RU2236461C2 - Внутриклеточный домен белка her-2/neu для предупреждения или лечения малигнизаций - Google Patents

Внутриклеточный домен белка her-2/neu для предупреждения или лечения малигнизаций Download PDF

Info

Publication number
RU2236461C2
RU2236461C2 RU97118145/13A RU97118145A RU2236461C2 RU 2236461 C2 RU2236461 C2 RU 2236461C2 RU 97118145/13 A RU97118145/13 A RU 97118145/13A RU 97118145 A RU97118145 A RU 97118145A RU 2236461 C2 RU2236461 C2 RU 2236461C2
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
polypeptide
neu
seq
dna
amino acid
Prior art date
Application number
RU97118145/13A
Other languages
English (en)
Other versions
RU97118145A (ru
Inventor
Мартин Э. ЧИВЕР (US)
Мартин Э. ЧИВЕР
Мэри Л. ДИСИС (US)
Мэри Л. ДИСИС
Original Assignee
Юниверсити Оф Вашингтон
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Юниверсити Оф Вашингтон filed Critical Юниверсити Оф Вашингтон
Publication of RU97118145A publication Critical patent/RU97118145A/ru
Application granted granted Critical
Publication of RU2236461C2 publication Critical patent/RU2236461C2/ru

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • A61K39/001102—Receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A61K39/001103—Receptors for growth factors
    • A61K39/001106—Her-2/neu/ErbB2, Her-3/ErbB3 or Her 4/ErbB4
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/461—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
    • A61K39/4611—T-cells, e.g. tumor infiltrating lymphocytes [TIL], lymphokine-activated killer cells [LAK] or regulatory T cells [Treg]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
    • A61K39/4643—Vertebrate antigens
    • A61K39/4644—Cancer antigens
    • A61K39/464402—Receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A61K39/464403—Receptors for growth factors
    • A61K39/464406—Her-2/neu/ErbB2, Her-3/ErbB3 or Her 4/ ErbB4
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4702—Regulators; Modulating activity
    • C07K14/4705—Regulators; Modulating activity stimulating, promoting or activating activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/71—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for growth factors; for growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/06—Linear peptides containing only normal peptide links having 5 to 11 amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57407—Specifically defined cancers
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57484—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites
    • G01N33/57488—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites involving compounds identifable in body fluids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G01N2333/71—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants for growth factors; for growth regulators
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/82—Translation products from oncogenes
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
    • Y10S530/806—Antigenic peptides or proteins
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
    • Y10S530/827—Proteins from mammals or birds
    • Y10S530/828—Cancer

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)

Abstract

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано в ветеринарии и медицине. В изобретении описаны полипептиды и нуклеиновые кислоты (нуклеотидные последовательности - в описании), кодирующие такие полипептиды, вызывающие или усиливающие иммунный ответ к белку HER-2/neu, а также их использование для лечения малигнизаций, ассоциированных с онкогеном HER-2/neu. Описан также слитый полипептид. Для иммунизации полипептид и слитый полипептид используют в сочетании с адъювантом. Предлагаются композиции для индукции или усиления Т-клеточного ответа на белок HER-2/neu на основе полипептида или ДНК, или вирусного вектора, управляющего экспрессией полипептида, а также композиции для иммунизации теплокровного животного против злокачественного образования на основе полипептида или ДНК, или вирусного вектора, управляющего экспрессией полипептида. Использование изобретения позволит более успешно осуществлять профилактику и терапию рака, в частности рака молочной железы. 10 н. и 20 з.п. ф-лы, 6 ил., 1 табл.

