MXPA97007501A - Dominio intracelular de la proteina her-2/neu para la prevencion o tratamiento de malignidades - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a compuestos y composiciones para obtener o mejorar la reactividad inmune a la proteína HER-2/neu. Los compuestos incluyen polipétidos y moléculas deácido nucleico que codifican estos péptidos. Los compuestos se pueden usar para la prevención o tratamiento de malignidades a las cuales se asocia eloncógeno HER-2/neu.

Description

DOMINIO INTRACELULAR DE LA PROTEINA HER-2/NEU PARA LA PREVENCIÓN O TRATAMIENTO DE MALIGNIDADES Campo técnico La presente invención generalmente se dirige a los polipéptidos, y a las moléculas de ácido nucleico que codifican estos polipéptidos, para obtener o mejorar una respuesta inmune a la proteína HER-2 /neu, que se incluye para el uso en el tratamiento de malignidades a las cuales se asocia el oncógeno HER-2 /neu .

Antecedentes de la invención A pesar de numerosas inversiones de recursos financieros y humanos, el cáncer sigue siendo una de las principales causas de muerte. Por ejemplo, el cáncer es la causa principal de muerte en mujeres entre la edad de 35 a 74 años. El cáncer de pecho es la malignidad más común en mujeres y la incidencia para desarrollar cáncer de pecho está creciendo. Una de cada nueve mujeres será diagnosticada con la enfermedad. Las formas de aproximación estándar para curar el cáncer de pecho han centrado su atención alrededor de una combinación de cirugía, radiación y quimioterapia. Estas formas de aproximación han dado como resultado éxitos notables en ciertas malignidades. Sin embargo, estas formas de aproximación no han tenido éxito en todas las malignidades y el cáncer en el pecho es más frecuentemente incurable cuando se intenta tratar más allá de cierta etapa. Se necesitan formas de aproximación alternativas para la prevención y la terapia. Una característica común de las malignidades es el crecimiento celular no controlado. Las células cancerosas parecen haber sufrido un proceso de transformación del fenotipo normal al fenotipo maligno capaz de crecimiento autónomo. La amplificación y la sobreexpresión de genes de células somáticas se considera que es un evento primario común que da como resultado la transformación de células normales en células malignas. Las características fenotípicas malignas codificadas por los genes oncogénicos se pasan durante la división celular a la progenie de las células transformadas. La investigación continua que involucra oncógenos ha identificado cuando menos cuarenta oncógenos operativos en células malignas y responsables de, o asociadas con, la transformación. Los oncógenos se han clasificado en grupos diferentes basados en la función putativa o localización de sus productos de gen (como la proteína expresada por el oncógeno) . Se cree que los oncógenos son esenciales para ciertos aspectos de fisiología celular normal . Con relación a esto, el oncógeno HER-2/neu es un miembro de la familia tirosina proteína quinasa de oncógenos y comparte un alto grado de homología con el receptor del factor de crecimiento epidérmico. El HER-2 /neu presumiblemente juega un papel en el crecimiento y/o diferenciación celular. El HER-2/.neu parece que induce malignidades a través de mecanismos cuantitativos que son resultado de la expresión aumentada o desregulada de un producto de gen esencialmente normal . El HER-2/neu (pl85) es el producto de proteína del oncógeno HER-2/neu. El gen HER-2/neu se amplifica y la proteína HER-2 /neu se sobreexpresa en una variedad de cánceres incluyendo el cáncer del pecho, ovarios, colon, pulmón y próstata. El HER-2/neu se relaciona con la transformación maligna. Se encuentra en el 50 al 60 por ciento de carcinoma ductal in si tu y en el 20 al 40 por ciento de todos los cánceres del pecho, así como en una fracción sustancial de adenocarcinomas que surgen en los ovarios, la próstata, el colon y el pulmón. El HER-2/neu está íntimamente asociado no solamente con el fenotipo maligno, sino también con la agresividad de la malignidad, encontrándose en una cuarta parte de todos los cánceres invasores de pecho. La sobreexpresión del HER-2 /neu está correlacionada con una mala prognosis en cáncer tanto en pecho como en ovario. HER-2 /neu es una proteína transmembránica con una masa molecular relativa de 185 kd que es aproximadamente de 1255 aminoácidos (aa) de longitud. Tiene un dominio de enlace extracelular (ECD) de aproximadamente 645 aminoácidos, con 40 por ciento de homología con el receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) , un dominio de anclaje de transmembrana altamente hidrofóbico (TMD) , y un dominio citoplasmático (CD) carboxiterminal de aproximadamente 580 aminoácidos con el 80 por ciento de homología con respecto al EGFR. Debido a las dificultades en las formas de aproximación actuales a la terapia de los cánceres en los cuales el oncógeno HER-2/neu está asociado, existe la necesidad en la técnica de compuestos y composiciones mejoradas. La presente invención cubre esta necesidad, y además proporciona otras ventajas relacionadas.

Compendio de la Invención Dicho brevemente, la presente invención proporciona polipéptidos, moléculas de ácidos nucleicos (que dirigen la expresión de esos polipéptidos) y de vectores virales (que dirigen la expresión de esos polipéptidos) para usarse para inmunización, o la fabricación de un medicamento para inmunización, de un animal de sangre caliente contra una malignidad a la cual está asociado el oncógeno HER-2/neu. Un polipéptido o molécula de ácido nucleico, de acuerdo con esta invención, puede estar presente en una composición que incluye un vehículo o diluyente aceptable farmacéuticamente. Ese polipéptido, molécula de ácido nucleico, vector viral o composición farmacéutica se puede usar para la inmunización en una base de una vez (por ejemplo, cuando se sospecha una malignidad ) o sobre una base periódica (por ejemplo, para un individuo con un riesgo elevado de adquirir o readquirir una malignidad) . Un medicamento para inmunización puede ser útil en el tratamiento de un tumor existente o para evitar la ocurrencia o recurrencia del tumor. En una modalidad, la presente invención proporciona un polipéptido codificado por una secuencia de ADN seleccionada de: (a) los riucleótidos del 2026 al 3765 de la SEQ ID NO: 1; y (b) secuencias de ADN que hibridizan a una secuencia complementaria de los nucleótidos del 2026 al 3765 de la SEQ ID NO: 1 bajo condiciones moderadamente rigurosas, en donde el ADN codifica un polipéptido que produce una respuesta inmune contra la proteína HER-2 /neu . En una modalidad preferida, un polipéptido tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2 desde lisina, el aminoácido 676, hasta valina, aminoácido 1255, o una variante de los mismos que produce cuando menos una respuesta inmune equivalente. Se proporciona una composición que comprende un polipéptido de la presente invención en combinación con un vehículo o diluyente aceptable farmacéuticamente. En otra modalidad, se proporciona un polipéptido o una composición de la presente invención para la inmunización de un animal de sangre caliente contra una malignidad a la cual el oncógeno HER-2/neu está asociado. En otra modalidad, ese polipéptido o composición se usa para la fabricación de un medicamento para la inmunización de un animal de sangre caliente contra una malignidad a la cual el oncógeno HER-2/neu está asociado. En otra modalidad, se proporciona una molécula de ácido nucleico que dirige la expresión de un polipéptido de acuerdo con la presente invención, para la inmunización transfectando las células de un animal de sangre caliente con la molécula de ácido nucleico. En otra modalidad, esa molécula de ácido nucleico se usa para la fabricación de un medicamento para la inmunización de un animal de sangre caliente contra la malignidad a la cual el oncógeno HER-2 /neu está asociado. En otra modalidad, se proporciona un vector viral que dirige la expresión de un polipéptido de acuerdo con la presente invención, para la inmunización por infección de las células de un animal de sangre caliente con el vector. En otra modalidad, ese vector viral se usa para la fabricación de un medicamento para la inmunización de un animal de sangre caliente contra una malignidad en la cual el oncógeno HER-2/neu está asociado. Estos y otros aspectos de la presente invención se harán evidentes con referencia a la siguiente descripción detallada y dibujos anexos.

Breve Descripción de los Dibujos La Figura 1 muestra los resultados de el cebado de los linfocitos T nativos con respecto al polipéptido HER-2 /neu mediante células dendríticas. Las células dendríticas derivadas de médula ósea se generaron con GM-CSF, y IL6 de las células de vastago CD34+. Las células dendríticas impulsadas con el polipéptido HER-2/neu inducen la proliferación específica de proteínas de los linfocitos autólogos CD4 +/CD45RA+ T después de 7 días de cultivar las células T con las células dendríticas. Las células de vastago CD34+ derivadas de médula ósea cultivadas durante una semana en un medio sin suero que contiene GM-CSF y IL-6 se usaron como APC.

Las APC se plaquearon en charolas de 96 pozos de fondo redondo (Corning, Corning, NY, Estados Unidos de Norteamérica) . en varias concentraciones y se incubaron durante 16-18 horas con 20-25 µg/mililitro de polipéptido HER-2/neu recombinante. Los linfocitos CD4+ T se aislaron de las células mononucleares de la sangre periférica mediante selección positiva usando columnas de inmunoafinidad (CellPro, Inc., Brothwell, WA, Estados Unidos de Norteamérica) . El APC impulsado por el antígeno se irradió (10 Gy) y los linfocitos CD4+ T se añadieron en 105 por pozo. La respuesta proliferativa de las células T se midió mediante la captación de (3H) timidina (lµCi/pozo) añadido el día 7 durante 16-18 horas. Los ensayos de proliferación se realizaron en un medio sin suero y sin citocina en 5 réplicas de pozos.

Los símbolos representan: —•— DC + polipéptido HER-2/neu+ CD4 +/CD45RA+ células T; —O— DC + CD4+/CD45RA+ células T; y —D— DC + polipéptido HER-2 /neu . La Figura 2 muestra la respuesta de las células CD4+ al polipéptido HER-2/neu. Usando el ensayo de cebado descrito para la Figura 1, CD4+ células T de donadores normales se probaron para ver sus respuestas al polipéptido recombinante humano HER-2 /neu . Los símbolos representan —I— SC + CD4; y 4 SC +CD4 + polipéptido HER-2/neu. "SC" es células de vastago. La Figura 3 muestra que las ratas inmunizadas con polipéptido HER-2/neu de rata desarrollaron anticuerpos específicos neu . Las ratas se inmunizaron con 25µg de polipéptido HER-2/neu de rata recombinante en MPL o adyuvante de Vaccel . Se dieron tres inmunizaciones, cada una separada 20 días. Veinte días después de la inmunización final las ratas se valoraron para ver sus respuestas de anticuerpos al neu de rata. Los animales inmunizados con el polipéptido HER-2 / neu y el adyuvante de Vaccel mostraron respuestas específicas altas a la dosificación de neu de rata, el control fue un animal inmunizado con el polipéptido HER-2/neu humano (proteína extraña) . En experimentos separados, las ratas inmunizadas con 100 µg y 300 µg de neu de rata entero purificado no desarrollaron anticuerpos específicos de neu detectables (información no mostrada) . La información representa la media y la desviación estándar de 3 animales . Los símbolos representan: —I— polipéptido HER-2/neu de rata/MPL; • polipéptido HER-2/neu de rata/Vaccel ; D-- --MPL solo; O Vaccel solo; y =¡¡= control. "MPL" y "Vaccel" son adyuvantes (Ribi, Bozeman, MT, USA) . "Neu" es la proteína HER-2/neu. La Figura 4 muestra que las pacientes de cáncer en el pecho tienen una inmunidad previamente existente al polipéptido HER-2 / neu . Las pacientes PBMC se evaluaron mediante la incorporación de timidina tritiada en réplicas de 24 pozos. Los pozos que respondieron se califican como mayor que la media y 3 desviaciones estándar (372 cpm) de los pozos de control. Este HER-2 /neu de una paciente de cáncer de pecho positivo en fase II tiene una respuesta significativa al polipéptido HER-2/neu humano recombinante. Los símbolos "p" representan péptidos para la proteína HER-2 /neu, "tt" representa toxoide tetánico, y "hH?P" representa el polipéptido HER-2/neu humano recombinante.

