ関連（「Ｃａｓ」）遺伝子の発現に関与するか、またはその活性を指示する転写物およびその他のエレメントを総称的に指し、ＣＲＩＳＰＲ関連（「Ｃａｓ」）遺伝子には、Ｃａｓ遺伝子をコードする配列、ｔｒａｃｒ（トランス活性化ＣＲＩＳＰＲ）配列（例えば、ｔｒａｃｒＲＮＡまたは活性な部分ｔｒａｃｒＲＮＡ）、ｔｒａｃｒメイト配列（内在性ＣＲＩＳＰＲシステムの文脈において、「ダイレクトリピート」およびｔｒａｃｒＲＮＡ－ｐｒｏｃｅｓｓｅｄパーシャルダイレクトリピートを包含する）、ガイド配列（内在性ＣＲＩＳＰＲシステムの文脈において、「スペーサー」とも呼ばれる）、ならびに／またはＣＲＩＳＰＲ部位由来の他の配列および転写物が含まれる。

ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓヌクレアーゼまたはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼシステムは、非コードＲＮＡ分子（ガイド）ＲＮＡ（これは、配列特異的にＤＮＡに結合する）、およびヌクレアーゼ機能性（例えば、２つのヌクレアーゼドメイン）を有するＣａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ９）を含んでいてもよい。ＣＲＩＳＰＲシステムの１つまたはそれを超えるエレメントは、タイプＩ、タイプＩＩ、またはタイプＩＩＩＣＲＩＳＰＲシステム由来であってもよく、例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓなどの、内在性ＣＲＩＳＰＲシステムを含む特定の生物由来であってもよい。

いくつかの態様において、ＣａｓヌクレアーゼおよびｇＲＮＡ（標的配列に特異的なｃｒＲＮＡと、配列が決まっているｔｒａｃｒＲＮＡの融合物を含む）を細胞に導入する。一般に、ｇＲＮＡの５’末端にある標的サイトは、相補的塩基対合を用いて、Ｃａｓヌクレアーゼをその標的サイト（例えば、遺伝子）に向ける。標的サイトは、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列（例えば、典型的にはＮＧＧ、またはＮＡＧ）のすぐ５’側である、その位置に基づいて選択され得る。この点に関し、ｇＲＮＡは、そのガイドＲＮＡの最初の２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１４、１２、１１、または１０ヌクレオチドを、標的ＤＮＡ配列に対応するように改変することによって、所望の配列に向けられる。一般に、ＣＲＩＳＰＲシステムは、標的配列の部位におけるＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を促進するエレメントによって特徴付けられる。典型的には、「標的配列」は、一般に、それに対してガイド配列が相補性を有するように設計された配列を指し、ここで、標的配列とガイド配列の間のハイブリダイゼーションによって、ＣＲＩＳＰＲ複合体の形成が促進される。ハイブリダイゼーションを引き起こし、ＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を促進する十分な相補性がある限り、完全な相補性は必ずしも必要ではない。

ＣＲＩＳＰＲシステムは、本明細書において述べるように、標的サイトにおいて二本鎖切断（ＤＳＢｓ）を誘導し、次いでそれを破壊することができる。他の実施形態において、Ｃａｓ９バリアント（「ニッカーゼ」とみなされる）が、標的サイトにおいて一本鎖にニックを入れるために使用される。ペアのニッカーゼを、例えば、特異性を向上させるために使用することができ、各ニッカーゼは、同時にニックが導入されると５’オーバーハングが導入されるように、１組の異なるｇＲＮＡターゲティング配列によって方向付けられている。他の実施形態において、触媒的に不活性なＣａｓ９が、遺伝子発現に影響を及ぼすように、異種性のエフェクタードメイン（例えば、転写抑制因子または転写活性化因子）に融合される。