Description

Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение в общем смысле относится к полипептидам и молекулам нуклеиновой кислоты, кодирующим такие полипептиды, вызывающим или усиливающим иммунный ответ к белку HER-2/neu, включающее их использование для лечения малигнизаций, ассоциированных с онкогеном HER-2/neu.
Предпосылки изобретения
Несмотря на громадные финансовые затраты и человеческих ресурсов, рак остается одной из главных причин смертности женщин в возрасте между 35 и 74 годами. Рак молочной железы является наиболее обычной малигнизацией у женщин и частота возникновения рака молочной железы возрастает. Заболевание диагностируют у каждой одной из девяти женщин. Обычные методы для лечения рака молочной железы основаны на сочетании хирургии, радиации и химиотерапии. При лечении некоторых малигниэаций эти методы дают иногда положительный эффект. Однако эти методы не всегда успешны в отношении всех малигнизаций и рак молочной железы является наиболее часто инкурабельным при попытке лечения некоторых стадий. Необходимы альтернативные методы предупреждения и терапии.
Обычным признаком малигнизированности является неконтролируемый клеточный рост. Возникновение раковых клеток связано с процессом превращения клеток нормального фенотипа в клетки с малигнизированным фенотипом, способными автономно расти. Амплификация и сверхэкспрессия генов соматической клетки считается обычным первичным событием, которое приводит к превращению нормальных клеток в малигнизированные клетки. Характеристики малигнизированного фенотипа кодируются онкогенными генами и передаются во время клеточного деления прогенам трансформированных клеток.
Непрерывное исследование онкогенов позволило идентифицировать не менее сорока онкогенов, действующих в малигнизированных клетках и ответственных за трансформацию или связанных с трансформацией. Онкогены распределили в разные группы на основании их предполагаемой функции или местонахождения их генных продуктов (таких как экспрессируемый онкогеном белок).
Полагают, что онкогены важны для некоторых аспектов нормальной клеточной физиологии. В этом отношении онкоген HER-2/neu является членом семейства онкогенов тирозиновых протеинкиназ и в высокой степени обладает гомологией с рецептором эпидермального ростового фактора. Онкоген HER/2-neu, предположительно, играет роль в клеточном росте и/или клеточной дифференциации. По-видимому, HER-2/neu индуцирует малигнизацию через количественные механизмы, которые являются результатом увеличенной или неограниченной экспрессии фактически нормального генного продукта.
HER-2/neu (р185) представляет собой белковый продукт онкогена HER-2/neu. Ген HER-2/neu является амплифицированным, а белок HER-2/neu - сверхэкспрессированным в разнообразных видах рака, включая рак молочной железы, яичников, толстой кишки, легких и предстательной железы. HER-2/neu связан с малигнизацией. Обнаружено, что 50-60% карциномы протоков in situ и 20-40% всех видов рака молочной железы, а также субстанциальная фракция аденокарцином, возникает в яичниках, предстательной железе, толстой кишке и легких. HER-2/neu, прямо связанный не только с малигнизированным фенотипом, но и с агрессивностью малигнизации, был обнаружен у одной четвертой всех инвазивных видов рака молочной железы. Сверхэкспрессия HER-2/neu коррелирует с плохим прогнозом и рака молочной железы, и рака яичников. HER-2/neu представляет собой трансмембранный белок с относительной молекулярной массой 185 kd, длиной, приблизительно, 1255 аминокислот (аа). Он обладает внеклеточным связывающим доменом (ECD) из, приблизительно, 645 аа, обладающим 40%-ной гомологией с рецептором фактора роста эпидермиса (EGFR), высокогидрофобным трансмембранным якорным доменом (TMD) и карбоксиконцевым цитоплазматическим доменом (CD) из, приблизительно, 580 аа, обладающим 80%-ной гомологией с EGFR.
Из-за трудностей в современных методах терапии видов рака, ассоциированных с онкогеном HER-2/neu, существует необходимость совершенствования, в данной области, соединений и композиций. Настоящее изобретение восполняет эту потребность и, кроме того, несет другие, связанные с этим, выгоды.
Краткое изложение существа изобретения
Вкратце отметим, что настоящим изобретением создали полипептиды, молекулы нуклеиновой кислоты (управляющие экспрессией таких полипептидов) и вирусные векторы (управляющие экспрессией таких полипептидов) для применения в иммунизации теплокровных животных или для изготовления лекарственного средства для иммунизации при малигнизациях, ассоциированных с онкогеном HER-2/neu. Полипептид или молекулу нуклеиновой кислоты, в соответствии с этим изобретением, можно представить в виде композиции, которая включает в себя фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель. Такой полипептид, молекулу нуклеиновой кислоты, вирусный вектор или фармацевтическую композицию можно применить для иммунизации однократно (напр., при подозрении на малигнизацию) или периодически (напр., для индивидуумов с повышенным риском приобретенной или повторно приобретенной малигнизации). Лекарственное средство для иммунизации может быть полезным при лечении имеющейся опухоли или для предупреждения возникновения или повторного появления опухоли.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения создали полипептид, кодируемый последовательностью ДНК, выбранной из: (а) нуклеотидов 2026-3765SEQ ID NO:1; и (b) последовательностей ДНК, которые гибридизуют с нуклеотидной последовательностью, комплементарной нуклеотидам 2026-3765 из SEQ ID NO: 1 при умеренно строгих условиях, где последовательность ДНК кодирует полипептид, который дает иммунный ответ на белок HER-2/neu. В предпочтительном варианте осуществления полипептид имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2 от лизина, аминокислоты 676, до валина, аминокислоты 1255, или ее вариант, который дает, как минимум, эквивалентный иммунный ответ. Предусмотрено создание композиции, которая включает в себя полипептид настоящего изобретения, в соединении с фармацевтически приемлемым носителем или разбавителем.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения предусматривается создание полипептида или композиции настоящего изобретения для иммунизации теплокровного животного против малигнизации, ассоциированной с онкогеном HER-2/neu. В следующем варианте настоящего изобретения такой полипептид или композицию используют для изготовления лекарственного средства для иммунизации теплокровного животного против малигнизации, ассоциированной с онкогеном HER-2/neu.
В очередном варианте осуществления настоящего изобретения предусматривается создать молекулу нуклеиновой кислоты, управляющую экспрессией полипептида, в соответствии с настоящим изобретением, для иммунизации путем трансфекции клеток теплокровного животного молекулой нуклеиновой кислоты. В следующем варианте осуществления настоящего изобретения такую молекулу нуклеиновой кислоты используют для изготовления лекарственного средства для иммунизации теплокровного животного против малигнизации, ассоциированной с онкогеном HER-2/neu.
В очередном варианте осуществления настоящего изобретения предусматривается создать вирусный вектор, управляющий экспрессией полипептида, в соответствии с настоящим изобретением, для иммунизации, путем инфицирования клеток теплокровного животного данным вектором. В следующем варианте осуществления настоящего изобретения такой вирусный вектор используют для изготовления лекарственного средства для иммунизации теплокровного животного против малигнизации, ассоциированной с онкогеном HER-2/neu.
Эти и другие цели настоящего изобретения становятся ясными при обращении к нижеследующему детальному описанию и прилагаемым чертежам.
Краткое описание чертежей
Фигура 1 представляет результаты праймирования первичных Т-лимфоцитов полипептидом HER-2/neu с помощью дендритных клеток. Производимые костным мозгом DC генерировали с помощью GM-CSF и IL6 из СD34+-стволовых клеток. DC, пульс-меченные по полипептиду HER-2/neu, индуцировали протеин-специфическую пролиферацию автологичных CD4+/CD45RA+-Т-лимфоцитов после 7 дней культивирования Т-клеток с DC. Производимые костным мозгом СD34+-стволовые клетки культивировали в течение одной недели в бессывороточной среде, содержащей GM-CSF и IL-6, использовали в качестве АРС. АРС помещали в 96-луночные круглодонные планшеты (Corning, Corning, NY, США) при различных концентрациях и инкубировали в течение 16-18 часов с 20-25 мкг/мл рекомбинантного полипептида HER-2/neu. Из автологичных моноядерных клеток периферической крови выделяли СD4+-Т-лимфоциты в результате положительной селекции, используя колонки для проведения хроматографии по иммуносродству (CellPro, Inc., Bothell, WA, США). Антиген-меченные АПК- облучали (10 Gy) и в каждую лунку добавляли 105 СD4+-Т-лимфоцитов. Пролиферативный ответ Т-клеток измеряли по поглощению (3H)-тимидина (1 мкКи/лунку), добавляемого на 7-й день в течение 16-18 часов. Анализ пролиферации осуществляли в бессывороточной и цитокин-свободной среде в 5 репликах. Приведенные символы соответствуют:
Figure 00000002
DC + полипептид HER-2/neu + СD4+/СD45RА+-Т-клетки;
Figure 00000003
DC + СD4+/СD45RА+-Т-клетки; и
Figure 00000004
DC + полипетид HER-2/neu.
Фигура 2 показывает ответ СD4+-клеток на полипептид HER-2/neu. Применяя метод праймирования, описанный для Фигуры 1, СD4+-Т-клетки от нормальных доноров тестировали на ответ к человеческому рекомбинантному полипептиду HER-2/neu. Приведенные символы соответствуют:
Figure 00000005
SC-+CD4; и
Figure 00000006
SC+СD4+НЕR-2/nеu-полипептид. "SC" - это стволовые клетки.
Фигура 3 показывает, что крысы, иммунизированные крысиным полипептидом HER-2/neu, вырабатывают специфические крысиные антитела nеu. Крыс иммунизировали рекомбинантным крысиным полипептидом HER-2/neu, 25 а.е.м.г, в MPL или vaccel-адъюванте. Было проведено три иммунизации, каждая с 20-дневным интервалом. Через двадцать дней после последней иммунизации у крыс определяли антительный ответ на крысиный nеu. Животные, иммунизированные крысиным полипептидом HER-2/neu и vaccel-адъювантом, показали высокий титр специфических ответов крысиного nеu. Контрольных животных иммунизировали человеческим полипептидом HER-2/neu (чужеродный белок). В отдельных экспериментах крысы, иммунизированные 100 а.е.м.г и 300 а.е.м.г очищенного целого крысиного nеu, не вырабатывали детектируемых специфических антител nеu (данные не показаны). Данные представляют среднее и стандартное отклонение по 3 животным. Приведенные символы соответствуют:
Figure 00000007
крысиный полипептид HER-2/neu/MPL;
Figure 00000008
крысиный полипептид HER-2/nеu/vaccel;
Figure 00000009
только MPL;
Figure 00000010
только vaccel; и
Figure 00000011
контроль. "MPL" и "vaccel" представляют собой адъюванты (Ribi, Bozeman, МТ, США). "Neu" представляет собой HER-2/neu-белок.
Фигура 4 показывает, что пациенты с раком молочной железы обладают предсуществующим иммунитетом к полипептиду HER-2/neu. Пациента РМВС оценивали по включению тритиированного тимидина в 24 реплики. Отвечающие лунки оценивали как превышающие среднее и 3 стандартных отклонения (372 имп/мин) контрольных лунок. Этот пациент с позитивной стадией II рака молочной железы обладал существенным ответом на рекомбинантный человеческий полипептид HER-2/neu. Символ "р" соответствует пептидам белка HER-2/neu, символ "tt" соответствует столбнячному анатоксину, а символ "hHNP" соответствует рекомбинантному человеческому полипептиду HER-2/neu.
График на фигуре 5 иллюстрирует анализ высвобождения 51Сr, демонстрирующий ICD-специфичную активность ЦТЛ в линии Т-клеток, полученной путем примирования дендритных клеток (ДК), инфицированных рекомбинантным аденовирусом, экспрессирующим ICD. Анализ представлял собой стандартный 4-часовой анализ высвобождения 51Сr; мишени представляли собой аутологичные B-LCL, инфицированные рекомбинантным возбудителем коровьей оспы, экспрессирующим ICD, EGFP, или ничем не инфицированные. Каждая точка является усредненным результатом по трем сериям.
На фигуре 6 проиллюстрированы результаты анализа IFNy ELISPOT CD8+ Т-клеточных линий, полученных путем примирования ДК, инфицированными аденовирусом-ICD, в качестве антиген-презентирующих клеток. Результаты показаны в трек сериях в двух линиях, стимулированных в одном из циклов либо ДК, инфицированными аденовирусом-ICD (А), либо анти-СD3 (В), протестированных на аутологичных фибробластах, трансдуцированных ICD или EGFP. Фибробласты обрабатывали IFNγ за 48-72 часа до анализа и промывали для удаления цитокина. На лунку высевали 2×103 стимуляторов при 2×104 респондеров для исходной клеточной линии и при 4×104 респондеров для стимулированной клеточной линии.
Подробное описание изобретения
Перед изложением данного изобретения и для его понимания полезно разъяснить используемые в нем некоторые термины.
Полипептид HER-2/neu, - как он используется здесь, относится к части белка HER-2/neu (данный белок известен также как р185 или с-еrbВ2), имеющего аминокислотную последовательность SEQ ID NO:2- от лизина, аминокислота 676, до валина, аминокислота 1255; и может быть получен естественным образом, синтетически, биотехнологически или можно получить его функционально эквивалентный вариант, напр., при замене одной или нескольких аминокислот другой аминокислотой (кислотами) или не аминокислотой (кислотами), что существенно не влияет на получение или усиление иммунного ответа к белку HER-2/neu (напр., вариант стимулирует ответ с помощью хелперных Т-клеток или цитотоксических Т-клеток).
Пролиферация Т-клеток, - как она используется здесь, включает в себя размножение Т-клеток, а также стимуляцию Т-клеток, ведущую к размножению, т.е. инициацию событий, приводящих к митозу, и митозу как таковому. Способы обнаружения пролиферации Т-клеток обсуждаются ниже.
Как отмечено выше, настоящее изобретение относится к соединениям и композициям, вызывающим или усиливающим иммунитет к белковому продукту, экспрессированному онкогеном HER-2/neu, включающего малигнизацию у теплокровного животного, у которого амплифицированный ген HER-2/neu ассоциирован с малигнизациями. Ассоциация амплифицированного гена HER-2/neu с малигнизацией не требует, чтобы экспрессируемый белковый продукт гена присутствовал в опухоли. Например, сверхэкспрессия экспрессируемого белкового продукта может быть вовлечена в инициацию опухоли, но экспрессия белка может быть затем утрачена. Настоящее изобретение можно применить для того, чтобы вызвать или усилить эффективный аутохтонный иммунный ответ для превращения HER-2/neu-позитивной опухоли в HER-2/neu-негативную.
Более конкретно, раскрытие настоящего изобретения, в соответствии с одной из целей, показывает, что полипептид, базирующийся на отдельной части (полипептид HER-2/neu) экспрессируемого белкового продукта гена HER-2/neu, может быть узнан тимус-зависимыми лимфоцитами (в дальнейшем "Т-клетки") и поэтому аутохтонный иммунный Т-клеточный ответ можно использовать профилактически или для лечения малигнизаций, в которых такой белок есть или был сверхэкспрессирован. Раскрытие настоящего изобретения показывает также, в соответствии с другой целью, что молекулы нуклеиновой кислоты, управляющие экспрессией такого пептида, можно использовать для иммунизации отдельно взятыми или в вирусном векторе.
Вообще, популяции CD4+ Т-клеток рассматривают по функции в качестве хелперов/индукторов, благодаря высвобождению лимфокинов при стимулировании специфическим антигеном; однако, подгруппа СD4+-клеток может действовать в качестве цитотоксических Т-лимфоцитов (CTL). Аналогично рассматриваются по функции СD8+-Т-клетки, вследствие прямого лизиса антигенных мишеней; однако, в различных обстоятельствах они могут секретировать лимфокины, осуществляя хелперную или DTH-функцию. Несмотря на возможную перекрывающуюся функцию, фенотипические маркеры CD4 и CD8 сопряжены с узнаванием пептидов, связанных с антигенами МНС класса II или класса I. Узнавание антигена в контексте МНС класса II или класса I обязывает CD4+- и СD8+-Т-клетки отвечать на разные антигены или на один и тот же антиген, представленный в разных обстоятельствах. Связывание иммуногенных пептидов с антигенами МНС класса II наиболее обычно наблюдается для антигенов, поглощаемых антигенпрезентирующими клетками. Поэтому, CD4+-T-клeтки обычно узнают антигены, которые находились вовне опухолевых клеток. Напротив, при нормальных условиях, связывание пептидов с МНС класса II наблюдается только для белков, представленных в цитозоле и синтезированных самой мишенью, для белков внешней среды такая возможность исключается. Исключением из этого является связывание экзогенных пептидов с определенным мотивом, связывающим класс I, который находится за пределами клетки в высокой концентрации. Таким образом, CD4+- и СD8+-клетки обладают широко отличающимися функциями и тенденцией к узнаванию различных антигенов как отражением того, где эти антигены обычно пребывают.
Как описано в рамках настоящего изобретения, полипептидная часть белкового продукта, экспрессированного онкогеном HER-2/neu, распознается Т-клетками. Циркулирующий полипептид HER-2/neu деградирует до пептидных фрагментов. Пептидные фрагменты данного полипептида связываются с антигенами главного комплекса гистосовместимости (МНС). Благодаря расположению пептида, связанного с антигеном МНС на клеточной поверхности, и узнавания хозяйскими Т-клетками комбинации пептид плюс собственный антиген МНС, полипептид HER-2/neu (в том числе и экспрессированный на малигнизированной клетке) будет иммуногенным для Т-клеток. Тонкая специфичность Т-клеточного рецептора дает возможность отдельным T-клеткам распознавать пептиды, которые отличаются по единственному аминокислотному остатку.
В течение иммунного ответа на пептидный фрагмент данного полипептида Т-клетки, экспрессирующие Т-клеточный рецептор, с высоким сродством связывающие комплекс пептид-МНС, будут связывать данный комплекс пептид-МНС и, таким образом, становиться активированными и индуцированными для того, чтобы пролиферировать. При первом столкновении с пептидом небольшое число иммунных Т-клеток будет секретировать лимфокины, пролиферировать и дифференцироваться на эффекторные и Т-клетки памяти. Первичный иммунный ответ, происходящий in vivo, трудно обнаруживать in vitro. Следующее столкновение с тем же антигеном Т-клеток памяти дает быстрый и более сильный иммунный ответ. Этот второй ответ можно наблюдать и in vivo, и in vitro. Данный in vitro ответ легко оценить путем измерения уровня пролиферации, уровня образования цитокинов или генерацией цитолитической активности Т-клеточной популяции, повторно подверженной действию антигена. Существенную пролиферацию Т-клеточной популяции в ответ на отдельный антиген считают указанием прежнего воздействия или праймирования по антигену.
Соединения этого изобретения повсеместно включают в себя HER-2/neu-полипептид или молекулы ДНК, которые управляют экспрессией таких пептидов, где молекулы ДНК могут присутствовать в вирусном векторе. Как отмечено выше, полипептиды настоящего изобретения включают в себя варианты полипептида SEQ ID NO:2, от аминокислоты 676 до аминокислоты 1255, которые сохраняют способность стимулировать иммунный ответ. Такие варианты включают различные структурные виды естественного полипептида. Благодаря наличию ионизируемых амино- и карбоксильных групп, к примеру, полипептид HER-2/neu может существовать в виде кислой или основной соли или находиться в нейтральной форме. Отдельные аминокислотные остатки можно также модифицировать окислением или восстановлением.
Варианты, в рамках объема настоящего изобретения, включают также полипептиды, в которых первичная аминокислотная структура естественного полипептида HER-2/neu модифицирована в результате образования ковалентных или агрегативных конъюгатов с другими пептидами или полипептидами, или химическими составляющими, такими как гликозильные группы, липидные, фосфатные, ацетильные группы и т.п. Ковалентные производные можно получить, например, путем присоединения отдельных функциональных групп к боковым аминокислотным цепям или к N- или С-концам.
Настоящее изобретение включает также в себя гликозилированные или негликозилированные HER-2/neu-полипептиды. Полипептиды, экспрессируемые в экспрессионных системах дрожжей или млекопитающих, в зависимости от экспрессионной системы, могут быть похожими или незначительно отличаться по молекулярному весу и типу гликозилирования, в сравнении с естественными молекулами. Например, экспрессия ДНК, кодирующей полипептиды в бактериях, таких как Е.coli, обычно дает негликозилированные молекулы. N-гликозилированные сайты эукариотических белков характеризуются аминокислотным триплетом Asn-A1-Z, где A1 представляет собой любую аминокислоту, за исключением Pro, a Z представляет собой Ser или Thr. Полипептидные варианты HER-2/neu, имеющие инактивированные N-гликозилированные сайты, можно получить с помощью методик, известных рядовым специалистам в данной области, таких как методики олигонуклеотидного синтеза и лигирования или сайт-специфичного мутагенеза, и представленных в рамках объема этого изобретения. Альтернативно, к полипептиду HER-2/neu можно добавить N-сцепленные гликозилированные сайты.
Полипептиды этого изобретения включают также варианты полипептида SEQ ID NO:2 (т.е. варианты полипептида, имеющего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, от аминокислоты 676 до аминокислоты 1255), которые имеют аминокислотную последовательность, отличающуюся от этой последовательности из-за одной или нескольких делеций, вставок, замен или других модификаций. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения такие варианты, по существу, гомологичны естественному полипептиду HER-2/neu и сохраняют способность стимулировать иммунный ответ. "Существенная гомология", в том смысле как она здесь используется, относится к аминокислотным последовательностям, которые могут быть кодированы последовательностями ДНК, способными гибридизовать в умеренно строгих условиях с нуклеотидной последовательностью, комплементарной естественно встречаемой последовательности ДНК, кодирующей указанную здесь часть SEQ ID NO:2 (т.е. нуклеотиды 2026-3765 SEQ ID NO:1). Соответствующие умеренно строгие условия включают в себя предварительную отмывку в растворе 5 Х SSC, 0,5% SDS, 1,0 мМ EDTA (рН 8,0); гибридизацию при 50-65°С, 5 Х SSC, в течение ночи; последующее промывание, дважды, при 65°С в течение 20 минут в каждом промывании, 2Х, 0,5Х и 0,2Х SSC (содержащего 0,1% SDS). Такие гибридизующие последовательности ДНК также представлены в рамках объема этого изобретения. Действие любой такой модификации на способность полипептида HER-2/neu давать иммунный ответ можно легко определить (напр., анализируя способность мутантного полипептида HER-2/neu индуцировать Т-клеточный ответ, используя, например, методы, описанные здесь).
Обычно, аминокислотные замены можно произвести различными способами, чтобы создать другие варианты осуществления в рамках настоящего изобретения. Во-первых, аминокислотные замены можно, например, осуществить консервативно, т.е. замещаемую аминокислоту заместить аминокислотой, которая обладает сходными свойствами, так чтобы специалист в области пептидной химии мог бы рассчитывать, что вторичная структура и гидрофильная природа данного полипептида существенно не изменится. В большинстве случаев консервативным изменениям соответствуют нижеследующие группы аминокислот: (1) ala, pro, gly, glu, asp, gln, asn, ser, thr; (2) cys, ser, tyr, thr; (3) val, ile, leu, met, ala, phe; (4) lys, arg, his; и (5) phe, tyr, trp, his. Примером неконсервативного изменения является замещение аминокислоты одной группы на аминокислоту другой группы.
Другой способ осуществить аминокислотные замены, с образованием вариантов настоящего изобретения, состоит в идентификации и замещении аминокислот в мотивах Т-клеток, для возможного связывания с молекулами МНС класса II (для СD4+-Т-клеточного ответа) или с молекулами МНС класса I (для СD8+-Т-клеточного ответа). Пептидные сегменты (полипептида HER-2/neu), с мотивом для теоретически возможного связывания с молекулами МНС класса II, можно идентифицировать в компьютерном анализе. Например, можно использовать аналитический пакет белковой последовательности, Т Sites, который включает несколько компьютерных алгоритмов, предназначенных для различения возможных сайтов для Т-клеточного узнавания (Feller и de la Cruz, Nature 349:720-721, 1991). Использовали два поисковых алгоритма: (1) алгоритм AMPHI, описанный Margalit (Feller и de la Cruz, Nature 349:720-721, 1991; Margalit et al., J. Immunol. 138:2213-2229, 1987), идентифицирующий эпитопные мотивы по альфа-спиральной периодичности и амфипатичности; (2) алгоритм Rothbard и Taylor, идентифицирующий эпитопные мотивы по заряду и паттерну полярности (Rothbard и Taylor, EMBO 7:93-100, 1988). Сегменты обоих мотивов более всего подходят для связывания молекул МНС класса II. СD8+-Т-клетки узнают пептид, связанный с молекулами МНС класса I. Falk et al. определили, что пептиды, связывающиеся с отдельными молекулами МНС, обладают различимыми последовательностями мотивов (Falk et al., Nature 351:290-296, 1991). Пептидный мотив для связывания в бороздке HLA-A2.1 определили путем Эдмановской деградации пептидов, удаленных из молекул HLA-A2.1, культивируемой клеточной линии (Таблица 2, из Falk et al., см. выше). Способ, идентифицирующий обычный или усредненный, связывающий HLA-A2.1 пептид, состоящий из 9 аминокислот в длину с доминантным якорным остатком, встречается в положении 2 (L) и 9 (V). Обычно наблюдаемые, сильно связывающие, остатки были идентифицированы в положениях 2 (М), 4 (Е, К), 6 (V), и 8 (К). Данный идентифицированный мотив представляет среднее многих связывающих пептидов (см. таблицу)
Figure 00000012
Полученный пептидный мотив, определенный как теоретический, не является особенно строгим. Некоторые связывающие HLA-A2.1 пептиды, не содержащие ни доминантных якорных остатков, ни аминокислот, фланкирующих доминантные якорные остатки, играют главную роль в осуществлении или неосуществлении связывания. Не каждый пептид в представленном связывающем мотиве будет связывать, но некоторые пептиды без данного мотива будут связывать. Однако представленный мотив является достаточно ценным для осуществления идентификации некоторых пептидов, способных к связыванию. Отметим, что представленный HLA-A2.1-мотив несет 6 аминокислот между доминантными якорными аминокислотами по остаткам 2 и 9.
Последующую идентификацию пептидных мотивов в рамках полипептида HER-2/neu, аминокислотных замен, можно осуществить консервативно и неконсервативно. Последний тип замен предназначен для получения улучшенного полипептида, который является более сильным и/или перекрестно реагирует более обширно (МНС полиморфизм). Примером более сильного полипептида является тот, который связан с высоким сходством с той же молекулой МНС в качестве естественного полипептида, не влияя на специфичное узнавание Т-клетками естественного полипептида. Примером полипептида с расширенной перекрестной реактивностью является тот, который более широко индуцирует перекрестно-реагирующие иммунные ответы (т.е. связывается с большим рядом молекул МНС), чем естественный полипептид. Аналогично, одна или несколько аминокислот, находящиеся между пептидными мотивами и обладающие спейсерной функцией (напр., препятствует взаимодействию с молекулой МНС или Т-клеточным рецептором), могут быть замещены консервативно или неконсервативно. Рядовым специалистам в данной области очевидно, что полипептиды, содержащие одну или несколько аминокислотных замен, можно протестировать на полезность или вредность иммунологических взаимодействий в разнообразных опытах, в том числе и в тех, которые описаны здесь, что касается способности стимулировать Т-клеточное узнавание.
Варианты в рамках объема этого изобретения могут также содержать или, напротив, не содержать другие модификации, включая удаление или добавление аминокислот, которые обладают минимальным влиянием на нужные иммунологические свойства данного полипептида. Для рядовых специалистов в данной области понятно, что можно использовать неполные формы или неестественно протяженные формы полипептида HER-2/neu для создания требуемых иммунологических свойств, которые, приблизительно, эквивалентны полноразмерным формам естественного полипептида HER-2/neu. Цистеиновые остатки можно удалить или заместить другими аминокислотами, чтобы при ренатурации предотвратить образование некорректных внутримолекулярных дисульфидных мостиков. Другие подходы в мутагенезе вовлекают модификацию смежных двуосновных аминокислотных остатков, чтобы усилить экспрессию в дрожжевых системах, в которых присутствует активность протеазы КЕХ2.
Обычно полипептид HER-2/neu можно получить, используя геномную или клоновую кДНК, кодирующую белок. Геномная последовательность, которая кодирует полноразмерный HER-2/neu, представлена в SEQ ID NO:1, а предсказанная аминокислотная последовательность представлена в SEQ ID NO:2. Такие клоны можно выделить путем скринирования надлежащей экспрессионной библиотеки для клонов, которые экспрессируют белок HER-2/neu. Получение и скринирование библиотеки можно осуществить, используя методы, известные рядовым специалистам в данной области, такие как методы, описанные у Sambrook et al. Molecular Cloning: A laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, N.Y., 1989, которые включены здесь путем ссылки. Вкратце, их суть состоит в том, что экспрессионную библиотеку бактериофага культивируют на чашках и переносят на фильтры. Затем фильтры можно инкубировать с детектирующим реагентом. В контексте этого изобретения "детектирующий реагент" представляет собой любое соединение, способное связываться с белком HER-2/neu, которое можно затем выявлять любым из многих способов, известных рядовым специалистам в данной области. Обычные детектирующие реагенты, содержащие "связывающий агент", такой как протеин А, протеин G, IgG или лектин, присоединяются к репортерной группе. Предпочтительные репортерные группы включают в себя ферменты, субстраты, кофакторы, ингибиторы, красители, радионуклиды, люминисцетные группы, флуоресцентные группы и биотин. Более предпочтительно, чтобы репортерная группа представляла собой пероксидазу хрена, которую можно обнаружить в результате инкубации с субстратом, таким как тетра-метилбензидин или 2,2'-азино-ди-3-этилбензтиазолинсульфоновая кислота. Бляшки, содержащие геномную или кДНК последовательность, которые экспрессируют белок HER-2/neu, выделяют и очищают методами, известными рядовым специалистам в данной области. Соответствующие методы можно найти, например, у Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989.
