KR101379364B1 - 암 치료를 위한 ｍｄａ-7을 포함하는 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 MDA-7 단백질 또는 MDA-7 암호화 핵산과 함께 1) 셀레콕시브와 같은 COX-2 억제제, 2) 겔다나마이신 또는 겔다나마이신 유도체 또는 유사체와 같은 Hsp90 억제제, 3) 암 치료용 비타민 E 화합물, 4) TNF-알파와 같은 TNF, 5) VEGF 억제제 또는 6) IL-10의 억제제를 포함하는 방법 및 조성물에 관한 것이다.
MDA-7 단백질, COX-2 억제제, Hsp90 억제제, 비타민 E 화합물, TNF, VEGF 억제제, IL-10 억제제, 병용 요법, 암 치료

Description

암 치료를 위한 ＭＤＡ-7을 포함하는 조성물{Compositions involving MDA-7 for the treatment of cancer}
발명의 배경
본원은 미국 가출원 번호 제60/650,807호 (출원일: 2005.2.8.), 제60/661,679호 (출원일: 2005.3.14.), 제60/676,096호 (출원일: 2005.4.29.) 및 제60/749,372호 (출원일: 2005.12.12.)와 연관되며, 각각의 가출원은 이의 전문이 본원에 참조로 인용된다.
국립보건원으로부터의 허가 번호 CA16672, CA78778 및 CA102716에 따라 정부도 본 발명에 대해 권리를 가질 수 있다.
본 발명은 일반적으로 분자생물학 및 종양학 분야와 관련된다. 보다 특히, 본 발명은 종양 억제제, 예를 들어 MDA-7, 및 하나 이상의 COX-2 억제제를 수반하는, 암 치료를 위한 방법 및 조성물에 관한 것이다. 이러한 치료의 병용은 각각의 성분 단독보다 효과적이며, 그 효과가 이들의 예상된 부가적 효과보다 크다. 또 다른 양태로서, 본 발명은 종양 억제제, 예를 들어 MDA-7, 및 Hsp90 억제제, 예를 들어 겔다나마이신 및 이의 유사체 및 유도체로 암을 치료하기 위한 방법 및 조성물에 관한 것이다. 추가의 양태로서, 본 발명은 MDA-7 및 비타민 E 화합물을 수반하는, 암을 치료하기 위한 방법 및 조성물에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 종양 억제제, 예를 들어 MDA-7, 및 TNF (tumor necrosis factor: 종양괴사인자)를 수반하는, 암을 치료하기 위한 방법 및 조성물에 관한 것이다. 또 다른 추가의 양태로서, 본 발명은 MDA-7 및 VEGF 억제제를 수반하는, 암을 치료하기 위한 방법 및 조성물에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 MDA-7 및 IL-10 억제제를 수반하는, 암을 치료하기 위한 방법 및 조성물에 관한 것이다.
1. MDA-7
흑색종 분화-관련 유전자 7(melanoma differentiation-associated gene 7: MDA-7)은 24kDa 단백질을 암호화하며, 정상 세포에는 해를 입히지 않으면서 암세포에서 선택적으로 세포 사멸 및 아폽토시스를 유발하는 최근에 기술된 종양 억제제 유전자이다 [참조: Mhashilkar et al., 2001; Mhashilkar et al., 2003; Pataer et al., 2002].
MDA-7의 아데노바이러스 과발현은 결장직장암 [참조: Sarkar et al., 2002], 유방암 [참조: Mhashilkar et al., 2003], 전립선암 [참조: Mhashilkar et al., 2001], 및 폐암 [참조: Chada et al., 2004]을 포함한 다양한 종양 유형에서 종양 선택적 성장 억제를 유발하고 아폽토시스를 유발한다.
최근에, mda-7의 아데노바이러스 매개되는 전달 (Ad-mda7) 및 트라스투주마브의 병용이 HER-2/neu (c-erbB2)-과발현 유방암세포에서 Akt 및 β-카테닌의 포스포릴화를 감소시킴으로써 항-종양 활성을 증가시킨다는 것이 밝혀졌다 [참조: McKenzie et al., 2004].
또한, mda-7의 아데노바이러스-매개된 과발현이 사람 폐암세포에서 다른 PKR 표적 기질인 eIF-2alpha의 후속적인 포스포릴화와 함께 PKR의 신속한 유발 및 아폽토시스 유발을 이끈다는 것이 입증되었다 [참조: Pataer et al., 2002].