標的配列は、任意のポリヌクレオチド、例えばＤＮＡまたはＲＮＡポリヌクレオチドを含んでいてもよい。標的配列は、細胞の核または細胞質中に、例えば、細胞のオルガネラ内に位置していてもよい。一般に、標的配列を含む標的部位中への組換えに使用され得る配列またはテンプレートは、「編集テンプレート」、または「編集ポリヌクレオチド」もしくは「編集配列」と呼ばれる。いくつかの態様において、外来性のテンプレートポリヌクレオチドは、編集テンプレートと呼ばれる。いくつかの態様において、組換えは、相同組換えである。

典型的には、内在性ＣＲＩＳＰＲシステムの文脈において、ＣＲＩＳＰＲ複合体（標的配列とハイブリダイズし、１つまたはそれを超えるＣａｓタンパク質と複合体を形成したガイド配列を含む）の形成によって、標的配列中、または標的配列近傍（例えば、標的配列から１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、５０、またはそれを超える塩基対以内）における、一方または両方の鎖の切断という結果がもたらされる。ｔｒａｃｒ配列（野生型ｔｒａｃｒ配列の全体を含んでいても、それから構成されていてもよく、または野生型ｔｒａｃｒ配列の一部（例えば、野生型ｔｒａｃｒ配列の、約２０、約２６、約３２、約４５、約４８、約５４、約６３、約６７、約８５、もしくはそれを超える、または約２０超、約２６超、約３２超、約４５超、約４８超、約５４超、約６３超、約６７超、約８５超、もしくはそれを超えるヌクレオチド）を含んでいても、それから構成されていてもよい）は、また、例えば、ガイド配列に作動可能に連結されたｔｒａｃｒメイト配列の全体または一部に対する少なくともｔｒａｃｒ配列の一部に沿ったハイブリダイゼーションによって、ＣＲＩＳＰＲ複合体の一部を形成してもよい。ｔｒａｃｒ配列は、ｔｒａｃｒメイト配列に対して、ハイブリダイズし、かつ、ＣＲＩＳＰＲ複合体の形成に関与するために十分な相補性、例えば、最適にアラインされた場合、ｔｒａｃｒメイト配列の長さに沿って、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％の配列相補性を有する。

ＣＲＩＳＰＲシステムのエレメントの発現が、１つまたはそれを超える標的サイトにおいて、ＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を指示するように、ＣＲＩＳＰＲシステムの１つまたはそれを超えるエレメントの発現を推進する１つまたはそれを超えるベクターを、細胞内に導入してもよい。コンポーネントもまた、タンパク質および／またはＲＮＡとして細胞に送達されてもよい。例えば、Ｃａｓ酵素、ｔｒａｃｒメイト配列に連結されたガイド配列、およびｔｒａｃｒ配列は、それぞれ別々のベクター上の、別々の調節エレメントに作動可能に連結されていてもよい。あるいは、同じか、または異なる調節エレメントから発現される２つまたはそれを超えるエレメントが、単一のベクター内で組み合わされ、かつ、１つまたはそれを超える追加のベクターが、第１のベクターに含まれていないＣＲＩＳＰＲシステムの任意のコンポーネントをもたらしてもよい。ベクターは、制限エンドヌクレアーゼ認識配列などの１つまたはそれを超える挿入部位（「クローニングサイト」とも呼ばれる）を含んでいてもよい。いくつかの実施形態において、１つまたはそれを超える挿入部位は、１つまたはそれを超えるベクターの１つまたはそれを超える配列エレメントの上流および／または下流に位置している。複数の異なるガイド配列が使用される場合、単一の発現構築物が、ＣＲＩＳＰＲ活性を、細胞内の複数の異なる対応する標的配列に向けるために使用され得る。

ベクターは、Ｃａｓタンパク質などのＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする酵素コード配列に作動可能に連結されている調節エレメントを含んでいてもよい。Ｃａｓタンパク質の非限定的な例としては、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９（Ｃｓｎ１およびＣｓｘ１２としても知られる）、Ｃａｓ１０、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆｌ、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４、それらのホモログ、またはそれらの改変形態があげられる。これらの酵素は知られており；例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９タンパク質のアミノ酸配列は、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔデータベース中に、受託番号Ｑ９９ＺＷ２で見出すことができる。

