CZ296618B6 - Farmaceutická nebo polypeptidová kompozice, molekula nukleové kyseliny, virový vektor a lécivo pro imunizaci proti malignitám - Google Patents

Farmaceutická nebo polypeptidová kompozice, molekula nukleové kyseliny, virový vektor a lécivo pro imunizaci proti malignitám Download PDF

Info

Publication number
CZ296618B6
CZ296618B6 CZ20040789A CZ2004789A CZ296618B6 CZ 296618 B6 CZ296618 B6 CZ 296618B6 CZ 20040789 A CZ20040789 A CZ 20040789A CZ 2004789 A CZ2004789 A CZ 2004789A CZ 296618 B6 CZ296618 B6 CZ 296618B6
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
polypeptide
neu
amino acid
immune response
leu
Prior art date
Application number
CZ20040789A
Other languages
English (en)
Inventor
A. Cheever@Martin
L. Disis@Mary
Original Assignee
University Of Washington
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by University Of Washington filed Critical University Of Washington
Publication of CZ296618B6 publication Critical patent/CZ296618B6/cs

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • A61K39/001102—Receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A61K39/001103—Receptors for growth factors
    • A61K39/001106—Her-2/neu/ErbB2, Her-3/ErbB3 or Her 4/ErbB4
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/461—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
    • A61K39/4611—T-cells, e.g. tumor infiltrating lymphocytes [TIL], lymphokine-activated killer cells [LAK] or regulatory T cells [Treg]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
    • A61K39/4643—Vertebrate antigens
    • A61K39/4644—Cancer antigens
    • A61K39/464402—Receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A61K39/464403—Receptors for growth factors
    • A61K39/464406—Her-2/neu/ErbB2, Her-3/ErbB3 or Her 4/ ErbB4
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4702—Regulators; Modulating activity
    • C07K14/4705—Regulators; Modulating activity stimulating, promoting or activating activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/71—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for growth factors; for growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/06—Linear peptides containing only normal peptide links having 5 to 11 amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57407—Specifically defined cancers
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57484—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites
    • G01N33/57488—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites involving compounds identifable in body fluids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G01N2333/71—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants for growth factors; for growth regulators
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/82—Translation products from oncogenes
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
    • Y10S530/806—Antigenic peptides or proteins
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
    • Y10S530/827—Proteins from mammals or birds
    • Y10S530/828—Cancer

Abstract

Jsou popsány farmaceutické a polypeptidové kompozice pro vyvolání nebo zvýsení imunitní odpovedi naHER-2/neu protein u teplokrevných zivocichu a jejich pouzití, molekuly nukleové kyseliny a jejího pouzití, napríklad pro zpusob transfekce bunek teplokrevných zivocichu, stejne jako virový vektor a jeho pouzití. Popsaná pouzití smerují predevsím k výrobe léciva pro lécbu malignit, se kterými je asociován HER-2/neu onkogen.