PKR은 인터페론 유도되고 이본쇄 RNA 활성화되는 단백질 키나제이다. 인터페론 (IFN)의 항바이러스 및 항증식 효과를 매개하는데 있어서 PKR의 기능이 잘 특징분석되었지만, 이는 또한 전사 조절, 세포 분화, 시그널 전달 및 종양 억제에도 관련된다 [참조: Taylor et al., 1999]. PKR이 아폽토시스, 세포-증식, 시그널 전달 및 분화에 관여한다는 것이 분명하다 [참조: Williams, 2001; Barber, 2001; Jagus et al., 1999]. 또한, PKR은 열 쇼크 단백질 90 (heat shock protein 90: Hsp90) 분자 샤페론 복합체에 의해 조절되는 것으로 밝혀졌다 [참조: Donze et al., 2001]. Hsp90 및 이의 공동-샤페론 p23은 N-말단 이본쇄 (ds) RNA 결합 영역뿐만 아니라 이의 키나제 도메인을 통해서 PKR에 결합한다 [참조: Donze et al, 2001]. dsRNA 및 겔다나마이신 (이하, GA로도 불림) 모두 성숙한 PKR로부터 Hsp90 및 p23의 신속한 분리를 유발하고; 생체내 및 시험관내 모두에서 PKR을 활성화시킨다 [참조: Donze et al., 2001]. Hsp90은 환경적 스트레스에 노출되는 세포에서 단백질의 재접힘 및 수개의 주요 조절 단백질의 구조적 성숙에 필요한 샤페론이다 [참조: Maloney and Workman, 2002].
2. NSAID
아스피린 및 일부 다른 비-스테로이드성 소염제 (non-steroidal anti-inflammatory drug: NSAID)가 결장직장암에 대해 화학적 보호작용을 발휘하고 위암, 식도암 [참조: Thun et al., 1991] 및 심지어 방광암 [참조: Earnest et al., 1992]에도 작용할 수 있음을 제시하는 실험적 및 역학적 자료가 증가하고 있다. 아스피린, 이부프로펜, 피록시캄 [참조: Reddy et al., 1990; Singh et al., 1994), 인도메타신 [참조: Narisawa, 1981], 및 술린닥 [참조: Piazza et al., 1997; Rao et al., 1995]이 AOM-처리된 래트 모델에서 결장 발암을 효과적으로 억제하고, 플루르비프로펜은 APC(Min)+마우스 모델에서 항-종양 효과를 입증하였다 [참조: Wechter et al., 1997]. 또한, NSAID는 활성화된 Ki-ras를 함유하는 종양의 발달을 억제한다 [참조: Singh and Reddy, 1995].
NSAID는 종양 세포에서 아폽토시스의 유발을 통해 발암을 억제하는 것으로 보인다 [참조: Bedi et al., 1995; Lupulescu, 1996; Piazza et al., 1995; Piazza et al., 1997b]. 많은 연구들은 아폽토시스의 유발을 포함한 NSAID의 화학적 보호 특성이 프로스타글란딘 합성을 억제하는 이들의 능력에 따른 기능임을 제시한다 [참조: DuBois et al., 1996; Lupulescu, 1996; Vane and Botting, 1997]. 이는 염증촉진성 프로스타글란딘의 합성을 억제하는 사이클로옥시게나제 (COX) 활성의 억제에 의해 발휘될 수 있는 것으로 추측된다 [참조: Hinz et al., 1999]. 역학적 및 실험실 연구에 의해, 결장암이 적어도 부분적으로 COX 이소자임 (COX-1 및 COX-2)의 프로스타글란딘 생성의 조절을 통해 매개되는 것으로 제시된다 [참조: Kawamori et al., 1998]. 그러나, 최근 조사에서는, NSAID가 프로스타글란딘-의존적 및 -독립적 기작 모두를 통해 발암을 억제할 수 있다고 보고된다 [참조: Alberts et al., 1995; Piazza et al., 1997a; Thompson et al., 1995; Hanif, 1996]. NSAID 술린닥의 대사산물인 술린닥 술폰은 COX-억제 활성이 결여되어 있으나 종양 세포에서 아폽토시스를 유발하고 [참조: Piazza et al., 1995; Piazza et al., 1997b] 수개의 발암 설치류 모델에서 종양 발달을 억제한다 [참조: Thompson et al., 1995; Piazza et al., 1995, 1997a]. 술린닥 활성의 잠정적 기작은, 다른 NSAID 제제의 COX 억제 보다는, 타이로신 키나제의 직접적 또는 간접적 억제일 수 있다고 가정된다 [참조: Winde et al., 1998].
