DE69634912T2 - Intrazellulare domäne des her-2/neu proteins, für die prevention oder behandlung von bösartigen tumoren - Google Patents

Intrazellulare domäne des her-2/neu proteins, für die prevention oder behandlung von bösartigen tumoren Download PDF

Info

Publication number
DE69634912T2
DE69634912T2 DE69634912T DE69634912T DE69634912T2 DE 69634912 T2 DE69634912 T2 DE 69634912T2 DE 69634912 T DE69634912 T DE 69634912T DE 69634912 T DE69634912 T DE 69634912T DE 69634912 T2 DE69634912 T2 DE 69634912T2
Authority
DE
Germany
Prior art keywords
polypeptide
amino acid
neu
cells
seq
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Lifetime
Application number
DE69634912T
Other languages
English (en)
Other versions
DE69634912D1 (de
Inventor
A. Martin CHEEVER
L. Mary DISIS
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
University of Washington
Original Assignee
University of Washington
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by University of Washington filed Critical University of Washington
Application granted granted Critical
Publication of DE69634912D1 publication Critical patent/DE69634912D1/de
Publication of DE69634912T2 publication Critical patent/DE69634912T2/de
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • A61K39/001102—Receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A61K39/001103—Receptors for growth factors
    • A61K39/001106—Her-2/neu/ErbB2, Her-3/ErbB3 or Her 4/ErbB4
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/461—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
    • A61K39/4611—T-cells, e.g. tumor infiltrating lymphocytes [TIL], lymphokine-activated killer cells [LAK] or regulatory T cells [Treg]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
    • A61K39/4643—Vertebrate antigens
    • A61K39/4644—Cancer antigens
    • A61K39/464402—Receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A61K39/464403—Receptors for growth factors
    • A61K39/464406—Her-2/neu/ErbB2, Her-3/ErbB3 or Her 4/ ErbB4
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4702—Regulators; Modulating activity
    • C07K14/4705—Regulators; Modulating activity stimulating, promoting or activating activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/71—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for growth factors; for growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/06—Linear peptides containing only normal peptide links having 5 to 11 amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57407—Specifically defined cancers
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57484—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites
    • G01N33/57488—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites involving compounds identifable in body fluids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G01N2333/71—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants for growth factors; for growth regulators
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/82—Translation products from oncogenes
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
    • Y10S530/806—Antigenic peptides or proteins
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
    • Y10S530/827—Proteins from mammals or birds
    • Y10S530/828—Cancer

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)