Description

Farmaceutická nebo polypeptidová kompozice, molekula nukleové kyseliny, virový vektor a léčivo pro imunizaci proti malignitám
Oblast techniky
Tento vynález se týká farmaceutické a polypeptidové kompozice pro vyvolání nebo zvýšení (posílení) imunitní odpovědi na HER-2/nebo protein u teplokrevných živočichů a jejich použití, molekuly nukleové kyseliny a jejího použití, například pro způsob transfekce buněk teplokrevných živočichů, stejně jako virového vektoru a jeho použití. Použití směřují především k výrobě léčiva pro léčbu malignit, se kterými je asociován HER-2/neu onkogen.
Dosavadní stav techniky
Navzdory enormním investicím finančním a lidským zůstávají nádory jednou z hlavních příčin úmrtí. Například rakovina je vedoucí příčinou úmrtí žen ve věku od 35 do 74 let. Rakovina prsu je nejčastější malignitou u žen a incidence vzniku karcinomu prsu vzrůstá. U jedné z devíti žen bude diagnostikováno onemocnění. Standardní přístupy pro léčbu rakoviny prsu jsou zaměřeny na kombinaci chirurgie, radioterapie a chemoterapie. Tyto přístupy vedle k určitým výrazným úspěchům u jistých malignit. Nicméně, tyto přístupy nebyly úspěšné pro všechny malignity a rakovina prsu je nejčastěji nevyléčitelná, pokud je léčeno jisté stadium onemocnění. Alternativní přístupy pro prevenci a terapii jsou nezbytné.
Společnou charakteristikou malignit je nekontrolovatelný buněčný růst. Zdá se, že rakovinné buňky podléhaj í procesu transformace z normálního fenotypu na maligní fenotyp schopný autonomního růstu. Amplifikace a nadměrná exprese somatických buněčných genů je považována za společnou primární událost, která vede k transformace normálních buněk na maligní buňky. Maligní fenotypové vlastnosti kódované onkogenními geny jsou přeneseny během buněčného dělení na potomstvo transformovaných buněk.
Probíhající výzkum onkogenů identifikoval nejméně čtyřicet onkogenů operativních v maligních buňkách a odpovědných za transformaci nebo asociovaných s transformací. Onkogeny byly klasifikovány do různých skupin na základě jejich putativní funkce nebo umístění jejich genových produktů (jako je protein exprimovaný onkogenem).
O onkogenech se soudí, že jsou zásadní pro jisté aspekty normální buněčné fyziologie. V tomto ohleduje HER-2/neu onkogen členem tyrosin proteinkinázové rodiny a vykazuje vysoký stupeň homologie s receptorem pro epidermální růstový faktor. HER-2/neu pravděpodobně hraje roli v buněčném růstu a/nebo diferenciaci. Her-2/neu pravděpodobně indikuje malignity kvantitativním mechanismem, který je následkem zvýšené nebo deregulované exprese v podstatě normálního genového produktu.
HER-2/neu (pl 85) je proteinový produkt HER-2/neu onkogen. HER-2/neu gen je amplifikován a HER-2/neu protein je nadměrně exprimován u mnoha druhů rakoviny včetně nádorů prsu, vaječníků, tlustého střeva, plic a prostaty. HER-2/neu je ve vztahu k maligní transformaci. Je nacházen v 50 až 60 % duktálních karcinomech in šitu a 20 až 40 % všech nádorů prsu, stejně jako v podstatné frakci adenokarcinomů vycházejících z vaječníků, prostaty, tlustého střeva a plic. HER-2/neu je těsně asociován nejen s maligním fenotypem, ale také s agresivitou malignity, kde je nacházen v jedné čtvrtině všech invazivních karcinomů prsu. HER-2/neu nadměrná exprese koreluje se špatnou prognózu jak karcinomu prsu, tak karcinomu vaječníků. HER-2/neu je transmembránový protein s relativní molekulovou hmotností 185, kde je asi 1255 aminokyselin (aa). Má extracelulámí vazebnou doménu (ECD) o asi 645 aminokyselinách, se 40% homologií s receptorem pro epidermální růstový faktor (EGRF), vysoce hydrofobní transmembránovou kotvicí
-1 CZ 296618 B6 doménu (TMD) a karboxyterminální cytoplasmatickou doménu (CD) o asi 580 aminokyselinách s 80% homologií k EGRF.
Vzhledem k obtížím v nynějších přístupech k terapii rakoviny, se kterými je asociován HER2/neu onkogen, v oboru existuje potřeba zlepšených sloučenin a kompozic. Předkládaný vynález naplňuje tuto potřebu a dále poskytuje jiné související výhody.
Podstata vynálezu
Předmětem tohoto vynálezu je farmaceutická kompozice pro vyvolání nebo zvýšení imunitní odpovědi na HER-2/neu protein u teplokrevných živočichů, jejíž podstata spočívá v tom že obsahuje farmaceuticky přijatelný nosič nebo ředidlo v kombinaci s polypeptidem kódovaným DNA sekvencí vybranou z
a) nukleotidů 2026 až 3765 SEQ ID NO: 1 a
b) DNA sekvencí, které hybridizují na nukleotidovou sekvenci komplementární k nukleotidům 2026 až 3765 SEQ ID NO: 1 za středně přísných podmínek, kde DNA sekvence kóduje polypeptid, který produkuje imunitní odpověď na HER-2/neu protein, a kde hybridizační podmínky zahrnují předpromytí v roztoku 5 x SSC, 0,5 % SDS, 1,0 mM EDTA, pH 8,0, hybridizaci při 50 až 65 °C, 5 x SSC, přes noc a potom následuje dvojnásobné promytí při 65 °C po 20 minut každým z 2 x, 0,5 x a 0,2 x SSC s obsahem 0,1 % SDS, nebo s molekulou nukleové kyseliny nebo virovým vektorem řídicím expresi výše uvedeného polypeptidu kódovaného DNA sekvencí vybranou ze sekvencí podle bodu a) a b) a popřípadě dále obsahuje adjuvans.
Předmětem tohoto vynálezu je také polypeptidová kompozice, jejíž podstata spočívá v tom, že kompozice obsahuje polypeptid, který je kódován DNA sekvencí vybranou z
a) nukleotidů 2026 až 3765 SEQ ID NO: 1 a
b) DNA sekvencí, které hybridizují na nukleotidovou sekvenci komplementární k nukleotidům 2026 až 3765 SEQ ID NO: 1 za středně přísných podmínek, kde DNA sekvence kóduje polypeptid, který produkuje imunitní odpověď na HER-2/neu protein, a kde hybridizační podmínky zahrnují předpromytí v roztoku 5 x SSC, 0,5 % SDS, 1,0 mM EDTA, pH 8,0, hybridizaci při 50 až 65 °C, 5 x SSC, přes noc a potom následuje dvojnásobné promytí při 65 ;C po 20 minut každým z 2 x, 0,5 x a 0,2 x SSC s obsahem 0,1 % SDS, a kde polypeptidová kompozice obsahuje adjuvans.
Předmětem tohoto vynálezu dále je použití polypeptidová kompozice vymezené v předchozím odstavci pro výrobu léčiva pro imunizaci teplokrevného živočicha proti malignitám, se kterými se asociován HER-2/neu onkogen.
-2CZ 296618 B6
Předmětem tohoto vynálezu je dále molekula nukleové kyseliny pro vyvolání nebo zvýšení imunitní odpovědi na HER-2/neu protein u teplokrevných živočichů, která řídí expresi polypeptidu kódovaného DNA sekvencí, která je vybrána z
a) nukleotidů 2026 až 3765 SEQ ID NO: 1 a
b) DNA sekvencí, které hybridizují na nukleotidovou sekvenci komplementární k nukleotidům 2026 až 3765 SEQ ID NO: 1 za středně přísných podmínek, kde DNA sekvence kóduje polypeptid, který produkuje imunitní odpověď na HER-2/neu protein, kde hybridizační podmínky zahrnují předpromytí v roztoku 5 x SSC, 0,5 % SDS, 1,0 mM EDTA, pH 8,0, hybridizaci při 50 až 65 °C, 5 x SSC, přes noc a potom následuje dvojnásobné promytí při 65 °C po 20 minut každým z 2 x, 0,5 x a 0,2 x SSC s obsahem 0,1 % SDS.
Předmětem tohoto vynálezu je také použití molekuly nukleové kyseliny vymezené výše pro výrobu léčiva pro vyvolání nebo zvýšení imunitní odpovědi na HER—2/neu protein.
Předmětem tohoto vynálezu je dále výše uvedená molekula nukleové kyseliny pro použití pro způsob transfekce buněk teplokrevných živočichů, pro léčení malignit, se kterými je asociován HER-2/neu onkogen.
Předmětem tohoto vynálezu je také virový vektor pro vyvolání nebo zvýšení imunitní odpovědi na HER-2/neu protein u teplokrevných živočichů, kde uvedený virový vektor zaměřující expresi polypeptidu kódovaného DNA sekvencí je vybrán z
a) nukleotidů 2026 až 3765 SEQ ID NO: 1 a
b) DNA sekvencí, které hybridizují na nukleotidovou sekvenci komplementární k nukleotidům 2026 až 3765 SEQ ID NO: 1 za středně přísných podmínek, kde DNA sekvence kóduje polypeptid, který produkuje imunitní odpověď na HER-2/neu protein, kde hybridizační podmínky zahrnují předpromytí v roztoku 5 x SSC, 0,5 % SDS, 1,0 mM EDTA, pH 8,0, hybridizaci při 50 až 65 °C, 5 x SSC, přes noc a potom následuje dvojnásobné promytí při 65 °C po 20 minut každým z 2 x, 0,5 x a 0,2 x SSC s obsahem 0,1 % SDS.
Předmětem tohoto vynálezu je rovněž použití virového vektoru vymezeného výše pro výrobu léčiva pro vyvolání nebo zvýšení imunitní odpovědi na HER-2/neu protein.
Tyto a jiné aspekty předkládaného vynálezu se stanou zřejmými s ohledem na následující podrobný popis a připojené obrázky.
Jedním z jiných aspektů předmětného vynálezu je například způsob infikování buněk teplokrevných živočichů, který zahrnuje infikování buněk ex vivo s virovým vektorem vymezeným výše a následující podávání infikovaných buněk živočichovi.
Přehled obrázků na výkresech
Obrázek 1 ukazuje výsledky zaměření naivních T lymfocytů na HER-2/neu polypeptid prostřednictvím dendritických buněk. Z kostní dřeně odvozené DC byly generovány GM-CSF a IL6 z CD34+ kmenových buněk. DC pulzované HER-2/neu polypeptidem indukovaly protein specifickou proliferaci autologních CD4+/CD4SRA+ T lymfocytů po 7 dnech kultivace T buněk s DC. Z kostní dřeně odvozené CD34+ kmenové buňky kultivované po dobu jednoho týdne v séra prostém médiu obsahujícím GM-CSF a IL-6 byly použity jako APC. APC byly umístěny na jamkovou plotnu se zakulaceným dnem (Coming, Coming, NY, USA) v různých koncentra-3 CZ 296618 B6 cích a byly inkubovány po dobu 16 až 18 hodin s 20 až 25 pg/ml rekombinantního HER-2/neu polypeptidů, CD4+ T lymfocyty byly izolovány z mononukleárních buněk autologní periferní krve pozitivní sekvencí za použití imunoafínitních kolon(CellPro lne., Bothell, WA, USA). Antigenem pulzované APC buňky byly ozářeny (10 Gy) a byly přidány CD4+ T lymfocyty v množství 105 na jamku. Proliferativní odpověď T buněk byla měřena vychytáváním [3H]thymidinu (37 kBq/jamku) přidaného v den 7 na 16 až 18 hodin. Proliferační testy byly provedeny v médiu prostém séra a cytokinů opakovaně v 5 jamkách. Symboly reprezentující:
-·- DC + HER-2/neu polypeptid + CD4+/CD4SRA+ T buňky;
-O- DC + CD4+/CD4SRA + T buňky; a
DC + HER-2/neu polypeptid.
Obrázek 2 ukazuje odpověď CD4+ buněk na HER-2/neu polypeptid. Za použití priming testu popsaného pro obrázek 1 byly CD4+ T buňky od normálních dárců testovány na odpověď na rekombinantní lidský HER-2/neu polypeptid. Symboly reprezentující:
SC + CD4; a
...ý·... SC + CD4 + HER-2/neu polypeptid.
„SC“ je kmenová buňka.
Obrázek 3 ukazuje, že u krys imunizovaných krysím HER-2/neu polypeptidem se vyvíjí krysí neu specifické protilátky. Krysy byly imunizované rekombinantních krysích HER-2/neu polypeptidem 25 pg v MFL nebo vakcínačním adjuvans. Byly podány tři imunizace, každá 20 dní od sebe. Dvacet dní po poslední imunizaci byly krysy hodnoceny na protilátkovou odpověď proti krysímu neu. Zvířata imunizovaná HER-2/neu polypeptidem a vakcínačním adjuvans vykazovala vysoký titr krysí neu specifických odpovědí. Kontrolou byla zvířata imunizovaná lidským HER-2/neu polypeptidem (cizorodým proteinem). V oddělených pokusech u krys imunizovaných 100 pg a 300 pg purifikováného kompletního krysího neu nevyvinuly detekovatelné neu specifické protilátky (hodnoty nejsou ukázány). Hodnoty reprezentují průměr a standardní odchylku od tří zvířat. Symboly reprezentují:
krysí HER-2/neu polypeptid/MPL;
...O... krysí HER-2/neu polypeptid/vakcínační;
—□— MPL samotný;
Φ - vakcínační samotný; kontrola.
„MPL“ a „vakcínační“ jsou adjuvans (Ribi, Bozeman, MT, USA).
„neu“ je HER-2/neu protein.
Obrázek 4 ukazuje, že pacienti s rakovinou prsu mají preexistující imunitu kHER-2/neu polypeptidu. PBMC od pacienta byly hodnoceny inkorporací triciovaného thymidinu ve 24 jamkových plotnách. Jako odpovídající jamky jsou čítány ty, které mají o více než tři standardní odchylky vyšší (372 cpm) hodnoty než kontrolní jamky. HER-2/neu pozitivní pacienti s rakovinou prsu stadia II měly signifikantní odpověď na rekombinantní lidský HER-2/neu polypeptid. Symboly „p“ reprezentují peptidy pro HER-2/neu protein, „tt“ reprezentují tetanický toxoid a „hFINP“ reprezentuje rekombinantní lidský HER-2/neu polypeptid.
Před popisem vynálezu může být užitečná pro jeho pochopení vymezení jistých termínů, které jsou zde dále používány.
HER-2/neu polypeptid - jak je zde použit, se týká části HER-2/neu proteinu (protein je také známý jako pl85 nebo c-erbB2) mající aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 2 od lysinu,
-4CZ 296618 B6 aminokyseliny 676, do valinu, aminokyseliny 1255; a může být přirozený, synteticky produkovaný, produkovaný genetickým inženýrstvím, nebo jeho funkčně ekvivalentní varianty, např. jedna nebo více aminokyselin je nahrazeno jinou aminokyselinou nebo neaminokyselinou nebo jinými aminokyselinami nebo neaminokyselinami, které v podstatě neovlivňují vyvoláni nebo posílení imunitní odpovědi na HER-2/neu protein (například varianta stimuluje odpověď pomocných T buněk nebo cytotoxických T buněk).
Proliferace T buněk - jak je zde použito, zahrnuje množení T buněk stejně jako stimulaci T buněk, která vede ke zmnožení tj. iniciaci událostí vedoucích i mitose a mitosu samotnou. Metoda pro detekci proliferace T buněk jsou uvedeny dále.
Jak je uvedeno výše, předkládaný vynález je zaměřen na sloučeniny a kompozice pro vyvolání nebo posílení imunity k proteinovému produktu exprimovanému HER-2/neu onkogenu, včetně malignit u teplokrevných živočichů, u kterých je amplifikovaný HER-2/neu gen asociován s malignitami. Asociace amplifikovaného HER-2/neu genu s malignitami nevyžaduje, aby proteinový produkt exprese genu byl přítomen v tumoru. Například nadměrná exprese proteinového expresního produktu může být zahrnuta v iniciaci tumoru, ale proteinová exprese může být následně ztracena. Použití předkládaného vynálezu umožňuje vyvolání nebo posílení účinné autochtonní imunitní odpovědi pro konvertování HER-2/neu pozitivního tumoru na HER-2/neu negativní.
Přesněji, zjištění podle předkládaného vynálezu v jednom aspektu ukazuje, že polypeptid založený na určité části (HER-2/neu polypeptid) proteinového expresního produktu HER-2/neu genu může být rozpoznán na thymu závislými lymfocyty (zde dále „T buňky“), a proto může být autochtonni imunitní T buněčná odpověď využita profýlakticky nebo pro léčbu malignit, u kterých je takový protein nadměrně exprimován. Zjištění podle předkládaného vynálezu také ukazuje, vjiném aspektu, že molekuly nukleové kyseliny řídící expresi takového peptidu mohou být použity samostatně nebo ve virovém vektoru pro imunizaci.
Obecně, o populacích CD4+ T buněk se soudí, že účinkují jako helper/inducery prostřednictvím uvolnění lymfokinů, pokud jsou stimulovány specifickým antigenem; nicméně, subpopulace CD4+ buněk může účinkovat jako cytotoxické T lymfocyty (CTL). Obdobně, o CD8+ T buňkách se soudí, že účinkují přímo lýzou antigenních cílů; nicméně, za různých okolností mohou secernovat lymfokiny za poskytnutí helper nebo DTH funkce. Navzdory potenciálně se překrývající funkci jsou fenotypové CD4 a CD8 markéry vázány na rozpoznání peptidů vázaných na třídu II nebo na třídu I MHC antigenů. Rozpoznání antigenu v kontextu třídy II nebo třídy I MHC umožňuje CD4+ a CD8+ buňkách odpovídat na různé antigeny nebo na stejný antigen prezentovaný za různých okolností. Vazba imunogenních peptidů na třídu II MHC antigenů se nejčastěji vyskytuje u antigenů trávených antigen prezentujícími buňkami. Proto CD4+ T buňky obyčejně rozpoznávají antigeny, které byly externě od nádorové buňky. Naproti tomu, za normálních okolností, se vazba peptidů na třídu I MHC vyskytuje pouze u proteinů přítomných v cytosolu a syntetizovaných samotným cílem, proteiny v zevním prostředí jsou vyloučeny. Výjimkou z tohoto je vazba exogenních peptidů s přesným třída I vazebným motivem, které jsou přítomny mimo buňku ve vysoké koncentraci. Tak CD4+ a CD8+ T buňky mají významně odlišné funkce a mají tendenci rozpoznávat různé antigeny s ohledem na to, kde jsou antigeny normálně umístěny.
Jak je popsáno v předkládaném vynálezu, polypeptidová část proteinového produktu exprimovaného HER-2/neu onkogenem je rozpoznávána T buňkami. Cirkulující HER-2/neu polypeptid je degradován na peptidové fragmenty. Peptidové fragmenty zpolypeptidu se vážou na antigeny hlavního histokompatibilního komplexu (MHC). Předložením peptidu navázaného na MHC antigen na povrchu buňky a rozpoznáním kombinace peptidu plus vlastního MHC antigenu T buňkami hostitele se stane HER-2/neu polypeptid (včetně toho, který je exprimován maligními buňkami) imunogenním pro T buňky. Vynikající specifita receptorů T buněk umožňuje jednotlivým T buňkám rozlišit peptidy, které se liší jediným aminokyselinovým zbytkem.
-5 CZ 296618 B6
V průběhu imunitní odpovědi na peptidový fragment z polypeptidů se budou T buňky exprimující T buněčný receptor s vysokou vazebnou afinitou ke komplexu MHC-peptid vázat na komplex MHC-peptid a tak se stanou aktivovanými a indukuje se v nich proliferace. Při prvním setkání s peptidem bude malý počet imunitních T buněk secernovat lymfokiny, proliferovat a diferencovat na efektorové a paměťové T buňky. Primární imunitní odpověď proběhne in vivo, ale bude obtížné ji detekovat in vitro. Další setkání paměťových T buněk se stejným antigenem povede k rychlejší a silnější imunitní odpovědi. Sekundární odpověď se vyskytne jak in vivo, tak i vitro. In vitro odpověď je snadno změřena měřením stupně proliferace, stupně produkce cytokinů nebo generování cytolytické aktivity populace T buněk re-exponovaných v antigenů. Významná proliferace populace T buněk v odpovědi na určitý antigen je považována za ukazatel předešlé expozice nebo vystavení antigenů.
Sloučeniny podle tohoto vynálezu obecně obsahují HER-2/neu polypeptidy nebo DNA molekuly, které řídí expresi takových peptidů, kde DNA molekuly mohou být přítomny ve virovém vektoru. Jak bylo uvedeno výše, polypeptidy podle přítomného vynálezu zahrnují varianty polypeptidu SEQ ID NO: 2 od aminokyseliny 676 do aminokyseliny 1255, které si uchovávají schopnost stimulovat imunitní odpověď. Takové varianty obsahují různé strukturální formy nativního polypeptidu. Díky přítomnosti ionizovatelných aminoskupin a karboxylových skupin, například může být HER-2/neu polypeptid ve formě soli s kyselinou nebo zásadou nebo může být v neutrální formě. Jednotlivá aminokyselinová residua mohou také být modifikována oxidací nebo redukcí.
Varianty v rozsahu tohoto vynálezu také zahrnují polypeptidy, ve kterých je primární aminokyselinová struktura nativního HER-2/neu polypeptidů modifikována vytvořením kovalentních nebo agregativních konjugátů s jinými peptidy nebo polypeptidy nebo chemickými skupinami, jako je glykosylová skupina, lipidy fosfáty, acetylové skupiny a podobně. Kovalentní deriváty mohou být připraveny například navázáním určitých funkčních skupin na postranní aminokyselinové řetězce nebo na N- nebo C-konec.
Předkládaný vynález také obsahuje HER-2/neu polypeptidy s nebo bez glykosylace. Polypeptidy exprimované v kvasinkových nebo savčích expresních systémech mohou být podobné nebo mírně odlišné v molekulové hmotnosti a v glykosylaci od nativních molekul, v závislosti na expresním systému. Například exprese DNA kódující polypeptidy v bakterii, jako je E. coli, typicky poskytuje neglykosylované molekuly. N-glykosylační místa eukaryotních proteinů jsou charakterizována tripletem aminokyselin Asn-Ai-Z, kde Ai je jakákoliv aminokyselina s výjimkou Pro, a Z je SER nebo Thr. Varianty HER-2/neu polypeptidů, které mají inaktivovaná N-glykosylační místa, mohou být produkovány technikami, které jsou odborníkovi v oboru známé, jako je syntéza oligonukleotidů a ligace nebo technika místně specifické mutageneze, a jsou v rozsahu předkládaného vynálezu. Alternativně, N-vázaná glykosylační místa mohou být přidána k HER-2/neu polypeptidů.
Polypeptidy podle předkládaného vynálezu také zahrnují varianty polypeptidů SEQ ID NO: 2 (tj. varianty polypeptidů majícího aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 2 od aminokyseliny 676 do aminokyseliny 1255), které mají aminokyselinovou sekvenci, která se liší od této sekvence v jedné nebo více delecích, inzercích, substitucích nebo jiných modifikacích. V jednom provedení jsou takové varianty v podstatě homologní k nativnímu HER-2/neu polypeptidů a uchovávají si schopnost stimulovat imunitní odpověď. Výraz „v podstatě homologní“, jak je zde použit, označuje sekvenci aminokyselin, které může být kodonován DNA sekvencemi, které jsou schopné hybridizace za středně přísných podmínek se sekvencí nukleotidů, která je komplementární k přirozeně se vyskytující DNA sekvenci, kódující specifickou část polypeptidů SEQ ID NO: 2 (tj. nukleotidy 2026 až 3765 SEQ ID NO: 1). Vhodné středně přísné podmínky zahrnují předpromytí v roztoku 5 x SSC, 0,5% SDS, 1,0 mM EDTA (pH 8,0) hybridizaci při 50 až 65 °C, 5 x SSC, přes noc; a potom následuje dvojnásobné promytí při 65 °C po dobu 20 minut každým z 2 x, 0,5 x a 0,2 x SSC (obsahujícím 0,1% SDS). Takové hybridizující DNA sekvence jsou také v rozsahu tohoto vynálezu. Účinek jakýchkoliv takových modifikací na schopnost HER-2/neu polypeptidů produkovat imunitní odpověď musí být možné snadno určit (např. analyzováním
-6CZ 296618 B6 schopnosti mutovaného HER-2/neu polypeptidu indukovat odpověď T buněk za použití například metod zde popsaných).
Obecně, aminokyselinové substituce mohou být provedeny různými způsoby pro poskytnutí jiných provedení variant předkládaného vynálezu. Za prvé například aminokyselinové substituce mohou být provedeny konzervativně, tj. substituovaná aminokyselina je nahrazena aminokyselinou, která má podobné vlastnosti, takže odborník v oboru peptidové chemie by očekával, že sekundární struktura a hydropatické vlastnosti polypeptidu zůstanou bez podstatných změn. Obecně, následující skupiny aminokyselin reprezentují konzervativní změny:
1) ala, pro, gly, glu, asp, gin, asn, ser, thr;
2) cys, ser, tyr, thr;
3) val, ile, leu, met, ala, phe;
4) lys, arg, his; a
5) phe, tyr, trp, his.
Příkladem nekonzervativní změny je nahrazení aminokyseliny z jedné skupiny aminokyselinou z jiné skupiny.
Jiným způsobem pro vytvoření aminokyselinových substitucí pro produkování variant podle předkládaného vynálezu je identifikace a nahrazení aminokyselin v motivech T buněk s potenciálem vazby třídy IIMHC molekul (pro CD4+ T buněčnou odpověď) nebo třídy I MHC molekul (pro CD8+ T buněčnou odpověď). Peptidové segmenty (HER-2/neu polypeptidu) s motivem s teoretickým potenciálem pro vazbu třídy II MHC molekul mohou být identifikovány počítačovou analýzou. Například může být použit program pro analýzu proteinové sekvence, T sites, který obsahuje několik počítačových algoritmů pro odlišení potenciálních míst pro rozpoznání T buněk (Feller a de la Cruz, Nátuře 349, 720 až 721 (1991)). Jsou použity dva vyhledávací algoritym:
1) AMPHI algoritmus popsaný Margalit a kol, J. Immunol. 138, 2213 až 2229 (1987)) identifikuje epitopové motivy podle alfa helikální periodicity a amfipaticity;
2) Rothbardův a Taylorův algoritmus, který identifikuje epitopové motivy podle náboje a polarity (Rothbard a Taylor, EMBO 7, 93 až 100 (1988)).
Segmenty s oběma motivy jsou nej vhodnější pro vazbu na třídu II MHC molekul. CD8+ T buněk zjistí peptidovou vazbu ke třídě I MHC molekul. Falk a kol. určili, že vazba peptidů na jednotlivé MHC molekuly vykazují rozpoznatelné sekvenční motivy (Falk a kol., Nátuře 351, 290 až 296 (1991)). Peptidový motiv pro vazbu v zářezu HLA-A2.1. byl definován Edmanem degradací peptidů získaných zHLA-A2.1 molekul kultivované buněčné linie (tabulka 2, od Falka a kol., viz výše). Metoda identifikovala typické nebo průměrné na HLA-A2.1 se vázající peptidy v délce 9 aminokyselin s dominantními kotvícími zbytky vyskytujícími se v pozicích 2 (L) a 9 (V). Běžně se vyskytující silně se vázající zbytky byly identifikovány v pozicích 2 (M), 4 (E,K), 6 (V) a 8 (K). Identifikovaný motiv reprezentuje průměr mnoha vazebných peptidů.
HLA-A2.1 restrikční motiv
1 aminokyselinová pozice 2 3 456789 bodové označení
dominantní vazebný kotvicí zbytek L V +3
silně se vázající zbytek Μ E V K K +2
slabě se vázající zbytek I A G I I A E L +1
L Y P K L Y S
F F D Y T H
K P T N
M M G
Y S V
H
Odvozený peptidový motiv jak je nyní definován není zvláště přísný. Některé HLA-A2.1 neobsahují oba dominantní kotevní zbytky a aminokyseliny sousedící s dominantními kotevními zbytky hrají hlavní roli v umožnění nebo neumožnění vazby. Ne všechny peptidy s nyní popsaným vazebným motivem se budou vázat a některé peptidy bez motivu se budou vázat. Nicméně, tento motiv je dostatečně hodnotný pro umožnění identifikace některých peptidů schopných vazby. Významné je, že tento HLA-A2.1 motiv umožňuje 6 aminokyselin mezi dominantní kotevní aminokyseliny na zbytcích 2 a 9.
Po identifikaci peptidových motivů v HER-2/neu polypeptidu může být aminokyselinová substituce provedena konzervativně nebo nekonzervativně. Nekonzervativní typ substituce je zamýšlen pro produkci zlepšeného polypeptidu, který je silnější a/nebo více zkříženě reaktivní (MHC polymorfismus). Příkladem silnějšího polypeptidu je ten, který se váže na stejnou MHC molekulu s vyšší afinitou, než nativní polypeptid, bez ovlivnění rozpoznání T buňkami specifickými pro přirozený polypeptid. Příkladem polypeptidu s širší zkříženou reaktivitou je ten, který indukuje šířeji zkříženě reaktivní imunitní odpovědi (tj. váže se na větší rozsah MHC molekul), než přirozený polypeptid. Podobně, jedna nebo více aminokyselin umístěných mezi peptidové motivy a majících prostorovou funkci (např. neinteragujících sMHC molekulou nebo receptorem T buněk) může být substituována konzervativně nebo nekonzervativně. Odborníkovi v oboru bude jasné, že polypeptidy obsahující jednu nebo více aminokyselinových substitucí mohou být testovány na výhodné nebo nevýhodné imunologické interakce množstvím testů, včetně těch, které jsou zde popsány pro schopnost stimulovat rozpoznávání T buňkami.
Varianty v rozsahu předkládaného vynálezu mohou také, nebo alternativně, obsahovat jiné modifikace, včetně delecí nebo adicí aminokyselin, které mají minimální vliv na požadované imunologické vlastnosti polypeptidu. Odborník v oboru ocení, že zkrácené formy nebo nepřirozeně rozsáhlé formy HER-2/neu polypeptidu mohou být použity s tím, že poskytnuté imunologické vlastnosti jsou zhruba ekvivalentní jako u kompletního, nativního HER-2/neu polypeptidu. Cysteinové zbytky mohou být deletovány nebo nahrazeny jinými aminokyselinami pro zabránění tvorby nesprávných intramolekulárních disulfidových můstků při renaturaci. Jiné přístupy mutageneze vyžadují modifikaci sousedních dibazických aminokyselinových zbytků pro zvýšení exprese v kvasinkových systémech, ve kterých je přítomna aktivita KEX2 proteázy.
HER-2/neu polypeptid může být obecně získán za použití genomového nebo cDNA klonu kódujících protein. Genomová sekvence, která kóduje kompletní HER-2/neu je ukázán v SEQ ID
NO: 1 a odvozená aminokyselinová sekvence je prezentována v SEQ ID NO: 2. Takové klony mohou být izolovány vyšetřením vhodné expresní knihovny na klony, které exprimují HER2/neu protein. Příprava knihovny a vyšetření může být obecně provedeno za použití metod odborníku v oboru známých, jako jsou metody, které popsal Sambrook a kol. vMolecular Cloning:
A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989, což je zde zahrnuto jako odkaz. Stručně uvedeno, bakteriofágová expresní knihovna může být umístěna a přenesena na filtry. Filtry mohou být potom inkubovány s detekčním reagens. V kontextu tohoto vynálezu je „detekčním reagens“ jakákoliv sloučenina schopná vazby na HER-2/neu protein, která může být potom detekována množstvím prostředků, která může být potom detekována množstvím prostředků, které jsou odborníkovi v oboru známé. Typická detekční reagens obsahují „vazebné agens“, jako je protein A, protein G, IgG nebo lektin, navázané na reportérovou skupinu. Preferované reportérové skupiny obsahují enzymy, substráty, kofaktory, inhibitory, barviva, radionuklidy, luminiscentní skupiny, fluorescentní skupiny abiotin. Výhodněji, reportérovou skupinou je křenová peroxidáza, která může být detekována inkubací se substrátem jako je tetramethylbenzidin nebo 2,2'-azino-di-3-ethylbenzthiazolinsulfonová kyselina. Plaky, které obsahují genomové nebo cDNA sekvence, které exprimují HER-2/neu protein, jsou izolovány a purifikovány technikami, které jsou odborníkovi v oboru známé. Vhodné metody mohou být nalezeny například v publikaci, kterou napsal Sambrook a kol., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989.
Varianty polypeptidů, které si uchovávají schopnost stimulovat imunitní odpověď, mohou obecně být identifikovány modifikováním sekvence v jednom nebo ve více aspektech popsaných výše a testováním vzniklého polypeptidů na schopnost stimulovat imunitní odpověď, např. odpověď T buněk. Například takové testy mohou být obecně provedeny kontaktováním T buněk s modifikovaným polypeptidem a testováním odpovědi. Přirozeně se vyskytující varianty polypeptidů mohou také být izolovány, například vyšetřením vhodné cDNA nebo genomové knihovny sDNA sekvencí kódující polypeptid nebo jeho variantu.
Výše popsané modifikace sekvence mohou být zavedeny za použití standardních rekombinačních technik nebo automatizovanou syntézou modifikovaného polypeptidů. Například mutace mohou být zavedeny do určitého místa syntetizováním oligonukleotidů obsahujících mutantní sekvenci, obklopenou restrikčními místy umožňujícími ligaci na frekvenci nativní sekvence. Po ligaci kóduje vzniklá rekonstruovaná sekvence analog mající požadovanou aminokyselinovou inzerci, substituci nebo deleci.
Alternativně, postupy na oligonukleotidy zaměřené místně specifické mutageneze mohou být použity pro poskytnutí genu, ve které jsou určité kodony alterovány požadovanou substitucí, deleci nebo inzercí. Příklady metody pro výrobu alternací uvedených výše jsou popsány ve Walder a kol. Gene 42, 133 (1986); Bauer a kol., Gene 37, 73 (1985); Craik, BioTechniques, leden 1985, 12 až 19; Smith a kol., Genetics Engineering: Principles and Methods, Plenům Press, 1981; a patenty US 4 518 584 a 4 737 462.
Mutace v nukleotidových sekvencích konstruované pro expresi takových HER-2/neu polypeptidů musí samozřejmě zachovávat čtecí rámeček kódujících sekvencí a preferovaně nebude vytvářet komplementární regiony, které by mohly hybridizovat za produkce sekundárních mRNA struktur, jako jsou smyčky s vlásenky, které mohou nežádoucím způsobem ovlivňovat translaci mRNA. Ačkoliv místo mutace může být předem určeno, není nezbytné, aby charakter mutace per se byl předem určen. Například pro vybrání optimálních charakteristik mutantů v daném místě může být provedena náhodná mutageneze v cílovém kodonu a exprimované HER-2/neu polypeptidové mutanty mohou být vyšetřovány na požadovanou aktivitu.
Ne všechny mutace v nukleotidové sekvenci, která kóduje HER-2/neu polypeptid, budou exprimovány v konečném produktu. Například substituce nukleotidů mohou být provedeny pro posílení exprese, především pro vyloučení smyček sekundární struktury v transkribované mRNA (viz např. evropská patentová přihláška 754 44A), nebo pro poskytnutí kodonů, které jsou snadněji translatovány selektovaným hostitelem, jako jsou dobře známé E. coli preferenční kodony pro expresi v E. coli.
Polypeptidy podle předkládaného vynálezu, jak přirozeně se vyskytující, tak modifikované, jsou preferovaně produkovány rekombinantními DNA metodami. Takové metody zahrnují inzerci
-9CZ 296618 B6
DNA sekvence kódující HER-2/neu polypeptid do rekombinantního expresního vektoru a expresi DNA sekvence v rekombinantním mikrobiálním, savčím nebo hmyzím buněčném expresním systému za podmínek navozujících expresi. DNA sekvence kódující polypeptidy poskytnuté tímto vynálezem mohou být sestaveny z cDNA fragmentů a krátkých oligonukleotidových linkerů, nebo ze série oligonukleotidů, za poskytnutí syntetického genu, který je schopen inzerce v rekombinantním expresním vektoru a exprese v rekombinantní transkripční jednotce.
Rekombinantní expresní vektory obsahují DNA sekvenci kódující HER-2/neu polypeptid operativně vázanou na vhodné transkripční nebo translační regulační elementy odvozené od savčích, mikrobiálních, virových nebo hmyzích genů. Takové regulační elementy zahrnují transkripční promotor, volitelnou operátorovou sekvenci pro kontrolu transkripce, sekvenci kódující vhodná mRNA ribosomální vazebná místa a sekvence, které kontrolují ukončení transkripce a translace. Zdroj replikace a selektovatelný markér pro usnadnění rozpoznání transformantů mohou být dále inkorporovány.
DNA regiony jsou operativně vázány, pokud jsou jeden ke druhému ve funkčním vztahu. Například DNA pro signální peptid (sekreční leader) je operativně navázán na DNA pro polypeptid pokud je exprimován jako prekurzor, který participuje na sekreci polypeptidu; promotor je operativně navázán na kódující sekvenci, pokud kontroluje transkripci sekvence; nebo ribosomové vazebné místo je operativně navázáno na kódující sekvenci, pokud je umístěno tak, že umožňuje translaci. Obecně operativně vázaný znamená sousedící a, v případě sekrečních leaderů, ve čtecím rámečku. DNA sekvence kódující HER-2/neu polypeptid, které mají být exprimovány v mikroorganismu, nebudou výhodně obsahovat žádné introny, které by mohly předčasně ukončit transkripci DNA na mRNA.
Expresní vektory pro bakteriální použití mohou obsahovat selektovatelný markér a bakteriální zdroj replikace odvozené od komerčně dostupných plazmidů obsahujících genetické elementy dobře známého klonovacího vektoru pBR322 (ATCC 37017). Takové komerční vektory zahrnují, například, pKK223-3 (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Sweden) a pGEMl (Promega Biotec, Madison, WI, USA). Tyto pBR322 „základní“ sekce jsou kombinovány s vhodným promotorem a strukturními sekvencemi, které mají být exprimovány. E. coli je typicky transformována za použití derivátů pBR322, plazmidů odvozeného od druhu E. coli (Bolivar a kol., Gene 2, 95 (1977)). pBR322 obsahuje geny pro resistenci na ampicilin atetracyklin a tak poskytuje jednoduchý prostředek pro identifikaci transformovaných buněk.