ＣＲＩＳＰＲ酵素は、Ｃａｓ９（例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓまたはＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａ由来の）であってもよい。ＣＲＩＳＰＲ酵素は、標的配列の位置、例えば標的配列内および／または標的配列の相補配列内における一方または両方の鎖の切断を指示することができる。ベクターは、改変されたＣＲＩＳＰＲ酵素が、標的配列を含む標的ポリヌクレオチドの一方または両方の鎖を切断する能力を欠くように、対応する野生型酵素に対して改変されたＣＲＩＳＰＲ酵素をコードしていてもよい。例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＣａｓ９のＲｕｖＣ Ｉ触媒ドメインにおけるアスパラギン酸からアラニンへの置換（Ｄ１０Ａ）は、Ｃａｓ９を、両方の鎖を切断するヌクレアーゼからニッカーゼ（一本鎖を切断する）に変換する。いくつかの実施形態において、Ｃａｓ９ニッカーゼは、例えば、それぞれがＤＮＡ標的のセンス鎖およびアンチセンス鎖を標的とする２つのガイド配列などの、ガイド配列（単数または複数）と組み合わせて使用してもよい。この組み合わせによって、両方の鎖にニックが入れられ、ＮＨＥＪまたはＨＤＲを導入するために使用することが可能になる。

いくつかの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする酵素コード配列は、真核細胞などの特定の細胞の発現に対してコドン最適化されている。真核細胞は、哺乳動物などの特定の生物の細胞、またはそのような生物に由来する細胞であってもよく、哺乳動物としては、それらに限定されないが、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、または非ヒト霊長類があげられる。一般に、コドン最適化は、目的の宿主細胞における発現を増加させるために、天然の配列の少なくとも１つのコドンを、その天然のアミノ酸配列を維持しつつ、目的の宿主細胞の遺伝子においてより高頻度または最も高頻度に使用されているコドンで置き換えることによって、核酸配列を改変するプロセスを指す。種々の型において、特定のアミノ酸のある特定のコドンについて特定のバイアスが見られる。コドンバイアス（生物間のコドン使用頻度の相異）は、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の翻訳効率（これは、また、とりわけ翻訳されているコドンの性質、および特定のトランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）分子の利用可能性に依存すると考えられている）に関連することが多い。細胞における選択されたｔＲＮＡの優位性は、一般に、ペプチド合成において最も高頻度に用いられるコドンを反映している。したがって、コドン最適化に基づいて、所与の生物における最適な遺伝子発現のために、遺伝子を調整することができる。

一般に、ガイド配列は、標的ポリヌクレオチド配列との十分な相補性を有し、その標的配列とハイブリダイズし、ＣＲＩＳＰＲ複合体のその標的配列への配列特異的結合を指示する、任意のポリヌクレオチド配列である。いくつかの実施形態において、ガイド配列と、それに対応する標的配列の間の相補性の程度は、適切なアライメントアルゴリズムを用いて最適にアラインした場合、約５０％、約６０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９７．５％、約９９％、もしくはそれを超えるか、または約５０％超、約６０％超、約７５％超、約８０％超、約８５％超、約９０％超、約９５％超、約９７．５％超、約９９％超、もしくはそれを超える。

最適なアライメントは、配列をアラインするための任意の適切なアルゴリズムを使用して決定することができ、そのようなアルゴリズムとしては、それらに限定されないが、Ｓｍｉｔｈ－Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム、Ｂｕｒｒｏｗｓ－Ｗｈｅｅｌｅｒ変換に基づくアルゴリズム（例えば、Ｂｕｒｒｏｗｓ Ｗｈｅｅｌｅｒ Ａｌｉｇｎｅｒ）、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗ、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｘ、ＢＬＡＴ、Ｎｏｖｏａｌｉｇｎ（Ｎｏｖｏｃｒａｆｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＥＬＡＮＤ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．），ＳＯＡＰ（ｓｏａｐ．ｇｅｎｏｍｉｃｓ．ｏｒｇ．ｃｎで利用可能）、およびＭａｑ（ｍａｑ．ｓｏｕｒｃｅｆｏｒｇｅ．ｎｅｔで利用可能）があげられる。