Description

  • Technisches Gebiet
  • Die vorliegende Erfindung ist im allgemeinen auf Polypeptide und auf Nukleinsäuremoleküle, die für solche Polypeptide kodieren, gerichtet, zum Auslösen oder Verstärken einer Immunantwort auf HER-2/neu-Protein, einschließlich zur Verwendung bei der Behandlung von bösartigen Erkrankungen, bei der das HER-2/neu-Oncogen assoziiert ist,
  • Hintergrund der Erfindung
  • Trotz enormer Investitionen an finanziellen und humanen Mitteln bleibt Krebs eine der Haupttodesursachen. Zum Beispiel ist Krebs die führende Todesursache bei Frauen zwischen 35 und 74 Jahren. Brustkrebs ist die häufigste bösartige Erkrankung bei Frauen, und das Auftreten einer Entwicklung von Brustkrebs steigt an. Eine aus neun Frauen wird mit der Erkrankung diagnostiziert werden. Standardansätze, um Brustkrebs zu heilen, haben sich auf eine Kombination von Operation, Bestrahlung und Chemotherapie konzentriert. Diese Ansätze haben zu einigen dramatischen Erfolgen bei bestimmten bösartigen Erkrankungen geführt. Jedoch sind diese Ansätze nicht für alle bösartigen Erkrankungen erfolgreich gewesen, und Brustkrebs ist sehr häufig unheilbar beim Versuch, über ein bestimmtes Stadium hinaus zu behandeln. Alternative Ansätze zur Verhinderung und Therapie sind notwendig.
  • Eine häufige Eigenschaft von bösartigen Erkrankungen ist unkontrolliertes Zellwachstum. Krebszellen scheinen einen Prozeß der Transformation von einem normalen Phänotyp zu einem malignen Phänotyp durchlaufen zu haben, der zu autonomem Wachstum in der Lage ist. Amplifikation und Überexpression von somatischen Zellgenen wird als ein häufiges primäres Ereignis angesehen, das zur Transformation von normalen Zellen in maligne Zellen führt. Die malignen phänotypischen Eigenschaften, die durch die oncogenen Gene kodiert werden, werden während der Zellteilung auf die Nachkommenschaft der transformierten Zellen übertragen.
  • Die gegenwärtige Forschung, die sich mit Oncogenen beschäftigt, hat wenigstens 40 Oncogene identifiziert, die in malignen Zellen aktiv sind und für eine Transformation verantwortlich oder damit assoziiert sind. Oncogene sind in verschiedene Gruppe klassifiziert worden, basie rend auf der vermeintlichen Funktion oder Lage ihrer Genprodukte (wie etwa des Proteins, das durch das Oncogen exprimiert wird).
  • Oncogene werden als essentiell für bestimmte Aspekte der normalen zellulären Physiologie angesehen. In dieser Hinsicht ist das HER-2/neu-Oncogen ein Mitglied der Tyrosin-Protein-Kinase-Familie der Oncogene und hat einen hohen Grad an Homologie mit dem epidermalen Wachstumsfaktorrezeptor. HER-2/neu spielt vermutliche eine Rolle beim Zellwachstum und/oder Differenzierung. HER-2/neu scheint bösartige Erkrankungen durch quantitative Mechanismen zu induzieren, die aus einer erhöhten oder deregulierten Expression eines im wesentlichen normalen Genprodukts resultieren.
  • HER-2/neu (p185) ist das Proteinprodukt des HER-2/neu-Oncogens. Das HER-2/neu-Gen wird amplifiziert, und das HER-2/neu-Protein wird überexprimiert in einer Vielzahl von Krebsen, einschließlich Brust-, Ovarial-, Colon-, Lungen- und Prostatakrebs. HER-2/neu steht mit maligner Transformation in Beziehung. Es wird in 50%–60% von in-situ-Duktuskarzinomen und 20%–40% aller Brustkrebse gefunden, ebenso wie einem substantiellen Bruchteil an Adenokarzinomen, die in den Eierstöcken, Prostata, Colon und Lunge entstehen. HER-2/neu ist nicht nur mit dem malignen Phänotyp innig assoziiert, sondern auch mit der Aggressivität der malignen Erkrankung, indem es in einem Viertel aller invasiven Brustkrebse gefunden wird. HER-2/neu-Überexpression steht mit einer schlechten Prognose bei sowohl Brust- als auch Ovarialkrebs in Beziehung. HER-2/neu ist ein Transmembranprotein mit einer relativen molekularen Masse von 185 kd, das näherungsweise 1255 Aminosäuren (aa) lang ist. Es hat eine extrazelluläre Bindungsdomäne (ECD) mit näherungsweise 645 aa, mit 40% Homologie mit dem epidermalen Wachstumsfaktorrezeptor (EGFR), einer stark hydrophoben Transmembranankerdomäne (TMD), und einer carboxyterminalen cytoplasmatischen Domäne (CD) von näherungsweise 580 aa mit 80% Homologie mit EGFR. Disis et al. (Cancer Res 54, 16–20, 1994) berichtet über eine HER-2/neu-Immunität in Patienten mit Brustkrebsen.
  • Aufgrund der Schwierigkeiten bei den gegenwärtigen Ansätzen für eine Therapie von Krebsen, bei denen das HER-2/neu-Oncogen assoziiert ist, gibt es einen Bedarf auf dem Gebiet für verbesserte Verbindungen und Zusammensetzungen. Die vorliegende Erfindung erfüllt diesen Bedarf und stellt darüber hinaus andere verwandte Vorteile bereit.
  • Zusammenfassung der Erfindung
  • Kurz gesagt, stellt die vorliegende Erfindung Polypeptide, Nukleinsäuremoleküle (die die Expression solcher Polpypeptide steuern) und virale Vektoren (die die Expression solcher Polypeptide steuern) zur Verwendung für die Immunisierung oder zur Herstellung eines Medikaments für die Immunisierung eines warmblütigen Tieres gegen eine bösartige Erkrankung bereit, bei der das HER-2/neu-Oncogen assoziiert ist. Ein Polypeptid oder Nukleinsäuremolekül entsprechend dieser Erfindung kann in einer Zusammensetzung vorliegen, die einen pharmazeutisch akzeptablen Träger oder Verdünnungsmittel einschließt. Ein solches Polypeptid, Nukleinsäuremolekül, viraler Vektor oder pharmazeutische Zusammensetzung kann für die Immunisierung auf einer Einmalbasis (z.B. wenn eine bösartige Erkrankung vermutet wird) oder auf einer periodischen Basis verwendet werden (z.B. für ein Individuum mit einem erhöhten Risiko, eine bösartige Erkrankung zu erwerben oder erneut zu erwerben). Ein Medikament für die Immunisierung kann bei der Behandlung eines existierenden Tumors nützlich sein oder um ein Auftreten oder erneutes Auftreten eines Tumors zu verhindern.
  • In einer Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung ein Polypeptid bereit, das durch eine DNA-Sequenz der Nukleotide 2026 bis 3765 von SEQ ID NO: 1 kodiert wird, bereit, wobei die DNA-Sequenz für ein Polypeptid kodiert, das eine Immunantwort auf HER-2/neu-Protein erzeugt. In einer bevorzugten Ausführungsform hat ein Polypeptid die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2 von Lysin, Aminosäure 676, bis Valin, Aminosäure 1255, oder eine Variante davon, die wenigstens eine äquivalente Immunantwort erzeugt. Eine Zusammensetzung wird bereitgestellt, die eine Polypeptid der vorliegenden Erfindung in Kombination mit einem pharmazeutisch akzeptablen Träger oder Verdünnungsmittel umfaßt.
  • In einer anderen Ausführungsform wird ein Polypeptid oder eine Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung für die Immunisierung eines warmblütigen Tieres gegen eine bösartige Erkrankung bereitgestellt, bei der das HER-2/neu-Oncogen assoziiert ist. In einer anderen Ausführungsform wird ein solches Polypeptid oder Zusammensetzung für die Herstellung eines Medikaments zur Immunisierung eines warmblütigen Tieres gegen eine bösartige Erkrankung verwendet, bei der das HER-2/neu-Oncogen assoziiert ist.
  • In einer anderen Ausführungsform wird ein Nukleinsäuremolekül, das die Expression eines Polypeptides gemäß der vorliegenden Erfindung steuert, für die Immunisierung durch Transfizieren der Zellen eines warmblütigen Tieres mit dem Nukleinsäuremolekül bereitgestellt. In einer anderen Ausführungsform wird ein solches Nukleinsäuremolekül für die Herstellung eines Medikaments zur Immunisierung eines warmblütigen Tieres gegen eine bösartige Erkrankung verwendet, bei der das HER-2/neu-Oncogen assoziiert ist.
  • In einer anderen Ausführungsform wird ein viraler Vektor, der die Expression eines Polypeptids gemäß der vorliegenden Erfindung steuert, für die Immunisierung durch Infizieren der Zellen eines warmblütigen Tieres mit dem Vektor bereitgestellt. In einer anderen Ausführungsform wird ein solcher viraler Vektor für die Herstellung eines Medikaments zur Immunisierung eines warmblütigen Tiers gegen eine bösartige Erkrankung verwendet, bei der das HER-2/neu-Oncogen assoziiert ist.
  • Diese und andere Aspekte der vorliegenden Erfindung werden unter Bezugnahme auf die folgende detaillierte Beschreibung und die angehängten Zeichnungen deutlich werden.
  • Kurze Beschreibung der Zeichnungen
  • 1 zeigt die Ergebnisse des Priming von naiven T-Lymphocyten auf HER-2/neu-Polypeptid durch dendritische Zellen. Aus Knochenmark stammende DC wurden mit GM-CSF und IL6 aus CD34+-Stammzellen erzeugt. DC, die mit HER-2/neu-Polypeptid gepulst wurden, induzierten eine Protein-spezifische Proliferation von autologen CD4+/CD45RA+-T-Lymphocyten nach 7 Tagen der Kultivierung von T-Zellen mit DC. Aus Knochenmark stammende CD34+-Stammzellen, die für eine Woche in serumfreien Medium, enthaltend GM-CSF und IL-6, kultiviert wurden, wurden als APC verwendet. APC wurde in 96-Napf-Rundbodenplatten (Corning, Corning, NY, USA) in verschiedenen Konzentrationen ausplattiert und für 16–18 Stunden mit 20–25 μg/ml rekombinantem HER-2/neu-Polypeptid inkubiert. CD4+-T-Lymphocyten wurden aus autologen peripheren mononukleären Blutzellen durch positive Auswahl unter Verwendung von Immunaffinitätsäulen (CellPro, Incl., Bothell, WA, USA) isoliert. Antigen-gepulste APC wurden bestrahlt (10 Gy), und CD4+-T-Lymphocyten wurden in 105 pro Napf zugegeben. Eine proliferative Antwort der T-Zellen wurde anhand der Aufnahme von (3H)-Thymidin (1 μCi/Napf) gemessen, das am Tag 7 für 16–18 Stunden zugegeben wurde. Proliferationsassays wurden in Serum-und-Cytokin-freiem Medium in 5-Napf-Replikaten durchgeführt. Die Symbole stellen dar: -•- DC + HER-2/neu-Polypeptid + CD4+/CD45RA+-T-Zellen; -o- DC + CD4 +/CD45RA+ -T-Zellen; und -☐- DC + HER-2/neu-Polypeptid.
  • 2 zeigt die Antwort von CD4+-Zellen auf HER-2/neu-Polypeptid. Unter Verwendung des Priming-Assay, der für 1 beschrieben wird, wurden CD4+-T-Zellen aus normalen Spendern auf Antworten auf humanes rekombinantes HER-2/neu-Polypeptid getestet. Die Symbole bedeuten; -
    Figure 00050001
    - SC+CD4; und ...♦... SC+CD4+HER-2/neu-Polzpeptid. SC" bedeutet Stammzellen.
  • 3 zeigt, daß Ratten, die mit Ratten-HER-2/neu-Polypeptid immunisiert werden, Ratten-neu-spezifische Antikörper entwickeln. Ratten wurden mit rekombinantem Ratten-HER-2/neu-Polypeptid, 25 μg in MPL oder Vaccel-Adjuvans, immunisiert. Drei Immunisierungen wurden verabreicht, jeweils für 20 Tage getrennt. 20 Tage nach der letzten Immunisierung wurden Ratten auf Antikörperantworten gegenüber Ratten-neu getestet. Tiere, die mit Ratten-HER-2/neu-Polypeptid und dem Vaccel-Adjuvans immunisiert wurden, zeigten hochtitrige-Ratten-neu-spezifische Antworten. Die Kontrolle war ein Tier, das mit humanem HER-2/neu-Polypeptid (Fremdprotein) immunisiert worden war. In getrennten Experimenten entwickelten Ratten, die mit 100 μg und 300 μg an aufgereinigtem ganzem Ratten-neu immunisiert worden waren, keine nachweisbaren neu-spezifischen Antikörper (Daten nicht gezeigt). Die Daten zeigen den Mittelwert und die Standardabweichung von 3 Tieren. Die Symbole bedeuten: -
    Figure 00050002
    - Ratten-HER-2/neu-Polypeptid/MPL; ...•... Ratten-HER-2/neu-Polypeptid/Vaccel; ---☐--- MPL alleine; ---o--- Vaccel alleine; und ---
    Figure 00050003
    --- Kontrolle. „MPL" und „Vaccel" sind Adjuvantien (Ribi, Bozeman, MT, USA). „Neu" ist HER-2/neu-Protein.
  • 4 zeigt, daß Brustkrebspatienten eine präexistente Resistenz gegenüber HER-2/neu-Polypeptid haben. Patienten-PBMC wurde anhand von tritiertem Thymidineinbau in 24-Napf-Replikaten bewertet. Näpfe, die eine Antwort zeigten, werden als größer als der Mittelwert und 3 Standardabweichungen (372 cpm) der Kontrollnäpfe bewertet. Dieser HER-2/neu-positive, Stadium-II-Brustkrebspatient hat eine signifikante Antwort auf rekombinantes humanes HER-2/neu-Polypeptid. Die Symbole „p" stellen Peptide für HER-2/neu-Protein dar, „tt" stellt Tetanustoxoid dar, und „hHNP" stellt rekombinantes humanes HER-2/neu-Polypeptid dar.
  • Detaillierte Beschreibung der Erfindung
  • Vor Darstellung der Erfindung ist es möglicherweise für das Verständnis hilfreich, Definitionen bestimmter hiernach zu verwendender Begriffe darzulegen.
  • HER-2/neu-Polypeptid wie hierin verwendet, bezieht sich auf einen Teil des HER-2/neu-Proteins (das Protein, das ebenfalls als p185 oder als c-erbB2 bekannt ist) mit der Aminosäuresequenz von SED ID NO: 2 von Lysin, Aminosäure 676, bis Valin, Aminosäure 1255; und kann natürlichen Ursprungs, synthetisch hergestellt, gentechnisch hergestellt oder eine funktionelle äquivalente Variante davon sein, z.B. bei der eine oder mehrere Aminosäuren durch eine andere Aminosäure (andere Aminosäuren) oder Nicht-Aminosäure(n) ersetzt ist, die nicht wesentlich das Hervorrufen oder die Verstärkung einer Immunatwort auf HER-2/neu-Protein beeinträchtigen (z.B. eine Variante stimuliert eine Antwort durch Helfer-T-Zellen oder cytotoxischen T-Zellen).
  • Proliferation von T-Zellen – wie hierin verwendet, schließt die Multiplikation von T-Zellen ebenso wie die Stimulation von T-Zellen, die zur Multiplikation führt, ein, d.h. die Initiierung von Ereignissen, die zu Mitose führen, und der Mitose selbst. Verfahren zum Nachweis der Proliferation von T-Zellen werden unten diskutiert.
  • Wie oben bemerkt, ist die vorliegende Erfindung auf Verbindungen und Zusammensetzungen gerichtet, um die Immunität gegenüber dem Proteinprodukt, das durch das HER-2/neu-Oncogen exprimiert wird, hervorzurufen oder zu verstärken, einschließlich für bösartige Erkrankungen in einem warmblütigen Tier, bei der ein amplifiziertes HER-2/neu-Gen mit den bösartigen Erkrankungen assoziiert ist. Eine Assoziation eines amplifizierten HER-2/neu-Gens mit einer bösartigen Erkrankung erfordert nicht, daß das Proteinexpressionsprodukt des Gens auf dem Tumor vorhanden ist. Zum Beispiel kann eine Überexpression des Proteinexpressionsprodukts bei der Initiierung eines Tumors beteiligt sein, aber die Proteinexpression kann im folgenden verloren gehen. Eine Verwendung der vorliegenden Erfindung ist es, eine effektive autochthone Immunantwort hervorzurufen oder zu verstärken, um einen HER-2/neu-positiven Tumor in einen HER-2/neu-negativen umzuwandeln.
  • Genauer zeigt die Offenbarung der vorliegenden Erfindung in einem Aspekt, daß ein Polypeptid, basierend auf einem bestimmten Teil (HER-2/neu-Polypeptid) des Proteinexpressi onsprodukts des HER-2/neu-Gens, von Thymus-abhängigen Lymphocyten (hiernach „T-Zellen") erkannt werden kann, und deshalb kann die autochthone Immun-T-Zellantwort prophylaktisch verwendet werden oder um bösartige Erkrankungen zu behandeln, bei denen ein solches Protein überexprimiert wird oder worden ist. Die Offenbarung der vorliegenden Erfindung zeigt ebenso in einem anderen Aspekt, daß Nukleinsäuremoleküle, die die Expression eines solchen Peptids steuern, alleine oder in einem viralen Vektor für die Immunisierung verwendet werden können.
  • Im allgemeinen wird davon ausgegangen, daß CD4+-T-Zell-Population als Helfer/Inducer durch die Freisetzung von Lymphokinen bei Stimulation durch ein spezifisches Antigen funktionieren; jedoch kann eine Teilmenge der CD4+-Zellen als cytotoxische T-Lymphocyten (CTL) fungieren. In ähnlicher Weise wird davon ausgegangen, daß CD8+-T-Zellen so funktionieren, daß sie direkt antigene Ziele lysieren; jedoch können sie unter einer Vielzahl von Umständen Lymphokine sezernieren, um eine Helfer- oder DTH-Funktion bereitzustellen. Trotz des Potentials einer überlappenden Funktion sind die phänotypischen CD4- und CD8-Marker mit der Erkennung von Peptiden verknüpft, die an Klasse II- oder Klasse I-MHC-Antigene gebunden sind. Die Erkennung eines Antigens im Kontext von Klasse II- oder Klasse I-MHC erfordert, daß CD4+ und CD8+-T-Zellen auf unterschiedliche Antigene oder das selbe Antigen, präsentiert unter verschiedenen Umständen, antworten. Die Bindung von immunogenen Peptiden an Klasse-II-MHC-Antigene findet am häufigsten für Antigene statt, die durch Antigen-präsentierende Zellen aufgenommen worden sind. Deshalb erkennen CD4+-T-Zellen im allgemeinen Antigene, die außerhalb von Tumorzellen gewesen sind. Im Gegensatz dazu findet unter normalen Umständen eine Bindung von Peptiden an Klasse-I-MHC nur für Proteine statt, die im Cytosol vorliegen und durch das Ziel selbst synthetisiert werden, Proteine in der äußeren Umgebung sind ausgeschlossen. Eine Ausnahme hierzu ist die Bindung von exogenen Peptiden mit einem genauen Klasse-I-Bindungsmotiv, die außerhalb der Zelle in hoher Konzentration vorliegen. Daher haben CD4+- und CD8+-T-Zellen in breiter Weise unterschiedliche Funktionen und tendieren dazu, unterschiedliche Antigene zu erkennen, als eine Reflexion davon, wo die Antigene normalerweise vorliegen.
  • Wie in der vorliegenden Erfindung offenbart, wird ein Polypeptid-Teil des Proteinprodukts, das durch das HER-2/neu-Oncogen exprimiert wird, von T-Zellen erkannt. Zirkulierendes HER-2/neu-Polypeptid wird in Peptid-Fragmente abgebaut. Peptid-Fragmente aus dem Polypeptid binden an Haupthistocompatibilitätskomplex(MHC)-Antigene. Durch ein Präsentieren eines an das MHC-Antigen gebundenen Peptids auf der Zelloberfläche und Erkennung durch Wirt-T-Zellen der Kombination von Peptid plus Selbst-MHC-Antigen wird ein HER-2/neu-Polypeptid (einschließlich demjenigen, das auf einer malignen Zelle exprimiert wird) gegenüber T-Zellen immunogen. Die ausgewählte Spezifität des T-Zellrezeptors ermöglicht es einzelnen T-Zellen, zwischen Peptiden zu unterscheiden, die sich nur durch einen einzelnen Aminosäurerest unterscheiden.
  • Während der Immunantwort auf ein Peptidfragment des Polypeptids werden T-Zellen, die einen T-Zellrezeptor mit hoher Affinitätsbindung des Peptid-MHC-Komplexes exprimieren, an den Peptid-MHC-Komplex binden und werden dadurch aktiviert und zur Proliferation induziert. Beim ersten Zusammentreffen mit einem Peptid wird eine kleine Anzahl von Immun-T-Zellen Lymphokine sezernieren, proliferieren und sich in Effektor- und Gedächtnis-T-Zellen differenzieren. Die Haupt-Immunantwort wird in vivo stattfinden, ist aber schwierig in vitro nachzuweisen gewesen. Ein darauffolgendes Zusammentreffen mit dem selben Antigen durch die Gedächtnis-T-Zelle wird zu einer schnelleren und intensiveren Immunantwort führen. Die sekundäre Antwort wird entweder in vivo oder in vitro stattfinden. Die In-vitro-Antwort ist in leichter Weise quantifizierbar durch Messung des Grads an Proliferation, des Grads an Cytokin-Herstellung oder der Erzeugung einer cytolytischen Aktivität der T-Zell-Population, die in dem Antigen erneut ausgestellt wird. Eine substantielle Proliferation der T-Zell-Population in Antwort auf ein bestimmtes Antigen wird als ein Indikator für eine frühere Konfrontation oder ein Priming gegenüber dem Antigen angesehen.
  • Die Verbindungen dieser Erfindung umfassen im allgemeinen HER-2/neu-Polypeptide oder DNA-Moleküle, die die Expression solcher Peptide steuern, wobei die DNA-Moleküle in einem viralen Vektor vorliegen. Wie oben bemerkt, schließen die Polypeptide der vorliegenden Erfindung Varianten des Polypeptids von SEQ ID NO: 2 von Aminosäure 676 bis Aminosäure 1255 ein, die die Fähigkeit beibehalten, eine Immunantwort zu stimulieren. Solche Varianten schließen verschiedene strukturelle Formen des nativen Polypeptids ein. Aufgrund der Anwesenheit von ionisierbaren Amino- und Carboxylgruppen kann z.B. ein HER-2/neu-Polypeptid in der Form eines sauren oder basischen Salzes sein oder kann in neutraler Form sein. Einzelne Aminosäurereste können ebenso durch Oxidation oder Reduktion modifiziert sein.
  • Varianten innerhalb des Umfangs dieser Erfindung schließen ebenso Polypeptide ein, bei denen die primäre Aminosäurestruktur von nativem HER-2/neu-Polypeptid durch Bildung von kovalenten oder aggregativen Konjugaten mit anderen Peptiden oder Polypeptiden oder mit. chemischen Gruppen wie etwa Glycosylgruppen, Lipiden, Phosphat, Acetyl-Gruppen und Ähnlichem modifiziert ist. Kovalente Derivate können z.B. hergestellt werden durch Verknüpfen bestimmter funktioneller Gruppen an Aminosäureseitenketten oder an den N- oder C-Terminus.
  • Die vorliegende Erfindung schließt ebenfalls HER-2/neu-Polypeptide mit oder ohne Glycosylierung ein. Polypeptide, die in Hefe oder Säugetierexpressionssytemen exprimiert werden, können hinsichtlich des Molekulargewichts und des Glycosylierungsmusters nativen Molekülen ähnlich oder geringfügig unterschiedlich sein, abhängig von dem Expressionssystem. Zum Beispiel liefert eine Expression von DNA-kodierenden Polypeptiden in Bakterien, wie etwa E. coli, typischerweise nicht-glycosylierte Moleküle. N-Glycosylierungsstellen von eukaryotischen Proteinen sind durch das Aminosäuretriplett Asn-A1-Z charakterisiert, wobei A1 eine beliebige Aminosäure außer Pro ist, und Z Ser oder Thr ist. Varianten von HER-2/neu-Polypeptiden mit inaktivierten N-Glycosylierungsstellen können mit Techniken produziert werden, die Fachleuten auf dem Gebiet bekannt sind, wie etwa Oligonukleotid-Synthese und Ligation oder ortsspezifische Mutagenesetechniken, und liegen innerhalb des Umfangs dieser Erfindung. Alternativ können N-verknüpfte Glycosylierungsstellen an ein HER-2/neu-Polypeptid angehängt werden.
  • Die Polypeptide dieser Erfindung schließen ebenso Varianten des SEQ ID NO: 2-Polypeptids (d.h. Varianten eines Polypeptids mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2 von Aminosäure 676 bis Aminosäure 1255) ein, die eine Aminosäuresequenz haben, die sich von dieser Sequenz wegen einer oder mehrerer Deletionen, Insertionen, Substitutionen oder anderen Modifikationen unterscheiden. In einer Ausführungsform sind solche Varianten im wesentlichen homolog zu dem nativen HER-2/neu-Polypeptid und behalten die Fähigkeit bei, eine Immunantwort zu stimulieren. Eine „wesentliche Homologie", wie hierin verwendet, bezieht sich auf Aminosäuresequenzen, die durch DNA-Sequenzen kodiert werden, die in der Lage sind, unter moderat stringenten Bedingungen an eine Nukleotid-Sequenz zu hybridisieren, die mit einer natürlich vorkommenden DNA-Sequenz komplementär ist, die für den spezifizierten Polypeptid-Teil von SEQ ID NO: 2 hierin kodiert (d.h. Nukleotide 2026 bis 3765 von SEQ ID NO: 1). Geeignet moderat stringente Bedingungen schließen ein Vor-Waschen in einer Lö sung von 5 × SSC, 0,5% SDS, 1,0 mM EDTA (pH 8,0); Hybridisieren bei 50°C–65°C, 5 × SSC, über Nacht; gefolgt von zweimaligem Waschen bei 65°C für 20 Minuten mit jeweils 2 ×, 0,5 × und 0,2 × SSC (enthaltend 0,1% SDS) ein. Solche hybridisierenden DNA-Sequenzen sind ebenso innerhalb des Umfangs dieser Erfindung. Der Effekt von irgendwelchen solchen Modifikationen auf die Fähigkeit eines HER-2/neu-Polypeptids, eine Immunantwort zu erzeugen, kann in leichter Weise bestimmt werden (z.B. durch Analysieren der Fähigkeit des mutierten HER-2/neu-Polypeptids, eine T-Zell-Antwort zu induzieren, unter Verwendung von z.B. den hierin beschriebenen Verfahren.