Promotory běžně používané v rekombinantních mikrobiálních expresních vektorech zahrnují βlaktamázový (penicilinázový) a laktosový promotorovy systém (Chang a kol., Nátuře 275, 615 (1978); a Goeddel a kol., Nátuře 281, 544 (1979)), tryptofanový (trp) promotorový systém (Goeddel a kol., Nucl. Acids Res. 8, 4057 (1980); a evropská patentová přihláška 36 776) a tac promotor (Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, str. 412, 1982). Zejména užitečný bakteriální expresní systém využívá fág lambda PL promotor a cI857ts termolabilní represor. Plazmidové vektory dostupné od Američan Type Culture Collection, které inkorporují deriváty lambda PL promotoru, zahrnují plazmid pHUB2, umístěný vE. coli kmenu JMB9 (ATCC 37092), a pPLc28, umístěný v E. coli RR1 (ATCC 53082).
Vhodné promotorové sekvence ve kvasinkových vektorech obsahují promotory pro metallothionein, 3-fosfoglycerát kinázu (Hitzeman a kol., J. Biol., Chem. 255, 2073 (1980)) nebo jiné glykolytrické enzymy (Hess a kol., J. Adv. Enzyme Reg. 7, 149 (1968); a Holland a kol., Biochem. 17, 4900 (1978)), jako je enoláza, glyceraldehyd-3-fosfát dehydrogenáza, hexokináza, pyruvát dekarboxyláza, fosfofruktokináza, glukóza-6-fosfát izomeráza, 3-fosfoglycerát mutáza, pyruvát kináza, triózafosfát izomeráza, fosfoglukóza izomeráza a glukokináza. Vhodné vektory a promotory pro použití v kvasinkové expresi jsou dále popsány v R. Hitzeman a kol., evropská patentová přihláška 73 657.
-10CZ 296618 B6
Preferované kvasinkové vektory mohou být sestaveny za použití DNA sekvencí z pBR322 pro selekci a replikaci v E. coli (Ampr gen a zdroj replikace) a kvasinkových DNA sekvencí obsahujících glukózou represibilní ADH2 promotor a α-faktor sekreční leader. ADH2 promotor popsal Russell a kol. (J. Biol. Chem. 258, 2674 (1982)) a Beier a kol. (Nátuře 300, 724 (1982)). Kvasinkový α-faktor leader, který řídí sekreci heterologních proteinů, může být inzertován mezi promotor a strukturální gen, který má být exprimován (viz např. Kurjan a kol., Cell 30, 933 (1982); a Bitter a kol., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 81, 5300 (1984)). Leader sekvence může být modifikována tak, aby obsahovala, v blízkosti svého 3' konce, jedno nebo více použitelných restrikčních míst pro usnadnění fúze leader sekvence na cizorodé geny. Transkripční a translační kontrolní sekvence v expresních vektorech pro použití v transformaci buněk obratlovců mohou být poskytnuty z virových zdrojů. Například, běžně používané promotory a enhancery jsou odvozeny od polyoma, adenoviru 2, opičího viru 40 (SV40) a lidského cytomegaloviru. DNA sekvence odvozené z SV40 virového genomu, například, SV40 zdroj, časný a pozdní promotor, enhancer, splice a polyadenylační místa mohou být použity pro poskytnutí jiných genetických elementů vyžadovaných pro expresi heterologní DNA sekvence. Časné a pozdní promotory jsou zejména užitečné, protože jsou oba snadno získány z viru jako fragment, který také obsahuje SV40 virový zdroj replikace (Fiers a kol., Nátuře 273, 113 (1978)). Menší nebo větší SV40 fragmenty mohou také být použity, takže přibližně 250 bp sekvence v rozsahu od Hind III místa kBgl II místu umístěné ve virovém zdroji replikace je také obsažena. Dále, virový genomový promotor, kontrolní a/nebo signální sekvence mohou být využity, kde takové kontrolní sekvence jsou kompatibilní s vybranou hostitelskou buňkou. Příkladné vektory mohou být konstruovány jak popisuje Okayama a Berg, Mol. Cell Biol. 3, 280 (1983).
Užitečný systém pro stabilní vysokou hladinu exprese cDNA savčího receptorů cDNAs v Cl27 myších savčích epiteliálních buňkách může být konstruován vpodstatě tak, jak popisuje Cosman a kol. (Mol. Immunol. 23, 935 (1986)). Preferovaným eukaryotním vektorem pro expresi DNA LbeIF4A proteinu je pCD406 (McMahan a kol., EMBO J., 10, 2821 (1991)) a obsahuje regulační sekvence odvozené od SV40, viru lidské imunodefícience (HIV) a viru Epstein-Barrové (EBV). Jiné preferované vektory zahrnují pDC409 a pDC410, které jsou odvozeny od pDC406. pDC409 byl odvozen od PDC406 substitucí EBV zdroje replikace za sekvenci kódující SV40 velký T antigen. pDC409 se liší od pDC406 v tom, že Bgl II restrikční místo mimo mnohočetné klonovací místo bylo deletováno, což činí Bgl II místo vmnohočetném klonovacím místě jedinečným.
Použitelná buněčná linie, která umožňuje epizomální replikaci expresních vektorů, jako je pCD406 a pCD409, které obsahují EBV zdroj replikace, je CV-l/EBNA (ATCC CRL 10478). CV-L/EBNA buněčná linie byla odvozena transfekcí CV-1 buněčné linie genem kódujícím nukleární antigen I viru Epstein-Barrové (EBNA-1) a konstitutivně exprimuje EBNA-1 řízený lidským CMV okamžitým-časným enhancerem/promotorem.
Transformované hostitelské buňky jsou buňky, které byly transformovány nebo transfektovány expresními vektory konstruovanými za použití rekombinantních DNA technik a které obsahují sekvence kódující HER-2/neu polypeptid podle předkládaného vynálezu. Transformované hostitelské buňky mohou exprimovat požadovaný HER-2/neu polypeptid, ale hostitelské buňky transformované za účelem klonování nebo amplifikace HER-2/neu DNA nemusí exprimovat HER2/neu polypeptid. Exprimované polypeptidy budou preferovaně secernovány do kultivačního supematantu, v závislosti na vybrané DNA, ale mohou také být deponovány v buněčné membráně.
Vhodné hostitelské buňky pro expresi rekombinantních proteinů zahrnují prokaryotní buňky, kvasinky nebo vyšší eukaryotní buňky pod kontrolou vhodných promotorů. Prokaryoty zahrnují gram negativní nebo gram pozitivní organismy, například E. coli nebo Bacilli. Vyšší eukaryotní buňky obsahují ustanovené buněčné linie hmyzího nebo savčího původu, jak jsou popsány dále.
Buněk prosté translační systémy mohou být také využity pro produkci HER-2/neu polypeptidů za použití RNA derivovaných z DNA konstruktů. Vhodné klonovací a expresní vektory pro
-11 CZ 296618 B6 použití v bakteriích, houbových, kvasinkových a savčích buněčných hostitelích jsou popsány například v Powels a kol., Cloning Vectors: A Laboratory Manual, Elsevier, New York, 1985.
Prokaryotní expresní hostitelé mohou být použity pro expresi HER-2/neu polypeptidů, které nevyžadují extensivní proteolytické a disulfidové zpracování. Prokaryotní expresní vektory obecně obsahují jeden nebo více fenotypových selektovatelných markérů, například gen kódující proteiny udílející resistenci na antibiotika nebo doplňující autotrofní požadavky a zdroj replikace rozpoznávaný hostitelem pro zajištění amplifikace v hostiteli. Vhodní prokaryotní hostitelé pro transformaci zahrnují E. coli, Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium a různé druhy rodu Pseudomonas, Streptomyces a Staphylococcus, ačkoliv jiní hostitelé mohou být také použiti.
Rekombinantní HER-2/neu polypeptidy mohou také být exprimovány v kvasinkovém hostiteli, preferovaně druhu Saccharomyces, jako je S. cerevisiae. Kvasinky jiných rodů, jako je Pichia nebo Kluyveromyces, mohou také být použity. Kvasinkové vektory budou obecně obsahovat zdroj replikace z 2μ kvasinkového plazmidů nebo autonomně se replikující sekvenci (ARS), promotor, DNA kódující HER-2/neu polypeptid, sekvence pro polyadenylaci, a terminaci transkripce a selekční gen. preferovaně budou kvasinkové vektory obsahovat zdroj replikace a selektovatelný markér umožňující transformaci jak kvasinky, tak E. coli, např. gen resistence na ampicilin E. coli a S. cerevisiae trpí gen, který poskytuje selekční markér pro mutantní kmen kvasinky postrádající schopnost růstu vtryptofanu, a promotor odvozený do vysoce exprimováného kvasinkového genu pro indukci transkripce strukturálního genu downstream. Přítomnosti trpí lése v buněčném genomu hostitelské kvasinky potom poskytuje účinné prostředí pro detekci transformace růstem za nepřítomnosti tryptofanu.
Vhodné transformační protokoly pro kvasinky jsou odborníkovi v oboru známé. Příkladná technika popsaná Hindem a kol. (Proč. nati. Acad. Sci. USA 75, 1929, (1978)) zahrnuje selekci Trp+ transformantů v selektivním médiu skládajícím se z 0,67 % kvasinkové dusíkaté báze, 0,5 % casaminokyselin, 2 % glukózy, 10 mg/ml adeninu a 20 mg/ml uracilu. Hostitelské kmeny transformované vektorem obsahujícím ADH2 promotor mohou být kultivovány pro expresi v bohatém médiu skládajícím se z 1 % kvasinkového extraktu, 2 % peptonu a 1 % glukózy doplněném 80 mg/ml adeninu a 80 mg/ml uracilu. Dereprese ADH2 promotoru se vyskytuje po vyčerpání glukózy v médiu. Surové kvasinkové supernatanty jsou získány filtrací a uchovávány při 4 °C před další purifikací.
Různé savčí nebo hmyzí (např. Spodoptera nebo Trichoplusia) buněčné kultivační systémy mohou také být použity pro expresi rekombinantního polypeptidů. Baculovirový systém pro produkci heterologních polypeptidů ve hmyzích buňkách jsou popsány například Luckowem a Summersem v Bio/Technology 6, 47 (1988). Příklady vhodných savčích hostitelských buněčných linií zahrnují COS-7 linie buněk opičích ledvin, popsané Gluzmanem (Cell 23, 175 (1981)) a jiné buněčné linie schopné exprese ve vhodných vektorech včetně například CV-l/EBNA (ATCC CRL 10478), L buněk, C127, 3T3, ovaria čínských křečků (CHO), COS, NS-1, HeLa a BHK buněčné linie. Savčí expresní vektory mohou obsahovat netranskribované elementy jako je zdroj replikace, vhodný promotor a enhancer navázaný na gen, který má být exprimován, a jiné 5' nebo 3' sousedící netranskribované sekvence a 5' nebo 3' netranslatované sekvence, jako jsou nezbytná vazebná místa pro ribosomy, polyadenylační místo, střihový donor a akceptor místa a transkripční terminační sekvence.
Purifikované HER-2/neu polypeptidy mohou být připraveny kultivací vhodných systémů hostitel/vektor pro expresi rekombinantních translačních produktů DNA podle předkládaného vynálezu, které jsou potom purifikovány z kultivačního média nebo z buněčných extraktů. Například supernatanty ze systémů, které secernují rekombinantní polypeptidy do kultivačního média, mohou být nejprve koncentrovány za použití komerčně dostupného proteinového koncentračního filtru, jako je Amicon nebo Millipore Pellicon ultrafíltrační jednotka. Po kroku koncentrování může být koncentrát aplikován na vhodnou purifikační matrix. Například vhodná afinitní matrice může obsahovat počitatelný strukturální protein (tj. protein, na který se HER-2/neu polypeptid
-12CZ 296618 B6 váže ve specifické interakci založené na struktuře) nebo lektin nebo molekulu protilátky navázanou na vhodný nosič. Alternativně může být využit aniontoměničová pryskyřice, například matrix nebo substrát, který má zavěšené diethylaminoethylové (DEAE) skupiny. Matrice mohou být akrylamidové, agarózové, dextranové, celulózové nebo jiných typů běžně používaných v proteinové purifikaci. Alternativně může být využit kationtoměničový krok. Vhodné kationtoměniče zahrnují různé nerozpustné matrice obsahující sulfopropylové nebo karboxymethylové skupiny. Sulfopropylové skupiny jsou preferovány. Gelová filtrační chromatografie také poskytuje prostředek pro purifikaci HER-2/neu.
Afinitní chromatografie je preferovanou metodou pro purifikaci HER-2/neu polypeptidů. Například monoklonální protilátky proti HER-2/neu polypeptidů mohou být také užitečné při purifikaci afinitní chromatografií, za použití metod, které jsou v oboru dobře známé.
Konečně, jeden nebo více kroků reverzní fázové vysoce účinné kapalinové chromatografie (RPHLPC) využívající hydrofobního RP-HPLC média (např. silikagel mající zavěšenou methylovou nebo jinou alifatickou skupinu) mohou být využity pro další čištění HER-2/neu polypeptidové kompozice. Některé nebo všechny výše uvedené kroky purifíkace, v různých kombinacích, mohou být také využity pro poskytnutí homogenního rekombinantního polypeptidů.
Rekombinantní HER-2/neu polypeptid produkovaný v bakteriální kultuře je preferovaně izolován iniciální extrakcí z buněčných pelet, po kterém následuje jedno nebo více koncentrací, vysolení, vodná iontová výměna nebo vyloučení podle velikosti kroky chromatografie. Vysoce účinná kapalinová chromatografie (HPLC) může být použita pro konečné kroky purifíkace. Mikrobiální buňky použité v expresi rekombinantního LbeIF4A proteinu mohou být rozrušeny jakoukoliv vhodnou metodou, včetně cyklování mrazením a rozmrazováním sonikace, mechanického rozrušení nebo za použití agens způsobujících lýzu buňky.
Fermentace kvasinek, které exprimují HER-2/neu polypeptid, jako secemovaný protein, značně zjednodušuje purifikaci. Secerovaný rekombinantní protein vzniklý z fermentace velkého roztoku může být purifíkován metodami analogickými k těm, které popsal Urbal a kol. (J. Chromatog. 296, 171 (1984)). Tento odkaz popisuje dva sekvenční, reverzní fáze HPLC kroky pro purifikaci rekombinantního lidského GM-CSF na preparativní HPLC koloně.
Prostředky z HER-2/neu polypeptidů syntetizovaných v rekombinantní kultuře mohou obsahovat non-HER-2/neu buněčné složky včetně proteinů v množství a charakteru, který závisí na krocích purifíkace vybraných pro získání HER-2/neu polypeptidů z kultury. Tyto složky budou obyčejně kvasinkového, prokaryotního nebo non-lidského eukaryotního původu. Takové prostředky jsou obyčejně prosté jiných proteinů, které mohou být normálně asociovány s HER-2/neu proteinem, jak je tomu v přírodě a v druzích, ze kterých pochází.
Automatizované syntézy poskytují alternativní metodu pro přípravu polypeptidů podle předkládaného vynálezu. Například mohou být použity jakékoliv komerčně dostupné techniky pevné fáze, jako je Merrifíeld solid phase syntetická metoda, ve které jsou aminokyseliny sekvenčně přidávány k rostoucímu aminokyselinovému řetězci. (Viz Merrifíeld, J. Am. Chem. Soc. 85, 2149-2146 (1963).) Vybavení pro automatizovanou syntézu polypeptidů je komerčně dostupné od dodavatelů, jako je Applied Biosystems, lne., z Foster City, CA, a může se obecně pracovat podle návodu výrobce.
V jednom aspektu podle předkládaného vynálezu, použití HER-2/neu polypeptidů (nebo DNA molekuly, která řídí expresi takového peptidu) pro generování imunitní odpovědi na HER-2/neu protein (včetně toho, který je exprimován na malignitách, se kterými je HER-2/neu onkogen asociován) může být detekováno. Reprezentativní vzorky takových malignit, zahrnují rakovinu prsu, ovaria, tlustého střeva, plic a prostaty. Imunitní odpověď na HER-2/neu protein, generovaná HER-2/neu polypeptidem, může být dlouhodobá a může být detekována dlouho po imunizaci, nezávisle na tom, zda je protein přítomen nebo nepřítomen v těle v době testování. Imunitní
-13 CZ 296618 B6 odpověď na HER-2/neu protein generovaná HER-2/neu polypeptidem může být detekována vyšetřením přítomnosti nebo nepřítomností, nebo zvýšení, specifické aktivace CD4+ nebo CD8+ T buněk. Přesněji, T buňky izolované od imunizovaného jedince rutinním způsobem (jako je Ficoll/Hypaque centrifugace podle gradientu density lymfocytů periferní krve) jsou inkubovány s HER-2/neu proteinem. Například T buňky mohou být inkubovány in vitro po 2 až 9 dní (obvykle 4 dny) při 37 °C s HER-2/neu proteinem (obvykle 5 pg/ml celého proteinu nebo stupňového počtu buněk syntetizujících HER-2/neu protein). Může být žádoucí inkubovat jiný podíl vzorku T buněk za absence HER-2/neu proteinu pro kontrolu.
Specifická aktivace CD4+ nebo CD8+ buněk může být detekována různými způsoby. Metoda pro detekování specifické aktivace T buněk zahrnují detekci proliferace T buněk, produkce cytokinů (např. lymfokinů) nebo generování cytolytické aktivity (tj. generování cytotoxických T buněk specifických pro HER-2/neu protein). Pro CD4+ T buňky je výhodnou metodou pro detekování specifické aktivace T buněk detekce proliferace T buněk. Pro CD8+ T buňky je preferovanou metodou pro detekování specifické aktivity T buněk detekce generování cytolytické aktivity.
Detekce proliferace T buněk může být provedena různými známými způsoby. Například proliferace T buněk může být detekována měřením stupně DNA syntézy. T buňky, které byly stimulovány k proliferaci, vykazují zvýšený stupeň syntézy DNA. Typickým způsobem pro měření stupně syntézy DNA jsou například pulzně značené kultury T buněk tritiováných thymidinem, prekurzorem nukleotidů, který je inkorporován do nově syntetizované DNA. Množství inkorporovaného tritiovaného thymidinu může být určeno za použití kapalinového scintilačního spektrofotometru. Jiné způsoby pro detekování proliferace T buněk zahrnují měření zvýšení produkce interleukinu 2 (IL-2), Ca2+ tok, nebo vychytávání barviva, jako je 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)2,5-diphenyltetrazolium. Alternativně, syntéza lymfokinů (jako je interferon-gamma) může být měřena nebo může být kvantifikován relativní počet T buněk, které mohou odpovídat na intaktní pl85HE“u protein.
Za použití nebo expresí HER-2/neu polypeptidu mohou být T buňky, které rozpoznávají HER2/neu protein, proliferovány in vivo. Například léčivo pro imunizaci s HER-2/neu peptidem (tj. jako je vakcína) může indukovat kontinuální expansi počtu T buněk nezbytných pro terapeutický útok na tumor, se kterým je HER-2/neu onkogen asociován. Typicky, asi 0,01 pg/kg až asi 100 mg/kg tělesné hmotnosti bude podáno intradermálně, subkutánně nebo intravenosním způsobem. Preferovaná dávka je od asi 1 pg/kg do asi 200 pg/kg. Odborníkovi v oboru bude jasné, že počet a frekvence podání bude záviset na odpovědi pacienta. Může být žádoucí podat HER-2/neu polypeptid opakovaně. Odborníkovi v oboru bude jasné, že může být podán více než jeden HER2/neu polypeptid, buď simultánně, nebo sekvenčně. Preferované peptidy pro použití v léčivu pro imunizaci jsou ty, které obsahují aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 2 začínající asi lysino vým zbytkem v aminokyselinové pozici 676 a sahají asi kvalinovému zbytku v aminokyselinové pozici 1255. Odborníkem v oboru bude oceněno, že předkládaný vynález předpokládá použití intaktního HER-2/neu polypeptidu, stejně jako dělení takového polypeptidu na množství peptidů. Ani intaktní pl85HER“2/neu protein, ani peptid mající aminokyselinovou sekvenci jeho celé extracelulámí domény (tj. peptid mající aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 2 od aminokyseliny v pozici 1 do aminokyseliny v pozici 650, plus nebo minus asi jedna až pět pozic, a s nebo bez prvních 21 aminokyselinových pozic) nejsou použity samostatně pro imunizaci.
HER-2/neu polypeptid (nebo nukleová kyselina) je preferovaně formulován pro použití ve výše uvedených metodách jako farmaceutická kompozice (např. vakcína). Farmaceutická kompozice obecně obsahuje jeden nebo více polypeptidů v kombinaci s farmaceuticky akceptovatelným nosičem, excipientem nebo ředidlem. Takové nosiče budou netoxické pro příjemce v použitých dávkách a koncentracích. Použití HER-2/neu polypeptidu v konjunkci s chemoterapeutickým agens je také předpokládáno.
Kromě HER~2/neu polypeptidu (který účinkuje jako antigen) může být také žádoucí zahrnout jiné složky do vakcíny, jako je vehikulum pro podání antigenu a imunostimulační substance pro
-14CZ 296618 B6 zvýšení imunogenicity proteinu. Příklady vehikulí pro antigen obsahují soli hliníku, emulze voda v oleji, biodegradovatelná olejová vehikula, emulze olej ve vodě, biodegradovatelné mikrokapsle a lipozomy. Příklady imunostimulačních substancí (adjuvans) zahrnují N-acetylmuramyl-Lalanin-D-izoglutamin (MDP), lipopolysacharidy (LPS), glukan, IL-12, GM-CSF, interferongamma a IL-15. Odborníkovi v oboru bude jasné, že HER-2/neu polypeptid pro vakcíny může být připraven synteticky nebo může být přirozeně odvozen.
Zatímco jakýkoliv vhodný nosič známý odborníkovi v oboru může být využit ve farmaceutických kompozic podle předkládaného vynálezu, typ nosiče bude velmi záviset na způsobu podání a na tom, zda je požadováno trvalé uvolňování. Pro parenterální podání, jako je subkutánní injekce, nosič preferovaně obsahuje vodu, salinický roztok, alkohol, tuk, vosk nebo pufr. Pro orální podání může být použit jakýkoliv z výše uvedených nosičů nebo pevný nosič jako je mannitol, laktóza, škrob, stearát hořečnatý, sacharid sodný, talek, celulóza, glukóza, sacharóza a uhličitan hořečnatý. Biodegradovatelné mikrosféry (např. polymléčný galaktid) mohou být také použity jako nosiče pro farmaceutické kompozice podle předkládaného vynálezu. Vhodné degradovatelné mikrosféry jsou popsány např. v patentech US 4 897 286 a 5 075 109. HER-2/neu polypeptid může být enkapsulován uvnitř biodegradovatelné mikrosféry nebo může být asociován s povrchem mikrosféry. Například v preferovaném provedení polypeptid mající aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 2 od aminokyseliny 676 do aminokyseliny 1255 je enkapsulován v biodegradovatelné mikrosféře. V tomto ohledu je preferováno, aby byla mikrosféra větší než přibližně 25 mikrometrů.
Farmaceutické kompozice (včetně vakcín) mohou také obsahovat ředidla, jako jsou pufry, antioxidanty, jako je kyselina askorbová, polypeptidy o nízké molekulové hmotnosti (menší než asi 10 zbytků), proteiny, aminokyseliny, uhlohydráty, jako je glukóza, sacharóza nebo dextriny, chelatační agens jako je EDTA, glutathion nebo jiné stabilizátory nebo excipiens. Neutrální pufrovaný salinický roztok nebo salinický roztok smísený s nespecifickým sérovým albuminem jsou příklady vhodných ředidel. Výhodně je produkt formulován jako lyofilizát za použití vhodných excipientních roztoků (např. sacharózy) jako ředidel.
Jako alternativu pro prezentaci HER-2/neu polypeptidů obsahuje předmět vynálezu kompozice schopně dopravní molekul nukleové kyseliny kódujících HER-2/neu polypeptid. Takové kompozice zahrnují rekombinantní virové vektory (např. retrovirové (viz W 90/07936, WO 91/02805, WO 93/25234, WO 93/25698 a WO 94/03622), adenovirové (viz Berkner, Biotechniques 6, 616 až 627 (1988); Li a kol., Hum. Gen. Ther. 4, 403 až 409 (1993); Vincent a kol., Nat. Genet., 5, 130 až 134 (1993); a Kolls a kol., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 91, 215 až 219 (1994)), pox virové (viz patent US 4 769 330; patent US 5 017 487; a WO 89/01973), naked DNA (viz WO 90/11092), molekula nukleové kyseliny komplexovaná na polykationtovou molekulu (viz WO 93/03709) a nukleová kyselina asociovaná s lipozomy (viz Wang a kol., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 84, 7851 (1987)). V jistých provedeních může být DNA navázána na usmrcený nebo inaktivovaný adenovirus (viz Curiel a kol., Hum. Gen. Ther. 3, 147 až 154 (1992); Cotton a kol., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 89, 6094 (1992)). Jiné vhodné kompozice obsahují DNA ligand (viz Wu a kol., J. Biol. Chem. 264, 16985 až 16987 (1989)) a lipid-DNA kombinace (viz Felgner a kol., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 84, 7413 až 7417 (1989)). Kromě toho účinnost vychytávání „naked DNA“ do buněk může být zvýšena potažením DNA na biodegradovatelné korálky.
Kromě přímých in vivo procedur mohou být použity ex vivo procedury, ve kterých jsou buňky odstraněny ze živočicha, modifikovány a umístěny do stejného nebo do jiného živočicha. Je jasné, že může být využita jakákoliv kompozice uvedená výše pro zavedení HER-2/neu molekuly nukleové kyseliny do buněk tkáně v ex vivo kontextu. Protokoly pro virové, fyzikální a chemické metody vychytávání jsou v oboru dobře známé.
V souladu s tím je předkládaný vynález užitečný pro posílení nebo vyvolání buněčné imunitní odpovědi (např. generování pro antigen specifických cytolytických T buněk) u pacienta nebo v buněčné kultuře. Jak je zde použito, termín „pacient“ označuje jakéhokoliv teplokrevnéhoživo- 15 CZ 296618 B6 čichá, preferovaně člověka. Pacient může být postižen rakovinou, jako je rakovina prsu, nebo může být normální (tj. bez detekovatelné choroby nebo infekce). „Buněčná kultura“ je jakýkoliv prostředek z T buněk nebo izolovaných složek buněk (včetně, ale nejenom, makrofágů, monocytů, B buněk a dendritických buněk). Takové buňky mohou být izolovány jakoukoliv z množství technik odborníkovi v oboru dobře známých (jako je Ficoll-hypaque denzitní centrifugace). Buňky mohou (ale nemusí) být izolovány od pacienta postiženého s HER-2/neu asociovanou malignitou, a mohou být znovu zavedeny do pacienta po léčbě.
Předkládaný vynález také popisuje, že HER-2/neu polypeptid, kromě toho, že je imunogenní pro T buňky, pravděpodobně stimuluje B buňky k produkci protilátek schopných rozpoznávat HER2/neu polypeptid. Protilátky specifické (tj. ty, které vykazují vazebnou afinitu okolo 107 litrů/mol nebo vyšší) pro HER-2/neu protein mohou být nalezeny v mnoha tělesných tekutinách včetně séra a ascitu. Stručně uvedeno, vzorek tělesné tekutiny je odebrán od teplokrevného živočicha, jako je člověk, u kterého je požadavek na určení přítomnosti protilátek specifických pro HER2/neu polypeptid. Tělesná tekutina je inkubována s HER-2/neu polypeptidem za podmínek a po dobu dostatečnou pro umožnění tvorby imunokomplexů mezi polypeptidem s protilátkami specifickými pro protein. Například tělesná tekutina a HER-2/neu polypeptid mohou být inkubovány při 4 °C po dobu 24 až 48 hodin. Po inkubaci je reakční směs testována na přítomnost imunokomplexů. Detekce jednoho nebo více imunokomplexů vytvořených mezi HER-2/neu polypeptidem a protilátkou specifickou pro ElER-2/neu polypeptid může být provedena množství různých technik, jako je radioimunotest (RIA) a enzymově vázaný imunosorbentní test (ELISA).
Vhodné imunotesty zahrnují sendvičovou imunotestovací techniku s použitím dvojích monoklonálních protilátek podle Davida a kol. (patent US 4 376 110); sendvičové testy s použitím monoklonální - polyklonální protilátky (Wide a kol., vKirkham a Hunter, vyd., Radioimunoassay Methods, E. and S. Livingstone, Edinburgh, 1970); „western blot“ metodu podle Gordona a kol., (patent US 4 452 901); imunoprecipitaci značeného ligandu (Brown a kol., J. Biol Chem. 255, 4980 až 4983 (1980); enzymově vázané imunosorbentní testy popsané například Rainesem aRossem (J.Biol. Chem. 257, 5154 až 5160 (1982)); imunocytochemické techniky, včetně použití fluorochromů (Brooks a kol., Clin. Exp. Immunol.39, 477 (1980)); a neutralizace aktivity (Bowen-Pope a kol., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 81, 2396 až 2400 (1984)), všechny jsou zde zahrnuty jako odkaz. Kromě imunotestů popsaných výše je dostupný velký počet jiných imunotestů, včetně těch, které jsou popsány v patentech US 3 817 827; US 3 850 752; US 3 901 654; US 3 935 074; US 3 984 533; US 4 034 074; a US 4 098 876, které jsou zde všechny zahrnuty jako odkaz.
Pro účely detekce může být HER-2/neu polypeptid („antigen“) buď značný, nebo neznačený. Pokud je neznačený, pak nachází antigen uplatnění v aglutinačních testech. Kromě toho, neznačený antigen může být použit v kombinaci se značenými molekulami, které jsou reaktivní s imunokomplexy, nebo v kombinaci se značenými protilátkami (sekundárním protilátkami), kteréjsou reaktivní s protilátkou namířenou proti HER-2/neu polypeptidu, jako je protilátka specifická pro imunoglobulin. Alternativně může být antigen značen přímo. Pokud je značen, pak může značkovací skupina obsahovat radioizotopy, fluorofory, enzymy, luminiscenční agens nebo částice barviva. Tyto a jiné značky jsou dobře známé v oboru a jsou popsány například v těchto patentech US 3 766 162; US 3 791 932; US 3 817 837; US 3 996 345; a US 4 233 402.
Typicky v ELISA testuje antigen absorbován na povrch mikrotitrační jamky. Residuální vazebná místa pro protein jsou potom blokována vhodným agens, jako je hovězí sérový albumin (BSA), teplem inaktivované normální kozí sérum (NGS), nebo BLOTTO (pufrovaný roztok netučného sušeného mléka, který také obsahuje ochranné agens, soli a protipěnicí agens). Jamka je potom inkubována se vzorkem, o kterém je předpokládáno, že obsahuje specifickou protilátku. Vzorek může potom být aplikován neředěný nebo, častěji, může být ředěn, obvykle v pufrovacím roztoku, který obsahuje malé množství (0,1 až 5,0 % hmotnostních) proteinu, jako je BSA, NGS nebo BLOTTO. Pro inkubaci po dostatečnou dobu pro umožnění proběhnutí specifické vazby, je jamka promyta pro odstranění nenavázaného proteinu a potom je inkubována se značenou proti
-16CZ 296618 B6 látkou specifickou pro druh imunoglobulinu, která je značena značkovací skupinou. Značkovací skupina může být vybrána z množství enzymů, včetně křenové peroxidázy, beta galaktosidázy, alkalické fosfatázy a glukóza oxidázy. Je umožněna dostatečně dlouhá doba pro výskyt specifické vazby, potom je jamka znovu promyta pro odstranění nenavázaného konjugáty a je přidán substrát pro enzym. Je umožněn vývoj barvy a optická densita obsahu jamky je měřena vizuálně nebo instrumentálně.
V jednom preferované provedení tohoto aspektu předkládaného vynálezu je značkovací skupina navázána na HER-2/neu protein. Krok detekce imunokomplexů vyžaduje odstranění v podstatě jakéhokoliv nevázaného HER-2/neu proteinu a potom detekování přítomnosti nebo nepřítomnosti reportérové (značkovací) skupiny.
V jiném preferovaném provedení je reportérová skupina navázána na druhou protilátku schopnou vazby na protilátky specifické pro HER-2/neu protein. Krok detekování imunokomplexů vyžaduje (a) odstranění v podstatě jakékoli nenavázané protilátky, (b) přidání druhé protilátky, (c) odstranění v podstatě jakékoliv nenavázané druhé protilátky a potom (d) detekování přítomnosti nebo absence reportérové skupiny.
Pokud je protilátka specifická pro HER-2/neu protein odvozena od lidské, pak je druhou protilátkou antilidská protilátka.
Ve třetím preferovaném provedení pro detekování imunokomplexů je reportérová skupina navázána na molekulu schopnou vazbu na imunokomplex. Krok detekování vyžaduje (a) přidání molekuly, (b) odstranění v podstatě jakékoliv nenavázané molekuly, (c) detekování přítomnosti nebo absence reportérové skupiny.
Příkladem molekuly schopné vazby na imunokomplexy je protein A.
Odborníku v oboru je jasné, že množství metod pro detekování imunokomplexů může být použito v předkládaném vynálezu. Reportérové skupiny vhodné pro použití v jakékoliv z těchto metod zahrnují radioizotopy, fluorofory, enzymy, luminiscenční agens a částice barviva.
V příbuzném aspektu předkládaného vynálezu může být detekce imunokomplexů tvořených mezi HER-2/neu polypeptidem a protilátkami v tělesných tekutinách specifickými pro HER-2/neu polypeptid použita pro monitorování účinnosti rakovinné terapie, které obsahují HER-2/neu polypeptid, malignit, se kterými je HER-2/neu onkogen asociován. Vzorky tělesné tekutiny od jedince odebrané před a po začátku terapie mohou být analyzovány na imunokomplexy metodami popsanými výše. Stručně uvedeno, je srovnáván počet imunokomplexů detekovaných v oboru vzorcích. Významná změna v počtu imunokomplexů ve druhém vzorku (po zahájení terapie) vzhledem k prvnímu vzorku (před terapií) odráží úspěšnou terapii.
Následující příklady jsou nabídnuty jako ilustrace a nikoliv jako omezení.
-17CZ 296618 B6
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1
Exprese a purifikace rekombinantního lidského HER-2/neu polypeptidu.
Lidský HER-2/neu polypeptid byl získán PCR metodou (např. patenty US 4 683 195; 4 683 202; a 4 800 159) z plazmidu připraveného podle Di Fiore a kol., (King a kol., Science 229, 974 až 976 (1985); Di Fiore a kol, Science 237, 178 až 182 (1987)) za použití oligonukleotidových primerů, které mají navíc zavedené BssHII restrikční místo a enterokinázové proteázové místo na 5' konci a EcoRI místo na 3' konci. Primer pro 5' konec byl 5-TCTGGCGCGCTGGATGACGATGACAAGAAACGACGGCAGCAGAAGATC-3' (SEQ ED NO: 3), zatímco primer pro 3' konec byl 5-TGAATTCTCGAGTCATTACACTGGCACGTCCAGACCCAG-3' (SEQ ID NO: 4). Vzniklý 1,8 kb PCR fragment byl subklonován do T-vektoru od Novagen (Madison, WI, USA) a sekvence vybraných klonů byla určena na ABI 373 automatizovaném DNA sekvenátoru (Applied Biosystéms lne., Foster City, CA, USA) za použití překrývajících se sekvenčních příměrů. PCR fragmenty, které korespondovaly s publikovanou DNA sekvencí pro lidský HER2/neu cDNA (SEQ ID NO: 1; Coussens a kol., Science 230, 1132 (1985); Yamamoto a kol., Nátuře 319, 230 (1986)) byly potom připojeny v řádném čtecím rámečku přes BssHII místo do modifikované E. coli thioredoxin reduktázy. óXhistidin afínitní smyčka použitá v Ni-NTA afinitní purifikaci exprimovaného fúzního proteinu byla inkorporována do thioredoxin reduktázového fúzního partnera. Tato cDNA pro trxA-lidský HER-2/neu polypeptid fúzní protein byla subklonována do modifikovaného PET expresního vektoru pro expresi v E. coli.
Ačkoliv u thioredoxin reduktézy bylo popsáno, že stabilizuje a solubilizuje jiné heterologní proteiny exprimované v E. coli, nezdá se, že by nabízela jakoukoliv signifikantní výhodu pro expresi lidského HER-2/neu polypeptidu v E. coli. I když signifikantní část trxA-HER-2/neu polypeptid fúzního proteinu byla solubilní většina ho byla exprimována v inkluzních tělískách. Fúzní protein byl také podroben degradaci během exprese v E. coli. Přítomnost thioredoxin reduktázového fúzního partnera však může stabilizovat protein v průběhu purifikace. Dostupnost monoklonálních protilátek k thioredoxin reduktáze poskytuje vhodný markér pro sledování v průběhu purifikace.