ＣＲＩＳＰＲ酵素は、１つまたはそれを超える異種性のタンパク質ドメインを含む融合タンパク質の一部であってもよい。ＣＲＩＳＰＲ酵素融合タンパク質は、任意の追加のタンパク質配列、および、必要に応じて、任意の２つのドメイン間に、リンカー配列を含んでいてもよい。ＣＲＩＳＰＲ酵素に融合し得るタンパク質ドメインの例としては、限定するものではないが、エピトープタグ、レポーター遺伝子配列、および以下の活性のうちの１つまたはそれを超える活性を有するタンパク質ドメインがあげられ、その活性とは、メチラーゼ活性、脱メチル化酵素活性、転写活性化活性、転写抑制活性、転写放出因子活性、ヒストン修飾活性、ＲＮＡ切断活性、および核酸結合活性である。エピトープタグの非限定的な例としては、ヒスチジン（Ｈｉｓ）タグ、Ｖ５タグ、ＦＬＡＧタグ、インフルエンザヘマグルチニン（ＨＡ）タグ、Ｍｙｃタグ、ＶＳＶ－Ｇタグ、およびチオレドキシン（Ｔｒｘ）タグがあげられる。レポーター遺伝子の例としては、それらに限定されないが、グルタチオン－５－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）ベータガラクトシダーゼ、ベータグルクロニダーゼ、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ＨｃＲｅｄ、ＤｓＲｅｄ、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、および青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）を含む自己蛍光タンパク質があげられる。ＣＲＩＳＰＲ酵素は、ＤＮＡ分子に結合もしくはその他の分子に結合するタンパク質またはタンパク質のフラグメント（それらに限定されないが、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、Ｓタグ、Ｌｅｘ Ａ ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）融合物、ＧＡＬ４Ａ ＤＮＡ結合ドメイン融合物、および単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ＢＰ１６タンパク質融合物を含む）をコードする遺伝子配列に融合されてもよい。ＣＲＩＳＰＲ酵素を含む融合タンパク質の一部を形成し得るさらなるドメインは、ＵＳ２０１１００５９５０２（参照により本明細書に援用される）に記載されている。
Ｖ．キットおよび診断

本発明の種々の態様において、体液または組織培養培地からエキソソームを精製するために必要なコンポーネントを含むキットが意図される。他の態様において、エキソソームを単離し、それを治療用核酸、治療用タンパク質、または阻害性ＲＮＡでトランスフェクトするために必要なコンポーネントを含むキットが意図される。キットは、このようなコンポーネントのいずれかを含む１つまたはそれを超える密封バイアルを含んでいてもよい。いくつかの実施形態において、キットは、また、キットのコンポーネントと反応しない容器である適切な容器手段（例えばエッペンドルフチューブ、アッセイプレート、シリンジ、ボトル、または管）を含んでいてもよい。容器は、プラスチックまたはガラスなどの滅菌可能な材料から作られていてもよい。キットは、本明細書に記載された方法の手順のステップの概要を示す指示書をさらに含んでいてもよく、本明細書に記載されたものと実質的に同じ手順に従うか、または当業者に知られている。指示の情報は、コンピューターを使用して実行した場合に、サンプルからエキソソームを精製し、そのエキソソームを治療用カーゴでトランスフェクトする実際の手順または仮想的な手順を表示させる機械可読指示（ｍａｃｈｉｎｅ－ｒｅａｄａｂｌｅ ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ）を含む、コンピューター可読媒体中にあってもよい。
ＶＩ．実施例

以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態を説明するために含められている。以下の実施例において開示されている技術は、本発明の実施において良好に機能することが本発明者らによって見出された技術を示し、したがって、本発明の実施のための好ましいモードを構成するものとみなされ得ることを、当業者は理解すべきである。しかしながら、当業者は、本開示を考慮して、開示されている特定の実施形態に対して多くの変更を加えることができ、それでもなお、本発明の趣旨および範囲を逸脱することなく、同様または類似の結果が得られ得ることを理解すべきである。