Варианты полипептида, которые сохраняют способность стимулировать иммунный ответ, можно, в большинстве случаев, получить путем модификации определенной последовательности для одной или нескольких целей, описанных выше, анализируя полученный полипептид на способность стимулировать иммунный ответ, напр., Т-клеточный ответ. К примеру, такой анализ можно, как правило, осуществить в результате контактирования Т-клеток с модифицированным полипептидом и анализа полученного ответа. Естественно встречаемые варианты полипептида можно также выделить, например, путем скринирования надлежащей кДНК или геномной библиотеки с последовательностью ДНК, кодирующей полипептид или его вариант.
Вышеописанные модификационные последовательности можно интродуцировать, используя стандартные рекомбинантные методики, или путем автоматизированного синтеза модифицированного полипептида. Например, мутации можно интродуцировать в отдельные локусы путем синтеза олигонуклеотидов, содержащих мутантную последовательность, фланкированную сайтами рестрикции, что дает возможность лигирования с фрагментами естественной последовательности. После лигирования, полученная перестроенная последовательность кодирует аналог, обладающий требуемой аминокислотной вставкой, заменой или делецией.
Альтернативно, можно применять методики олигонуклеотид-направленного сайт-специфического мутагенеза для создания гена, в котором отдельные кодоны изменены в соответствии с требуемой заменой, делецией или вставкой. Типичные методы по осуществлению указанных выше изменений описаны Walder et al., Gene 42:133, 1986; Bauer et al., Gene 37:73, 1985; Craik, BioTechniques, January 1985, 12-19; Smith et al., Genetic Engineering: Principles and Methods, Plenum Press, 1981; и в Патентах США №4518584 и №4737462.
Мутации в нуклеотидных последовательностях, сконструированных для экспрессии таких HER-2/neu-полипептидов, должны, конечно, сохранять открытую рамку считывания кодирующих последовательностей и, предпочтительно, не должны создавать комплементарных областей, которые могли бы гибридизовать с произведенными вторичными структурами мРНК, такими как петли или шпильки. Хотя сайт мутации можно заранее определить, нет необходимости в том, чтобы определять природу мутации per se. Например, с целью отбора мутантов с оптимальными характеристиками по данному сайту, можно осуществить случайный мутационный процесс по кодону-мишени, а экспрессированные мутантные полипептиды HER-2/neu скринировать по нужной активности.
Не все мутации в нуклеотидной последовательности, которая кодирует полипептид HER-2/neu, будут экспрессироваться в конечный продукт. Например, можно осуществить нуклеотидные замены, которые усиливают экспрессию, в первую очередь, чтобы избежать образования в транскрибированной мРНК вторичной структуры в виде петель (см., напр.. Европейскую Патентную Заявку №75444А) или чтобы создать кодоны, которые более легко транслируются при помощи выбранного хозяина, такие как хорошо известные предпочтительные кодоны Е.coli для экспрессии в Е.coil.
Полипептиды настоящего изобретения, естественно встречаемые и модифицированные, предпочтительно получают с помощью методов рекомбинантных ДНК. Такие методы включают в себя операцию по введению последовательности ДНК, кодирующей полипептид HER-2/neu в рекомбинантный экспрессионный вектор и экспрессирование данной последовательности ДНК в рекомбинантной экспрессионной системе клетки бактерии, млекопитающего или насекомого в условиях, промотирующих экспрессию. Последовательности ДНК, кодирующие полипептиды, созданные с помощью этого изобретения, можно укомплектовать фрагментами кДНК и короткими олигонуклеотидными линкерами или наборами олигонуклеотидов для создания синтетического гена, который может быть вставлен в рекомбинантный экспрессионный вектор и экспрессирован в рекомбинантной экспрессионной единице.
Рекомбинантные экспрессионные векторы, содержащие последовательность ДНК, кодирующей HER-2/neu-полипептид, присоединенный путем сшивки к подходящим транскрипционным или трансляционным элементам, получали из генов млекопитающего, бактерии, вируса или насекомого. Такие регуляторные элементы включают в себя промотор транскрипции, необязательную операторную последовательность для контроля транскрипции, последовательность, кодирующую соответствующую мРНК рибосомных сайтов связывания, и последовательности, которые контролируют терминацию транскрипции и трансляции. Можно дополнительно инкорпорировать начало области репликации и селектируемый маркер для усиления узнавания трансформантов.
Области ДНК, когда они функционально связаны друг с другом, присоединяют путем сшивки. Например, ДНК для сигнального пептида (секреторный лидер) присоединяют путем сшивки к ДНК полипептида, если она экспрессируется в качестве предшественника, который участвует в секреции полипептида; промотор присоединяют путем сшивки к кодирующей последовательности, если она контролирует транскрипцию данной последовательности; а рибосомный участок связывания присоединяют путем сшивки к кодирующей последовательности, если она расположена таким образом, что допускает трансляцию. Вообще, присоединение путем сшивки подразумевает сцепление, а для случая секреторных лидеров, в открытой рамке считывание. Последовательности ДНК, кодирующие HER-2/neu-полипептиды, экспрессированные в микроорганизме, предпочтительно не будут содержать интроны, которые могли бы преждевременно терминировать транскрипцию ДНК в мРНК.
Экспрессионные векторы для бактериального использования могут включать в себя селектируемый маркер и бактериальное начало области репликации, полученные из коммерчески доступных плазмид, включающие в себя генетические элементы хорошо известного клонирующего вектора pBR322 (ATCC 37017). Такие коммерческие векторы включают в себя, например, рКК223-3 (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Швеция) и pGEMl (Promega Biotec, Madison, WI, США). Эти части "остова" pBR322 комбинируют с надлежащим промотором и экспрессируют структурную последовательность. Е.coli обычно трансформируют, используя производные pBR322, плазмидные производные из штаммов Е.coli (Bolivar et al., Gene 2:95, 1977). pBR322 содержит гены для амплификации и устойчивости к ампициллину и тетрациклину и, таким образом, предоставляет простые способы по идентификации трансформированных клеток.
Промоторы, обычно используемые в рекомбинантных бактериальных экспрессионных векторах, включают в себя β-лактамазную (пенициллиназную) и лактозную промоторную систему (Chang et al., Nature 275:615, 1978; и Goeddel et al., Nature 281:544, 1979), триптофановую (три) промоторную систему (Goeddel et al., Nucl. Acids Res. 8:4057, 1980; и Европейская Патентная Заявка №36776) и tac-промоторную (Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, p.412, 1982). Особенно полезная бактериальная экспрессионная система использует РL-промотор фага λ и термолабильный репрессор c1857ts. Плазмидные векторы доступны из Американской Коллекции Типовых Культур, в которой содержатся производные РL-промотора фага λ, включенного в плазмиду pHUB2, присущую штамму JMB9 Е.coli (ATCC 37092), и плазмиду pPLc28, присущую штамму RR1 Е.coli (ATCC 53082).
Соответствующие промоторные последовательности для дрожжевых векторов включают в себя промоторы для металлотионеина, 3-фосфоглицераткиназы (Hitzeman et al., J. Biol. Chem. 255:2073, 1980) или для других гликолитических ферментов (Hess et al., J. Adv. Enzyme Reg. 7:149, 1968; и Holland et al., Biochem 17:4900, 1978), таких как енолаза, глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа, гексокиназа, пируватдекарбоксилаза, фосфофруктокиназа, глюкозо-6-фосфат-изомераза, 3-фосфоглицератмутаза, пируваткиназа, триозофосфатизомераза, фосфоглюкоизомераза и глюкокиназа. Соответствующие векторы и промоторы для использования в дрожжевой экспрессии описаны, кроме того, у R. Hitzeman et al. Европейская Патентная Заявка №73657.
Предпочтительные дрожжевые векторы можно укомплектовать, используя последовательности ДНК из pBR322 для селекции и репликации в Е.coli (ген Аmpr и начало области репликации) и дрожжевые последовательности ДНК, включающие в себя репрессируемый глюкозой промотор ADH2 и секретируемый лидер α-фактора. Промотор ADH2 описан Russel et al. (J. Biol. Chem. 258:2674, 1982) и Beier et al. (Nature 300:724, 1982). Дрожжевой лидер α-фактора, который управляет секрецией гетерологичных белков, может быть вставлен между промотором и экспрессируемым структурным геном (см., напр., Kurjan et al. Cell 30:933, 1982; и Bitter et al. Proc. Natl. Acad. Scl. USA 81:5330, 1984). Лидерную последовательность можно модифицировать, чтобы она содержала вблизи своего 3'-конца один или несколько полезных сайтов рестрикции, способствующих слиянию лидерной последовательности с чужеродными генами. Транскрипционный и трансляционный контроль последовательностей в экспрессионных векторах, для применения трансформации клеток позвоночных, можно создать с помощью вирусных источников. Например, обычно используемые промоторы и энхансеры получают из полиомы, аденовируса2, обезьянего вируса 40 (SV40) и человеческого цитомегаловируса. Последовательности ДНК, полученные из вирусного генома SV40, например, начало области репликации SV40, ранний и поздний промотор, энхансер, сайты сплайсирования и полиаденилирования, можно использовать для создания других генетических элементов, необходимых для экспрессии гетерологичной последовательности ДНК. Ранний и поздний промоторы являются особенно полезными, поскольку оба легко получить из вируса в виде фрагмента, который также содержит начало области репликации SV40 (Fiers et al. Nature 273:113, 1978). Для включения можно также использовать маленькие или большие фрагменты SV40, создавая последовательность протяженностью, приблизительно, из 250 п.н., от сайта Hind III к сайту Вgl II, расположенному в вирусном начале области репликации. Кроме того, можно использовать вирусный геномный промотор, контрольную и/или сигнальную последовательности, создавая такие контрольные последовательности, которые совместимы с выбранной хозяйской клеткой. Типичные векторы можно сконструировать так, как описано у Okayama и Berg, Mol. Cell. Biol. 3:280, 1983.
Полезную систему для стабилизации высокоэкспрессионных рецепторных кДНК млекопитающего в эпителиальных клетках молочной железы у С127-мыщей можно сконструировать практически такой же, какая описана у Cosman еt al. (Mol. Immunol. 23:935, 1986). Предпочтительным эукариотическим вектором для экспрессии ДНК белка LbeIF4A является pDC406 (NcMahan et al.) EMBO J. 20:2821, 1991) и включает регуляторные последовательности, полученные из SV40, человеческого вируса иммунодефицита (HIV), и вируса Эпштейн-Барра (EBV). Другие предпочтительные векторы включают в себя pDC409 и pDC410, которые получены из pDC406. Вектор pDC410 получали из вектора pDC406 путем замещения начала области репликации EBV на последовательности, кодирующие большой Т-зависимый антиген SV40. Вектор pDC409 отличается от вектора pDC406, в котором сайт рестрикции Вgl II, за исключением множественного клонирующего сайта, был делетирован, получением уникального сайта Вgl II в рамках множественного клонирующего сайта.
Полезной клеточной линией, которая допускает эписомную репликацию экспрессионных векторов, таких как pDC406 и pDC409, содержащих начало области репликации EBV является CV-1/EBNA (АТСС CRL 10478). Клеточную линию CV-L/EBNA получили в результате трансфекции клеточной линии CV-1 геном, кодирующим ядерный антиген-I вируса Эпштейн-Барра (EBNA-1), а конститутивно экспрессируемый EBNA-1 вставляли непосредственно из раннего энхансера/промотора человеческого CMV.
Трансформированные хозяйские клетки представляют собой клетки, которые трансформировали или трансфицировали экспрессионными векторами, сконструированными с использованием методов рекомбинантной ДНК, и которые содержат последовательности, кодирующие полипептид HER-2/neu настоящего изобретения. Трансформированные хозяйские клетки могут экспрессировать желаемый HER-2/neu-полипептид, однако, хозяйские клетки, трансформированные для целей клонирования или амплификации ДНК HER-2/neu, не должны экспрессировать полипептид HER-2/neu. Экспрессированные полипептиды предпочтительно выделяются в культуральный супернатант, в зависимости от выбранной ДНК, но могут также депонироваться в клеточной мембране.
Соответствующие хозяйские клетки для экспрессии рекомбинантных белков включают в себя прокариотические, дрожжевые или эукариотические клетки высших организмов под контролем соответствующих промоторов. Прокариоты включают в себя грамотрицательные или грамположительные организмы, например, Е.coli или Bacilli. Высшие эукариотические клетки включают в себя адаптированные клеточные линии насекомых или происходящие от млекопитающих, как описано ниже. Бесклеточные трансляционные системы могли бы также использоваться для получения полипептидов HER-2/neu с применением РНК, полученными из ДНК-конструктов. Соответствующие клонирующие и экспрессионные векторы, используемые в клетках-хозяевах бактерий, грибков, дрожжей и млекопитающих, описаны, например, у Pouwels et al. Cloning Vectors: A Laboratory Manual, Elsevier, New York, 1985.
Прокариотических экспрессионных хозяев можно использовать для экспрессии HER-2/neu-полипептидов, которые нуждаются в экстенсивном протеолитическом и дисульфидном процессинге. Прокариотические экспрессионные векторы включают, как правило, один или несколько фенотипических селектируемых маркеров, например, ген, кодирующий белки, придающие устойчивость к антибиотику или восполняющие аутотрофную потребность, а начало области репликации, узнаваемое данным хозяином, гарантирует амплификацию в рамках данного хозяина. Соответствующие Прокариотические хозяева для трансформации включают в себя Е.coli. Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium и разные виды рода Psuedomonas, Streptomyces и Staphylococcus, хотя можно также использовать и других хозяев.
Рекомбинантные HER-2/neu-полипептиды можно также экспрессировать в дрожжах-хозяевах, предпочтительно из видов Saccharomyces, таких как S. cerevisiae. Дрожжи другого рода, такого как Pichia или Kluyveromyces, также можно использовать. Дрожжевые векторы содержат, обычно, начало области репликации, из 2 мк дрожжевой плазмиды или из автономно реплицирующейся последовательности (ARS), промотор, ДНК, кодирующую HER-2/neu-полипетид, последовательности для терминирования полиаденилирования и транскрипции и селектируемый ген. Предпочтительно, дрожжевые векторы включают в себя начало области репликации и селектируемый маркер, позволяющий трансформироваться и дрожжам, и Е. coli, например, ген устойчивости к ампициллину у Е.coli и ген trpl у S. cerevisiae, который создает селективный маркер для мутантного штамма дрожжей, утративших способность к росту на триптофане, и промотор, полученный из высокоэкспрессируемого дрожжевого гена для индукции транскрипции нижележащей структурной последовательности. Наличие повреждения гена trpl в геноме дрожжевой хозяйской клетки создает впоследствии эффективную среду для выявления трансформации, благодаря росту в отсутствие триптофана.
Надлежащие условия осуществления дрожжевой трансформации хорошо известны специалистам в данной области. Типичная методика, описанная у Hind et al. (Proc. Natl. Acad.. Sci. USA 75:1929, 1978), включает селекцию по Trp+ -трансформантам на селективной среде, состоящей из 0,67% основного дрожжевого азота, 0,5% казаминовых кислот, 2% глюкозы, 10 мг/мл аденина и 20 мг/мл урацила. Хозяйские штаммы, трансформированные с помощью векторов, включающие в себя ADH2-промотор, можно выращивать для экспрессии в богатой среде, состоящей из 1% дрожжевого экстракта, 2% пептона и 1% глюкозы с добавлением 80 мг/мл аденина и 80 мг/мл урацила. Дерепрессия промотора ADH2 наблюдается при исчерпании глюкозы среды. Неочищенные дрожжевые супернатанты собирали фильтрацией и держали при 4°С перед дальнейшей очисткой.
Для экспрессии рекомбинантного полипептида можно также использовать различные системы клеточной культуры млекопитающих или насекомых (напр., Spodoptera или Trichoplusia). Обзор бакуловирусных систем для получения гетерологичных полипептидов в клетках насекомых представлен, например, у Luckow и Summers, Bio/Technology 6:47, 1988. Примеры соответствующих хозяйских клеточных линий млекопитающих включают в себя COS-7-линии клеток почек обезьяны, описанные у Gluzman (Cell 23:175, 1981), и другие клеточные линии, способные экспрессировать соответствующий вектор, включающий в себя, например, CV-1/EBNA (АТСС CRL 10478), L-клетки, С127, 3Т3, овариальные клетки китайского хомячка (СНО), COS, NS-1, HeLa и ВНК клеточные линии. Экспрессионные векторы млекопитающих могут включать в себя нетранскрибируемые элементы, такие как начало области репликации, соответствующий промотор и энхансер, сцепленные с экспрессируемым геном, и другие 5'- или 3'-фланкирующие нетранскрибируемые последовательности и 5'- или 3'-нетранслируемые последовательности, такие как рибосом-связывающие саиты, сайт полиаденилирования, донорный и акцепторный сайты сплайсинга и последовательности, терминирующие транскрипцию.
Очищенные HER-2/neu-полипептиды можно получить путем культивирования соответствующих систем хозяин/вектор для экспрессии рекомбинантных трансляционных продуктов ДНК настоящего изобретения, которые затем выделяют очисткой из культуральной среды или клеточных экстрактов. Например, супернатанты из систем, которые выделяют рекомбинантный полипептид в культуральную среду, можно, во-первых, сконцентрировать, используя коммерчески доступные фильтры для концентрирования белков, такие как изделия фирмы Amicon или Millipore Pellicon. После стадии концентрирования концентрат можно нанести на матрицу очистки. К примеру, соответствующая матрица по сродству может включать в себя белок противоположной структуры (напр., белок, с которым полипептид HER-2/neu связывается путем специфического взаимодействия, основанным на структуре) или лектин, или молекула антитела, связанная с соответствующим носителем. Альтернативно, можно использовать анионобменную смолу, например матрицу или субстрат, обладающие дополнительными диэтиламиноэтиловыми (DEAE) группами. Матрицы могут быть акриламидными, агарозными, декстрановыми, целлюлозными или других типов, обычно употребляемых для очистки белка. Альтернативно, можно применить катионобменную стадию. Соответствующие катионобменники представлены различными нерастворимыми матрицами, включающими в себя сульфопропиловые или карбоксиметиловые группы. Сульфопропиловые группы являются предпочтительными. Гель-фильтрующая хроматография также предоставляет возможности по очистке HER-2/neu.
Хроматография по сродству является предпочтительным методом очистки полипептида HER-2/neu. При использовании методов, которые хорошо известны специалистам в данной области, моноклональные антитела к HER-2/neu-полипептиду, например, могут быть также пригодны для очистки хроматографией по сродству.
Наконец, одно- или многостадийная обращенно-фазовая жидкостная хроматография высокого давления (RP-HPLC), использующая гидрофобную RP-HPLC-среду (напр., силикагель, имеющий дополнительные метильные или другие алифатические группы) можно применить для дополнительной очистки композиции с HER-2/neu-полипептидом. Некоторые или все предшествующие стадии очистки, в различных сочетаниях, можно также применить для создания гомогенного рекомбинантного полипептида.
Рекомбинантный HER-2/neu-полипептид, полученный в бактериальной культуре, предпочтительно выделяют в результате начальной экстракции из клеточного осадка, с последующей одной или несколькими стадиями концентрирования, высаливанием, ионобменной или эксклюзионной хроматографией по размеру. Жидкостную хроматографию высокого давления (HPLC) применяли на конечных стадиях очистки. Бактериальные клетки, используемые для экспрессии рекомбинантного LbeIF4A-белка, можно разрушить с помощью любого подходящего способа, включая неоднократное замораживание-оттаивание, механическое разрушение или используя лизирующие клетки агенты.
Ферментация дрожжей, которые экспрессируют HER-2/neu-полипептид в виде секретируемого белка, очень упрощает очистку. Секретируемый белок, получаемый при крупномасштабной ферментации, можно очистить методами, описанными у Urdal et al. (J. Chromatog. 296:111, 1984). Этот источник описывает две последовательные стадии обращенно-фазовой HPLC для очистки рекомбинантного человеческого GM-CSF на препаративной HPLC -колонке.
Препараты HER-2/neu-полипептидов, синтезированных в рекомбинантной культуре, могут содержать клеточные компоненты, не относящиеся к HER-2/neu, в том числе и белки в количествах и качестве, которые зависят от соответствующих стадий очистки, осуществляемых при извлечении HER-2/neu-полипептида из данной культуры. Эти компоненты обычно имеют дрожжевой, прокариотический или эукариотический, не принадлежащий человеку, источник.. Такие препараты обычно свободны от других белков, которые в норме могут быть ассоциированы с HER-2/neu-белком, что естественно связано с их видовым происхождением.
Автоматизированный синтез представляет собой альтернативный способ получения полипептидов этого изобретения. Например, можно применять любую из коммерчески доступных твердофазных методик, такую как твердофазный метод синтеза Merrifield, в котором аминокислоты последовательно включаются в растущую аминокислотную цепь (см. Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 65:2149-2146, 1963). Оборудование для автоматизированного синтеза коммерчески доступно от поставщиков, таких как Applied Biosystems, Inc. of Foster City, Ca, и может быть в большинстве случаев задействовано в соответствии с инструкциями изготовителя.
В рамках одной из целей настоящего изобретения, использование HER-2/nеu-полипептида (или молекулы ДНК, которая управляет экспрессией такого пептида), для получения иммунного ответа к данному HER-2/neu-белку (в том числе и тому, который экспрессируется малигнизированным трансформантом, ассоциированному с онкогеном HER-2/neu), может быть выявлено. Представительные примеры таких малигнизированных трансформантов включают рак молочной железы, яичников, толстой кишки, легких и предстательной железы. Иммунный ответ к данному HER-2/neu-белку, однажды полученному при помощи HER-2/neu-полипептида, может быть долговечным и может долго детектироваться после иммунизации, независимо от того, присутствует или отсутствует данный белок в организме на момент тестирования. Иммунный ответ к данному HER-2/neu-белку, полученный в реакции с HER-2/neu-полипептидом, может быть выявлен в результате проверки на наличие или отсутствие, или усиления специфической активации CD4+- или CD8+-клеток. В частности, Т-клетки выделяли из иммунизированных особей с помощью стандартных методик (таких как центрифугирование лимфоцитов периферической крови в градиенте плотности Фиколл/Гипак) и инкубировали с HER-2/neu-белком. Например, Т-клетки можно инкубировать in vitro в течение 2-9 дней (обычно 4 дня) при 37°С с HER-2/neu-белком (обычно, 5 мкг/мл цельного белка или отобранных клеток, синтезирующих HER-2/neu-белок). По желанию, можно проинкубировать второй аликвот Т-клеточного образца в отсутствие HER-2/пеи-белка, который служит в качестве контроля.
Специфическую активацию CD4+- или СD8+-клеток можно выявлять разнообразными способами. Методы выявления специфической Т-клеточной активации включают в себя выявление пролиферации Т-клеток, образование цитокинов (напр., лимфокинов) или генерирование цитолитической активности (т.е., генерирование цитотоксических Т-клеток, специфичных по HER-2/neu-белку). Для CD4+-T-клeтoк предпочтительным способом по выявлению специфической Т-клеточной активации является обнаружение пролиферации Т-клеток. Для СD8+-Т-клеток предпочтительным способом выявления специфической Т-клеточной активации является обнаружение генерированной цитолитической активности.
Обнаружение пролиферации Т-клеток можно осуществить с помощью различных известных методик. Например, Т-клеточная пролиферация может быть обнаружена путем измерения скорости синтеза ДНК. Т-клетки, которые стимулировали к пролиферации, проявляют повышенную скорость синтеза ДНК. Обычный способ измерить скорость синтеза ДНК осуществляют, например, с помощью пульсмеченья культур Т-клеток тритиированным тимидином, нуклеозидным предшественником, который инкорпорируется во вновь синтезированную ДНК. Количество инкорпорированного тритиированного тимидина можно определить, используя жидкостный сцинтилляционный спектрофотометр. Другие способы обнаружения Т-клеточной пролиферации включают в себя измерение увеличения образования интерлейкина-2 (IL-2), потока Са2+ или поглощения красителя, такого как 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолий. Альтернативно, синтез лимфокинов (такого как гамма-интерферон) можно измерить или количественно определить по числу Т-клеток, которые могут отвечать на интактный р185HER-2/neu-белок.
При использовании или экспрессии HER-2/neu-полипептида Т-клетки, которые узнают HER-2/neu-белок, могут быть пролиферированы in vivo. Например, лекарственное средство, для иммунизации HER-2/nеu-пептидом (т.е. в виде вакцины), можно индуцировать непрерывной экспансией множества Т-клеток, необходимых для терапевтической атаки против опухоли, ассоциированной с онкогеном HER-2/neu. Обычно, от, около, 0,01 мкг/кг до, около, 100 мг/кг веса тела вводят внутрикожно, подкожно или внутривенно. Предпочтительная доза составляет от, около, 1 мкг/кг до, около, 1 мг/кг, но наиболее предпочтительной является доза от, около, 5 мкг/кг до, около, 200 мкг/кг. Специалистам в данной области очевидно, что количество и частота введения будет зависеть от ответа, получаемого от конкретного пациента. Желательно вводить полипептид HER-2/neu повторно. Специалистам в данной области очевидно, что вводить можно более чем один вид полипептида HER-2/neu, одновременно или последовательно. Предпочтительными пептидами, для использования в лекарственном средстве для иммунизации, являются пептиды, которые включают в себя аминокислотную последовательность SEQ ID NO:2, начинающуюся, примерно, от лизинового остатка на аминокислотной позиции 676 и простирающейся, примерно, до валинового остатка на аминокислотной позиции 1255. Специалистам в данной области необходимо иметь ввиду, что настоящее изобретение рассматривает использование интактного HER-2/neu-полипептида, а также деление такого полипептида на множество пептидов. Поодиночке, для иммунизации, не использовали ни интактный p185HER-2/neu-бeлoк, ни пептид, имеющий аминокислотную последовательность во всей полноте внеклеточного домена (т.е. пептид, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:2 от аминокислоты на позиции 1 до аминокислоты на позиции 650, плюс-минус, примерно, 1-5 позиций, и, с или без, первых 21 аминокислотных позиций).
HER-2/neu-полипептид (или нуклеиновая кислота) является, предпочтительно, рецептурным для использования в вышеуказанных способах в виде фармацевтической композиции (напр., вакцины). Фармацевтические композиции, в большинстве случаев, включают в себя один или несколько полипептидов в сочетании с фармацевтически приемлемым носителем, наполнителем или разбавителем. Такие носители не должны быть токсичными для реципиентов при используемых дозах и концентрациях. Рассматривается также использование HER-2/neu-полипетида в соединении с химиотерапевтическими агентами.
Помимо HER-2/neu-полипептида (который функционирует в качестве антигена) в вакцину желательно включать другие компоненты, такие как посредник для доставки антигена и иммуностимулирующие вещества, предназначенные для усиления белковой иммуногенности. Примеры посредников для доставки антигена включают в себя соли алюминия, вода-в-масле эмульсии, биодеградируемые масляные посредники, масло-в-воде эмульсии, биодеградируемые микрокапсулы и липосомы. Примеры иммуностимулирующих веществ (адъюванты) включают в себя N-ацетилмурамил-L-аланин-D-изоглутамин (MDP), липополисахариды (LPS), глюкан, IL-12, GM-CSF, гамма-интерферон и IL-15. Рядовым специалистам в данной области очевидно, что HER-2/neu-полипептид для вакцины можно получить синтетически и естественным способом.
Хотя в фармацевтических композициях этого изобретения можно использовать любой подходящий носитель, известный рядовым спецалистам в данной области, вид носителя меняется в зависимости от способа введения и того, является ли его высвобождение желательным. Для парентерального введения, такого как подкожная инъекция, носитель предпочтительно включает в себя воду, физраствор, спирт, жир, воск или буфер. Для перорального введения можно использовать любой из вышеуказанных носителей или твердый носитель, такой как маннит, лактоза, крахмал, стеарат магния, натриевый сахарин, тальк, целлюлоза, глюкоза, сахароза и углекисый магний. Биодеградируемые микросферы (напр., полилактикгалак-тид) также можно использовать в качестве носителей для фармацевтических композиций этого изобретения. Соответствующие биодеградируемые микросферы описаны, например, в Патентах США №4897268 и 5075109. HER-2/neu-полипептид можно инкапсулировать в биодеградируемую микросферу или связать с поверхностью микросферы. Например, в предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения полипептид, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:2 от аминокислоты 676 до аминокислоты 1255, инкапсулирован в биодеградируемую микросферу. В этом отношении, предпочтительным является то, что микросфера, примерно, более 25 микрон.
Фармацевтические композиции (в том числе, вакцины) могут также содержать разбавители, такие как буферы, антиоксиданты, такие как аскорбиновая кислота, низкомолекулярные (менее 10 остатков) полипептиды, белки, аминокислоты, углеводы, в том числе, глюкозу или доктрины, хелатирующие агенты, такие как ЭДТА, глутатион, и другие стабилизаторы и наполнители. Нейтральный забуференный физраствор или физраствор, смешанный с неспецифическим сывороточным альбумином, представляют собой типичные подходящие разбавители. Предпочтительно, продукт представляет собой лиофилизированную форму, с использованием надлежащих наполняющих растворов (напр., глюкозы) в качестве разбавителей.