Pro purifikaci lidského HER-2/neu polypeptidu s thioredoxin reduktáza fúzním partnerem obsahujícím 6XHis afínitní smyčky byly E. coli pelety resuspendovány s inhibitory proteáz a lysozymem a sonikovány. Inkluzní tělíska byla izolována centrifugací a byla třikrát promyta deoxycholátem, kdy poslední promytí bylo přes noc pro odstranění LPS. Promytá inkluzní tělíska byla solubilizována v GuHCl pro Ni purifikaci. Ni kolona byla eluována imidazolem v močovině a dialyzována proti 10 mM Tris pH 8. Získání HER-2/neu polypeptidu za použití tohoto protokolu bylo od 80 do 95% čistoty kompletního proteinu, kdy hlavním kontaminantem byla degradovaný protein. Z 500 ml fermentace bylo získáno 20 mg produktu, kterým byl > 98 % HER-2/neu polypeptid. Techniky zde použité jsou odborníkovi v oboru dobře známé a byly popsány například v J. Sambrook a kol., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. vydání, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, Cold Spring Harbor, New York, USA.
Příklad 2
Dendritické buňky mohou navodit lidský HER-2/neu polypeptid
A. Generování DC kultur z kostní dřeně
DC kultury byl generovány z CD34+ hematopoetických progenitorových buněk (HPC). CD34+ buňky byly purifíkovány z kostní dřeně normálních dárců za použití buněčného separačního systému Ceprate LC kit (CellPro, Bothell, WA, USA). Čistota získaných CD34+ buněk byla určena
-18CZ 296618 B6 analýzou průtokovou cytometrií 80 až 95 %. CD34+ buňky byly kultivovány v séru prostém médiu (X-VIVO 10, Biowhittaker, lne., Walkersville, MD, USA), doplněném L-glutaminem (584 pg/ml), penicilinem (10 IU/ml), streptomycinem (100 pg/ml) 100 ng/ml lidského rGM-CSF a 50 ng/ml lidského rIL-6 (Immunex, Seattle, WA, USA). Po kultivační době v trvání 0 až 17 dnů byly buňky sklizeny a použity a použity pro fenotypizační testy a pro testy stimulace T buněk. U GM-CSF samotném nebo v kombinaci s IL-4 nebo TNFa bylo popsáno, že indukuje in vitro růst DC. V pokusech za použití KLH a OVA jako antigenů pro nastavení naivních T buněk dávaly GM-CSF plus IL-6 srovnatelnou celkovou stimulaci, ale s nižším pozadí, a proto vyšší stimulační index ve srovnání s GM-CSF plus IL-4 nebo TNFa.
B. Test nastavení T buněk
Z kostní dřeně odvozené CD34+ HPC kultivované v sérum prostém médiu obsahujícím GM-CSF a IL-6 a byly použity jako APC po kultivační periodě 0 až 17 dní. Nastavovací (priming) schopnost DC byla určena jejich kultivací s autologními, naivními T lymfocyty za přítomnosti nebo absence proteinového antigenů, rekombinantního lidského HER-2/neu polypeptidů (hHNF) (10 μg/ml). CD4+ T lymfocyty byly izolovány z mononukleárních buněk periferní krve pozitivní selekcí za použití imunoafínitních kolon (CellPro, lne., Bothell, WA, USA). CD4+ CD45RA+ (naivní) T lymfocyty byly selektovány z CD4+ T lymfocytů za použití anti-CD45A mAb přímo konjugované na FITC (Imunotech, Westbrook, ME, USA) tříděním průtokovou cytometrií. Získané CD4+ CD45RA+ T buňky byly 99% čistoty. DC kultury byly umístěny do 96 jamkových ploten s kulatým dnem (Coming, Coming, NY, USA) v různých koncentracích a byly inkubovány po 16 až 18 hodin s hHNF v konečné koncentraci 10 pg/ml. Antigenem pulzované DC byly ozářeny (10 Gy) a autologní CD4+ CD45RA+ T lymfocyty byly přidány (5 x 104/jamka). Proliferativní odpověď T buněk byla měřena vychytáváním [3H]thymidinu (37 kBq/jamka), který byl přidán v den 6 na 16 až 18 hodin. Proliferační testy byl provedeny v séru prostém a cytokinů prostém médiu. Výsledky jsou ukázány na obrázku 1. Obrázek 2 ukazuje výsledky testování CD4+ T buněk, od normálního dárce, na odpověď na hHNP. Podobná data byla získána s T buňkami od devíti z deseti normálních jedinců.
Příklad 3
Test pro detekci nízké frekvence lymfocytárních prekurzorů
Tři testy byl použity pro detekci CD4+ odpovědí: standardní proliferační test, vyšetřovací metoda pro události s nízkou frekvencí a test limitního ředění (LDA). Běžné proliferační testy jsou schopné snadno detekovat navozené odpovědi. Stimulační index proliferativní odpovědi poskytuje hrubou korelaci s frekvencí prekurzorů antigen reaktivních T buněk. Jakákoliv specifická proliferativní odpověď detekovaná z PBL je považována za navozenou odpověď.
Pro poskytnutí více kvantitativní interpretace odpovědí CD4+ T buněk byl použit testovací systém vyvinutý pro detekci odpovědí lymfocytárních prekurzorů o nízké frekvenci (popsaný dále). Tento test je jednoduchý a finančně výhodný. Za okolností, kdy je potřebné přesnější určení, je frekvence prekurzoru určena testem limitujícího ředění (Bishop and Orosz, Transplantation47, 671 až 677(1989)).
Odpovědi větší, než jsou detekovány u normálních jedinců, jsou definovány jako navozená odpověď a naznačují existující imunity. Nízké odpovědi, detekovatelné pouze LDA podmínkami, jsou považovány za nenavozené odpovědi. Absence odpovědi u LDA nebo odpovědi nižší, než jsou definovány pro normální populaci, jsou považovány za toleranci/energii.
Obecně, navozené odpovědi CD4+ T buněk mohou být detekovány v běžných testech proliferace, zatímco nenavozené odpovědi nejsou těmito testy detekovatelné. Detekce malého množství nena-19CZ 296618 B6 vožených T buněk je omezena matoucím pozadím vychytávání thymidinu, které obsahuje autologní smíšenou lymfocytární odpověď (AMLR) na vlastní MHC antigen plus odpovědi na zpracované proteiny vlastního séra a na exogenní přidané sérové proteiny.
Pro vyvolání a detekování nenavozených T buněk byl použit testovací systém pro odpovědi o nízké frekvenci založený na Poissonově statistice vzorků (v Pinnacles, Chiron Corporation, 1, 1 a 2 (1991)). Tento typ analýzy se specificky používá na jevy nízké frekvence vtom, že pokud je frekvence prekurzoru nižší než počet buněk v replikované kultuře, pak je požadováno mnoho replikátů pro detekování statisticky signifikantního počtu pozitivních. Teoreticky, analýza bude opravena pro autologní odpovědi za zadání známé pozitivní kontroly (jako je PHA nebo tetanický toxoid) a známé negativní kontroly (žádný antigen) a hodnocení všech dat od nejnižších do nejvyšších bez ohledu na experimentální skupiny, ke kterým patří. Hraniční hodnota je vypočítána na základě rovnice = M + (F + SD), kde M = aritmetický průměr, F = 3,29, faktor z tabulek standardizované normální distribuce vybraný tak, aby ne více než 0,1 % „správně negativních“ z normálně distribuovaného pozadí nebylo nad hraniční hodnotou SD = standardní odchylka. V tomto vyšetřovacím testu jsou jamky nad hraniční hodnotou považovány za pravdivě pozitivní v tom, že potenciálně obsahují lymfocyty, které jsou specificky proliferující proti požadovanému antigenu. Ačkoliv hodnocení frekvence prekurzorů lymfocytů je možné za použití této metody, přesné určení vyžaduje formální LDA analýzy.
Příklad 4
Vakcína založená na HER-2/neu polypeptidu zvyšuje imunitu vůči HER-2/neu proteinu.
A. Zvířata
Krysy použité v této studii byly kmeny Fischer 344 (CDF (F-344)/CrlBR) (Charles River Laboratories, Portage, MI, USA). Zvířata byla chována v University of Washington Animal facilities za specifických podmínek bez patogenů a rutinně byla používána pro studie ve věku 3 a 4 měsíce.
B. Imunizace
Krysy kmene Fischer byly imunizovány rekombinantním krysím HER-2/neu polypeptidem (rHNP) v různých adjuvans (MFL, Vaccel; Ribi, Bozeman, MT, USA). Zvířata dostala 50 pg rHNP smíšeného s adjuvans subkutánně. O dvacet dní později byla zvířatům podána dosycovací dávka k druhé imunizaci za podání 50 pg 1 rHNP podaného stejným způsobem. Dvacet dní po dosycovací imunizaci byla zvířata testována na přítomnost protilátek namířených proti krysímu HER-2/neu proteinu (neu).
C. Buněčné linie
Dvě buněčné linie byly použity jako zdroj neu proteinů. SKBR3, lidská buněčná linie rakovinu prsu, která se vyznačuje nadměrnou expresí HER-2/neu (Američan Type Culture Collection Rockville, MD, USA) byla uchovávána v kultuře v 10% fetálním hovězím séru (FBS) (Gemini Bioproducts, lne., Calabasas, CA, USA) a RPMI. DHFR-G8, NIH/3T3 buněčná linie kotransfektovaná s cneu-p a pSV2-DHFR (Američan Type Culture Collection, Rockville, MD, USA) byla použita jako zdroj netransformujícího krysího neu proteinu (Bernards a kol., Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 84, 6854 až 6858 (1987)). Tato buněčná linie byla uchovávána v 10% FBS a Dulbecco~em modifikovaném Eaglově médiu s 4,5 g/1 glukózy. DHFR-G8 buňky byly pasážovány přes stejné médium doplněné 0,3 pM methotrexatem v každé třetí pasáži pro udržení neu transfektantů.
-20CZ 296618 B6
D. Příprava buněčných lyzátů
Lyzáty jako SKBR3, tak DHFR-G8 byly připraveny a použity jako zdroj neu proteinu. Stručně uvedeno, byl připraven pufr pro lýzu, který se skládal z Tris báze, chloridu sodného a Triton-X 5 (1%) pH 7,5. Byly přidány inhibitory proteáz; aprotinin (1 pg/ml), benzamidin (1 mM) a PMSF (1 mM). 1 ml pufru pro lýzu byl použit pro suspendování 107 buněk. Buňky byly vortexovány po dobu 15 sekund každých 10 minut o jednu hodinu, dokud nebyly narušeny. Všechny postupy byly provedeny na ledu v místnosti s teplotou 4 °C. Po narušení byly buňky mikrofugovány při 4 °C po 20 minut. Ze supernatantu byla odstraněna buněčná drť a byl uskladněn v malých 10 alikvotách při -70 °C po použití. Přítomnost lidského a krysího neu v lyzátech byla dokumentována Western blot analýzami.
E. ELISA pro krysí neu protilátkovou odpověď
96 jamkové Immunol 4 plotny (Baxter SP, Redmond, WA, USA: Dynatech Laboratories) byly inkubovány přes noc při 4 °C s krysí neu specifickou monoklonální protilátkou (Oncogene Science), 7.16.4, v koncentraci 10 pg/ml ředěnou v uhličitanovém pufru (ekvimolární koncentrace Na2CO3 a NaHCO3, pH 9,6). Po inkubaci byla všechny jamky blokovány s PBS-1% BSA (sigma Chemicals, St. Louis, MO, USA), 100 pg/jamku po 3 hodiny při teplotě místnosti. Plotna byla 20 promyta PBS-0,5% Tween a lyzáty DHFRG8, myší buněčné linie transfektované krysí neu DNA (Anerican Type Culture Collection, Rockville, MD, USA); zdroj krysího neu proteinu, byly přidány. Plotna byla inkubována přes noc při 4 °C. Plotna byla potom promyta PBS-0,5% Tween a pokusné sérum bylo přidáno v následujících ředěních: 1:25 až 1:200. Sérum bylo ředěno v PBS-1% BSA-1%, FBS-25 pg/ml myší IgG-0,01% NaN3 a potom sériově do PBS-1% BSA.
50 μΐ ředěného séra bylo přidáno na jamku a inkubováno po jednu hodinu při teplotě místnosti.
Každé pokusné sérum bylo přidáno do jamky s krysím neu a do jamky bez krysího neu. Ovčí anti-krysí Ig F (ab')2 křenová peroxidáza (HRP) byly přidány do jamek při ředění 1:5000 v PBS1% BSA a byly inkubovány po 45 minut při teplotě místnosti (Amersham Co., Arlington Heights, IL, USA). Po konečném promytí bylo přidáno TMB (Kirkegaard and perry Laboratories,
Gaithersburg, MD, USA) vývojové reagens. Byla čtena optická densita (OD) barevné reakce při 450 nm. OD každého ředěného séra byla vypočtena jako krysím neu potažených jamek minus OD PBS-1% BSA potažených jamek. Sérum od zvířat imunizovaných samotných adjuvans a zvířat imunizovaných hHNP (cizorodých proteinem) byla také hodnocena obdobným způsobem. Výsledky jsou ukázány na obrázku 3.
F. Testy proliferace T buněk
Pro analýzu specifických odpovědí na HER-2/neu polypeptid: čerstvé buňky sleziny nebo lymfatické uzliny jsou získány mechanickým poškozením a pasáží přes drátěné síto a promytím. 2 x 40 105 buněk sleziny na jamku a 1 x 105 buněk lymfatické uzliny na jamku bylo umístěno na jamkovou mikrotitrační plotny s kulatým dnem (Coming, Coming, NY, USA), s šesti replikáty na pokusnou skupinu. Médium se skládalo z EHAA 120 (Biofluids) s L-glutaminem, penicilin/streptomycinem, 2-merkaptoethanolem a 5% FBS. Buňky byly inkubovány s polypeptidy. Po 4 dnech byly jamky pulzovány 37 kBq [3H]thymidinu po dobu 6 až 8 hodin a čítány. Data 45 jsou vyjádřena jako stimulační index (SI), který je definován jako průměr pokusných jamek dělený průměrem kontrolních jamek (bez antigenů). Pro analýzu specifických odpovědí na HER2/neu protein: čerstvé buňky sleziny nebo lymfatické uzliny jsou kultivovány pro tři in vitro stimulace. V době analýz je 1 x 105 T buněk sleziny nebo lymfatické uzliny umístěno na 96 jamkovou mikrotitrační plotnu, jak je popsáno výše. Buňky jsou inkubovány s 1 pg/ml imunoafinitní 50 kolonou purifikovaného krysího neu (z DHFR-G8 buněk jako zdroje krysího neu). Po 4 dnech byly jamky pulzovány s 37 kBq [3H]thymidinu po dobu 6 až 8 hodin a čítány. Data jsou vyjádřena jako stimulační index, který je definován jako průměr pokusných jamek dělený průměrem kontrolních jamek (bez antigenů).
-21 CZ 296618 B6
Příklad 5
Navozená odpověď k lidskému HER-2/neu polypeptidu může být detekována a u pacientů s rakovinou prsu.
Heparinizovaná krev byla získána od pacientů se stadiem II rakoviny prsu s nadměrnou expresí HER~2/neu. Mononukleární buňky periferní krve (PBMC) byly separovány Ficoll Hypaque centrifugací podle density. PBMC byly umístěny v koncentraci 2 x 105/jamka na 96 jamkovou mikrotitrační plotnu s kulatým dnem (Coming, Corning, NY, USA). Pro každou pokusnou skupinu bylo provedeno 24 replikátů jamek. Antigeny skládající se z HER-2/neu odvozených peptidů (15 až 20 aminokyselin délky s uvedeným číslem první aminokyseliny v sekvenci) 25 pg/ml, lidský HER-2/neu polypeptid (hHNP) 1 pg/ml, tetanický toxoid 1 pg/ml a p30 peptid odvozený od tetanu 25 pg/ml, byly přidány do každé z replikovatelných 24 jamek. Test byl proveden v médiu obsahujícím 10% lidské sérum. Proliferativní odpověď T buněk byla měřena vychytáváním [3H]thymydinu (37 kBq/jamku) přidaným v den 4 na dobu 10 hodin. Pozitivní jamky, antigen reaktivní jamky, byly skórovány jako pozitivní, pokud bylo cpm vyšší než průměr a 3 standardní odchylky jamek bez antigenu. Výsledky jsou ukázány na obrázku 4. Tito pacienti se II. stadiem rakoviny prsu mají signifikantní odpověď na rekombinantní hHNP.
Z předešlého popisu je jasné, že ačkoliv specifická provedení vynálezu zde byla popsána za účelem ilustrace, mohou být provedeny různé modifikace bez narušené smyslu a rozsahu vynález.
Seznam sekvencí (1) Obecná informace:
(i) Přihlašovatel: University of Washington (ii) Název vynálezu: Sloučeniny pro vyvolání nebo posílení imunitní reaktivity k HER2/neu proteinu pro prevenci nebo léčbu malignit, se kterými je HER-2/neu onkogen asociován (iii) Počet sekvencí: 4 (iv) Adresa pro korespondenci (A) Adresa: Seed and Berry LLP (B) Ulice: 6300 Columbia Center. 701 Fifth Avenue (C) Město: Seattle (D) Stát: Washington (E) Země: USA (F) PSČ: 98104-7092 (v) Počítačová čtecí forma:
(A) Typ média: Floppy disk (B) Počítač: IBM PC kompatibilní (C) operační systém: PC-DOS/MS-DOS (D) Software: Patentln Release #1.0, verse #1.30
-22CZ 296618 B6 (vi) Údaje o současné přihlášce:
(A) Číslo přihlášky:
(B) Datum podání: 28.3. 1996 (C) Klasifikace:
(viíi) Zástupce/agent informace (A) Jméno: Sharkey, Richard G.
(B) Registrační číslo: 32.629 (C) Reference/číslo rejstříku: 920010.448PC (ix) Telekomunikační informace:
(A) Telefon: (206) 622-4900 (B) Telefax: (206) 682-6031 (2) Informace pro SEQ ID NO: 1:
(i) Charakteristiky sekvence:
(A) Délka: 334 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ix) Vlastnosti:
(A) Jméno/klíč CDS (B) Umístění: 1...3765
-23 CZ 296618 B6 (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 1:
ATG Met 1 GAG CTG GCG GCC TTG TGC CGC TGG GGG CTC CTC CTC GCC CTC Leu 15 TTG Leu 48
Glu Leu Ala Ala 5 Leu Cys Arg Trp Gly 10 Leu Leu Leu Ala
CCC CCC GGA GCC GCG AGC ACC CAA GTG TGC ACC GGC ACA GAC ATG AAG 96
Pro Pro Gly Ala Ala Ser Thr Gin Val Cys Thr Gly Thr Asp Met Lys
20 25 30
CTG CGG CTC CCT GCC AGT CCC GAG ACC CAC CTG GAC ATG CTC CGC CAC 144
Leu Arg Leu Pro Ala Ser Pro Glu Thr His Leu Asp Met Leu Arg His
35 40 45
CTC TAC CAG GGC TGC CAG GTG GTG CAG GGA AAC CTG GAA CTC ACC TAC 192
Leu Tyr Gin Gly Cys Gin Val Val Gin Gly Asn Leu Glu Leu Thr Tyr
50 55 60
CTG CCC ACC AAT GCC AGC CTG TCC TTC CTG CAG GAT ATC CAG GAG GTG 240
Leu Pro Thr Asn Ala Ser Leu Ser Phe Leu Gin Asp Ile Gin Glu Val
65 70 75 80
CAG GGC TAC GTG CTC ATC GCT CAC AAC CAA GTG AGG CAG GTC CCA CTG 288
Gin Gly Tyr Val Leu Ile Ala His Asn Gin Val Arg Gin Val Pro Leu
85 90 95
CAG AGG CTG CGG Απ GTG CGA GGC ACC CAG CTC TTT GAG GAC .AAC TAT 336
Gin Arg Leu Arg Ile Val Arg Gly Thr Gin Leu Phe Glu Asp Asn Tyr
100 105 110
GCC CTG GCC GTG CTA GAC AAT GGA GAC CCG CTG AAC AAT ACC ACC CCT 384
Ala Leu Ala Val Leu Asp Asn Gly Asp Pro Leu Asn Asn Thr Thr Pro
-24CZ 296618 B6
115 120 125
GTC ACA GGG GCC TCC CCA GGA GGC CTG CGG GAG CTG CAG CK CGA AGC 432
Val Thr Gly Ala Ser Pro Gly Gly Leu Arg Glu Leu Gin Leu Arg Ser
130 135 140
CTC ACA GAG ATC TTG AAA GGA GGG GTC KG ATC CAG CGG AAC CCC CAG 480
Leu Thr Glu Ile Leu Lys Gly Gly Val Leu Ile· Gin Arg Asn Pro Gin
145 150 155 160
CTC TGC TAC CAG GAC ACG ATT KG TGG AAG GAC ATC KC CAC AAG AAC 528
Leu Cys Tyr Gin Asp Thr Ile Leu Trp Lys Asp Ile Phe His Lys Asn
165 170 175
AAC CAG CTG GCT CTC ACA CTG ATA GAC ACC AAC CGC TCT CGG GCC TGC 576
Asn Gin Leu AI a Leu Thr Leu Ile Asp Thr Asn Arg Ser Arg Ala Cys
180 185 190
CAC CCC TGT TCT CCG ATG TGT AAG GGC TCC CGC TGC TGG GGA GAG AGT 624
His Pro Cys Ser Pro Met Cys Lys Gly Ser Arg Cys Trp Gly Glu Ser
195 200 205
TCT GAG GAT TGT CAG AGC CTG ACG CGC ACT GTC TGT GCC GGT GGC TGT 672
Ser Glu Asp Cys Gin Ser Leu Thr Arg Thr Val Cys Ala Gly Gly Cys
210 215 220
GCC CGC TGC AAG GGG CCA C i G CCC ACT GAC TGC TGC CAT GAG CAG TGT 720
Ala Arg Cys Lys Gly Pro Leu Pro Thr Asp Cys Cys His Glu Gin Cys
225 230 235 240
GCT GCC GGC TGC ACG GGC C-CC AAG CAC TCT GAC TGC CTG GCC TGC CTC 768
Ala Ala Gly Cys Thr Gly Pro Lys His Ser Asp Cys Leu Ala Cys Leu
245 250 255
CAC TTC AAC CAC AGT GGC ATC TGT GAG CTG CAC i GC CCA GCC CTG GTC 816
His Phe Asn His Ser Gly Ile Cys Glu Leu His Cys Pro A1 a Leu Val
260 265 270
ACC TAC AAC ACA GAC ACG TTT GAG TCC ATG CCC AAT CCC GAG GGC CGG 864
Thr Tyr Asn Thr Asp Thr Phe Glu Ser Met Pro Asn Pro Glu Gly Arg
275 280 285
TAT ACA TTC GGo GCC AGC TGT GTG ACT GCC TGT CCC TAC AAC TAC CK 912
Tyr Thr Phe Gly Ala Ser Cys Val Thr Ala Cys Pro Tyr Asn Tyr Leu
290 295 300
-25 CZ 296618 B6
TCT ACG GAC GTG GGA TCC TGC ACC CTC GTC TGC CCC CTG CAC AAC CAA 960
Ser Thr Asp Val Gly Ser Cys Thr Leu Val Cys Pro Leu His Asn Gin
305 310 315 320
GAG GTG ACA GCA GAG GAT GGA ACA CAG uGG TGT GAG AAG TGC AGC AAG 1008
Glu Val Thr Ala Glu Asp Gly Thr Gin Arg Cys Glu Lys Cys Ser Lys
325 330 335
CCC TGT GCC CGA GTG TGC TAT GGT CTG GGC ATG GAG CAC πβ CGA GAG 1056
Pro Cys Ala Arg Val Cys Tyr Gly Leu Gly Met Glu His Leu Arg Glu
340 345 350
GTG AGG GCA GTT ACC AGT GCC AAT ATC CAG GAG TTT GCT GGC TGC AAG 1104
Val Arg Ala Vel Thr Ser Ala Asn Ile Gin Glu Phe Ala Gly Cys Lys
355 360 365
AAG ATC TTT GGG AGC CTG GCA TTT CTG CCG GAG AGC τπ GAT GGG GAC 1152
Lys Ile Phe Gly Ser Leu Ala Phe Leu Pro Glu Ser Phe Asp Gly Asp
37 c 375 380
CCA GCC TCC AAC ACT GCC CCG CTC CAG CCA GAG CAG CTC CAA gtg πτ 1200
Pro Ala Ser Asn Thr Ala Pro Leu Gin Pro Glu Gin Leu Gin Val Phe
335 390 395 400
GAG ACT CTG GAA GAG ATC ACA GGT TAC CTA TAC ATC TCA GCA TGG CCG 1248
Glu Thr Leu Glu Glu Ile Thr Gly Tyr Leu Tyr Ile Ser Ala Trp Pro
405 410 415
GAC AGC CTG CCT GAC CTC AGC GTC TTC CAG AAC CTG CAA GTA ATC CGG· 1295
Asp Ser Leu Pro Asp Leu Ser Val Pne Gin Asn Leu Gin Val Ile Arg
420 425 430
GGA CGA ATT CTG CAC AAT GGC GCC TAC TCG CTG ACC CTG CAA GGG CTG 1344
Gly Arq Ile Leu His Asn Gly Ala Tyr Ser Leu Thr Leu Gin Gly Leu
435 440 445
GGC ATC AGC TGG CTG GGG CTG CGC TCA CTG AGG GAA CTG GGC AGT GGA 1392
Gly Ile Ser Trp Leu Gly Leu Arg Ser Leu Arg Glu Leu Gly Ser Gly
450 455 ' 460
CTG GCC CTC ATC CAC CAT AAC ACC CAC CTC TGC TTC GTu CAC ACG GTG 1440
Leu Ala Leu Ile His His Asn Thr His Leu Cys Phe Val His Thr Val
465 470 475 480
-26CZ 296618 B6
CCC TGG GAC CAG CTC TTT CGG AAC CCG CAC CAA GCT CTG CTC CAC ACT 1488
Pro Trp Asp G1 n Leu Phe Arg. Asn Pro His Gin Ala Leu Leu His Thr
485 490 495
GCC AAC CGG CCA GAG GAC GAG TGT GTG GGC GAG GGC CTG GCC TGC CAC 1536
Ala Asn Arg Pro Glu Asp Glu Cys Val Gly Glu Gly Leu Ala Cys His
500 505 510
CAG CTG TGC GCC CGA GGG CAC TGC TGG GGT CCA GGG CCC ACC CAG TGT 1584
Gin Leu Cys Ala Arg Gly His Cys Trp Gly Pro Gly Pro Thr Gin Cys
515 520 525
GTC AAC TGC AGC CAG TTC CK CGG GGC CAG GAG TGC GTG GAG GAA TGC 1632
Val Asn Cys Ser Gin Phe Leu Arg Gly Gin Glu Cys Val Glu Glu Cys
530 535 540
CGA GTA CTG CAG GGG CTC CCC AGG GAG TAT GTG AAT GCC AGG CAC TGT 1680
Arg Val Leu Gin Gly Leu Pro Arg Glu Tyr Val Asn Ala Arg His Cys
545 550 555 560
KG CCG TGC CAC CCT GAG TGT CAG CCC CAG AAT GGC TCA GTG ACC TGT 1728
Leu Pro Cys His Pro Glu Cys Gin Pro Gin Asn Gly Ser Val Thr Cys
565 570 575
TTT GGA CCG GAG GCT GAC CAG TGT GTG GCC TGT GCC CAC TAT AAG GAC 1776
Phe Gly Pro Glu Ala Asp Gin Cys Val Ala Cys Ala His Tyr Lys Asp
580 585 590
CCT CCC TTC TGC GTG GCC CGC TGC CCC AGC GGT GTG AAA CCT GAC CTC 1824
Pro Pro Phe Cys Val Ala Arg Cys Pro Ser Gly Val Lys Pro Asp Leu
595 600 605
TCC TAC ATG CCC ATC TGG AAG TTT CCA GAT GAG GAG GGC GCA TGC CAG 1872
Ser Tyr Met Pro Ile Trp Lys Phe Pro Asp Glu Glu Gly Ala Cys Gin
610 615 620
CCT TGC CCC ATC AAC TGC ACC CAC TCC TGT GTG GAC CTG GAT GAC AAG 1920
Pro Cys Pro Ile Asn Cys Thr His Ser Cys Val Asp Leu Asp Asp Lys
625 630 635 640
GGC TGC CCC GCC GAG CAG AGA GCC AGC CCT ‘ CTG ACG TCC ATC ATC TCT 1968
Gly Cys Pro Ala Glu Gin Arg Ala Ser Prc > Leu Thr Ser Ile Ile Ser
645 650 655
GC3 GTG GTT □□u AT CTG CTG ; gtc GTG I GTC KG GGG GTG ; gtc : TK GGG 2016
-27CZ 296618 B6
Ala Val Val Gly Ile Leu Leu VrJ Val Val Leu Gly Val Val Phe Gly
660 665 670
ATC CTC ATC AAG CGA CGG CAG CAG AAG ATC CGG AAG TAC ACG ATG CGG 2064
Ile Leu Ile Lys Arg Arg Gin Gin Lys Ile Arg Lys Tyr Thr Met Arg
675 680 685
AGA CTG CTG CAG GAA ACG GAG CTG GTG GAG CCG CTG ACA CCT AGC GGA 2112
Arg Leu Leu Gin Glu Thr Glu Leu Val Glu Pro Leu Thr Pro Ser Gly
590 695 700
GCG ATG CCC AAC CAG GCG CAG ATG CGG ATC CTG AAÁ GAG ACG GAG CTG 2160
Ala Met Pro Asn Gin Ala Gin Met Arg Ile Leu Lys Glu Thr Glu Leu
705 710 715 720
AGG AAG GTG AAG GTG cn GGA TCT GGC GCT nr GGC ACA GTC TAC AAG 2208
Arg Lys Val Lys Val Leu Gly Ser Gly Ala Phe Gly Thr Val Tyr Lys
725 730 735
GGC ATC TGG ATC CCT GAT GGG GAG AAT GTG AAA ATT CCA GTG GCC ATC 2255
Gly Ile Trp Ile Pro Asp Gly Glu Asn Val Lys Ile Pro Val Ala Ile
740 745 750
AAA GTG HG AGG GAA AAC ACA TCC CCC AAA GCC AAC AAA GAA ATC TTA 2304
Lys Val Leu Arg Glu Asn Thr Ser Pro Lys Ala Asn Lys Glu Ile Leu
755 760 765
GAC GAA GCA TAC GTG ATG GCT GGT GTG GGC TCC CCA TAT GTC TCC CGC 2352
Asp Glu Ala Tyr Val Met Ala Gly Val Gly Ser Pro Tyr Val Ser Arg
770 775 780
cn CTG GGC ATC TGC CTG ACA TCC ACG GTG CAG CTG GTG ACA CAG cn 2400
Leu Leu Gly Ile Cys Leu Thr Ser Thr Val Gin Leu Val Thr Gin Leu
785 790 795 800
ATG CCC TAT GGC TGC CTC ΠΑ GAC CAT GTC CGG G.AA AAC CGC GGA CGC 2448
Met Pro Tyr Gly Cys Leu Leu Asp His Val Arg Glu Asn Arg Gly Arg
805 810 815
CTG GGC TCC CAG GAC CTG CTG AAC TGG TGT ATG CAG AK GCC AAG GGG 2496
Leu Gly Ser Gin Asp Leu Leu Asn TrD Cys Met Gin Ile Ala Lys Gly
820 825 830
ATG AGC TAC CTG GAG GAT GTG CGG CTC GTA . CAC AGG GAC ne GCC GCT 2544
Met Ser Tvr Leu Glu Asp 1 Arg Leu Val His Arg Asp i Leu Al a Ala
-28CZ 296618 B6
835 840 845
CGG AAC GTG CTG GTC AAG AGT CCC AAC CAT GTC AAA ATT ACA GAC ne 2592
Arg Asn Val Leu Val Lys Ser Pro Asn His Val Lys Ile Thr Asp Phe
850 855 860
GGG CTG GCT CGG CTG CTG GAC ATT GAC GAG ACA GAG TAC CAT GCA GAT 2640
Gly Leu Ala Arg Leu Leu Asp Ile Asp Glu Thr Glu Tyr His Ala Asp
865 870 875 880
GGG GGC AAG GTG CCC ATC AAG TGG ATG GCG CTG GAG TCC Απ CTC CGC 2688
Gly Gly Lys Val Pro Ile Lys Trp Met Ala Leu Glu Ser Ile Leu Arg
885 890 895
CGG CGG TTC ACC CAC CAG AGT GAT GTG TGG AGT TAT GGT GTG ACT GTG 2736
Arg Arg Phe Thr His Gin Ser Asp Val Trp Ser Tyr Gly Val Thr Val
900 905 910
TGG GAG CTG ATG ACT πτ GGG GCC AAA CCT TAC GAT GGG ATC CCA GCC 2784
Trp Glu Leu Met Thr Phe Gly Ala Lys Pro Tyr Asp Gly Ile Pro Ala
915 920 925
CGG GAG ATC CCT GAC CTG CTG GAA AAG GGG GAG CGG CTG CCC CAG CCC 2832
Arg Glu Ile Pro Asp Leu Leu Glu Lys Gly Glu Arg Leu Pro Gin Pro
930 935 940
CCC ATC TGC ACC ATT GAT GTC TAC ATG ATC ATG GTC AAA TGT TGG ATG 2880
Pro Ile Cys Thr Ile Asp Val Tyr Met Ile Met Val Lys Cys Trp Met
945 950 955 960
ATT GAC TCT GAA TGT CGG CCA AGA ne CGG GAG KG GTG TCT GAA KC 2928
Ile Asp Ser Glu Cys Arg Pro Arg Phe Arg Glu Leu Val Ser Glu Phe
965 970 975
TCC CGC ATG GCC AGG' GAC CCC CAG CGC πτ GTG GTC ATC CAG AAT GAG 2976
Ser Arg Met Ala Arg Asp Pro Gin Arg Phe Val Val Ile Gin Asn Glu
980 985 990
GAC TTG GGC CCA GCC AGT CCC TTG GAC AGC ACC nc TAC CGC TCA CTG 3024
Asp Leu Gly Pro Ala Ser Pro Leu Asp Ser Thr Phe Tyr Arg Ser Leu
995 100 0 100 5
CTG GAG GAC GAT GAC ATG GGG GAC CTG GTG GAT GCT GAG GAG TAT CTG 3072
Leu Glu Asp Asp Asp Met Gly Asp Leu Val Asp Ala Glu Glu Tyr Leu
101 c 101 102 0
-29CZ 296618 B6
GTA CCC CAG CAG GGC TTC TTC TGT CCA GAC CCT GCC CCG GGC GCT GGG 3120
Val Pro Gin Gin Gly Phe Phe Cys Pro Asp Pro Ala Pro Gly Ala Gly
1025 1030 1035 1040
GGC ATG GTC CAC CAC AGG CAC CGC AGC TCA TCT ACC AGG AGT GGC GGT 3168
Gly Met Val His His Arg His Arg Ser Ser Ser Thr Arg Ser Gly Gly
1045 1050 1055
GGG GAC CTG ACA CTA GGG CTG GAG CCC TCT GAA GAG GAG GCC CCC AGG 3216
Gly Asp Leu Thr Leu Gly Leu Glu Pro Ser Glu Glu Glu Ala Pro Arg
1060 1065 1070
TCT CCA CTG GCA CCC TCC GAA GGG GCT GGC TCC GAT GTA TTT GAT GGT 3264
Ser Pro Leu Ala Pro Ser Glu Gly Ala Gly Ser Asp Val Phe Asp Gly
1075 1080 1085
GAC CTG GGA ATG GGG GCA GCC AAG GGG CTG CAA AGC CTC CCC ACA CAT 3312
Asp Leu Gly Met Gly Ala A i a Lys Gly Leu Gin Ser Leu Pro Thr His
1090 1095 1100
GAC CCC AGC CCT CTA CAG CGG TAC AGT GAG GAC CCC ACA GTA CCC CTG 3360
Asp Pro Ser Pro Leu Gin Arg Tyr Ser Glu Asp Pro Thr Val Pro Leu
1105 1110 1115 1120
CCC TCT GAG ACT GAT GGC TAC GCT prr ggL CCC CTG ACC TGC AGC CCC CAG 3408
Pro Ser Glu Thr Asp Gly Tyr Val Ala Pro Leu Thr Cys Ser Pro Gin
1125 1130 1135
CCT G.AA TAT GTG AAC CAG CCA GAT GCT CGG CCC CAG CCC CCT TCG CCC 3456
Pro Glu Tyr Val Asn Gin Pro Asp Val Arg Pro Gin Pro Pro Ser Pro
1140 1145 1150
CGA GAG GGC CCT CTG CCT GCT GuC CGA CCT GCT GGT GCC ACT CTG GAA 3504
Arg Glu Gly Pro Leu Pro Ala Ala Arg Pro Ala Gly Ala Thr Leu Glu
115; 116! 116! 3
AGG CCC AAG ACT CTC TCC CCA Ubd AAG AAT GGG GTC GTC AAA GAC GCT 3552
Arg Pro Lys Thr Leu Ser Pro Gly Lys Asn Gly Val Val Lys Asp Val
1171 j 1171 5 118 0
τπ GCC πτ GGG GGT GCC GTG GAG AAC CCC GAG TAC CTG ACA CCC CAG 3600
Phe Ala Phe Gly Gly Ala Val Glu Asn Pro Glu Tyr Leu Thr Pro Gin
1181 1190 119: 5 1200
-30CZ 296618 B6
GGA GGA GCT GCC CCT CAG CCC CAC CCT CCT CCT GCC TTC AGC CCA GCC 3648
Gly Gly Ala Ala Pro Gin Pro His Pro Pro Pro Ala Phe Ser Pro Ala
1205 1210 1215
TTC GAC .AAC CTC TAT TAC TGG GAC CAG GAC CCA CCA GAG CGG GGG GCT 3696
Phe Asp Asn Leu Tyr Tyr Trp Asp Gin Asp Pro Pro Glu Arq Gly Ala
1220 1225 1230
CCA CCC AGC ACC TTC .AAA GGG ACA CCT ACG GCA GAG AAC CCA GAG TAC 3744
Pro Pro Ser Thr Phe Lys Gly Thr Pro Thr Ala Glu Asn Pro Glu Tyr
1235 1240 1245
CTG GGT CTG GAC GTG CCA GTG TGA 3768
Leu Gly Leu Asp Val Pro Val 1250 1255
(2) Informace pro SEQ ID NO: 2:
(i) Charakteristiky sekvence:
(A) Délka: 1255 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina ío (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: protein (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 2:
Met Glu Leu Ala Ala Leu Cys Arg Trp Gly Leu Leu Leu Ala Leu Leu
1 5 10 15
Pro Pro Gly Ala Ala Ser Thr Gin Val Cys Thr Gly Thr Asp Met Lys
20 25 30
Leu Arg Leu Pro Ala Ser Pro Glu Thr His Leu Asp Met Leu Arg His
35 40 45
Leu Tyr Gin Gly Cys Gin Val Val Gin Gly Asn Leu Glu Leu Thr Tyr
50 55 60
Leu Pro Thr Asn Ala Ser Leu Sér Phe Leu Gin Asp Ile Gin Glu Val
65 70 75 80
Gin Gly Tyr* Val l?Lí Ile Ala Hi s ASP Gin Val Arg Gin Val Pro Leu
CÍL 93 OA
-31 CZ 296618 B6
Gin Arg Leu Arg Ile Val Arg Gly Thr Gin Leu Phe Glu Asp Asn Tyr
100 105 110
Ala Leu Ala Val Leu Asp Asn Gly Asp Pro Leu Asn Asn Thr Thr Pro
115 120 125
Val Thr Gly Ala Ser Pro Gly Gly Leu Arg Glu Leu Gin Leu Arg Ser
130 135 140
Leu Thr Glu Ile Leu Lys Gly Gly Vál Leu Ile Gin Arg Asn Pro Gin
145 150 155 160
Leu Cys Tyr Gin Asp Thr Ile Leu Trp Lys Asp Ile Phe His Lys Asn
165 170 175
Asn Gin Leu Ala Leu Thr Leu Ile Asp Thr Asn Arg Ser Arg Ala Cys
180 185 190
His Pro Cys Ser Pro Met Cys Lys Gly Ser Arg Cys Trp Gly Glu Ser
195 200 205
Ser Glu Asp Cys Gin Ser Leu Thr Arg Thr Val Cys Ala Gly Gly Cys
210 215 220
Al a Arg Cys Lys Gly Pro Leu Pro Thr Asp Cys Cys His Glu Gin Cys
225 230 235 240
Ala Ala Gly Cys Thr Gly Pro Lys His Ser Asp Cys Leu Ala Cys Leu
245 250 255
His Phe Asn His Ser Gly Ile Cys Glu Leu His Cys Pro Ala Leu Val
260 265 270
Thr Tyr Asn Thr Asp Thr Pne Glu Ser Met Pro Asn Pro Glu Gly Arg
275 280 285
Tyr Thr Phe Gly Ala Ser Cys Val Thr Ala Cys Pro Tyr Asn Tyr Leu
290 295 300
Ser Thr Asp Val Gly Ser Cys Thr Leu Val Cys Pro Leu His Asn Gin
305 310 315 320
Glu Val Thr Ala Glu Asp G ly Thr Gin Arg Cys Glu ; Lys Cys ; Ser Lys
325 330 335
-32CZ 296618 B6
Pro Cys Ala Arg Val Cys Tyr Gly Leu Gly Met Glu His Leu Arg Glu
340 345 350
Val Arg Ala Val Thr Ser Ala Asn Ile Gin Glu Phe Ala Gly Cys Lys
355 360 365
Lys Ile Phe Gly Ser Leu Ala Phe Leu Pro Glu Ser Phe Asp Gly Asp
370 375 380
Pro Ala Ser Asn Thr Ala Pro Leu Gin Pro Glu Gin Leu Gin Val Phe
385 390 395 400
Glu Thr Leu Glu Glu Ile Thr Gly Tyr Leu Tyr Ile Ser Al a Trp Pro
405 410 415
Asp Ser Leu Pro Asp Leu Ser Val Phe Gin Asn Leu Gin Val Ile Arg
420 425 430
Gly Arg Ile Leu His Asn Gly Ala Tyr Ser Leu Thr Leu Gin Gly Leu
435 440 445
Gly ile Ser Trp Leu Gly Leu Arg Ser Leu Arg Glu Leu Gly Ser Gly
450 455 460
Leu Ala Leu Ile His His Asn Thr His Leu Cys Phe Val Hi s Thr Val
465 470 475 480
Pro Trp Asp Gin Leu Phe Arg Asn Pro His Gin Ala Leu Leu His Thr
485 490 495
Ala Asn Arg Pro Glu Asp Glu Cys Val Gly Glu Gly Leu Al a Cys His
500 505 510
Gin Leu Cys Ala Arg Gly Hi s Cys Trp Gly Pro Gly Pro Thr Gin Cys
515 520 525
Val Asn Cys Ser Gin Phe Leu Arg Gly Gin Glu Cys Val Glu Glu Cys
530 535 540
Arg Val Leu Gin Gly Leu •Pro Arg Glu Tyr Val Asn Ala Arg His Cys
545 550 555 560
Leu Pro Cys His Pro Glu Cys Gin Pro Gin Asn Gly Ser Val Thr Cys
565 570 575
-33CZ 296618 B6
Phe Gly Pro Glu Ala Asp Gin Cys Val Ala Cys Al a His Tyr Lys Asp
580 585 590
Pro Pro Phe Cys Val Ala Arg Cys Pro Ser Gly Val Lys Pro Asp Leu
595 600 605
Ser Tyr Met Pro Ile Trp Lys Phe Pro Asp Glu Glu Gly Ala Cys Gin
610 615 620
Pro Cys Pro Ile Asn Cys Thr His Ser Cys Val Asp Leu Asp Asp Lys
625 630 635 640
Gly Cys Pro Ala Glu Gin Arg Ala Ser Pro Leu Thr Ser Ile Ile Ser
645 650 655
Ala Val Val Gly Ile Leu Leu Val Val Val Leu Gly Val Val Phe Gly
660 665 670
Ile Leu Ile Lys Arg Arg Gin Gin Lys Ile Arg Lys Tyr Thr Met Arg
675 680 685
Arg Leu Leu Gin Glu Thr Glu Leu Val Glu Pro Leu Thr Pro Ser Gly
690 695 700
Ala Met Pro Asn Gin Ala Gin Met Arg Ile Leu Lys Glu Thr Glu Leu
705 710 715 720
Arg Lys Val Lys V 6 í Leu Gly Ser Gly Ala Phe Gly Thr Val Tyr Lys
725 730 735
Gly Ile Trp Ile Pro Asp Gly Glu Asn Val Lys Ile Pro Val Ala Ile
740 745 750
Lys Val Leu Arg Glu Asn Thr Ser Pro Lys Ala Asn Lys Glu Ile Leu
755 760 765
Asp Glu Ala Ty- Val Met Ala Gly Val Gly Ser Pro Tyr Val Ser Arg
770 775 780
Leu Leu Gly ile Cys Leu Thr Ser Thr Val Gin Leu Val Thr Gin Leu
785 790 795 300
Met Pro Tyr Gly Cys Leu Leu Asp His Val Arg Glu Asn Arg Gly Arg
805 810 815 1
-34CZ 296618 B6
Leu Gly Ser Gin Asp Leu Leu Asn Trp Cys Met Gin Ile Ala Lys Gly
820 825 830
Met Ser Tyr Leu Glu Asp Val Arg Leu Val His Arg Asp Leu Ala Ala
835 840 845
Arg Asn Val Leu Val Lys Ser Pro Asn His Val Lys Ile Thr Asp Phe
850 855 860
Gly Leu Ala Arg Leu Leu Asp Ile Asp Glu Thr Glu Tyr Hi s Al a Asp
865 870 875 880
Gly Gly Lys Val Pro Ile Lys Trp Met Ala Leu Glu Ser Ile Leu Arg
885 890 895
Arg Arg Phe Thr His Gin Ser Asp Val Trp Ser Tyr Gly Val Thr Val
900 905 910
Trp Glu Leu Met Thr Phe Gly Ala Lys Pro Tyr Asp Gly Ile Pro Al a
915 $20 925
Arg G1 u Ile Pro Asp Leu Leu Glu Lys Gly Glu Arg Leu Pro Gin Pro
930 935 940
Pro Ile Cys Thr Ile ASO Val Tyr Met Ile Met Val Lys Cys Trp Met
945 950 955 960
Ile Asp Ser Glu Cys Arg Pro Arg Phe Arg Glu Leu Val Ser Glu Phe
965 970 975
Ser Arg Met Ala Arg Asp Pro Gin Arg Phe Val Val Ile Gin Asn Glu
980 985 990
Asp Leu Gly Pro Ala Ser Pro Leu Asp Ser Thr Phe Tyr Arg Ser Leu
995 100 0 1005
Leu Glu Asp Asp Asp Met Gly Aso Leu Val Asp Ala Glu Glu Tyr Leu
101 0 101 5 102 0
Val Pro Gin Gin Gly Phe Phe Cys Pro Asp Pro . Ala Pro Gly Ala Gly
102 5 103 0 103 5 1040
Gly Met Val His His Arg His Arg Ser Ser Ser Thr Arg Ser Gly Gly
1045 1050 1055
-35CZ 296618 B6
Gly Asp Leu Thr Leu Gly Leu Glu Pro Ser Glu Glu Glu Ala Pro Arg
1060 1065 1070
Ser Pro Leu Ala Pro Ser Glu Gly Ala Gly Ser Asp Val Phe Asp Gly
1075 1080 1085
Asp Leu Gly Met Gly Ala Ala Lys Gly Leu Gin Ser Leu Pro Thr His
1090 1095 1100
Asp Pro Ser Pro Leu Gin Arg Tyr Ser Glu Asp Pro Thr Val Pro Leu
1105 1110 1115 1120
Pro Ser Glu Thr Asp Gly Tyr Val Ala Pro Leu Thr Cys Ser Pro Gin
1125 1130 1135
Pro Glu Tyr Val Asn Gin Pro Asp V a i Arg Pro Gin Pro Pro Ser Pro
1140 1145 1150
Arg Glu Gly Pro Leu Prc Ala Ala Arg Pro Ala Gly Ala Thr Leu Glu
1155 1160 1165
Arg Pro Lys Thr Leu Ser Pro Gly Lys Asn Gly Val Val Lys Asp Val
1170 1175 1181 1
Phe Ala Phe Gly Gly Ala Val Glu Asn Pro Glu Tyr Leu Thr Pro Gin
113: 5 1191 3 119: 5 1200
Gly Gly Ala Al a Pro Gin Pro His Pro Pro Pro Ala Phe Ser Pro Ala
120: 5 121· 0 121!
Phe Asp Asn Leu Tyr Tyr Trp Asp Gin Asp Pro Pro Glu Arg Gly Ala
122' 0 122. 5 123 0
Pro Pro Ser Thr Phe Lys Gly Thr Pro Thr Ala Glu Asn Pro Glu Tyr
1235 1240 1245
Leu Gly Leu Asp Val Pro Val
1250 1255
-36CZ 296618 B6 (2) Informace pro SEQ ID NO: 3:
(i) Charakteristiky sekvence:
(A) Délka: 48 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 3:
TCTGGCGCGC TGGATGACGA TGACAAGAAA CGACGGCAGC AGAAGATC 48 (2) Informace pro SEQ ID NO: 4:
(i) Charakteristiky sekvence:
(A) Délka: 39 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 4:
TGAATTCTCG AGTCATTACA CTGGCACGTC CAGACCCAG 39
PATENTOVÉ NÁROKY