サルにおける間葉系幹細胞由来エキソソームの体内分布
３匹の雄のアカゲザルの成体（体重６ｋｇ）を使用した。１匹は、ＰＨＫ－６７標識エキソソームの静脈内投与を受け；１匹は、ＤｉＲ標識エキソソームの静脈内投与を受け；１匹は、ＤｉＲ標識エキソソームの腹腔内投与を受けた。エキソソーム投与の前に、それぞれのサルから、５ｍＬの全血を採取した。エキソソーム投与は、ＮａｎｏＳｉｇｈｔポストラベリングで評価して、６８０億のエキソソームを含む２．５ｍＬからなるものであった。アカゲザルは、エキソソーム投与の２４時間後に安楽死させた。尿の採取を行った。血液は、以下のようにして採取した：２×５ｍＬ全血、２×５ｍＬ ＥＤＴＡ、２×５ｍＬヘパリン。臓器を採取して、ホルマリン固定のために処理し、ＨＥ染色のためにパラフィン包埋し、液体窒素中で急速凍結させ、ＯＣＴ包埋し、ドライアイス上でゆっくりと冷却するか、または臓器を採取して、ＩＶＩＳイメージングのために新鮮な状態に保った。大腿骨から骨髄を採取した。イメージング結果によって、エキソソームが、膵臓（図１Ａ～Ｂ）、肝臓（図１Ｃ～Ｄ）、および脳（図１Ｅ）に局在することが示された。

エキソソームを用いたｔｄＴｏｍａｔｏ ｍＲＮＡ送達
プリンシパル（ｐｒｉｎｃｉｐａｌ）の実証として、２９３Ｔ細胞を、ｔｄＴｏｍａｔｏをコードするプラスミドＤＮＡまたはＲＮＡのいずれかでトランスフェクトした（図８Ｃ）。トランスフェクトした細胞を、トランスフェクションの２４時間後に、ＦＡＣＳ（図８Ａ）および免疫蛍光（図８Ｂ）を用いてアッセイした。次に、２９３Ｔ細胞をｔｄＴｏｍａｔｏ ｍＲＮＡで電気穿孔したエキソソームで処理し、２４時間後にＦＡＣＳを用いてアッセイした（図８Ｄ）。２９３Ｔ細胞を、同様に、ＥｘｏｆｅｃｔとｔｄＴｏｍａｔｏ ｍＲＮＡまたはプラスミドＤＮＡで処理したエキソソームでトランスフェクトした。細胞を、２４時間後に、ｔｄＴｏｍａｔｏ発現（図８ＥおよびＦ）および細胞生存率（図８ＨおよびＩ）について、ＦＡＣＳによってアッセイした。細胞を、同様に、ｔｄＴｏｍａｔｏ発現について、免疫蛍光によってアッセイした（図８Ｇ）。最後に、Ｅｘｏｆｅｃｔを用いたエキソソームによるｍＲＮＡの送達を、Ｕ２ＯＳ細胞を用いて可視化した（図８Ｊ）。

抗加齢療法のためのテロメラーゼエキソソーム
プリンシパル（ｐｒｉｎｃｉｐａｌ）の実証として、ＢＪ細胞を、９６時間の時間経過にわたって、リポフェクタミンを用いて、ｉｎ ｖｉｔｒｏで転写されたｈＴＥＲＴ ｍＲＮＡ（図２Ａ）でトランスフェクトした。この時間経過の間、ｍＲＮＡを細胞から単離し、ｈＴＥＲＴ ｍＲＮＡのレベルをｑＰＣＲによって評価した。ｈＴＥＲＴ ｍＲＮＡレベルは、２４時間にわたって、比較的一定のままであった（図２Ｂ）。同様にこの時間経過の間、タンパク質を単離し、テロメラーゼ活性について試験した。相対テロメラーゼ活性は、トランスフェクション後２４時間の間、上昇したままであった（図２ＣおよびＤ）。