Descripción Detallada de la Invención Antes de presentar la invención, puede ser útil para comprender la misma presentar definiciones de algunos términos que se van a usar en lo sucesivo en la presente. Polipéptido HER-2/nßu - como se emplea en la presente, se refiere a una porción de la proteína HER-2/neu (la proteína también conocida como pl85 o c-erbB2) que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2 desde lisina, aminoácido 676, hasta valina, aminoácido 1255; y se puede derivar naturalmente, producir sintéticamente, elaborar por ingeniería genética, o una variante equivalente funcionalmente de la misma, por ejemplo, en donde uno o más aminoácidos se reemplazan por otros aminoácidos o no aminoácidos lo cual no afecta sustancialmente la obtención o mejoramiento de una respuesta inmune con respecto a la proteína HER-2 /neu (por ejemplo, la variante estimula una respuesta mediante las células T ayudantes o las células T citotóxicas) . Proliferación de las células T - como se emplea en la presente, incluye la multiplicación de las células T así como la estimulación de las células T que conducen a la multiplicación, o sea, la iniciación de los eventos que conducen a la mitosis y la mitosis en sí misma. Los métodos para detectar la proliferación de las células T se discute más adelante. Como se hizo notar anteriormente, la presente invención se dirige hacia compuestos y composiciones para obtener o mejorar la inmunidad al producto de proteína expresado por el oncógeno HER-2 /neu, incluyendo malignidades en un animal de sangre caliente en donde el gen HER-2 /neu amplificado se asocia con las malignidades. La asociación de un gen HER-2/neu amplificado con una malignidad no requiere que el producto de expresión de la proteína del gen esté presente en el tumor. Por ejemplo, la sobreexpresión del producto de expresión de la proteína puede estar involucrado con la iniciación de un tumor, pero la expresión de la proteína puede haberse perdido posteriormente. Un uso de la presente invención es el de obtener o mejorar una respuesta inmune autóctona efectiva para convertir un tumor positivo de HER-2 /neu en un de HER-2 /neu negativo. Más específicamente, la descripción de la presente invención, en un aspecto, muestra que un polipéptido basado en una porción particular (polipéptido HER-2/neu) del producto de expresión de la proteína del gen HER-2 /neu se puede reconocer por los linfocitos dependientes del timo (en lo sucesivo llamadas "células T") y, por lo tanto, la respuesta de células T inmune autóctona se puede usar profilácticamente o para tratar malignidades en las cuales una proteína así se sobreexpresa, o se ha sobreexpresado. La descripción de la presente invención también muestra, en otro aspecto, que las moléculas de ácido nucleico que dirigen la expresión de ese péptido se pueden usar solas o en un vector viral para inmunización. En general, las poblaciones de células T CD4+ se consideran por funcionar como ayudantes/inductoras a través de la liberación de linfocinas cuando se estimulan mediante un antígeno específico; sin embargo, un subconjunto de células CD4+ puede actuar como linfocitos T citotóxicos (CTL) . De manera similar, las células T CD8+ se considera que funcionan Usando directamente metas antigénicas; sin embargo, dentro de una variedad de circunstancias éstas pueden secretar linfocinas para proporcionar ayuda o la función DTH. A pesar del potencial de la función de traslapar, los marcadores fenotípicos CD4 y CD8 están ligados al reconocimiento de los péptidos unidos a los antígenos MHC clase II o a la clase I. El reconocimiento del antígeno en el contexto de la clase II o la clase I manda que las células T CE4+ o CD8+ respondan a diferentes antígenos o al mismo antígeno presentado bajo diferentes circunstancias. La unión de los péptidos inmunogénicos con los antígenos MHC de la clase II ocurre con más comúnmente para los antígenos ingeridos por las células que presentan antígenos. Por lo tanto, las células T CD4+ generalmente reconocen a los antígenos que han sido externos a las células del tumor. Por el contrario, bajo circunstancias normales, la unión de los péptidos a MHC clase I ocurre sólo para las proteínas presentes en el citosol y sintetizadas por la propia meta, las proteínas en el ambiente externo quedan excluidas. Una excepción a esto es la unión de péptidos exógenos con un motivo preciso de unión de clase I que están presentes afuera de la célula en una concentración alta. Así, las células T CD4+ y CD8+ tienen funciones ampliamente diferentes y tienden a reconocer diferentes antígenos como una reflexión de en dónde residen normalmente los antígenos. Como se describe dentro de la presente invención, una porción de polipéptido del producto de la proteína expresado por el oncógeno HER-2 /neu es reconocido por las Células T. El polipéptido HER-2/neu en circulación se degrada en fragmentos de péptido. Los fragmentos de péptido desde el polipéptido se unen con los antígenos (MHC) de mayor histocompatibilidad compleja. Mediante el despliegue de una unión de péptido con un antígeno MHC en la superficie de la célula y el reconocimiento mediante las células T huéspedes de la combinación del péptido más el propio antígeno MHC, el polipéptido HER-2/neu (que incluye el expresado en una célula maligna) será inmunogénico para las células T. La exquisita especificidad del receptor de la célula T capacita a las células T individuales a discriminar entre los péptidos que difieren por un solo residuo de aminoácido. Durante la respuesta inmune a un fragmento de péptido desde el polipéptido, las células T que expresan un receptor de célula T con gran afinidad de unión del complejo péptido-MHC se unirá con el complejo péptido MHC y por lo tanto se activa y se induce a proliferar. En el primer encuentro con un péptido, pequeños números de células T inmunes secretarán linfocinas, proliferarán y se diferenciarán dentro del efector y la memoria de las células T. La respuesta inmune primaria ocurrirá in vivo pero ha sido difícil de detectar in vi tro . El encuentro siguiente con el mismo antígeno mediante la memoria de la célula T conducirá a una respuesta inmune más rápida y más intensa. La respuesta secundaria ocurrirá ya sea in vivo o in vi tro La respuesta in vitro se calibra fácilmente midiendo el grado . de proliferación, el grado de producción de citocina, o la generación de actividad citolítica de la población de células T vueltas a exponer en al antígeno. La proliferación sustancial de la población de las células T en respuesta a un antígeno particular se considera ser indicadora de una exposición anterior o cebado del antígeno. Los compuestos de esta invención generalmente comprenden polipéptidos HER-2/neu o moléculas de ADN que dirigen la expresión de esos péptidos, en donde las moléculas de ADN pueden estar presentes en un vector viral . Como se hizo notar anteriormente, los polipéptidos de la presente invención incluyen variantes del polipéptido de la SEQ ID NO: 2 desde el aminoácido 676 hasta el aminoácido 1255, que retienen la capacidad de estimular una respuesta inmune. Esas variantes incluyen diversas formas estructurales del polipéptido nativo. Debido a la presencia de grupos amino y carboxilo ionizables, por ejemplo, un polipéptido HER-2/neu puede estar en la forma de una sal acida o básica, o puede estar en forma neutra. Los residuos de aminoácidos individuales también se pueden modificar mediante oxidación o reducción.