Как альтернативу представляемым HER-2/neu-полипептидам, предмет изобретения включает в себя композиции, способные доставлять молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие HER-2/neu-полипептид. Такие композиции включают в себя рекомбинантные вирусные векторы (напр., ретровирусы (см. WO 90/07936, WO 91/02805, WO 93/25234, WO 93/25698 и W094/03622), аденовирус (см. Berkner, Biotechniques 6:616-627, 1988; Li et al. Hum. Gene Ther. 4:403-409, 1993; Vincent et al. Nat. Genet. 5:130-134, 1993; и Kolls et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:215-219, 1994), поксвирус (см. Патент США №4769330; Патент США №5017487; и WO 89/01973)), изолированную ДНК (см. WO 90/11092), молекулу нуклеиновой кислоты, скомплексированную с поликатионной молекулой (см. WO 93/03709), и нуклеиновую кислоту, ассоциированную с липосомами (см. Wang et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:7851, 1987). В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения ДНК присоединяли к убитому или инактивированному аденовирусу (см. Curiel et al. Hum. Gene Ther. 3:147-154, 1992; Cotton et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:6094, 1992). Другие подходящие композиции включают в себя сочетания ДНК-лиганд (см. Wu et al. J. Biol. Chem. 264:16985-16987, 1989) и липид-ДНК (см. Felgner et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:7413-7417, 1989). Кроме того, эффективность изолированной ДНК, поглощенной в клетках, можно повысить путем помещения ДНК в биодеградируемые бусинки.
В дополнение к прямым in vivo методикам, можно использовать ех vivo методики, в которых клетки удаляют из организма животного, модифицируют и помещают в то же или в другое животное. Очевидно, что для интродукции HER-2/neu-молекул нуклеиновой кислоты в тканевые клетки можно использовать любую из композиций в контексте ех vivo. Условия применения вирусных, физических и химических методов поглощения хорошо известны в данной области.
В соответствии с этим, настоящее изобретение является полезным для усиления или получения у пациента или в клеточной культуре клеточного иммунного ответа (напр., генерированием антигенспецифических цитолитических Т-клеток). Термин "пациент", как он используется здесь, относится к любому теплокровному животному, предпочтительно - к человеку. Пациент может быть поражен раковым заболеванием, таким как рак молочной железы, или может быть здоровым (т.е. не обнаруживать болезни и инфекции). "Клеточная культура" подразумевает любой препарат Т-клеток или выделенного компонента клеток (включая, но не ограничиваясь ими, макрофаги, моноциты, В-клетки и дендритные клетки). Такие клетки можно выделить с помощью любой методики, хорошо известными рядовым специалистам в данной области (такой как центрифугирование в градиенте плотности Фиколл-гипак). Данные клетки можно (но не обязательно) выделить от пациента, пораженного малигнизацией, ассоциированной с HER-2/neu, и могут быть вновь интродуцированы пациенту после лечения.
Настоящее изобретение указывает также, что HER-2/neu-полипептид, помимо того, что является иммуногенным к Т-клеткам, стимулирует В-клетки к образованию антител, способных узнавать HER-2/neu-полипептид. Антитела, специфичные (т.е., которые проявляют сродство к связыванию почти 107 литра/моль или лучше) по HER-2/neu-белку, можно найти в разных жидкостях тела, в том числе в сыворотке и в асците. Вкратце, суть заключается в том, что образец организменной жидкости выделяют из теплокровного животного, такого как человек, чтобы определить действительное наличие антител, специфичных к HER-2/neu-полипептиду. Организменную жидкость инкубируют с HER-2/neu-полипептидом при условиях и в течение времени, достаточных, чтобы позволить образоваться иммунокомплексам между данным полипептидом и антителами, специфичными к данному белку. Например, организменную жидкость и HER-2/neu-полипептид можно икубировать при 45°С в течение 24-48 ч. После инкубации реакционную смесь тестируют на наличие иммунокомплексов. Обнаружение одного или нескольких иммунокомплексов, образованных между HER-2/neu-полипептидом и антителами, специфичными к HER-2/neu-полипептиду можно осуществить с помощью различных известных методик, таких как радиоиммунный анализ (RIA) и твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA).
Соответствующий иммунный метод включает в себя методику сэндвич-иммунотеста David et al. (Патент США №4376110) с помощью двойных моноклональных антител; метод получения сэндвича из моноклонального-поликлонального антитела (Wide et al., Kirkham и Hunter, редакторы, Radio-immunoassay Methods, E. и S. Livingstone, Edinburgh, 1970); метод "вестерн-блот" Gordon et al. (Патент США №4452901), иммунопреципитацию меченного лиганда (Brown et al. J. Biol. Chem. 255:4980-4983, 1980); твердофазный иммунофер-ментный анализ, как он описан, например, у Raines и Ross (J. Biol. Chem. 257:5154-5160, 1982); иммуноцитохимические методики, включающие применение флуорохромов (Brooks et. al. Clin. Exp. Immunol. 39:477, 1980); и нейтрализацию активности [Bowen-Pope et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:2396-2400 (1984)], которые все включены здесь в качестве ссылки. Кроме вышеуказанных иммунных методов, использовали ряд других иммунных методов, в том числе и те, которые описаны в Патентах США №3817827; 3850752; 3901654; 3935074; 3984533; 3996345; 4034074 и 4098876, которые все включены здесь в качестве ссылки.
Для целей детектирования, HER-2/neu-полипептид ("антиген") мог быть помечен или быть немеченым. В случае немеченья, антиген обнаруживали в опытах по агглютинации. Кроме того, немеченый антиген можно использовать в сочетании с мечеными молекулами, которые реагируют с иммунокомплексами, или в сочетании с мечеными антителами (вторичные антитела), которые реагируют с антителом, направленным против HER-2/neu-полипептида, такими как антитела, специфичные по иммуноглобулину. Альтернативно, данный антиген может быть непосредственно помечен. Когда он помечен, репортерная группа может включать в себя радиоизотопы, флуорофоры, ферменты, люминофоры или красящие частицы. Эти и другие метки хорошо известны в данной области и описаны, например, в следующих Патентах США: №3766162; 3791932; 3817837; 3996345 и 4233402.
В обычном твердофазном иммуноферментном анализе антиген адсорбируется на поверхности лунки планшета для микротитрования. Остаточные белок-связывающие участки на поверхности лунки блокируются затем соответствующим агентом, таким как бычий сывороточный альбумин (BSA), инактивированной нагреванием нормальной козей сывороткой (NGS), BLOTTO (забуференный раствор сухого обезжиренного молока, которое содержит также консервант, соли и пеногаситель). Затем лунку инкубируют с образцом, предположительно содержащим специфическое антитело. Образец наносят неразбавленным или, что более часто, его можно разбавлять, обычно, в забуференном растворе, который содержит небольшое количество (0,1-5,0% по весу) белка, такого как BSA, NGS или BLOTTO. После инкубации в течение достаточно длительного времени, позволяющего осуществиться специфическому связыванию, лунку промывают для удаления несвязавшегося белка и затем инкубируют со специфическим иммуноглобулиновым антителом к другому виду, меченному репортерной группой. Репортерную группу можно выбрать из разных ферментов, включающих в себя пероксидазу хрена, бета-галактозидазу, щелочную фосфатазу и глюкозооксидазу. Специфическому связыванию позволяет осуществиться в течение достаточного периода времени, затем лунку снова промывают для удаления несвязавшегося конъюгата и добавляют субстрат для выбранного фермента. Развитие окраски и оптическую плотность содержимого лунки определяют визуально или инструментально.
В одном из предпочтительных вариантов осуществления этого аспекта настоящего изобретения, репортерную группу связывают с HER-2/neu-белком. Стадия детектирования иммунокомплексов предусматривает полное удаление любого несвязавшегося HER-2/neu-белка и последующее обнаружение наличия или отсутствия данной репортерной группы.
В другом предпочтительном варианте, репортерную группу связывают с вторичным антителом, способным связываться с антителами, специфичными по HER-2/neu-белку. Стадия детектирования иммунокомплексов предусматривает (а) полное удаление любого несвязавшегося антитела, (b) внесение вторичного антитела, (с) полное удаление любого несвязавшегося вторичного антитела и, затем, (d) детектирование наличия или отсутствия данной репортерной группы. Когда антитело, специфичное по HER-2/neu-белку, получают у человека, вторичное антитело представляет собой антитело к антителу человека.
В третьем предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения, для детектирования иммунокомплексов репортерную группу связывают с молекулой, способной связываться с иммунокомплексами. Стадия детектирования предусматривает (а) внесение данной молекулы, (b) полное удаление любой несвязавшейся молекулы и, затем, (с) детектирование наличия или отсутствия данной репортерной группы. Примером молекулы, способной связываться с соответствующими иммунокомплексами, является молекула протеина А.
Специалистам в данной области очевидно, что в рамках настоящего изобретения можно использовать разные методы по детектированию иммунокомплексов. Репортерные группы, приемлемые для применения в любом из данных методов, включают в себя радиоизотопы, флуорофоры, ферменты, люминофоры и красящие частицы.
В родственном аспекте настоящего изобретения, детекцию иммунокомплексов, образованных между HER-2/neu-полипептидом и антителами организменной жидкости, которая специфична по HER-2/neu-полипептиду, можно использовать для мониторинга эффективности терапии рака, в которой участвует HER-2/neu-полипептид малигнизации, ассоциированной с онкогеном HER-2/neu. Образцы организменной жидкости, взятой у индивидуумов до и после начала терапии, можно анализировать по иммунокомплексам, с помощью вышеописанных подходов. Вкратце, сравнивают количество иммунокомплексов, выявляемых в обоих образцах. Существенное изменение количества иммунокомплексов во втором образце (после начала терапии), по отношению к первому образцу, отражает успех терапии.
Нижеследующие примеры предлагаются способом иллюстрации, а не способом ограничения.
ПРИМЕРЫ
ПРИМЕР 1
ЭКСПРЕССИЯ И ОЧИСТКА РЕКОМБИНАНТНОГО ЧЕЛОВЕЧЕСКОГО HER-2/neu-ПОЛИПЕПТИДА
Человеческий HER-2/neu-полипептид воспроизводили методом ПЦР (напр., Патенты США №4683195; 4683202; 4800159) из плазмиды, полученной согласно Di Fiore et al. (King с еt al. Science 225:974-976, 1985; Di Fiore et al. Science 237:178-182, 1987), с использованием олигонуклеотидных праймеров, которыми дополнительно интродуцировали сайт рестрикции BssHII и сайт энтерокиназной протеазы по 5'-концу, а EcoRI-сайт - по 3'-концу. Праймер для 5'-конца представляет собой 5'-TCTGGCGCGCTGGATGACGATGACAAGAAACGACGGCAGCAGAAGATC-3’ (SEQ ID NO:3) праймер для 3'-конца представляет собой 5'-TGAATTCTCGAGTCATTACACTGGCACGTCCAGACCCAG-3' (SEQ ID NO: 4).
Получаемый 1,8 kb PCR-фрагмент субклонировали в Т-вектор из Novagen (Madison, WI, США), а последовательность из селектированных клонов определяли на автоматическом ДНК-секвенаторе ABI 373 (Applied Biosystems Inc., Foster City, CA, США), с использованием перекрывающихся секвенирующих праймеров. Затем PCR-фрагменты, с последовательностью, которая совпадает с опубликованной последовательностью ДНК для человеческой HER-2/neu-кДНК (SEQ ID NO:1; Coussens et al. Science 230:1132, 1985; Yamamoto et al. Nature 319:230, 1986), присоединяли с помощью BssHII-сайта к модифицированной тиоредоксин-редуктазе Е.coli для корректирования открытой рамки считывания. Используемую 6Хгистидиновую метку по сродству, для Ni-NTA очистки по сродству экспрессированного слитого белка, включали в участника слияния - тиоредоксин-редуктазу. Эту кДНК для слитого белка, trxA-человеческий HER-2/neu-полипептид, субклонировали в модифицированном экспрессионном векторе рЕТ для экспрессии в Е.coli.
Поскольку тиоредоксин-редуктаза, как сообщали, стабилизирует и солюбилизирует другие гетерологичные белки, экспрессируемые в Е.coli, она не придает сколь-нибудь ощутимого преимущества экспрессии в Е.coli человеческому HER-2/neu-полипептиду. Так как значительная часть слитого белка trx-HER-2/neu-полипептид была растворимой, он, в основном, экспрессировался во внутриклеточных тельцах. Во время экспрессии в Е.coli данный слитой белок был также подвержен деградации. Наличие тиоредоксин-редуктазы, как участника слияния, может, однако, стабилизировать белок в процессе очистки. Доступность моноклональных антител для тиреодоксин-редуктазы создает удобный маркер для последующей очистки.
Для очистки человеческого HER-2/neu-полипептида, слитого с тиреодоксин-редуктазой, содержащей 6XHis-метку по сродству, осадок клеток Е.coli ресуспендировали с протеазными ингибиторами и лизозимом и обрабатывали ультразвуком. Внутриклеточные тельца выделяли центрифугированием и троекратно промывали дезоксихолатом, последнюю промывку осуществляли в течение ночи для удаления LPS. Отмытые внутриклеточные тельца солюбилизировали в GuHCl для Ni-очистки. Ni-колонку промывали имидазолом в мочевине и диализовали против 10 мМ Tris pH 8,0. Извлечение HER-2/neu-полипептида, с использованием этих условий опыта, составляло 80-95% полноразмерного белка, загрязненного, в основном, разрушенным белком. Из 500 мл ферментированной жидкости извлекали 20 мг белка. Это составляет >98% HER-2/neu-полипептида. Данные методики, используемые здесь, хорошо известны специалистам в данной области и были описаны, например, у J. Sambrook с et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2-е изд., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, Cold Spring Harbor, New York, США.
ПРИМЕР 2
Дендритные клетки можно праймировать HER-2/neu-полипептидом
А. Получение культур DC из костного мозга
Культуры DC получали из СD34+-предшественников гемопоэтических клеток (НРС). СD34+-клетки выделяли очисткой из костного мозга нормальных доноров, с использованием сепарирующей системы Ceprate LC Kit (Cellpro, Bothell, WA, США). Степень очистки извлеченных СD34+-клеток, определяяемая в проточном цитометрическом анализе, составляла 80-95%. СD34+-клетки культивировали в бессывороточной среде (X-VIVO 10, Biowhittaker, Inc., Walkersville, MD, США) с добавлением L-глутамина (584 мкг/л), пенициллина (10 МЕ/мл, стрептомицина (100 мкг/мл), 100 нг/мл человеческого rGM-CSF и 50 нг/мл человеческого rIL-6 (Immunex, Seattle, WA, США).
Клетки собирали через 0-17 дней культивирования и использовали их для фенотипирования и анализа Т-клеточной стимуляции. GM-CSF в отдельности и в сочетании с IL-4 или, как описано, с TNFα индуцировал рост in vitro DC. В экспериментах с использованием KLH и OVA, в качестве антигенов для праймирования первичных Т-клеток, GM-CSF плюс IL-6 устойчиво давали стимуляцию, близкую к тотальной, но с пониженным фоном, и поэтому, по сравнению со стимуляцией GM-CSF плюс IL-4 или TNFα индекс стимуляции был выше.
В. Анализ Т-клеточного праймирования
Производимые костным мозгом СD34+-ПГК, культивированные в бессывороточной среде, содержащей GM-CSF и IL-6, использовали в качестве АРС после периода культивирования в течение 0-17 дней. Праймирующую способность DC определяли путем их культивирования с автологичными, первичными Т-лимфоцитами на наличие или отсутствие белкового антигена рекомбинантного человеческого HER-2/neu-полипептида (hHNP) (10 мкг/мл). СD4+-Т-лимфоциты выделяли из моноядерных клеток периферической крови путем положительной селекции с использованием колонок для проведения хроматографии по иммуносродству (CellPro, Inc., Bothell, WA, США). CD4+-CD45RA+-(первичные) Т-лимфоциты отбирали из CD4+-T-лимфоцитов, на проточном цитометрическом сортере, используя анти-СD45КА mAb, непосредственно конъюгированных с FITC (Immunotech, Westbrook, ME, США). Эти полученные CD4+-СD45RА+-Т-клетки имели 99% чистоты. Культуры DC в различных концентрациях помещали в 96-луночные круглодонные планшеты (Corning, Corning, NY, США) и инкубировали в течение 16-18 часов с hHNP в конечной концентрации 10 мкг/мл. Антиген-меченные DC облучали (10 Gy) и вносили автологичные CD4+-СD45RА+-Т-лимфоциты (5×104/лунку). Пролиферативный ответ Т-клеток измеряли по поглощению 3H-тимидина (1 мкКи/лунку), вносимого на 6-й день, в течение 16-18 часов. Изучение пролиферации осуществляли в бессывороточной и цитокин-свободной среде. Полученные результаты представлены на Фигуре 1. Фигура 2 показывает результаты тестирования CD4+-T-клеток от здорового донора на ответ к hHNP. Аналогичные данные получены для Т-клеток для девяти из десяти нормальных индивидуумов.
ПРИМЕР 3
Метод детектирования предшественников лимфоцитов, встреченных с низкой частотой
Можно применить три вида анализа для выявления CD4+-ответов: стандартный метод пролиферации, метод скрининга для низкочастотных событий и метод лимитирующих разведении (LDA). Стандартный пролиферативный анализ позволяет легко обнаруживать праймированные ответы. Индекс стимуляции профилеративного ответа предусматривает грубую корреляцию с частотой предшественника антигенреактивных Т-клеток. Любой специфический Пролиферативный ответ, выявляемый в PBL, считается праймированным ответом.
Чтобы обеспечить в большей мере количественную интерпретацию CD4+-T-клeтoчныx ответов, применили разработанную аналитическую систему для детектирования лимфоцитарного предшественника с низкой частотой ответов (описывается ниже). Этот анализ является простым и значительно менее дорогостоящим. В условиях, когда необходима большая точность, частоту предшественника учитывали, с помощью метода лимитирующих разведении (Bishop и Orosz, Transplantation 47:671-677, 1989).
Превышение ответов, по сравнению с обнаруживаемыми у нормальных индивидуумов, квалифицируется как праймирование ответов, и означает существование иммунитета. Ответы с низкой частотой, выявляемые только с помощью LDA, считаются непраймированными ответами. Отсутствие ответа при LDA или снижение ответов, по сравнению с обычным анализом популяции, рассматривается как устойчивость/анергия.
Вообще, праймированные CD4+-T-клeтoчныe ответы можно выявить в обычном пролиферативном анализе, тогда как в таком же анализе непраймированные ответы не выявляются. Обнаружение небольшого количества непраймированных Т-клеток ограничено из-за смешения фона тимидинового поглощения с автологичным смешанным лимфоцитарным ответом (AMLR) к собственному антигену МНС плюс ответы к процессированным собственным сывороточным белкам и экзогенно добавленным сывороточным белкам.
Чтобы установить и выявить непраймированные Т-клетки, применяли анализ системы низкочастотных ответов, основанный на Пуассоновской выборочной статистике (В: Pinnacles, Chiron Corporation, 2:1-2. 1991). Этот вид анализа относится, в частности, к низкочастотным событиям в том отношении, что если частота предшественника меньше, чем количество клеток в реплицированной культуре, требуется много повторов для обнаружения статистически значимого числа позитивов. Теоретически, анализ будет корректным для автологичных ответов в результате постановки известного позитивного контроля (такого как PHA или столбнячного анатоксина) и известного негативного контроля (без антигена) и оценивания всех данных наблюдений от самой нижней до самой высшей точки, независимо от принадлежности к экспериментальной группе. Значение предельной частоты вычисляют по уравнению предельной частоты = М + (F + 3D), где М = средняя арифметическая, F=3,29, множитель из таблиц стандартизованного нормального распределения, выбранный таким образом, чтобы не превышать 0,1% от "истинного негатива" нормально распределенного фона вышеуказанной предельной частоты, а SD = стандартное отклонение. В этом скринирующем анализе лунки, находящиеся выше предельной частоты, считаются истинными позитивами, которые потенциально содержат лимфоцит, который пролиферирует именно с интересующим антигеном. Хотя оценка частоты предшественника лимфоцита возможна при использовании этого метода, точное определение нуждается в формальном LDA -анализе.
ПРИМЕР 4
Вакцина, основанная на HER-2/neu-полипептиде, проявляет иммунность К HER-2/neu-белку
А. Животные
Крысы, используемые в этом исследовании, представлены штаммом 344 Fischer (CDF (F-344)/CrlBR) (Charles River Laboratories, Portage MI). Животных содержали в виварии Вашингтонского университета в условиях, свободных от определенных патогенов, и обычно использовали для экспериментальных исследований в возрасте между 3 и 4 месяцами.
В. Иммунизация
Крыс Fischer иммунизировали рекомбинантным крысиным HER-2/neu-полипептидом (rHNP) в разных адъювантах (MPL, Vaccel; Ribi, Bozeman, МТ, США). Животные получали 50 мкг rHNP в смеси с адъювантом подкожно. Через двадцать дней животных вторично иммунизировали 50 мкг rHNP, вводимого тем же образом. Еще через двадцать дней повторно иммунизированных животных, тестировали на наличие антител к крысиному HER-2/neu-белку (neu).
С. Клеточные линии
В качестве источника neu-белков использовали две клеточные линии. Линию раковых клеток молочной железы человека. SKBR3, которую маркировали сверхэкспрессором HER-2/neu (Американская Коллекция Типовых Культур, Rockville, MD), поддерживали в культуре в 10%-ной сыворотке плода коровы (FBS) (Gemini Bioproducts, Inc., Catabasas, CA) и RPMI. Линию клеток NIH/3T3, DHFR-G8, контрансфицированную cneu-p и pSV2-DHFR (Американская Коллекция Типовых Культур, Rockville, MD), использовали в качестве источника нетрансформирующего крысиного, nеu-белка (Bernards et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:6854-6858, 1987). Эту клеточную линию поддерживали в 10%-ной FBS и среде Игла, модифицированной Дюльбекко, с 4,5 г/л глюкозы. DНFR-G8-клетки пассировали в той же среде с добавлением 0,3 мкМ метотрексата в каждом третьем пассаже для поддержания neu-трансфектанта.
D. Получение клеточных лизатов
Лизаты линии SKBR3 и линии DHFR-G8 получали и использовали в качестве источника neu-белка. Вкратце, готовили лизирующий буфер, содержащий трис-основание, хлорид натрия и Тритон-Х (1%) рН 7,5. Добавляли протеазные ингибиторы; апротинин (1 мкг/мл), бензамидин (1 мМ) и PMSF (1 мМ). 1 мл лизирующего буфера использовали для суспендирования 107 клеток. Клетки встряхивали в течение 15 секунд каждые 10 минут в течение часа до их разрушения. Все процедуры выполняли на льду при 4°С в холодной комнате. После разрушения клетки откручивали на микроцентрифуге при 4°С в течение 20 минут. Супернатант отделяли от клеточного дебриса и хранили небольшими аликвотами при -70°С перед использованием. Наличие человеческого и крысиного nеu подтверждали с помощью Вестерн-блот-анализа.
Е.ELISAответов антител на крысиный nеu
4 96-луночных иммунологических планшета (Baxter SP, Redmond, WA: Dynatech Laboratories) инкубировали в течение ночи при 4°С с моноклональным антителом, специфичным к крысиному neu (Oncogene Science), 7.16.4, при концентрации 10 мкг/мл, разбавленного в карбонатном буфере (эквимолярные концентрации Na2CO3 и NaHCO3 pH 9,6). После инкубации все лунки блокировали PBS-1% BSA (Sigma Chemical, St. Louis, МО, США), 100 мкл/лунка, в течение 3 часов при комнатной температуре. Планшет промывали PBS-0.5% Tween и лизатой DHFRG8, мышиную клеточную линию трансфицировали ДНК крысиного nеu (Американская Коллекция Типовых Культур, Rockville, MD, США); источник крысиного neu-белка, вносили в перемежающиеся ряды. Планшет инкубировали в течение ночи при 4°С. Затем планшет промывали PBS-0.5% Tween и исследуемую сыворотку добавляли при следующих разведениях: 1:25-1:200. Эту сыворотку разбавляли в PBS-1% BSA-1% FBS-25 мкг/мл мышиного IgG-0,01% NaN3 и затем, последовательно, в PBS-1% BSA. Разбавленную сыворотку, из расчета 50 мкл/лунка, вносили в лунки и инкубировали 1 час при комнатной температуре. Каждую исследуемую сыворотку вносили в лунку с крысиным neu и в лунку без крысиного neu. Конъюгированные с пероксидазой хрена (HRP) антитела барана к анти-IG F(ab')2 крысы вносили в эти лунки при разведении 1:5000 в PBS-1% BSA и инкубировали в течение 45 минут при комнатной температуре (Amersham Co., Arlington Heights, IL, США). После последней промывки добавляли реактив для развития окраски, ТМВ (Kirkegaard и Perry Laboratories, Gaithersburg, MD). Цветную реакцию прочитывали при оптической плотности 450 нм. Оптическую плотность каждой разбавленной сыворотки вычисляли как ОП крысиного neu, покрывающего лунку, минус ОП лунок, покрытых PBS-1% BSA. Аналогичным образом оценивали также сыворотку животных, иммунизированных одним только адъювантом, и животных, иммунизированных hHNP (чужеродный белок). Эти результаты показаны на Фигуре 3.
F. Анализ Т-клеточной пролиферации
Для анализа ответов, специфичных к HER-2/neu-полипептиду, клетки свежевзятых селезенки или лимфатических узлов получали путем механического разрушения тканей, продавливания через металлическую сетку и промывания. 2×105 клеток/лунка селезенки и 1×105 клеток/лунка лимфатических узлов помещали в 96-луночные круглодонные планшеты для микротитрования (Corning, Corning, NY) в 6 репликах на исследуемую группу. Среда состояла из ЕНАА 120 (Biofluids) с L-глутамином, пенициллин/стрептомицином, 2-меркаптоэтанолом и 5% FBS. Клетки инкубировали с полипептидами. Через 4 дня клетки метили в течение 6-8 часов импульсной меткой с 1 мкКи [3H]тимидина и считали. Данные выражали в виде индекса стимуляции (SI), который определяли как среднюю экспериментальных лунок, деленную на среднюю контрольных лунок (без антигена). Для анализа ответов, специфичных к HER-2/neu-белку, клетки селезенки и лимфатических узлов культивировали для 3-х стимуляций in vitro. Для проведения анализа 1×105 культивированных Т-клеток селезенки или лимфатических узлов помещали в 96-луночные планшеты для микротитрования, как описано выше. Клетки инкубировали с 1 мкг/мл, очищенным хроматографией на колонке по иммуносродству крысиным neu (из DHFR-G8-клеток, как источнике крысиного neu). Через 4 дня лунки метили импульсной меткой в течение 6 часов с 1 мкКи [3H]тимидина и считали. Данные выражали в виде индекса стимуляции, который определяли как среднюю экспериментальных лунок, деленную на среднюю контрольных лунок (без антигена).
ПРИМЕР 5
Праймированные ответы к человеческому HER-2/neu-полипептиду можно обнаружить у пациентов, пораженных раком молочной железы
Гепаринизированную кровь получали от пациентов на II стадии рака молочной железы со сверхэкспрессией HER-2/neu. Моноядерные клетки периферической крови (РВМС) отделяли центрифугированием в градиенте плотности Фиколл-гипак. РВМС в концентрации 2×105/лунка помещали в 96-луночные круглодонные планшеты (Corning, Corning NY, США). По каждой экспериментальной группе осуществлено 24 реплики.
Антигены, состоящие из пептидов, полученных из HER-2/neu (длиной 15-20 аминокислот, начиная с первой аминокислоты указанной последовательности) 25 мкг/мл, человеческого HER-2/neu-полипептида (hHNP) 1 мкг/мл, столбнячного анатоксина 1 мкг/мл, и р30 пептида, полученного из анатоксина 25 мкг/мл, вносили в каждую из 24 реплик. Анализ проводили в среде, содержащей 10% человеческой сыворотки. Пролиферативный ответ Т-клеток измеряли по поглощению (3H)тимидина (1 мкКи/лунка), вносимого в течение 10 часов на 4-й день. Позитивные лунки, антигенреактивные лунки оценивали как позитивные, если количество имп/мин было выше средней и 3 стандартных отклонений для лунок без антигена. Полученные результаты показаны на Фигуре 4. Эта стадия II у пациента, пораженного раком молочной железы, обладала существенным ответом к рекомбинантному hHNP.
Пример 6
Иммунизация in vitro рекомбинантным аденовирусом, экспрессирующим icd, индуцирует иммунный ответ на белок HER-2/neu
Была продемонстрирована иммунизация in vitro с использованием инфекции дендритных клеток (ДК) рекомбинантным аденовирусом. Конструировали аденовирусный вектор, делегированный по Е1А и рекомбинантный по внутриклеточному домену (ICD) белка HER-2/neu, и полученный вектор использовали для инфицирования ДК. После созревания ДК с CD40-L инициировали примирующие культуры, содержащие 1,3×106 инфицированных и зрелых ДК и 1,8×107 МКПК. Культуры также содержали по 10 нг/мл IL-7 и IL-12, добавленных в 0 сутки и 10 МЕ/мл IL-2, добавленного на 3 сутки. Перед второй стимуляцией CD8+ клетки выделяли из культуры с использованием колонок MACS и CD8+ клетки повторно стимулировали в 24-луночных планшетах ДК, инфицированными аденовирусом-ICD, в качестве антиген-презентирующих клеток (АПК). Культуру еще дважды стимулировали аутологичными фибробластами, трансдуцированными с помощью ретровируса ICD, и тестировали на предмет ICD-специфичной активности ЦТЛ по методу анализа высвобождения 51Сr. Как показано на фиг.5, что культивируемая клеточная линия обладала специфичной активностью по отношению к ICD, поскольку указанная линия лизировала аутологичные клетки B-LCL, трансдуцированные с помощью возбудителя коровьей оспы ICD, но не лизировала трансдуцированные EGFP или интактные клетки.
Затем ICD-специфичную клеточную линию повторно стимулировали сначала аутологичными клетками B-LCL, трансдуцированные с помощью возбудителя коровьей оспы ICD, a затем либо аутологичными ДК, инфицированными аденовирусом-ICD, либо анти-CDS; обе указанные линии тестировали на предмет распознавания клеток-мишеней, экспрессирующих ICD, с помощью анализа IFNγ ELISPOT. Как показано на фиг.6, ICD-специфичная реактивность определялась как в культуре, стимулированной антигеном (вверху), так и в культуре, стимулированной анти-CD3 (внизу). Среднее количество пятен в трех сериях лунок составляло 344 для ICD-фибробластов и 22 для EGFP-фибробластов (стимуляция антигеном) и 365 (ICD) и 17 (EGFP) (стимуляция aнти-CD3).
Таким образом, иммунизация in vitro рекомбинантным аденовирусом, экспрессирующим ICD, индуцирует иммунный ответ на белок HER-2/neu.
Из вышеизложенного следует, что хотя конкретные варианты осуществления настоящего изобретения, описаны здесь в иллюстративных целях, в них можно вносить различные модификации без отклонения от существа и объема настоящего изобретения.
Figure 00000013
Figure 00000014
Figure 00000015
Figure 00000016
Figure 00000017
Figure 00000018
Figure 00000019
Figure 00000020
Figure 00000021
Figure 00000022
Figure 00000023
Figure 00000024
Figure 00000025
Figure 00000026
Figure 00000027