수개의 NSAID가 사람에서 임상 실험으로 이들의 효과에 대해 시험되었다. 이부프로펜의 제IIa기 실험(1개월)이 완결되었으며, 300 mg/day의 용량에서도 편평 점막에서의 프로스타글란딘 E2 (PGE2) 수준에 상당한 감소가 나타났다. 300 mg의 용량의 이부프로펜은 매우 낮은 것이며 (치료 용량 범위는 1200-3000 mg/day 이상이다), 독성은 장기간에 걸쳐서도 나타날 것 같지 않다. 그러나, 동물 화학적 보호 모델에서, 이부프로펜은 다른 NSAID보다 덜 효과적이다. 결장암의 발생에 있어 NSAID인 아스피린의 유리한 효과가 제시되었으며, 효과는 단지 매주 1000 mg 이상의 총 용량에서만 분명하였다 [참조: Giovannucci et al., 1994]. 그러나, 3개의 커다란 그룹의 연구들이 아스피린의 유리한 효과에 대해 상충되는 보고를 하고 있다 [참조: Gann et al., 1993; Giovannucci et al., 1996; Greenberg et al., 1993]. 최근에, 일 그룹의 연구자는 80 내지 160 mg/day의 용량으로 PGE2α가 감소될 수 있다고 밝혔다. 이와는 반대로, 또 다른 그룹의 연구자는, 비록 상부 위장 점막에서 프로스타글란딘의 실질적인 소양이 입증되었지만, 이러한 용량의 아스피린에서는 결장 점막 프로스타글란딘에 대한 상기한 효과가 없다고 밝혔다. 이들 연구 결과는 80mg의 아스피린 용량이 결장 점막에 대한 상기 제제의 효과에 대한 역치임을 지적한다. 따라서, 아스피린은 장기간의 아스피린 사용 시 심각한 뇌혈관 및 위장 부작용에 대한 상당한 위험과 관련된 이의 효능에 대한 문제가 있어 일반적 집단에서는 결직장암의 1차적 화학보호에 대해서는 통상적으로 권장되지 않는다 [참조: Singh, 1998].
NSAID 피록시캄은, 비록 최근의 제IIb기 실험에서 부작용이 입증되었지만, 동물 모델에서 가장 효과적인 화학적 보호제이다 [참조: Pollard and Luckert, 1989; Reddy et al., 1987; Ritland and Gendler, 1999]. 또한, NSAID의 부작용에 대한 거대 메타-분석에서는, 피록시캄이 다른 NSAID 보다 더 부작용을 갖는다는 것을 나타낸다 [참조: Lanza et al., 1995]. 또한, 하나 이상의 연구에서, 상부 위장관의 종양이 피록시캄 처리에 민감한 반면, 십이지장 및 결장의 종양에서는 상대적으로 저항적이라고 제시하였다 [참조: Ritland and Gendler, 1999]. 술린닥은 FAP (Familial Adenomatous Polyposis) 환자에서 선종을 퇴화시키는 것으로 밝혀졌으며 [참조: Muscat et al, 1994], 산발 선종에서의 하나 이상의 연구가 이러한 효과가 없다고 밝히기는 하였다 [참조: Ladenheim et al., 1995].
새로운 분자 기술의 신속한 발달 및 사람 게놈 프로젝트의 완성에 힘입어, 암의 신호전달 경로에 대한 새로운 치료적 표적물들이 개발되고 있다. 최근에 합리적으로 고안된 약물은 셀레콕시브 (선택적 COX-2 억제제)이며, 이는 소염제로서 [참조: Garner et al., 2002] 및 화학적보호 세팅에서 [참조: Kismet et al., 2004] 활성을 갖는 것으로 밝혀졌었다. 사이클로옥시게나제 2 (이전에는 프로스타글란딘 엔도퍼옥사이드 H 신타제로 불림)는 2가지 이소형태의 사이클로옥시게나제 중의 하나이다. 항상성으로 발현되는 사이클로옥시게나제 1과는 달리, COX-2는 유도성 효소이며 결장암, 유방암, 폐암 및 위암을 포함한 많은 종양 유형에서 고도로 증가된 발현을 보이며, 이는 발암에서 COX-2의 원인적 역할을 제시한다 [참조: Koehne and Dubois, 2004; Howe et al., 2001]. 최근에, 셀레콕시브는 생존촉진성 (prosurvival) 신호전달 키나제인 단백질 키나제 B (PKB)/Akt를 하향-조절함으로써 유방암을 포함한 다수의 암에서 성장 저지를 촉진하고 아폽토시스를 유발하는 것으로 밝혀졌다 [참조: Basu et al., 2004; Kulp et al., 2004; El-Rayes et al., 2004; Leng et al., 2003].