Las variantes dentro del campo de esta invención también incluyen polipéptidos en los cuales el polipéptido HER-2 / neu nativo de estructura de aminoácido primario se modifica formando conjugados covalentes o agregativos con otros péptidos o polipéptidos, o fracciones químicas tales como grupos glicosilo, lípidos, fosfato, grupos acetilo y similares. Los derivados covalentes se pueden preparar, por ejemplo, enlazando grupos funcionales particulares a cadenas laterales de aminoácidos o' en las terminales N- o C- . La presente invención también incluye polipéptidos HER-2/neu con o sin glicosilación. Los polipéptidos expresados en levadura o en sistemas de expresión en mamíferos pueden ser similares o ligeramente diferentes en peso molecular y en el patrón de glicosilación que las moléculas nativas, dependiendo del sistema de expresión. Por ejemplo, la expresión de ADN que codifican polipéptidos en bacterias tales como E. coli típicamente proporciona moléculas no glicosiladas. Los sitios de N-glicosilación de las proteínas eucarióticas se caracterizan por el triplete de aminoácido Asn-A-^Z, en donde A-L es cualquier aminoácido excepto Pro, y Z es Ser o Thr. Las variantes de los polipéptidos HER-2/neu que tienen sitios de N-glicosilación inactivados se pueden producir mediante técnicas conocidas por los expertos en la técnica, como la síntesis y ligado de oligonucleótidos o técnicas de mutagénesis de sitio específico, y están dentro del alcance de esta invención. Alternativamente, los sitios de glicosilación N-enlazados se pueden añadir al polipéptido HER-2 /neu . Los polipéptidos de esta invención también incluyen variantes polipéptido de la SEQ ID NO: 2 (o sea, variantes de un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2 desde el aminoácido 676 hasta el aminoácido 1255) que tienen una secuencia de aminoácido diferente de esta secuencia debido a una o más supresiones, inserciones, sustituciones u otras modificaciones. En una modalidad, esas variantes son sustancialmente homologas al polipéptido HER-2 /neu nativo y retienen la capacidad de estimular una respuesta inmune. "Homología sustancial" como se emplea en la presente, se refiere a secuencias de aminoácidos que se pueden codificar mediante secuencias de ADN que son capaces de hibridizar dentro de condiciones moderadamente rigurosas, una secuencia de nucleótidos complementaria a una secuencia de ADN que ocurre naturalmente, que codifica la porción del polipéptido de la SEQ ID NO: 2 especificada en la presente (o sea, los nucleótidos 2026 hasta 3765 de la SEQ ID NO: 1) . Las condiciones moderadamente estrictas adecuadas incluyen prelavado en una solución de 5 x SSC, 0.5 por ciento SDS, 1.0 mM EDTA (pH 8.0); hibridización a 50°C-65°C, 5 x SSC, durante la noche,- seguido por un doble lavado a 65°C durante 20 minutos con cada uno de 2x, 0.5x y 0.2x SSC (que contiene 0.1 por ciento de SDS) . Esas secuencias del ADN de hibridización también están dentro del alcance de esta invención. El efecto de cualquiera de esas modificaciones en la capacidad del polipéptido HER-2/neu de producir una respuesta inmune puede determinarse fácilmente (por ejemplo, analizando la capacidad del polipéptido HER-2 / neu mutado de inducir una respuesta de célula T usando, por ejemplo, los métodos descritos en la presente) . Generalmente, las sustituciones de los aminoácidos se pueden hacer en una variedad de formas para proporcionar otras modalidades de variantes dentro de la presente invención. Primero, por ejemplo, las sustituciones de aminoácidos se pueden hacer conservadoramente; o sea, un aminoácido sustituto reemplaza un aminoácido que tiene propiedades similares, tal como un experto en la técnica de la química de péptidos esperaría la estructura secundaria de naturaleza hidropática del polipéptido que va a ser sustancialmente sin cambio. En general, los siguientes grupos de aminoácidos representan cambios conservadores (1) ala, pro, gly, glu, asp, gln, asn, ser, thr; (2) cys, ser, tyr, thr; (3) val, ile, leu, met, ala, phe; (4) lys, arg, his,- y (5) phe, tyr, trp, his. Un ejemplo de cambio no conservador es reemplazar un aminoácido de un grupo con un aminoácido de otro grupo . Otra manera de hacer sustituciones de aminoácidos para producir variantes de la presente invención es identificar y reemplazar aminoácidos en los motivos de las células T con potencial para unirse a las moléculas MHC de clase II (para respuesta de células T CD4+ ) o moléculas de MHC de clase I (para respuesta de células T CD8+) . Los segmentos de péptido (de un polipéptido HER-2/neu) con un motivo con potencial teórico para unirse a las moléculas MHC de clase II se puede identificar mediante análisis por computadora. Por ejemplo, se puede usar un paquete de análisis de secuencias de proteínas, Si tios T, que incorpora varios algoritmos de computadora diseñados para distinguir sitios potenciales para el reconocimiento de células T (Feller y de la Cruz, Nature 349 : 720-721, 1991) . Se usan dos algoritmos de búsqueda: (1) el algoritmo AMPHI descrito por Margalit (Feller y de la Cruz, Nature 349 : 720-721, 1991; Margalit y colaboradores, J. Immunol .138 : 2213-2229 , 1987) identifica motivos de epítope de acuerdo con la periodicidad alfa-helicoidal y anfipaticidad; (2) el algoritmo de Rothbard y Taylor identifica motivos de epítope de acuerdo con el patrón de carga y polaridad (Rothbard y Taylor, EMBO 7:93-100, 1988) . Los segmentos con ambos motivos son lo más apropiado para unirse a las moléculas MHC de la clase II. Las células T CD8+ reconocen la unión del péptido a las moléculas de MHC clase I . Falk y colaboradores han determinado que los péptidos que se unen a moléculas de MHC particulares comparten motivos de secuencias discernibles (Falk y colaboradores, Nature 351 : 290-296, 1991) . Un motivo de péptido para unirse en la ranura de HLA-A2.1 se ha definido por Edman como degradación de péptidos separados de las moléculas de HLA-A2.1 de una línea de células cultivadas (Tabla 2, de Falk y colaboradores, supra) . El método identificó lo típico o el promedio del péptido que se une a HLA-A2.1 siendo de 9 aminoácidos de longitud con residuos de anclaje dominantes que ocurren en las posiciones 2 (L) y 9 (V) . Se han identificado residuos de unión fuerte que ocurren comúnmente en las posiciones 2 (M) , 4 (E,K), 6 (V) , y 8 (K) . El motivo identificado representa el promedio de muchos péptidos de unión El Motivo restringido HLA-A2.1 El motivo del péptido derivado como se define actualmente no es particularmente estricto. Algunos péptidos de unión HLA-A2.1 no contienen ambos residuos de anclaje dominantes y los aminoácidos que flanquean a los residuos de ancla dominantes juegan papeles importantes para permitir o impedir la unión. No todos los péptidos con el motivo de unión descrito ahora se unirá, y algunos péptidos sin el motivo se unirán. Sin embargo, el motivo actual es válido lo suficientemente para permitir la identificación de algunos péptidos capaces de unirse. De nota, el motivo HLA-A2.1 actual coloca 6 aminoácidos entre los aminoácidos de ancla dominantes en los residuos 2 y 9. Siguiendo la identificación de los motivos de péptidos dentro de un polipéptido HER-2/neu, las sustituciones de los aminoácidos pueden hacerse conservadoramente o no conservadoramente. El último tipo de sustituciones intenta producir un polipéptido que es más potente y/o más ampliamente reactivo en cruz (polimorfismo MHC) . Un ejemplo de un polipéptido más potente es uno que se une con mayor afinidad a la misma molécula MHC que el polipéptido natural, sin afectar el reconocimiento por las células T específicas para el polipéptido natural. Un ejemplo de un polipéptido con una más amplia reactividad en cruz es uno que induce más ampliamente respuestas inmunes reactivas en cruz (o sea, une a un mayor rango de moléculas de MHC) que el polipéptido natural. De manera similar, uno o más aminoácidos que residen entre motivos de péptidos y que tienen una función de separadores (v. gr., no interactúan con la molécula de MHC o el receptor de la célula T) se pueden sustituir conservadoramente o no conservadoramente. Será evidente para los expertos en la técnica que los polipéptidos que contienen una o más sustituciones de aminoácidos se pueden probar con respecto a sus interacciones inmunológicas benéficas o adversas mediante una variedad de ensayos, incluyendo los descritos en la presente para la capacidad de estimular el reconocimiento de las células T. Las variantes dentro del alcance de esta invención pueden ser también, o alternativamente, contener otras modificaciones, incluyendo la supresión o adición de aminoácidos, que tienen una influencia mínima en las propiedades inmunológicas del polipéptido. Los expertos en la técnica apreciarán que se pueden usar las formas truncadas o extendidas no nativas de un polipéptido HER-2/neu, a condición de que las propiedades inmunológicas deseadas sean cuando menos a grandes rasgos, equivalentes a las del polipéptido HER-2/neu nativo de longitud total. Los residuos de cisteína se pueden suprimir o reemplazar con otros aminoácidos para evitar la formación de puentes de disulfuro intramoleculares incorrectos durante la renaturalización. Otras formas de aproximación a la mutagénesis implica modificaciones de residuos de aminoácidos dibásicos adyacentes para realzar la expresión en sistemas de levadura en los cuales está presente la actividad de la proteasa KEX2. Un polipéptido HER-2 / neu generalmente se puede obtener usando una clona de DNAc o genómica que codifica a la proteína. Una secuencia genómica que codifica la longitud total de HER-2 /neu se muestra en la SEQ ID N0:1, y la secuencia de aminoácidos deducida se presenta en la SEQ ID NO: 2. Esas clonas se pueden aislar filtrando una biblioteca de expresión apropiada para las clonas que expresan la proteína HER-2/neu. La preparación de la biblioteca y el filtro se puede realizar generalmente usando métodos conocidos por los expertos en la técnica, tales como los métodos descritos en Sambrook y colaboradores., Molecular Cloning: A Laboratory Manual , Cold Spring Harbor Laboratories. Cold Spring Harbor, N.Y., 1989, que se incorpora a la presente mediante referencia. Brevemente, una librería de expresión de un bacteriófago se puede plaquear y transferir a filtros. Los filtros se pueden incubar luego con un reactivo de detección. En el contexto de esta invención, un "reactivo de detección" es cualquier compuesto capaz de unirse a la proteína HER-2 / neu, que se pueda entonces detectar mediante alguno de una variedad de medios conocidos por los expertos en la técnica. Los reactivos de detección típicos contienen un "agente de unión, " como Proteína A, Proteína G, IgG o una lectina, acoplada a un grupo reportero. Los grupos reporteros preferidos incluyen enzimas, tintes, radionúclidos, grupos luminiscentes, grupos fluorescentes y biotina. Más preferiblemente, el grupo reportero es peroxidasa de rábano picante, que se puede detectar por incubación con un sustrato tal como tetrametilbencidina o ácido 2, 2 ' -azino-di-3- etilbencitiazolinsulfónico. Las placas que contienen secuencias genómicas o de ADNc que expresan la proteína HER- 2 / neu se aislan y purifican mediante técnicas conocidas por los expertos en la técnica. Se pueden encontrar métodos apropiados, por ejemplo, en Sambrook y colaboradores, Molecular Cloning: A Laboratory Manual , Cold Spring Harbor Laboratories. Cold Spring Harbor, N.Y., 1989. Las variantes del polipéptido que retienen la capacidad de estimular una respuesta inmune generalmente se pueden identificar modificando la secuencia en uno o más de los aspectos descritos anteriormente y probando el polipéptido resultante con respecto a su capacidad de estimular una respuesta inmune, v. gr., una respuesta de célula T. Por ejemplo, esos ensayos se pueden realizar generalmente poniendo en contacto células T con el polipéptido modificado y probando la respuesta. Las variantes del polipéptido que ocurren naturalmente también se pueden aislar, por ejemplo, filtrando una librería de ADNc o genómica con una secuencia de ADN que codifica al polipéptido o a una variante del mismo. Las modificaciones de secuencia descritas anteriormente se pueden introducir usando técnicas de recombinación estándar o mediante síntesis automatizada del polipéptido modificado. Por ejemplo, se pueden introducir mutaciones en sitios particulares sintetizando oligonucleótidos que contienen una secuencia de mutante, flanqueada por sitios de restricción que hacen posible la liga con fragmentos de la secuencia nativa. Siguiendo a la liga, la secuencia reconstruida resultante codifica un análogo .que tiene la inserción, sustitución o supresión de aminoácidos deseada. Alternativamente, se pueden emplear procedimientos de mutagénesis específica de sitio para proporcionar un gen en el cual los codones particulares se alteran de acuerdo con la sustitución, supresión, o inserción requerida. Los métodos de ejemplo para hacer las alteraciones presentadas anteriormente se describen en Walder y colaboradores, Gene 42:133, 1986; Bauer y colaboradores, Gene 37:73, 1985, Craik, BioTechniques, Enero de 1985, 12-19; Smith y colaboradores, Genetic Engineering: Principies and Methods, Plenum Press, 1981; y las Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica Números: 4.518.584 u 4.737.462. Las mutaciones en las secuencias de nucleótidos construidas para la expresión de los polipéptidos HER-2/neu deben, por supuesto conservar el cuadro de lectura de las secuencias de codificación y preferiblemente, no crearán regiones complementarias que se puedan hibridizar para producir estructuras de RNAm secundarias, tales como ciclos, u horquillas, que afectarían de manera adversa la traducción del RNAm. Aunque un sitio de mutación se puede determinar previamente, no es necesario que la naturaleza de la mutación en sí se determine previamente. Por ejemplo, con el fin de seleccionar conforme a las características óptimas de los mutantes en un sitio dado, se puede conducir una mutagénesis aleatoria en el codón meta y los mutantes del polipéptido HER-2 / neu filtrarse con respecto a la actividad deseada. No todas las mutaciones en una secuencia de nucleótidos que codifica un- polipéptido HER-2/neu se expresará en el producto final. Por ejemplo, las sustituciones de nucleótidos se pueden hacer para realzar la expresión, antes que para eliminar los ciclos de la estructura secundaria en el RNAm transcrito (ver, por ejemplo, la Solicitud de Patente Europea 75 , 444A) , o para proporcionar codones que se traducen más rápidamente mediante el huésped seleccionado, tal como los muy conocidos codones de E. coli de preferencia para la expresión de E. coli . Los polipéptidos de la presente invención, tanto los que ocurren naturalmente como los modificados, se producen preferiblemente mediante métodos de ADN recombinantes. Esos métodos incluyen insertar una secuencia de ADN que codifica un polipéptido HER-2/neu dentro de un vector de expresión recombinante y que expresa la secuencia de ADN en un sistema de expresión recombinante de célula de microbio, mamífero o insecto bajo condiciones que promueven la expresión. Las secuencias de ADN que codifican los polipéptidos proporcionados por esta invención se pueden armar a partir de fragmentos de ADNc y enlazadores de oligonucleótidos cortos, o a partir de una serie de oligonucleótidos, para proporcionar un gen sintético que sea capaz de ser insertado en un vector de expresión recombinante y expresado en una unidad de transcripción recombinante. Los vectores de expresión recombinantes contienen una secuencia de ADN que codifica a un polipéptido HER-2/neu enlazado funcionalmente a elementos reguladores de transcripción o de traducción derivados de genes de mamíferos, microbios, virus o insectos. Esos elementos reguladores incluyen un promotor de transcripción, una secuencia de operador opcional para el control de la transcripción, un RNAm ribosomal adecuado que codifica la secuencia uniendo sitios, y secuencias que controlan la terminación de la transcripción y traducción. Adicionalmente se pueden incorporar un origen de réplica y un marcador seleccionable para facilitar el reconocimiento de los transformadores . Las regiones del ADN se enlazan de manera operable cuando están relacionadas funcionalmente unas con otras. Por ejemplo, el ADN para un péptido de señal (delantero secretor) está enlazado de manera operable al ADN por un polipéptido si éste se expresa como un precursor que participa en la secreción del polipéptido; un promotor está enlazado de manera operable a una secuencia de codificación si controla la transcripción de la secuencia; o un sitio de unión de ribosoma está enlazado operablemente a una secuencia de codificación si está colocado de modo de permitir la traducción. Generalmente, enlazado operablemente significa contiguo y, en el caso de secretores delanteros, en cuadro de lectura. Las secuencias de ADN que codifican a los polipéptidos HER-2 /neu que se van a expresar en un microorganismo preferiblemente no contendrán intrones que puedan terminar prematuramente la transcripción del ADN en el RNAm. Los vectores de expresión para uso en bacterias puede comprender un marcador seleccionable y origen bacteriano de replicación derivado de plásmidos disponibles comercialmente que comprenden elementos genéticos del muy conocido vector de clonación pBR322 (ATCC 37017) . Esos vectores comerciales incluyen, por ejemplo, pKK223-3 (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Suecia) y pGEMl (Promega Biotec, Madison, Wl, Estados Unidos de Norteamérica) . Estas secciones de "estructura" se combinan con un promotor apropiado y la secuencia estructural que se va a expresar. E. coli se transforma típicamente usando derivados de pBR322, un plásmido derivado de una especie de E. coli (Bolívar y colaboradores, Gene 2:95, 1977) . El pBR322 contiene genes para la resistencia a la ampicilina y a la tetraciclina y así proporciona medios simples para identificar células transformadas . Los promotores usados comúnmente para los vectores de expresión microbiana recombinante incluyen la ß-lactamasa (penicilinasa) y el sistema promotor de lactosa (Chang y colaboradores, Nature 281:544, 1979), el sistema promotor de triptofano (trp) (Goeddel y colaboradores, Nucí . Acids Res 8:4057, 1980 y la Solicitud de Patente Europea 36,766) y el promotor tac (Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual , Cold Spring Harbor Laboratory, p. 412, 1982) . Un sistema de expresión bacteriana particularmente útil emplea el promotor PL del fago ? el represor termolábil cl857ts. Los vectores disponibles de la American Type Culture Collection que incorporan derivados del promotor PL de ? incluye el plásmido pHUB2, residente en E. coli , cepa JMB9 (ATCC 37092) y pPLc28, residente en E. coli RRl (ATCC 53082) . Las secuencias de promotor adecuadas en los vectores de levadura incluyen los promotores para metalotioneína, 3-fosfoglicerato quinasa (Hitzeman y colaboradores, ". Biol . Chem . 255:2073, 1980) u otras enzimas glicolíticas (Hess y colaboradores, J. Adv. Enzyme Reg. 7:149, 1968; y Holland y colaboradores, Biochem. 17:4900, 1978), tal como enolasa, gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa, hexoquinasa piruvato descarboxilasa, fosfofructoquinasa, glucosa-6-fosfato isomerasa, 3-fosfoglicerato mutasa, piruvato quinasa, triosefosfato isomerasa, fosfoglucosa isomerasa, y glucocinasa. Los vectores y promotores adecuados para usarse en expresión de levadura se describen además en R. Hitzeman y colaboradores, Solicitud de Patente Europea 73,657. Los vectores de levadura preferidos se pueden armar usando secuencias de ADN a partir de pBR322 para la selección y la replicación en E. coli (Gen Ampr y origen de replicación) y secuencias de ADN de levadura incluyendo el promotor ADH2 que puede reprimir la glucosa y un líder de secreción del factor ex. El promotor ADH2 ha sido descrito por Russell y colaboradores (J. Biol . Chem . 258:2674, 1982) y Beier y colaboradores (Nature 300:724, 1982). El líder del factor OÍ, que dirige la secreción de proteínas heterólogas, se puede insertar entre el promotor y el gen estructural para ser expresado (ver v. gr., Kurjan y colaboradores, Cell 30:933, 1982; y Bitter y colaboradores, Proc . Nati . Acad. Sci . Estados Unidos de Norteamérica 81:5330, 1984) . La secuencia delantera puede modificarse para contener, cerca de su extremo 3 uno o más sitios de restricción útiles para facilitar la fusión de la secuencia delantera con los genes extraños. Las secuencias de control de transcripción y de traducción en vectores de expresión que se van a usar para transformar células de vertebrados se deben proporcionar mediante fuentes virales . Por ejemplo, los promotores y mejoradores comúnmente usados se derivan de polioma, adenovirus 2, virus de simio 40 (SV40) , y citomegalovirus humano. Las secuencias de ADN derivadas del genoma viral SV40, por ejemplo, origen SV40 promotor temprano y tardío, mejorador, los sitios de división y de poliadenilación se pueden usar para proporcionar los otros elementos genéticos requeridos para la expresión de una secuencia de ADN heteróloga. Los promotores temprano y tardío son particularmente útiles debido a que ambos se obtienen fácilmente a partir del virus como un fragmento que también contiene el origen de replicación viral SV40 (Fiers y colaboradores, Nature 273:113, 1978). Se pueden usar también fragmentos de SV40 más pequeños o más grandes, a condición de que se incluya la secuencia de los aproximadamente 250 pares de bases que se extienden desde el sitio de HindIII hacia el sitio Bgl II localizado en el origen viral de la replicación. Además, se pueden utilizar el promotor genómico viral, las secuencias de señal y/o control a condición de que esas secuencias de control sean compatibles con la célula huésped elegida. Los vectores ejemplares se pueden construir como se describe en Okayama y Berg, Mol . Cell . Biol . 3:280, 1983. Un sistema útil para la expresión en un nivel alto estable de los AD?c receptores de mamífero en las células epiteliales mamarias de murino C127 se puede construir sustancialmente como lo describen Cosman y colaboradores (Mol . Immunol . 23:935, 1986). Un vector eucariótico preferido para la expresión del AD? de la proteína LbeIF4A es pDC406 (McMahan y colaboradores, EMBO J. 10:2821, 1991), e incluye secuencias reguladoras derivadas de SV40, del virus de inmunodeficiencia humano (HIV) , y del virus Epstein-Barr (EBV) . Otros vectores preferidos incluyen pDC409 y pDC410, que se derivan de pDC406. El pDC410 se derivó del pDC406 sustituyendo el origen de replicación del EBV con secuencias que codifican el antígeno T grande SV40. El pDC409 difiere del pDC406 en que un sitio de restricción Bgl II afuera del sitio de clonación múltiple se ha suprimido, haciendo que el sitio de Bgl II dentro del sitio de clonación múltiple sea único. Una línea celular útil que permite la replicación episomal de vectores de expresión, tales como pDC406 y pDC409, que contiene el origen de replicación del EBV, es CV-1/EBNA (ATCC CRL 10478) . La línea celular CV-L/EBNA se derivó mediante transfección de la línea celular CV-1 con un gen que codifica el antígeno -I nuclear del virus Epstein-Barr (EBNA-1) y constitutivamente expresa EBNA-1 dirigido desde el mejorador/promotor inmediato anterior CMV humano. Las células huésped transformadas son células que se han transformado o transfectado con vectores de expresión construidos usando técnicas de ADN recombinante y las cuales contienen secuencias que codifican un polipéptido HER-2/neu de la presente invención. Las células huéspedes transformadas pueden expresar el polipéptido HER-2/neu deseado, pero las células huéspedes transformadas con fines de clonación o amplificación del ADN de HER-2/neu no necesitan expresar el polipéptido HER-2/neu. Los polipéptidos expresados preferiblemente se secretan en el sobrenadante del cultivo, dependiendo del ADN seleccionado, pero también se pueden depositar en la membrana celular. Las células huésped convenientes para la expresión de proteínas recombinantes incluyen procariotes, levadura o células eucarióticas superiores bajo el control de promotores adecuados. Los procariotes incluyen organismos gram negativos o gram positivos, por ejemplo E. coli o Bacilli . Las células eucarióticas superiores incluyen líneas de células establecidas de insecto o de origen mamífero como se describe más adelante. Los sistemas de traducción libre de célula también podrían emplearse para producir polipéptidos HER-2/neu usando ARN derivados de construcciones de ADN. Los vectores de expresión y clonación adecuados para su uso con huéspedes celulares bacterianos, de hongos, levaduras y mamíferos se describen, por ejemplo por Pouwels y colaboradores, Cloning Vectors : A Laboratory Manual , Elsevier, Nueva York. 1985. Los huéspedes de expresión procarióticos se pueden usar para la expresión de polipéptidos HER-2/neu que no requieran procesamiento proteolítico y disulfuro extensivo. Los vectores de expresión procarióticos generalmente comprenden uno o más marcadores fenotípicos seleccionables, por ejemplo proteínas que codifican a un gen confiriendo resistencia al antibiótico o suministrando un requisito autotrófico, y un origen de replicación reconocido por el huésped para asegurar la amplificación dentro del huésped. Los huéspedes procarióticos convenientes para la transformación incluyen E. coli , Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium, y varias especies dentro de los géneros Pseudomonas, Streptomyces, y Staphilococcus, aunque también se pueden emplear otros huéspedes. También se pueden expresar polipéptidos HER-2 /neu recombinantes en huéspedes de levadura, preferiblemente a partir de la especie Saccharomyces, como S. cerevisiae . También se pueden emplear levaduras de otros géneros, como Pichia o Kluyveromycee . Los vectores de levadura generalmente contendrán un origen de replicación a partir del plásmido de levadura 2µ o una secuencia de replicación autónoma (ARS) , un promotor, ADN que codifica al polipéptido HER-2/neu, secuencias para la poliadenilación y la terminación de transcripción y un gen de selección. Preferiblemente, los vectores de levaduras incluirán un origen de replicación y marcador seleccionable que permite la transformación tanto de la levadura como de E. coli , por ejemplo, el gen de resistencia a la ampicilina de E. coli y el gen trpl S. cerevisiae, el cual proporciona un marcador de selección para una cepa mutante de levadura que carece de la capacidad para crecer en triptofano, y un promotor derivado de un gen de levadura altamente expresado para inducir la transcripción de una secuencia estructural corriente abajo. La presencia de la lesión trpl en el genoma de célula huésped de levadura proporciona entonces un ambiente efectivo para detectar la transformación por crecimiento en ausencia del triptofano. Los protocolos de transformación de levadura convenientes son conocidos por los expertos en la técnica. Una técnica ejemplar descrita por Hind y colaboradores ( Proc . Nati . Acad. Sci . USA 75:1929, 1978), involucra seleccionar transformantes Trp+ en un medio selectivo que consiste en 0.67 por ciento de base de nitrógeno de levadura, 0.5 por ciento de casaminoácidos, 2 por ciento de glucosa, 10 miligramos/mililitro de adenina y 20 miligramos/mililitro uracilo. Las cepas huéspedes transformadas por vectores que comprenden el promotor ADH2 se pueden cultivar para la expresión en un medio rico que consiste en 1 por ciento de extracto de levadura, 2 por ciento de peptona, y 1 por ciento de glucosa suplementado con 80 miligramos/mililitro de adenina y 80 miligramos/mililitro de uracilo. La des-represión del promotor ADH2 ocurre después de la terminación de la glucosa en el medio. Los sobrenadantes de levadura cruda se cosechan por filtración y se mantienen a 4°C antes de purificación adicional . También se pueden emplear varios sistemas de cultivo de células de insectos o mamíferos (por ejemplo, Spodoptera o Trichoplueia) para expresar polipéptido recombinante. Los sistemas de baculovirus para la producción de polipéptidos heterólogos en células de insectos, se revisan, por ejemplo en Luckow y Summers, Bio/Technology 6 : 4.1 , 1988. Ejemplos de líneas celulares huéspedes convenientes de mamíferos incluyen las líneas COS-7 de células de riñon de mono, descritas por Gluzman ( Cell 23 : 115 , 1981), y otras líneas de células capaces de expresar un vector adecuado incluyendo, por ejemplo, CV-1/EBNA (ATCC CRL 10478), células L, C127, 3T3, líneas de células de ovario de hámster chino (CHO), COS, NS-1, HeLa y BHK. Los vectores de expresión de mamíferos pueden comprender elementos no transcritos como un origen de replicación, un promotor conveniente y mejorador ligado al gene que se va a expresar, y otras secuencias no transcritas flanqueadas con 5' o 3', y secuencias no traducidas 5' o 3', como sitios de unión de ribosoma necesarios, un sitio de poliadenilación, sitios de empalme de donador y aceptador, y secuencias de terminación de la transcripción. Se pueden preparar polipéptidos HER-2/neu purificados cultivando sistemas convenientes de huésped/vector para expresar los productos de traducción recombinante de los ADN de la presente invención, que se purifican entonces del medio de cultivo o los extractos celulares. Por ejemplo, los sobrenadantes de los sistemas que secretan polipéptido recombinante en un medio de cultivo primero se pueden concentrar usando un filtro de concentración de proteína comercialmente disponible, como una unidad de ultrafiltración Amicon o Millipore Pellicon. Después del paso de concentración, el concentrado se puede aplicar a una matriz de purificación conveniente. Por ejemplo, una matriz de afinidad conveniente puede comprender una proteína de estructura contadora (es decir, una proteína para la cual un polipéptido HER-2/neu se une en una interacción específica basada en la estructura) o lectina o molécula de anticuerpo unida a un soporte conveniente. Alternativamente, una resina de intercambio de aniones se puede emplear, por ejemplo una matriz o sustrato que tiene grupos dietilaminoetilo (DEAE) pendientes. Las matrices pueden ser acrilamida, agarosa, dextrán, celulosa u otros tipos comúnmente empleados en purificación de proteínas. Alternativamente, se puede emplear un paso de intercambio de cationes . Los intercambiadores de cationes convenientes incluyen varias matrices insolubles que comprenden grupos sulfopropilo o carboximetilo. Se prefieren los grupos sulfopropilo. La cromatografía de filtración en gel también proporciona un medio de purificar un HER-2 /neu . La cromatografía por afinidad es un método preferido de purificar polipéptidos de HER-2/neu. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales contra el polipéptido HER-2/neu también pueden ser útiles en la purificación por cromatografía de afinidad, utilizando métodos que son muy conocidos en la técnica.