ＢＪ細胞を、同様に、９６時間の時間経過にわたって、リポフェクタミンを用いて、ｉｎ ｖｉｔｒｏで転写された改変ｈＴＥＲＴ ｍＲＮＡ（ｈＴＥＲＴ ｍｏｄＲＮＡ）でトランスフェクトした。この時間経過の間、ｍＲＮＡを細胞から単離し、ｈＴＥＲＴ ｍＲＮＡのレベルをｑＰＣＲによって評価した。ｈＴＥＲＴ ｍＲＮＡレベルは、２４時間にわたって、比較的一定のままであった（図２Ｅ）。同様にこの時間経過の間、タンパク質を単離し、テロメラーゼ活性について試験した。相対テロメラーゼ活性は、トランスフェクション後２４時間の間、上昇したままであった（図２Ｆ）。注目すべきことに、ドミナントネガティブｈＴＥＲＴ ｍｏｄＲＮＡは、テロメラーゼ活性を上昇させなかった（図２Ｇ）。

細胞生存率に対するｈＴＥＲＴ ｍＲＮＡおよびｈＴＥＲＴ ｍｏｄＲＮＡの効果を、細胞を２４時間または４８時間のいずれかの時間トランスフェクトし、その培養物を細胞死についてアッセイすることによって試験した。ｈＴＥＲＴ ｍＲＮＡは細胞死を誘導するが、ｈＴＥＲＴ ｍｏｄＲＮＡは誘導しないことが見出された（図２Ｈ）。

細胞老化に対するｈＴＥＲＴ ｍｏｄＲＮＡの効果を、リポフェクタミンを用いて、細胞をｈＴＥＲＴ ｍｏｄＲＮＡで３週間にわたって４回処理することによって試験した。リポフェクタミン単独を対照として使用した。最後に細胞を採取し、βガラクトシダーゼ発現について評価した。ｈＴＥＲＴ ｍｏｄＲＮＡによる処理は、細胞老化のレベルを低下させたが、ドミナントネガティブｈＴＥＲＴ ｍｏｄＲＮＡによる処理は低下させなかった（図２ＩおよびＪ）。

ＦＩＳＨで検出したときのテロメアシグナルに対するｈＴＥＲＴ ｍｏｄＲＮＡの効果を、リポフェクタミンを用いて、細胞をｈＴＥＲＴ ｍｏｄＲＮＡで３週間にわたって４回処理することによって検出した。リポフェクタミン単独を対照として使用した。最後に細胞を採取し、ＰＮＡ－ＦＩＳＨを用いてテロメアシグナルを評価した。細胞をイメージングし、テロメアシグナルを、シグナル積分密度（ｓｉｇｎａｌ ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ｄｅｎｓｉｔｙ）に基づいてソフトウェアを用いて評価した。ｈＴＥＲＴ ｍｏｄＲＮＡによる処理は、より高いテロメアシグナルを示す細胞の相対頻度を増加させた（図２Ｋ）。

次に、ＢＪ細胞を、ｈＴＥＲＴ ｍｏｄＲＮＡで電気穿孔したエキソソームを用いて調べた。エレクトロポレーション後のエキソソームにおけるｍｏｄＲＮＡの発現（図３Ｂに示すプライマーを使用して行った）が、より効率的であることを示す（図３Ａ）。ＢＪ細胞は、０時間および４８時間において、ｈＴＥＲＴ ｍｏｄＲＮＡを含有するエキソソームで処理した。７２時間において細胞を採取し、ｈＴＥＲＴ ｍＲＮＡおよびｍｏｄＲＮＡレベルについて試験した（図４Ａ）。細胞を、同様に、テロメラーゼ活性（図４Ｂ）および老化（図４Ｃ～Ｅ）について試験した。

Ｕ２ＯＳ細胞を、Ｅｘｏｆｅｃｔを用いて、ｈＴＥＲＴ ｍｏｄＲＮＡでトランスフェクトしたエキソソームで処理し、２４時間後に、ｈＴＥＲＴ ｍＲＮＡ発現（図５Ａ）およびテロメラーゼ活性（図５Ｂ）について試験した。