HER-2/neu 과발현은 공격적이고 침습적인 유방암의 특징이다 [참조: Ross et al., 2003]. 또한, 최근의 연구에서는 COX-2 과다발현이 공격적인 유방암에 대한 예후적 마커일 수 있으며, 저조한 생존과 관련되는 것으로 보인다고 제시하였다 [참조: Denkert et al., 2004]. 높은 수준의 COX-2가 HER-2/neu 양성 종양에서 나타나며, 이들 마커들 사이에 양성 피드백 루프가 존재한다고 제안되었다 [참조: Benoit et al., 2004]. COX-2 발현은 HER-2/neu 유전자의 전사를 증가시키며, COX-2의 억제는 HER-2/neu twns을 감소시킨다. HER-2/neu의 증가된 발현은 포스파티딜이노시톨 3-키나제 (PI3K)를 통해 Akt/단백질 키나제 B (PKB)로 항상성 신호전달을 형성한다 [참조: Le et al., 2005]. 이들 세린/트레오닌 키나제의 활성화로 세포가 증식하고 생존 신호전달을 형성한다 [참조: Craven et al., 2003]. Ad-mda7이 유방암 세포에서 Akt 생존 경로를 네가티브 조절한다는 것이 이전에 밝혀진 바 있다 [참조: McKenzie et al., 2004].
3. Hsp90 억제제
겔다나마이신 (GA) 및 17-알릴-아미노-겔다나마이신 (17AAG)는 Hsp90의 NH2-말단부에 있는 ATP-결합 부위에 특이적으로 결합할 수 있으며, 이의 작용을 억제한다. Hsp90 기능의 억제로 스테로이드 수용체인 HER2를 포함한 이의 클라이언트 (client) 단백질 및 Raf, PDK1, Akt 및 cdk4 키나제가 분해된다 [참조: Sausville et al., 2003]. 이와는 반대로, 이전 연구에서는 GA가 성숙한 PKR로부터 Hsp90 및 p23의 신속한 분해를 유발하고 생체내 및 시험관내에서 PKR을 활성화시킬 수 있다고 밝혔다 [참조: Donze et al., 2001]. 겔다나마이신 (GA)는 상당한 항암 특성을 갖는 천연 발생의 아나사마이신 항생제이다. 17-알릴아미노, 17-데메톡시겔다나마이신 (17AAG) (겔다나마이신 유도체)는 예비임상적 모델에서 우수한 활성 및 암 선택성을 보였으며, 현재 고무적인 초기 결과와 함께 암 환자에서 제I, 제II 임상 실험이 진행중이다 [참조: Kamal et al., 2003]. 17AAG와 예리한 조사의 병용 요법은 사람 전립선암에서 초부가적인 성장 억제를 갖는다 [참조: Enmon et al., 2003]. 낮은 수준의 17AAG를 사용하는 병용 요법이 HER2-과발현 유방암 세포주에서 탁솔 및 독소루비신의 효과를 향상시키는 것으로 밝혀졌다 [참조: Solit et al., 2003]. 이전의 연구들은 유방암 세포에서 PI3K/AKT 경로의 17AAG 파괴를 연루시켰으며, AKT의 하향-조절은 부티레이트-유도된 아폽토시스에 대한 결장 종양 세포의 향상된 민감성과 관련되었다 [참조: Rahmani et al., 2003].
4. 비타민 E 화합물
비타민 E 숙시네이트 (VES)의 항종양 활성을 기술하는 연구들이 발표되었다 [참조: Prasad et al., 1982]. 최근 연구들에 의해 복강내로 투여되는 VES가 동물 이종이식 및 동종이식 모델에서 항종양 활성을 갖는다는 것이 밝혀졌다 [참조: Malafa et al., 2000; Malafa et al., 2002]. VES가 DNA 합성을 차단하고 세포 분화를 유도하며 아폽토시스를 유발함으로써 암세포 성장의 농도- 및 시간-의존적 억제를 유발한다고 밝혀졌다 [참조: Kline et al., 1998; Kline et al., 2001; Neuzil et al., 2001; You et al, 2001; You et al., 2002; Yu et al., 2001].