Claims (30)

1. Полипептид, кодируемый последовательностью ДНК, выбранной из (a) нуклеотидов 2026-3765 SEQ ID NO: 1 и (b) последовательностей ДНК, которые гибридизуются с нуклеотидной последовательностью, комплементарной нуклеотидам 2026-3765 SEQ ID NO:1 в умеренно жестких условиях, причем последовательность ДНК кодирует полипептид, который вызывает иммунный ответ на белок HER-2/neu и полная аминокислотная последовательность которого происходит из белка HER-2/neu, или фрагмент указанного полипептида, применяемые для иммунизации теплокровного животного для индукции или усиления Т-клеточного ответа на злокачественное новообразование, ассоциированное с онкогеном HER-2/neu.
2. Полипептид по п.1, применимый для иммунизации в сочетании с адъювантом.
3. Слитый полипептид, содержащий полипептид по п.1 или 2, связанный с пептидом или полипептидом, обладающим иммуногенными свойствами.
4. Полипептид по п.3, применимый для иммунизации в сочетании с адъювантом.
5. Молекула ДНК, применяемая для иммунизации для индукции или усиления Т-клеточного ответа на злокачественное новообразование, ассоциированное с онкогеном HER-2/neu, посредством трансфекции клеток теплокровного животного указанной молекулой ДНК, выбранной из (a) нуклеотидов 2026-3765 SEQ ID NO:1 и (b) последовательностей ДНК, которые гибридизуются с нуклеотидной последовательностью, комплементарной нуклеотидам 2026-3765 SEQ ID NO:l в умеренно жестких условиях, причем последовательность ДНК кодирует полипептид, который вызывает иммунный ответ на белок HER-2/neu и полная аминокислотная последовательность которого происходит из белка HER-2/neu.
6. Вирусный вектор, применяемый для иммунизации для индукции или усиления Т-клеточного ответа на злокачественное новообразование, ассоциированное с онкогеном HER-2/neu, посредством инфицирования клеток теплокровного животного вектором, управляющим экспрессией полипептида, кодируемого последовательностью ДНК, выбранной из (a) нуклеотидов 2026-3765 SEQ ID NO:1 и (b) последовательностей ДНК, которые гибридизуются с нуклеотидной последовательностью, комлементарной нуклеотидам 2026-3765 SEQ ID NO:1 в умеренно жестких условиях, причем последовательность ДНК кодирует полипептид, который вызывает иммунный ответ на белок HER-2/neu и полная аминокислотная последовательность которого происходит из белка HER-2/neu, или указанный полипептид, связанный с пептидом или полипептидом, обладающим иммуногенными свойствами.
7. Композиция для индукции или усиления Т-клеточного ответа на белок HER-2/neu, содержащая фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель в сочетании с полипептидом, кодируемым последовательностью ДНК, выбранной из (a) нуклеотидов 2026-3765 SEQ ID NO:1 и (b) последовательностей ДНК, которые гибридизуются с нуклеотидной последовательностью, комплементарной нуклеотидам 2026-3765 SEQ ID NO:1 в умеренно жестких условиях, причем последовательность ДНК кодирует полипептид, который вызывает Т-клеточный ответ на белок HER-2/neu, или указанный полипептид, связанный с пептидом или полипептидом, обладающим иммуногенными свойствами.
8. Композиция по п.7, где полипептид имеет аминокислотную последовательность из SEQ ID NO:2 от лизина в положении 676 до валина в положении 1255 включительно или ее вариант, который индуцирует по крайней мере эквивалентный иммунный ответ.
9. Композиция по п.7, содержащая полипептид, имеющий аминокислотную последовательность из SEQ ID NO:2 от лизина в положении 676 до валина в положении 1255 включительно, или его фрагмент, сохраняющий иммуногенную активность цельного полипептида.
10. Композиция по п.7, дополнительно содержащая адъювант.
11. Композиция для иммунизации теплокровного животного против злокачественного новообразования, ассоциированного с онкогеном HER-2/neu, содержащая фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель в сочетании с полипептидом, кодируемым последовательностью ДНК, выбранной из (a) нуклеотидов 2026-3765 SEQ ID NO:1 и (b) последовательностей ДНК, которые гибридизуются с нуклеотидной последовательностью, комплементарной нуклеотидам 2026-3765 SEQ ID NO:1 в умеренно жестких условиях, причем последовательность ДНК кодирует полипептид, который вызывает иммунный ответ на белок HER-2/neu, или указанный полипептид, связанный с пептидом или полипептидом, обладающим иммуногенными свойствами.
12. Композиция по п.11, где полипептид имеет аминокислотную последовательность из SEQ ID NO:2 от лизина в положении 676 до валина в положении 1255 включительно или ее вариант, который индуцирует по крайней мере эквивалентный иммунный ответ.
13. Композиция по п.11, содержащая полипептид, имеющий аминокислотную последовательность из SEQ ID NO:2 от лизина в положении 676 до валина в положении 1255 включительно, или его фрагмент, сохраняющий иммуногенную активность цельного полипептида.
14. Композиция по п.11, дополнительно содержащая адъювант.
15. Композиция для индукции или усиления Т-клеточного ответа на белок HER-2/neu, содержащая молекулу ДНК, выбранную из (a) нуклеотидов 2026-3765 SEQ ID NO:1 и (b) последовательностей ДНК, которые гибридизуются с нуклеотидной последовательностью, комплементарной нуклеотидам 2026-3765 SEQ ID NО:1 в умеренно жестких условиях, причем последовательность ДНК кодирует полипептид, который вызывает Т-клеточный ответ на белок HER-2/neu, или указанный полипептид, связанный с пептидом или полипептидом, обладающим иммуногенными свойствами.
16. Композиция по п.15, где полипептид имеет аминокислотную последовательность из SEQ ID NO:2 от лизина в положении 676 до валина в положении 1255 включительно или ее вариант, который индуцирует по крайней мере эквивалентный иммунный ответ.
17. Композиция по п.15, содержащая полипептид, имеющий аминокислотную последовательность из SEQ ID NO:2 от лизина в положении 676 до валина в положении 1255 включительно, или его фрагмент, сохраняющий иммуногенную активность цельного полипептида.
18. Композиция по п.15, дополнительно содержащая адъювант.
19. Композиция для иммунизации теплокровного животного против злокачественного новообразования, ассоциированного с онкогеном HER-2/neu, содержащая молекулу ДНК, выбранную из (a) нуклеотидов 2026-3765 SEQ ID NO:1 и (b) последовательностей ДНК, которые гибридизуются с нуклеотидной последовательностью, комплементарной нуклеотидам 2026-3765 SEQ ID N0:l в умеренно жестких условиях, причем последовательность ДНК кодирует полипептид, который вызывает иммунный ответ на белок HER-2/neu, или указанный полипептид, связанный с пептидом или полипептидом, обладающим иммуногенными свойствами.
20. Композиция по п.19, где полипептид имеет аминокислотную последовательность из SEQ ID NO:2 от лизина в положении 676 до валина в положении 1255 включительно или ее вариант, который индуцирует по крайней мере эквивалентный иммунный ответ.
21. Композиция по п.19, содержащая полипептид, имеющий аминокислотную последовательность из SEQ ID NO:2 от лизина в положении 676 до валина в положении 1255 включительно, или его фрагмент, сохраняющий иммуногенную активность цельного полипептида.
22. Композиция по п.19, дополнительно содержащая адъювант.
23. Композиция для индукции или усиления Т-клеточного ответа на белок HER-2/neu, содержащая вирусный вектор, управляющий экспрессией полипептида, кодируемого последовательностью ДНК, выбранной из (a) нуклеотидов 2026-3765 SEQ ID NO:1 и (b) последовательностей ДНК, которые гибридизуются с нуклеотидной последовательностью, комплементарной нуклеотидам 2026-3765 SEQ ID NО:1 в умеренно жестких условиях, причем последовательность ДНК кодирует полипептид, который вызывает Т-клеточный ответ на белок HER-2/neu, или указанный полипептид, связанный к с пептидом или полипептидом, обладающим иммуногенными свойствами.
24. Композиция по п.23, где полипептид имеет аминокислотную последовательность из SEQ ID NO:2 от лизина в положении 676 до валина в положении 1255 включительно или ее вариант, который индуцирует по крайней мере эквивалентный иммунный ответ.
25. Композиция по п.23, содержащая полипептид, имеющий аминокислотную последовательность из SEQ ID NO:2 от лизина в положении 676 до валина в положении 1255 включительно, или его фрагмент, сохраняющий иммуногенную активность цельного полипептида.
26. Композиция по п.23, дополнительно содержащая адъювант.
27. Композиция для иммунизации теплокровного животного против злокачественного новообразования, ассоциированного с онкогеном HER-2/neu, содержащая вирусный вектор, управляющий экспрессией полипептида, кодируемого последовательностью ДНК, выбранной из (a) нуклеотидов 2026-3765 SEQ ID NO:1 и (b) последовательностей ДНК, которые гибридизуются с нуклеотидной последовательностью, комплементарной нуклеотидам 2026-3765 SEQ ID NО:1 в умеренно жестких условиях, причем последовательность ДНК кодирует полипептид, который вызывает иммунный ответ на белок HER-2/neu, или указанный полипептид, связанный с пептидом или полипептидом, обладающим иммуногенными свойствами.
28. Композиция по п.27, где полипептид имеет аминокислотную последовательность из SEQ ID NO:2 от лизина в положении 676 до валина в положении 1255 включительно или ее вариант, который индуцирует по крайней мере эквивалентный иммунный ответ.
29. Композиция по п.27, содержащая полипептид, имеющий аминокислотную последовательность из SEQ ID NO:2 от лизина в положении 676 до валина в положении 1255 включительно, или его фрагмент, сохраняющий иммуногенную активность цельного полипептида.
30. Композиция по п.27, дополнительно содержащая адъювант.
RU97118145/13A 1995-03-31 1996-03-28 Внутриклеточный домен белка her-2/neu для предупреждения или лечения малигнизаций RU2236461C2 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US08/414,417 1995-03-31
US08/414,417 US5801005A (en) 1993-03-17 1995-03-31 Immune reactivity to HER-2/neu protein for diagnosis of malignancies in which the HER-2/neu oncogene is associated

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2004115492/13A Division RU2004115492A (ru) 1995-03-31 2004-05-21 Внутриклеточный домен белка her-2/neu для предупреждения или лечения малигнизаций

Publications (2)

Publication Number Publication Date
RU97118145A RU97118145A (ru) 1999-10-27
RU2236461C2 true RU2236461C2 (ru) 2004-09-20