Claims (34)

1. Farmaceutická kompozice pro vyvolání nebo zvýšení imunitní odpovědi na HER-2/neu protein u teplokrevných živočichů, vyznačující se tím, že obsahuje farmaceuticky přijatelný nosič nebo ředidlo v kombinaci s polypeptidem kódovaným DNA sekvencí vybranou z
a) nukleotidů 2026 až 3765 SEQ ID NO: 1 a
b) DNA sekvencí, které hybridizují na nukleotidovou sekvenci komplementární k nukleotidům 2026 až 3765 SEQ ID NO: 1 za středně přísných podmínek, kde DNA sekvence kóduje polypeptid, který produkuje imunitní odpověď na HER-2/neu protein, a kde hybridizační podmínky zahrnují předpromytí v roztoku 5 x SSC, 0,5 % SDS, 1,0 mM EDTA, pH 8,0, hybridizaci při 50 až 65 °C, 5 x SSC, přes noc a potom následuje dvojnásobné promytí při 65 °C po 20 minut každým z 2 x, 0,5 x 0,2 x SSC s obsahem 0,1 % SDS, nebo s molekulou nukleové kyseliny nebo virovým vektorem řídicím expresi výše uvedeného polypeptidů kódovaného DNA sekvencí vybranou ze sekvencí podle bodu a) a b) a popřípadě dále obsahuje adjuvans.
-37CZ 296618 B6
2. Polypeptidová kompozice pro vyvolání nebo zvýšení imunitní odpovědi na HER-2/neu protein u teplokrevných živočichů, vyznačující se tím, že obsahuje polypeptid, který je kódován DNA sekvencí vybranou z
a) nukleotidů 2026 až 3765 SEQ ID NO: 1 a
b) DNA sekvencí, které hybridizují na nukleotidovou sekvenci komplementární k nukleotidům 2026 až 3765 SEQ ID NO: 1 za středně přísných podmínek, kde DNA sekvence kóduje polypeptid, který produkuje imunitní odpověď na HER-2/neu protein, a kde hybridizační podmínky zahrnují předpromytí v roztoku 5 x SSC, 0,5 % SDS, 1,0 mM EDTA, pH 8,0, hybridizaci při 50 až 65 °C, 5 x SSC, přes noc a potom následuje dvojnásobné promytí při 65 °C po 20 minut každým z 2 x, 0,5 x a 0,2 x SSC s obsahem 0,1 % SDS, a kde polypeptidová kompozice obsahuje adjuvans.
3. Polypeptidová kompozice podle nároku 2, vyznačující se tím, že polypeptid má aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 2 od lysinu, aminokyseliny 676, až do valinu, aminokyseliny 1255, nebo její variantu, která produkuje alespoň ekvivalentní imunitní odpověď.
4. Polypeptidová kompozice podle nároku 3, vy z n a č uj í c í se tím, že polypeptid má aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 2 a od aminokyseliny 676 až do aminokyseliny 1255.
5. Polypeptidová kompozice podle některé z nároků 2 až 4, v y z n a č u j í c í se tím, že je v kombinaci s farmaceuticky přijatelným nosičem nebo ředidlem.
6. Polypeptidová kompozice podle některého z nároků 2 až 5 pro imunizaci teplokrevného živočicha proti malignitám, se kterými je asociován HER-2/neu onkogen.
7. Použití polypeptidové kompozice podle některého z nároků 2 až 5 pro výrobu léčiva pro imunizaci teplokrevného živočicha proti malignitám, se kterými je asociován HER-2/neu onkogen.
8. Polypeptidová kompozice podle některé z nároků 3 až 5 pro vyvolání nebo zvýšení imunitní odpovědi na HER-2/neu protein.
9. Použití polypeptidové kompozice podle některého z nároků 2 až 5 pro výrobu léčiva pro vyvolání nebo zvýšení imunitní odpovědi na HER-2/neu protein.
10. Farmaceutická kompozice podle nároku 1, vyznačující se tím, že polypeptid je vázán na druhý polypeptid nebo peptid mající imunogenní vlastnosti.
11. Polypeptidová kompozice podle některého z nároků 2 až 6, v y z n a č u j í c í se tím, že polypeptid je vázán na druhý polypeptid nebo peptid mající imunogenní vlastnosti.
12. Kompozice podle nároku 3 nebo 4, vyznačující se tím, že polypeptid je zkrácen a produkuje imunitní odpověď na HER-2/neu protein.
13. Kompozice podle nároku 12, vy z n a č u j í c í se t í m , že polypeptid je vázán na druhý polypeptid nebo peptid mající imunogenní vlastnosti.
-38CZ 296618 B6
14. Molekula nukleové kyseliny pro vyvolání nebo zvýšení imunitní odpovědi na HER-2/neu protein u teplokrevných živočichů, která řídí expresi polypeptidu kódovaného DNA sekvencí, která je vybrána z
a) nukleotidů 2026 až 3765 SEQ ID NO: 1 a
b) DNA sekvencí, které hybridizují na nukleotidovou sekvenci komplementární k nukleotidům 2026 až 3765 se 3765 SEQ ID NO: 1 za středně přísných podmínek,kde DNA sekvence kóduje polypeptid, který produkuje imunitní odpověď na HER-2/neu protein, kde hybridizační podmínky zahrnují předpromytí v roztoku 5 x SSC, 0,5 % SDS, 1,0 mM EDTA, pH 8,0, hybridizaci při 50 až 65 °C, 5 x SSC, přes noc a potom následuje dvojnásobné promytí při 65 °C po 20 minut každým z 2 x, 0,5 x a 0,2 x SSC s obsahem 0,1 % SDS.
15. Molekula nukleové kyseliny podle nároku 14, kde polypeptid má aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 2 od lysinu, aminokyseliny 676, až do valinu, aminokyseliny 1255, nebo její variantu, která produkuje alespoň ekvivalentní imunitní odpověď.
16. Molekula nukleové kyseliny podle nároku 15, kde polypeptid má aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 2 od lysinu, aminokyseliny 676 až do valinu, aminokyseliny 1255.
17. Molekula nukleové kyseliny podle některého z nároků 14 až 16, kde polypeptid je vázán na druhý polypeptid nebo peptid mající imunogenní vlastnosti.
18. Molekula nukleové kyseliny podle nároku 15 nebo 16, kde polypeptid je zkrácen a produkuje imunitní odpověď na HER-2/neu protein.
19. Molekula nukleové kyseliny podle nároku 18, kde polypeptid je vázán na druhý polypeptid nebo peptid mající imunogenní vlastnosti.
20. Molekula nukleové kyseliny podle některého z nároků 14 až 19, pro použití pro způsob transfekce buněk teplokrevného živočicha pro léčení malignity spojené s HER-2/neu onkogenem.
21. Molekula nukleové kyseliny podle některého z nároků 14 až 20, kde molekula nukleové kyseliny je v kombinaci s adjuvans.
22. Použití molekuly nukleové kyseliny podle některého z nároků 14 až 19 pro výrobu léčiva pro vyvolání nebo zvýšení imunitní odpovědi na HER-2/neu protein.
23. Použití molekuly nukleové kyseliny podle nároku 22, kde molekula nukleové kyseliny je v kombinaci s adjuvans.
24. Virový vektor pro vyvolání nebo zvýšení imunitní odpovědi na HER-2/nebu protein u teplokrevných živočichů, kde virový vektor se zaměřuje na expresi kódovaného polypeptidu, kódovaného DNA sekvencí vybranou z
a) nukleotidů 2026 až 3765 SEQ ID NO: 1 a
b) DNA sekvencí, které hybridizují na nukleotidovou sekvenci komplementární k nukleotidům 2026 až 3765 SEQ ID NO: 1 za středně přísných podmínek, kde DNA sekvence kóduje polypeptid, který produkuje imunitní odpověď na HER-2/neu protein,
-39CZ 296618 B6 kde hybridizační podmínky zahrnují předpromytí v roztoku 5 x SSC, 0,5 % SDS, 1,0 mM EDTA, pH 8,0, hybridizaci při 50 až 65 °C, 5 x SSC, přes noc a potom následuje dvojnásobné promytí při 65 °C po 20 minut každým z 2 x, 0,5 x a 0,2 x SSC s obsahem 0,1 % SDS.
25. Virový vektor podle nároku 24, kde kódovaný polypeptid má aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 2 od lysinu, aminokyseliny 676, až do valinu, aminokyseliny 1255, nebo její variantu, která produkuje alespoň ekvivalentní imunitní odpověď.
26. Virový vektor podle nároku 25, kde kódovaný polyleptid má aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 2 od lysinu, aminokyseliny 676, až do valinu, aminokyseliny 1255.
27. Virový vektor podle některého z nároků 24 až 26, kde polypeptid je vázán na druhý polypeptid nebo peptid mající imunogenní vlastnosti.
28. Virový vektor podle nároku 25 nebo 26, kde polypeptid je zkrácen a produkuje imunitní odpověď na HER-2/neu protein.
29. Virový vektor podle nároku 28, kde polypeptid je vázán na druhý polypeptid nebo peptid mající imunogenní vlastnosti.
30. Virový vektor podle některého z nároků 24 až 29, pro použití pro způsob infikování buněk teplokrevných živočichů pro léčení malignit spojených sHER-2/neu onkogenem.
31. Virový vektor podle některého z nároků 24 až 30, kde virový vektor je v kombinaci s adjuvans.
32. Použití virového vektoru podle některého z nároků 24 až 29 pro výrobu léčiva pro vyvolání nebo zvýšení imunitní odpovědi na HER-2/neu protein.
33. Použití virového vektoru podle nároku 32, kde virový vektor je vkombinaci s adjuvans.
34. Farmaceutický prostředek podle nároku 1 nebo 10, vyznačující se tím, že obsahuje adjuvans.
CZ20040789A 1995-03-31 1996-03-28 Farmaceutická nebo polypeptidová kompozice, molekula nukleové kyseliny, virový vektor a lécivo pro imunizaci proti malignitám CZ296618B6 (cs)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US08/414,417 US5801005A (en) 1993-03-17 1995-03-31 Immune reactivity to HER-2/neu protein for diagnosis of malignancies in which the HER-2/neu oncogene is associated