Finalmente, se pueden emplear uno o más pasos de cromatografía líquida de alto rendimiento de fase inversa (RP-HPLC) empleando medio hidrofóbico RP-HPLC (por ejemplo, gel de sílice que tiene metilo pendiente u otros grupos alifáticos) para purificar adicionalmente una composición de polipéptido HER-2/neu. Algunos o todos los pasos de purificación anteriores, en distintas combinaciones, también se pueden emplear para proporcionar un polipéptido recombinante homogéneo . El polipéptido HER-2 /neu recombinante producido en cultivo bacteriano se aisla preferiblemente mediante la extracción inicial de aglomeración de células, seguido por uno o más pasos de concentraciones, salaciones, intercambio de ion acuoso o cromatografía de exclusión por tamaño. La cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) se puede emplear para los pasos de purificación final. Las células microbianas empleadas en la expresión de una proteína LbeIF4A recombinante se pueden romper por cualquier método conveniente, incluyendo ciclo de congelación-descongelación, sonificación, interrupción mecánica, o uso de agentes de separación de células . La fermentación de la levadura que expresa el polipéptido HER-2/neu como una proteína secretada simplifica mucho la purificación. La proteína recombinante secretada resultante de una fermentación a gran escala se puede purificar mediante métodos análogos a los descritos por Urdal y colaboradores (J. Chromatog. 269 : 111 , 1984) . Esta referencia describe dos pasos secuenciales de cromatografía líquida de alto rendimiento de fase inversa para la purificación del GM-CSF humano recombinante en una columna de cromatografía líquida de alto rendimiento preparativa. Las preparaciones de polipéptidos HER-2 /neu sintetizados en cultivo recombinante pueden contener componentes celulares no HER-2 /neu, incluyendo proteínas, en cantidades y de un carácter que depende de los pasos de purificación tomados para recuperar el polipéptido HER-2 /neu del cultivo. Estos componentes ordinariamente serán de origen de levadura, procariótico o eucariótico no humano. Estas preparaciones típicamente están libres de otras proteínas que normalmente se pueden asociar con la proteína HER-2 /neu como se encuentra en la naturaleza en su especie de origen. La síntesis automatizada proporciona un método alternativo para preparar polipéptidos de esta invención. Por ejemplo, se puede emplear cualquier técnica comercialmente disponible de fase sólida como el método de síntesis de fase sólida de Merrifield, en el cual los aminoácidos se añaden secuencialmente a una cadena de aminoácidos creciente. (Ver Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85.-2149-2146, 1963.) El equipo para la síntesis automatizada de polipéptidos está disponible comercialmente en proveedores como Applied Biosystems, Inc. de Foster City, CA, y generalmente pueden operarse de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Dentro de un aspecto de la presente invención, se puede detectar el uso de un polipéptido HER-2/neu (o una molécula de ADN que dirige la expresión de este péptido) para generar una respuesta inmune a la proteína HER-2 /neu (incluyendo la expresada en una malignidad a la cual se asocia el oncógeno HER-2 /neu) . Ejemplos representativos de estas malignidades incluyen cáncer del pecho, ovarios, colon, pulmón y próstata. Una respuesta inmune a la proteína HER-2 /neu una vez generada por un polipéptido HER-2/neu, puede ser de vida larga y se puede detectar mucho después de la inmunización, independientemente de si la proteína está presente o ausente en el cuerpo en el momento de la prueba. Una respuesta inmune a la proteína HER-2 /neu generada por la reacción a un polipéptido HER-2 /neu se puede detectar examinando la presencia o ausencia, o aumento, de activación específica de células T CD4+ o CD8 Más específicamente, las células T aisladas de un individuo inmunizado por técnicas de rutina (como por centrifugación de gradiente de densidad Ficoll/Hypaque de linfocitos de la sangre periférica) se incuban con proteína HER-2 /neu . Por ejemplo, se pueden incubar células T in vi tro durante 2 a 9 días (típicamente 4 días) a 37°C con proteína HER-2/neu (típicamente, 5 µg/mililitro de proteína completa o números graduados de células que sintetizan la proteína HER-2 /neu) . Puede ser deseable incubar otra alícuota de una muestra de células T en ausencia de proteína HER-2/neu para servir como control. La activación específica de las células T CD4+ o CD8+ se puede detectar de varias maneras. Los métodos para detectar activación específica de células T incluye detectar la proliferación de células T, la producción de citocinas (por ejemplo, linfocinas) , o la generación de actividad citolítica (es decir, generación de células T citotóxicas específicas para la proteína HER-2/neu) . Para las células T CD4+, un método preferido para detectar activación específica de células T es la detección de la proliferación de células T. Para las células T CD8+, un método preferido para detectar la activación específica de células T es la detección de la generación de actividad citolítica. La detección de la proliferación de células T se puede llevar a cabo por una variedad de técnicas conocidas . Por ejemplo, la proliferación de células T se puede detectar midiendo la velocidad de la síntesis de ADN. Las células T que han sido estimuladas para proliferar exhiben una velocidad creciente de síntesis de ADN. Una manera típica de medir la velocidad de síntesis de ADN es, por ejemplo, mediante cultivos etiquetados por pulsos de células T con timidina tritiada, un precursor de nucleósido que se incorpora en ADN nuevamente sintetizado. La cantidad de timidina tritiada incorporada se puede determinar usando un espectrofotómetro de centilación líquida. Otras maneras de detectar la proliferación de Células T incluyen medir aumentos en la producción de interleucina-2 (IL-2) , flujo de Ca2+, o absorción de tinte, como 3- (4, 5-dimetiltiazol-2-il) -2, 5-difenil-tetrazolio. Alternativamente, se puede medir la síntesis de linfocinas (como la interferona-gama) o se puede cuantificar el número relativo de células T que puede responder a la proteína pi85HER-2/neu intacta. Mediante el uso o la expresión de un polipéptido HER-2/neu, las células T que reconocen a la proteína HER-2/neu pueden proliferar en vivo. Por ejemplo, un medicamento para inmunización con un péptido HER-2 /neu (es decir, como una vacuna) puede inducir expansión continuada en el número de células T necesarias para el ataque terapéutico contra un tumor al cual está asociado el oncógeno HER-2 /neu . Típicamente, aproximadamente de 0.01 µg/kilogramo hasta aproximadamente 100 miligramos/kilogramo de peso corporal será administrado por ruta intradérmica, subcutánea o intravenosa. Una dosis preferida es de aproximadamente 1 µg/ hasta aproximadamente 1 miligramo/kilogramo, con aproximadamente de 5 µg/kilogramo hasta aproximadamente 200µg/kilogramo particularmente preferido. Será evidente para los expertos en la técnica que el número y la frecuencia de administración dependerá de la respuesta del paciente. Puede ser deseable administrar el polipéptido HER-2/neu repetidamente. Será evidente para los expertos en esta técnica que se puede administrar más de un polipéptido HER-2/neu, ya sea simultáneamente o secuencialmente. Los péptido preferidos para su uso en un medicamento para inmunización son los que incluyen la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 2 comenzando en aproximadamente el residuo de lisina en la posición de aminoácido 676 y extendiéndose hasta aproximadamente el residuo de valina en la posición de aminoácido 1255. Será apreciado por los expertos en la técnica que la presente invención contempla el uso de un polipéptido HER-2 /neu intacto así como la división de este polipéptido en una pluralidad de péptidos. Ni la proteína pi85HER_2/peu intacta ni un péptido que tenga la secuencia de aminoácidos de su dominio extracelular entero (es decir, un péptido que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 desde la posición de aminoácido 1 hasta la posición de aminoácido 650, más o menos aproximadamente de una a cinco posiciones, y con o sin las primeras 21 posiciones de aminoácidos) se usa solo para inmunización. Un polipéptido HER-2/neu (o ácido nucleico) se formula preferiblemente para su uso en los métodos anteriores como composición farmacéutica (por ejemplo, vacuna) . Las composiciones farmacéuticas generalmente comprenden uno o más polipéptidos en combinación con un vehículo, excipiente o diluyente farmacéuticamente aceptable. Estos vehículos serán no tóxicos a los receptores en las dosis y concentraciones empleadas. También se contempla el uso de un polipéptido HER-2 /neu junto con agentes quimioterapéuticos. Además del polipéptido HER-2/neu (el cual funciona como un antígeno) , puede ser deseable incluir otros componentes en la vacuna, como un vehículo para administración de antígeno y sustancias inmunoestimuladoras diseñadas para aumentar la inmunogenicidad de la proteína. Ejemplos de vehículos para administración de antígeno incluyen las sales de aluminio, emulsiones de agua en aceite, vehículos de aceite biodegradable, emulsiones de aceite en agua, microcápsulas biodegradables, y liposomas. Ejemplos de sustancias inmunoestimulantes (adyuvantes) incluyen N-acetilmuramil-L-alanina-D-isoglutamina (MDP) , lipopoli-sacáridos (LPS) , glucano, IL-12, GM-CSF, gama interferona e IL-15. Será evidente para los técnicos con experiencia ordinaria en esta técnica que un polipéptido HER-2/neu para una vacuna se puede preparar sintéticamente o derivarse de manera natural . Aunque se puede emplear cualquier vehículo conveniente conocido por los técnicos con experiencia ordinaria en la técnica para las composiciones farmacéuticas de esta invención, el tipo de vehículo variará dependiendo del modo de administración y si se desea una liberación sostenida. Para administración parenteral, como una inyección subcutánea, el vehículo preferiblemente comprende agua, solución salina, alcohol, una grasa, una cera o un regulador. Para administración oral, se puede emplear cualquiera de los vehículos anteriores o un vehículo sólido, como manitol, lactosa, almidón, estearato de magnesio, sacarina de sodio, talco, celulosa, glucosa, sacarosa, y carbonato de magnesio. Las microesferas biodegradables (por ejemplo galactida poliláctica) también se pueden emplear como vehículos para la composición farmacéutica de esta invención. Se describen microesferas biodegradables convenientes, por ejemplo, en las Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica Números : 4,897,268 y 5,075,109. Se puede encapsular un polipéptido HER-2 / neu dentro de la microesfera biodegradable o asociarse con la superficie de la microesfera. Por ejemplo, en una modalidad preferida, un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 desde el aminoácido 676 hasta el aminoácido 1255 se encapsula dentro de una microesfera biodegradable. Con relación a esto, es preferible que la microesfera sea mayor de aproximadamente 25 mieras. Las composiciones farmacéuticas (incluyendo vacunas) también pueden contener diluyentes como reguladores, antioxidantes como ácido ascórbico, polipéptidos de bajo peso molecular (menos de aproximadamente 10 residuos) , proteínas, aminoácidos, carbohidratos incluyendo glucosa, sacarosa o dextrinas, agentes quelantes como EDTA, glutationa y otros estabilizantes y excipientes. La solución salina regulada neutral o salina mezclada con albúmina de suero no específico son ejemplos de diluyentes adecuados. Preferiblemente se formula el producto como un liofilizado usando soluciones de excipientes adecuadas (por ejemplo, sacarosa) como diluyentes . Como una alternativa a la presentación de los polipéptidos HER-2/neu, la presente invención incluye composiciones capaces de administrar moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido HER-2/neu. Estas composiciones incluyen vectores virales recombinantes (por ejemplo, retrovirus (ver WO 90/07936, WO 91/02805, WO 93/25234, WO 93/25698, y WO 94/03622), adenovirus (ver Berkner, Bio ec?nigues 6:616-627, 1988; Li y colaboradores, Huir?. Gene Ther. 4:403-409, 1993; Vincent y colaboradores, Nat . Genet. 5:130-134, 1993; y Kolls y colaboradores, Proc . Nati . Acad. Sci . USA 91:215-219 , 1994), virus de viruela (ver Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número: 4,769,330; Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número: 5,017,487; y WO 89/01973)), ADN puro (ver WO 90/11092) , molécula de ácido nucleico complejada para una molécula policatiónica (ver WO 93/03709) , y ácido nucleico asociado con liposomas (ver Wang y colaboradores, Proc . Nati . Acad. Sci . USA 84:7851, 1987). En ciertas modalidades, el ADN puede estar ligado a adenovirus aniquilado o inactivado (ver Curiel y colaboradores, Hu . Gene Ther. 3:147-154, 1992; Cotton y colaboradores, Proc. Nati . Acad. Sci . USA 89 : 6094 , 1992) . Otras composiciones convenientes incluyen ligando de ADN (ver Wu y colaboradores, J. Biol . Chem. 264 : 16985 - 16981 , 1989) y combinaciones de ADN lípido (ver Felgner y colaboradores, Proc. Nati . Acad. Sci . USA 84:7413-7417 , 1989) . Además, la eficiencia de asimilación de ADN puro en las células se puede incrementar cubriendo el ADN sobre cuentas biodegradables . Además de los procedimientos directos en vivo, se pueden usar procedimientos ex vivo en las cuales las células se remueven de un animal, se modifican, y se colocan en el mismo o en otro animal. Será evidente que uno puede utilizar cualquiera de las composiciones anotadas anteriormente para la introducción de moléculas de ácido nucleico HER-2 /neu en células de tejido en un contexto ex vivo . Los protocolos para métodos virales, físicos y químicos, de asimilación se conocen bien en la técnica. De conformidad con lo anterior, la presente invención es útil para aumentar o provocar, en un paciente o cultivo celular, una respuesta inmune celular (por ejemplo, la generación de células T citolíticas específicas para antígeno) . Como se usa en la presente el término "paciente" se refiere a cualquier animal de sangre caliente, preferiblemente un humano. Un paciente puede estar afectado de cáncer, como cáncer del pecho, o puede ser normal (es decir, libre de enfermedad e infección detectable) . Un "cultivo celular" es cualquier preparación de células T o de células componentes aisladas (incluyendo, pero sin limitarse a, macrófagos, monocitos, células B y células dendríticas) . Estas células se pueden aislar mediante cualquiera de una variedad de técnicas bien conocidas a los de experiencia ordinaria en la técnica (como centrifugación por densidad de Ficoll-hypaque) . Las células pueden (pero no necesariamente) haber sido aisladas de un paciente afligido con una malignidad asociada con HER-2 / neu, y pueden ser reintroducidas en un paciente después del tratamiento . La presente invención también describe que el polipéptido HER-2/neu, además de ser inmunogénico a las células T, parece estimular las células B para producir anticuerpos capaces de reconocer el polipéptido HER-2/neu. Los anticuerpos específicos (es decir, que exhiben una afinidad de unión de aproximadamente 107 litros/mol o mejor) para la proteína HER-2 /neu se pueden encontrar en una variedad de fluidos corporales incluyendo sueros y ascitas. En resumen, una muestra de fluido corporal se aisla de un animal de sangre caliente, como un humano, para el cual se desea determinar si están presentes anticuerpos para el polipéptido HER-2 /neu . El fluido corporal se incuba con el polipéptido HER-2/neu bajo condiciones y durante un tiempo suficiente para permitir que se formen inmunocomplejos entre el polipéptido y los anticuerpos específicos para la proteína. Por ejemplo, un fluido corporal y el polipéptido HER-2 /neu se pueden incubar a 4°C durante 24-48 horas. Después de la incubación, la mezcla de la reacción se prueba para ver la presencia de inmunocomplejos . La detección de uno o más inmunocomplejos formados entre el polipéptido HER-2 /neu y los anticuerpos específicos para el polipéptido HER-2/neu se puede llevar a cabo mediante una variedad de técnicas conocidas, como radioinmunoensayos (RÍA) y prueba inmunosorbente de enzima enlazada (ELISA) . Los inmunoensayos convenientes incluyen la técnica de inmunoensayo de emparedado de anticuerpo monoclonal doble de David y colaboradores (Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número: 4,376,110); ensayos de emparedado de anticuerpo monoclonal-policlonal (Wide y colaboradores, en Kirkham y Hunter, editores, Radioimmunoassay Methods, E. y S. Livingstone, Edinburgh, 1970) ; el método de la "mancha western" de Gordon y colaboradores (Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número: 4,452,901); inmunoprecipitación de ligando etiquetado (Brown y colaboradores, J. Biol . Chem . 255:4980-4983, 1980); ensayos inmunosorbentes de enzima enlazada como los describen, por ejemplo Raines y Ross (J. Biol . Chem .257:5154-5160, 1982); técnicas inmunocitoquímicas, incluyendo el uso de fluorócromos (Brooks y colaboradores, Clin . Exp. Immunol . 39 : 477, 1980); y neutralización de actividad [Bowen-Pope y colaboradores, Proc. Nati . Acad. Sci . ULSA 81:2396-2400 (1984)], todas las cuales se incorporan en la presente mediante referencia. Además de los inmunoensayos descritos anteriormente, se dispone de varios de otros inmunoensayos, incluyendo los descritos en las Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica Números: 3,817,827; 3,850,752; 3,901,654; 3,935,074; 3,984,533; 3,996,345; 4,034,074; y 4,098,876, las cuales todas se incorporan en la presente mediante referencia. Para fines de detección, el polipéptido HER-2/neu ("antígeno") puede estar etiquetado o no etiquetado. Cuando está no etiquetado, el antígeno encuentra uso en ensayos de aglutinación. Además, el antígeno no etiquetado se puede usar en combinación con moléculas etiquetadas que son reactivas con inmunocomplejos, o en combinación con anticuerpos etiquetados (segundos anticuerpos) que son reactivos con el anticuerpo dirigido contra el polipéptido HER-2/neu, como anticuerpos específicos para inmunoglobulina. Alternativamente, el antígeno se puede etiquetar directamente. Cuando está etiquetado, el grupo reportero puede incluir radioisótopos, fluoróforos, enzimas, partículas luminiscentes o de tinte. Estas y otras etiquetas se conocen bien en la técnica y se describen, por ejemplo en las siguientes Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica Números: 3,766,162; 3,791,932; 3,817,837; 3,996,345; y 4,233,402.