Family

ID=23641368

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU97118145/13A RU2236461C2 (ru) 1995-03-31 1996-03-28 Внутриклеточный домен белка her-2/neu для предупреждения или лечения малигнизаций
RU2004115492/13A RU2004115492A (ru) 1995-03-31 2004-05-21 Внутриклеточный домен белка her-2/neu для предупреждения или лечения малигнизаций

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2004115492/13A RU2004115492A (ru) 1995-03-31 2004-05-21 Внутриклеточный домен белка her-2/neu для предупреждения или лечения малигнизаций

Country Status (19)

Country Link
US (9) US5801005A (ru)
EP (2) EP1418235A3 (ru)
JP (2) JP4510147B2 (ru)
KR (1) KR100554186B1 (ru)
CN (3) CN1150318C (ru)
AT (1) ATE299180T1 (ru)
AU (1) AU708237B2 (ru)
BR (1) BR9607889A (ru)
CA (1) CA2216601C (ru)
CZ (2) CZ296618B6 (ru)
DE (1) DE69634912T2 (ru)
DK (1) DK0817846T3 (ru)
ES (1) ES2245783T3 (ru)
HU (1) HUP9801826A3 (ru)
NO (2) NO321941B1 (ru)
NZ (1) NZ306616A (ru)
PT (1) PT817846E (ru)
RU (2) RU2236461C2 (ru)
WO (1) WO1996030514A1 (ru)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2612015C2 (ru) * 2015-06-29 2017-03-01 Общество с ограниченной ответственностью "Сибинтех" Пептид-иммуноген, используемый в терапевтической вакцине для лечения метастатического рака молочной железы у кошек и собак
RU2624862C2 (ru) * 2015-10-20 2017-07-07 Общество с ограниченной ответственностью "Эпитек" Пептид-иммуноген, используемый в терапевтической вакцине для лечения метастатического рака молочной железы