5. 암
모든 남성의 거의 절반 및 모든 여성의 1/3 이상이 이들의 생존 시 암에 걸린다. 백만명 이상의 사람들이 매년 암으로 진단된다. 암의 사망률이 일반적으로 감소하기는 하나, 매년 많은 사람들이 일부 형태의 암 때문에 계속적으로 사망하고 있다. 폐암, 결장/직장암, 전립선암 및 유방암이 가장 많은 사망을 초래하는 암이다.
여성들의 건강을 위협하는 다양한 암중에서, 유방암은 아메리카 여성 중 암-관련된 사망에 대한 두번째의 빈발 원인이다. 여성에서 보고되는 모든 암 사망중 약 15%가 유방암 때문이며, 이의 발생은 폐암에 비해 단지 약간 처진다 [참조: Jel et al., 2002]. 또한, 유방암은 전 세계를 통해 대부분의 개발국 및 개발도상국에서 암 사망률의 선두적 원인 중의 하나이다 [참조: Pisani et al., 1999]. 새로운 약물의 개발 및 치료 양식의 개발을 통해 상당한 진전이 이루어졌지만, 치료-관련된 독성을 감소시키면서 치료 결과를 개선해야 할 긴박한 필요가 여전히 존재한다 [참조: Peto et al., 2000]. 이는 다른 암에 대해서도 마찬가지이다.
본 발명은 암에 대한 새롭고도 개선된 치료에 대한 필요성에 부응한다.
발명의 요지
본 발명은 일반적으로 MDA-7을 하나 이상의 부가적 치료제와 병용하여 암을 치료하기 위한 방법 및 조성물을 제공한다. 부가적 치료제는 COX-2 억제제, Hsp90 억제제, 비타민 E 화합물, TNF, VEGF 억제제 또는 IL-10 억제제를 포함한다.
일부 양태에서, 본 발명은 MDA-7과 COX-2 억제제를 병용하여 암을 치료하기 위한 방법 및 조성물을 제공한다. 또한, 본 발명은 MDA-7과 Hsp90 억제제를 병용하여 암을 치료하기 위한 방법 및 조성물을 제공한다. 추가의 양태에서, 본 발명은 MDA-7과 비타민 E 화합물을 병용하여 암을 치료하기 위한 방법 및 조성물을 제공한다. 또 다른 추가의 양태에서, 본 발명은 MDA-7과 종양괴사인자 (TNF)를 병용하여 암을 치료하기 위한 방법 및 조성물을 제공한다. 또한, 본 발명은 MDA-7과 혈관내피성장인자 (VEGF)를 병용하여 암을 치료하기 위한 방법 및 조성물을 제공한다. 추가의 양태에서, 본 발명은 MDA-7과 IL-10 억제제를 병용하여 암을 치료하기 위한 방법 및 조성물을 제공한다.
본 발명의 방법은 구체적으로 MDA-7을 i) COX-2 억제제, ii) Hsp90 억제제; iii) 비타민 E 화합물; iv) TNF; v) VEGF 억제제; vi) IL-10 억제제; 또는 vii) 상기 i), ii), iii), iv), v) 및 vi) 중 하나 이상 병용하여 환자에게 제공함을 포함하는 암 환자의 치료 방법을 포함한다. 이들 화합물 i), ii), iii), iv), v) 또는 vi)이 MDA-7과 관련해서 사용되는 경우, 이들은 총체적으로 "MDA-7 병용제 (conjunctive agent)"라 불릴 수 있으며, MDA-7과 i), ii), iii), iv), v) 또는 vi)의 어떠한 병용 요법이라도 "MDA-7 병용 요법"이라 불릴 수 있다. 제공되는 양은 특정 양태에서 "유효량"으로 간주될 수 있다.
특정 양태에서, MDA-7은 이를 암호화하는 발현 작제물을 세포에 투여하여 이 세포에서 MDA-7을 발현시킴으로써 세포에 제공된다. 특정 양태에서, 발현 작제물은 바이러스 벡터이다. 추가의 양태에서, 바이러스 벡터는 MDA-7을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 아데노바이러스 벡터이다.