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CZ296618B6 true CZ296618B6 (cs) 2006-05-17

Family

ID=23641368

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ0309697A CZ296617B6 (cs) 1995-03-31 1996-03-28 Farmaceutická kompozice, molekula nukleové kyseliny, virový vektor a jejich pouzití a pouzití polypeptidu
CZ20040789A CZ296618B6 (cs) 1995-03-31 1996-03-28 Farmaceutická nebo polypeptidová kompozice, molekula nukleové kyseliny, virový vektor a lécivo pro imunizaci proti malignitám

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ0309697A CZ296617B6 (cs) 1995-03-31 1996-03-28 Farmaceutická kompozice, molekula nukleové kyseliny, virový vektor a jejich pouzití a pouzití polypeptidu

Country Status (19)

Country Link
US (9) US5801005A (cs)
EP (2) EP1418235A3 (cs)
JP (2) JP4510147B2 (cs)
KR (1) KR100554186B1 (cs)
CN (3) CN1597953A (cs)
AT (1) ATE299180T1 (cs)
AU (1) AU708237B2 (cs)
BR (1) BR9607889A (cs)
CA (1) CA2216601C (cs)
CZ (2) CZ296617B6 (cs)
DE (1) DE69634912T2 (cs)
DK (1) DK0817846T3 (cs)
ES (1) ES2245783T3 (cs)
HU (1) HUP9801826A3 (cs)
NO (2) NO321941B1 (cs)
NZ (1) NZ306616A (cs)
PT (1) PT817846E (cs)
RU (2) RU2236461C2 (cs)
WO (1) WO1996030514A1 (cs)