Families Citing this family (337)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7252829B1 (en) * 1998-06-17 2007-08-07 Idm Pharma, Inc. HLA binding peptides and their uses
JPH10510988A (ja) * 1994-12-14 1998-10-27 ザ スクリップス リサーチ インスティテュート 腫瘍−特異的細胞毒性ｔ細胞のインビボ活性化
US6514942B1 (en) * 1995-03-14 2003-02-04 The Board Of Regents, The University Of Texas System Methods and compositions for stimulating T-lymphocytes
US6685940B2 (en) * 1995-07-27 2004-02-03 Genentech, Inc. Protein formulation
US6267958B1 (en) 1995-07-27 2001-07-31 Genentech, Inc. Protein formulation
US20080220012A1 (en) * 1996-05-15 2008-09-11 Ragupathy Madiyalakan Therapeutic Compositions that alter the immune response
US8038994B2 (en) 1996-05-15 2011-10-18 Quest Pharmatech Inc. Combination therapy for treating disease
ES2193240T3 (es) * 1996-05-15 2003-11-01 Altarex Inc Metodo y composicion para reconformar antigenos multi-epitopicos para iniciar una respuesta inmune.
US7371376B1 (en) * 1996-10-18 2008-05-13 Genentech, Inc. Anti-ErbB2 antibodies
AU6020998A (en) * 1997-01-08 1998-08-03 Life Technologies, Inc. Methods for production of proteins
US6884435B1 (en) * 1997-01-30 2005-04-26 Chiron Corporation Microparticles with adsorbent surfaces, methods of making same, and uses thereof
US20040202680A1 (en) * 1997-01-30 2004-10-14 O'hagan Derek Microparticles with adsorbent surfaces, methods of making same, and uses thereof
WO1998033487A1 (en) * 1997-01-30 1998-08-06 Chiron Corporation Use of microparticles with adsorbed antigen to stimulate immune responses
ZA9811162B (en) * 1997-12-12 2000-06-07 Genentech Inc Treatment with anti-ERBB2 antibodies.
JP2002514573A (ja) * 1998-05-08 2002-05-21 スローン − ケッタリング インスティチュート フォー キャンサー リサーチ 能動的なワクチン接種のための組成物および方法
GB9810040D0 (en) * 1998-05-11 1998-07-08 Univ Nottingham Blood borne tumour markers
DE69939939D1 (de) 1998-08-11 2009-01-02 Idec Pharma Corp Kombinationstherapien gegen b-zell-lymphome beinhaltend die verabreichung von anti-cd20-antikörpern
US6573043B1 (en) * 1998-10-07 2003-06-03 Genentech, Inc. Tissue analysis and kits therefor
DE69941903D1 (de) * 1998-11-09 2010-02-25 Biogen Idec Inc Behandlung von patienten die eine knochenmarktransplantation oder eine transplantation peripherer blutstammzellen erhalten mit anti-cd20 antikörpern
KR20010103655A (ko) 1998-11-09 2001-11-23 케네쓰 제이. 울코트 키메라 항-ｃｄ２０항체를 이용한 순환성 종양세포와관련된 혈액학적 악성종양의 치료법
US6541214B1 (en) * 1998-11-13 2003-04-01 Oregon Heath Science University N-terminally truncated HER-2/neu protein as a cancer prognostic indicator
GB9827228D0 (en) 1998-12-10 1999-02-03 Univ Nottingham Cancer detection method and reagents
US7625859B1 (en) * 2000-02-16 2009-12-01 Oregon Health & Science University HER-2 binding antagonists
US7396810B1 (en) * 2000-08-14 2008-07-08 Oregon Health Sciences University Compositions and methods for treating cancer by modulating HER-2 and EGF receptors
US7393823B1 (en) 1999-01-20 2008-07-01 Oregon Health And Science University HER-2 binding antagonists
ATE425749T1 (de) 1999-01-27 2009-04-15 Cornell Res Foundation Inc Behandlung von mit her-2/neu-uberexprimierung einhergehendem krebs
US7198920B1 (en) 1999-01-29 2007-04-03 Corika Corporation HER-2/neu fusion proteins
TR200102191T2 (tr) * 1999-01-29 2001-12-21 Corixa Corporation HER-2/neu füzyon proteinleri.
CA2367692A1 (en) * 1999-03-15 2000-09-21 Introgen Therapeutics, Inc. Dendritic cells transduced with a wild-type self gene elicit potent antitumor immune responses
EP1754488A1 (en) 1999-05-24 2007-02-21 Introgen Therapeutics, Inc. Methods and compositions for non-viral gene therapy for treatment of hyperproliferative diseases
AU5045900A (en) * 1999-05-25 2000-12-12 Beth Israel Deaconess Medical Center Meth1 and meth2 polynucleotides and polypeptides
US20030086924A1 (en) * 1999-06-25 2003-05-08 Genentech, Inc. Treatment with anti-ErbB2 antibodies
ES2282120T3 (es) * 1999-06-25 2007-10-16 Genentech, Inc. Tratamiento del cancer de prostata con anticuerpos anti-erbb2.
US6949245B1 (en) * 1999-06-25 2005-09-27 Genentech, Inc. Humanized anti-ErbB2 antibodies and treatment with anti-ErbB2 antibodies
US20040013667A1 (en) * 1999-06-25 2004-01-22 Genentech, Inc. Treatment with anti-ErbB2 antibodies
US7041292B1 (en) 1999-06-25 2006-05-09 Genentech, Inc. Treating prostate cancer with anti-ErbB2 antibodies
JP4658423B2 (ja) * 1999-08-03 2011-03-23 ザ オハイオ ステイト ユニバーシティ Ｈｅｒ−２タンパク質に対する免疫反応性を増強するためのポリペプチドおよびポリヌクレオチド
US8557244B1 (en) 1999-08-11 2013-10-15 Biogen Idec Inc. Treatment of aggressive non-Hodgkins lymphoma with anti-CD20 antibody
PL202369B1 (pl) 1999-08-27 2009-06-30 Genentech Inc Zastosowanie przeciwciała skierowanego przeciw ErbB2, zastosowanie przeciwciała skierowanego przeciw ErbB oraz zestaw zawierający to przeciwciało
US20030157119A1 (en) * 1999-09-22 2003-08-21 Corixa Corporation Methods for diagnosis and therapy of hematological and virus-associated malignancies
EP1214595A2 (en) * 1999-09-22 2002-06-19 Corixa Corporation Methods for diagnosis and therapy of hematological and virus-associated malignancies
JP2003510334A (ja) * 1999-09-30 2003-03-18 コリクサ コーポレイション 癌及び感染症の予防及び治療のためのストレスタンパク質組成物及び方法
US7378096B2 (en) 1999-09-30 2008-05-27 Health Research, Inc. Stress protein compositions and methods for prevention and treatment of cancer and infectious disease
FR2801106B1 (fr) * 1999-11-12 2007-10-05 Commissariat Energie Atomique Procede de diagnostic d'une esst provoquee par une souche d'atnc dans un echantillon biologique et son utilisation dans le diagnostic differentiel des differentes souches d'atnc
WO2001041787A1 (en) * 1999-12-10 2001-06-14 Epimmune Inc. INDUCING CELLULAR IMMUNE RESPONSES TO HER2/neu USING PEPTIDE AND NUCLEIC ACID COMPOSITIONS
AU2744201A (en) * 1999-12-29 2001-07-09 Corixa Corporation Murine neu sequences and methods of use therefor
US20020039573A1 (en) * 2000-01-21 2002-04-04 Cheever Martin A. Compounds and methods for prevention and treatment of HER-2/neu associated malignancies
US6528060B1 (en) * 2000-03-16 2003-03-04 Genzyme Corporation Therapeutic compounds
DE60144516D1 (de) * 2000-03-30 2011-06-09 Dendreon Corp Zusammensetzungen und verfahren für eine auf dendritischen zellen basierende immuntherapie
AU5226201A (en) * 2000-04-13 2001-10-30 Bio Life Science Forschungs & Entwicklungsgesellschaft Mbh Vaccine against cancerous diseases which is based on mimotopes of antigens expressed on tumor cells
EP1280923A2 (en) * 2000-04-28 2003-02-05 Millennium Pharmaceuticals, Inc. 14094, a human trypsin family member and uses thereof
CN101711868A (zh) * 2000-05-19 2010-05-26 杰南技术公司 用于提高对ErbB拮抗剂癌症治疗的有效应答可能性的基因检测试验
US10293056B1 (en) 2000-05-24 2019-05-21 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods and compositions for non-viral gene therapy for treatment of hyperproliferative diseases
US20030232399A1 (en) * 2000-06-14 2003-12-18 Robertson John Forsyth Russell Cancer detection methods and reagents
FR2812087B1 (fr) * 2000-07-21 2007-05-11 Inst Nat Sante Rech Med Procede de criblage de peptides utilisables en immunotherapie
US7229623B1 (en) 2000-08-03 2007-06-12 Corixa Corporation Her-2/neu fusion proteins
JP2004522412A (ja) * 2000-08-14 2004-07-29 コリクサ コーポレイション Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ−関連悪性腫瘍の治療および診断のための組成物および方法
WO2002013847A2 (en) * 2000-08-14 2002-02-21 Corixa Corporation Methods for diagnosis and therapy of hematological and virus-associated malignancies
ES2377077T3 (es) 2000-10-18 2012-03-22 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Vacunas que comprenden al antígeno MAGE unido a un fragmento de proteína D
CA2429769C (en) * 2000-12-07 2016-04-26 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods of treatment involving human mda-7
US20040121946A9 (en) * 2000-12-11 2004-06-24 John Fikes Inducing cellular immune responses to her2/neu using peptide and nucleic acid compositions
US7507724B2 (en) * 2001-01-16 2009-03-24 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Therapy-enhancing glucan
US7906492B2 (en) * 2001-01-16 2011-03-15 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Therapy-enhancing glucan
PL206976B1 (pl) * 2001-02-20 2010-10-29 Ortho Mcneil Pharm Inc Sposoby wytwarzania zawiesiny CD8⁺ do stosowania w leczeniu podmiotu z rakiem lub czerniakiem, sposób produkcji nie występującej naturalnie komórki i nie występująca naturalnie linia komórkowa
US20040071671A1 (en) * 2001-02-20 2004-04-15 Leturcq Didier J. Cell therapy method for the treatment of tumors
ES2394293T3 (es) * 2001-02-28 2013-01-30 Bio Life Science Forschungs- Und Entwicklungsges.M.B.H. Vacuna contra cánceres que están asociados con el oncogén HER-2/neu
WO2002072766A2 (en) * 2001-03-09 2002-09-19 Board Of Regents, Universitx Of Texas System Induction of tumor immunity by variants of folate binding protein
GB0109297D0 (en) 2001-04-12 2001-05-30 Glaxosmithkline Biolog Sa Vaccine
WO2002099035A2 (en) 2001-05-31 2002-12-12 Chiron Corporation Chimeric alphavirus replicon particles
ATE345812T1 (de) * 2001-09-03 2006-12-15 Bio Life Science Forschungs & Entwicklungsgesellschaft Mbh Antigen-mimotope und vakzine gegen krebserkrankungen
US7718387B2 (en) 2001-09-20 2010-05-18 Board Of Regents, The University Of Texas System Measuring circulating therapeutic antibody, antigen and antigen/antibody complexes using ELISA assays
AU2003228267A1 (en) * 2002-03-05 2003-09-22 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods of enhancing immune induction involving mda-7
EP1482963A4 (en) * 2002-03-08 2010-06-09 Univ Texas CONTROLLED MODULATION OF LATERAL CHAIN LENGTH OF AMINO ACIDS OF ANTIGENS PEPTIDES
CA2481796A1 (en) * 2002-04-11 2003-10-23 Altarex Medical Corporation Binding agents and their use in targeting tumor cells
WO2004000102A2 (en) * 2002-06-19 2003-12-31 Abgenix, Inc. Method for predicting response to epidermal growth factor receptor-directed therapy
US20090110702A1 (en) 2002-07-12 2009-04-30 The Johns Hopkins University Mesothelin Vaccines and Model Systems and Control of Tumors
US9200036B2 (en) 2002-07-12 2015-12-01 The Johns Hopkins University Mesothelin vaccines and model systems
JP2006521090A (ja) 2002-07-12 2006-09-21 ザ ジョンズ ホプキンス ユニバーシティー メゾテリンワクチンおよびモデルシステム
US20060099224A1 (en) 2002-08-12 2006-05-11 David Kirn Methods and compositions concerning poxviruses and cancer
US20080019992A1 (en) * 2002-09-02 2008-01-24 Christoph Zielinski Antigen mimotopes and vaccine against cancerous diseases
CN1497255A (zh) * 2002-10-02 2004-05-19 ���µ�����ҵ��ʽ���� 被检测体用取样元件、被检测体处理装置及其处理方法
AU2003267077A1 (en) * 2002-11-12 2004-06-03 Millipore Corporation Evaporation control device for multiwell plates
GB2395270B (en) * 2002-11-14 2006-08-16 Univ Nottingham Tumour marker proteins and uses thereof
JP2006516117A (ja) * 2002-11-21 2006-06-22 ジェネンテック・インコーポレーテッド 抗ＥｒｂＢ２抗体を用いた非悪性疾病または疾患の治療
US7282365B2 (en) 2003-01-03 2007-10-16 Istituto Di Ricerche Di Biologia Molecolare P. Angeletti S.P.A. Rhesus HER2/neu, nucleotides encoding same, and uses thereof
EP1590437A4 (en) * 2003-01-24 2008-06-18 Agensys Inc NUCLEIC ACIDS SUITABLE FOR THE TREATMENT AND DETECTION OF CANCER AND CORRESPONDING PROTEINS NAMED 254P1D6B
WO2004078124A2 (en) * 2003-03-03 2004-09-16 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods and compositions involving mda-7
CA2522812C (en) * 2003-04-18 2012-08-21 Idm Pharma, Inc. Hla-a2 tumor associated antigen peptides and compositions
JP2007525187A (ja) * 2003-05-16 2007-09-06 レセプター・バイオロジクス・インコーポレイテッド イントロン融合タンパク質、ならびにその同定方法および使用方法
US7178491B2 (en) * 2003-06-05 2007-02-20 Caterpillar Inc Control system and method for engine valve actuator
EP2338506A3 (en) * 2003-06-17 2011-10-12 Mannkind Corporation Combinations of tumor-associated antigens for the treatment of various types of cancers
EP1649020B1 (en) * 2003-07-21 2017-01-11 MSD Italia S.r.l. Synthetic gene encoding human epidermal growth factor 2/neu antigen and uses thereof
GB0321615D0 (en) 2003-09-15 2003-10-15 Glaxo Group Ltd Improvements in vaccination
CN1901795B (zh) 2003-10-22 2014-03-26 弗雷德哈钦森癌症研究中心 用于在细胞，组织，器官，和有机体中诱导停滞的方法，组合物和装置
BR122018071808B8 (pt) 2003-11-06 2020-06-30 Seattle Genetics Inc conjugado
WO2005082396A2 (en) * 2003-12-01 2005-09-09 Introgen Therapeutics, Inc. Use of mda-7 to inhibit infection by pathogenic organisms
US20070281041A1 (en) * 2004-03-02 2007-12-06 Introgen Therapeutics, Inc. Compositions and Methods Involving MDA-7 for the Treatment of Cancer
AU2005245896A1 (en) * 2004-05-14 2005-12-01 Receptor Biologix, Inc. Cell surface receptor isoforms and methods of identifying and using the same
EP2471923B1 (en) 2004-05-28 2014-08-20 Asuragen, Inc. Methods and compositions involving microRNA
EP2286844A3 (en) 2004-06-01 2012-08-22 Genentech, Inc. Antibody-drug conjugates and methods
EP2277595A3 (en) 2004-06-24 2011-09-28 Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. Compounds for immunopotentiation
US20110104186A1 (en) 2004-06-24 2011-05-05 Nicholas Valiante Small molecule immunopotentiators and assays for their detection
US20100111856A1 (en) 2004-09-23 2010-05-06 Herman Gill Zirconium-radiolabeled, cysteine engineered antibody conjugates
NZ553500A (en) 2004-09-23 2009-11-27 Genentech Inc Genentech Inc Cysteine engineered antibodies and conjugates withCysteine engineered antibodies and conjugates with a free cysteine amino acid in the heavy chain a free cysteine amino acid in the heavy chain
EP1807106A2 (en) * 2004-10-05 2007-07-18 Oregon Health and Science University Compositions and methods for treating disease
JP4798801B2 (ja) * 2004-10-06 2011-10-19 ウェルスタット バイオロジクス コーポレイション 循環する癌細胞におけるＨｅｒ−２／ｎｅｕタンパク質のレベルの上昇の検出および処置
ES2503765T3 (es) 2004-11-12 2014-10-07 Asuragen, Inc. Procedimientos y composiciones que implican miARN y moléculas inhibidoras de miARN
US20060115862A1 (en) * 2004-11-17 2006-06-01 Duke University Anti-tenascin monoclonal antibody immunoassays and diagnostic kits
CN100381460C (zh) * 2004-11-30 2008-04-16 北京市肿瘤防治研究所 Her-2模拟抗原表位及含有该表位的肽
AU2005321904B2 (en) * 2004-12-29 2012-07-12 Mannkind Corporation Methods to elicit, enhance and sustain immune responses against MHC class I-restricted epitopes, for prophylactic or therapeutic purposes
AU2006211960A1 (en) * 2005-02-08 2006-08-17 Board Of Regents, The University Of Texas System Compositions and methods involving MDA-7 for the treatment of cancer
AU2006236150A1 (en) * 2005-04-20 2006-10-26 Fred Hutchinson Cancer Research Center Methods, compositions and articles of manufacture for enhancing survivability of cells, tissues, organs, and organisms
CN100398558C (zh) * 2005-05-10 2008-07-02 中国人民解放军军事医学科学院基础医学研究所 HER2/neu与Herstatin相互作用的活性片段及其编码基因与应用
CA2608236A1 (en) * 2005-05-12 2006-11-23 Introgen Therapeutics, Inc. P53 vaccines for the treatment of cancers
US20090170769A1 (en) * 2005-05-13 2009-07-02 Pei Jin Cell surface receptor isoforms and methods of identifying and using the same
NZ563466A (en) 2005-05-27 2009-12-24 Oncimmune Ltd Improved immunoassay methods
GB2426581A (en) * 2005-05-27 2006-11-29 Univ Nottingham Immunoassay methods
JP5222134B2 (ja) * 2005-06-15 2013-06-26 ザ オハイオ ステート ユニバーシティー リサーチ ファウンデーション Ｈｅｒ−２ペプチド
EP2385060A3 (en) 2005-06-17 2012-02-15 Mannkind Corporation Methods and compositions to elicit multivalent immune responses against dominant and subdominant epitopes, expressed on cancer cells and tumor stroma
GB0512751D0 (en) * 2005-06-22 2005-07-27 Glaxo Group Ltd New adjuvant
JP2009507853A (ja) * 2005-09-07 2009-02-26 ジェンネレックス インコーポレイティッド Ｇｍ−ｃｓｆ発現ポックスウイルスを用いる転移性および／または全身播種性癌の全身処置
EP1933864A4 (en) * 2005-09-07 2009-12-16 Receptor Logic Ltd ANTIBODIES AS T-CELL RECEPTOR MIMICS, METHOD OF MANUFACTURE AND ITS USES
US8980246B2 (en) 2005-09-07 2015-03-17 Sillajen Biotherapeutics, Inc. Oncolytic vaccinia virus cancer therapy
US8945573B2 (en) 2005-09-08 2015-02-03 The Henry M. Jackson Foundation For The Advancement Of Military Medicine, Inc. Targeted identification of immunogenic peptides
CA2812110A1 (en) * 2005-09-08 2007-03-15 Henry M. Jackson Foundation For The Advancement Of Military Medicine, Inc. Targeted identification of immunogenic peptides
WO2007047749A1 (en) 2005-10-18 2007-04-26 Novartis Vaccines And Diagnostics Inc. Mucosal and systemic immunizations with alphavirus replicon particles
TWI457133B (zh) 2005-12-13 2014-10-21 Glaxosmithkline Biolog Sa 新穎組合物
US8323644B2 (en) * 2006-01-17 2012-12-04 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Therapy-enhancing glucan
WO2007084661A2 (en) * 2006-01-17 2007-07-26 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Therapy-enhancing glucan
US20090053221A1 (en) * 2006-01-17 2009-02-26 Cheung Nai-Kong V Immune response enhancing glucan
WO2007092944A2 (en) * 2006-02-08 2007-08-16 Introgen Therapeutics, Inc. Compositions and methods involving gene therapy and proteasome modulation
EP2357184B1 (en) 2006-03-23 2015-02-25 Novartis AG Imidazoquinoxaline compounds as immunomodulators
ES2388556T3 (es) * 2006-03-23 2012-10-16 Novartis Ag Compuestos inmunopotenciadores
US20100010217A1 (en) * 2006-03-23 2010-01-14 Valiante Nicholas M Methods for the preparation of imidazole-containing compounds
US7517270B2 (en) * 2006-05-30 2009-04-14 Minds-I, Inc. Construction system
WO2008042495A2 (en) 2006-07-21 2008-04-10 Life Technologies Corporation Sharply resolving labeled protein molecular weight standards
US7972602B2 (en) 2006-08-11 2011-07-05 Dendreon Corporation Promiscuous HER-2/Neu CD4 T cell epitopes
CN101632020B (zh) 2006-09-13 2013-11-27 昂西免疫有限公司 改进的免疫测定方法
CN105769931B (zh) 2006-09-15 2021-04-27 渥太华医院研究机构 溶瘤弹状病毒
AU2007299748A1 (en) 2006-09-19 2008-03-27 Asuragen, Inc. miR-15, miR-26, miR -31,miR -145, miR-147, miR-188, miR-215, miR-216 miR-331, mmu-miR-292-3p regulated genes and pathways as targets for therapeutic intervention
US20080075528A1 (en) * 2006-09-22 2008-03-27 Michael Marzetta Construction system
US8129184B2 (en) * 2006-09-26 2012-03-06 Cedars-Sinai Medical Center Cancer stem cell antigen vaccines and methods
WO2008039974A2 (en) 2006-09-28 2008-04-03 Cedars-Sinai Medical Center Cancer vaccines and vaccination methods
US20080131878A1 (en) * 2006-12-05 2008-06-05 Asuragen, Inc. Compositions and Methods for the Detection of Small RNA
EP2104734A2 (en) * 2006-12-08 2009-09-30 Asuragen, INC. Mir-20 regulated genes and pathways as targets for therapeutic intervention
US8889143B2 (en) 2006-12-14 2014-11-18 Antigen Express, Inc. Ii-key/HER-2/neu hybrid cancer vaccine
US7935350B2 (en) * 2006-12-14 2011-05-03 Antigen Express, Inc. Ii-key/Her-2/neu hybrid cancer vaccine
US7410225B1 (en) * 2007-03-14 2008-08-12 Minds-I, Inc. Multi-part links for endless track
KR20080084528A (ko) * 2007-03-15 2008-09-19 제네렉스 바이오테라퓨틱스 인크. 종양살상형 백시니아 바이러스 암 치료
WO2008130910A1 (en) * 2007-04-19 2008-10-30 Wellstat Biologics Corporation Detection her-2/neu protein from non-isolated circulating cancer cells and treatment
PT2162149E (pt) 2007-06-01 2014-02-12 Jackson H M Found Military Med Vacina para a prevenção da recaída do cancro da mama
US20090017716A1 (en) * 2007-07-11 2009-01-15 Michael Marzetta Construction system
US20090061456A1 (en) * 2007-08-30 2009-03-05 Allard William J Method for predicting progression free and overall survival at each follow-up time point during therapy of metastatic breast cancer patients using circulating tumor cells
WO2009036332A1 (en) 2007-09-14 2009-03-19 Asuragen, Inc. Micrornas differentially expressed in cervical cancer and uses thereof
US20090117532A1 (en) * 2007-11-01 2009-05-07 Doyle Gerald V Pre-clinical method for monitoring serial changes in circulating breast cancer cells in mice
WO2009059450A1 (en) * 2007-11-05 2009-05-14 Shanghai Jiaotong University Peptide ligand directed drug delivery
US7841923B2 (en) * 2007-11-13 2010-11-30 Minds-I, Inc. Vehicle axle joint for a toy vehicle
EP2225563B1 (en) 2007-11-27 2015-01-21 Janssen Diagnostics, LLC Automated enumeration and characterization of circulating melanoma cells in blood
WO2009070805A2 (en) 2007-12-01 2009-06-04 Asuragen, Inc. Mir-124 regulated genes and pathways as targets for therapeutic intervention
US20090191535A1 (en) * 2007-12-22 2009-07-30 Mark Carle Connelly Method of assessing metastatic carcinomas from circulating endothelial cells and disseminated tumor cells
GB0725239D0 (en) * 2007-12-24 2008-02-06 Oncimmune Ltd Calibrator for autoantibody assay
US8258111B2 (en) 2008-05-08 2012-09-04 The Johns Hopkins University Compositions and methods related to miRNA modulation of neovascularization or angiogenesis
JP2010006705A (ja) * 2008-06-13 2010-01-14 Atlas Antibodies Ab Ｈｅｒ２サブセット
WO2010028066A2 (en) 2008-09-02 2010-03-11 Cedars-Sinai Medical Center Cd133 epitopes
EP2355843B8 (en) 2008-12-10 2017-08-02 The Henry M. Jackson Foundation for the Advancement of Military Medicine, Inc. Vaccine for the prevention of breast cancer recurrence
US20100234283A1 (en) 2009-02-04 2010-09-16 The Ohio State University Research Foundation Immunogenic epitopes, peptidomimetics, and anti-peptide antibodies, and methods of their use
US20110045080A1 (en) * 2009-03-24 2011-02-24 William Marsh Rice University Single-Walled Carbon Nanotube/Bioactive Substance Complexes and Methods Related Thereto
WO2010132723A1 (en) * 2009-05-14 2010-11-18 Prometheus Laboratories Inc. Biomarkers for determining sensitivity of breast cancer cells to her2-targeted therapy
US20110065643A1 (en) 2009-06-12 2011-03-17 University Of Southern California Clusterin Pharmaceuticals and Treatment Methods Using the Same
AU2010292172A1 (en) 2009-09-09 2012-05-03 Centrose, Llc Extracellular targeted drug conjugates
KR101759888B1 (ko) 2009-09-14 2017-07-20 신라젠(주) 종양 용해 백시니아 바이러스 병용 암 치료요법
AU2010329551B2 (en) 2009-12-10 2016-02-11 Turnstone Limited Partnership Oncolytic rhabdovirus
WO2011107100A1 (en) 2010-03-03 2011-09-09 Aarhus Universitet Methods and compositions for regulation of herv4
JP5972864B2 (ja) 2010-04-15 2016-08-17 メディミューン リミテッド ピロロベンゾジアゼピン及びそれらのコンジュゲート
WO2011149564A1 (en) 2010-05-28 2011-12-01 Tetris Online, Inc. Interactive hybrid asynchronous computer game infrastructure
WO2011154863A1 (en) 2010-06-07 2011-12-15 Pfizer Inc. Her-2 peptides and vaccines
EP2579897A1 (en) 2010-06-08 2013-04-17 Genentech, Inc. Cysteine engineered antibodies and conjugates
EP2640727B1 (en) 2010-11-17 2015-05-13 Genentech, Inc. Alaninyl maytansinol antibody conjugates
CN103429258B (zh) 2011-01-04 2016-03-09 新罗杰公司 通过施用溶瘤痘苗病毒生成针对肿瘤抗原的抗体和生成肿瘤特异性补体依赖性细胞毒性
US9222085B2 (en) 2011-02-03 2015-12-29 Mirna Therapeutics, Inc. Synthetic mimics of MIR-124
JP2014506791A (ja) 2011-02-03 2014-03-20 マーナ セラピューティクス インコーポレイテッド ｍｉＲ−３４の合成模倣体
MX2013013054A (es) 2011-05-12 2014-02-20 Genentech Inc Metodo de monitoreo de lc-ms/ms de reaccion multiple para detectar anticuerpos terapeuticos en muestras de animales utilizando peptidos de firma de estructura.
WO2012167382A1 (en) 2011-06-08 2012-12-13 Children's Hospital Of Eastern Ontario Research Institute Inc. Compositions and methods for glioblastoma treatment
DK2739310T3 (en) 2011-08-05 2018-07-16 Res Found Dev Improved methods and compositions for modulating OLFML3-mediated angiogenesis
US10258676B2 (en) 2011-09-06 2019-04-16 Agency For Science, Technology And Research Polypeptide vaccine
WO2013040251A2 (en) 2011-09-13 2013-03-21 Asurgen, Inc. Methods and compositions involving mir-135b for distinguishing pancreatic cancer from benign pancreatic disease
KR101877598B1 (ko) 2011-10-14 2018-07-11 메디뮨 리미티드 피롤로벤조디아제핀 및 그의 컨주게이트
CA2864841C (en) 2012-02-17 2020-07-07 Keith L. Knutson Methods and materials for generating cd8+ t cells having the ability to recognize cancer cells expressing a her2/neu polypeptide
WO2013130093A1 (en) 2012-03-02 2013-09-06 Genentech, Inc. Biomarkers for treatment with anti-tubulin chemotherapeutic compounds
US20150283233A1 (en) 2012-06-15 2015-10-08 Gencia Corporation Compositions and Methods for Enhancing Immune Responses
UA114108C2 (uk) 2012-07-10 2017-04-25 Борд Оф Ріджентс, Дзе Юніверсіті Оф Техас Сістем Моноклональне антитіло для застосування в діагностиці і терапії злоякісних пухлин і аутоімунного захворювання
PT2906296T (pt) 2012-10-12 2018-06-01 Medimmune Ltd Conjugados de pirrolobenzodiazepina-anticorpo
SI2906251T1 (en) 2012-10-12 2018-01-31 Adc Therapeutics Sa Pyrrolobenzodiazepine-anti-CD22 antibody conjugates
WO2014057120A1 (en) 2012-10-12 2014-04-17 Adc Therapeutics Sàrl Pyrrolobenzodiazepine-antibody conjugates
SI2906298T1 (sl) 2012-10-12 2018-12-31 Adc Therapeutics Sa Konjugati pirolobenzodiazepin-protitelo
AU2013328580B2 (en) 2012-10-12 2016-01-21 Medimmune Limited Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof
KR101986404B1 (ko) 2012-10-12 2019-06-07 에이디씨 테라퓨틱스 에스에이 피롤로벤조디아제핀-항체 컨주게이트
EP2906250B1 (en) 2012-10-12 2018-05-30 ADC Therapeutics SA Pyrrolobenzodiazepine-anti-psma antibody conjugates
CA2888345C (en) 2012-10-24 2020-04-21 Research Development Foundation Jam-c antibodies and methods for treatment of cancer
CN105246894A (zh) 2012-12-21 2016-01-13 斯皮罗根有限公司 用于治疗增殖性和自身免疫疾病的非对称吡咯并苯并二氮杂卓二聚物
EP2935268B2 (en) 2012-12-21 2021-02-17 MedImmune Limited Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof
EP2956544B1 (en) 2013-02-14 2017-11-01 Immunocellular Therapeutics Ltd. Cancer vaccines and vaccination methods
CN105658790A (zh) 2013-02-21 2016-06-08 东安大略研究所儿童医院有限公司 疫苗组合物
NZ710745A (en) 2013-03-13 2019-03-29 Genentech Inc Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof
AU2014230735B2 (en) 2013-03-13 2018-03-15 Medimmune Limited Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof
US9649390B2 (en) 2013-03-13 2017-05-16 Medimmune Limited Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof
WO2015023355A1 (en) 2013-08-12 2015-02-19 Genentech, Inc. 1-(chloromethyl)-2,3-dihydro-1h-benzo[e]indole dimer antibody-drug conjugate compounds, and methods of use and treatment
SG10201810067YA (en) 2013-08-14 2018-12-28 Univ Rice William M Derivatives of uncialamycin, methods of synthesis and their use as antitumor agents
CN114621346A (zh) 2013-08-21 2022-06-14 德克萨斯州大学系统董事会 用于靶向连接蛋白半通道的组合物和方法
AU2014312168B2 (en) 2013-08-29 2020-08-06 Board Of Regents, The University Of Texas System Engineered primate cystine/cysteine degrading enzymes as antineogenic agents
EP3038636B1 (en) 2013-08-30 2018-11-07 Board of Regents, The University of Texas System Administration of kynurenine depleting enzymes for tumor therapy
WO2015052532A1 (en) 2013-10-11 2015-04-16 Spirogen Sàrl Pyrrolobenzodiazepine-antibody conjugates
GB201317982D0 (en) 2013-10-11 2013-11-27 Spirogen Sarl Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof
US9956299B2 (en) 2013-10-11 2018-05-01 Medimmune Limited Pyrrolobenzodiazepine—antibody conjugates
EP3054985B1 (en) 2013-10-11 2018-12-26 Medimmune Limited Pyrrolobenzodiazepine-antibody conjugates
DK3076949T3 (da) 2013-12-04 2019-11-25 Univ Texas Fremgangsmåde til isolering af kræftcelle-afledte eksosomer
BR112016013861A2 (pt) 2013-12-16 2017-10-10 Genentech Inc conjugados de droga e anticorpo, compostos, método de tratamento e composição farmacêutica
BR112016013258A2 (pt) 2013-12-16 2018-01-16 Genentech Inc composto conjugado anticorpo-droga, composição farmacêutica, método para tratar câncer e kit
JP6671292B2 (ja) 2013-12-16 2020-03-25 ジェネンテック， インコーポレイテッド ペプチド模倣化合物及びその抗体−薬物コンジュゲート
WO2016153761A1 (en) * 2015-03-13 2016-09-29 Czerniecki Brian J Methods for monitoring cd4+ t-helper type 1 response in cancer and immune restoration
EP3186371B1 (en) 2014-08-29 2024-08-14 Board of Regents, The University of Texas System Administration of kynurenine depleting enzymes for tumor therapy
EP3193940A1 (en) 2014-09-10 2017-07-26 Medimmune Limited Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof
GB201416112D0 (en) 2014-09-12 2014-10-29 Medimmune Ltd Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof
WO2016040825A1 (en) 2014-09-12 2016-03-17 Genentech, Inc. Anthracycline disulfide intermediates, antibody-drug conjugates and methods
AR101844A1 (es) 2014-09-12 2017-01-18 Genentech Inc Anticuerpos y conjugados modificados genéticamente con cisteína
CR20170099A (es) 2014-09-17 2017-07-19 Genentech Inc Pirrolobenzodiazepinas y conjugados de anticuerpos-disulfuro de las mismas
CN107148285B (zh) 2014-11-25 2022-01-04 Adc治疗股份有限公司 吡咯并苯并二氮杂䓬-抗体缀合物
CA2969689A1 (en) 2014-12-03 2016-06-09 Genentech, Inc. Quaternary amine compounds and antibody-drug conjugates thereof
WO2016130516A1 (en) 2015-02-09 2016-08-18 Research Development Foundation Engineered immunoglobulin fc polypeptides displaying improved complement activation
JP6811718B2 (ja) 2015-03-04 2021-01-13 ボード・オブ・リージエンツ，ザ・ユニバーシテイ・オブ・テキサス・システム Ｔｐ５３のヘミ接合性喪失を保有するがんを処置する方法
US20180171294A1 (en) * 2015-03-26 2018-06-21 The Trustees Of The University Of Pennsylvania In vitro artificial lymph node method for sensitization and expansion of t cells for therapy and epitope mapping
GB201506411D0 (en) 2015-04-15 2015-05-27 Bergenbio As Humanized anti-axl antibodies
GB201506402D0 (en) 2015-04-15 2015-05-27 Berkel Patricius H C Van And Howard Philip W Site-specific antibody-drug conjugates
CN107206061A (zh) * 2015-05-22 2017-09-26 布莱恩·J·赫尔尼奇 多剂量注射用树突状细胞疫苗的制备,用于阻断her2和her3的联合治疗和雌激素受体阳性her2乳腺癌治疗
US9993538B2 (en) 2015-05-29 2018-06-12 Galena Biopharma, Inc. Peptide vaccine therapy for treatment of FRα-expressing tumors
EP3307890A1 (en) 2015-06-10 2018-04-18 Board of Regents, The University of Texas System Use of exosomes for the treatment of disease
AU2016298210B2 (en) 2015-07-28 2021-12-09 Board Of Regents, The University Of Texas System Implant compositions for the unidirectional delivery of therapeutic compounds to the brain
WO2017040380A2 (en) 2015-08-28 2017-03-09 Research Development Foundation Engineered antibody fc variants
MA43345A (fr) 2015-10-02 2018-08-08 Hoffmann La Roche Conjugués anticorps-médicaments de pyrrolobenzodiazépine et méthodes d'utilisation
BR112018007611A2 (pt) 2015-10-14 2018-10-23 Bio Path Holding Inc ácidos nucleicos p-etóxi para formulação lipossômica
MA43354A (fr) 2015-10-16 2018-08-22 Genentech Inc Conjugués médicamenteux à pont disulfure encombré
MA45326A (fr) 2015-10-20 2018-08-29 Genentech Inc Conjugués calichéamicine-anticorps-médicament et procédés d'utilisation
KR20180104597A (ko) 2015-11-07 2018-09-21 멀티비르 인코포레이티드 암 치료를 위한 종양 억제 유전자 요법 및 면역관문 봉쇄를 포함하는 조성물
JP6987068B2 (ja) 2015-11-09 2021-12-22 ザ・チルドレンズ・ホスピタル・オブ・フィラデルフィアThe Children’S Hospital Of Philadelphia 癌マーカーおよび治療標的としてのグリピカン２
US11253590B2 (en) 2015-12-02 2022-02-22 Stsciences, Inc. Antibodies specific to glycosylated BTLA (B- and T- lymphocyte attenuator)
WO2017096051A1 (en) 2015-12-02 2017-06-08 Stcube & Co., Inc. Antibodies and molecules that immunospecifically bind to btn1a1 and the therapeutic uses thereof
GB201601431D0 (en) 2016-01-26 2016-03-09 Medimmune Ltd Pyrrolobenzodiazepines
GB201602359D0 (en) 2016-02-10 2016-03-23 Medimmune Ltd Pyrrolobenzodiazepine Conjugates
GB201602356D0 (en) 2016-02-10 2016-03-23 Medimmune Ltd Pyrrolobenzodiazepine Conjugates
AU2017224122B2 (en) 2016-02-26 2024-04-11 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Connexin (Cx) 43 hemichannel-binding antibodies and uses thereof
MX2018010586A (es) 2016-03-02 2019-03-28 Univ Texas Nanovacuna de activacion de "sting" para inmunoterapia.
WO2017165734A1 (en) 2016-03-25 2017-09-28 Genentech, Inc. Multiplexed total antibody and antibody-conjugated drug quantification assay
EP3436475A1 (en) 2016-03-29 2019-02-06 STCube & Co., Inc. Methods for selecting antibodies that specifically bind glycosylated immune checkpoint proteins
KR102418372B1 (ko) 2016-03-29 2022-07-08 주식회사 에스티큐브 글리코실화된 pd-l1에 특이적인 이중 기능 항체 및 이의 사용 방법
WO2017176076A1 (en) 2016-04-06 2017-10-12 Ewha University - Industry Collaboration Foundation A peptide with ability to penetrate cell membrane
EP4029950A1 (en) 2016-04-29 2022-07-20 Board of Regents, The University of Texas System Targeted measure of transcriptional activity related to hormone receptors
GB201607478D0 (en) 2016-04-29 2016-06-15 Medimmune Ltd Pyrrolobenzodiazepine Conjugates
CN115919769A (zh) 2016-05-16 2023-04-07 德克萨斯大学系统董事会 用于作为纳米粒递送tRNA的组合物及其使用方法
PL3458101T3 (pl) 2016-05-20 2021-05-31 F. Hoffmann-La Roche Ag Koniugaty PROTAC-przeciwciało i sposoby ich stosowania
EP3465221B1 (en) 2016-05-27 2020-07-22 H. Hoffnabb-La Roche Ag Bioanalytical method for the characterization of site-specific antibody-drug conjugates
WO2017210255A1 (en) 2016-05-31 2017-12-07 Galena Biopharma, Inc. Vaccine therapy for treatment of endometrial and ovarian cancer
US20190134174A1 (en) * 2016-06-03 2019-05-09 Etubics Corporation Compositions and methods for tumor vaccination and immunotherapy involving her2/neu
US10639378B2 (en) 2016-06-06 2020-05-05 Genentech, Inc. Silvestrol antibody-drug conjugates and methods of use
CN109562178A (zh) 2016-07-06 2019-04-02 得克萨斯州大学系统董事会 用于治疗胱氨酸尿症患者的人类酶介导的胱氨酸剔除
WO2018017673A1 (en) 2016-07-20 2018-01-25 Stcube, Inc. Methods of cancer treatment and therapy using a combination of antibodies that bind glycosylated pd-l1
JP7093767B2 (ja) 2016-08-11 2022-06-30 ジェネンテック， インコーポレイテッド ピロロベンゾジアゼピンプロドラッグ及びその抗体コンジュゲート
WO2018035429A1 (en) 2016-08-18 2018-02-22 Wisconsin Alumni Research Foundation Peptides that inhibit syndecan-1 activation of vla-4 and igf-1r
ES2928654T3 (es) 2016-09-16 2022-11-21 Bio Path Holdings Inc Terapia combinada con oligonucleótidos antisentido liposomales
CN110139674B (zh) 2016-10-05 2023-05-16 豪夫迈·罗氏有限公司 制备抗体药物缀合物的方法
GB201617466D0 (en) 2016-10-14 2016-11-30 Medimmune Ltd Pyrrolobenzodiazepine conjugates
WO2018089423A1 (en) 2016-11-09 2018-05-17 Musc Foundation For Research Development Cd38-nad+ regulated metabolic axis in anti-tumor immunotherapy
JP2020510624A (ja) 2016-12-12 2020-04-09 マルチビア インコーポレイテッド がんおよび感染性疾患の治療および予防のための、ウイルス遺伝子治療および免疫チェックポイント阻害剤を含む方法および組成物
GB201702031D0 (en) 2017-02-08 2017-03-22 Medlmmune Ltd Pyrrolobenzodiazepine-antibody conjugates
CA3047683C (en) 2017-02-08 2020-03-10 Adc Therapeutics Sa Pyrrolobenzodiazepine-antibody conjugates
EP3586136B1 (en) 2017-02-24 2023-11-08 Board Of Regents, The University Of Texas System Assay for detection of early stage pancreatic cancer
LT3612537T (lt) 2017-04-18 2022-10-10 Medimmune Limited Pirolobenzodiazepino konjugatai
BR112019021880A2 (pt) 2017-04-20 2020-06-02 Adc Therapeutics Sa Terapia de combinação com conjugado anticorpo anti-axl-droga
BR112019023800A2 (pt) 2017-05-12 2020-07-28 Board Of Regents, The University Of Texas System depleção mediada por enzima humana de homocisteína para tratar pacientes com hiperhomocisteinemia e homocistinúria
US10865403B2 (en) 2017-05-12 2020-12-15 Board Of Regents, The University Of Texas System Engineered primate cystine/cysteine degrading enzymes for therapeutic uses
EP3630834A1 (en) 2017-05-31 2020-04-08 STCube & Co., Inc. Methods of treating cancer using antibodies and molecules that immunospecifically bind to btn1a1
KR20200015602A (ko) 2017-05-31 2020-02-12 주식회사 에스티큐브앤컴퍼니 Btn1a1에 면역특이적으로 결합하는 항체 및 분자 및 이의 치료적 용도
CN110997724A (zh) 2017-06-06 2020-04-10 斯特库伯株式会社 使用结合btn1a1或btn1a1-配体的抗体和分子治疗癌症的方法
US11318211B2 (en) 2017-06-14 2022-05-03 Adc Therapeutics Sa Dosage regimes for the administration of an anti-CD19 ADC
LT3668874T (lt) 2017-08-18 2022-03-25 Medimmune Limited Pirolobenzodiazepino konjugatai
RU2020113749A (ru) 2017-09-20 2021-10-20 пиЭйч ФАРМА Ко., ЛТД. Аналоги таиланстатина
EP3694545A4 (en) 2017-10-11 2021-12-01 Board Of Regents, The University Of Texas System HUMAN PD-L1 ANTIBODIES AND METHOD OF USING THEM
AU2018365880A1 (en) 2017-11-07 2020-05-28 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Targeting LILRB4 with car-T or car-NK cells in the treatment of cancer
GB201803342D0 (en) 2018-03-01 2018-04-18 Medimmune Ltd Methods
CA3094329A1 (en) 2018-03-19 2020-02-20 Multivir Inc. Methods and compositions comprising tumor suppressor gene therapy and cd122/cd132 agonists for the treatment of cancer
US20210214445A1 (en) 2018-03-23 2021-07-15 Board Of Regents, The University Of Texas System Dual specificity antibodies to pd-l1 and pd-l2 and methods of use therefor
MX2020010121A (es) 2018-03-27 2021-01-08 Univ Texas Compuestos con actividad antitumoral contra celulas de cancer que portan las mutaciones del exon 19 del receptor 2 del factor de crecimiento epidermico humano.
GB201806022D0 (en) 2018-04-12 2018-05-30 Medimmune Ltd Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof
CN108624589B (zh) * 2018-04-17 2021-12-17 广州永诺生物科技有限公司 环状RNA circ-ERBB2及其检测试剂与应用
CN108715603A (zh) * 2018-06-08 2018-10-30 天津亨佳生物科技发展有限公司 一种治疗肿瘤的抗原肽链组及其在药物中的应用
CN108484732A (zh) * 2018-06-08 2018-09-04 天津亨佳生物科技发展有限公司 一种治疗肿瘤的抗原肽链组及其在药物中的应用
GB201814281D0 (en) 2018-09-03 2018-10-17 Femtogenix Ltd Cytotoxic agents
AU2019365238A1 (en) 2018-10-24 2021-05-13 F. Hoffmann-La Roche Ag Conjugated chemical inducers of degradation and methods of use
US20220033848A1 (en) 2018-11-19 2022-02-03 Board Of Regents, The University Of Texas System A modular, polycistronic vector for car and tcr transduction
EA202191463A1 (ru) 2018-11-28 2021-10-13 Борд Оф Риджентс, Дзе Юниверсити Оф Техас Систем Мультиплексное редактирование генома иммунных клеток для повышения функциональности и устойчивости к подавляющей среде
CA3121210A1 (en) 2018-11-29 2020-06-04 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods for ex vivo expansion of natural killer cells and use thereof
CN113227119A (zh) 2018-12-10 2021-08-06 基因泰克公司 用于与含Fc的蛋白质进行位点特异性缀合的光交联肽
GB201901197D0 (en) 2019-01-29 2019-03-20 Femtogenix Ltd G-A Crosslinking cytotoxic agents
EP3920889A4 (en) 2019-02-08 2022-12-07 Board of Regents, The University of Texas System TELOMERASE-CONTAINING EXOSOMES FOR THE TREATMENT OF DISEASES RELATED TO AGE-RELATED ORGANDYS FUNCTION
JP7556502B2 (ja) 2019-05-09 2024-09-26 フジフィルム セルラー ダイナミクス，インコーポレイテッド ヘパトサイトの作製方法
CN114096240A (zh) 2019-05-17 2022-02-25 癌症预防制药股份有限公司 用于治疗家族性腺瘤性息肉病的方法
WO2021016062A1 (en) 2019-07-19 2021-01-28 The Children's Hospital Of Philadelphia Chimeric antigen receptors containing glypican 2 binding domains
EP4027978A1 (en) 2019-09-13 2022-07-20 Elektrofi, Inc. Compositions and methods for the delivery of therapeutic biologics for treatment of disease
EP4041767A1 (en) 2019-09-26 2022-08-17 StCube & Co. Antibodies specific to glycosylated ctla-4 and methods of use thereof
WO2021072277A1 (en) 2019-10-09 2021-04-15 Stcube & Co. Antibodies specific to glycosylated lag3 and methods of use thereof
WO2021087458A2 (en) 2019-11-02 2021-05-06 Board Of Regents, The University Of Texas System Targeting nonsense-mediated decay to activate p53 pathway for the treatment of cancer
WO2021113644A1 (en) 2019-12-05 2021-06-10 Multivir Inc. Combinations comprising a cd8+ t cell enhancer, an immune checkpoint inhibitor and radiotherapy for targeted and abscopal effects for the treatment of cancer
JP2023509516A (ja) 2020-01-07 2023-03-08 ボード オブ リージェンツ，ザ ユニバーシティ オブ テキサス システム がん治療のための改良型ヒトメチルチオアデノシン／アデノシン枯渇酵素変種
EP4107173A1 (en) 2020-02-17 2022-12-28 Board of Regents, The University of Texas System Methods for expansion of tumor infiltrating lymphocytes and use thereof
JP2023526416A (ja) 2020-05-21 2023-06-21 ボード オブ リージェンツ，ザ ユニバーシティ オブ テキサス システム Ｖｇｌｌ１特異性を有するｔ細胞受容体およびその使用法
WO2021247836A1 (en) 2020-06-03 2021-12-09 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods for targeting shp-2 to overcome resistance
CN115989415A (zh) 2020-06-30 2023-04-18 健肺生命人工智能公司 用于检测肺癌的方法
GB2597532A (en) 2020-07-28 2022-02-02 Femtogenix Ltd Cytotoxic compounds
WO2022104109A1 (en) 2020-11-13 2022-05-19 Catamaran Bio, Inc. Genetically modified natural killer cells and methods of use thereof
US20220162288A1 (en) 2020-11-25 2022-05-26 Catamaran Bio, Inc. Cellular therapeutics engineered with signal modulators and methods of use thereof
CA3205538A1 (en) 2021-01-19 2022-07-28 Han XIAO Bone-specific delivery of polypeptides
GB2603166A (en) 2021-01-29 2022-08-03 Thelper As Therapeutic and Diagnostic Agents and Uses Thereof
WO2023014922A1 (en) 2021-08-04 2023-02-09 The Regents Of The University Of Colorado, A Body Corporate Lat activating chimeric antigen receptor t cells and methods of use thereof
CN115925875A (zh) * 2021-08-20 2023-04-07 百奥赛图(北京)医药科技股份有限公司 Her2基因人源化非人动物及其构建方法和应用
JP2024537176A (ja) 2021-10-05 2024-10-10 サイトヴィア セラピューティクス， エルエルシー ナチュラルキラー細胞及びその使用方法
CN113699221B (zh) * 2021-10-19 2023-10-10 广州吉赛医疗科技有限公司 HER2 mRNA及环状RNA多重荧光定量PCR检测引物探针及其应用
MX2024004365A (es) 2021-10-20 2024-04-25 Takeda Pharmaceuticals Co Composiciones que actuan sobre el antigeno de maduracion de linfocitos b (bcma) y metodos de uso de las mismas.
WO2023076880A1 (en) 2021-10-25 2023-05-04 Board Of Regents, The University Of Texas System Foxo1-targeted therapy for the treatment of cancer
CN114262689A (zh) * 2021-12-17 2022-04-01 上海纳米技术及应用国家工程研究中心有限公司 一种快速检测cd19/cd20-car-t细胞活性的方法
GB202201137D0 (en) 2022-01-28 2022-03-16 Thelper As Therapeutic and diagnostic agents and uses thereof
WO2023172514A1 (en) 2022-03-07 2023-09-14 Catamaran Bio, Inc. Engineered immune cell therapeutics targeted to her2 and methods of use thereof
WO2023192976A1 (en) 2022-04-01 2023-10-05 Board Of Regents, The University Of Texas System Dual specificity antibodies to human pd-l1 and pd-l2 and methods of use therefor
WO2023211972A1 (en) 2022-04-28 2023-11-02 Medical University Of South Carolina Chimeric antigen receptor modified regulatory t cells for treating cancer
WO2023220083A1 (en) 2022-05-09 2023-11-16 Flagship Pioneering Innovations Vi, Llc Trem compositions and methods of use for treating proliferative disorders
WO2023230531A1 (en) 2022-05-24 2023-11-30 Lunglife Ai, Inc. Methods for detecting circulating genetically abnormal cells
WO2023239940A1 (en) 2022-06-10 2023-12-14 Research Development Foundation Engineered fcriib selective igg1 fc variants and uses thereof
WO2024138128A2 (en) 2022-12-23 2024-06-27 Genentech, Inc. Cereblon degrader conjugates, and uses thereof
CN116042657A (zh) * 2023-01-16 2023-05-02 上海复诺健生物科技有限公司 自复制信使核糖核酸疫苗