Típicamente, en una prueba inmunosorbente de enzima enlazada, el antígeno se adsorbe en la superficie de un pozo de microtitulación. Los sitios de unión de proteína residuales en la superficie se bloquean con un agente apropiado, como albúmina de suero bovino (BSA) , suero de cabra normal inactivado por calor (NGS) , o BLOTTO (solución regulada de leche seca descremada que también contiene un conservador, sales, y un agente antiespumante) . El pozo se incuba entonces con una muestra sospechosa de contener anticuerpo específico. La muestra se puede aplicar así, o más frecuentemente, se puede diluir, usualmente en una solución regulada que contiene una cantidad pequeña (0.1 por ciento- 5.0 por ciento en peso) de proteína, como albúmina de suero bovino, suero de cabra normal inactivado por calor, o BLOTTO. Después de incubar durante una cantidad de tiempo suficiente para permitir que ocurra la unión, el pozo se lava para remover la proteína no unida y luego se incuba con un anticuerpo de inmunoglobina específico anti-especie etiquetado con un grupo reportero. El grupo reportero se puede elegir de una variedad de enzimas, incluyendo peroxidasa de rábano picante, beta-galactosidasa, fosfatasa alcalina, y glucosa oxidasa. Se deja suficiente tiempo para que ocurra la unión específica, luego el pozo se vuelve a lavar para remover el conjugado no unido y se añade el sustrato para la enzima. Se deja desarrollar el color y la densidad óptica del contenido del pozo se determina visualmente o instrumentalmente . En una modalidad preferida de este aspecto de la presente invención, un grupo reportero se une a la proteína HER-2 / neu . El paso de detectar inmunocomplejos involucra remover sustancialmente cualquier proteína HER-2 /neu no unida y luego detectar la presencia o ausencia del grupo reportero. En otra modalidad preferida, un grupo reportero se une a un segundo anticuerpo capaz de unirse con los anticuerpos específicos para la proteína HER-2/neu. El paso de detectar inmunocomplejos involucra (a) remover sustancialmente cualquier anticuerpo no unido, (b) añadir el segundo anticuerpo, (c) remover sustancialmente cualquier segundo anticuerpo no unido y luego (d) detectar la presencia o ausencia del grupo reportero. Cuando el anticuerpo específico para la proteína HER-2 /neu se deriva de un humano, el segundo anticuerpo es un anticuerpo anti-humano. En una tercera modalidad preferida para detectar inmunocomplejos, un grupo reportero se une a una molécula capaz de unirse a los inmunocomplejos. El paso de detección involucra (a) añadir la molécula, (b) remover sustancialmente cualquier molécula no unida, y luego (c) detectar la presencia o ausencia del grupo reportero. Un ejemplo de una molécula capaz de ligarse a los inmunocomplejos es la proteína A. Será evidente para alguien experto en la técnica que se puede emplear una variedad de métodos para detectar los inmunocomplejos dentro de la presente invención. Los grupos reporteros convenientes para su uso en cualquiera de los métodos incluyen radioisótopos, fluoróforos, enzimas, iluminadores, y partículas de tinte. En un aspecto relacionado de la presente invención, se puede usar la detección de inmunocomplejos formados entre el polipéptido HER-2 /neu y anticuerpos en el fluido corporal que son específicos para el polipéptido HER-2/neu para vigilar la efectividad de la terapia contra el cáncer, la cual involucra un polipéptido HER-2/neu, para una malignidad a la cual se asocia el oncógeno HER-2/neu. Se pueden analizar muestras de fluido corporal tomados de un individuo antes y después a la iniciación de la terapia para los inmunocomplejos mediante las metodologías descritas anteriormente. En pocas palabras, se compara el número de inmunocomplejos detectados en ambas muestras. Un cambio sustancial en el número de inmunocomplejos en la segunda muestra (iniciación posterior a la terapia) con relación a la primera muestra (previa a la terapia) refleja terapia exitosa. Los siguientes ejemplos se ofrecen a manera de ilustración y no a manera de limitación.