  • Im allgemeinen können Aminosäuresubstitutionen in einer Vielzahl von Arten durchgeführt werden, um andere Ausführungsformen von Varianten innerhalb der vorliegenden Erfindung bereitzustellen. Als erstes können z.B. Aminosäuresubstitutionen konservativ gemacht werden; d.h. eine Austauschaminosäure ersetzt eine Aminosäure, die ähnliche Eigenschaften hat, so daß ein Fachmann der Peptidchemie erwarten würde, daß die Sekundärstruktur und Hydropathie-Eigenschaften des Polypeptids im wesentlichen unverändert bleiben. In allgemeinen stellen die folgenden Gruppen von Aminosäuren konservative Veränderungen dar; (1) ala, pro, gly, glu, asp, gln, asn, ser, thr; (2) cys, ser, tyr, thr; (3) val, ile, leu, met, ala, phe; (4) lys, arg, his; und (5) phe, tyr, trp, his. Ein Beispiel einer nicht-konservativen Veränderung ist das Ersetzen einer Aminosäure einer Gruppe mit einer Aminosäure von einer anderen Gruppe.
  • Eine weitere Art, um Aminosäuresubstitutionen durchzuführen, um Varianten der vorliegenden Erfindung zu erzeugen, ist es, Aminosäuren in T-Zellmotiven mit einem Potential, an Klasse-II-MHC-Moleküle (für eine CD4+-T-Zellenantwort) oder an Klasse-I-MHC-Moleküle (für eine CD8+-T-Zellenantwort) zu binden, zu identifizieren und zu ersetzen. Peptidsegmente (eines HER-2/neu-Polypeptids) mit einem Motiv mit einem theoretischen Potential, an Klasse-II-MHC-Moleküle zu binden, können mittels Computeranalyse identifiziert werden. Zum Beispiel kann ein Proteinsequenzanalysepaket, T Sites, das verschiedene Computeralgorithmen eingebaut hat, die darauf angelegt sind, potentielle Stellen für die T-Zell-Erkennung zu unterscheiden, verwendet werden (Feller and de la Cruz, Nature 349: 720–721, 1991). Zwei Suchalgorithmen werden verwendet: (1) der AMPHI-Algorithmus beschrieben von Margalit (Feller und de la Cruz, Nature 349: 720–721, 1991; Margalit et al., J. Immunol. 138: 2213–2229, 1987) identifiziert Epitopmotive entsprechend einer alpha-helicalen Periodizität und Amphipathizität; (2) der Rothbard- und Taylor-Algorithmus identifiziert Epitopmotive entsprechend dem Ladungs- und Polaritätsmuster (Rothbard und Taylor, EMBO 7: 93–100, 1988). Segmente mit beiden Motiven sind am geeignetsten für die Bindung an Klasse-II-MHC-Moleküle. CD8+-T-Zellen erkennen Peptide, gebunden an Klasse-I-MHC-Moleküle. Falk et al. haben herausgefunden, daß Peptide, die an bestimmte MHC-Moleküle binden, unterscheidbare Sequenzmotive gemeinsam haben (Falk et al., Nature 351: 290–296, 1991). Ein Peptidmotiv für die Bindung in der Furche von HLA-A2.1 ist mittels Edmann-Abbau von Peptiden definiert worden, die von HLA-A2.1-Molekülen einer kultivierten Zellinie (Tabelle 2 von Falk et al., oben) gestreift worden sind („stripped"). Das Verfahren identifizierte das typische oder durchschnittliche HLA-A2.1 Bindungspeptid dahingehend, daß es 9 Aminosäuren lang ist, wobei dominante Ankerreste an den Positionen 2 (L) und 9 (V) auftreten. Häufig vorkommende starke Bindungsreste sind an Positionen 2 (M), 4 (E, K), 6 (V) und 8 (K) identifiziert worden. Das identifizierte Motiv stellt den Durchschnitt von vielen Bindungspeptiden dar.
  • Das HLA-A2.1-beschränkte Motiv
    Figure 00110001
  • Das abgeleitete Peptidmotiv, wie gegenwärtig definiert, ist nicht besonders stringent. Einige HLA-A2.1-Bindungspeptide enthalten nicht beide dominanten Ankerreste und die Aminosäuren, die die dominanten Ankerreste flankieren, spielen wesentliche Rollen beim Ermöglichen oder Verhindern einer Bindung. Nicht jedes Peptid mit dem gegenwärtig beschriebenen Bindungsmotiv wird binden, und einige Peptide ohne das Motiv werden ebenfalls binden. Jedoch ist das gegenwärtige Motiv genügend gültig, um eine Identifizierung von einigen Peptiden zu ermöglichen, die zur Bindung in der Lage sind. Man beachte, daß das das gegenwärtige HLA-A2.1-Motiv 6 Aminosäuren zwischen die dominanten Anker-Aminosäuren an Resten 2 und 9 plaziert.
  • Nach der Identifizierung von Peptidmotiven innerhalb eines HER-2/neu-Polypeptids können Aminosäurensubstitutionen konservativ oder nicht-konservativ durchgeführt werden. Der letztere Typ an Substitutionen soll ein verbessertes Polypeptid erzeugen, das potenter und/oder in breiterer Weise kreuzreaktiv ist (MHC-Polymorphismus). Ein Beispiel für ein potenteres Polypeptid ist eines, das mit höherer Affinität an dasselbe MHC-Molekül wie ein natürliches Polypeptid bindet, ohne ein Erkennen durch T-Zellen, die für natürliches Polypeptid spezifisch sind, zu beeinträchtigen. Ein Beispiel für ein Polypeptid mit einer breiteren Kreuzreaktivität ist eines, das in breiterer Weise kreuzreaktive Immunantworten induziert, (d.h. an eine größere Vielzahl von MHC-Molekülen bindet) als das natürliche Polypeptid. In ähnlicher Weise können ein oder mehrere Aminosäuren, die zwischen Peptidmotiven liegen und eine Spacer-Funktion haben (die z.B. nicht mit einem MHC-Molekül oder einem T-Zellrezeptor Wechselwirken) konservativ oder nicht-konservativ substituiert werden. Es wird Fachleuten offensichtlich sein, daß Polypeptide, die ein oder mehrere Aminosäuresubstitutionen enthalten, auf vorteilhafte oder nachteilhafte immunologische Wechselwirkungen mit einer Vielzahl von Assays getestet werden können, einschließlich denjenigen, die hierin im Hinblick auf die Fähigkeit zur Stimulation der T-Zellerkennung beschrieben sind.
  • Varianten innerhalb des Umfangs dieser Erfindung können ebenso oder alternativ andere Modifikationen enthalten, einschließlich der Deletion oder Addition von Aminosäuren, die einen minimalen Einfluß auf die erwünschten immunologischen Eigenschaften des Polypeptids haben. Es wird von Fachleuten erkannt werden, daß trunkierte Formen oder nicht-native verlängerte Formen eines HER-2/neu-Polypeptids verwendet werden können, vorausgesetzt, daß die erwünschten immunologischen Eigenschaften wenigstens grob äquivalent mit denjenigen eines nativen HER-2/neu-Polypeptids voller Länge sind. Cysteinreste können deletiert oder durch andere Aminosäuren ersetzt werden, um eine Bildung von unkorrekten intramolekularen Disulfidbrücken bei der Renaturierung zu verhindern. Andere Ansätze für eine Mutagenese beinhalten die Modifizierung von angrenzenden dibasischen Aminosäureresten, um eine Expression in Hefesystemen zu verbessern, bei denen eine KEX2-Proteaseaktivität vorhanden ist.
  • Eine HER-2/neu-Polypeptid kann im allgemeinen unter Verwendung eines genomischen oder cDNA-Klons erhalten werden, der für das Protein kodiert. Eine genomische Sequenz, die für HER-2/neu in voller Länge kodiert, wird in SEQ ID NO: 1 gezeigt, und die abgeleitete Aminosäuresequenz wird in SEQ ID NO: 2 dargestellt. Solche Klone können durch Screenen einer geeigneten Expressionsbibliothek auf Klone isoliert werden, die HER-2/neu-Protein exprimieren. Die Bibliotheksherstellung und der Screen können im allgemeinen mit Verfahren durchgeführt werden, die Fachleuten auf dem Gebiet bekannt sind, wie etwa Verfahren, beschrieben in Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, N.Y. 1989, das hierin durch Bezugnahme aufgenommen wird. Kurz gesagt, kann eine Bakteriophagenexpressionsbibliothek ausplattiert und auf Filter übertragen werden. Die Filter können dann mit einem Nachweisreagenz inkubiert werden. Im Kontext dieser Erfindung ist ein „Nachweisreagenz" eine beliebige Verbindung, die in der Lage ist, an ein HER-2/neu-Protein zu binden, die dann mit einer Vielzahl von Mitteln nachgewiesen werden kann, die Fachleuten auf dem Gebiet bekannt sind. Typische Nachweisreagenzien enthalten ein „Bindungsmittel", wie etwa Protein A, Protein G, IgG oder ein Lectin, das an eine Reportergruppe gekoppelt ist. Bevorzugte Reportergruppen schließen Enzyme, Substrate, Co-Factoren, Inhibitoren, Farbstoffe, Radionuklide, lumineszente Gruppen, fluoreszierende Gruppen und Biotin ein. Bevorzugter ist die Reportergruppe Meerettichperoxidase, die durch Inkubation mit einem Substrat nachgewiesen werden kann, wie etwa Tetramethylbenzidin oder 2,2'-Azino-di-3-ethylbenzthiazolinsulfonsäure. Plaques, enthaltend genomische oder cDNA-Sequenzen, die HER-2/neu Protein exprimieren, werden mit Techniken isoliert und aufgereinigt, die Fachleuten auf dem Gebiet bekannt sind. Geeignete Verfahren können zum Beispiel in Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989 gefunden werden.
  • Varianten des Polypeptids, die die Fähigkeit beibehalten, eine Immunantwort zu stimulieren, können im allgemeinen durch Modifizieren der Sequenz in einem oder mehreren der oben beschriebenen Aspekte und durch Testen des resultierenden Polypeptids auf die Fähigkeit zur Stimulation einer Immunantwort, z.B. einer T-Zell-Antwort, identifiziert werden. Zum Beispiel können solche Assays im allgemeinen durchgeführt werden durch In-Kontakt-Bringen von T-Zellen mit dem modifizierten Polypeptid und durch Testen der Antwort. Natürlich vorkommende Varianten des Polypeptids können ebenso z.B. durch Screenen einer geeigneten cDNA- oder genomischen Bibliothek mit einer DNA-Sequenz isoliert werden, die für das Polypeptid oder eine Variante davon kodiert.
  • Die oben beschriebenen Sequenzmodifikationen können unter Verwendung von rekombinanten Standardtechniken oder mittels automatisierter Synthese des modifizierten Polypeptids eingeführt werden. Zum Beispiel können Mutationen an bestimmten Loci durch Synthetisieren von Oligonukleotiden eingeführt werden, die eine mutante Sequenz enthalten, flankiert von Restriktionsstellen, die eine Ligation an Fragmente der nativen Sequenz ermöglichen. Nach der Ligation kodiert die resultierende rekonstruierte Sequenz für ein Analog mit der erwünschten Aminosäureinsertion, -substitution oder -deletion.
  • Alternativ können Oligonukleotid-gesteuerte, ortsspezifische Mutageneseprozeduren verwendet werden, um ein Gen bereitzustellen, bei dem bestimmte Codons entsprechend der erforderlichen Substitution, Deletion oder Insertion verändert sind. Beispielhafte Methoden zum Durchführen der oben dargestellten Veränderungen werden offenbart von Walder et al., Gene 42: 133, 1986; Bauer et al., Gene 37: 73, 1985; Craik, BioTechniques, Januar 1985, 12–19; Smith et al., Genetic Engineering: Principles and Methods, Plenum Press, 1981; und US-Patente Nr. 4,518,584 und 4,737,462.
  • Mutationen in Nukleotidsequenzen, die zur Expression von solchen HER-2/neu-Polypeptiden konstruiert sind, müssen natürlich den Leserahmen der kodierenden Sequenz bewahren und werden bevorzugt keine komplementären Regionen erzeugen, die hybridisieren könnten, um sekundäre mRNA-Strukturen zu erzeugen, wie etwa Schleifen oder Haarnadeln, die die Translation der mRNA nachteilig beeinflussen würden. Obwohl eine Mutationsstelle vorher bestimmt sein kann, ist es nicht notwendig, daß die Natur der Mutation per se vorbestimmt ist. Zum Beispiel kann, um optimale Eigenschaften von Mutanten an einer gegebenen Stelle auszuwählen, eine Zufallsmutagenese am Zielcodon durchgeführt werden und die exprimierien HER-2/neu-Polypeptidmutanten auf die erwünschte Aktivität untersucht werden.
  • Nicht alle Mutationen in einer Nukleotidsequenz, die für ein HER-2/neu-Polypeptid kodiert, werden im Endprodukt exprimiert werden. Zum Beispiel können Nukleotidsubstitutionen gemacht werden, um die Expression zu verbessern, hauptsächlich um Sekundärstrukturschleifen in der transkribierten mRNA zu verhindern (siehe z.B. Europäische Patentanmeldung Nr. 75,444A), oder um Codons bereitzustellen, die in leichterer Weise durch den ausgewählten Wirt translatiert werden können, wie etwa die wohlbekannten E. coli-Präferenzkodons für die Expression in E. coli.
  • Die Polypeptide der vorliegenden Erfindung, sowohl natürlich vorkommend als auch modifiziert, werden bevorzugt mit rekombinanten DNA-Verfahren erzeugt. Solche Verfahren schließen das Inserieren einer DNA-Sequenz, die für ein HER-2/neu-Polypeptid kodiert, in einen rekombinanten Expressionsvektor und das Exprimieren der DNA-Sequenz in einem rekombinanten mikrobiellen, Säugetier- oder Insektenzell-Expressionssystem unter expressionsfördernden Bedingungen ein. DNA-Sequenzen, die für die Polypeptide kodieren, die durch diese Erfindung bereitgestellt werden, können aus cDNA-Fragmenten und kurzen Oligonukleotidlinkern zusammengesetzt werden oder aus einer Reihe von Oligonukleotiden, um ein synthetisches Gen bereitzustellen, das in der Lage ist, in einen rekombinanten Expressionsvektor eingebaut und in einer rekombinanten Transkriptionseinheit exprimiert zu werden.
  • Rekombinante Expressionsvektoren enthalten eine DNA-Sequenz, die für ein HER-2/neu Polypeptid kodiert, das mit geeigneten transkriptionellen oder translationalen regulatorischen Elementen verknüpft ist, die aus Säugetier-, mikrobiellen, viralen oder Insektengenen stammen. Solche regulatorischen Elemente schließen einen Transkriptionspromoter, eine fakultative Operatorsequenz zur Kontrolle der Transkription, eine Sequenz, die für geeignete mRNA-ribosomale Bindungsstellen kodiert, und Sequenzen ein, die die Termination der Transkription und Translation kontrollieren. Ein Replikationsursprung und ein selektierbarer Marker, um das Erkennen von Transformanten zu erleichtern, kann zusätzlich eingebaut sein.
  • DNA-Regionen sind in operabler Weise verknüpft, wenn sie funktionell miteinander in Beziehung stehen. Zum Beispiel wird DNA für ein Signalpeptid (sekretorischer Leader) in operabler Weise an eine DNA für ein Polypeptid geknüpft, wenn es als ein Vorläufer exprimiert wird, das bei der Sezernierung des Polypeptids teilnimmt; ein Promoter ist in operabler Weise mit einer kodierenden Sequenz verknüpft, wenn er die Transkription der Sequenz kontrolliert; oder eine Ribosomenbindungsstelle ist in operabler Weise mit einer kodierenden Sequenz verknüpft, wenn sie so positioniert ist, daß eine Translation ermöglicht wird. Im allgemeinen bedeutet in operabler Weise verknüpft aneinander angrenzend und, im Falle von sekretorischen Leaders, innerhalb des Leserahmens. DNA-Sequenzen, die für HER-2/neu Polypeptide kodieren, die in einem Mikroorganismus exprimiert werden sollen, werden bevorzugt keine Introns enthalten, die vorzeitig die Transkription der DNA in mRNA terminieren könnten.
  • Expressionsvektoren für eine bakterielle Verwendung können einen selektierbaren Marker und einen bakteriellen Replikationsursprung umfassen, abgeleitet aus kommerziell erhältlichen Plasmiden, umfassend genetische Elemente des gut bekannten Klonierungsvektors pBR322 (ATCC 37017). Solche kommerziellen Vektoren schließen zum Beispiel pKK223-3 (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Schweden) und pGEMI (Promega Biotec, Madison, WI, USA) ein. Diese pBR322 „Rückgrat" Abschnitte werden mit einem geeigneten Promoter und der zu exprimierenden strukturellen Sequenz kombiniert. E. coli wird typischerweise unter Verwendung von pBR322-Derivaten transformiert, einem Plasmid, das aus einer E. coli Spezies stammt (Bolivar et al., Gene 2: 95, 1977). pBR322 enthält Gene für eine Ampicillin- und Tetrazyklin-Resistenz und stellt damit ein einfaches Mittel zum Identifizieren von transformierten Zellen bereit.
  • Promotoren, die häufig bei rekombinanten mikrobiellen Expressionsvektoren verwendet werden, schließen das β-Lactamase (Penicillinase)- und Lactose-Promoter-Sytem (Chang et al., Nature 275: 615, 1987; und Goeddel et al., Nature 281: 544, 1979), das Tryptophan (trp)-Promoter-System (Goeddel et al., Nucl. Acids Res. 8: 4057, 1980; und Europäische Patentanmeldung 36,776) und den tac-Promoter (Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Seite 412, 1982) ein. Ein besonders nützliches bakterielles Expressionssystem verwendet den Phagen λ PL-Promoter und den cI857ts-thermolabilen Repressor. Plasmidvektoren, die von der American Type Culture Collection erhältlich sind, die Derivate des λ-PL-Promoter enthalten, schließen Plasmid pHUB2, das in E. coli Stamm JMB9 (ATCC 37092) vorkommt, und pPLc28 ein, das in E. coli RR1 (ATCC53082) vorkommt.
  • Geeignete Promotersequenzen in Hefevektoren schließen die Promotoren für Metallothionein, 3-Phosphoglyceratkinase (Hitzeman et al., J. Biol. Chem. 255: 2073, 1980) oder andere glycolytische Enzyme (Hess et al., J. Adv. Enzyme Reg. 7: 149, 1968; und Holland et al., Biochem. 17: 4900, 1978), wie etwa Enolase, Glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase, Hexokinase, Pyruvatdecarboxylase, Phosphofructokinase, Glucose-6-phosphatisomerase, 3-Phosphoglyceratmutase, Pyruvatkinase, Triosephosphatisomerase, Phosphoglucoseisomerase und Glucokinase ein. Geeignete Vektoren und Promotoren zur Verwendung in Hefeexpression werden weiter beschrieben in R. Hitzeman et al., Europäische Patentanmeldung Nr. 73,657.
  • Bevorzugte Hefevektoren können unter Verwendung von DNA-Sequenzen aus pBR322 für die Selektion und Replikation in E. coli (Ampr-Gen und Replikationsursprung) und Hefe-DNA-Sequenzen zusammengesetzt werden, einschließlich eines Glucose-reprimierbaren ADH2-Promoter und eines α-Faktor Sekretionsleader. Der ADH2-Promoter ist von Russell et al. beschrieben worden (J. Biol. Chem. 258: 2674, 1982) und Beier et al. (Nature 300: 724, 1982). Der Hefe-α-Faktor-Leader, der die Sekretion von heterologen Proteinen steuert, kann zwischen dem Promoter und dem zu exprimerenden strukturellen Gen inseriert werden (siehe z.B. Kurjan et al., Cell 30: 933, 1982; und Bitter et al., Proc Natl. Acad. Sci. USA 81: 5339, 1984). Die Leader-Sequenz kann modifiziert werden, so daß sie nahe ihrem 3'-Ende eine oder mehrere nützliche Restriktionsstellen enthält, um die Fusion der Leader-Sequenz an Fremdgene zu erleichtern. Die transkriptionellen und translationalen Kontrollsequenzen in Expressionsvektoren, die beim Transformieren von Vertebraten-Zellen verwendet werden sollen, können von viralen Quellen bereitgestellt werden.
  • Zum Beispiel stammen häufig verwendete Promotoren und Enhancers aus Polyoma, Adenovirus 2, Simian Virus 40 (SV 40), und humanem Cytomegalovirus. DNA-Sequenzen, die aus dem SV40-viralen Genom stammen, z.B. der SV40-Ursprung, Early- und Late-Promoter, Enhancer-, Splice-, und Polyadenylierungsstellen können verwendet werden, um die anderen genetischen Elemente bereitzustellen, die für die Expression einer heterologen DNA-Sequenz erforderlich sind. Die Early- und Late-Promotoren sind besonders nützlich, weil beide in leichter Weise aus dem Virus als ein Fragment erhalten werden, das ebenfalls den SV40-viralen Replikationsursprung enthält (Fiers et al., Nature 273: 113, 1978). Kleinere oder größere SV40-Fragmente können ebenso verwendet werden, vorausgesetzt, daß die näherungsweise 250 bp-Sequenz eingeschlossen ist, die sich von der HindIII-Stelle zu der Bgl-II-Stelle erstreckt, die sich in dem viralen Replikationsursprung befindet. Weiterhin können virale genomische Promotoren, Kontroll- und/oder Signalsequenzen verwendet werden, vorausgesetzt, daß solche Kontrollsequenzen mit der ausgewählten Wirtszelle kompatibel sind. Beispielhafte Vektoren können konstruiert werden wie von Okayama und Berg, Mol. Cell. Biol. 3: 280, 1983, offenbart.
  • Ein nützliches System für eine stabile Expression in hohen Konzentrationen von Säugetier-Rezeptor-cDNAs in C127-murinen Mammaepithelzellen kann konstruiert werden, wie im wesentlichen von Cosman et al. (Mol. Immunol. 23: 935, 1986) beschrieben. Ein bevorzugter eukaryotischer Vektor für die Expression von LbeIF4A-Protein-DNA ist pDC406 (McMahan et al., EMBO J. 10: 2821, 1991) und schließt regulatorische Sequenzen ein, die aus SV40, humanem Immunschwächevirus (HIV) und Epstein-Barr-Virus (EBV) stammen. Andere bevorzugte Vektoren schließen pDC409 und pDC410 ein, die aus pDC406 stammen. pDC410 stammte aus pDC406 durch Substituieren des EBV-Replikationsursprungs mit Sequenzen, die für das SV40-Large-T-Antigen kodieren. pDC409 unterscheidet sich von pDC406 dahingehend, daß eine Bgl-II-Restriktionsstelle außerhalb der vielfachen Klonierungsstelle deletiert worden ist, was die Bgl-II-Stelle innerhalb der multiplen Klonierungstelle einzigartig macht.
  • Eine nützliche Zelllinie, die eine episomale Replikation der Expressionsvektoren ermöglicht, wie etwa pDC406 und pDC409, die den EBV-Replikationsursprung enthalten, ist CV-1/EBNA (ATTCC CRL 10478). Die CV-L/EBNA-Zelllinie wurde mittels Transfektion der CV-1-Zelllinie mit einem Gen erhalten, das für das Epstein-Barr-Virus-Kern-Antigen-I (EBNA-1) kodiert, und durch konstitutives Exprimieren von EBNA-1, angetrieben von einem humanen CMV-immediate-early-Enhancer/Promoter.
  • Transformierte Wirtszellen sind Zellen, die mit Expressionsvektoren transformiert oder transfiziert worden sind, die konstruiert wurden unter Verwendung von rekombinanten DNA-Techniken und die Sequenzen enthalten, die für ein HER-2/neu-Polypeptid der vorliegenden Erfindung kodieren. Transformierte Wirtszellen können das erwünschte HER-2/neu-Polypeptid exprimieren, aber Wirtszellen, die für Zwecke des Klonierens oder Amplifizierens von HER-2/neu-DNA transformiert worden sind, müssen das HER-2/neu-Polypeptid nicht exprimieren. Exprimierte Polypeptide werden bevorzugt in den Kulturüberstand sezerniert werden, abhängig von der ausgewählten DNA, können aber ebenso in der Zellmembran abgelagert werden.
  • Geeignete Wirtszellen für die Expression von rekombinanten Proteinen schließen Prokaryoten, Hefe oder höhere eukaryotische Zellen unter der Kontrolle von geeigneten Promotoren ein. Prokaryoten schließen Gram-negative oder Gram-positive Organismen, z.B. E. coli oder Bacilli, ein. Höhere eukaryotische Zellen schließen etablierte Zelllinien aus Insekten oder Säugetieren, wie unten beschrieben, ein. Zellfreie Translationssysteme können ebenso verwendet werden, um HER-2/neu-Polypeptide zu erzeugen, unter Verwendung von RNAs, die aus DNA-Konstrukten stammen. Geeignete Klonierungs- und Expressionsvektoren zur Verwendung mit bakteriellen, Pilz-, Hefe- und Säugetierzell-Wirten werden z.B. beschrieben von Pouwels et al., Cloning Vectors: A Laboratory Manual, Elsevier, New York, 1985.
  • Prokaryotische Expressionswirte können zur Expression von HER-2/neu-Polypeptiden verwendet werden, die keine extensive proteolytische und Disulfid-Verarbeitung erfordern. Prokaryotische Expressionsvektoren umfassen im allgemeinen einen oder mehrere phänotypische selektierbare Marker z.B. ein Gen, das für Proteine kodiert, die eine Antibiotikaresistenz verleihen oder ein autotrophes Erfordernis liefern, und einen Replikationsursprung, der vom Wirt erkannt wird, um eine Amplifikation innerhalb des Wirts sicherzustellen. Geeignete prokaryotische Wirte zur Transformation schließen E. coli, Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium und verschiedene Spezies innerhalb der Genera Pseudomonas, Streptomyces und Staphylococcus ein, obwohl andere Wirte ebenso verwendet werden können.
  • Rekombinante HER-2/neu-Polypeptide können ebenso in Hefewirten exprimiert werden, bevorzugt aus der Saccharomyces-Spezies, wie etwa S. Cerevisiae. Hefe von anderen Genera, wie etwa Pichia oder Kluyveromyces, können ebenso verwendet werden. Hefevektoren werden im allgemeinen einen Replikationsursprung aus dem 2 μ-Hefeplasmid oder einer autonom replizierenden Sequenz (ARS), einen Promoter, DNA- die für das HER-2/neu-Polypeptid kodiert, Sequenzen für die Polyadenylierung und Transkriptionstermination und ein Selektionsgen enthalten. Bevorzugt werden Hefevektoren einen Replikationsursprung enthalten und auswählbare Marker, die die Transformation von sowohl Hefe als auch E. coli ermöglichen, z.B. das Ampicillinresistenzgen von E. coli und das S. Cerevisiae-trp1-Gen, das einen Selektionsmarker für einen mutanten Hefestamm bereitstellt, dem die Fähigkeit fehlt, in Tryptophan zu wachsen, und einen Promoter, der aus einem stark exprimierten Hefegen stammt, um die Transkription einer strukturellen Sequenz stromabwärts zu induzieren. Die Anwesenheit der trp1-Läsion in dem Hefe-Wirtszellgenom stellt dann eine effektive Umgebung zum Nachweis der Transformation durch Wachstum in der Abwesenheit von Tryptophan bereit.