일부 양태에서, MDA-7 핵산 조성물은 하나 이상의 지질을 포함한다. 예를 들어, 조성물은 DOTAP 및 콜레스테롤, 또는 이의 유도체를 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 소염제가 MDA-7을 투여하기 전, 동안 또는 후에 투여될 수 있다.
MDA-7은 정제된 MDA-7 단백질을 포함하는 조성물을 환자에게 투여함으로써 환자에게 제공될 수 있다. 특정 양태에서, 이 방법은 환자에게 방사선요법, 화학요법 및/또는 예비악성 또는 악성 병소의 수술적 절제를 수행하는 것을 포함한다.
특정 양태에서, 본 발명은 유방암 세포에 MDA-7 및 MDA-7 병용제를 제공함으 로써 유방암 세포를 치료하는 방법 및 조성물에 관한 것이다. 특정 양태에서, MDA-7 병용제는 상기 세포에 대한 COX-2 억제제이다.
일부 양태는 암세포에 MDA-7 및 MDA-7 병용제를 제공함을 포함하여 환자에서 암세포를 방사선감작화시키는 방법에 관한 것이다. 용어 "방사선감작화"는 세포가 방사선의 해로운 효과에 보다 민감하게 되는 것을 의미한다.
용어 "유효량"은 환자에게 1) MDA-7과 2) i) COX-2 억제제, ii) Hsp90 억제제, iii) 비타민 E 화합물, iv) TNF, v) VEGF 억제제, 또는 vi) IL-10 억제제 또는 MDA-7 치료와 함께 사용되는 다른 제제 모두가 치료학적으로 유리하게 하는 양으로 제공되는 것을 의미한다. 환자에게는, 치료학적으로 유리하다고 믿어지는, 소정량이 MDA-7 및 소정량의 i) COX-2 억제제, ii) Hsp90 억제제, iii) 비타민 E 화합물, iv) TNF, v) VEGF 억제제, 또는 vi) IL-10 억제제가 제공된다. 2개의 상이한 화합물이 MDA-7과 함께 제공되는 양태에서, 예를 들어 비타민 E 화합물들의 병용 또는 비타민 E 화합물과 COX-2 억제제의 병용이 MDA-7과 함께 제공되는 양태에서, 용어 "유효량"은, 환자에게 제공되는 물질들의 배합물의 양으로부터 치료학적 이점이 제공되는 양이 환자에게 제공되는 것을 의미한다.
특정 양태에서, 조성물은 MDA-7 폴리펩타이드 및 또 다른 항암제, 예를 들어 COX-2 억제제, Hsp90 억제제, 비타민 E 화합물, 또는 다른 MDA-7 병용제, 예를 들어 VEGF 억제제, TNF, 또는 IL-10 억제제를 포함한다. 따라서, 본 발명의 일부 방법에서, 환자에게 정제된 MDA-7 단백질을 포함하는 조성물이 제공된다. 용어 "정제된"은 MDA-7 단백질이 다른 단백질이 없도록 이전에 분리되었으며, 이 단백질이 조성물로 제형화되기 전에 약 95% 이상 순수하다는 것을 의미한다. 특정 양태에서, 정제된 MDA-7 단백질은 약 또는 적어도 약 95, 96, 97, 98, 99, 99.1, 99.2, 99.3, 99.4, 99.5% 이상, 또는 이 범위로부터 유도가능한 임의의 범위에서 순수하다. 또한, 정제된 MDA-7 단백질은 활성이며, 이는 아폽토시스를 유도할 수 있다는 것을 의미한다. 또한, 정제된 MDA-7 단백질은, 활성 측면에서, 등량의 정제되지 않은 MDA-7 (예를 들어 재조합적 수단에 의해 제조된 MDA-7)의 활성 (아폽토시스 활성을 측정)에 대해 약, 적어도 약, 또는 기껏해야 약 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95% 이상 (또는 이로부터 유도될 수 있는 임의의 범위) 활성이도록 정량화될 수 있다.
다른 양태에서, 이는 환자 또는 환자의 세포에서 MDA-7 폴리펩타이드에 대해 COX-2 억제제, Hsp90 억제제, 비타민 E, VEGF 억제제, TNF 폴리펩타이드 또는 IL-10 억제제를 이끌 수 있는 화합물을 포함한다.
환자는 치료를 받는 암을 갖는 임의의 동물이다. 본 발명의 많은 양태에서, 환자는 포유동물, 구체적으로 사람이다.