EJEMPLOS EJEMPLO 1 Expresión y purificación de polipéptido HER-2/neu humano recombinante El polipéptido HER-2/neu humano se recuperó mediante el método de reacción de cadena de polimerasa (por ejemplo Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica Números : 4,683,195; 4,683,202; 4,800,159) a partir de un plásmido preparado de acuerdo con 'Di Fiore y colaboradores (King y colaboradores, Science 229 : 914 - 916 , 1985; Di Fiore y •colaboradores, Science 237:178-182, 1987) usando cebadores de oligonucleótidos que adicionalmente introdujeron un sitio de restricción BssHII y un sitio proteasa enteroquinasa en el extremo 5 ' y un sitio EcoRI en el extremo 3 ' . El cebador para el extremo 5' fue: 5,-TCTGGCGCGCTGGATGACGATGACAAGA CGACGGCAGCAGAAGATC-3, (SEQ ID NO: 3) mientras que el cebador para el extremo 3' fue: S'-TGAATTCTCGAGTCATTACACTGGCACGTCCAGACCCAG-S' (SEQ ID NO: 4). El fragmento resultante de reacción de cadena de polimerasa de 1.8 kb se subclonó en el vector T de Novagen (Madison, Wl, EUA) y la secuencia de las clonas seleccionadas se determinó en el secuenciador de ADN automatizado ABI 373 (Applied Biosyistems Inc., Foster City, CA, EUA) usando cebadores de secuenciamiento de traslape. Fragmentos de la reacción de cadena de polimerasa con la secuencia que correspondió a la secuencia de ADN publicada para el ADNc del HER-2 /neu humano (SEQ ID NO:l; Coussens y colaboradores, Science 230:1132, 1985; Yamamoto y colaboradores, Nature 319:230, 1986) se conectaron entonces en el cuadro de lectura correcto vía el sitio BssHII a una tio-redoxina reductasa de E. coli modificada. Una etiqueta de afinidad ßXhistidina empleada en la purificación de afinidad ?i-?TA de la proteína de fusión expresada se incorporó en la parte de fusión de tio-redoxina reductasa. Este AD?c para la proteína de fusión del polipéptido HER-2/neu trxA-humano se subclonó en un vector de expresión pET modificado para la expresión en E. coli . Aunque se ha reportado que la tio-redoxina reductasa estabiliza y solubiliza otras proteínas heterólogas expresadas en E. coli , no parece ofrecer ninguna ventaja significativa para la expresión del polipéptido HER-2/neu humano en E. coli . Aunque una proporción significativa de la proteína de fusión de polipéptido trxA-HER-2/neu fue soluble, una mayoría se expresó en cuerpos de inclusión. La proteína de fusión se sometió también a degradación durante la expresión en E. coli . Sin embargo, la presencia de la parte de fusión de tio-redoxina reductasa puede estabilizar a la proteína durante la purificación. La disponibilidad de anticuerpos monoclonales para la tio-redoxina reductasa proporciona un marcador conveniente para seguirlo durante la purificación. Para la purificación del polipéptido HER-2/neu humano con la parte de fusión de tio-redoxina reductasa que contiene la etiqueta de afinidad 6HHis, la aglomeración de El coli se resuspendió con inhibidores de proteasa y lisozima y se sonificó. Los cuerpos de inclusión se aislaron mediante centrifugación, y se lavaron 3 veces con deoxicolato, la última lavada fue durante la noche para remover LPS. Los cuerpos de inclusión lavados se solubilizaron en GuHCl para la purificación Ni. La columna Ni se lixivió con imidazol en urea y se dializó contra 10 mM Tris pH 8. La recuperación del polipéptido HER-2/neu usando este protocolo fue del 80-95 por ciento de proteína pura de longitud total siendo el principal contaminante la proteína degradada. De 500 mililitros de fermentación, se recuperaron 20 miligramos. Fue más del 98 por ciento de polipéptido HER-2/neu. Las técnicas usadas en la presente son bien conocidas en la técnica y han sido descritas, por ejemplo en J. Sambrook y colaboradores, Molecular Cloning: A Laboratory Manual , 2nd, Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, Cold Spring Harbor, Nueva York, EUA. EJEMPLO 2 Células dendríticas pueden cebar polipéptido HER-2/neu humano A. Generación de cultivos de células dendríticas (DC) a partir de médula ósea Se generaron cultivos de células dendríticas a partir de células progenitoras hematopoyéticas (HPC) CD34+.

Las células CD34+ se purificaron a partir de médula ósea de donadores normales usando el sistema de separación de células Ceprate LC Kit (CellPro, Bothell, WA, EUA) . Mediante el análisis citométrico de flujo se determinó una pureza del 80 al 90 por ciento de las células CD34+ recuperadas. Las células CD34+ se cultivaron en medio libre de suero (X-VIVO 10, Biowhittaker, Inc., Walkersville, MD, EUA) suplementado con L-glutamina (584 µg/litro) , penicilina (10 Ul/mililitro) , estreptomicina (100 µg/mililitro) , 100 ng/mililitro de rGM-CSF humano y 50 ng/mililitro de rIL-6 humana (Immunex, Seattle, WA, EUA) . Después de 0 a 17 días de tiempo de cultivo, las células se cosecharon y usaron para fenotipificar y para ensayos de estimulación de células T. El GM-CSF solo y en combinación con la IL-4 o TNFa se ha descrito que inducen el crecimiento in vi tro de las células dendríticas. En experimentos usando KLH y OVA como antígenos para cebar células T nativas, GM-CSF más IL-6 consistentemente dieron una estimulación total comparable, pero con un fondo más bajo y así un índice de estimulación más alto comparado con GM-CSF más IL-4 o TNFa. B. Ensavo de cebado de células T Las células progenitoras hematopoyéticas CD34+ derivadas de médula ósea cultivadas en medio Ubre de suero que contenía GM-CSF e IL-6 se usaron como APC después de un período de cultivo de 0 a 17 días. La capacidad de cebado de células dendríticas se determinó cultivándolas con linfocitos T naturales, autólogos en presencia o ausencia del polipéptido HER-2/neu humano (hHNP) recombinante antígeno proteína (10 µ/mililitro) . Los linfocitos T CD4+ se aislaron de células mononucleares de la sangre periférica mediante selección positiva usando columnas de inmunoafinidad (CellPro, Inc., Bothell, WA, EUA) . Se seleccionaron linfocitos T CD4+ CD45RA+ (naturales) a partir de linfocitos T CD4+ usando un anticuerpo monoclonal mAb anti-CD45RA directamente conjugado para FITC (Immunotech, Westbrook, ME, EUA) mediante clasificación citométrica de flujo. Las células T CD4+ CD45RA+ obtenidas fueron 99 por ciento puras. Los cultivos de células dendríticas se plaquearon en charolas de 96 pozos de fondo redondo (Corning, Corning, NY, EUA) a varias concentraciones y se incubaron durante 16-18 horas con hHNP 10 µg/ mililitro de concentración final. Las células dendríticas pulsadas con antígeno se irradiaron (10 Gy) , y se añadieron linfocitos T CD4+ CD45RA+ autólogos (5 x 104/pozo) . La respuesta proliferativa a las células T se midió mediante la asimilación de (3H) timidina (1 µCi/pozo) añadida el día 6 durante 16-18 horas. Se realizaron ensayos de proliferación en medio libre de suero y libre de citocina. Los resultados se muestran en la Figura 1. La Figura 2 muestra los resultados de probar las células T CD4+, a partir de un donador normal para ver sus respuestas al polipéptido HER-2/neu humano. Se obtuvo información similar con las células T de nueve de cada 10 individuos normales . EJEMPLO 3 Ensayo para detectar precursores de linfocitos de baia frecuencia Se pueden usar tres ensayos para la detección de respuestas de CD4+: un ensayo de proliferación estándar, un método de búsqueda de eventos de baja frecuencia, y un ensayo de dilución limitante (LDA) . Los ensayos proliferativos convencionales son capaces de detectar fácilmente respuestas cebadas. El índice de estimulación de respuesta proliferativa proporciona una burda correlación con la frecuencia de precursor de las células T reactivas al antígeno. Cualquier respuesta proliferativa específica detectada del PBL se considera una respuesta cebada. Para proporcionar una interpretación más cuantitativa de las respuestas de células T CD4+, se usa el sistema de ensayos desarrollado para detectar respuestas de frecuencia baja del precursor de linfocito (descritas más adelante) . Este ensayo es simple y efectivo en costo. En circunstancias en las cuales se necesita más precisión, la frecuencia de precursor se valida limitando los ensayos de dilución (Bishop y Orosz, Transplantation 41 : 611- 611 , 1989). Las respuestas mayores que las detectadas en individuos normales se definen como respuesta cebada e implican inmunidad existente. Las respuestas bajas, detectables solamente mediante condiciones de ensayo de dilución limitante se considera que son respuestas no cebadas. Una ausencia de respuesta por ensayo de dilución limitante o una respuesta menor que la definida por el análisis de la población normal se considera ser tolerancia/anergia. En general, las respuestas de las células T CD4+ cebadas se pueden detectar en ensayos proliferativos convencionales, mientras que las respuestas no cebadas no son detectables en los mismos ensayos. La detección de números pequeños de células T no cebadas se limita confundiendo la absorción de timidina de fondo que incluye la respuesta de linfocito mezclado autólogo (AMLR) para el antígeno auto MHC más las respuestas a proteínas de auto suero procesadas y proteínas con suero añadido exógenamente . Para obtener y detectar células T no cebadas, se usó un sistema de ensayos para respuestas de baja frecuencia basado en estadísticas de muestreo de Poisson (En: Pinnaclee, Chiron Corporation, 1:1-2, 1991) . Este tipo de análisis aplica específicamente a eventos de baja frecuencia en que, si la frecuencia precursora es menor que el número de células en un cultivo de réplica, se requieren muchas réplicas para detectar un número estadísticamente significativo de positivos. Teóricamente, el análisis corregirá para respuestas autólogas presentando un control positivo conocido (como PHA o toxoide tetánico) y control negativo conocido (no antígeno) y evaluando todos los puntos de datos desde el más bajo hasta el más alto irrespectivo del grupo experimental al cual pertenecen. Un valor de corte se calcula basado en la ecuación corte = M + (F +SD) , en donde M = media aritmética, F = 3.29, un factor de las tablas de la distribución normal estandarizada elegida de manera que no más del 0.1 por ciento de los "verdaderos negativos" de un fondo distribuido normalmente estará arriba del corte, y SD = desviación estándar. En este ensayo de búsqueda, los pozos por encima del corte se consideran verdadero positivos que potencialmente contienen un linfocito que está específicamente proliferando ara el antígeno de interés . Aunque es posible hacer estimaciones de la frecuencia del precursor linfocito usando este método, la determinación precisa requiere análisis ensayo de dilución limitante formal. EJEMPLO 4 La vacuna basada en el polipéptido HER-2/neu otorcra inmunidad a la proteína HER-2/neu A. Animales Las ratas usadas en este estudio fueron Fischer cepa 344 (CDF (F-344) /CrlBR) (Charles River Laboratories, Portage MI) . Los animales se mantuvieron en las instalaciones para animales en la Universidad de Washington bajo condiciones específicas libres de patógenos y se usaron rutinariamente para estudios experimentales entre los 3 y 4 meses de edad.

B. Inmunización Las ratas Fischer fueron inmunizadas con polipéptido HER-2 / neu de rata (rHNP) recombinante en una variedad de adyuvantes (MPL, Vaccel; Ribi, Bozeman, MT, EUA) . Los animales recibieron 50 µg de rHNP mezclado con adyuvante subcutáneamente. Veinte días después los animales fueron reforzados con una segunda inmunización de 50 µg de rHNP administrada de la misma manera. Veinte días después de la inmunización de refuerzo se probaron los animales para ver la presencia de anticuerpos dirigidos contra la proteína HER-2 /neu de rata (neu) . C. Líneas celulares Se usaron dos líneas de células como una fuente de proteína HER-2/neu de rata. SKBR3, una línea de célula de cáncer de pecho humana que es un marcado sobre-expresador de HER-2/neu (American Type Culture Collection, Rockville, MD) se mantuvo en cultivo en 10 por ciento de suero de bovino fetal (FBS) (Gemini Bioproducts, Inc., Calabasas, CA) y RPMI . DHFR-G8, una línea celular NIH/3T3 cotransfectada con cneu-p y pSV2-DHFR (American Type Culture Collection, Rockville, MD) , se usó como una fuente de proteína neu de rata no transformante (Bernards y colaboradores., Proc . Nati . Acad. Sci . USA 84:6854-6858, 1987) . Esta línea celular se mantuvo en 10 por ciento de suero bovino fetal y medio de Eagle modificado de Dulbecco con 4.5 gramos/litro de glucosa. Las células DHFR-G8 se pasaron a través del mismo medio suplementado con 0.3 µM metotrexato a cada tres pasadas para mantener el transfectante neu. D. Preparación de Lisados de células Los lisados tanto de SKBR3 como de DHFR-G8 se prepararon y usaron como una fuente de proteína neu. Brevemente, se preparó un regulador de lisis que consiste en una base tris, cloruro de sodio y Triton-X (1 por ciento) pH 7.5. Se añadieron inhibidores de proteasa: aprotinina (lµg/ml) , benzamidina (lmM) y PMSF (lmM) . Se usó 1 mililitro del regulador de lisis para suspender 107 células. Las células se centrifugaron durante 15 segundos cada 10 minutos durante una hora hasta romperse. Todos los procedimientos se realizaron sobre hielo en un cuarto frío a 4°C. Después de la interrupción las células se microfugaron a 4°C durante 20 minutos . Se removió el sobrenadante del desperdicio celular y se almacenó en pequeñas alícuotas a -70°C hasta usarse. La presencia de neu humana y de rata en los lisados se documentó mediante análisis de mancha Western. E. Prueba inmunosorbente de enzima enlazada para respuestas de anticuerpo de neu de rata Se incubaron 4 charolas Immulon de 96 pozos (Baxter SP, Redmond, WA: Dynatech Laboratories) durante la noche a 4°C con un anticuerpo monoclonal específico para neu de rata (Oncogene Science), 7.16.4, a una concentración de 10 µg/mililitro diluido en regulador de carbonato (concentraciones equimolares de Na2C03 y NaHC03 pH 9.6).