  • Geeignete Hefetransformationsprotokolle sind Fachleuten auf dem Gebiet bekannt. Eine beispielhaft Technik, beschrieben von Hind et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75/1929, 1978), beinhaltet, das Selektionieren auf Trp+-Transformanten in einem selektiven Medium, bestehend aus 0,67% Hefe-Stickstoffbase, 0,5% Casamino-Säuren, 2% Glucose, 10 mg/ml Adenin und 20 mg/ml Uracil. Wirtstämme, die durch Vektoren transformiert sind, umfassend den ADH2-Promotor, können zur Expression in einem reichen Medium wachsen gelassen werden, bestehend aus 1% Hefeextrakt, 2% Pepton und 1% Glukose, supplementiert mit 80 mg/ml Adenin und 80 mg/ml Uracil. Die Derepression des ADH2-Promoter findet nach Aufbrauchen der Glukose im Medium statt. Rohe Hefeüberstände werden mittels Filtration geerntet und bei 4°C vor der weiteren Aufreinigung gehalten.
  • Verschiedene Säugetier- oder Insekten- (z.B. Spodoptera oder Trichoplusia) – Zellkultursysteme können ebenso verwendet werden, um rekombinantes Polypeptid zu exprimieren. Baculovirussysteme zur Produktion von heterologen Polypeptiden in Insektenzellen werden z.B. in einem Review-Artikel von Luckow und Summers behandelt, Bio/Technology 6: 47, 1988. Beispiele für geeignete Säugetier-Wiriszellinien schließen die COS-7-Linien von Affennierenzellen, beschrieben von Gluzman (Cell 23: 175, 1981), und andere Zelllinien ein, die in der Lage sind, einen geeigneten Sektor zu exprimieren, einschließlich z.B. CV-1/EBNA (ATTC CRL 10478), L-Zellen, C127, 3T3, Chinesische Hamstereierstock (CHO), COS, NS-1, HeLa und BHK-Zelllinien. Säugetierexpressionsvektoren können nicht-transkribierie Elemente umfassen, wie etwa einen Replikationsursprung, einen geeigneten Promoter und Enhancer, verknüpft mit dem zu exprimierenden Gen, und andere 5'- oder 3'-flankierende, nicht-transkribierie Sequenzen, und 5'- oder 3'-nicht-translatierie Sequenzen, wie etwa notwendige Ribosomen-Bindungsstellen, eine Polyadenylierungstelle, Splice-Donor- und -Akzeptor-Stellen und transkriptionale Terminationssequenzen.
  • Aufgereinigte HER-2/neu-Polypeptide können hergestellt werden durch Kultivieren von geeigneten Wiris/Vektorsystemen, um die rekombinanten Translationsprodukte der DNAs der vorliegenden Erfindung zu exprimieren, die dann aus Kulturmedien oder Zellextrakten aufgereinigt werden. Zum Beispiel können Überstände aus Systemen, die rekombinantes Polypeptid in Kulturmedien sezernieren, zuerst unter Verwendung eines kommerziell erhältlichen Proteinkonzentrationsfilters aufkonzentriert werden, wie etwa einer Amicon- oder Millipore-Pellicon-Ultrafiltrationseinheit. Nach dem Konzentrationsschritt kann das Konzentrat auf eine geeignete Aufreinigungsmatrix aufgebracht werden. Zum Beispiel kann eine geeignete Affinitätsmatrix ein Gegenstrukturprotein (d.h. ein Protein, an das ein HER-2/neu-Polypeptid in einer spezifischen, strukturbasierenden Wechselwirkung bindet) oder Lectin oder ein Antikörpermolekül umfassen, das an einen geeigneten Träger gebunden ist. Alternativ kann ein Anionenaustauschharz verwendet werden, z.B. eine Matrix oder ein Substrat mit anhängenden Diethylaminoethylgruppen (DEAE). Die Matrices könne Acrylamid, Agarose, Dextran, Zellulose oder andere Typen sein, die häufig bei der Proteinaufreinigung verwendet werden. Alternativ kann ein Kationenaustauschschritt verwendet werden. Geeignete Kationenaustauscher schließen verschiedene unlösliche Matricen ein, umfassend Sulfopropyl- oder Carbo xymethyl-Gruppen. Sulfopropylgruppen werden bevorzugt. Gelfiltrationschromatographie stellt ebenso ein Mittel zum Aufreinigen eines HER-2/neu bereit.
  • Affinitätschromatographie ist ein bevorzugtes Verfahren zum Aufreinigen von HER-2/neu-Polypeptiden. Zum Beispiel können monoklonale Antikörper gegen das HER-2/neu-Polypeptid ebenso in Affinitätschromatographieaufreinigung nützlich sein, durch Verwendung von Verfahren, die auf dem Gebiet gut bekannt sind.
  • Schließlich können ein oder mehrere Umkehrphasen-Hochleistungschromatographieschritte (RP-HPLC) angewandt werden, die hydrophobe RP-HPLC-Medien, (z.B., Silicagel mit anhängenden Methyl- oder anderen aliphatischen Gruppen) verwenden, um eine HER-2/neu-Polypeptidzusammensetzung weiter aufzureinigen. Einige oder alle der vorhergehenden Aufreinigungsschritte in verschieden Kombinationen können ebenso verwendet werden, um ein homogenes rekombinantes Polypeptid bereitzustellen.
  • Rekombinantes HER-2/neu-Polypeptid, das in bakterieller Kultur erzeugt wird, wird bevorzugt durch anfängliche Extraktion aus Zellpellets isoliert, gefolgt von einem oder mehreren Konzentrations-, Aussalzungs-, wäßrigen Ionenaustausch- oder Größenausschlußchromatographieschritten. Hochleistungsflüssigchromatographie (HPLC) kann für letzte Aufreinigungsschritte verwendet werden. Microbielle Zellen, die bei der Expression von rekombinantem LbeIF4A-Proteinen verwendet werden, können mit einem beliebigen herkömmlichen Verfahren aufgebrochen werden, einschließlich Einfrier-Auftau-Cyclen, Beschallung, mechanischer Zerstörung oder der Verwendung von Zell-Lyse-Mitteln.
  • Die Fermentation von Hefe, die HER-2/neu-Polypeptid als ein sezerniertes Protein exprimiert, vereinfacht die Aufreinigung in starker Weise. Sezerniertes rekombinantes Protein, das aus einer Fermentation in großem Maßstab resultiert, kann mit Verfahren aufgereinigt werden, die denjenigen analog sind, die von Urdal et al. offenbart werden (J. Chromatog. 296: 171, 1984). Diese Literaturstelle beschreibt zwei sequentielle Umkehrphasen-HPLC-Schritte zur Aufreinigung von rekombinantem humanem GM-CSF auf einer präparativen HPLC-Säule.
  • Zubereitungen von HER-2/neu-Polypeptiden, die in rekombinanter Kultur synthetisiert worden sind, können Zellbestandteile enthalten, die nicht HER-2/neu sind, einschließlich Proteinen, in Mengen und einer Art, die von den unternommenen Aufreinigungsschritten abhängen, um das HER-2/neu-Polypeptid aus der Kultur zu gewinnen. Diese Bestandteile werden üblicherweise aus Hefe, Prokaryoten oder nicht-humanen Eukaryoten stammen. Solche Zubereitungen sind üblicherweise frei von anderen Proteinen, die normalerweise mit dem HER-2/neu-Protein assoziiert sind, wie es normalerweise in der Natur in seiner üblichen Spezies gefunden wird.
  • Eine automatisierte Synthese bietet ein alternatives Verfahren zum Herstellen von Polypeptiden dieser Erfindung. Zum Beispiel kann eine der kommerziell erhältlichen Festphasentechniken verwendet werden, wie etwa das Festphasensyntheseverfahren nach Merrifield, bei dem Aminosäuren sequentiell an eine wachsende Aminosäurenkette angehängt werden. (Siehe Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 852149-2146, 1963). Die Ausrüstung für eine automatisierte Synthese von Polypeptiden ist kommerziell erhältlich von Herstellern, wie etwa Applied Biosystems, Inc., aus Foster City, CA, und können im allgemeinen gemäß den Anweisungen des Herstellers betrieben werden.
  • In einem Aspekt der vorliegenden Erfindung kann die Verwendung eines HER-2/neu-Polypeptids (oder eines DNA-Moleküls, das die Expression eines solchen Peptids steuert), um eine Immunantwort auf das HER-2/neu-Protein zu erzeugen (einschließlich demjenigen, das bei einer bösartigen Erkrankung exprimert wird, bei der ein HER-2/neu-Oncogen assoziiert ist), nachgewiesen werden. Repräsentative Beispiele für solche bösartigen Erkrankungen schließen Brust-, Ovarial-, Colon-, Lungen- und Prostatakrebse ein. Eine Immunatwort auf das HER-2/neu-Protein, wenn sie von einem HER-2/neu-Polypeptid erzeugt worden ist, kann langlebig sein und kann lange nach einer Immunisierung nachgewiesen werden, unabhängig davon, ob das Protein im Körper zum Zeitpunkt des Testens anwesend oder abwesend ist. Eine Immunantwort auf das HER-2/neu-Protein, erzeugt durch Reaktion auf ein HER-2/neu-Polypeptid, kann durch Untersuchen auf Anwesenheit oder Abwesenheit oder durch eine Verstärkung der spezifischen Aktivierung von CD4+- oder CD8+-T-Zellen nachgewiesen werden. Genauer werden T-Zellen, die aus einem immunisierten Individuum mit Routinetechniken isoliert worden sind (wie etwa mittels Ficoll/Hypaque-Dichtegradientenzentrifugation von peripheren Blutlymphocyten), mit HER-2/neu-Protein inkubiert. Zum Beispiel können T-Zellen in vitro für 2–9 Tage (typischerweise 4 Tage) bei 37°C mit HER-2/neu-Protein inkubiert werden (typischerweise 5 μg/ml des ganzen Proteins oder eine bemessene Anzahl an Zellen, die HER-2/neu-Protein synthetisieren). Es mag wünschenswert sein, ein weiteres Ali quot einer T-Zellprobe in der Abwesenheit von HER-2/neu-Protein zu inkuzieren, um als eine Kontrolle zu dienen.
  • Eine spezifische Aktivierung von CD4+- oder CD8+-T-Zellen kann in einer Vielzahl von Arten nachgewiesen werden. Verfahren zum Nachweisen von einer spezifischen T-Zell-Aktivierung schließen den Nachweis der Proliferation von T-Zellen, die Produktion von Cytokinen (z.B. Lymphokinen) oder die Erzeugung von cytolytischer Aktivität (d.h. Erzeugung von cytotoxischen T-Zellen, die für HER-2/neu-Protein spezifisch sind) ein. Für CD4+-T-Zellen ist ein bevorzugtes Nachweisverfahren spezifischer T-Zell-Aktivierung der Nachweis der Proliferation von T-Zellen. Für CD8+-T-Zellen ist ein bevorzugtes Nachweisverfahren spezifischer T-Zellen-Aktivierung der Nachweis der Erzeugung von cytolytischer Aktivität.
  • Der Nachweis der Proliferation von T-Zellen kann mit einer Vielzahl von bekannten Techniken erreicht werden. Zum Beispiel kann eine T-Zellproliferation durch Messen der DNA-Syntheserate nachgewiesen werden. T-Zellen, die stimuliert worden sind, um zu proliferieren, weisen eine erhöhte DNA-Syntheserate auf. Ein typischer Weg, um die DNA-Syntheserate zu messen, ist z.B. das Puls-Markieren von T-Zellkulturen mit tritiiertem Thymidin, einem Nukleosid-Vorläufer, der in neu-synthetisierte DNA eingebaut wird. Die Menge an tritiiertem Thymidin, die eingebaut ist, kann unter Verwendung eines Flüssig-Scintillations-Spectrophotometers bestimmt werden. Andere Arten, um eine T-Zellproliferation nachzuweisen, schließen das Messen von Zunahmen der Interleukin-2 (IL-2)-Produktion, des Ca2+-Flusses oder der Farbstoffaufnahme, wie etwa 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium ein. Alternativ kann eine Synthese von Lymphokinen (wie etwa Interferon-Gamma) gemessen werden, oder die relative Anzahl von T-Zellen, die auf intaktes p185HER-2/neu-Protein antworten können, kann quantifiziert werden.
  • Durch Verwendung oder Expression eines HER-2/neu-Polypeptids können T-Zellen, die das HER-2/neu-Protein erkennen, in vivo proliferiert werden. Zum Beispiel kann ein Medikament zur Immunisierung mit einem HER-2/neu-Peptid (d.h. als ein Vaccin) eine kontinuierliche Expansion in der Anzahl von T-Zellen induzieren, die für einen therapeutischen Angriff gegen einen Tumor notwendig sind, bei dem das HER-2/neu-Oncogen assoziiert ist. Typischerweise werden ungefähr 0,01 μg/kg bis ungefähr 100 mg/kg Körpergewicht auf intradermale, subkutane oder intravenöse Route verabreicht. Eine bevorzugte Dosierung ist ungefähr 1 μg/kg bis 1 mg/kg, wobei ungefähr 5 μg/kg bis ungefähr 200 μg/kg besonders bevorzugt sind.
  • Es wird Fachleuten klar sein, daß die Anzahl und Frequenz der Verabreichung von der Antwort des Patienten abhängen wird. Es kann wünschenswert sein, das HER-2/neu-Polypeptid repetitiv zu verabreichen. Es wird für Fachleute klar sein, daß mehr als 1 HER-2/neu-Polypeptid verabreicht werden kann, entweder simultan oder sequentiell. Bevorzugte Peptide zur Verwendung in einem Medikament zur Immunisierung sind diejenigen, die die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2, beginnend bei ungefähr dem Lysinrest bei Aminosäureposition 676 und sich erstreckend bis ungefähr zu dem Valinrest bei Aminosäureposition 1255, einschließen. Es wird von Fachleuten erkannt werden, daß die vorliegende Erfindung die Verwendung eines intakten HER-2/neu-Polypeptids ebenso wie eine Aufteilung eines solchen Polypeptids in eine Vielzahl von Peptiden in Erwägung zieht. Weder intaktes p185HER-2/neu-Protein noch ein Peptid mit der Aminsäuresequenz seiner ganzen extrazellulären Domäne (d.h. einem Peptid mit einer Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2 von Aminosäureposition 1 bis Aminosäureposition 650, ± ungefähr 1–5 Positionen, und mit oder ohne die ersten 21 Aminosäurepositionen) werden alleine zur Immunisierung verwendet.
  • Ein HER-2/neu-Polypeptid (oder Nukleinsäure) wird bevorzugt zur Verwendung in den obigen Verfahren als eine pharmazeutische Zusammensetzung formuliert (z.B. Vaccin). Pharmazeutische Zusammensetzung umfassen im allgemeinen ein oder mehrere Polypeptide in Kombination mit einem pharmazeutisch akzeptablen Träger, Bindemittel oder Verdünnungsmittel. Solche Träger werden gegenüber Empfängern in den verwendeten Dosierungen und Konzentrationen nicht-toxisch sein Die Verwendung eines HER-2/neu-Polypeptids in Verbindung mit chemotherapeutischen Mitteln wird ebenso in Erwägung gezogen.
  • Zusätzlich zu dem HER-2/neu-Polypeptid (das als ein Antigen funktioniert), kann es wünschenswert sein, andere Bestandteile in dem Vaccin einzuschließen, wie etwa einen Träger für die Antigenabgabe und immunstimulatorische Substanzen, die darauf angelegt sind, die Immunogenizität des Proteins zu verbessern. Beispiele für Träger zur Antigenabgabe schließen Aluminiumsalze, Wasser-in-Öl-Emulsionen, bio-abbaubare Ölträger, Öl-in-Wasser-Emulsionen, bio-abbaubare Microkapseln und Liposomen ein. Beispiele für immunstimulatorische Substanzen (Adjuvantien) schließen N-Acetylmuramyl-L-Alanin-D-Isoglutamin (MDP), Lipopolysaccharide (LPS), Glucan, IL-12, GM-CSF, Gamma-Interferon und IL-15 ein. Es wird Fachleuten klar sein, daß ein HER-2/neu-Polypeptid zur Verwendung als ein Vaccin synthetisch hergestellt oder aus natürlichem Ursprung gewonnen werden kann.
  • Während ein beliebiger geeigneter Träger, der Fachleuten auf dem Gebiet bekannt ist, bei den pharmazeutischen Zusammensetzungen dieser Erfindung verwendet werden kann, wird der Typ des Trägers in Abhängigkeit von dem Verabreichungsmodus und davon, ob eine verzögerte Freisetzung erwünscht ist, variieren. Für eine parenterale Verabreichung, wie etwa eine subkutane Injektion, umfaßt der Träger bevorzugt Wasser, Salzlösung, Alkohol, ein Fett, ein Wachs oder einen Puffer. Für eine orale Verabreichung kann ein beliebiger der obigen Träger oder einen fester Träger wie etwa Mannitol, Lactose, Stärke, Magnesiumstearat, Natriumsaccharin, Talkum, Zellulose, Glukose, Sacharose und Magnesiumcarbonat, verwendet werden. Bio-abbaubare Microsphären (z.B. Polymilchsäuregalaktid) können ebenso als Träger für die pharmazeutischen Zusammensetzungen dieser Erfindung verwendet werden. Geeignete bioabbaubare Microsphären werden z.B. in US-Patent Nr. 4,897,268 und 5,075,109 offenbart.
  • Ein HER-2/neu-Polypeptid kann in der bioabbaubaren Mikrosphäre verkapselt oder mit der Oberfläche der Mikrosphäre assoziiert sein. Zum Beispiel wird in einer bevorzugten Ausführungsform ein Polypeptid mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2 von Aminosäure 76 bis Aminosäure 1255 innerhalb einer bioabbaubaren Mikrosphäre verkapselt. In dieser Hinsicht ist es bevorzugt, daß die Mikrosphäre größer als näherungsweise 25 Mikron ist.
  • Pharmazeutische Zusammensetzungen (einschließlich Vakzinen) können ebenso Verdünnungsmittel, wie etwa Puffer, Antioxidantien, wie etwa Ascorbinsäure, Polypeptide mit niedrigem Molekulargewicht (weniger als ungefähr 10 Reste), Proteine, Aminosäuren, Kohlenhydrate, einschließlich Glucose, Saccharose oder Dextrine, chelierende Mittel, wie etwa EDTA, Glutathion und andere Stabilisatoren und Bindemittel enthalten. Neutral-gepufferte Salzlösungen oder Salzlösungen, die mit nicht-spezifischem Serumalbumin gemischt sind, sind beispielhafte geeignete Verdünnungsmittel. Bevorzugt wird das Produkt als ein Lyophilisat unter Verwendung von geeigneten Bindemittellösungen (z.B. Saccharose) als Verdünnungsmittel formuliert.
  • Als eine Alternative zur Präsentation von HER-2/neu-Polypeptiden schließt die vorliegende Erfindung Zusammensetzungen ein, die in der Lage sind, Nukleinsäuremoleküle, die für ein HER-2/neu-Polypeptid kodieren, abzugeben. Solche Zusammensetzungen schließen rekombinante virale Vektoren (z.B. Retroviren (siehe WO 90/07936, WO 91/02805, WO 93/25234, WO 93/25698 und WO 94/03622), Adenovirus (siehe Berkner, Biotechniques, 6: 616–627, 1988; Li et al., Hum. Gene Ther. 4: 403–409, 1993; Vincent et al., Nat. Genet. 5: 130–134, 1993; und Kolis et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 215–219, 1994), Pockenvirus (siehe US- Patent Nr. 4,769,330, US-Patent Nr. 5,017,487 und WO 89/01973)), nackte DNA (siehe WO 90/11092), Nukleinsäuremoleküle, die mit einem polykationischen Molekül komplexiert sind (siehe WO 93/03709), und Nukleinsäure, die mit Liposomen assoziiert ist (siehe Wang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 7851, 1987) ein. In bestimmten Ausführungsformen kann die DNA mit abgetötetem oder inaktiviertem Adenovirus verknüpft sein (siehe Curiel et al., Hum. Gene Ther. 3: 147–154, 1992; Cotton et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 6094, 1992). Andere geeignete Zusammensetzungen schließen DNA-Ligand (siehe Wu et al., J. Biol. Chem. 264: 16985–16987, 1989) und Lipid-DNA-Kombinationen (siehe Felgner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 7413–7417, 1989) ein. Zusätzlich kann die Effizienz der Aufnahme von nackter DNA in Zellen durch Auftragen der DNA auf bioabbaubare Kügelchen erhöht werden.
  • Zusätzlich zu direkten in-vivo-Prozeduren können ex-vivo-Prozeduren verwendet werden, bei denen Zellen einem Tier entnommen, modifiziert und in dasselbe oder ein anderes Tier eingebracht werden. Es wird klar sein, daß man eine der obigen aufgeführten Zusammensetzungen zum Einführen von HER-2/neu-Nukleinsäuremolekülen in Gewebezellen in einem ex-vivo-Kontext verwenden kann. Protokolle für virale, physikalische und chemische Aufnahmeverfahren sind auf dem Gebiet gut bekannt.
  • Entsprechend ist die vorliegende Erfindung zum Verbessern oder Auslösen einer zellulären Immunantwort in einem Patienten oder einer Zellkultur nützlich (z.B. die Erzeugung von Antigen-spezifischen cytolytischen T-Zellen). Wie hierin verwendet, bezieht sich der Begriff „Patient" auf jedes warmblütige Tier, bevorzugt einen Menschen. Ein Patient kann von Krebs betroffen sein, wie etwa Brustkrebs, oder kann normal sein (d.h. frei von nachweisbarer Erkrankung und Infektion). Eine „Zellkultur" ist eine Zubereitung von T-Zellen oder isolierten Bestandteilzellen (einschließlich, aber nicht beschränkt auf Makrophagen, Monocyten, B-Zellen und dendritischen Zellen). Solche Zellen können mit einer aus einer Vielzahl von Techniken isoliert werden, die Fachleuten auf dem Gebiet wohlbekannt sind (wie etwa Ficoll-Hypaque-Dichte-Zentrifugation). Die Zellen können (müssen aber nicht) aus einem Patienten isoliert worden sein, der von einer mit HER-2/neu-assoziierten bösartigen Erkrankung betroffen ist, und können in einen Patienten nach der Behandlung erneut eingeführt werden.
  • Die vorliegende Erfindung offenbart ebenso, daß HER-2/neu-Polypeptid zusätzlich dazu, daß es gegenüber T-Zellen immunogen ist, B-Zellen zu stimulieren scheint, um Antikörper zu erzeugen, die in der Lage sind, HER-2/neu-Polypeptid zu erkennen. Antikörper, die für HER-2/neu-Protein spezifisch sind (d.h., die eine Bindungsaffinität von ungefähr 107 Liter/Mol oder besser aufweisen), können in einer Vielzahl von Körperflüssigkeiten gefunden werden, einschließlich Seren und Ascites. Kurz gesagt, wird eine Körperflüssigkeitsprobe aus einem warmblütigen Tier, wie etwa einem Menschen, isoliert, für den es wünschenswert ist, zu bestimmen, ob Antikörper vorhanden sind, die für HER-2/neu-Polypeptid spezifisch sind. Die Körperflüssigkeit wird mit HER-2/neu-Polypeptid unter Bedingungen und für eine Zeit inkubiert, die ausreicht, um die Bildung von Immunkomplexen zwischen dem Polypeptid und den für das Protein spezifischen Antikörpern zu ermöglichen. Zum Beispiel kann eine Körperflüssigkeit und HER-2/neu-Polypeptid bei 4°C für 24–48 Stunden inkubiert werden. Nach Inkubation wird die Reaktionsmischung auf die Anwesenheit von Immunkomplexen getestet. Der Nachweis von einem oder mehreren Immunkomplexen, der sich zwischen HER-2/neu-Polypeptid und für HER-2/neu-Polypeptid-spezifischen Antikörpern gebildet hat, kann durch eine Vielzahl von bekannten Techniken erreicht werden, wie etwa Radioimmunassays (RIA) und Enzym-verknüpfte immunsorbierende Assays (ELISA).
  • Geeignete Immunoassays schließen die doppel-monoklonale-Antikörper-Sandwich-Immunassay-Technik von David et al. (US-Patent 4,376,110), monoklonal-polyklonal-Antikörper-Sandwich-Assays (Wide et al., in Kirkham und Hunter, eds., Radioimunoassay Methods, E. and S. Livingstone, Edinburgh, 1970); das "Western Blot"-Verfahren von Gordon et al. (US-Patent 4,452,901); Immunausfällung von markiertem Liganden (Brown et al., J. Biol. Chem. 255: 4980–4983, 1980); enzym-verknüpfte immunsorbierende Assays, wie zum Beispiel beschrieben von Raines and Ross (J. Biol. Chem. 257: 5154–5160, 1982); Immuncytochemische Techniken, einschließlich der Verwendung von Fluorochromen (Brooks et al., Clin. Exp. Immunol. 39: 477, 1980); und Neutralisierung der Aktivität [Bowen-Pope et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 2396–2400 (1984)] ein, die alle hierbei durch Bezugnahme aufgenommen werden. Zusätzlich zu den oben beschriebenen Immunassays steht eine Anzahl von anderen Immunassays zur Verfügung, einschließlich denjenigen, die in US-Patent Nr. beschrieben sind: 3,817,827; 3,850,752; 3,901,654; 3,935,074; 3,984,533; 3,996,345; 4,034,074; und 4,098,876, die alle hierin durch Bezugnahme aufgenommen werden.
  • Für Nachweiszwecke kann das HER-2/neu-Polypeptid („Antigen"), entweder markiert oder nicht-markiert sein. Wenn es nicht markiert ist, findet das Antigen Verwendung in Agglutinationsassays. Zusätzlich kann nicht-markiertes Antigen in Kombination mit markierten Mole külen verwendet werden, die mit Immunkomplexen reaktiv sind, oder in Kombination mit markierten Antikörpern (zweiten Antikörpern), die mit dem Antikörper reaktiv sind, der gegen das HER-2/neu Peptid gerichtet ist, wie etwa Antikörper, die für Immunglobulin spezifisch sind. Alternativ kann das Antigen direkt markiert sein. Wenn es markiert ist, kann die Reportergruppe Radioisotope, Flurophore, Enzyme, lumineszente Substanzen oder Farbstoffpartikel einschließen. Diese und andere Markierungen sind auf dem Gebiet wohlbekannt und sind zum Beispiel beschrieben in den folgenden US-Patenten:
    3,766,162; 3,791,932; 3,817,837; 3,996,345 und 4,233,402.