ｈＴＥＲＴは、２９３Ｔ細胞において過剰発現していた（図６Ａ）。ｈＴＥＲＴ過剰発現２９３Ｔ細胞は、より高いテロメラーゼ活性を示し（図６Ｂ）、かつより多くのｈＴＥＲＴ ｍＲＮＡを発現すること（図６Ｃ）が見出された。ｈＴＥＲＴは、同様に、ＢＪ細胞およびＵ２ＯＳ細胞においても過剰発現しており、それらは、同様に、より高いｈＴＥＲＴ ｍＲＮＡレベル（図６Ｄ）およびタンパク質レベル（図６Ｅ）も示した。ｈＴＥＲＴ過剰発現２９３Ｔ細胞から単離されたエキソソームを、ＢＪ細胞およびＵ２ＯＳ細胞を処理するために使用した。処理したＵ２ＯＳ細胞は、より強いテロメアシグナルを示した（図７）。

本明細書に記載および特許請求されている方法の全ては、本開示を考慮して、過度な実験を行うことなく実施または実行することができる。本発明の組成物および方法は、好ましい態様によって説明されてきたが、本発明の概念、趣旨、および範囲を逸脱することなく、その方法に対して、ならびに本明細書に記載されている方法のステップまたは一連のステップにおいて、変更を加えてもよいことが当業者には明らかである。より具体的には、化学的にも生理学的にも関連するある特定の薬剤を、本明細書に記載されている薬剤の代用としてもよく、それでもなお同じまたは類似の結果が達成されることが明らかである。当業者に明らかなこのような類似の置換および改変は、全て、添付の特許請求の範囲によって規定される本発明の趣旨、範囲、および概念の範囲内であるとみなされる。
参考文献
以下の参考文献は、本明細書に記載されているものを補足する、例示的な手順上またはその他の詳細を提供する範囲で、参照により本明細書に具体的に援用される。
米国特許第４，８７０，２８７号
米国特許第５，７３９，１６９号
米国特許第５，７６０，３９５号
米国特許第５，８０１，００５号
米国特許第５，８２４，３１１号
米国特許第５，８３０，８８０号
米国特許第５，８４６，９４５号

Claims (42)