암은 임의 유형의 암일 수 있다. 예를 들어, 암은 흑색종, 비소세포폐암, 소세포폐암, 폐암, 간암종, 망막모세포종, 성상세포종, 아교모세포종, 치은암, 설암, 백혈병, 신경모세포종, 두부암 (head), 경부암 (neck), 유방암, 췌장암, 전립선암, 신장암, 골암, 고환암, 난소암, 중피종, 자궁경부암 (cervical), 위장암, 림프종, 뇌종양 (brain), 결장암, 또는 방광암일 수 있다. 특정 양태에서, 암은 상피암세포를 포함한다. 특정 양태에서, 암을 유방암, 폐암, 또는 전립선암이다.
피험자는 관련 예방 제제가 투여될 때 특정 질환 또는 건강-관련된 증상이 없는 것으로 공지되거나 의심되는 대상일 수 있다. 예를 들어, 대상은 공지된 질환 또는 건강-관련된 증상이 없는 대상 (즉, 건강한 대상)일 수 있다. 일부 양태에서, 대상은 특정 질환 또는 건강-관련된 증상이 발병될 위험이 있는 대상이다. 예를 들어, 대상은 과거에 치료되었던 암이 있는 병력이 있어 암의 재발 위험성이 있는 대상일 수 있다. 이러한 대상은 유전적 소인 때문에 또는 과거 화학요법의 결과로서 암의 재발 위험에 있는 대상일 수 있다. 달리, 대상은 현재 질병은 없으나 제2의 원발성 종양이 발병될 위험이 있는, 성공적으로 치료된 암의 병력을 갖는 대상일 수 있다. 예를 들어, 이러한 위험은 제1의 원발성 종양의 치료로서 적용되었던 과거의 방사선요법 또는 화학요법의 결과일 수 있다. 일부 양태에서, 대상은 제2의 질환 또는 건강-관련된 증상의 발병의 위험이 있는 제1의 질병 또는 건강-관련된 증상을 갖는 대상일 수 있다.
용어 "치료" 및 "치료하는"은 질환 또는 건강-관련된 증상에 대해 치료학적으로 유익할 목적으로 대상에게 제제, 약물 또는 의약품을 투여 또는 적용하거나 대상에 대해 절차 또는 방식을 수행하는 것을 지칭한다.
용어 "질환" 또는 "건강-관련된 증상"은 임의의 원인, 예를 들어 감염, 유전적 결함 및/또는 환경적 스트레스로부터 발생하는 신체, 기관 또는 시스템의 병리학적 상태일 수 있다. 원인은 공지되거나 그렇지 않을 수 있다. 이러한 상태의 예는, 이로 제한됨이 없이. 예비악성 상태, 형성 이상, 암 및 기타 과증식 질환을 포함한다. 예를 들어 암은 통상의 치료 요법 및 표준 치료에 대해 내성인 것으로 공지되거나 의심되는 암 또는 재발성 암일 수 있다.
본원에 걸쳐 사용되는 용어 "치료학적 이점'은, 이로 제한됨이 없이, 예비-암, 형성 이상, 암 및 기타 과증식 질환의 치료를 포함하는 증상의 의학적 치료에 대해 대상의 안녕을 촉진하거나 증진시키는 임의의 것을 지칭한다. 치료학적 이점에 대한 일부의 예는, 대상의 삶의 임의 기간까지의 연장, 질환에 대한 종양 발병의 감소 또는 지연, 과증식의 감소, 종양 성장의 감소, 전이의 지연 또는 전이수의 감소, 암세포 또는 종양세포 증식률의 감소, 예비악성 증상으로부터 종양 발병으로의 전개의 감소 또는 지연, 및 대상의 상태에 기인될 수 있는 대상에 대한 통증의 감소를 포함한다.
용어 "예방" 및 "예방하는"은 통상적인 그대로의 의미에 따라 "전에 작용하는" 또는 그러한 작용을 의미하도록 사용된다. 특정 질환 또는 건강-관련된 증상과 관련하여, 이들 용어는 질환 또는 건강-관련 증상의 발작을 차단할 목적으로 대상에게 제제, 약물 또는 의약품을 투여 또는 적용하거나 대상에 대해 절차 또는 방식을 수행하는 것을 지칭한다. 본 발명의 특정 양태에서, 본 방법은 대상에 질환 또는 건강-관련된 증상을 예방하기 위해 MDA-7 단백질 또는 MDA-7 단백질을 암호화하는 핵산을 전달하는 것을 포함한다. 질환 또는 증상을 예방하기에 적합한 약제학적 조성물의 양은 질환 또는 건강-관련된 증상의 발작을 차단하는 것으로 공지되거나 여겨지는 양이다. 본 발명은 MDA-7이 하나 이상의 다른 제제, 예를 들어 COX-2 억제제 또는 다른 MDA-7 병용제에 추가하여 대상에게 제공될 수 있다는 것을 고찰한다.