  • Typischerweise wird in einem ELISA-Assay ein Antigen auf die Oberfläche eines Mikrotiternapfes adsorbiert. Verbleibende Proteinbindungsstellen auf der Oberfläche werden dann mit einem geeigneten Mittel blockiert, wie etwa bovinem Serumalbumin (BSA), Hitzeinaktiviertem normalem Ziegenserum (NGS), oder BLOTTO (gepufferte Lösung einer fettfreien Trockenmilch, die ebenso ein Konservierungsmittel, Salze und ein Antischaummittel enthält). Der Napf wird dann mit einer Probe inkubiert, von der angenommen wird, daß sie spezifische Antikörper enthält. Die Probe kann unverdünnt aufgetragen werden, oder sie kann, was öfter vorkommt, verdünnt werden, gewöhnlich in einer gepufferten Lösung, die eine geringe Menge (0,1 Gew.-%–5,0 Gew.-%) an Protein enthält, wie etwa BSA, NGS oder BLOTTO. Nach Inkubieren für eine ausreichende Länge an Zeit, um eine spezifische Bindung stattfinden zu lassen, wird der Napf gewaschen, um ungebundenes Protein zu entfernen, und dann mit einem anti-Spezies-spezifischen Immunglobulin-Antikörper inkubiert, der mit einer Reportergruppe markiert ist. Die Reportergruppe kann aus einer Vielzahl von Enzymen ausgewählt sein, einschließlich Meerrettichperoxidase, Beta-Galactosidase, alkalische Phosphatase und Glucoseoxidase. Es wird ausreichend Zeit gelassen, damit eine spezifische Bindung stattfinden kann, dann wird der Napf wieder gewaschen, um nicht-gebundenes Konjugat zu entfernen, und das Substrat für das Enzym wird zugegeben. Die Farbe läßt man sich entwickeln, und die optische Dichte des Inhalts des Napfes wird visuell oder instrumentell bestimmt.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform dieses Aspekts der vorliegenden Erfindung wird eine Reportergruppe an HER-2/neu-Protein gebunden. Der Schritt des Nachweises von Immunkomplexen beinhaltet das Entfernen von im wesentlichen jeglichen ungebundenen HER- 2/neu-Protein und dann den Nachweis der Anwesenheit oder Abwesenheit der Reportergruppe.
  • In einer anderen bevorzugten Ausführungsform wird eine Reportergrppe an einen zweiten Antikörper gebunden, der in der Lage ist, an die für HER-2/neu-Protein spezifischen Antikörper zu binden. Der Schritt des Nachweises der Immunkomplexe beinhaltet (a) Entfernen von im wesentlichen jeglichen ungebundenem Antikörper, (b) Zugabe des zweiten Antikörpers, (c) Entfernen von im wesentlichen jeglichen ungebundenem zweiten Antikörper und dann (d) Nachweisen der Anwesenheit oder Abwesenheit der Reportergruppe. Wenn der Antikörper, der für HER-2/neu-Protein spezifisch ist, von einem Menschen stammt, ist der zweite Antikörper ein anti-humaner Antikörper.
  • In einer dritten bevorzugten Ausführungsform zum Nachweis von Immunkomplexen wird eine Reportergrppe an ein Molekül gebunden, das in der Lage ist, an die Immunkomplexe zu binden. Der Schritt des Nachweises beinhaltet (a) Zugabe des Moleküls, (b) Entfernen von im wesentlichen jeglichen ungebundenem Molekül und dann (c) Nachweisen der Anwesenheit oder Abwesenheit der Reportergruppe. Ein Beispiel für ein Molekül, das in der Lage ist, an die Immunkomplexe zu binden, ist Protein A.
  • Es wird für Fachleute offensichtlich sein, daß eine Vielzahl von Verfahren zum Nachweis der Immunkomplexe innerhalb der vorliegenden Erfindung verwendet werden kann. Reportergruppen, die zur Verwendung in einem der Verfahren geeignet sind, schließen Radioisotope, Fluorophore, Enzyme, lumineszente Substanzen und Farbstoffpartikel ein.
  • In einem verwandten Gesichtspunkt der vorliegenden Erfindung kann der Nachweis von Immunkomplexen, die zwischen HER-2/neu-Polypeptid und Antikörpern in einer Körperflüssigkeit gebildet werden, die für HER-2/neu-Polypeptid spezifisch sind, dazu verwendet werden, um die Wirksamkeit einer Krebstherapie zu überwachen, die ein HER-2/neu-Polypeptid beinhaltet, für eine bösartige Erkrankung, bei der das HER-2/neu-Onkogen assoziiert ist. Körperflüssigkeitsproben, die einem Individuum vor und nach der Initiierung einer Therapie entnommen worden sind, können auf die Immunkomplexe durch die oben beschriebenen Methodologien analysiert werden. Kurz gesagt, die Anzahl an Immunkomplexen, die in beiden Proben nachgewiesen werden, werden verglichen. Eine wesentliche Veränderung in der An zahl an Immunkomplexen in der zweiten Probe (nach Therapiebeginn), relativ zu der ersten Probe (vor der Therapie) reflektiert eine erfolgreiche Therapie.
  • Die folgenden Beispiele werden zu Illustrationszwecken dargeboten und nicht, um die Erfindung zu beschränken.
  • BEISPIELE
  • BEISPIEL 1
  • EXPRESSION UND AUFREINIGUNG VON REKOMBINANTEM HUMANEM HER-2/NEU-POLYPEPTID
  • Das humane HER-2/neu-Polypeptid wurde mit dem PCR-Verfahren (z.B. US-Patent Nr. 4,683,195, 4,683,202, 4,800,159) aus einem Plasmid gewonnen, das gemäß Di Fiore et al. hergestellt worden ist (King et al., Science 229: 974–976, 1985; Di Fiore et al., Science 237: 178–182, 1987), unter Verwendung von Oligonukleotid-Primern, die zusätzlich eine BssHII-Restriktionsstelle und eine Enterokinase-Protease-Stelle am 5'-Ende und eine EcoRI-Stelle an 3'-Ende einführte. Der Primer für das 5'-Ende war 5'-TCTGGCGCGCTGGATGACGATGACAAGAAACGACGGCAGCAGAAGATC-3' (SEQ ID NO: 3), während der Primer für das 3'-Ende 5'-TGAATTCTCGAGTCATTACACTGGCACGTCCAGACCCAG-3' (SEQ ID NO: 4) war. Das resultierende 1,8 kb-PCR-Fragment wurde in den T-Vektor von Novagen (Madison, WI, USA) subkloniert, und die Sequenz der ausgewählten Klone wurde auf dem automatisierten ABI 373-DNA-Sequenzierer bestimmt (Applied Biosystems Inc., Foster City, CA, USA), unter Verwendung von überlappenden Sequenzierungs-Primern. PCR-Fragmente mit einer Sequenz, die der publizierten DNA-Sequenz für die humane HER-2/neu-cDNA entsprach (SEQ ID NO: 1; Coussens et al., Science 230: 132, 1985; Yamamoto et al., Nature 319: 230, 1986) wurden dann in dem korrekten Leserahmen über die BssHII-Stelle mit einer modifizierten E. coli Thioredoxin-Reduktase verbunden. Ein 6X-Histidin-Affinitätstag, der bei der Ni-NTA-Affinitätsaufreinigung des exprimierten Fusionsproteins verwendet wird, wurde in den Thioredoxin-Reductase-Fusionspartner eingebaut. Diese cDNA für das trxA-humane HER- 2/neu-Polypeptidfusionsprotein wurde in einen modifizierten pET-Expressionsvektor zur Expression in E. coli subkloniert.
  • Während berichtet worden ist, daß Thioredoxin-Reductase andere heterologe Proteine, die in E. coli exprimiert werden, stabilisiert und solubilisiert, scheint sie keinen signifikanten Vorteil für die Expression von humanem HER-2/neu-Polypeptid in E. coli zu bieten. Während ein signifikanter Anteil des trxA-HER-2/neu-Polypeptid-Fusionsproteins löslich war, wurde ein Hauptteil in Inclusion bodies exprimiert. Das Fusionsprotein wurde ebenso einem Abbau während der Expression in E. coli unterzogen. Die Anwesenheit des Thioredoxin-Reductase-Fusionspartners kann jedoch das Protein während der Aufreinigung stabilisieren. Die Verfügbarkeit von monoklonalen Antikörpern gegen Thioredoxin-Reductase stellt einen bequemen Marker bereit, der während der Aufreinigung verfolgt werden kann.
  • Für die Aufreinigung des humanen HER-2/neu-Polypeptids mit dem Thioredoxin-Reductase-Fusionspartner, enthaltend den 6 × His-Affinitätstag, wurde das E. coli-Pellet mit Proteaseinhibitoren und Lysozym resuspendiert und beschallt. Die Inclusion Bodies wurden mittels Zentrifugation isoliert und werden 3 × mit Deoxycholat gewaschen, wobei die letzte Waschung über Nacht stattfindet, um LPS zu entfernen. Die gewaschenen Inclusion Bodies werden in GuHCl für die Ni-Aufreinigung solubilisiert. Die Ni-Säule wurde mit Imidazol in Harnstoff eluiert und gegen 10 mM Tris pH8 dialysiert. Die Ausbeute an HER-2/neu-Polypeptid unter Verwendung dieses Protokolls betrug von 80%–95% des reinen Vollängenproteins, wobei die Hauptkontaminante abgebautes Protein war. Aus 500 ml Fermentation wurden 20 mg gewonnen. Es war > 98% HER-2/neu-Polypeptid. Die hierin verwendeten Techniken sind Fachleuten wohlbekannt und sind z.B. beschrieben worden in J. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, Cold Spring Harbor, New York, USA.
  • BEISPIEL 2
  • DENDRITISCHE ZELLEN KÖNNEN HUMANES HER-2/NEU-POLYPEPTID AUSLÖSEN („Prime")
  • A. Erzeugung von DC-Kulturen aus Knochenmark
  • DC-Kulturen wurden aus hämatopoietischen CD34+-Progenitorzellen (HPC) erzeugt. CD34+-Zellen wurden aus Knochenmark von normalen Spendern unter Verwendung des Zelltrennungssystems Ceprate LC Kit aufgereinigt (CellPro, Bothell, WA, USA). Die Reinheit der gewonnenen CD34+-Zellen wurde anhand von flußzytometrischer Analyse auf 80% bis 95% bestimmt. CD34+-Zellen wurden in Serum-freien Medium kultiviert (X-VIVO 10, Biowhittaker, Inc., Walkersville, MD, USA), supplementiert mit L-Glutamin (584 μg/l), Penicillin (10 IU/ml), Streptomycin (100 μg/ml), 100 ng/ml humanem rGM-CSF und 50 ng/ml humanem rIL-6 (Immunex, Seattle, WA, USA). Nach 0 bis 17 Tagen Kultivierungszeit wurden Zellen geerntet und zum Phänotypisieren und in T-Zell-Stimulationsassays verwendet. Es ist beschrieben worden, daß GM-CSF alleine und in Kombination mit IL-4 oder TNFα das In-Vitro-Wachstum von DC induziert. In Experimenten unter Verwendung von KLH und OVA als Antigen, um naive T-Zellen zu primen, ergab GM-CSF plus IL-6 in konsistenter Weise eine vergleichbare Gesamtstimulation, aber mit einem niedrigeren Hintergrund und damit einen höheren Stimulationsindex im Vergleich zu GM-CSF plus IL-4 oder TNFα.
  • B. T-Zell-Priming-Assay
  • Aus Knochenmark stammende CD34+HPC, die in Serum-freiem Medium, enthaltend GM-CSF und IL-6, kultiviert wurden, wurden als APC nach einer Kultivationspenode von 0–17 Tagen verwendet. Die Fähigkeit der DC zum Priming wurde durch Kultivieren mit autologen, naiven T-Lymphocyten in Anwesenheit oder Abwesenheit des Protein-Antigen-rekombinanten humanen HER-2/neu-Polypeptids (hHNP) (10 μg/ml) bestimmt. CD4+-T-Lymphocyten wurden aus peripheren mononukleären Blutzellen durch positive Selektion unter Verwendung von Immunaffinitätssäulen isoliert (CellPro, Inc., Bothell, WA, USA). CD4+CD45RA+ (naive) T-Lymphocyten wurden aus CD4+-T-Lymphocyten unter Verwendung eines anti-CD45RA-mAb selektioniert, der direkt an FITC konjugiert war (Immunotech, Westbrook, ME, USA), durch flußcytometrisches Sortieren. Die CD4+CD45RA+-T-Zellen, die erhalten wurden, waren 99% rein. DC-Kulturen wurden in 96-Napf-Rundbodenplatten (Corning, Corning, NY, USA) in verschiedenen Konzentrationen ausplattiert und für 16–18 Stunden mit hHNP 10 μg/ml Endkonzentration inkubiert. Antigen-gepulste DC wurden bestrahlt (10 Gy), und autologe CD4+CD45RA+-T-Lymphocyten wurden zugegeben (5 × 104/Napf). Eine proliferative Antwort der T-Zellen wurde anhand der Aufnahme von (3H) Thymidin (1 μCi/Napf) gemessen, das am Tag 6 für 16–18 Stunden zugegeben worden war. Proliferationsassays wurden in serumfreien und cytokin-freien Medium durchgeführt. Die Resultate werden in 1 gezeigt. 2 zeigt die Ergebnisse des Testens von CD4+-T-Zellen aus einem normalen Donor auf Antworten auf hHNP. Ähnliche Daten wurden mit T-Zellen aus neun von zehn normalen Individuen erhalten.
  • BEISPIEL 3
  • ASSAY ZUM NACHWEIS VON LYMPHOCYTEN-VORLÄUFERN MIT NIEDRIGER FREQUENZ
  • Drei Assays können zum Nachweis von CD4+-Antworten verwendet werden: Ein Standard-Proliferationsassay, ein Screeningverfahren für Ereignisse mit niedriger Frequenz, und ein limitierender Verdünnungsassay (LDA). Herkömmliche proliferative Assays sind in der Lage, in leichter Weise ausgelöste („primed") Antworten nachzuweisen. Der proliferative Antwort-Stimulationsindex stellt eine grobe Korrelation mit einer Vorläuferfrequenz an Antigen-reaktiven T-Zellen bereit. Jede spezifische proliferative Antwort, die aa PBL nachgewiesen wird, wird als eine ausgelöste Antwort angesehen.
  • Um eine quantitativere Interpretation von CD4+-T-Zellantworten bereitzustellen, wird das Assaysystem verwendet, das zum Nachweis von niedrigen Lymphocyt-Vorläufer-Frequenz-Antworten entwickelt worden ist (unten beschrieben). Dieser Assay ist einfach und kosteneffektiv. Unter Umständen, bei denen eine größere Präzision benötigt wird, wird die Vorläuferfrequenz durch limitierende Verdünnungsassays validiert (Bishop and Orosz, Transplantation 47: 671–677, 1989).
  • Antworten, die größer sind als diejenigen, die in normalen Individuen nachgewiesen werden, werden als eine ausgelöste Antwort definiert und implizieren eine existierende Immunität. Niedrige Antworten, die nur anhand von LDA-Bedingungen nachweisbar sind, werden als nicht-ausgelöste Antworten betrachtet. Eine abwesende Antwort anhand von LDA oder eine Antwort, die niedriger ist als diejenige, die durch die normale Populationsanalyse definiert wird, wird als Toleranz/Anergie („anergy") angesehen.
  • Im allgemeinen können ausgelöste CD4+-T-Zellantworten in herkömmlichen proliferativen Assays nachgewiesen werden, während nicht-ausgelöste Antworten in denselben Assays nicht nachweisbar sind. Der Nachweis einer geringen Anzahl von nicht-ausgelösten-T-Zellen ist beschränkt durch Mischung einer Hintergrund-Thymidin-Aufnahme, einschließlich der autologen gemischten Lmyphocytenantwort (AMLR) auf Selbst-MHC-Antigen plus Antworten auf verarbeitete Selbst-Serumproteine und exogen zugegebene Serumproteine.
  • Um nicht-ausgelöste („unprimed") T-Zellen auszulösen und nachzuweisen, wurde ein Assaysystem für Niedrigfrequenzantworten verwendet, basierend auf Poissonprobenstatistiken (In: Pinnacles, Chiron Corporation, 1: 1–2, 1991). Dieser Typ von Analyse ist insbesondere auf Ereignisse mit niedriger Frequenz dahingehend anwendbar, daß, wenn die Vorläuferfrequenz weniger als die Anzahl von Zellen in einer Replikakultur ist, viele Replikate erforderlich sind, um eine statistisch signifikante Anzahl an Positiven nachzuweisen. Theoretisch wird die Analyse im Hinblick auf autologe Antworten eine Korrektur durchführen, indem eine bekannte positive Kontrolle (wie etwa PHA oder Tetanustoxoid) und eine bekannte negative Kontrolle (kein Antigen) erstellt wird und durch Bewerten aller Datenpunkte vom niedrigsten bis zum höchsten, unabhängig von der experimentellen Gruppe, zu der sie gehören. Ein Cutoff-Wert wird berechnet, basierend auf dem Gleichungs-Cutoff = M + (F + SD), wobei M = arithmetischer Mittelwert, F = 3,29, ein Faktor aus Tabellen einer standardisierten Normalverteilung, der so ausgewählt ist, daß nicht mehr als 0,1% der „echten Negativen" eines normalverteilten Hintergrundes oberhalb des Cutoff sein werden, und SD = Standardabweichung. In diesem Screening-Assay werden Näpfe oberhalb des Cutoff als echte Positive angesehen, die potentiell einen Lymphocyten enthalten, der spezifisch proliferiert im Hinblick auf das Antigen von Interesse. Obwohl Schätzungen der Lymphocytenvorläuferfrequenz möglich sind unter Verwendung dieses Verfahrens, erfordert eine genaue Bestimmung eine formale LDA-Analyse.
  • BEISPIEL 4
  • HER-2/NEU-POLYPEPTID-BASIERENDES VACCIN LÖST EINE IMMUNITÄT GEGEN HER-2/NEU-PROTEIN AUS
  • A. Tiere
  • Ratten, die in dieser Studie verwendet wurden, waren Ratten vom Fischer-Stamm 344 (CDF (F-344)/Cr1BR) (Charles River Laboratories, Portage MI). Die Tiere wurden in den Animal-Facilities der University of Washington unter spezifischen pathogenfreien Bedingungen gehalten und routinemäßig für experimentelle Studien im Alter zwischen 3 und 4 Monaten verwendet.
  • B. Immunisierung
  • Fischer-Ratten wurden mit einem rekombinanten Ratten-HER-2/neu-Polypeptid (rHNP) in einer Vielzahl von Adjuvantien (MPL, Vaccel; Ribi, Bozeman, MT, USA) immunisiert. Tiere erhielten 50 μg rHNP subkutan, gemischt mit einem Adjuvans. 20 Tage später wurden die Tiere mit einer zweiten Immunisierung von 50 μg rHNP geboostet, das auf dieselbe Weise verabreicht wurde. 20 Tage nach der Booster-Immunisierung wurden die Tiere auf die Anwesenheit von Antikörpern getestet, die gegen Ratten-HER-2/neu-Protein (neu) gerichtet waren.
  • C. Zelllinien
  • Zwei Zelllinien wurden als eine Quelle von neu-Proteinen verwendet. SKBR3, eine humane Brustkrebszelllinie, die ein bemerkenswerter Überexprimierer von Ratten-HER-2/neu ist (American Type Culture Collection, Rockville, MD), wurde in Kultur in 10% fötalem bovinem Serum (FBS) (Gemini Bioproducts, Inc., Calabasas, CA) und RPMI gehalten. DHFR-G8, eine NIH/3T3-Zelllinie, die mit cneu-p und psV2-DHFR cotransfiziert worden war (American Type Culture Collection, Rockville, MD), wurde als eine Quelle für nicht-transformierendes Ratten-HER-2/neu-Protein verwendet (Bernards et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 6854–6858, 1987). Diese Zelllinie wurde in 10% FBS und Dulbecco's modifiziertem Eagle-Medium mit 4,5 g/L-Glukose gehalten. DHFR-GB-Zellen wurden durch das selbe Medium passagiert, das mit 0,3 μM Methotrexat bei jeder dritten Passage supplementiert war, um den neu-Transfektanten beizubehalten.
  • D. Herstellung von Zelllysaten
  • Lysate von sowohl SKBR3 als auch DHFR-GS wurden hergestellt und als eine Quelle von neu-Protein verwendet. Kurz gesagt wurde ein Lysepuffer, bestehend aus tris-Base, Natriumchlorid und Triton-X (1%), pH 7,5, hergestellt. Protease-Inhibitoren wurden zugegeben; Aprotinin (1 μg/ml), Benzamidin (1 mM) und PMSF (1 mM). 1 ml des Lysepuffer wurde verwendet, um 107 Zellen zu suspendieren. Die Zellen wurden für 15 Sekunden alle 10 Minuten über eine Stunde gevortext, bis sie aufgebrochen waren. Alle Prozeduren wurden auf Eis in einem Kühlraum bei 4°C durchgeführt. Nach Aufbrechen wurden die Zellen bei 4°C für 20 Minuten microzentrifugiert. Der Überstand wurde von den Zelltrümmern entfernt und in kleinen Aliquots bei –70°C bis zur Verwendung aufbewahrt. Die Anwesenheit von humanem und Ratten-neu in den Lysaten wurde mittels Western-Blot-Analyse dokumentiert.
  • E. ELISA für Ratten-neu-Antikörper-Antworten
  • 96-Napf-Immulon-4-Platten (Baxter SP, Redmond, WA: Dynatech Laboratories) wurden über Nacht bei 4°C mit einem Ratten-neu-spezifischen monoklonalen Antikörper inkubiert (Oncogene Science), 7.16.4, bei einer Konzentration von 10 μg/ml verdünnt in Carbonatpuffer (äquimolare Konzentration von Na2CO3 und NaHCO3 pH 9,6). Nach Inkubation wurden alle Näpfe mit PBS-1% BSA (Sigma Chemical, St. Louis, MO, USA), 100 μl/Napf für 3 Stunden bei Zimmertemperatur blockiert. Die Platte wurde mit PBS-0,5% Tween gewaschen, und Lysate von DHFRG8, einer murinen Zelllinie, die mit Ratten-neu-DNA transfiziert ist (American Type Culture Collection, Rockville, MD, USA), eine Quelle von Ratten-neu-Protein, wurden zu alternierenden Reihen zugegeben. Die Platte wurde über Nacht bei 4°C inkubiert. Die Platte wurde dann mit PBS-0,5% Tween gewaschen, und experimentelle Seren wurden in folgenden Verdünnungen zugegeben: 1:25–1:200. Die Seren wurden in PBS-1% BSA-1% FBS-25 μg/ml Maus-IgG-0,01% NaN3 verdünnt und dann seriell in PBS-1% BSA. 50 μl verdünnte Seren wurden zugegeben/Napf und 1 Stunde bei Zimmertemperatur inkubiert. Jedes experimentelle Serum wurde zu einem Napf mit Ratten-neu und einem Napf ohne Ratten-neu zugegeben. Schaf-anti-Ratten-Ig-F(ab')2-Menettichperoxidase (HRP) wurde zu den Näpfen in einer 1:5000-Vedünnung in PBS-1% BSA zugegeben und für 45 Minuten bei Zimmertemperatur inkubiert (Amersham Co., Arlington Heights, IL, USA). Nach der letzten Waschung wurde TMB (Kirkegaard and Perry Laboratories, Gaithersburg, MD) -Entwicklungsreagenz zugegeben. Eine Farbreaktion wurde bei einer optischen Dichte von 450 nm abgelesen. Die OD jeder Serumverdünnung wurde als die OD der Ratten-neu-beschichteten Näpfen minus der OD der PBS-1% BSA-beschichteten Näpfen berechnet. Seren aus Tieren, die mit den Adjuvantien alleine immunisiert sind, und einem Tier, das mit hHNP immunisiert war (Fremdprotein), wurden ebenso auf eine ähnliche Weise bewertet. Die Resultate werden in 3 gezeigt.
  • F. T-Zell-Proliferations-Assay
  • Für die Analyse von HER-2/neu-Polypeptid-spezifischen Antworten: frische Milz- oder Lymphknotenzellen werden mittels mechanischem Aufbrechen und Passage durch ein Drahtgeflecht geerntet und gewaschen. 2 × 105 Milzellen/Napf und 1 × 105 Lymphknotenzellen/Napf werden in 96-Napf-Rundboden-Microtiterplatten ausplattiert (Corning, Corning, NY) mit 6 Replika pro experimenteller Gruppe. Das Medium besteht aus EHAA 120 (Biofluids) mit L-Glutamin, Penicillin/Streptomycin, 2-Mercaptoethanol und 5% FBS. Die Zellen werden mit Polypeptiden inkubiert. Nach 4 Tagen werden die Näpfe mit 1 μCi [3H]Thymidin für 6–8 Stunden gepulst und gezählt. Die Daten werden als ein Stimulationsindex (SI) ausgedrückt, der als der Mittelwert der experimentellen Näpfe, geteilt durch den Mittelwert der Kontrollnäpfe (kein Antigen), definiert ist. Für die Analyse der HER-2/neu-Protein-spezifischen Antworten: Milz- oder Lymphknotenzellen werden für 3 in-vitro-Stimulationen kultiviert. Zum Zeitpunkt der Analyse werden 1 × 105 kultiviert Milz- oder Lymphknoten-T-Zellen in 96-Napf-Microtiterplatten, wie oben beschrieben, ausplattiert. Zellen werden mit 1 μg/ml-Immunaffinitätssäule-aufgreinigtem-Ratten-neu (aus DHFR-G8-Zellen als die Quelle von Ratten-neu) inkubiert. Nach 4 Tagen werden die Näpfe mit 1 μCi an [3H]-Thymidin für 6–8 Stunden gepulst und gezählt. Die Daten werden als ein Stimulationsindex ausgedrückt, der als der Mittelwert der experimentellen Näpfe, geteilt durch den Mittelwert der Kontrollnäpfe (kein Antigen), definiert ist.
  • BEISPIEL 5
  • AUSGELÖSTE ANTWORTEN AUF HUMANES HER-2/NEU-POLYPEPTID KÖNNEN IN PATIENTEN MIT BRUSTKREBS NACHGEWIESEN WERDEN:
  • Heparinisiertes Blut wurde aus einem Patienten mit HER-2/neu-überexprimierendem Brustkrebs im Stadium Π erhalten. Periphere mononukleäre Blutzellen (PBMC) wurden mittels einer Ficoll-Hypaque-Dichte-Zentrifugation abgetrennt. PBMC wurde bei einer Konzentration von 2 × 105/Napf in 96-Napf-Rundbodenplatten ausplattiert (Corning, Corning, NY, USA). 24-Napf-Replika wurden für jede experimentelle Gruppe durchgeführt. Antigene, bestehend aus HER-2/neu-abgeleiteten Peptiden (15–20 Aminosäuren lang, wobei die Nummer der ersten Aminosäure in der Sequenz aufgelistet ist) 25 μg/ml, humanes HER-2/neu-Polypeptid (hHNP) 1 μg/ml, Tetanustoxoid 1 μg/ml, und p30, einem Peptid, das aus Tetanus stammt, 25 μg/ml, wurden zu jedem 24-Napf-Replikat zugegeben. Der Assay wurde in Medium durchgeführt, enthaltend 10% humane Seren. Eine proliferative Antwort von T-Zellen wurde anhand der Aufnahme von (3H)-Thymidin (1 μCi/Napf) gemessen, das am Tag 4 für 10 Stunden zugegeben wurde. Positive Näpfe, Antigen-reaktive Näpfe, wurden als positiv bewertet, wenn der cpm größer als der Mittelwert und 3 Standardabweichungen der Näpfe ohne Antigen war. Die Resultate werden in 4 gezeigt. Dieser Brustkrebspatient im Stadium II hat eine signifikante Antwort auf rekombinantes hHNP.
  • Anhand des vorgehenden wird es klar sein, daß, obwohl spezifische Ausführungsformen der Erfindung hierin aus Illustrationszwecken beschrieben worden sind, verschiedene Modifikationen gemacht werden können, ohne vom Geist und Umfang der Erfindung abzuweichen.
  • Sequenzprotokoll
    Figure 00390001
  • Figure 00400001
  • Figure 00410001
  • Figure 00420001
  • Figure 00430001
  • Figure 00440001
  • Figure 00450001
  • Figure 00460001
  • Figure 00470001
  • Figure 00480001
  • Figure 00490001
  • Figure 00500001
  • Figure 00510001
  • Figure 00520001
  • Figure 00530001