Families Citing this family (336)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7252829B1 (en) * 1998-06-17 2007-08-07 Idm Pharma, Inc. HLA binding peptides and their uses
AU712441B2 (en) * 1994-12-14 1999-11-04 Scripps Research Institute, The In vivo activation of tumor-specific cytotoxic T cells
US6514942B1 (en) * 1995-03-14 2003-02-04 The Board Of Regents, The University Of Texas System Methods and compositions for stimulating T-lymphocytes
US6685940B2 (en) 1995-07-27 2004-02-03 Genentech, Inc. Protein formulation
US6267958B1 (en) 1995-07-27 2001-07-31 Genentech, Inc. Protein formulation
US8038994B2 (en) 1996-05-15 2011-10-18 Quest Pharmatech Inc. Combination therapy for treating disease
US20080220012A1 (en) * 1996-05-15 2008-09-11 Ragupathy Madiyalakan Therapeutic Compositions that alter the immune response
ATE233102T1 (de) * 1996-05-15 2003-03-15 Altarex Inc Verfahren und zusammensetzung zur umgestaltung multi-epitopischer antigene um die immunantwort einzuleiten
US7371376B1 (en) * 1996-10-18 2008-05-13 Genentech, Inc. Anti-ErbB2 antibodies
AU6020998A (en) 1997-01-08 1998-08-03 Life Technologies, Inc. Methods for production of proteins
US6884435B1 (en) * 1997-01-30 2005-04-26 Chiron Corporation Microparticles with adsorbent surfaces, methods of making same, and uses thereof
DK0991403T3 (da) * 1997-01-30 2003-07-28 Chiron Corp Anvendelse af mikropartikler med adsorberet antigen til stimulering af immunresponser
US20040202680A1 (en) * 1997-01-30 2004-10-14 O'hagan Derek Microparticles with adsorbent surfaces, methods of making same, and uses thereof
ZA9811162B (en) 1997-12-12 2000-06-07 Genentech Inc Treatment with anti-ERBB2 antibodies.
JP2002514573A (ja) * 1998-05-08 2002-05-21 スローン − ケッタリング インスティチュート フォー キャンサー リサーチ 能動的なワクチン接種のための組成物および方法
GB9810040D0 (en) 1998-05-11 1998-07-08 Univ Nottingham Blood borne tumour markers
MY136203A (en) * 1998-08-11 2008-08-29 Idec Pharma Corp Combination therapies for b-cell lymphomas comprising administration of anti-cd20 antibody
US6573043B1 (en) * 1998-10-07 2003-06-03 Genentech, Inc. Tissue analysis and kits therefor
CA2350064C (en) * 1998-11-09 2012-05-08 Idec Pharmaceuticals Corporation Chimeric anti-cd20 antibody treatment of patients receiving bmt or pbsc transplants
EP1616572B1 (en) * 1998-11-09 2010-09-01 Biogen Idec Inc. Chimeric anti-CD20 antibody, rituxan, for use in the treatment of chronic lymphocytic leukemia
US6541214B1 (en) * 1998-11-13 2003-04-01 Oregon Heath Science University N-terminally truncated HER-2/neu protein as a cancer prognostic indicator
GB9827228D0 (en) 1998-12-10 1999-02-03 Univ Nottingham Cancer detection method and reagents
US7396810B1 (en) 2000-08-14 2008-07-08 Oregon Health Sciences University Compositions and methods for treating cancer by modulating HER-2 and EGF receptors
US7625859B1 (en) 2000-02-16 2009-12-01 Oregon Health & Science University HER-2 binding antagonists
US7393823B1 (en) 1999-01-20 2008-07-01 Oregon Health And Science University HER-2 binding antagonists
ATE425749T1 (de) 1999-01-27 2009-04-15 Cornell Res Foundation Inc Behandlung von mit her-2/neu-uberexprimierung einhergehendem krebs
MXPA01007721A (es) * 1999-01-29 2003-07-14 Corixa Corp Proteinas de fusion her-2/neu.
US7198920B1 (en) 1999-01-29 2007-04-03 Corika Corporation HER-2/neu fusion proteins
AU3755800A (en) * 1999-03-15 2000-10-04 Introgen Therapeutics, Inc. Dendritic cells transduced with a wild-type self gene elicit potent antitumor immune responses
EP1754488A1 (en) 1999-05-24 2007-02-21 Introgen Therapeutics, Inc. Methods and compositions for non-viral gene therapy for treatment of hyperproliferative diseases
EP1187849A1 (en) * 1999-05-25 2002-03-20 Human Genome Sciences, Inc. Meth1 and meth2 polynucleotides and polypeptides
CA2383493C (en) * 1999-06-25 2010-08-10 Genentech, Inc. Treating prostate cancer with anti-erbb2 antibodies
US20030086924A1 (en) * 1999-06-25 2003-05-08 Genentech, Inc. Treatment with anti-ErbB2 antibodies
US6949245B1 (en) * 1999-06-25 2005-09-27 Genentech, Inc. Humanized anti-ErbB2 antibodies and treatment with anti-ErbB2 antibodies
US7041292B1 (en) 1999-06-25 2006-05-09 Genentech, Inc. Treating prostate cancer with anti-ErbB2 antibodies
US20040013667A1 (en) * 1999-06-25 2004-01-22 Genentech, Inc. Treatment with anti-ErbB2 antibodies
WO2001008636A2 (en) * 1999-08-03 2001-02-08 The Ohio State University Polypeptides and polynucleotides for enhancing immune reactivity to her-2 protein
US8557244B1 (en) 1999-08-11 2013-10-15 Biogen Idec Inc. Treatment of aggressive non-Hodgkins lymphoma with anti-CD20 antibody
DE60042693D1 (de) * 1999-08-27 2009-09-17 Genentech Inc Dosierung für die behandlung mit anti erbb2-antikörpern
US20030157119A1 (en) * 1999-09-22 2003-08-21 Corixa Corporation Methods for diagnosis and therapy of hematological and virus-associated malignancies
AU7710300A (en) * 1999-09-22 2001-04-24 Corixa Corporation Methods for diagnosis and therapy of hematological and virus-associated malignancies
US7378096B2 (en) 1999-09-30 2008-05-27 Health Research, Inc. Stress protein compositions and methods for prevention and treatment of cancer and infectious disease
JP2003510334A (ja) * 1999-09-30 2003-03-18 コリクサ コーポレイション 癌及び感染症の予防及び治療のためのストレスタンパク質組成物及び方法
FR2801106B1 (fr) * 1999-11-12 2007-10-05 Commissariat Energie Atomique Procede de diagnostic d'une esst provoquee par une souche d'atnc dans un echantillon biologique et son utilisation dans le diagnostic differentiel des differentes souches d'atnc
CA2393738A1 (en) * 1999-12-10 2001-06-14 Epimmune Inc. Inducing cellular immune responses to her2/neu using peptide and nucleic acid compositions
WO2001048205A2 (en) * 1999-12-29 2001-07-05 Corixa Corporation Murine neu sequences and methods of use therefor
CA2398102A1 (en) * 2000-01-21 2001-07-26 Corixa Corporation Compounds and methods for prevention and treatment of her-2/neu associated malignancies
US6528060B1 (en) * 2000-03-16 2003-03-04 Genzyme Corporation Therapeutic compounds
EP1272633B1 (en) * 2000-03-30 2011-04-27 Dendreon Corporation Compositions and methods for dendritic cell-based immunotherapy
WO2001078766A1 (de) * 2000-04-13 2001-10-25 Bio Life Science Forschungs Und Entwicklungsgesellschaft Mbh Vakzine gegen krebserkrankungen, die sich auf mimotope von auf tumorzellen exprimierte antigenen stützt
EP1280923A2 (en) * 2000-04-28 2003-02-05 Millennium Pharmaceuticals, Inc. 14094, a human trypsin family member and uses thereof
JP2003534292A (ja) * 2000-05-19 2003-11-18 ジェネンテック・インコーポレーテッド Ｅｒｂｂアンタゴニスト癌治療に対する有効な応答の可能性を向上させるための遺伝子検出アッセイ
US10293056B1 (en) 2000-05-24 2019-05-21 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods and compositions for non-viral gene therapy for treatment of hyperproliferative diseases
US20030232399A1 (en) * 2000-06-14 2003-12-18 Robertson John Forsyth Russell Cancer detection methods and reagents
FR2812087B1 (fr) * 2000-07-21 2007-05-11 Inst Nat Sante Rech Med Procede de criblage de peptides utilisables en immunotherapie
US7229623B1 (en) 2000-08-03 2007-06-12 Corixa Corporation Her-2/neu fusion proteins
AU2001283360A1 (en) * 2000-08-14 2002-02-25 Corixa Corporation Methods for diagnosis and therapy of hematological and virus-associated malignancies
US20020193329A1 (en) * 2000-08-14 2002-12-19 Corixa Corporation Compositions and methods for the therapy and diagnosis of Her-2/neu-associated malignancies
PT1889630E (pt) 2000-10-18 2012-02-29 Glaxosmithkline Biolog Sa Vacinas compreendendo o antigénio mage ligado a um fragmento da proteína d
CA2429769C (en) * 2000-12-07 2016-04-26 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods of treatment involving human mda-7
US20040121946A9 (en) * 2000-12-11 2004-06-24 John Fikes Inducing cellular immune responses to her2/neu using peptide and nucleic acid compositions
US7906492B2 (en) * 2001-01-16 2011-03-15 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Therapy-enhancing glucan
US7507724B2 (en) * 2001-01-16 2009-03-24 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Therapy-enhancing glucan
US20040071671A1 (en) * 2001-02-20 2004-04-15 Leturcq Didier J. Cell therapy method for the treatment of tumors
EA013944B1 (ru) * 2001-02-20 2010-08-30 Орто-Макнейл Фармасьютикал, Инк. Способ получения неприродной антигенпрезентирующей клеточной линии и применение линии для лечения опухолей
EP1236740B1 (de) * 2001-02-28 2012-07-18 Bio Life Science Forschungs- und Entwicklungsges.m.b.H. Vakzine gegen Krebserkrankungen, die mit dem HER-2/neu Onkogen assoziiert sind
US7547759B2 (en) 2001-03-09 2009-06-16 Board Of Regents, The University Of Texas System Induction of tumor immunity by variants of folate binding protein
GB0109297D0 (en) 2001-04-12 2001-05-30 Glaxosmithkline Biolog Sa Vaccine
EP2305299B1 (en) 2001-05-31 2017-03-01 GlaxoSmithKline Biologicals SA Chimeric alphavirus replicon particles
ATE345812T1 (de) * 2001-09-03 2006-12-15 Bio Life Science Forschungs & Entwicklungsgesellschaft Mbh Antigen-mimotope und vakzine gegen krebserkrankungen
EP2131198B1 (en) 2001-09-20 2013-03-27 Board of Regents, The University of Texas System Measuring circulating therapeutic antibody, antigen and antigen/antibody complexes using ELISA assays
US20040009939A1 (en) * 2002-03-05 2004-01-15 Board Of Regent, The University Of Texas System Methods of enhancing immune induction involving MDA-7
EP1482963A4 (en) * 2002-03-08 2010-06-09 Univ Texas CONTROLLED MODULATION OF LATERAL CHAIN LENGTH OF AMINO ACIDS OF ANTIGENS PEPTIDES
US20050260208A1 (en) * 2002-04-11 2005-11-24 Altarex Medical Corp. Binding agents and their use in targeting tumor cells
US20050276812A1 (en) 2004-06-01 2005-12-15 Genentech, Inc. Antibody-drug conjugates and methods
US20040132097A1 (en) * 2002-06-19 2004-07-08 Bacus Sarah S. Method for predicting response to epidermal growth factor receptor-directed therapy
US20090110702A1 (en) 2002-07-12 2009-04-30 The Johns Hopkins University Mesothelin Vaccines and Model Systems and Control of Tumors
EP1575500A4 (en) 2002-07-12 2007-01-03 Univ Johns Hopkins MESOTHELIN VACCINE AND MODEL SYSTEMS
US9200036B2 (en) 2002-07-12 2015-12-01 The Johns Hopkins University Mesothelin vaccines and model systems
EP2269619A1 (en) 2002-08-12 2011-01-05 Jennerex Biotherapeutics ULC Methods and compositions concerning poxviruses and cancer
US20080019992A1 (en) * 2002-09-02 2008-01-24 Christoph Zielinski Antigen mimotopes and vaccine against cancerous diseases
CN1497255A (zh) * 2002-10-02 2004-05-19 ���µ�����ҵ��ʽ���� 被检测体用取样元件、被检测体处理装置及其处理方法
AU2003267077A1 (en) * 2002-11-12 2004-06-03 Millipore Corporation Evaporation control device for multiwell plates
GB2395270B (en) * 2002-11-14 2006-08-16 Univ Nottingham Tumour marker proteins and uses thereof
JP2006516117A (ja) * 2002-11-21 2006-06-22 ジェネンテック・インコーポレーテッド 抗ＥｒｂＢ２抗体を用いた非悪性疾病または疾患の治療
AU2003294023B2 (en) 2003-01-03 2008-01-31 Istituto Di Ricerche Di Biologia Molecolare P. Angeletti Spa Rhesus HER2/neu, nucleotides encoding same, and uses thereof
CA2514058C (en) * 2003-01-24 2014-05-13 Agensys, Inc. Nucleic acids and corresponding proteins entitled 254p1d6b useful in treatment and detection of cancer
CA2518150C (en) * 2003-03-03 2015-08-11 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods and compositions involving mda-7
CA2522812C (en) 2003-04-18 2012-08-21 Idm Pharma, Inc. Hla-a2 tumor associated antigen peptides and compositions
US20050239088A1 (en) * 2003-05-16 2005-10-27 Shepard H M Intron fusion proteins, and methods of identifying and using same
US7178491B2 (en) * 2003-06-05 2007-02-20 Caterpillar Inc Control system and method for engine valve actuator
ATE546153T1 (de) * 2003-06-17 2012-03-15 Mannkind Corp Kombinationen von tumor-assoziierten antigenen zur behandlung von verschiedenen krebstypen
CA2532460C (en) * 2003-07-21 2012-04-24 Istituto Di Ricerche Di Biologia Molecolare P. Angeletti S.P.A. Synthetic gene encoding human epidermal growth factor 2/neu antigen and uses thereof
GB0321615D0 (en) 2003-09-15 2003-10-15 Glaxo Group Ltd Improvements in vaccination
AU2004285477A1 (en) 2003-10-22 2005-05-12 Fred Hutchinson Cancer Research Center Methods, compositions and devices for inducing stasis in tissues and organs
BR122018071968B8 (pt) 2003-11-06 2021-07-27 Seattle Genetics Inc conjugado de anticorpo-droga, composição farmacêutica, artigo de manufatura e uso de um conjugado de anticorpo-droga
US8034790B2 (en) * 2003-12-01 2011-10-11 Introgen Therapeutics Use of MDA-7 to inhibit pathogenic infectious organisms
US20070281041A1 (en) * 2004-03-02 2007-12-06 Introgen Therapeutics, Inc. Compositions and Methods Involving MDA-7 for the Treatment of Cancer
JP2008506366A (ja) * 2004-05-14 2008-03-06 レセプター バイオロジックス インコーポレイテッド 細胞表面受容体アイソフォームならびにその同定および使用方法
EP2471924A1 (en) 2004-05-28 2012-07-04 Asuragen, INC. Methods and compositions involving microRNA
JP2008504292A (ja) 2004-06-24 2008-02-14 ノバルティス ヴァクシンズ アンド ダイアグノスティクス， インコーポレイテッド 免疫増強用の化合物
EP1768662A2 (en) 2004-06-24 2007-04-04 Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. Small molecule immunopotentiators and assays for their detection
US20100111856A1 (en) 2004-09-23 2010-05-06 Herman Gill Zirconium-radiolabeled, cysteine engineered antibody conjugates
NZ580115A (en) 2004-09-23 2010-10-29 Genentech Inc Cysteine engineered antibody light chains and conjugates
WO2006042002A2 (en) * 2004-10-05 2006-04-20 Oregon Health And Science University Compositions and methods for treating disease
MX2007004079A (es) * 2004-10-06 2007-06-15 Wellstat Biologics Corp Detecci??n de niveles elevados de prote??na her-2/neu en celulas cancerosas circulantes y tratamiento.
EP2302055B1 (en) 2004-11-12 2014-08-27 Asuragen, Inc. Methods and compositions involving miRNA and miRNA inhibitor molecules
US20060115862A1 (en) * 2004-11-17 2006-06-01 Duke University Anti-tenascin monoclonal antibody immunoassays and diagnostic kits
CN100381460C (zh) * 2004-11-30 2008-04-16 北京市肿瘤防治研究所 Her-2模拟抗原表位及含有该表位的肽
AU2005321904B2 (en) * 2004-12-29 2012-07-12 Mannkind Corporation Methods to elicit, enhance and sustain immune responses against MHC class I-restricted epitopes, for prophylactic or therapeutic purposes
CA2597329C (en) * 2005-02-08 2016-10-11 Board Of Regents, The University Of Texas System Compositions and methods involving mda-7 for the treatment of cancer
AU2006236150A1 (en) * 2005-04-20 2006-10-26 Fred Hutchinson Cancer Research Center Methods, compositions and articles of manufacture for enhancing survivability of cells, tissues, organs, and organisms
CN100398558C (zh) * 2005-05-10 2008-07-02 中国人民解放军军事医学科学院基础医学研究所 HER2/neu与Herstatin相互作用的活性片段及其编码基因与应用
WO2006124700A2 (en) * 2005-05-12 2006-11-23 Introgen Therapeutics, Inc. P53 vaccines for the treatment of cancers
US20090170769A1 (en) * 2005-05-13 2009-07-02 Pei Jin Cell surface receptor isoforms and methods of identifying and using the same
SI1889059T1 (sl) 2005-05-27 2009-12-31 Oncimmune Ltd Izboljšani imunotestni postopek
GB2426581A (en) * 2005-05-27 2006-11-29 Univ Nottingham Immunoassay methods
CA2612394C (en) * 2005-06-15 2017-02-21 The Ohio State University Research Foundation Her-2 peptides
JP5416968B2 (ja) 2005-06-17 2014-02-12 マンカインド コーポレイション 癌細胞及び腫瘍間質上に発現される優勢及び亜優勢エピトープに対する多価免疫応答を誘発するための方法及び組成物
GB0512751D0 (en) * 2005-06-22 2005-07-27 Glaxo Group Ltd New adjuvant
US8980246B2 (en) 2005-09-07 2015-03-17 Sillajen Biotherapeutics, Inc. Oncolytic vaccinia virus cancer therapy
CA2662798A1 (en) * 2005-09-07 2007-03-15 Receptor Logic, Ltd. Antibodies as t cell receptor mimics, methods of production and uses thereof
CA2621982C (en) * 2005-09-07 2017-11-28 Jennerex Biotherapeutics Ulc Systemic treatment of metastatic and/or systemically-disseminated cancers using gm-csf-expressing poxviruses
US8945573B2 (en) 2005-09-08 2015-02-03 The Henry M. Jackson Foundation For The Advancement Of Military Medicine, Inc. Targeted identification of immunogenic peptides
JP5424640B2 (ja) * 2005-09-08 2014-02-26 ザ ヘンリー エム．ジャクソン ファウンデイション フォー ザ アドバンスメント オブ ミリタリー メディスン，インコーポレイティド 免疫源性ペプチドの標的特異的同定方法
JP2009511636A (ja) 2005-10-18 2009-03-19 ノバルティス ヴァクシンズ アンド ダイアグノスティクス， インコーポレイテッド アルファウイルスレプリコン粒子による粘膜免疫および全身免疫
TWI457133B (zh) 2005-12-13 2014-10-21 Glaxosmithkline Biolog Sa 新穎組合物
US20090053221A1 (en) * 2006-01-17 2009-02-26 Cheung Nai-Kong V Immune response enhancing glucan
US8323644B2 (en) * 2006-01-17 2012-12-04 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Therapy-enhancing glucan
WO2007084661A2 (en) * 2006-01-17 2007-07-26 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Therapy-enhancing glucan
WO2007092944A2 (en) * 2006-02-08 2007-08-16 Introgen Therapeutics, Inc. Compositions and methods involving gene therapy and proteasome modulation
CA2647100A1 (en) * 2006-03-23 2007-09-27 Novartis Ag Methods for the preparation of imidazole-containing compounds
CA2646539A1 (en) * 2006-03-23 2007-09-27 Novartis Ag Imidazoquinoxaline compounds as immunomodulators
US8063063B2 (en) * 2006-03-23 2011-11-22 Novartis Ag Immunopotentiating compounds
US7517270B2 (en) * 2006-05-30 2009-04-14 Minds-I, Inc. Construction system
WO2008042495A2 (en) 2006-07-21 2008-04-10 Life Technologies Corporation Sharply resolving labeled protein molecular weight standards
US7972602B2 (en) * 2006-08-11 2011-07-05 Dendreon Corporation Promiscuous HER-2/Neu CD4 T cell epitopes
CN101632020B (zh) 2006-09-13 2013-11-27 昂西免疫有限公司 改进的免疫测定方法
CN102026645B (zh) 2006-09-15 2016-01-27 渥太华医院研究机构 溶瘤弹状病毒
AU2007299748A1 (en) 2006-09-19 2008-03-27 Asuragen, Inc. miR-15, miR-26, miR -31,miR -145, miR-147, miR-188, miR-215, miR-216 miR-331, mmu-miR-292-3p regulated genes and pathways as targets for therapeutic intervention
US20080075528A1 (en) * 2006-09-22 2008-03-27 Michael Marzetta Construction system
EP2084267B1 (en) * 2006-09-26 2018-04-11 Cedars-Sinai Medical Center Cancer stem cell antigen vaccines and methods
US8097256B2 (en) 2006-09-28 2012-01-17 Cedars-Sinai Medical Center Cancer vaccines and vaccination methods
US20080131878A1 (en) * 2006-12-05 2008-06-05 Asuragen, Inc. Compositions and Methods for the Detection of Small RNA
AU2007333106A1 (en) * 2006-12-08 2008-06-19 Asuragen, Inc. miR-20 regulated genes and pathways as targets for therapeutic intervention
US7935350B2 (en) * 2006-12-14 2011-05-03 Antigen Express, Inc. Ii-key/Her-2/neu hybrid cancer vaccine
US8889143B2 (en) 2006-12-14 2014-11-18 Antigen Express, Inc. Ii-key/HER-2/neu hybrid cancer vaccine
US7410225B1 (en) * 2007-03-14 2008-08-12 Minds-I, Inc. Multi-part links for endless track
KR20080084528A (ko) * 2007-03-15 2008-09-19 제네렉스 바이오테라퓨틱스 인크. 종양살상형 백시니아 바이러스 암 치료
JP2010525326A (ja) * 2007-04-19 2010-07-22 ウェルスタット バイオロジックス コーポレイション 分離されていない循環癌細胞由来のＨｅｒ−２／ｎｅｕタンパク質の上昇したレベルの検出および治療
MX2009012858A (es) 2007-06-01 2010-02-03 Jackson H M Found Military Med Vacuna para la prevencion de recaidas de cancer de seno.
US20090017716A1 (en) * 2007-07-11 2009-01-15 Michael Marzetta Construction system
US20090061456A1 (en) * 2007-08-30 2009-03-05 Allard William J Method for predicting progression free and overall survival at each follow-up time point during therapy of metastatic breast cancer patients using circulating tumor cells
EP2198050A1 (en) 2007-09-14 2010-06-23 Asuragen, INC. Micrornas differentially expressed in cervical cancer and uses thereof
US20090117532A1 (en) * 2007-11-01 2009-05-07 Doyle Gerald V Pre-clinical method for monitoring serial changes in circulating breast cancer cells in mice
WO2009059450A1 (en) * 2007-11-05 2009-05-14 Shanghai Jiaotong University Peptide ligand directed drug delivery
US7841923B2 (en) * 2007-11-13 2010-11-30 Minds-I, Inc. Vehicle axle joint for a toy vehicle
CA2706442C (en) * 2007-11-27 2017-07-11 Veridex, Llc Automated enumeration and characterization of circulating melanoma cells in blood
WO2009070805A2 (en) 2007-12-01 2009-06-04 Asuragen, Inc. Mir-124 regulated genes and pathways as targets for therapeutic intervention
US20090191535A1 (en) * 2007-12-22 2009-07-30 Mark Carle Connelly Method of assessing metastatic carcinomas from circulating endothelial cells and disseminated tumor cells
GB0725239D0 (en) * 2007-12-24 2008-02-06 Oncimmune Ltd Calibrator for autoantibody assay
US8258111B2 (en) 2008-05-08 2012-09-04 The Johns Hopkins University Compositions and methods related to miRNA modulation of neovascularization or angiogenesis
JP2010006705A (ja) * 2008-06-13 2010-01-14 Atlas Antibodies Ab Ｈｅｒ２サブセット
US9068020B2 (en) * 2008-09-02 2015-06-30 Cedars-Sinai Medical Center CD133 epitopes
WO2010068647A1 (en) 2008-12-10 2010-06-17 The Henry M. Jackson Foundation For The Advancement Of Military Medicine, Inc. Vaccine for the prevention of breast cancer recurrence
US20100234283A1 (en) 2009-02-04 2010-09-16 The Ohio State University Research Foundation Immunogenic epitopes, peptidomimetics, and anti-peptide antibodies, and methods of their use
US20110045080A1 (en) * 2009-03-24 2011-02-24 William Marsh Rice University Single-Walled Carbon Nanotube/Bioactive Substance Complexes and Methods Related Thereto
CA2761777A1 (en) * 2009-05-14 2010-11-18 Prometheus Laboratories Inc. Biomarkers for determining sensitivity of breast cancer cells to her2-targeted therapy
US20110065643A1 (en) 2009-06-12 2011-03-17 University Of Southern California Clusterin Pharmaceuticals and Treatment Methods Using the Same
AU2010292172A1 (en) 2009-09-09 2012-05-03 Centrose, Llc Extracellular targeted drug conjugates
ES2848650T3 (es) 2009-09-14 2021-08-11 Sillajen Biotherapeutics Inc Terapia combinada contra el cáncer con virus vaccinia oncolítico
AU2010329551B2 (en) 2009-12-10 2016-02-11 Turnstone Limited Partnership Oncolytic rhabdovirus
WO2011107100A1 (en) 2010-03-03 2011-09-09 Aarhus Universitet Methods and compositions for regulation of herv4
PE20130342A1 (es) 2010-04-15 2013-04-20 Spirogen Sarl Pirrolobenzodiacepinas y conjugados de las mismas
CN102933267B (zh) 2010-05-28 2015-05-27 泰特里斯在线公司 交互式混合异步计算机游戏基础结构
CA2798837A1 (en) 2010-06-07 2011-12-15 Pfizer Inc. Her-2 peptides and vaccines
CN114246952A (zh) 2010-06-08 2022-03-29 基因泰克公司 半胱氨酸改造的抗体和偶联物
JP5889912B2 (ja) 2010-11-17 2016-03-22 ジェネンテック， インコーポレイテッド アラニニルメイタンシノール抗体コンジュゲート
CN103429258B (zh) 2011-01-04 2016-03-09 新罗杰公司 通过施用溶瘤痘苗病毒生成针对肿瘤抗原的抗体和生成肿瘤特异性补体依赖性细胞毒性
WO2012106586A1 (en) 2011-02-03 2012-08-09 Mirna Therapeutics, Inc. Synthetic mimics of mir-124
JP2014506791A (ja) 2011-02-03 2014-03-20 マーナ セラピューティクス インコーポレイテッド ｍｉＲ−３４の合成模倣体
JP5987053B2 (ja) 2011-05-12 2016-09-06 ジェネンテック， インコーポレイテッド フレームワークシグネチャーペプチドを用いて動物サンプルにおける治療抗体を検出するための多重反応モニタリングｌｃ−ｍｓ／ｍｓ法
WO2012167382A1 (en) 2011-06-08 2012-12-13 Children's Hospital Of Eastern Ontario Research Institute Inc. Compositions and methods for glioblastoma treatment
AU2012294814A1 (en) 2011-08-05 2014-02-27 Research Development Foundation Improved methods and compositions for modulation of Olfml3 mediated angiogenesis
WO2013036201A1 (en) 2011-09-06 2013-03-14 Agency For Science, Technology And Research Polypeptide vaccine
WO2013040251A2 (en) 2011-09-13 2013-03-21 Asurgen, Inc. Methods and compositions involving mir-135b for distinguishing pancreatic cancer from benign pancreatic disease
PT2750713E (pt) 2011-10-14 2016-01-20 Genentech Inc Pirrolobenzodiazepinas e conjugados das mesmas
CA2864841C (en) * 2012-02-17 2020-07-07 Keith L. Knutson Methods and materials for generating cd8+ t cells having the ability to recognize cancer cells expressing a her2/neu polypeptide
WO2013130093A1 (en) 2012-03-02 2013-09-06 Genentech, Inc. Biomarkers for treatment with anti-tubulin chemotherapeutic compounds
US20150283233A1 (en) 2012-06-15 2015-10-08 Gencia Corporation Compositions and Methods for Enhancing Immune Responses
UA114108C2 (uk) 2012-07-10 2017-04-25 Борд Оф Ріджентс, Дзе Юніверсіті Оф Техас Сістем Моноклональне антитіло для застосування в діагностиці і терапії злоякісних пухлин і аутоімунного захворювання
JP6270859B2 (ja) 2012-10-12 2018-01-31 エイディーシー・セラピューティクス・エス・アー・エール・エルＡｄｃ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ Ｓａｒｌ ピロロベンゾジアゼピン−抗体結合体
KR101995621B1 (ko) 2012-10-12 2019-07-03 에이디씨 테라퓨틱스 에스에이 피롤로벤조디아제핀-항-cd22 항체 컨주게이트
RS53818B1 (en) 2012-10-12 2015-06-30 Spirogen Sàrl PIROLOBENZODIAZEPINI I NJIHOVI conjugated
WO2014057120A1 (en) 2012-10-12 2014-04-17 Adc Therapeutics Sàrl Pyrrolobenzodiazepine-antibody conjugates
CA2887895C (en) 2012-10-12 2019-10-29 Adc Therapeutics Sarl Pyrrolobenzodiazepine-anti-cd19 antibody conjugates
PT2906296T (pt) 2012-10-12 2018-06-01 Medimmune Ltd Conjugados de pirrolobenzodiazepina-anticorpo
ES2680153T3 (es) 2012-10-12 2018-09-04 Adc Therapeutics Sa Conjugados de anticuerpos anti-PSMA-pirrolobenzodiazepinas
DK2912064T3 (da) 2012-10-24 2019-07-22 Res Found Dev Jam-c-antistoffer og fremgangsmåder til behandling af cancer
CN105246894A (zh) 2012-12-21 2016-01-13 斯皮罗根有限公司 用于治疗增殖性和自身免疫疾病的非对称吡咯并苯并二氮杂卓二聚物
CN110452242A (zh) 2012-12-21 2019-11-15 麦迪穆有限责任公司 吡咯并苯并二氮杂卓及其结合物
WO2014127296A1 (en) 2013-02-14 2014-08-21 Immunocellular Therapeutics, Ltd Cancer vaccines and vaccination methods
RU2684211C2 (ru) 2013-02-21 2019-04-04 Тёрнстоун Лимитед Партнершип Композиция вакцины
CA2905181C (en) 2013-03-13 2020-06-02 Medimmune Limited Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof for providing targeted therapy
KR102057755B1 (ko) 2013-03-13 2019-12-19 메디뮨 리미티드 피롤로벤조디아제핀 및 그의 컨쥬게이트
JP6340019B2 (ja) 2013-03-13 2018-06-06 メドイミューン・リミテッドＭｅｄＩｍｍｕｎｅ Ｌｉｍｉｔｅｄ ピロロベンゾジアゼピン及びそのコンジュゲート
KR20160042080A (ko) 2013-08-12 2016-04-18 제넨테크, 인크. 1-(클로로메틸)-2,3-디히드로-1H-벤조[e]인돌 이량체 항체-약물 접합체 화합물, 및 사용 및 치료 방법
CA2921401A1 (en) 2013-08-14 2015-02-19 William Marsh Rice University Derivatives of uncialamycin, methods of synthesis and their use as antitumor agents
EP3036005A4 (en) 2013-08-21 2017-04-26 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Compositions and methods for targeting connexin hemichannels
EP3039137B1 (en) 2013-08-29 2019-07-31 Board of Regents, The University of Texas System Engineered primate cystine/cysteine degrading enzymes as antineogenic agents
CN105722522B (zh) 2013-08-30 2021-10-19 得克萨斯大学体系董事会 用于肿瘤疗法的犬尿氨酸耗竭酶的施用
US9956299B2 (en) 2013-10-11 2018-05-01 Medimmune Limited Pyrrolobenzodiazepine—antibody conjugates
US9950078B2 (en) 2013-10-11 2018-04-24 Medimmune Limited Pyrrolobenzodiazepine-antibody conjugates
EP3054983B1 (en) 2013-10-11 2019-03-20 Medimmune Limited Pyrrolobenzodiazepine-antibody conjugates
GB201317982D0 (en) 2013-10-11 2013-11-27 Spirogen Sarl Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof
SI3076949T1 (sl) 2013-12-04 2020-01-31 Board Of Regents, The University Of Texas System Postopek za izoliranje eksosomov, ki izvirajo iz rakavih celic
JP6671292B2 (ja) 2013-12-16 2020-03-25 ジェネンテック， インコーポレイテッド ペプチド模倣化合物及びその抗体−薬物コンジュゲート
WO2015095212A1 (en) 2013-12-16 2015-06-25 Genentech, Inc. 1-(chloromethyl)-2,3-dihydro-1h-benzo[e]indole dimer antibody-drug conjugate compounds, and methods of use and treatment
MX2016007826A (es) 2013-12-16 2017-03-31 Genentech Inc Compuestos peptidomimeticos y sus conjugados de anticuerpo-farmaco.
JP7080053B2 (ja) 2014-08-29 2022-06-03 ボード オブ リージェンツ，ザ ユニバーシティ オブ テキサス システム 腫瘍の治療のための、キヌレニンを枯渇させる酵素の投与
WO2016033105A1 (en) 2014-08-29 2016-03-03 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Novel capsazepine analogs for the treatment of cancer and other proliferative diseases
WO2016037644A1 (en) 2014-09-10 2016-03-17 Medimmune Limited Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof
KR20170052600A (ko) 2014-09-12 2017-05-12 제넨테크, 인크. 시스테인 가공된 항체 및 콘주게이트
GB201416112D0 (en) 2014-09-12 2014-10-29 Medimmune Ltd Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof
EP3191134B1 (en) 2014-09-12 2019-11-20 Genentech, Inc. Anthracycline disulfide intermediates, antibody-drug conjugates and methods
CA2959689A1 (en) 2014-09-17 2016-03-24 Genentech, Inc. Pyrrolobenzodiazepines and antibody disulfide conjugates thereof
EP3223854A1 (en) 2014-11-25 2017-10-04 ADC Therapeutics SA Pyrrolobenzodiazepine-antibody conjugates
CN107206101B (zh) 2014-12-03 2021-06-25 基因泰克公司 季铵化合物及其抗体-药物缀合物
JP6724023B2 (ja) 2015-02-09 2020-07-15 リサーチ ディベロップメント ファウンデーション 改善された補体活性化を示す操作された免疫グロブリンｆｃポリペプチド
AU2016226133B2 (en) 2015-03-04 2021-12-02 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods of treating cancer harboring hemizygous loss of TP53
CA2979676A1 (en) * 2015-03-13 2016-09-29 Brian J. Czerniecki Methods for monitoring cd4+ t-helper type 1 response in cancer and immune restoration
US20180171294A1 (en) * 2015-03-26 2018-06-21 The Trustees Of The University Of Pennsylvania In vitro artificial lymph node method for sensitization and expansion of t cells for therapy and epitope mapping
GB201506402D0 (en) 2015-04-15 2015-05-27 Berkel Patricius H C Van And Howard Philip W Site-specific antibody-drug conjugates
GB201506411D0 (en) 2015-04-15 2015-05-27 Bergenbio As Humanized anti-axl antibodies
CN107206061A (zh) * 2015-05-22 2017-09-26 布莱恩·J·赫尔尼奇 多剂量注射用树突状细胞疫苗的制备,用于阻断her2和her3的联合治疗和雌激素受体阳性her2乳腺癌治疗
US9993538B2 (en) 2015-05-29 2018-06-12 Galena Biopharma, Inc. Peptide vaccine therapy for treatment of FRα-expressing tumors
JP2018520125A (ja) 2015-06-10 2018-07-26 ボード・オブ・リージエンツ，ザ・ユニバーシテイ・オブ・テキサス・システム 疾患の処置のためのエキソソームの使用
RU2612015C2 (ru) * 2015-06-29 2017-03-01 Общество с ограниченной ответственностью "Сибинтех" Пептид-иммуноген, используемый в терапевтической вакцине для лечения метастатического рака молочной железы у кошек и собак
WO2017019829A1 (en) 2015-07-28 2017-02-02 Board Of Regents, The University Of Texas System Implant compositions for the unidirectional delivery of therapeutic compounds to the brain
WO2017040380A2 (en) 2015-08-28 2017-03-09 Research Development Foundation Engineered antibody fc variants
MA43345A (fr) 2015-10-02 2018-08-08 Hoffmann La Roche Conjugués anticorps-médicaments de pyrrolobenzodiazépine et méthodes d'utilisation
US9744187B2 (en) 2015-10-14 2017-08-29 Bio-Path Holdings, Inc. p-Ethoxy nucleic acids for liposomal formulation
MA43354A (fr) 2015-10-16 2018-08-22 Genentech Inc Conjugués médicamenteux à pont disulfure encombré
RU2624862C2 (ru) * 2015-10-20 2017-07-07 Общество с ограниченной ответственностью "Эпитек" Пептид-иммуноген, используемый в терапевтической вакцине для лечения метастатического рака молочной железы
MA45326A (fr) 2015-10-20 2018-08-29 Genentech Inc Conjugués calichéamicine-anticorps-médicament et procédés d'utilisation
WO2017079746A2 (en) 2015-11-07 2017-05-11 Multivir Inc. Methods and compositions comprising tumor suppressor gene therapy and immune checkpoint blockade for the treatment of cancer
CA3004438A1 (en) 2015-11-09 2017-05-18 The Children's Hospital Of Philadelphia Glypican 2 as a cancer marker and therapeutic target
EP3383908A1 (en) 2015-12-02 2018-10-10 Stsciences, Inc. Antibodies specific to glycosylated btla (b- and t- lymphocyte attenuator)
EP3909983A1 (en) 2015-12-02 2021-11-17 STCube & Co. Inc. Antibodies and molecules that immunospecifically bind to btn1a1 and the therapeutic uses thereof
GB201601431D0 (en) 2016-01-26 2016-03-09 Medimmune Ltd Pyrrolobenzodiazepines
GB201602359D0 (en) 2016-02-10 2016-03-23 Medimmune Ltd Pyrrolobenzodiazepine Conjugates
GB201602356D0 (en) 2016-02-10 2016-03-23 Medimmune Ltd Pyrrolobenzodiazepine Conjugates
US10889637B2 (en) 2016-02-26 2021-01-12 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Methods of treating an osteolytic tumor and spinal cord injury by administering connexin (Cx) 43 hemichannel-binding antibodies
JP2019511483A (ja) 2016-03-02 2019-04-25 ザ ボード オブ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティー オブ テキサス システム 免疫療法のためのｓｔｉｎｇ活性化ナノワクチン
JP6943872B2 (ja) 2016-03-25 2021-10-06 ジェネンテック， インコーポレイテッド 多重全抗体及び抗体複合体化薬物定量化アッセイ
WO2017172517A1 (en) 2016-03-29 2017-10-05 Stcube & Co., Inc. Methods for selecting antibodies that specifically bind glycosylated immune checkpoint proteins
US11660352B2 (en) 2016-03-29 2023-05-30 Stcube, Inc. Dual function antibodies specific to glycosylated PD-L1 and methods of use thereof
WO2017176076A1 (en) 2016-04-06 2017-10-12 Ewha University - Industry Collaboration Foundation A peptide with ability to penetrate cell membrane
GB201607478D0 (en) 2016-04-29 2016-06-15 Medimmune Ltd Pyrrolobenzodiazepine Conjugates
JP7131773B2 (ja) 2016-04-29 2022-09-06 ボード オブ リージェンツ，ザ ユニバーシティ オブ テキサス システム ホルモン受容体に関連する転写活性の標的尺度
PL3458101T3 (pl) 2016-05-20 2021-05-31 F. Hoffmann-La Roche Ag Koniugaty PROTAC-przeciwciało i sposoby ich stosowania
US20170370906A1 (en) 2016-05-27 2017-12-28 Genentech, Inc. Bioanalytical analysis of site-specific antibody drug conjugates
EP3463438B1 (en) 2016-05-31 2022-04-06 The Henry M. Jackson Foundation for the Advancement of Military Medicine, Inc. Vaccine therapy for treatment of endometrial and ovarian cancer
KR20190034160A (ko) * 2016-06-03 2019-04-01 이투빅스 코포레이션 Her2/neu 가 관련되는 종양 백신화 및 면역요법을 위한 조성물 및 방법
US10639378B2 (en) 2016-06-06 2020-05-05 Genentech, Inc. Silvestrol antibody-drug conjugates and methods of use
CA3028771A1 (en) 2016-07-06 2018-01-11 Board Of Regents, The University Of Texas System Human-enzyme mediated depletion of cystine for treating patients with cystinuria
KR20190031299A (ko) 2016-07-20 2019-03-25 주식회사 에스티큐브 글리코실화된 pd-l1에 결합하는 항체의 조합을 사용하는 암 치료 방법
CN109689111B (zh) 2016-08-11 2024-04-05 基因泰克公司 吡咯并苯并二氮杂䓬前药及其抗体缀合物
WO2018035429A1 (en) 2016-08-18 2018-02-22 Wisconsin Alumni Research Foundation Peptides that inhibit syndecan-1 activation of vla-4 and igf-1r
MX2019003070A (es) 2016-09-16 2019-10-14 Bio Path Holdings Inc Terapia de combinacion con oligonucleotidos antisentido liposomales.
CN110139674B (zh) 2016-10-05 2023-05-16 豪夫迈·罗氏有限公司 制备抗体药物缀合物的方法
GB201617466D0 (en) 2016-10-14 2016-11-30 Medimmune Ltd Pyrrolobenzodiazepine conjugates
CA3043356A1 (en) 2016-11-09 2018-05-17 Musc Foundation For Research Development Cd38-nad+ regulated metabolic axis in anti-tumor immunotherapy
WO2018111902A1 (en) 2016-12-12 2018-06-21 Multivir Inc. Methods and compositions comprising viral gene therapy and an immune checkpoint inhibitor for treatment and prevention of cancer and infectious diseases
GB201702031D0 (en) 2017-02-08 2017-03-22 Medlmmune Ltd Pyrrolobenzodiazepine-antibody conjugates
US11160872B2 (en) 2017-02-08 2021-11-02 Adc Therapeutics Sa Pyrrolobenzodiazepine-antibody conjugates
WO2018156973A1 (en) 2017-02-24 2018-08-30 Board Of Regents, The University Of Texas System Assay for detection of early stage pancreatic cancer
CN110582505B (zh) 2017-04-18 2021-04-02 免疫医疗有限公司 吡咯并苯并二氮杂*缀合物
CN110536703A (zh) 2017-04-20 2019-12-03 Adc治疗有限公司 使用抗axl抗体-药物缀合物的组合疗法
WO2018209211A1 (en) 2017-05-12 2018-11-15 Board Of Regents, The University Of Texas System Engineered primate cystine/cysteine degrading enzymes for therapeutic uses
MX2019013458A (es) 2017-05-12 2020-01-15 Univ Texas Disminucion de homocisteina mediada por enzimas humanas para el tratamiento de pacientes con hiperhomocisteinemia y homocistinuria.
JP2020522512A (ja) 2017-05-31 2020-07-30 ストキューブ アンド シーオー．， インコーポレイテッド Ｂｔｎ１ａ１に免疫特異的に結合する抗体及び分子を用いて癌を治療する方法
JP7369038B2 (ja) 2017-05-31 2023-10-25 ストキューブ アンド シーオー．， インコーポレイテッド Ｂｔｎ１ａ１に免疫特異的に結合する抗体及び分子並びにその治療的使用
JP2020522562A (ja) 2017-06-06 2020-07-30 ストキューブ アンド シーオー．， インコーポレイテッド Ｂｔｎ１ａ１又はｂｔｎ１ａ１リガンドに結合する抗体及び分子を用いて癌を治療する方法
US11318211B2 (en) 2017-06-14 2022-05-03 Adc Therapeutics Sa Dosage regimes for the administration of an anti-CD19 ADC
SI3668874T1 (sl) 2017-08-18 2022-04-29 Medimmune Limited Pirolobenzodiazepinski konjugati
RU2020113749A (ru) 2017-09-20 2021-10-20 пиЭйч ФАРМА Ко., ЛТД. Аналоги таиланстатина
US11525002B2 (en) 2017-10-11 2022-12-13 Board Of Regents, The University Of Texas System Human PD-L1 antibodies and methods of use therefor
GB201803342D0 (en) 2018-03-01 2018-04-18 Medimmune Ltd Methods
EP3768698A4 (en) 2018-03-19 2022-03-30 MultiVir Inc. METHODS AND COMPOSITIONS COMPRISING TUMOR SUPPRESSIVE GENE THERAPY AND CD122/CD132 AGONISTS FOR THE TREATMENT OF CANCER
WO2019182896A1 (en) 2018-03-23 2019-09-26 Board Of Regents, The University Of Texas System Dual specificity antibodies to pd-l1 and pd-l2 and methods of use therefor
EP3773551A4 (en) 2018-03-27 2022-03-23 Board of Regents, The University of Texas System COMPOUNDS WITH ANTITUMOR ACTIVITY AGAINST CANCER CELLS CARRYING HER2 EXON 19 MUTATIONS
GB201806022D0 (en) 2018-04-12 2018-05-30 Medimmune Ltd Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof
CN108624589B (zh) * 2018-04-17 2021-12-17 广州永诺生物科技有限公司 环状RNA circ-ERBB2及其检测试剂与应用
CN108715603A (zh) * 2018-06-08 2018-10-30 天津亨佳生物科技发展有限公司 一种治疗肿瘤的抗原肽链组及其在药物中的应用
CN108484732A (zh) * 2018-06-08 2018-09-04 天津亨佳生物科技发展有限公司 一种治疗肿瘤的抗原肽链组及其在药物中的应用
GB201814281D0 (en) 2018-09-03 2018-10-17 Femtogenix Ltd Cytotoxic agents
AU2019365238A1 (en) 2018-10-24 2021-05-13 F. Hoffmann-La Roche Ag Conjugated chemical inducers of degradation and methods of use
US20220033848A1 (en) 2018-11-19 2022-02-03 Board Of Regents, The University Of Texas System A modular, polycistronic vector for car and tcr transduction
WO2020113029A2 (en) 2018-11-28 2020-06-04 Board Of Regents, The University Of Texas System Multiplex genome editing of immune cells to enhance functionality and resistance to suppressive environment
BR112021010248A2 (pt) 2018-11-29 2021-08-17 Board Of Regents, The University Of Texas System métodos para expansão ex vivo de células naturais killer e uso dos mesmos
EP3894427A1 (en) 2018-12-10 2021-10-20 Genentech, Inc. Photocrosslinking peptides for site specific conjugation to fc-containing proteins
GB201901197D0 (en) 2019-01-29 2019-03-20 Femtogenix Ltd G-A Crosslinking cytotoxic agents
JP2022519718A (ja) 2019-02-08 2022-03-24 ボード オブ リージェンツ，ザ ユニバーシティ オブ テキサス システム 加齢および加齢性臓器不全に関連する疾患の処置のためのテロメラーゼ含有エキソソーム
CA3138348A1 (en) 2019-05-09 2020-11-12 FUJIFILM Cellular Dynamics, Inc. Methods for the production of hepatocytes
TW202110431A (zh) 2019-05-17 2021-03-16 美商癌症預防製藥股份有限公司 治療家族性腺瘤性瘜肉症之方法
JP2022541538A (ja) 2019-07-19 2022-09-26 ザ・チルドレンズ・ホスピタル・オブ・フィラデルフィア グリピカン２結合ドメインを含有するキメラ抗原受容体
WO2021050953A1 (en) 2019-09-13 2021-03-18 Elektrofi, Inc. Compositions and methods for the delivery of therapeutic biologics for treatment of disease
CN114729045A (zh) 2019-09-26 2022-07-08 斯特库比公司 对糖基化的ctla-4特异性的抗体及其使用方法
EP4041768A1 (en) 2019-10-09 2022-08-17 StCube & Co. Antibodies specific to glycosylated lag3 and methods of use thereof
US20220380765A1 (en) 2019-11-02 2022-12-01 Board Of Regents, The University Of Texas System Targeting nonsense-mediated decay to activate p53 pathway for the treatment of cancer
WO2021113644A1 (en) 2019-12-05 2021-06-10 Multivir Inc. Combinations comprising a cd8+ t cell enhancer, an immune checkpoint inhibitor and radiotherapy for targeted and abscopal effects for the treatment of cancer
KR20220124718A (ko) 2020-01-07 2022-09-14 더 보드 오브 리젠츠 오브 더 유니버시티 오브 텍사스 시스템 암 치료를 위한 개선된 인간 메틸 티오아데노신/아데노신 고갈 효소 변이체
EP4107173A1 (en) 2020-02-17 2022-12-28 Board of Regents, The University of Texas System Methods for expansion of tumor infiltrating lymphocytes and use thereof
EP4153301A2 (en) 2020-05-21 2023-03-29 Board of Regents, The University of Texas System T cell receptors with vgll1 specificity and uses thereof
WO2021247836A1 (en) 2020-06-03 2021-12-09 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods for targeting shp-2 to overcome resistance
EP4172370A1 (en) 2020-06-30 2023-05-03 Lunglife Ai, Inc. Methods for detecting lung cancer
GB2597532A (en) 2020-07-28 2022-02-02 Femtogenix Ltd Cytotoxic compounds
WO2022104109A1 (en) 2020-11-13 2022-05-19 Catamaran Bio, Inc. Genetically modified natural killer cells and methods of use thereof
US20220162288A1 (en) 2020-11-25 2022-05-26 Catamaran Bio, Inc. Cellular therapeutics engineered with signal modulators and methods of use thereof
CN117529338A (zh) 2021-01-19 2024-02-06 威廉马歇莱思大学 多肽的骨特异性递送
GB2603166A (en) 2021-01-29 2022-08-03 Thelper As Therapeutic and Diagnostic Agents and Uses Thereof
IL310550A (en) 2021-08-04 2024-03-01 Univ Colorado Regents LAT-activating chimeric antigen receptor T cells and methods of using them
CN115925875A (zh) * 2021-08-20 2023-04-07 百奥赛图(北京)医药科技股份有限公司 Her2基因人源化非人动物及其构建方法和应用
CA3234457A1 (en) 2021-10-05 2023-04-13 Cytovia Therapeutics, Llc Natural killer cells and methods of use thereof
CN113699221B (zh) * 2021-10-19 2023-10-10 广州吉赛医疗科技有限公司 HER2 mRNA及环状RNA多重荧光定量PCR检测引物探针及其应用
WO2023068382A2 (en) 2021-10-20 2023-04-27 Takeda Pharmaceutical Company Limited Compositions targeting bcma and methods of use thereof
WO2023076880A1 (en) 2021-10-25 2023-05-04 Board Of Regents, The University Of Texas System Foxo1-targeted therapy for the treatment of cancer
CN114262689A (zh) * 2021-12-17 2022-04-01 上海纳米技术及应用国家工程研究中心有限公司 一种快速检测cd19/cd20-car-t细胞活性的方法
GB202201137D0 (en) 2022-01-28 2022-03-16 Thelper As Therapeutic and diagnostic agents and uses thereof
WO2023172514A1 (en) 2022-03-07 2023-09-14 Catamaran Bio, Inc. Engineered immune cell therapeutics targeted to her2 and methods of use thereof
WO2023192976A1 (en) 2022-04-01 2023-10-05 Board Of Regents, The University Of Texas System Dual specificity antibodies to human pd-l1 and pd-l2 and methods of use therefor
WO2023211972A1 (en) 2022-04-28 2023-11-02 Medical University Of South Carolina Chimeric antigen receptor modified regulatory t cells for treating cancer
WO2023220083A1 (en) 2022-05-09 2023-11-16 Flagship Pioneering Innovations Vi, Llc Trem compositions and methods of use for treating proliferative disorders
WO2023230531A1 (en) 2022-05-24 2023-11-30 Lunglife Ai, Inc. Methods for detecting circulating genetically abnormal cells
US20240010742A1 (en) 2022-06-10 2024-01-11 Research Development Foundation Engineered fcriib selective igg1 fc variants and uses thereof