1. テロメラーゼ複合体の活性を増強させる治療剤カーゴを含む脂質に基づくナノ粒子を含む組成物。
2. 前記脂質に基づくナノ粒子が、その表面上にＣＤ４７を含む、請求項１に記載の組成物。
3. 前記脂質に基づくナノ粒子が、その表面上に増殖因子を含む、請求項１に記載の組成物。
4. 前記脂質に基づくナノ粒子が、リポソームまたはエキソソームである、請求項１に記載の組成物。
5. 前記治療剤カーゴが、治療用タンパク質、抗体、阻害性ＲＮＡ、遺伝子編集システム、または小分子薬物である、請求項１に記載の組成物。
6. 前記治療用タンパク質が、ＴＥＲＴタンパク質に相当する、請求項５に記載の組成物。
7. 前記抗体が、細胞内抗原に結合する、請求項５に記載の組成物。
8. 前記抗体が、完全長抗体、ｓｃＦｖ、Ｆａｂフラグメント、（Ｆａｂ）２、ダイアボディ、トリアボディ、またはミニボディである、請求項５に記載の組成物。
9. 前記阻害性ＲＮＡが、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、またはｐｒｅ－ｍｉＲＮＡである、請求項５に記載の組成物。
10. 前記ｓｉＲＮＡが、テロメラーゼ活性をダウンレギュレートするタンパク質の発現をノックダウンする、請求項９に記載の組成物。
11. 前記遺伝子編集システムが、ＣＲＩＳＰＲシステムである、請求項９に記載の組成物。
12. 前記ＣＲＩＳＰＲシステムが、エンドヌクレアーゼおよびガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含む、請求項１１に記載の組成物。
13. 前記エンドヌクレアーゼおよび前記ｇＲＮＡが、前記エキソソーム内の単一の核酸分子上にコードされている、請求項１２に記載の組成物。
14. 前記ＣＲＩＳＰＲシステムが、ＴＥＲＴまたはＴＥＲＣ変異を標的とする、請求項１１に記載の組成物。
15. 請求項１～１４のいずれか一項に記載の脂質に基づくナノ粒子と、賦形剤とを含む医薬組成物。
16. 前記組成物が、非経口投与のために製剤化される、請求項１５に記載の組成物。
17. 前記組成物が、静脈内、筋肉内、皮下、または腹腔内注射のために製剤化される、請求項１６に記載の組成物。
18. 抗微生物剤をさらに含む、請求項１６の組成物。
19. 前記抗微生物剤が、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、ベンジルアルコール、ブロノポール、セトリミド、塩化セチルピリジニウム、クロルヘキシジン、クロロブタノール、クロロクレゾール、クロロキシレノール、クレゾール、エチルアルコール、グリセリン、ヘキセチジン、イミド尿素、フェノール、フェノキシエタノール、フェニルエチルアルコール、硝酸フェニル水銀、プロピレングリコール、またはチメロサールである、請求項１８に記載の組成物。
20. それを必要とする患者における疾患または障害を処置する方法であって、請求項１５～１９のいずれか一項に記載の組成物を前記患者に投与することを含む、方法。
21. 投与が、前記患者の細胞への、前記治療剤カーゴの送達をもたらす、請求項２０に記載の方法。
22. 前記疾患または障害が、加齢関連疾患または障害である、請求項２０に記載の方法。
23. 前記疾患または障害が、肺線維症、先天性角化異常症、再生不良性貧血、筋ジストロフィー、アテローム性動脈硬化症、高血圧、心疾患、がん、脳卒中、糖尿病、糖尿病性潰瘍、アルツハイマー病、骨粗鬆症、黄斑変性、免疫老化、心筋梗塞、または血管性認知症である、請求項２０に記載の方法。
24. 前記投与が、全身投与である、請求項２０に記載の方法。
25. 前記全身投与が、静脈内投与である、請求項２４に記載の方法。
26. 少なくとも第２の療法を前記患者に施すことをさらに含む、請求項２０に記載の方法。
27. 前記第２の療法が、外科療法、化学療法、放射線療法、凍結療法、ホルモン療法、または免疫療法を含む、請求項２６に記載の方法。
28. 前記患者が、ヒトである、請求項２０に記載の方法。
29. 前記脂質に基づくナノ粒子が、エキソソームであり、前記エキソソームが、前記患者について自家性である、請求項２８に記載の方法。
30. 前記エキソソームが、前記患者から得られる体液サンプルから得られる、請求項２９に記載の方法。
31. 前記体液サンプルが、血液、リンパ、唾液、尿、脳脊髄液、骨髄吸引物、眼滲出液／涙、または血清である、請求項３０に記載の方法。
32. 前記エキソソームが、間葉系細胞から得られる、請求項２９に記載の方法。
33. 前記方法が、テロメラーゼ複合体の活性を増強させる治療剤カーゴを、前記患者の肝臓、脳、および／または膵臓に送達する方法とさらに定義される、請求項３２に記載の方法。
34. 前記組成物が、１回を超える回数投与される、請求項２０に記載の方法。
35. 治療剤を、患者の肝臓組織、脳組織、および／または膵臓組織に送達する方法であって、前記治療剤を運搬する間葉系細胞由来エキソソームを前記患者に投与することを含む、方法。
36. 前記エキソソームが、前記患者について自家性である、請求項３５に記載の方法。
37. 前記治療剤が、治療用タンパク質、抗体、阻害性ＲＮＡ、遺伝子編集システム、または小分子薬物である、請求項３５に記載の方法。
38. 前記治療剤が、テロメラーゼ複合体の活性を増強させる、請求項３５に記載の方法。
39. 前記治療剤が、ＴＥＲＴタンパク質である、請求項３８に記載の方法。
40. 前記エキソソームが、１回を超える回数投与される、請求項３５に記載の方法。
41. 前記エキソソームが、全身的に投与される、請求項３５に記載の方法。
42. 前記エキソソームが、局所的に投与される、請求項３５に記載の方法。

Images