Claims (25)

  1. Eine Zusammensetzung, umfassend einen pharmazeutisch annehmbaren Träger oder Verdünnungsmittel in Kombination mit einem Polypeptid, das von einer DNA-Sequenz der Nukleotide 2026 bis 3765 von SEQ ID NO: 1 kodiert wird, zur Immunisierung eines warmblütigen Tieres gegen eine bösartige Erkrankung, bei der das HER-2/neu-Oncogen assoziiert ist.
  2. Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei das Polypeptid die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2 von Lysin, Aminosäure 676, bis Valin, Aminosäure 1255, hat, oder eine Variante davon, die wenigstens eine äquivalente Immunantwort erzeugt.
  3. Zusammensetzung nach Anspruch 2, wobei das Polypeptid die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2 von Aminosäure 676 bis Aminosäure 1255 hat.
  4. Verwendung einer. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 3 oder eines Polypeptids der Zusammensetzung zur Herstellung eines Medikaments zur Immunsierung eines warmblütigen Tieres gegen eine bösartige Erkrankung, bei der das HER-2/neu-Oncogen assoziiert ist.
  5. Ein Nukleinsäuremolekül zur Immunisierung durch Transfizieren der Zellen eines warmblütigen Tieres mit dem Nukleinsäuremoleküls, wobei besagtes Nukleinsäuremolekül die Expression eines Polypeptids steuert, das von einer DNA-Sequenz der Nukleotide 2026 bis 3765 von SEQ ID NO: 1 kodiert ist.
  6. Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 5, wobei die Zellen ex vivo transfiziert werden, zur darauffolgenden Verabreichung an das Tier.
  7. Verwendung eines Nukleinsäuremoleküls zur Herstellung eines Medikaments zur Immunisierung eines warmblütigen Tieres gegen eine bösartige Erkrankung, bei der das HER-2/neu-Oncogen assoziiert ist, wobei besagtes Nukleinsäuremolekül die Expression eines Polypeptids steuert, das von einer DNA-Sequenz der Nukleotide 2026 bis 3765 von SEQ ID NO: 1 kodiert wird.
  8. Ein viraler Vektor zur Immunisierung durch Infizieren der Zellen eines warmblütigen Tieres mit dem Vektor, wobei besagter viraler Vektor die Expression eines Polypeptids steuert, das von einer DNA-Sequenz der Nukleotide 2026 bis 3765 von SEQ ID NO: 1 kodiert wird.
  9. Viraler Vektor nach Anspruch 8, wobei die Zellen ex vivo infiziert werden, zur darauffolgenden Verabreichung an das Tier.
  10. Verwendung eines viralen Vektors zur Herstellung eines Medikaments zur Immunisierung eines warmblütigen Tieres gegen eine bösartige Erkrankung, bei der das HER-2/neu-Oncogen assoziiert ist, wobei besagter viraler Vektor die Expression eines Polypeptids steuert, das von einer DNA-Sequenz der Nukleotide 2026 bis 3765 von SEQ ID NO: 1 kodiert wird.
  11. Eine Zusammensetzung, umfassend einen pharmazeutisch annehmbaren Träger oder Verdünnungsmittel in Kombination mit einem Polypeptid, das von einer DNA-Sequenz der Nukleotide 2026 bis 3765 von SEQ ID NO: 1 kodiert wird, zum Auslösen oder Verstärken einer Immunantwort auf das HER-2/neu-Protein.
  12. Zusammensetzung nach Anspruch 11, wobei das Polypeptid die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2 von Lysin, Aminosäure 676, bis Valin, Aminosäure 1255, hat, oder eine Variante davon, die wenigstens eine äquivalente Immunantwort erzeugt.
  13. Zusammensetzung nach Anspruch 12, wobei das Polypeptid die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2 von Aminosäure 676 bis Aminosäure 1255 hat.
  14. Verwendung einer Zusammensetzung nach Anspruch 11, 12 oder 13, zur Herstellung eines Medikaments zum Auslösen oder Verstärken einer Immunantwort auf HER-2/neu-Protein.
  15. Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 5, zum Auslösen oder Verstärken einer Immunantwort auf HER-2/neu-Protein.
  16. Verwendung eines Nukleinsäuremoleküls nach Anspruch 5 zur Herstellung eines Medikaments zum Auslösen oder Verstärken einer Immunantwort auf HER-2/neu-Protein.
  17. Nukleinsäuremolekül oder Verwendung eines Nukleinsäuremoleküls nach einem der Ansprüche 5 bis 7, 15 oder 16, wobei das kodierte Polypeptid die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2 von Lysin, Aminosäure 676, bis Valin, Aminosäure 1255, hat, oder eine Variante davon, die wenigstens eine äquivalente Immunantwort erzeugt.
  18. Nukleinsäuremolekül oder Verwendung eines Nukleinsäuremoleküls nach einem der Ansprüche 5 bis 7, 15 oder 16, wobei das kodierte Polypeptid die Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 2 von Aminosäure 676 bis Aminosäure 1255 hat.
  19. Viraler Vektor nach Anspruch 8 zum Auslösen oder Verstärken einer Immunantwort auf HER-2/neu-Protein.
  20. Verwendung eines viralen Vektor nach Anspruch 8 zur Herstellung eines Medikaments zum Auslösen oder Verstärken einer Immunantwort auf HER-2/neu-Protein.
  21. Viraler Vektor oder Verwendung eines viralen Vektors nach einem der Ansprüche 8 bis 10, 19 oder 20, wobei das Polypeptid die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2 von Lysin, Aminosäure 676, bis Valin, Aminosäure 1255, hat, oder eine Variante davon, die wenigstens eine äquivalente Immununantwort erzeugt.
  22. Viraler Vektor oder Verwendung eines viralen Vektors nach einem der Ansprüche 8 bis 10, 19 oder 20, wobei das Polypeptid die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2 von Aminosäure 676 bis Aminosäure 1255 hat.
  23. Zusammensetzung oder Verwendung davon nach einem der Ansprüche 1 bis 4 oder 11 bis 14, wobei das Polypeptid mit einem Peptid oder einem Polypeptid verbunden ist.
  24. Zusammensetzung oder Verwendung davon nach einem der Ansprüche 1 bis 4 oder 11 bis 14, wobei das Polypeptid trunkiert ist.
  25. Zusammensetzung nach Anspruch 24, wobei das Polypeptid mit einem Peptid oder einem Polypeptid verbunden ist.
DE69634912T 1995-03-31 1996-03-28 Intrazellulare domäne des her-2/neu proteins, für die prevention oder behandlung von bösartigen tumoren Expired - Lifetime DE69634912T2 (de)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US414417 1995-03-31
US08/414,417 US5801005A (en) 1993-03-17 1995-03-31 Immune reactivity to HER-2/neu protein for diagnosis of malignancies in which the HER-2/neu oncogene is associated
PCT/US1996/001689 WO1996030514A1 (en) 1995-03-31 1996-03-28 Intracellular domain of the her-2/neu protein for prevention or treatment of malignancies