Después de la incubación, todos los pozos se bloquearon con solución reguladora de fosfato-1 por ciento albúmina de suero bovino (Sigma Chemical, St. Louis, MO, EUA), 100 µ/pozo durante 3 horas a temperatura ambiente. La charola se lavó con solución reguladora de fosfato-0.5 por ciento Tween y lisados de DHFRG8, una línea de células murina transfectada con ADN neu de rata (American Type Culture Collection, Rockville, MD, EUA) ; una fuente de proteína neu de rata, se añadieron a filas alternas. La placa se incubó durante la noche a 4°C. La placa se lavó luego con solución reguladora de fosfato-0.5 por ciento Tween y se añadió suero experimental en las siguientes diluciones: 1:25 a 1:200. El suero se diluyó en solución reguladora de fosfato-1 por ciento albúmina de suero bovino-1 por ciento suero bovino fetal 25 µg/mililitro inmunoglobina de ratón-0.01 por ciento NaN3 y luego serialmente en solución reguladora de fosfato-1 por ciento albúmina de suero bovino. Se añadieron 50 µl de suero diluido por pozo y se incubó l hora a temperatura ambiente . Cada suero experimental se añadió a un pozo con neu de rata y un pozo sin neu de rata. Inmunoglobina de oveja anti-rata F(ab')2 peroxidasa de rábano picante (HRP) se añadió a los pozos a una dilución de 1:5000 en solución reguladora-1 por ciento albúmina de suero bovino y se incubó durante 45 minutos a temperatura ambiente (Amersham Co., Arlington Heights, IL, EUA) . Después del lavado final, se añadió el reactivo revelador TMB (Kirkegaard and Perry Laboratories, Gaithersburg, MD) . La reacción de color se leyó a una densidad óptica de 450 nm. La densidad óptica de cada dilución de suero se calculó como la densidad óptica de los pozos cubiertos con neu de rata menos la densidad óptica de los pozos cubiertos con solución reguladora de fosfato-1 por ciento albúmina de suero bovino. Los sueros de animales inmunizados nada más con los adyuvantes y un animal inmunizado con hHNP (proteína extraña) también se evaluaron de una manera similar. Los resultados se muestran en la Figura 3. F. Ensayos de proliferación de células T Para el análisis de las respuestas específicas del polipéptido HER-2 /neu : Se cosecharon células de bazo o de nodulo linfático frescas mediante interrupción mecánica y pasaje a través de una malla de alambre y se lavaron. Se plaquearon 2 x 105 células de bazo/pozo y 1 x 105 células de nodulo linfático/pozo en charolas de microtitulación de fondo redondo de 96 pozos (Corning, Corning, NY) con 6 réplicas por grupo experimental. El medio consistió en EHAA 120 (Biofluidos) con L-glutamina, penicilina/estreptomicina, 2-mercaptoetanol, y 5 por ciento de suero bovino fetal. Las células se incubaron con polipéptidos. Después de 4 días, se pulsaron los pozos con 1 µCi de [3H] timidina durante 6-8 horas y se contaron. Los datos se expresaron como un índice de estimulación (SI) el cual se define como la media de los pozos experimentales divididos por la media de los pozos de control (no antígeno) . Para el análisis de las respuestas específicas de la proteína HER-2/neu: se cultivaron células de bazo o nodulo linfático para 3 estimulaciones in vitro. Al mismo tiempo del análisis 1 x 105 células T de nodulo linfático o de bazo cultivadas se plaquean en charolas de microtitulación de 96 pozos como se describió anteriormente. Las células se incubaron con lµg/mililitro de neu de rata purificada de columna de inmunoafinidad (desde células DHFR-G8 como la fuente de neu de rata) . Después de 4 días, los pozos se pulsaron con 1 µCi de [3H] timidina durante 6-8 horas y se contaron. Los datos se expresaron como un índice de estimulación el cual se define como la media de los pozos experimentales divididos entre la media de los pozos de control (no antígeno) . EJEMPLO 5 Respuestas cebadas a polipéptido HER-2/neu humano se puede detectar en pacientes con cáncer del pecho Se obtuvo sangre heparinizada de un paciente con cáncer de pecho sobreexpresado de HER-2/neu en etapa II. Se separaron células mononucleares de sangre periférica (PBMC) por centrifugación de densidad de Ficoll Hipaque. Las células mononucleares de sangre periférica se plaquearon a una concentración de 2 x 105/pozo en charolas de fondo redondo de 96 pozos (Corning, Corning, NY, EUA) . Se realizaron 24 pozos para cada grupo experimental . Los antígenos consistentes en péptidos derivados HER-2/neu (15-20 aminoácidos en longitud con número de primer aminoácido en la secuencia listado) 25 µg/mililitro, polipéptido HER-2/neu humano (hHNP) 1 µg/mililitro, toxoide tetánico 1 µg/mililitro, y p30 un péptido derivado del tétano 25 µg/miligramo se añadieron a cada replicado de 24 pozos. El ensayo se realizó en medio que contenía 10 por ciento de sueros humanos . La respuesta proliferativa de las células T se midió por la absorción de (3H) timidina (l µCi/pozo) añadido en el día 4 durante 10 horas. Los pozos positivos, los pozos reactivos de antígeno, fueron calificados como positivos si el cpm era mayor que la media y 3 desviaciones estándar de los pozos sin antígeno. Los resultados se muestran en la Figura 4. Este paciente de cáncer del pecho en etapa II tiene una respuesta significativa al hHNP recombinante. De lo anterior será evidente que, aunque se han descrito aquí modalidades específicas de la invención con fines de ilustración, se pueden hacer varias modificaciones sin desviarse del espíritu y alcance de la invención.