Family Cites Families (24)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
NL154600B (nl) * 1971-02-10 1977-09-15 Organon Nv Werkwijze voor het aantonen en bepalen van specifiek bindende eiwitten en hun corresponderende bindbare stoffen.
NL154598B (nl) * 1970-11-10 1977-09-15 Organon Nv Werkwijze voor het aantonen en bepalen van laagmoleculire verbindingen en van eiwitten die deze verbindingen specifiek kunnen binden, alsmede testverpakking.
US3817837A (en) * 1971-05-14 1974-06-18 Syva Corp Enzyme amplification assay
US3901654A (en) * 1971-06-21 1975-08-26 Biological Developments Receptor assays of biologically active compounds employing biologically specific receptors
US3766162A (en) * 1971-08-24 1973-10-16 Hoffmann La Roche Barbituric acid antigens and antibodies specific therefor
US3935074A (en) * 1973-12-17 1976-01-27 Syva Company Antibody steric hindrance immunoassay with two antibodies
US3996345A (en) * 1974-08-12 1976-12-07 Syva Company Fluorescence quenching with immunological pairs in immunoassays
US4034074A (en) * 1974-09-19 1977-07-05 The Board Of Trustees Of Leland Stanford Junior University Universal reagent 2-site immunoradiometric assay using labelled anti (IgG)
US3984533A (en) * 1975-11-13 1976-10-05 General Electric Company Electrophoretic method of detecting antigen-antibody reaction
US4098876A (en) * 1976-10-26 1978-07-04 Corning Glass Works Reverse sandwich immunoassay
US4233402A (en) * 1978-04-05 1980-11-11 Syva Company Reagents and method employing channeling
US4452901A (en) * 1980-03-20 1984-06-05 Ciba-Geigy Corporation Electrophoretically transferring electropherograms to nitrocellulose sheets for immuno-assays
US7838216B1 (en) * 1986-03-05 2010-11-23 The United States Of America, As Represented By The Department Of Health And Human Services Human gene related to but distinct from EGF receptor gene
US5401638A (en) * 1986-06-04 1995-03-28 Oncogene Science, Inc. Detection and quantification of neu related proteins in the biological fluids of humans
ES2106033T3 (es) * 1989-05-19 1997-11-01 Genentech Inc Dominio extracelular de her2.
DE69033842T2 (de) * 1989-08-04 2002-06-20 Schering Ag Äusserliche domäne von c-erbb-2:gp75
ES2134294T3 (es) * 1990-01-26 1999-10-01 Washington Res Found Reactividad inmune para oncogenes expresados activos para la diagnosis y el tratamiento de tumores malignos.
US5958784A (en) * 1992-03-25 1999-09-28 Benner; Steven Albert Predicting folded structures of proteins
KR960700739A (ko) * 1993-03-05 1996-02-24 카린 이스텀 Hla-a2. 1 결합 펩티드 및 그의 용도(hla-a2. 1 binding peptides and their uses)
US5550214A (en) * 1994-02-10 1996-08-27 Brigham And Women's Hospital Isolated antigenic oncogene peptide fragments and uses
JPH10510988A (ja) * 1994-12-14 1998-10-27 ザ スクリップス リサーチ インスティテュート 腫瘍−特異的細胞毒性ｔ細胞のインビボ活性化
US6514942B1 (en) * 1995-03-14 2003-02-04 The Board Of Regents, The University Of Texas System Methods and compositions for stimulating T-lymphocytes
US5840839A (en) * 1996-02-09 1998-11-24 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Alternative open reading frame DNA of a normal gene and a novel human cancer antigen encoded therein
FR2812087B1 (fr) * 2000-07-21 2007-05-11 Inst Nat Sante Rech Med Procede de criblage de peptides utilisables en immunotherapie

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
MARY L. DISIS et al. Existent T-cell and antibody immunity to HER-2/neu protein in patients with breast cancer. Cancer Research -1994, 54, p. 16-20. *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2612015C2 (ru) * 2015-06-29 2017-03-01 Общество с ограниченной ответственностью "Сибинтех" Пептид-иммуноген, используемый в терапевтической вакцине для лечения метастатического рака молочной железы у кошек и собак
RU2624862C2 (ru) * 2015-10-20 2017-07-07 Общество с ограниченной ответственностью "Эпитек" Пептид-иммуноген, используемый в терапевтической вакцине для лечения метастатического рака молочной железы

Also Published As

Publication number Publication date
AU708237B2 (en) 1999-07-29
WO1996030514A1 (en) 1996-10-03
US6664370B2 (en) 2003-12-16
US7247703B2 (en) 2007-07-24
EP1418235A2 (en) 2004-05-12
BR9607889A (pt) 1999-08-10
US5726023A (en) 1998-03-10
US7655239B2 (en) 2010-02-02
DE69634912T2 (de) 2006-04-20
US20080076904A1 (en) 2008-03-27
DE69634912D1 (de) 2005-08-11
CN1183117A (zh) 1998-05-27
HUP9801826A2 (hu) 1998-11-30
CN1951398A (zh) 2007-04-25
HUP9801826A3 (en) 2000-12-28
KR100554186B1 (ko) 2007-04-11
NO974502D0 (no) 1997-09-29
PT817846E (pt) 2005-11-30
NO974502L (no) 1997-11-27
EP1418235A3 (en) 2004-08-11
US5876712A (en) 1999-03-02
US5801005A (en) 1998-09-01
CN1597953A (zh) 2005-03-23
US20020055614A1 (en) 2002-05-09
CZ296618B6 (cs) 2006-05-17
DK0817846T3 (da) 2005-11-07
CZ309697A3 (cs) 1998-01-14
JPH11502710A (ja) 1999-03-09
JP4510147B2 (ja) 2010-07-21
MX9707501A (es) 1998-06-30
AU5522296A (en) 1996-10-16
CA2216601A1 (en) 1996-10-03
CN1150318C (zh) 2004-05-19
EP0817846A1 (en) 1998-01-14
ES2245783T3 (es) 2006-01-16
US6075122A (en) 2000-06-13
RU2004115492A (ru) 2005-11-10
US5846538A (en) 1998-12-08
JP2008056679A (ja) 2008-03-13
NO321941B1 (no) 2006-07-24
EP0817846B1 (en) 2005-07-06
NZ306616A (en) 2001-03-30
KR19980703453A (ko) 1998-11-05
US20100087621A1 (en) 2010-04-08
ATE299180T1 (de) 2005-07-15
CZ296617B6 (cs) 2006-05-17
NO20061723L (no) 1996-10-01
CA2216601C (en) 2002-10-22
US20040082758A1 (en) 2004-04-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
RU2236461C2 (ru) Внутриклеточный домен белка her-2/neu для предупреждения или лечения малигнизаций
US5869445A (en) Methods for eliciting or enhancing reactivity to HER-2/neu protein
US20020039573A1 (en) Compounds and methods for prevention and treatment of HER-2/neu associated malignancies
DK2186889T3 (en) CDCA1 PEPTID AND PHARMACEUTICAL COMPOSITION, INCLUDING THIS
EP1224216B1 (en) Mage-a1 peptides presented by hla class ii molecules
JP2004521609A (ja) Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ融合タンパク質
JP2002535004A (ja) ＨＥＲ−２／ｎｅｕ融合タンパク質
JP2007516966A (ja) 合成ｈｌａ結合ペプチド類似体及びその使用方法
JP4051602B2 (ja) 腫瘍抗原
US8524491B2 (en) Compounds for eliciting or enhancing immune reactivity to HER-2/neu protein for prevention or treatment of malignancies in which the HER-2/neu oncogene is associated
CA2691406C (en) Preprocalcitonin antigen t epitopes
US7041502B2 (en) Isolated peptides which bind to HLA-B18 molecules and uses thereof
US20060009393A1 (en) Immunogenic epitopes for fibroblast growth factors 5 (FGF-5)
MXPA97007501A (en) Intracellular domain of protein her-2 / neu for the prevention or treatment of malignida
EP1109568A1 (en) An antigenic peptide encoded by an alternative open reading frame of human macrophage colony-stimulating factor
Arlen et al. therapeutic vaccines for colorectal cancer: A review of clinical data
WO2004045555A2 (en) Immunogenic epitopes for fibroblast growth factor 5 (fgf-5) presented by hla-a3 and hla-a2

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A The patent is invalid due to non-payment of fees

Effective date: 20090329