Publications (2)

Publication Number Publication Date
DE69634912D1 DE69634912D1 (de) 2005-08-11
DE69634912T2 true DE69634912T2 (de) 2006-04-20

Family

ID=23641368

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DE69634912T Expired - Lifetime DE69634912T2 (de) 1995-03-31 1996-03-28 Intrazellulare domäne des her-2/neu proteins, für die prevention oder behandlung von bösartigen tumoren

Country Status (19)

Country Link
US (9) US5801005A (de)
EP (2) EP1418235A3 (de)
JP (2) JP4510147B2 (de)
KR (1) KR100554186B1 (de)
CN (3) CN1150318C (de)
AT (1) ATE299180T1 (de)
AU (1) AU708237B2 (de)
BR (1) BR9607889A (de)
CA (1) CA2216601C (de)
CZ (2) CZ296618B6 (de)
DE (1) DE69634912T2 (de)
DK (1) DK0817846T3 (de)
ES (1) ES2245783T3 (de)
HU (1) HUP9801826A3 (de)
NO (2) NO321941B1 (de)
NZ (1) NZ306616A (de)
PT (1) PT817846E (de)
RU (2) RU2236461C2 (de)
WO (1) WO1996030514A1 (de)

Families Citing this family (338)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7252829B1 (en) * 1998-06-17 2007-08-07 Idm Pharma, Inc. HLA binding peptides and their uses
JPH10510988A (ja) * 1994-12-14 1998-10-27 ザ スクリップス リサーチ インスティテュート 腫瘍−特異的細胞毒性ｔ細胞のインビボ活性化
US6514942B1 (en) * 1995-03-14 2003-02-04 The Board Of Regents, The University Of Texas System Methods and compositions for stimulating T-lymphocytes
US6267958B1 (en) * 1995-07-27 2001-07-31 Genentech, Inc. Protein formulation
US6685940B2 (en) 1995-07-27 2004-02-03 Genentech, Inc. Protein formulation
WO1997042973A1 (en) * 1996-05-15 1997-11-20 Altarex, Corp. Method and composition for reconforming multi-epitopic antigens to initiate an immune response
US8038994B2 (en) 1996-05-15 2011-10-18 Quest Pharmatech Inc. Combination therapy for treating disease
US20080220012A1 (en) * 1996-05-15 2008-09-11 Ragupathy Madiyalakan Therapeutic Compositions that alter the immune response
US7371376B1 (en) 1996-10-18 2008-05-13 Genentech, Inc. Anti-ErbB2 antibodies
AU6020998A (en) 1997-01-08 1998-08-03 Life Technologies, Inc. Methods for production of proteins
US6884435B1 (en) * 1997-01-30 2005-04-26 Chiron Corporation Microparticles with adsorbent surfaces, methods of making same, and uses thereof
DE69812941T2 (de) * 1997-01-30 2004-02-05 Chiron Corp. (N.D.Ges.D. Staates Delaware), Emeryville Verwendung von mikropartikeln mit adsorbiertem antigen zur stimulierung der immunabwehr
US20040202680A1 (en) * 1997-01-30 2004-10-14 O'hagan Derek Microparticles with adsorbent surfaces, methods of making same, and uses thereof
ZA9811162B (en) * 1997-12-12 2000-06-07 Genentech Inc Treatment with anti-ERBB2 antibodies.
CA2330212A1 (en) * 1998-05-08 1999-11-18 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Compositions and methods for active vaccination
GB9810040D0 (en) 1998-05-11 1998-07-08 Univ Nottingham Blood borne tumour markers
EA004107B1 (ru) * 1998-08-11 2003-12-25 Айдек Фармацевтикалс Корпорэйшн Комбинированная терапия в-клеточных лимфом, предусматривающая введение антитела против cd20
US6573043B1 (en) * 1998-10-07 2003-06-03 Genentech, Inc. Tissue analysis and kits therefor
MY155913A (en) * 1998-11-09 2015-12-15 Biogen Inc Chimeric anti-cd20 antibody treatment of patients receiving bmt or pbsc transpants
WO2000027428A1 (en) 1998-11-09 2000-05-18 Idec Pharmaceuticals Corporation Treatment of hematologic malignancies associated with circulating tumor cells using chimeric anti-cd20 antibody
US6541214B1 (en) * 1998-11-13 2003-04-01 Oregon Heath Science University N-terminally truncated HER-2/neu protein as a cancer prognostic indicator
GB9827228D0 (en) 1998-12-10 1999-02-03 Univ Nottingham Cancer detection method and reagents
US7393823B1 (en) 1999-01-20 2008-07-01 Oregon Health And Science University HER-2 binding antagonists
US7396810B1 (en) * 2000-08-14 2008-07-08 Oregon Health Sciences University Compositions and methods for treating cancer by modulating HER-2 and EGF receptors
US7625859B1 (en) 2000-02-16 2009-12-01 Oregon Health & Science University HER-2 binding antagonists
CA2357525A1 (en) 1999-01-27 2000-08-03 Cornell Research Foundation, Inc. Treating cancers associated with overexpression of her-2/neu
US7198920B1 (en) * 1999-01-29 2007-04-03 Corika Corporation HER-2/neu fusion proteins
WO2000044899A1 (en) * 1999-01-29 2000-08-03 Corixa Corporation Her-2/neu fusion proteins
CA2367692A1 (en) * 1999-03-15 2000-09-21 Introgen Therapeutics, Inc. Dendritic cells transduced with a wild-type self gene elicit potent antitumor immune responses
EP1754488A1 (de) 1999-05-24 2007-02-21 Introgen Therapeutics, Inc. Verfahren und Zusammensetzungen für nichtvirale Gentherapie zur Behandlung von hyperproliferativen Krankheiten
CA2382774A1 (en) * 1999-05-25 2000-11-30 Human Genome Sciences, Inc. Meth1 and meth2 polynucleotides and polypeptides
US6949245B1 (en) * 1999-06-25 2005-09-27 Genentech, Inc. Humanized anti-ErbB2 antibodies and treatment with anti-ErbB2 antibodies
US20030086924A1 (en) * 1999-06-25 2003-05-08 Genentech, Inc. Treatment with anti-ErbB2 antibodies
US20040013667A1 (en) * 1999-06-25 2004-01-22 Genentech, Inc. Treatment with anti-ErbB2 antibodies
US7041292B1 (en) 1999-06-25 2006-05-09 Genentech, Inc. Treating prostate cancer with anti-ErbB2 antibodies
BR0012195A (pt) * 1999-06-25 2002-07-23 Genentech Inc Método para tratar câncer de próstata num ser humano, artigo de fabricação e uso de um anticorpo que liga erbb2
JP4658423B2 (ja) * 1999-08-03 2011-03-23 ザ オハイオ ステイト ユニバーシティ Ｈｅｒ−２タンパク質に対する免疫反応性を増強するためのポリペプチドおよびポリヌクレオチド
US8557244B1 (en) 1999-08-11 2013-10-15 Biogen Idec Inc. Treatment of aggressive non-Hodgkins lymphoma with anti-CD20 antibody
US6627196B1 (en) 1999-08-27 2003-09-30 Genentech, Inc. Dosages for treatment with anti-ErbB2 antibodies
US20030157119A1 (en) * 1999-09-22 2003-08-21 Corixa Corporation Methods for diagnosis and therapy of hematological and virus-associated malignancies
WO2001021192A2 (en) * 1999-09-22 2001-03-29 Corixa Corporation Methods for diagnosis and therapy of hematological and virus-associated malignancies
US7378096B2 (en) 1999-09-30 2008-05-27 Health Research, Inc. Stress protein compositions and methods for prevention and treatment of cancer and infectious disease
JP2003510334A (ja) * 1999-09-30 2003-03-18 コリクサ コーポレイション 癌及び感染症の予防及び治療のためのストレスタンパク質組成物及び方法
FR2801106B1 (fr) * 1999-11-12 2007-10-05 Commissariat Energie Atomique Procede de diagnostic d'une esst provoquee par une souche d'atnc dans un echantillon biologique et son utilisation dans le diagnostic differentiel des differentes souches d'atnc
EP1239866A4 (de) * 1999-12-10 2005-02-09 Epimmune Inc Induzierung von zellulärer immunantwort auf her2/neu mit hilfe von peptid- und neukleinsäurezubereitungen
AU2744201A (en) * 1999-12-29 2001-07-09 Corixa Corporation Murine neu sequences and methods of use therefor
US20020039573A1 (en) * 2000-01-21 2002-04-04 Cheever Martin A. Compounds and methods for prevention and treatment of HER-2/neu associated malignancies
US6528060B1 (en) * 2000-03-16 2003-03-04 Genzyme Corporation Therapeutic compounds
DK1272633T3 (da) * 2000-03-30 2011-05-23 Dendreon Corp Præparater og fremgangsmåder til dendritisk celle-baseret immunterapi
CA2405290C (en) * 2000-04-13 2011-06-21 Bio Life Science Forschungs Und Entwicklungsgesellschaft Mbh Vaccine against cancerous diseases
AU2001259271A1 (en) * 2000-04-28 2001-11-12 Millennium Pharmaceuticals, Inc. 14094, a novel human trypsin family member and uses thereof
KR101135233B1 (ko) * 2000-05-19 2012-04-12 제넨테크, 인크. ＥｒｂＢ 길항제에 의한 암 치료요법에 대한 효과적인 반응의 가능성을 개선시키기 위한 유전자 검출 분석
US10293056B1 (en) 2000-05-24 2019-05-21 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods and compositions for non-viral gene therapy for treatment of hyperproliferative diseases
US20030232399A1 (en) * 2000-06-14 2003-12-18 Robertson John Forsyth Russell Cancer detection methods and reagents
FR2812087B1 (fr) * 2000-07-21 2007-05-11 Inst Nat Sante Rech Med Procede de criblage de peptides utilisables en immunotherapie
US7229623B1 (en) 2000-08-03 2007-06-12 Corixa Corporation Her-2/neu fusion proteins
AU2001283360A1 (en) * 2000-08-14 2002-02-25 Corixa Corporation Methods for diagnosis and therapy of hematological and virus-associated malignancies
CA2419533A1 (en) * 2000-08-14 2002-02-21 Corixa Corporation Compositions and methods for the therapy and diagnosis of her-2/neu-associated malignancies
PT2266603E (pt) 2000-10-18 2012-11-02 Glaxosmithkline Biolog Sa Vacinas tumorais
US20020183271A1 (en) * 2000-12-07 2002-12-05 Sunil Chada Methods of treatment involving human MDA-7
US20040121946A9 (en) * 2000-12-11 2004-06-24 John Fikes Inducing cellular immune responses to her2/neu using peptide and nucleic acid compositions
US7906492B2 (en) * 2001-01-16 2011-03-15 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Therapy-enhancing glucan
US7507724B2 (en) * 2001-01-16 2009-03-24 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Therapy-enhancing glucan
US20040071671A1 (en) * 2001-02-20 2004-04-15 Leturcq Didier J. Cell therapy method for the treatment of tumors
DK2016930T3 (en) * 2001-02-20 2014-12-08 Janssen Pharmaceuticals Inc CD8 cell suspension for use in the treatment of melanomas
EP1236740B1 (de) * 2001-02-28 2012-07-18 Bio Life Science Forschungs- und Entwicklungsges.m.b.H. Vakzine gegen Krebserkrankungen, die mit dem HER-2/neu Onkogen assoziiert sind
ES2502366T3 (es) 2001-03-09 2014-10-03 Board Of Regents, The University Of Texas System Inducción de inmunidad tumoral por variantes de proteína de unión a folato
GB0109297D0 (en) 2001-04-12 2001-05-30 Glaxosmithkline Biolog Sa Vaccine
EP1399183B1 (de) 2001-05-31 2010-06-30 Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. Chimere alphavirus-replikon-partikel
DE50111493D1 (de) * 2001-09-03 2007-01-04 Bio Life Science Forschungs & Entwicklungsgesellschaft Mbh Antigen-Mimotope und Vakzine gegen Krebserkrankungen
EP2131198B1 (de) 2001-09-20 2013-03-27 Board of Regents, The University of Texas System Messung der zirkulierenden therapeutischen Antikörper-, Antigen- und Antigen-/Antikörperkomplexe unter Verwendung enzymgekoppelter Immunadsorptionstests
CA2477780A1 (en) * 2002-03-05 2003-09-18 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods of enhancing immune induction involving mda-7
WO2003076585A2 (en) * 2002-03-08 2003-09-18 Board Of Regents, The University Of Texas System Controlled modulation of amino acid side chain length of peptide antigens
JP2005522483A (ja) * 2002-04-11 2005-07-28 アルタレックス メディカル コーポレーション 結合剤及び腫瘍細胞をターゲティングする際のそれらの使用
AU2003251597A1 (en) * 2002-06-19 2004-01-06 Abgenix, Inc. Method for predicting response to epidermal growth factor receptor-directed therapy
US20090110702A1 (en) 2002-07-12 2009-04-30 The Johns Hopkins University Mesothelin Vaccines and Model Systems and Control of Tumors
EP1575500A4 (de) 2002-07-12 2007-01-03 Univ Johns Hopkins Mesothelin-vakzine und model systems
US9200036B2 (en) 2002-07-12 2015-12-01 The Johns Hopkins University Mesothelin vaccines and model systems
KR20120002613A (ko) 2002-08-12 2012-01-06 제네렉스, 인코포레이티드 폭스바이러스 및 암과 관련된 방법 및 조성물
US20080019992A1 (en) * 2002-09-02 2008-01-24 Christoph Zielinski Antigen mimotopes and vaccine against cancerous diseases
CN1497255A (zh) * 2002-10-02 2004-05-19 ���µ�����ҵ��ʽ���� 被检测体用取样元件、被检测体处理装置及其处理方法
EP1560651A1 (de) * 2002-11-12 2005-08-10 Millipore Corporation Vorrichtung zum kontrollieren der verdunstung aus mehrfachlochplatten
GB2424273B (en) * 2002-11-14 2007-06-27 Univ Nottingham Method for preparing tumour marker protein
JP2006516117A (ja) * 2002-11-21 2006-06-22 ジェネンテック・インコーポレーテッド 抗ＥｒｂＢ２抗体を用いた非悪性疾病または疾患の治療
WO2004061105A1 (en) 2003-01-03 2004-07-22 Istituto Di Ricerche Di Biologia Molecolare P. Angeletti Spa Rhesus her2/neu, nucleotides encoding same, and uses thereof
US7638270B2 (en) * 2003-01-24 2009-12-29 Agensys, Inc. Nucleic acids and corresponding proteins entitled 254P1D6B useful in treatment and detection of cancer
AU2004218407A1 (en) * 2003-03-03 2004-09-16 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods and compositions involving MDA-7
US20080274129A1 (en) 2003-04-18 2008-11-06 Fikes John D Hla-A2 Tumor Associated Antigen Peptides and Compositions
JP2007525187A (ja) * 2003-05-16 2007-09-06 レセプター・バイオロジクス・インコーポレイテッド イントロン融合タンパク質、ならびにその同定方法および使用方法
US7178491B2 (en) * 2003-06-05 2007-02-20 Caterpillar Inc Control system and method for engine valve actuator
WO2004112825A2 (en) * 2003-06-17 2004-12-29 Mannkind Corporation Combinations of tumor-associated antigens for the treatment of various types of cancers
CN101173282B (zh) * 2003-07-21 2011-04-06 P.安杰莱蒂分子生物学研究所 编码人表皮生长因子2/neu抗原的合成基因及其用途
GB0321615D0 (en) 2003-09-15 2003-10-15 Glaxo Group Ltd Improvements in vaccination
WO2005041656A2 (en) 2003-10-22 2005-05-12 Fred Hutchinson Cancer Research Center Methods, compositions and devices for inducing stasis in tissues and organs
SI1725249T1 (sl) 2003-11-06 2014-04-30 Seattle Genetics, Inc. Spojine monometilvalina, sposobne konjugacije na ligande
CA2548220A1 (en) * 2003-12-01 2005-09-09 Introgen Therapeutics, Inc. Use of mda-7 to inhibit infection by pathogenic organisms
US20070281041A1 (en) * 2004-03-02 2007-12-06 Introgen Therapeutics, Inc. Compositions and Methods Involving MDA-7 for the Treatment of Cancer
AU2005245896A1 (en) * 2004-05-14 2005-12-01 Receptor Biologix, Inc. Cell surface receptor isoforms and methods of identifying and using the same
EP2471924A1 (de) * 2004-05-28 2012-07-04 Asuragen, INC. Verfahren und Zusammensetzungen mit microRNA
EP2286844A3 (de) 2004-06-01 2012-08-22 Genentech, Inc. Antikörper-Arzneimittelkonjugate und Verfahren
EP1768662A2 (de) 2004-06-24 2007-04-04 Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. Immunstimulatoren kleiner moleküle und assays für deren nachweis
EP1765313A2 (de) 2004-06-24 2007-03-28 Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. Verbindungen als immunstimulatoren
WO2006034488A2 (en) 2004-09-23 2006-03-30 Genentech, Inc. Cysteine engineered antibodies and conjugates
US20100111856A1 (en) 2004-09-23 2010-05-06 Herman Gill Zirconium-radiolabeled, cysteine engineered antibody conjugates
CA2583230A1 (en) * 2004-10-05 2006-04-20 Oregon Health And Science University Compositions and methods for treating disease
EP1797431B1 (de) * 2004-10-06 2011-01-26 Wellstat Biologics Corporation Erkennung eines erhöhten spiegels von her-2/neu-proteinen in zirkulierenden krebszellen und dessen behandlung
CA2850323A1 (en) 2004-11-12 2006-12-28 Asuragen, Inc. Methods and compositions involving mirna and mirna inhibitor molecules
US20060115862A1 (en) * 2004-11-17 2006-06-01 Duke University Anti-tenascin monoclonal antibody immunoassays and diagnostic kits
CN100381460C (zh) * 2004-11-30 2008-04-16 北京市肿瘤防治研究所 Her-2模拟抗原表位及含有该表位的肽
EP1835932A2 (de) * 2004-12-29 2007-09-26 Mannkind Corporation Verfahren zur auslösung, verbesserung und erhaltung von immunantworten gegen mhc-klasse-i-beschränkte epitope, für prophylaktische oder therapeutische zwecke
AU2006211960A1 (en) * 2005-02-08 2006-08-17 Board Of Regents, The University Of Texas System Compositions and methods involving MDA-7 for the treatment of cancer
EP1879599B1 (de) * 2005-04-20 2013-10-16 Fred Hutchinson Cancer Research Center Verfahren, zusammensetzungen und hergestellte artikel zur verbesserten überlebensfähigkeit von zellen, geweben, organen und organismen
CN100398558C (zh) * 2005-05-10 2008-07-02 中国人民解放军军事医学科学院基础医学研究所 HER2/neu与Herstatin相互作用的活性片段及其编码基因与应用
US8668905B2 (en) * 2005-05-12 2014-03-11 University Of South Florida P53 vaccines for the treatment of cancers
US20090170769A1 (en) * 2005-05-13 2009-07-02 Pei Jin Cell surface receptor isoforms and methods of identifying and using the same
GB2426581A (en) * 2005-05-27 2006-11-29 Univ Nottingham Immunoassay methods
SI1889059T1 (sl) 2005-05-27 2009-12-31 Oncimmune Ltd Izboljšani imunotestni postopek
JP5222134B2 (ja) * 2005-06-15 2013-06-26 ザ オハイオ ステート ユニバーシティー リサーチ ファウンデーション Ｈｅｒ−２ペプチド
EP2385060A3 (de) 2005-06-17 2012-02-15 Mannkind Corporation Verfahren und Zusammensetzungen zum Auslösen von multivalenten Immunreaktionen gegen auf Krebszellen und Tumor-Stroma exprimierte dominante und subdominante Epitope
GB0512751D0 (en) * 2005-06-22 2005-07-27 Glaxo Group Ltd New adjuvant
JP2009507853A (ja) * 2005-09-07 2009-02-26 ジェンネレックス インコーポレイティッド Ｇｍ−ｃｓｆ発現ポックスウイルスを用いる転移性および／または全身播種性癌の全身処置
CA2662798A1 (en) * 2005-09-07 2007-03-15 Receptor Logic, Ltd. Antibodies as t cell receptor mimics, methods of production and uses thereof
US8980246B2 (en) 2005-09-07 2015-03-17 Sillajen Biotherapeutics, Inc. Oncolytic vaccinia virus cancer therapy
JP5424640B2 (ja) * 2005-09-08 2014-02-26 ザ ヘンリー エム．ジャクソン ファウンデイション フォー ザ アドバンスメント オブ ミリタリー メディスン，インコーポレイティド 免疫源性ペプチドの標的特異的同定方法
US8945573B2 (en) * 2005-09-08 2015-02-03 The Henry M. Jackson Foundation For The Advancement Of Military Medicine, Inc. Targeted identification of immunogenic peptides
WO2007047749A1 (en) 2005-10-18 2007-04-26 Novartis Vaccines And Diagnostics Inc. Mucosal and systemic immunizations with alphavirus replicon particles
TWI457133B (zh) 2005-12-13 2014-10-21 Glaxosmithkline Biolog Sa 新穎組合物
US20090053221A1 (en) * 2006-01-17 2009-02-26 Cheung Nai-Kong V Immune response enhancing glucan
US8323644B2 (en) * 2006-01-17 2012-12-04 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Therapy-enhancing glucan
EP1984004A4 (de) * 2006-01-17 2010-03-03 Sloan Kettering Inst Cancer Die therapie verstärkendes glucan
WO2007092944A2 (en) * 2006-02-08 2007-08-16 Introgen Therapeutics, Inc. Compositions and methods involving gene therapy and proteasome modulation
CA2646891A1 (en) * 2006-03-23 2007-09-27 Novartis Ag Immunopotentiating compounds
ATE539079T1 (de) * 2006-03-23 2012-01-15 Novartis Ag Imidazochinoxalinverbindungen als immunmodulatoren
EP2010530A2 (de) * 2006-03-23 2009-01-07 Novartis AG Herstellungsverfahren für imidazolhaltige verbindungen
US7517270B2 (en) * 2006-05-30 2009-04-14 Minds-I, Inc. Construction system
EP2069386A4 (de) 2006-07-21 2009-10-28 Life Technologies Corp Proteinmolekülgewichtsstandards mit hoher trennschärfe
US7972602B2 (en) * 2006-08-11 2011-07-05 Dendreon Corporation Promiscuous HER-2/Neu CD4 T cell epitopes
CN101632020B (zh) 2006-09-13 2013-11-27 昂西免疫有限公司 改进的免疫测定方法
ES2741138T3 (es) 2006-09-15 2020-02-10 Childrens Hospital Of Eastern Ontario Res Institute Inc Rhabdovirus oncolítico de Farmington
EP2145001A2 (de) 2006-09-19 2010-01-20 Asuragen, Inc. Von mir-15, mir-26, mir -31,mir -145, mir-147, mir-188, mir-215, mir-216 mir-331, mmu-mir-292-3p regulierte gene und stoffwechselwege als ziele für einen therapeutischen eingriff
US20080075528A1 (en) * 2006-09-22 2008-03-27 Michael Marzetta Construction system
CA2700573C (en) * 2006-09-26 2016-11-22 Cedars-Sinai Medical Center Cancer stem cell antigen vaccines and methods
CA2700436C (en) 2006-09-28 2017-04-18 John S. Yu Cancer vaccines and vaccination methods
US20080131878A1 (en) * 2006-12-05 2008-06-05 Asuragen, Inc. Compositions and Methods for the Detection of Small RNA
EP2104734A2 (de) * 2006-12-08 2009-09-30 Asuragen, INC. Mir-20-regulierte gene und pfade als ziele für therapeutische interventionen
US8889143B2 (en) 2006-12-14 2014-11-18 Antigen Express, Inc. Ii-key/HER-2/neu hybrid cancer vaccine
US7935350B2 (en) * 2006-12-14 2011-05-03 Antigen Express, Inc. Ii-key/Her-2/neu hybrid cancer vaccine
US7410225B1 (en) * 2007-03-14 2008-08-12 Minds-I, Inc. Multi-part links for endless track
KR20080084528A (ko) * 2007-03-15 2008-09-19 제네렉스 바이오테라퓨틱스 인크. 종양살상형 백시니아 바이러스 암 치료
JP2010525326A (ja) * 2007-04-19 2010-07-22 ウェルスタット バイオロジックス コーポレイション 分離されていない循環癌細胞由来のＨｅｒ−２／ｎｅｕタンパク質の上昇したレベルの検出および治療
EP2162149B1 (de) 2007-06-01 2013-11-06 The Henry M. Jackson Foundation for the Advancement of Military Medicine, Inc. Impfstoff zur verhinderung eines brustkrebsrezidivs
US20090017716A1 (en) * 2007-07-11 2009-01-15 Michael Marzetta Construction system
US20090061456A1 (en) * 2007-08-30 2009-03-05 Allard William J Method for predicting progression free and overall survival at each follow-up time point during therapy of metastatic breast cancer patients using circulating tumor cells
WO2009036332A1 (en) 2007-09-14 2009-03-19 Asuragen, Inc. Micrornas differentially expressed in cervical cancer and uses thereof
US20090117532A1 (en) * 2007-11-01 2009-05-07 Doyle Gerald V Pre-clinical method for monitoring serial changes in circulating breast cancer cells in mice
WO2009059450A1 (en) * 2007-11-05 2009-05-14 Shanghai Jiaotong University Peptide ligand directed drug delivery
US7841923B2 (en) * 2007-11-13 2010-11-30 Minds-I, Inc. Vehicle axle joint for a toy vehicle
CN101878429B (zh) * 2007-11-27 2015-05-20 维里德克斯有限责任公司 血液中循环黑素瘤细胞的自动化计数和表征
US8071562B2 (en) 2007-12-01 2011-12-06 Mirna Therapeutics, Inc. MiR-124 regulated genes and pathways as targets for therapeutic intervention
US20090191535A1 (en) * 2007-12-22 2009-07-30 Mark Carle Connelly Method of assessing metastatic carcinomas from circulating endothelial cells and disseminated tumor cells
GB0725239D0 (en) * 2007-12-24 2008-02-06 Oncimmune Ltd Calibrator for autoantibody assay
US8258111B2 (en) 2008-05-08 2012-09-04 The Johns Hopkins University Compositions and methods related to miRNA modulation of neovascularization or angiogenesis
JP2010006705A (ja) * 2008-06-13 2010-01-14 Atlas Antibodies Ab Ｈｅｒ２サブセット
EP2328923B1 (de) * 2008-09-02 2016-01-13 Cedars-Sinai Medical Center Cd133-epitope
KR20170097234A (ko) 2008-12-10 2017-08-25 더 헨리 엠. 잭슨 파운데이션 포 더 어드벤스먼트 오브 밀리터리 메디신, 인코포레이티드 유방암 재발 예방용 백신
US20100234283A1 (en) 2009-02-04 2010-09-16 The Ohio State University Research Foundation Immunogenic epitopes, peptidomimetics, and anti-peptide antibodies, and methods of their use
US20110045080A1 (en) * 2009-03-24 2011-02-24 William Marsh Rice University Single-Walled Carbon Nanotube/Bioactive Substance Complexes and Methods Related Thereto
WO2010132723A1 (en) * 2009-05-14 2010-11-18 Prometheus Laboratories Inc. Biomarkers for determining sensitivity of breast cancer cells to her2-targeted therapy
US20110065643A1 (en) 2009-06-12 2011-03-17 University Of Southern California Clusterin Pharmaceuticals and Treatment Methods Using the Same
AU2010292172A1 (en) 2009-09-09 2012-05-03 Centrose, Llc Extracellular targeted drug conjugates
ES2671570T3 (es) 2009-09-14 2018-06-07 Sillajen Biotherapeutics, Inc. Terapia combinada contra el cáncer con virus oncolítico de vaccinia
US9045729B2 (en) 2009-12-10 2015-06-02 Ottawa Hospital Research Institute Oncolytic rhabdovirus
WO2011107100A1 (en) 2010-03-03 2011-09-09 Aarhus Universitet Methods and compositions for regulation of herv4
PE20130342A1 (es) 2010-04-15 2013-04-20 Spirogen Sarl Pirrolobenzodiacepinas y conjugados de las mismas
WO2011149564A1 (en) 2010-05-28 2011-12-01 Tetris Online, Inc. Interactive hybrid asynchronous computer game infrastructure
EP2576613A1 (de) 2010-06-07 2013-04-10 Pfizer Inc. Her-2-peptide und impfstoffe
EP2579897A1 (de) 2010-06-08 2013-04-17 Genentech, Inc. Cystein-manipulierte antikörper und konjugate
ES2544608T3 (es) 2010-11-17 2015-09-02 Genentech, Inc. Conjugados de anticuerpo y de alaninil-maitansinol
CA2824277C (en) 2011-01-04 2021-08-31 Jennerex, Inc. Generation of antibodies to tumor antigens and generation of tumor specific complement dependent cytotoxicity by administration of oncolytic vaccinia virus
CA2826043A1 (en) 2011-02-03 2012-08-09 Mirna Therapeutics, Inc. Synthetic mimics of mir-124
KR20140020900A (ko) 2011-02-03 2014-02-19 미르나 테라퓨틱스 인코포레이티드 Ｍｉｒ―34의 합성 모방체
CA2833212C (en) 2011-05-12 2020-06-09 Genentech, Inc. Multiple reaction monitoring lc-ms/ms method to detect therapeutic antibodies in animal samples using framework signature peptides
US9364532B2 (en) 2011-06-08 2016-06-14 Children's Hospital Of Eastern Ontario Research Institute Inc. Compositions and methods for glioblastoma treatment
HUE039009T2 (hu) 2011-08-05 2018-12-28 Res Found Dev Javított eljárások és készítmények Olfml3-mediált angiogenesis modulálására
SG10201903119QA (en) 2011-09-06 2019-05-30 Agency Science Tech & Res Polypeptide vaccine
US9644241B2 (en) 2011-09-13 2017-05-09 Interpace Diagnostics, Llc Methods and compositions involving miR-135B for distinguishing pancreatic cancer from benign pancreatic disease
HUE025661T2 (en) 2011-10-14 2016-04-28 Medimmune Ltd Pyrrolobenzodiazepines and their conjugates
CA2864841C (en) 2012-02-17 2020-07-07 Keith L. Knutson Methods and materials for generating cd8+ t cells having the ability to recognize cancer cells expressing a her2/neu polypeptide
WO2013130093A1 (en) 2012-03-02 2013-09-06 Genentech, Inc. Biomarkers for treatment with anti-tubulin chemotherapeutic compounds
US20150283233A1 (en) 2012-06-15 2015-10-08 Gencia Corporation Compositions and Methods for Enhancing Immune Responses
UA114108C2 (uk) 2012-07-10 2017-04-25 Борд Оф Ріджентс, Дзе Юніверсіті Оф Техас Сістем Моноклональне антитіло для застосування в діагностиці і терапії злоякісних пухлин і аутоімунного захворювання
MX364328B (es) 2012-10-12 2019-04-23 Medimmune Ltd Conjugados del anticuerpo pirrolobenzodiazepina.
WO2014057114A1 (en) 2012-10-12 2014-04-17 Adc Therapeutics Sàrl Pyrrolobenzodiazepine-anti-psma antibody conjugates
NZ707534A (en) 2012-10-12 2018-08-31 Adc Therapeutics Sa Pyrrolobenzodiazepine-antibody conjugates
NZ707486A (en) 2012-10-12 2018-09-28 Adc Therapeutics Sa Pyrrolobenzodiazepine - anti-psma antibody conjugates
DK2906251T3 (da) 2012-10-12 2017-11-20 Adc Therapeutics Sa Pyrrolobenzodiazepin-anti-CD22-antistofkonjugater
EP2906297B1 (de) 2012-10-12 2017-12-06 ADC Therapeutics SA Pyrrolobenzodiazepin-antikörper-konjugate
PL2766048T3 (pl) 2012-10-12 2015-05-29 Medimmune Ltd Pirolobenzodiazepiny i ich koniugaty
US9803014B2 (en) 2012-10-24 2017-10-31 Research Development Foundation JAM-C antibodies and methods for treatment of cancer
CN110452242A (zh) 2012-12-21 2019-11-15 麦迪穆有限责任公司 吡咯并苯并二氮杂卓及其结合物
CA2894959C (en) 2012-12-21 2022-01-11 Spirogen Sarl Unsymmetrical pyrrolobenzodiazepines-dimers for use in the treatment of proliferative and autoimmune diseases
EP2956544B1 (de) 2013-02-14 2017-11-01 Immunocellular Therapeutics Ltd. Krebsimpfstoffe und impfverfahren
CN105658790A (zh) 2013-02-21 2016-06-08 东安大略研究所儿童医院有限公司 疫苗组合物
US20160031887A1 (en) 2013-03-13 2016-02-04 Medimmune Limited Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof
CN105142674B (zh) 2013-03-13 2018-11-13 麦迪穆有限责任公司 吡咯并苯并二氮杂卓和其结合物
AU2014244245C1 (en) 2013-03-13 2018-04-19 Genentech, Inc. Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof
EA201690195A1 (ru) 2013-08-12 2016-05-31 Дженентек, Инк. Конъюгатные соединения антитело-лекарство на основе димера 1-(хлорметил)-2,3-дигидро-1h-бензо[e]индола и способы применения и лечения
CN105899515B (zh) 2013-08-14 2020-01-14 威廉马歇莱思大学 uncialamycin的衍生物、合成方法及其作为抗肿瘤剂的用途
US9914775B2 (en) 2013-08-21 2018-03-13 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Methods for treating inflammatory disorders or cancer metastasis by administering antibodies to connexin 43 (Cx43) hemichannels
ES2745287T3 (es) 2013-08-29 2020-02-28 Univ Texas Enzimas degradadoras de cistina/cisteína de primate genomanipuladas como agentes antineogénicos
US9808486B2 (en) 2013-08-30 2017-11-07 Board Of Regents, The University Of Texas System Administration of kynurenine depleting enzymes for tumor therapy
WO2015052534A1 (en) 2013-10-11 2015-04-16 Spirogen Sàrl Pyrrolobenzodiazepine-antibody conjugates
US10010624B2 (en) 2013-10-11 2018-07-03 Medimmune Limited Pyrrolobenzodiazepine-antibody conjugates
EP3054986B1 (de) 2013-10-11 2019-03-20 Medimmune Limited Pyrrolobenzodiazepin-antikörper-konjugate
GB201317982D0 (en) 2013-10-11 2013-11-27 Spirogen Sarl Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof
CA2936100A1 (en) 2013-12-04 2015-06-11 Board Of Regents, The University Of Texas System Analysis of genomic dna, rna, and proteins in exosomes for diagnosis and theranosis
EP3082875B1 (de) 2013-12-16 2020-11-25 Genentech, Inc. Peptidomimetische verbindungen und antikörper-wirkstoff-konjugate davon
MX2016007578A (es) 2013-12-16 2016-10-03 Genentech Inc Compuestos de conjugado anticuerpo-farmaco dimerico de 1-(clorometil)-2,3-dihidro-1h-benzo [e] indol, y metodos de uso y tratamiento.
CN105873614B (zh) 2013-12-16 2020-10-30 基因泰克公司 肽模拟化合物及其抗体-药物缀合物
WO2016190940A1 (en) * 2015-05-22 2016-12-01 Czerniecki Brian J Manufacturing multi-dose injection ready dendritic cell vaccines
EP3549582A3 (de) 2014-08-29 2020-01-01 The Board of Regents of The University of Texas System Neuartige capsazepinanaloga zur behandlung von krebs und anderen proliferativen erkrankungen
US9975959B2 (en) 2014-08-29 2018-05-22 Board Of Regents, The University Of Texas System Administration of kynurenine depleting enzymes for tumor therapy
EP3193940A1 (de) 2014-09-10 2017-07-26 Medimmune Limited Pyrrolobenzodiazepine und konjugate daraus
WO2016040825A1 (en) 2014-09-12 2016-03-17 Genentech, Inc. Anthracycline disulfide intermediates, antibody-drug conjugates and methods
AR101844A1 (es) 2014-09-12 2017-01-18 Genentech Inc Anticuerpos y conjugados modificados genéticamente con cisteína
GB201416112D0 (en) 2014-09-12 2014-10-29 Medimmune Ltd Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof
JP2017533887A (ja) 2014-09-17 2017-11-16 ジェネンテック， インコーポレイテッド ピロロベンゾジアゼピン類及びその抗体ジスルフィドコンジュゲート
KR20170101895A (ko) 2014-11-25 2017-09-06 에이디씨 테라퓨틱스 에스에이 피롤로벤조디아제핀-항체 접합체
KR20170086121A (ko) 2014-12-03 2017-07-25 제넨테크, 인크. 4급 아민 화합물 및 그의 항체-약물 접합체
JP6724023B2 (ja) 2015-02-09 2020-07-15 リサーチ ディベロップメント ファウンデーション 改善された補体活性化を示す操作された免疫グロブリンｆｃポリペプチド
RS61047B1 (sr) 2015-03-04 2020-12-31 Univ Texas Postupci za lečenje kancera sa hemizigotnim gubitkom gena tp53
CN107533065A (zh) * 2015-03-13 2018-01-02 布莱恩·J·赫尔尼奇 在癌症和免疫恢复中监测cd4+1型t辅助细胞应答的方法
US20180171294A1 (en) * 2015-03-26 2018-06-21 The Trustees Of The University Of Pennsylvania In vitro artificial lymph node method for sensitization and expansion of t cells for therapy and epitope mapping
GB201506402D0 (en) 2015-04-15 2015-05-27 Berkel Patricius H C Van And Howard Philip W Site-specific antibody-drug conjugates
GB201506411D0 (en) 2015-04-15 2015-05-27 Bergenbio As Humanized anti-axl antibodies
WO2016196506A1 (en) 2015-05-29 2016-12-08 Galena Biopharma, Inc. PEPTIDE VACCINE THERAPY FOR TREATMENT OF FRα-EXPRESSING TUMORS
MA45481A (fr) 2015-06-10 2018-04-18 Univ Texas Utilisation d'exosomes pour le traitement de maladies
RU2612015C2 (ru) * 2015-06-29 2017-03-01 Общество с ограниченной ответственностью "Сибинтех" Пептид-иммуноген, используемый в терапевтической вакцине для лечения метастатического рака молочной железы у кошек и собак
WO2017019829A1 (en) 2015-07-28 2017-02-02 Board Of Regents, The University Of Texas System Implant compositions for the unidirectional delivery of therapeutic compounds to the brain
WO2017040380A2 (en) 2015-08-28 2017-03-09 Research Development Foundation Engineered antibody fc variants
MA43345A (fr) 2015-10-02 2018-08-08 Hoffmann La Roche Conjugués anticorps-médicaments de pyrrolobenzodiazépine et méthodes d'utilisation
CN108291227A (zh) 2015-10-14 2018-07-17 拜奥-帕斯控股股份有限公司 用于脂质体制剂的对乙氧基核酸
MA43354A (fr) 2015-10-16 2018-08-22 Genentech Inc Conjugués médicamenteux à pont disulfure encombré
MA45326A (fr) 2015-10-20 2018-08-29 Genentech Inc Conjugués calichéamicine-anticorps-médicament et procédés d'utilisation
RU2624862C2 (ru) * 2015-10-20 2017-07-07 Общество с ограниченной ответственностью "Эпитек" Пептид-иммуноген, используемый в терапевтической вакцине для лечения метастатического рака молочной железы
JP2018532810A (ja) 2015-11-07 2018-11-08 マルチビア インコーポレイテッド がんの処置のための腫瘍抑制因子遺伝子治療および免疫チェックポイント治療を含む組成物
EP3373968B1 (de) 2015-11-09 2024-04-17 The Children's Hospital of Philadelphia Glypican 2 als tumormarker und therapeutikum
CN114470194A (zh) 2015-12-02 2022-05-13 斯特库伯株式会社 与btn1a1免疫特异性结合的抗体和分子及其治疗用途
CN108925136B (zh) 2015-12-02 2022-02-01 斯特赛恩斯公司 特异于糖基化的btla（b和t淋巴细胞衰减因子）的抗体
GB201601431D0 (en) 2016-01-26 2016-03-09 Medimmune Ltd Pyrrolobenzodiazepines
GB201602356D0 (en) 2016-02-10 2016-03-23 Medimmune Ltd Pyrrolobenzodiazepine Conjugates
GB201602359D0 (en) 2016-02-10 2016-03-23 Medimmune Ltd Pyrrolobenzodiazepine Conjugates
CA3015839A1 (en) 2016-02-26 2017-08-31 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Connexin (cx)43 hemichannel-binding antibodies and uses thereof
US11376324B2 (en) 2016-03-02 2022-07-05 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Sting activating nanovaccine for immunotherapy
JP6943872B2 (ja) 2016-03-25 2021-10-06 ジェネンテック， インコーポレイテッド 多重全抗体及び抗体複合体化薬物定量化アッセイ
US20190105403A1 (en) 2016-03-29 2019-04-11 Stcube & Co., Inc. Methods for selecting antibodies that specifically bind glycosylated immune checkpoint proteins
EP3436481B1 (de) 2016-03-29 2021-06-30 Stcube, Inc. Zweifach funktionelle antikörper, die spezifisch für glykosyliertes pd-l1 sind, und verfahren zur verwendung davon
WO2017176076A1 (en) 2016-04-06 2017-10-12 Ewha University - Industry Collaboration Foundation A peptide with ability to penetrate cell membrane
GB201607478D0 (en) 2016-04-29 2016-06-15 Medimmune Ltd Pyrrolobenzodiazepine Conjugates
EP3449017B1 (de) 2016-04-29 2021-12-22 Board of Regents, The University of Texas System Gezielte messung der transkriptionellen aktivität im zusammenhang mit hormonrezeptoren
EP3458074B1 (de) 2016-05-16 2024-04-17 Board of Regents of the University of Texas System Zusammensetzungen zur ausgabe von trna-nanopartikeln und verfahren zur verwendung darin
PL3458101T3 (pl) 2016-05-20 2021-05-31 F. Hoffmann-La Roche Ag Koniugaty PROTAC-przeciwciało i sposoby ich stosowania
JP7022080B2 (ja) 2016-05-27 2022-02-17 ジェネンテック， インコーポレイテッド 部位特異的抗体－薬物複合体の特徴付けのための生化学分析的方法
EP3463438B1 (de) 2016-05-31 2022-04-06 The Henry M. Jackson Foundation for the Advancement of Military Medicine, Inc. Impstofftherapie für die behandlung von endometriellen und ovarischen krebs
WO2017210579A1 (en) * 2016-06-03 2017-12-07 Etubics Corporation Compositions and methods for tumor vaccination and immunotherapy involving her2/neu
US10639378B2 (en) 2016-06-06 2020-05-05 Genentech, Inc. Silvestrol antibody-drug conjugates and methods of use
CN109562178A (zh) 2016-07-06 2019-04-02 得克萨斯州大学系统董事会 用于治疗胱氨酸尿症患者的人类酶介导的胱氨酸剔除
KR20190031299A (ko) 2016-07-20 2019-03-25 주식회사 에스티큐브 글리코실화된 pd-l1에 결합하는 항체의 조합을 사용하는 암 치료 방법
EP3496763A1 (de) 2016-08-11 2019-06-19 Genentech, Inc. Pyrrolobenzodiazepin-prodrugs und antikörperkonjugate davon
US9963498B2 (en) 2016-08-18 2018-05-08 Wisconsin Alumni Research Foundation Peptides that inhibit syndecan-1 activation of VLA-4 and IGF-1R
EP3512525B1 (de) 2016-09-16 2022-07-27 Bio-Path Holdings, Inc. Kombinationstherapie mit liposomalen antisense-oligonukleotiden
WO2018065501A1 (en) 2016-10-05 2018-04-12 F. Hoffmann-La Roche Ag Methods for preparing antibody drug conjugates
GB201617466D0 (en) 2016-10-14 2016-11-30 Medimmune Ltd Pyrrolobenzodiazepine conjugates
EP3538112A4 (de) 2016-11-09 2020-09-02 Musc Foundation for Research Development Cd38-nad+-regulierte stoffwechselachse in der antitumorimmuntherapie
CN110381997A (zh) 2016-12-12 2019-10-25 茂体外尔公司 用于治疗和预防癌症和感染性疾病的包含病毒基因治疗和免疫检查点抑制剂的方法和组合物
GB201702031D0 (en) 2017-02-08 2017-03-22 Medlmmune Ltd Pyrrolobenzodiazepine-antibody conjugates
AU2018217926B2 (en) 2017-02-08 2019-10-03 Adc Therapeutics Sa Pyrrolobenzodiazepine-antibody conjugates
CN110612447B (zh) 2017-02-24 2024-02-06 德克萨斯州立大学董事会 用于检测早期胰腺癌的测定
EP3612537B1 (de) 2017-04-18 2022-07-13 Medimmune Limited Pyrrolobenzodiazepinkonjugate
US20200129637A1 (en) 2017-04-20 2020-04-30 Adc Therapeutics Sa Combination therapy with an anti-axl antibody-drug conjugate
IL270503B1 (en) 2017-05-12 2024-06-01 Univ Texas Depletion of homocysteine by human enzymes for the treatment of patients with hyperhomocysteinemia and homocystinuria
WO2018209211A1 (en) 2017-05-12 2018-11-15 Board Of Regents, The University Of Texas System Engineered primate cystine/cysteine degrading enzymes for therapeutic uses
US20200131266A1 (en) 2017-05-31 2020-04-30 Stcube & Co., Inc. Methods of treating cancer using antibodies and molecules that immunospecifically bind to btn1a1
AU2018277838A1 (en) 2017-05-31 2019-12-19 Stcube & Co., Inc. Antibodies and molecules that immunospecifically bind to BTN1A1 and the therapeutic uses thereof
JP2020522562A (ja) 2017-06-06 2020-07-30 ストキューブ アンド シーオー．， インコーポレイテッド Ｂｔｎ１ａ１又はｂｔｎ１ａ１リガンドに結合する抗体及び分子を用いて癌を治療する方法
KR102442736B1 (ko) 2017-06-14 2022-09-16 에이디씨 테라퓨틱스 에스에이 항-cd19 adc의 투여를 위한 투약량 체제
JP7220203B2 (ja) 2017-08-18 2023-02-09 メドイミューン・リミテッド ピロロベンゾジアゼピン複合体
IL273387B2 (en) 2017-09-20 2023-10-01 Ph Pharma Co Ltd Thylanstatin analogs
EP4116327A1 (de) 2017-10-11 2023-01-11 Board Of Regents, The University Of Texas System Menschliche pd-l1-antikörper und verfahren zu ihrer verwendung
GB201803342D0 (en) 2018-03-01 2018-04-18 Medimmune Ltd Methods
CN112020510A (zh) 2018-03-19 2020-12-01 茂体外尔公司 包含用于治疗癌症的肿瘤抑制基因疗法和cd122/cd132激动剂的方法及组合物
US20210214445A1 (en) 2018-03-23 2021-07-15 Board Of Regents, The University Of Texas System Dual specificity antibodies to pd-l1 and pd-l2 and methods of use therefor
CN112088000A (zh) 2018-03-27 2020-12-15 得克萨斯州大学系统董事会 具有针对携带her2外显子19突变之癌细胞的抗肿瘤活性的化合物
GB201806022D0 (en) 2018-04-12 2018-05-30 Medimmune Ltd Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof
CN108624589B (zh) * 2018-04-17 2021-12-17 广州永诺生物科技有限公司 环状RNA circ-ERBB2及其检测试剂与应用
CN108484732A (zh) * 2018-06-08 2018-09-04 天津亨佳生物科技发展有限公司 一种治疗肿瘤的抗原肽链组及其在药物中的应用
CN108715603A (zh) * 2018-06-08 2018-10-30 天津亨佳生物科技发展有限公司 一种治疗肿瘤的抗原肽链组及其在药物中的应用
GB201814281D0 (en) 2018-09-03 2018-10-17 Femtogenix Ltd Cytotoxic agents
EP3870235A1 (de) 2018-10-24 2021-09-01 F. Hoffmann-La Roche AG Konjugierte chemische abbauauslöser und verwendungsverfahren
US20220033848A1 (en) 2018-11-19 2022-02-03 Board Of Regents, The University Of Texas System A modular, polycistronic vector for car and tcr transduction
EA202191463A1 (ru) 2018-11-28 2021-10-13 Борд Оф Риджентс, Дзе Юниверсити Оф Техас Систем Мультиплексное редактирование генома иммунных клеток для повышения функциональности и устойчивости к подавляющей среде
CA3121210A1 (en) 2018-11-29 2020-06-04 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods for ex vivo expansion of natural killer cells and use thereof
CN113227119A (zh) 2018-12-10 2021-08-06 基因泰克公司 用于与含Fc的蛋白质进行位点特异性缀合的光交联肽
GB201901197D0 (en) 2019-01-29 2019-03-20 Femtogenix Ltd G-A Crosslinking cytotoxic agents
WO2020163705A1 (en) 2019-02-08 2020-08-13 Board Of Regents, The University Of Texas System Telomerase-containing exosomes for treatment of diseases associated with aging and age-related organ dysfunction
CN114144514A (zh) 2019-05-09 2022-03-04 富士胶片细胞动力公司 产生肝细胞的方法
EP3968971A1 (de) 2019-05-17 2022-03-23 Cancer Prevention Pharmaceuticals, Inc. Verfahren zur behandlung familiärer adenomatöser polyposis
AU2020317009A1 (en) 2019-07-19 2022-02-03 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Chimeric antigen receptors containing Glypican 2 binding domains
JP2022547546A (ja) 2019-09-13 2022-11-14 エレクトロフィ，インコーポレイテッド 疾患の処置のための治療用生物学的作用剤の送達のための組成物及び方法
JP2022549504A (ja) 2019-09-26 2022-11-25 エスティーキューブ アンド カンパニー グリコシル化ｃｔｌａ－４に対して特異的な抗体およびその使用方法
US20220356248A1 (en) 2019-10-09 2022-11-10 Stcube & Co Antibodies specific to glycosylated lag3 and methods of use thereof
US20220380765A1 (en) 2019-11-02 2022-12-01 Board Of Regents, The University Of Texas System Targeting nonsense-mediated decay to activate p53 pathway for the treatment of cancer
WO2021113644A1 (en) 2019-12-05 2021-06-10 Multivir Inc. Combinations comprising a cd8+ t cell enhancer, an immune checkpoint inhibitor and radiotherapy for targeted and abscopal effects for the treatment of cancer
JP2023509516A (ja) 2020-01-07 2023-03-08 ボード オブ リージェンツ，ザ ユニバーシティ オブ テキサス システム がん治療のための改良型ヒトメチルチオアデノシン／アデノシン枯渇酵素変種
EP4107173A1 (de) 2020-02-17 2022-12-28 Board of Regents, The University of Texas System Verfahren zur expansion tumorinfiltrierender lymphozyten und deren verwendung
CA3178726A1 (en) 2020-05-21 2021-11-25 Gregory LIZEE T cell receptors with vgll1 specificity and uses thereof
WO2021247836A1 (en) 2020-06-03 2021-12-09 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods for targeting shp-2 to overcome resistance
WO2022006286A1 (en) 2020-06-30 2022-01-06 Lunglife Ai Methods for detecting lung cancer
GB2597532A (en) 2020-07-28 2022-02-02 Femtogenix Ltd Cytotoxic compounds
EP4243839A1 (de) 2020-11-13 2023-09-20 Catamaran Bio, Inc. Genetisch modifizierte natürliche killerzellen und verfahren zur verwendung davon
US20220162288A1 (en) 2020-11-25 2022-05-26 Catamaran Bio, Inc. Cellular therapeutics engineered with signal modulators and methods of use thereof
JP2024503480A (ja) 2021-01-19 2024-01-25 ウィリアム マーシュ ライス ユニバーシティ ポリペプチドの骨特異的送達法
GB2603166A (en) 2021-01-29 2022-08-03 Thelper As Therapeutic and Diagnostic Agents and Uses Thereof
IL310550A (en) 2021-08-04 2024-03-01 Univ Colorado Regents LAT-activating chimeric antigen receptor T cells and methods of using them
WO2023020612A1 (en) * 2021-08-20 2023-02-23 Biocytogen Pharmaceuticals (Beijing) Co., Ltd. Genetically modified non-human animal with human or chimeric her2
IL311790A (en) 2021-10-05 2024-05-01 Chang Hao Ming Natural killer cells and methods of their use
CN113699221B (zh) * 2021-10-19 2023-10-10 广州吉赛医疗科技有限公司 HER2 mRNA及环状RNA多重荧光定量PCR检测引物探针及其应用
IL311837A (en) 2021-10-20 2024-05-01 Takeda Pharmaceuticals Co BCMA designated preparations and methods for their use
WO2023076880A1 (en) 2021-10-25 2023-05-04 Board Of Regents, The University Of Texas System Foxo1-targeted therapy for the treatment of cancer
CN114262689A (zh) * 2021-12-17 2022-04-01 上海纳米技术及应用国家工程研究中心有限公司 一种快速检测cd19/cd20-car-t细胞活性的方法
GB202201137D0 (en) 2022-01-28 2022-03-16 Thelper As Therapeutic and diagnostic agents and uses thereof
WO2023172514A1 (en) 2022-03-07 2023-09-14 Catamaran Bio, Inc. Engineered immune cell therapeutics targeted to her2 and methods of use thereof
WO2023192976A1 (en) 2022-04-01 2023-10-05 Board Of Regents, The University Of Texas System Dual specificity antibodies to human pd-l1 and pd-l2 and methods of use therefor
WO2023211972A1 (en) 2022-04-28 2023-11-02 Medical University Of South Carolina Chimeric antigen receptor modified regulatory t cells for treating cancer
WO2023220083A1 (en) 2022-05-09 2023-11-16 Flagship Pioneering Innovations Vi, Llc Trem compositions and methods of use for treating proliferative disorders
WO2023230531A1 (en) 2022-05-24 2023-11-30 Lunglife Ai, Inc. Methods for detecting circulating genetically abnormal cells
WO2023239940A1 (en) 2022-06-10 2023-12-14 Research Development Foundation Engineered fcriib selective igg1 fc variants and uses thereof
WO2024138128A2 (en) 2022-12-23 2024-06-27 Genentech, Inc. Cereblon degrader conjugates, and uses thereof