Listado de Secuencias (1) INFORMACIÓN GENERAL (i) SOLICITANTE: Universidad de Washington (ii) TITULO DE LA INVENCIÓN: COMPUESTOS PARA OTORGAR O AUMENTAR LA REACTIVIDAD INMUNE A LA PROTEINA HER- 2 / neu PARA LA PREVENCIÓN O TRATAMIENTO DE MALIGNIDADES A LAS CUALES SE ASOCIA EL ONCOGENO HER- 2 / neu (iii) NUMERO DE SECUENCIAS: 4 (iv) DIRECCIÓN DE CORRESPONDENCIA: (A) DIRECCIÓN: SEED and BERRY LLP (B) CALLE: 6300 Columbia Center. 701 Fifth Avenue (C) CIUDAD: Seattle (D) ESTADO: Washington (E) PAÍS: Estados Unidos de Norteamérica (F) CÓDIGO POSTAL: 98104-7092 (v) FORMA LEGIBLE POR COMPUTADORA: (A) TIPO MEDIO: Disco flexible (B) COMPUTADORA: IBM PC compatible (C) SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTWARE: Patentln Reléase #1.0. Versión #1.30 (vi) DATOS DE SOLICITUD ACTUAL: (A) NÚMERO DE SOLICITUD: (B) FECHA DE PRESENTACIÓN: 28-MAR-1996 (C) CLASIFICACIÓN: (viii) INFORMACIÓN ABOGADO/AGENTE (A) NOMBRE: Sharkey, Richard G. (B) NUMERO DE REGISTRO: 32,629 (C) NUMERO DE REFERENCIA/EXPEDIENTE: 920010.448PC (ix) INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIÓN (A) TELEFONO: (206) 622-4900 (B) TELEFAX: (206) 682-6031 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO : 1 (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 3768 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) CADENA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (ix) CARACTERÍSTICAS: (A) NOMBRE/CLAVE : CDS (B) LUGAR: 1..3765 (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:l ATG GAG CTG GCG GCC TTG TGC CGC TGG GGG CTC CTC CTC GCC CTC TTG 48 Met Glu Leu Ala Ala Leu Cys Arg Trp Gly Leu Leu Leu Ala Leu Leu 1 5 10 15 CCC CCC GGA GCC GCG AGC ACC CAÁ GTG TGC ACC GGC ACA GAC ATG AAG 96 Pro Pro Gly Ala Ala Ser Thr Gln Val Cys Thr Gly Thr Asp Met Lys 20 25 30 CTG CGG CTC CCT GCC AGT CCC GAG ACC CAC CTG GAC ATG CTC CGC CAC 144 Leu Arg Leu Pro Ala Ser Pro Glu Thr His Leu Asp Met Leu Arg His 35 40 45 CTC TAC CAG GGC TGC CAG GTG GTG CAG GGA AAC CTG GAA CTC ACC TAC 192 Leu Tyr Gln Gly Cys Gln Val Val Gln Gly Asn Leu Glu Leu Thr Tyr 50 55 60 CTG CCC ACC AAT GCC AGC CTG TCC TTC CTG CAG GAT ATC CAG GAG GTG 240 Leu Pro Thr Asn Ala Ser Leu Ser Phe Leu Gln Asp He Gln Glu Val 65 70 75 80 CAG GGC TAC GTG CTC ATC GCT CAC AAC CAÁ GTG AGG CAG GTC CCA CTG 288 Gln Gly Tyr Val Leu lie Ala His Asn Gln Val Arg Gln Val Pro Leu 85 90 95 CAG AGG CTG CGG Ap GTG CGA GGC ACC CAG CTC TTT GAG GAC AAC TAT 336 Gln Arg Leu Arg He Val Arg Gly Thr Gln Leu Phe Glu Asp Asn Tyr 100 105 110 GCC CTG GCC GTG CTA GAC AAT GGA GAC CCG CTG AAC AAT ACC ACC CCT 384 Ala Leu Ala Val Leu Asp Asn Gly Asp Pro Leu Asn Asn Thr Thr Pro 115 120 125 GTC ACA GGG GCC TCC CCA GGA GGC CTG CGG GAG CTG CAG CTT CGA AGC 432 Val Thr Gly Ala Ser Pro Gly Gly Leu Arg Glu Leu Gln Leu Arg Ser 130 135 140 CTC ACA GAG ATC TTG AAA GGA GGG GTC TTG ATC CAG CGG AAC CCC CAG 480 Leu Thr Glu He Leu Lys Gly Gly Val Leu Ile-Gln Arg Asn Pro Gln 145 150 155 160 CTC TGC TAC CAG GAC ACG ATT TTG TGG AAG GAC ATC TTC CAC AAG AAC 528 Leu Cys Tyr Gln Asp Thr He Leu Trp Lys Asp He Phe His Lys Asn 165 170 175 AAC CAG CTG GCT CTC ACA CTG ATA GAC ACC AAC CGC TCT CGG GCC TGC 576 Asn Gln Leu Ala Leu Thr Leu He Asp Thr Asn Arg Ser Arg Ala Cys 180 185 190 CAC CCC TGT TCT CCG ATG TGT AAG GGC TCC CGC TGC TGG GGA GAG AGT 624 His Pro Cys Ser Pro Met Cys Lys Gly Ser Arg Cys Trp Gly Glu Ser 195 200 205 TCT GAG GAT TGT CAG AGC CTG ACG CGC ACT GTC TGT GCC GGT GGC TGT 672 Ser Glu Asp Cys Gln Ser Leu Thr Arg Thr Val Cys Ala Gly Gly Cys 210 215 220 GCC CGC TGC AAG GGG CCA CTG CCC ACT GAC TGC TGC CAT GAG CAG TGT 720 Ala Arg Cys Lys Gly Pro Leu Pro Thr Asp Cys Cys His Glu Gln Cys 225 230 235 240 GCT GCC GGC TGC ACG GGC CCC AAG CAC TCT GAC TGC CTG GCC TGC CTC 768 Ala Ala Gly Cys Thr Gly Pro Lys His Ser Asp Cys Leu Ala Cys Leu 245 250 255 CAC TTC AAC CAC AGT GGC ATC TGT GAG CTG CAC TGC CCA GCC CTG GTC 816 His Phe Asn His Ser Gly He Cys Glu Leu His Cys Pro Ala Leu Val 260 265 270 ACC TAC AAC ACA GAC ACG TTT GAG TCC ATG CCC AAT CCC GAG GGC CGG 864 Thr Tyr Asn Thr Asp Thr Phe Glu Ser Met Pro Asn Pro Glu Gly Arg 275 280 285 TAT ACA pc GGC GCC AGC TGT GTG ACT GCC TGT CCC TAC AAC TAC CTT 912 Tyr Thr Phe Gly Ala Ser Cys Val Thr Ala Cys Pro Tyr Asn Tyr Leu 290 295 300 TCT ACG GAC GTG GGA TCC TGC ACC CTC GTC TGC CCC CTG CAC AAC CAÁ 960 Ser Thr Asp Val Gly Ser Cys Thr Leu Val Cys Pro Leu His Asn Gln 305 310 315 320 GAG GTG ACA GCA GAG GAT GGA ACA CAG CGG TGT GAG AAG TGC AGC AAG 1008 Glu Val Thr Ala Glu Asp Gly Thr Gln Arg Gys Glu Lys Cys Ser Lys 325 330 335 CCC TGT GCC CGA GTG TGC TAT GGT CTG GGC ATG GAG CAC TTG CGA GAG 1056 Pro Cys Ala Arg Val Cys Tyr Gly Leu Gly Met Glu His Leu Arg Glu 340 345 350 GTG AGG GCA GTT ACC AGT GCC AAT ATC CAG GAG Tp GCT GGC TGC AAG -1104 Val Arg Ala Val Thr Ser Ala Asn He Gln Glu Phe Ala Gly Cys Lys 355 360 365 AAG ATC Tp GGG AGC CTG GCA Tp CTG CCG GAG AGC Tp GAT GGG GAC 1152 Lys He Phe Gly Ser Leu Ala Phe Leu Pro Glu Ser Phe Asp Gly Asp 370 375 380 CCA GCC TCC AAC ACT GCC CCG CTC CAG CCA GAG CAG CTC CAÁ GTG Tp 1200 Pro Ala Ser Asn Thr Ala Pro Leu Gln Pro Glu Gln Leu Gln Val Phe 385 390 395 400 GAG ACT CTG GAA GAG ATC ACA GGT TAC CTA TAC ATC TCA GCA TGG CCG 1248 Glu Thr Leu Glu Glu He Thr Gly Tyr Leu Tyr He Ser Ala Trp Pro 405 410 415 GAC AGC CTG CCT GAC CTC AGC GTC pC CAG AAC CTG CAÁ GTA ATC CGG 1296 Asp Ser Leu Pro Asp Leu Ser Val Phe Gln Asn Leu Gln Val He Arg 420 425 430 GGA CGA Ap CTG CAC AAT GGC GCC TAC TCG CTG ACC CTG CAÁ GGG CTG 1344 Gly Arg He Leu His Asn Gly Ala Tyr Ser Leu Thr Leu Gln Gly Leu 435 440 445 GGC ATC AGC TGG CTG GGG CTG CGC TCA CTG AGG GAA CTG GGC AGT GGA 1392 Gly He Ser Trp Leu Gly Leu Arg Ser Leu Arg Glu Leu Gly Ser Gly 450 455 460 CTG GCC CTC ATC CAC CAT AAC ACC CAC CTC TGC pc GTG CAC ACG GTG 1440 Leu Ala Leu He His His Asn Thr His Leu Cys Phe Val His Thr Val 465 470 475 480 CCC TGG GAC CAG CTC Tp CGG AAC CCG CAC CAÁ GCT CTG CTC CAC ACT 1488 Pro Trp Asp Gln Leu Phe Arg Asn Pro His Gln Ala Leu Leu His Thr 485 490 495 GCC AAC CGG CCA GAG GAC GAG TGT GTG GGC GAG GGC CTG GCC TGC CAC 1536 Ala Asn Arg Pro Glu 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Tyr Met Pro He Trp Lys Phe Pro Asp Glu Glu Gly Ala Cys Gln 610 615 620 CCT TGC CCC ATC AAC TGC ACC CAC TCC TGT GTG GAC CTG GAT GAC AAG 1920 Pro Cys Pro He Asn Cys Thr His Ser Cys Val Asp Leu Asp Asp Lys 625 630 635 640 GGC TGC CCC GCC GAG CAG AGA GCC AGC CCT CTG ACG TCC ATC ATC TCT 1968 Gly Cys Pro Ala Glu Gln Arg Ala Ser Pro Leu Thr Ser He He Ser 645 650 655 GCG GTG Gp GGC Ap CTG CTG GTC GTG GTC pG GGG GTG GTC Tp GGG 2016 Ala Val Val Gly He Leu Leu Val Val Val Leu Gly Val Val Phe Gly 660 665 670 ATC CTC ATC AAG CGA CGG CAG CAG AAG ATC CGG AAG TAC ACG ATG CGG 2064 He Leu He Lys Arg Arg Gln Gln Lys He Arg Lys Tyr Thr Met Arg 675 680 685 AGA CTG CTG CAG GAA ACG GAG CTG GTG GAG CCG.CTG ACA CCT AGC GGA 2112 Arg Leu Leu Gln Glu Thr Glu Leu Val Glu Pro Leu Thr Pro Ser Gly 690 695 700 GCG ATG CCC AAC CAG GCG CAG ATG CGG ATC CTG AAA GAG ACG GAG CTG 2160 Ala Met Pro Asn Gln Ala Gln Met Arg He Leu Lys Glu Thr Glu Leu 705 710 715 720 AGG AAG GTG AAG GTG Cp GGA TCT GGC GCT Tp GGC ACA GTC TAC AAG 2208 Arg Lys Val Lys Val Leu Gly Ser Gly Ala Phe Gly Thr Val Tyr Lys 725 730 735 GGC ATC TGG ATC CCT GAT GGG GAG AAT GTG AAA Ap CCA GTG GCC ATC 2256 Gly He Trp He Pro Asp Gly Glu Asn Val Lys He Pro Val Ala He 740 745 750 AAA GTG pG AGG GAA AAC ACA TCC CCC AAA GCC AAC AAA GAA ATC pA 2304 Lys Val Leu Arg Glu Asn Thr Ser Pro Lys Ala Asn Lys Glu He Leu 755 760 765 GAC GAA GCA TAC GTG ATG GCT GGT GTG GGC TCC CCA TAT GTC TCC CGC 2352 Asp Glu Ala Tyr Val Met Ala Gly Val Gly Ser Pro Tyr Val Ser Arg 770 775 780 Cp CTG GGC ATC TGC CTG ACA TCC ACG GTG CAG CTG GTG ACA CAG Cp 2400 Leu Leu Gly He Cys Leu Thr Ser Thr Val Gln Leu Val Thr Gln Leu 785 790 795 800 ATG CCC TAT GGC TGC CTC pA GAC CAT GTC CGG GAA AAC CGC GGA CGC 2448 Met Pro Tyr Gly Cys Leu Leu Asp His Val Arg Glu Asn Arg Gly Arg 805 810 815 CTG GGC TCC CAG GAC CTG CTG AAC TGG TGT ATG CAG Ap GCC AAG GGG 2496 Leu Gly Ser Gln Asp Leu Leu Asn Trp Cys Met Gln He Ala Lys Gly 820 825 830 ATG AGC TAC CTG GAG GAT GTG CGG CTC GTA CAC AGG GAC pG GCC 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CCC TCT GAA GAG GAG GCC CCC AGG 3216 Gly Asp Leu Thr Leu Gly Leu Glu Pro Ser Glu Glu Glu Ala Pro Arg 1060 1065 1070 TCT CCA CTG GCA CCC TCC GAA GGG GCT GGC TCC GAT GTA Tp GAT GGT 3264 Ser Pro Leu Ala Pro Ser Glu Gly Ala Gly Ser Asp Val Phe Asp Gly 1075 1080 1085 GAC CTG GGA ATG GGG GCA GCC AAG GGG CTG CAÁ AGC CTC CCC ACA CAT 3312 Asp Leu Gly Met Gly Ala Ala Lys Gly Leu Gln Ser Leu Pro Thr His 1090 1095 1100 GAC CCC AGC CCT CTA CAG CGG TAC AGT GAG GAC CCC ACA GTA CCC CTG 3360 Asp Pro Ser Pro Leu Gln Arg Tyr Ser Glu Asp Pro Thr Val Pro Leu 1105 1110 1115 1120 CCC TCT GAG ACT GAT GGC TAC Gp GCC CCC CTG ACC TGC AGC CCC CAG 3408 Pro Ser Glu Thr Asp Gly Tyr Val Ala Pro Leu Thr Cys Ser Pro Gln 1125 1130 1135 CCT GAA TAT GTG AAC CAG CCA GAT Gp CGG CCC CAG CCC CCT TCG CCC 3456 Pro Glu Tyr Val Asn Gln Pro Asp Val Arg Pro Gln Pro Pro Ser Pro 1140 1145 1150 CGA GAG GGC CCT CTG CCT GCT GCC CGA CCT GCT GGT GCC ACT CTG GAA 3504 Arg Glu Gly Pro Leu Pro Ala Ala Arg Pro Ala Gly Ala Thr Leu Glu 1155 1160 1165 AGG CCC AAG ACT CTC TCC CCA GGG AAG AAT GGG GTC GTC AAA GAC Gp 3552 Arg Pro Lys Thr Leu Ser Pro Gly Lys Asn Gly Val Val Lys Asp Val 1170 1175 1180 Tp GCC pr GGG GGT GCC GTG GAG AAC CCC GAG TAC pG ACÁ CCC CAG 3600 Phe Ala Phe Gly Gly Ala Val Glu Asn Pro Glu Tyr Leu Thr Pro Gln 1185 1190 1195 1200 GGA GGA GCT GCC CCT CAG CCC CAC CCT CCT CCT GCC pC AGC CCA GCC 3648 Gly Gly Ala Ala Pro Gln Pro His Pro Pro Pro Ala Phe Ser Pro Ala 1205. 1210 1215 pc GAC AAC CTC TAT TAC TGG GAC CAG GAC CCA CCA GAG CGG GGG GCT 3696 Phe Asp Asn Leu Tyr Tyr Trp Asp Gln Asp Pro Pro Glu Arg Gly Ala 1220 1225 •. 1230 CCA CCC AGC ACC pc AAA GGG ACA CCT ACG GCA GAG AAC CCA GAG TAC 3744 Pro Pro Ser Thr Phe Lys Gly Thr Pro Thr Ala Glu Asn Pro Glu Tyr 1235 1240 1245 CTG GGT CTG GAC GTG CCA GTG TGA 3768 Leu Gly Leu Asp Val Pro Val 1250 1255 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 2 (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 1255 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO : 2 Met Glu Leu Ala Ala Leu Cys Arg Trp Gly Leu Leu Leu Ala Leu Leu 1 5 10 15 Pro Pro Gly Ala Ala Ser Thr Gln Val Cys Thr Gly Thr Asp Met Lys 20 25 30 Leu Arg Leu Pro Ala Ser Pro Glu Thr His Leu Asp Met Leu Arg His 35 40 45 Leu Tyr Gln Gly Cys Gln Val Val Gln Gly Asn Leu Glu Leu Thr Tyr 50 55 60 Leu Pro Thr Asn Ala Ser Leu Ser Phe Leu Gln Asp He Gln Glu Val 65 70 75 80 Gln Gly Tyr Val Leu He Ala His Asn Gln Val Arg Gln Val Pro Leu 85 90 95 Gln Arg Leu Arg He Val Arg Gly Thr Gln Leu Phe Glu Asp Asn Tyr 100 105 110 Ala Leu Ala Val Leu Asp Asn Gly Asp Pro Leu Asn Asn Thr Thr Pro 115 120 125 Val Thr Gly Ala Ser Pro Gly Gly Leu Arg Glu Leu Gln Leu Arg Ser 130 135 140 Leu Thr Glu He Leu Lys Gly Gly Val Leu He Gln Arg Asn Pro Gln 145 150 155 160 Leu Cys Tyr Gln Asp Thr He Leu Trp Lys Asp He Phe His Lys Asn 165 170 175 Asn Gln Leu Ala Leu Thr Leu He Asp Thr Asn Arg Ser Arg Ala Cys 180 185 190 His Pro Cys Ser Pro Met Cys Lys Gly Ser Arg Cys Trp Gly Glu 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Claims (12)

REIVINDICACIONES

1. Un polipéptido codificado por una secuencia de ADN seleccionada de: (a) los nucleótidos 2026 hasta 3765 de la SEQ ID N0:1; y (b) las secuencias de ADN que hibridizan a una secuencia de nucleótido complementaria a los nucleótidos 2026 hasta 3765 de la SEQ ID N0:1 bajo condiciones moderadamente estrictas, en donde la secuencia de ADN codifica un polipéptido que produce una respuesta inmune a la proteína HER-2 /neu .

2 . Un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 2 desde lisina, aminoácido 676, hasta valina, aminoácido 1255, o una variante de la misma que produce cuando menos una respuesta inmune equivalente.

3. Un polipéptido de acuerdo con la reivindicación 2 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 desde el aminoácido 676 hasta el aminoácido 1255.

4. Una composición que comprende un polipéptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1, 2 o 3, en combinación con un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable .

5. Un polipéptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1, 2 o 3, o una composición de acuerdo con la reivindicación 4, para la inmunización de un animal de sangre caliente contra una malignidad a la cual se asocia el oncógeno HER-2/neu.

6. El uso de un polipéptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1, 2 o 3, o una composición de acuerdo con la reivindicación 4, para la fabricación de un medicamento para la inmunización de un animal de sangre caliente contra una malignidad a la cual se asocia el oncógeno HER-2 / neu .

7. Una molécula de ácido nucleico que dirige la expresión de un polipéptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1, 2 o 3 para la inmunización mediante la transfección de células de un animal de sangre caliente con la molécula de ácido nucleico.

8. Una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 7 en donde las células se transfectan ex vivo y posteriormente se administran al animal.

9. El uso de una molécula de ácido nucleico que dirige la expresión de un polipéptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1, 2 o 3, para la fabricación de un medicamento para la inmunización de un animal de sangre caliente contra una malignidad a la cual se asocia el oncógeno HER-2/neu.

10. Un vector viral que dirige la expresión de un polipéptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones l, 2 o 3 para la inmunización infectando las células de un animal de sangre caliente con el vector.

11. Un vector viral de acuerdo con la reivindicación 10 en donde las células se infectan ex vivo y posteriormente se administran al animal.

12. El uso de un vector viral que dirige la expresión de un polipéptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1, 2 o 3, para la fabricación de un medicamento para la inmunización de un animal de sangre caliente contra una malignidad a la cual se asocia el oncógeno HER-2 /neu .