Family Cites Families (24)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
NL154600B (nl) * 1971-02-10 1977-09-15 Organon Nv Werkwijze voor het aantonen en bepalen van specifiek bindende eiwitten en hun corresponderende bindbare stoffen.
NL154598B (nl) * 1970-11-10 1977-09-15 Organon Nv Werkwijze voor het aantonen en bepalen van laagmoleculire verbindingen en van eiwitten die deze verbindingen specifiek kunnen binden, alsmede testverpakking.
US3817837A (en) * 1971-05-14 1974-06-18 Syva Corp Enzyme amplification assay
US3901654A (en) * 1971-06-21 1975-08-26 Biological Developments Receptor assays of biologically active compounds employing biologically specific receptors
US3766162A (en) * 1971-08-24 1973-10-16 Hoffmann La Roche Barbituric acid antigens and antibodies specific therefor
US3935074A (en) * 1973-12-17 1976-01-27 Syva Company Antibody steric hindrance immunoassay with two antibodies
US3996345A (en) * 1974-08-12 1976-12-07 Syva Company Fluorescence quenching with immunological pairs in immunoassays
US4034074A (en) * 1974-09-19 1977-07-05 The Board Of Trustees Of Leland Stanford Junior University Universal reagent 2-site immunoradiometric assay using labelled anti (IgG)
US3984533A (en) * 1975-11-13 1976-10-05 General Electric Company Electrophoretic method of detecting antigen-antibody reaction
US4098876A (en) * 1976-10-26 1978-07-04 Corning Glass Works Reverse sandwich immunoassay
US4233402A (en) * 1978-04-05 1980-11-11 Syva Company Reagents and method employing channeling
US4452901A (en) * 1980-03-20 1984-06-05 Ciba-Geigy Corporation Electrophoretically transferring electropherograms to nitrocellulose sheets for immuno-assays
US7838216B1 (en) * 1986-03-05 2010-11-23 The United States Of America, As Represented By The Department Of Health And Human Services Human gene related to but distinct from EGF receptor gene
US5401638A (en) * 1986-06-04 1995-03-28 Oncogene Science, Inc. Detection and quantification of neu related proteins in the biological fluids of humans
CA2055441C (en) * 1989-05-19 2003-01-07 Robert M. Hudziak Her2 extracellular domain
EP0444181B2 (en) * 1989-08-04 2010-11-24 Bayer Schering Pharma Aktiengesellschaft C-erbb-2 external domain: gp75
JP2552047B2 (ja) * 1990-01-26 1996-11-06 ワシントン リサーチ ファウンデーション 悪性腫瘍の検査方法
US5958784A (en) * 1992-03-25 1999-09-28 Benner; Steven Albert Predicting folded structures of proteins
ATE466869T1 (de) * 1993-03-05 2010-05-15 Epimmune Inc Verfahren zur herstellung von immunogenen hla- a2.1-bindenden peptiden
US5550214A (en) * 1994-02-10 1996-08-27 Brigham And Women's Hospital Isolated antigenic oncogene peptide fragments and uses
AU712441B2 (en) * 1994-12-14 1999-11-04 Scripps Research Institute, The In vivo activation of tumor-specific cytotoxic T cells
US6514942B1 (en) * 1995-03-14 2003-02-04 The Board Of Regents, The University Of Texas System Methods and compositions for stimulating T-lymphocytes
US5840839A (en) * 1996-02-09 1998-11-24 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Alternative open reading frame DNA of a normal gene and a novel human cancer antigen encoded therein
FR2812087B1 (fr) * 2000-07-21 2007-05-11 Inst Nat Sante Rech Med Procede de criblage de peptides utilisables en immunotherapie

Also Published As

Publication number Publication date
MX9707501A (es) 1998-06-30
RU2236461C2 (ru) 2004-09-20
US5801005A (en) 1998-09-01
US7247703B2 (en) 2007-07-24
NZ306616A (en) 2001-03-30
CA2216601C (en) 2002-10-22
US6664370B2 (en) 2003-12-16
AU5522296A (en) 1996-10-16
JP4510147B2 (ja) 2010-07-21
EP0817846B1 (en) 2005-07-06
CN1150318C (zh) 2004-05-19
EP1418235A2 (en) 2004-05-12
JP2008056679A (ja) 2008-03-13
CN1597953A (zh) 2005-03-23
PT817846E (pt) 2005-11-30
KR19980703453A (ko) 1998-11-05
NO321941B1 (no) 2006-07-24
US20020055614A1 (en) 2002-05-09
DE69634912T2 (de) 2006-04-20
AU708237B2 (en) 1999-07-29
US6075122A (en) 2000-06-13
EP1418235A3 (en) 2004-08-11
ES2245783T3 (es) 2006-01-16
DE69634912D1 (de) 2005-08-11
US20080076904A1 (en) 2008-03-27
HUP9801826A2 (hu) 1998-11-30
BR9607889A (pt) 1999-08-10
CN1183117A (zh) 1998-05-27
US7655239B2 (en) 2010-02-02
ATE299180T1 (de) 2005-07-15
KR100554186B1 (ko) 2007-04-11
NO974502D0 (no) 1997-09-29
CA2216601A1 (en) 1996-10-03
EP0817846A1 (en) 1998-01-14
HUP9801826A3 (en) 2000-12-28
US5726023A (en) 1998-03-10
DK0817846T3 (da) 2005-11-07
NO974502L (no) 1997-11-27
US5876712A (en) 1999-03-02
RU2004115492A (ru) 2005-11-10
CZ309697A3 (cs) 1998-01-14
CN1951398A (zh) 2007-04-25
JPH11502710A (ja) 1999-03-09
US20040082758A1 (en) 2004-04-29
NO20061723L (no) 1996-10-01
WO1996030514A1 (en) 1996-10-03
CZ296617B6 (cs) 2006-05-17
US5846538A (en) 1998-12-08
US20100087621A1 (en) 2010-04-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CZ296618B6 (cs) Farmaceutická nebo polypeptidová kompozice, molekula nukleové kyseliny, virový vektor a lécivo pro imunizaci proti malignitám
US5869445A (en) Methods for eliciting or enhancing reactivity to HER-2/neu protein
JP5164300B2 (ja) ＨＥＲ−２／ｎｅｕ融合タンパク質
JP4235984B2 (ja) Ｗｔ１特異的免疫療法のための組成物および方法
US7202334B1 (en) Compositions and methods for the therapy and diagnosis of ovarian cancer
US7063854B1 (en) Composition and methods for WTI specific immunotherapy
JP2004521609A (ja) Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ融合タンパク質
US7144581B2 (en) Compositions and methods for WT1 specific immunotherapy
KR20020007354A (ko) 폐암의 치료 및 진단에 유용한 화합물 및 방법
KR20020007348A (ko) 유방암의 치료 및 진단용 조성물 및 이의 사용 방법
MXPA03002983A (es) Composiciones y metodos `para la inmunoterapia especifica de wt1.
WO2001025273A2 (en) Compositions and methods for wt1 specific immunotherapy
US7115272B1 (en) Compositions and methods for WT1 specific immunotherapy
US7901693B2 (en) Compositions and methods for WT1 specific immunotherapy
US8524491B2 (en) Compounds for eliciting or enhancing immune reactivity to HER-2/neu protein for prevention or treatment of malignancies in which the HER-2/neu oncogene is associated
JP2002540789A (ja) 乳癌の処置および診断のための組成物ならびにそれらの使用方法
MXPA97007501A (en) Intracellular domain of protein her-2 / neu for the prevention or treatment of malignida

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Patent lapsed due to non-payment of fee

Effective date: 20090328