Family Cites Families (24)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
NL154600B (nl) * 1971-02-10 1977-09-15 Organon Nv Werkwijze voor het aantonen en bepalen van specifiek bindende eiwitten en hun corresponderende bindbare stoffen.
NL154598B (nl) * 1970-11-10 1977-09-15 Organon Nv Werkwijze voor het aantonen en bepalen van laagmoleculire verbindingen en van eiwitten die deze verbindingen specifiek kunnen binden, alsmede testverpakking.
US3817837A (en) * 1971-05-14 1974-06-18 Syva Corp Enzyme amplification assay
US3901654A (en) * 1971-06-21 1975-08-26 Biological Developments Receptor assays of biologically active compounds employing biologically specific receptors
US3766162A (en) * 1971-08-24 1973-10-16 Hoffmann La Roche Barbituric acid antigens and antibodies specific therefor
US3935074A (en) * 1973-12-17 1976-01-27 Syva Company Antibody steric hindrance immunoassay with two antibodies
US3996345A (en) * 1974-08-12 1976-12-07 Syva Company Fluorescence quenching with immunological pairs in immunoassays
US4034074A (en) * 1974-09-19 1977-07-05 The Board Of Trustees Of Leland Stanford Junior University Universal reagent 2-site immunoradiometric assay using labelled anti (IgG)
US3984533A (en) * 1975-11-13 1976-10-05 General Electric Company Electrophoretic method of detecting antigen-antibody reaction
US4098876A (en) * 1976-10-26 1978-07-04 Corning Glass Works Reverse sandwich immunoassay
US4233402A (en) * 1978-04-05 1980-11-11 Syva Company Reagents and method employing channeling
US4452901A (en) * 1980-03-20 1984-06-05 Ciba-Geigy Corporation Electrophoretically transferring electropherograms to nitrocellulose sheets for immuno-assays
US7838216B1 (en) * 1986-03-05 2010-11-23 The United States Of America, As Represented By The Department Of Health And Human Services Human gene related to but distinct from EGF receptor gene
US5401638A (en) * 1986-06-04 1995-03-28 Oncogene Science, Inc. Detection and quantification of neu related proteins in the biological fluids of humans
ES2106033T3 (es) * 1989-05-19 1997-11-01 Genentech Inc Dominio extracelular de her2.
DK0444181T3 (da) * 1989-08-04 2002-02-25 Schering Ag C-erbB-2 eksternt domæne: gp75
ATE120860T1 (de) * 1990-01-26 1995-04-15 Washington Res Found Immunreaktivität gegenüber exprimierten aktivierten oncogenen zur diagnose und behandlung von bösartigen geschwülsten.
US5958784A (en) * 1992-03-25 1999-09-28 Benner; Steven Albert Predicting folded structures of proteins
CA2157510A1 (en) * 1993-03-05 1994-09-15 Howard M. Grey Hla-a2.1 binding peptides and their uses
US5550214A (en) * 1994-02-10 1996-08-27 Brigham And Women's Hospital Isolated antigenic oncogene peptide fragments and uses
JPH10510988A (ja) * 1994-12-14 1998-10-27 ザ スクリップス リサーチ インスティテュート 腫瘍−特異的細胞毒性ｔ細胞のインビボ活性化
US6514942B1 (en) * 1995-03-14 2003-02-04 The Board Of Regents, The University Of Texas System Methods and compositions for stimulating T-lymphocytes
US5840839A (en) * 1996-02-09 1998-11-24 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Alternative open reading frame DNA of a normal gene and a novel human cancer antigen encoded therein
FR2812087B1 (fr) * 2000-07-21 2007-05-11 Inst Nat Sante Rech Med Procede de criblage de peptides utilisables en immunotherapie

Also Published As

Publication number Publication date
EP0817846A1 (de) 1998-01-14
KR100554186B1 (ko) 2007-04-11
NO974502D0 (no) 1997-09-29
AU5522296A (en) 1996-10-16
US20080076904A1 (en) 2008-03-27
CN1951398A (zh) 2007-04-25
CZ296618B6 (cs) 2006-05-17
EP1418235A2 (de) 2004-05-12
US5846538A (en) 1998-12-08
NO321941B1 (no) 2006-07-24
US7247703B2 (en) 2007-07-24
RU2236461C2 (ru) 2004-09-20
NZ306616A (en) 2001-03-30
KR19980703453A (ko) 1998-11-05
DK0817846T3 (da) 2005-11-07
BR9607889A (pt) 1999-08-10
MX9707501A (es) 1998-06-30
DE69634912D1 (de) 2005-08-11
WO1996030514A1 (en) 1996-10-03
US6664370B2 (en) 2003-12-16
CN1183117A (zh) 1998-05-27
US5801005A (en) 1998-09-01
JPH11502710A (ja) 1999-03-09
NO974502L (no) 1997-11-27
EP1418235A3 (de) 2004-08-11
JP4510147B2 (ja) 2010-07-21
EP0817846B1 (de) 2005-07-06
CA2216601A1 (en) 1996-10-03
AU708237B2 (en) 1999-07-29
ATE299180T1 (de) 2005-07-15
RU2004115492A (ru) 2005-11-10
CN1597953A (zh) 2005-03-23
HUP9801826A2 (hu) 1998-11-30
US6075122A (en) 2000-06-13
ES2245783T3 (es) 2006-01-16
US7655239B2 (en) 2010-02-02
US5876712A (en) 1999-03-02
PT817846E (pt) 2005-11-30
CZ309697A3 (cs) 1998-01-14
US20100087621A1 (en) 2010-04-08
US5726023A (en) 1998-03-10
NO20061723L (no) 1996-10-01
JP2008056679A (ja) 2008-03-13
CA2216601C (en) 2002-10-22
HUP9801826A3 (en) 2000-12-28
CZ296617B6 (cs) 2006-05-17
US20040082758A1 (en) 2004-04-29
CN1150318C (zh) 2004-05-19
US20020055614A1 (en) 2002-05-09

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DE69634912T2 (de) Intrazellulare domäne des her-2/neu proteins, für die prevention oder behandlung von bösartigen tumoren
US5869445A (en) Methods for eliciting or enhancing reactivity to HER-2/neu protein
JP2022046693A (ja) インターロイキン－２のスーパーアンタゴニスト、パーシャルアゴニスト及びアンタゴニスト
EP0817847B2 (de) Il-17 receptor
DE69837273T2 (de) Menschliches krebsantigen ny eso-1/cag-3 und dazu kodierendes gen
JP2002535004A (ja) ＨＥＲ−２／ｎｅｕ融合タンパク質
DE60133287T2 (de) Tumorantigen
US5264416A (en) Interleukin-7 receptors
IE903467A1 (en) Granulocyte-colony stimulating factor receptors
DE69931482T2 (de) Isolierte peptide die aminosäuresequenzen von ny-eso-1 entsprechen und an mhc-klasse i und mhc klasse ii moleküle binden, und deren verwendungen
WO1997000317A1 (en) Osteoclast growth regulatory factor
US8524491B2 (en) Compounds for eliciting or enhancing immune reactivity to HER-2/neu protein for prevention or treatment of malignancies in which the HER-2/neu oncogene is associated
Mackiewicz et al. Gene Therapy of Human Melanoma. Immunization of Patients with Autologous Tumor Cells Admixed with Allogeneic Melanoma Cells Secreting Interleukin 6 and Soluble Interleukin 6 Receptor. University School of Medical Sciences at GreatPoland Cancer Center, Poznań, Poland
WO1997000318A1 (en) Osteoclast growth regulatory factor
JPH09502358A (ja) 哺乳動物のチモカイン遺伝子
WO1991005046A1 (en) Granulocyte-colony stimulating factor receptors
US5194375A (en) Dna encoding interleukin-7 receptors and methods of use
DE102015106731A1 (de) Peptide für die Krebsimmuntherapie
US20030228325A1 (en) Isolated peptides which bind to HLA-B18 molecules and uses thereof
MXPA97007501A (en) Intracellular domain of protein her-2 / neu for the prevention or treatment of malignida
JP2002509712A (ja) Ｎｋ細胞活性化誘導リガンド（ｎａｉｌ）ｄｎａおよびポリペプチド、並びにそれらの使用
US20030100520A1 (en) Immunological process and constructs for increasing the hdl cholesterol concentration by dna vaccination
JP2001520884A (ja) ウイルスがコードするセマフォリンタンパク質受容体ｄｎａおよびポリペプチド

Legal Events

Date Code Title Description
8364 No opposition during term of opposition