본 발명의 추가의 양태에서, 치료가 필요한 환자를 확인하는 방법을 포함한다. 예를 들어 환자의 병력을 취하거나 환자가 암 또는 종양을 갖는 지의 여부를 결정하기 위해 수행되는 하나 이상의 시험을 수행하거나, 환자를 수술하거나, 생검을 취하는 것에 기초하여 환자를 확인할 수 있다.
따라서, 일부 양태에서, 환자에서 발현되는 MDA-7 폴리펩타이드를 암호화하는 서열을 갖는 핵산을 포함하는 조성물을 환자에게 투여함으로써 MDA-7이 환자에게 제공된다. MDA-7 암호화 핵산 서열이 환자에서 발현을 제공할 수 있는 프로모터의 조절하에 있다는 것이 고찰된다. 프로모터는 항상성이거나, 조직-특이적이거나, 유도성일 수 있다. 특정 양태에서, 프로모터는 CMV IE 프로모터이다. 추가의 양태에서, 인핸서가 포함된다. 발현 작제물을 포함한 벡터는 환자에서 MDA-7을 제공하도록 본 발명의 방법에 사용될 수 있다. 특정 양태에서, 벡터는 바이러스 벡터이다. 바이러스 벡터가 사용되는 경우, 일부 양태에서, 벡터는 프로타민과 함께 제형화된다. 특정 양태에서, 벡터는 하나 이상의 지질과 함께 제형화된다. 일부 양태에서, 지질 제형물은 DOTAP:콜레스테롤 (또는 이의 유도체) (DOTAP:chol) 제형물이다.
환자에게 투여되는 조성물이 약제학적으로 허용되는 제형물에 포함된다는 것이 고찰된다.
사용될 수 있는 바이러스 벡터는 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스, 헤르페스바이러스, 렌티바이러스, 레트로바이러스, 및 백시니아 바이러스이다. 특정 양태에서, 벡터는 복제-결여될 수 있는 아데노바이러스 벡터이다. 이러한 경우, 투여당 (환자/투여) 또는 하루당 (평균적인 1일 용량) 약 109 내지 약 1013개의 바이러스 입자 (cp) 또는 플라크 형성 단위 (pfu)가 투여되는 것이 고찰된다. 이러한 용량은, 투여당, 하루당 또는 치료 주기당 제공되는 양일 수 있는, 약, 적어도 약, 기껏해야 약 109, 1010, 1011, 1012, 또는 1013 vp 또는 pfu (또는 이로부터 유도가능한 임의의 범위)를 포함한다.
사실, 본 발명의 양태는 MDA-7과 COX-2 억제제의 병용이 암세포에서 아폽토시스를 촉진하는 것과 관련해 상승작용적 치료 효과를 제공한다는 것을 기술한다. 또한, 본 발명의 양태는 MDA-7과 TNF-알파의 병용이 종양 세포 증식의 억제하는 것과 관련해 상승작용적 치료 효과를 제공하는 것을 기술한다. 본 발명의 다른 양태에서, 본 발명은 암세포에서 아폽토시스를 촉진하는 것과 관련된 상승작용적 치료 효과를 제공하는 MDA-7과 Hsp90 억제제의 병용에 관한 것이다. 본 발명의 추가의 양태는 MDA-7과 하나 이상의 비타민 E 화합물의 병용이 암세포의 억제를 촉진하는 것과 관련해 상승작용적 치료 효과를 제공한다는 것을 기술한다. 본 발명의 추가의 양태는 MDA-7과 VEGF 억제제의 병용이 종양 성장을 억제하는 것과 관련해 상승작용적 치료 효과를 제공하는 것을 기술한다. 본 발명의 양태는 MDA-7과 TNF 폴리펩타이드의 병용이 암 치료와 관련해 상승작용적 치료 효과를 제공한다는 것을 기술한다. 또한, 일부 양태에서, MDA-7과 IL-10 억제제의 배합물은 암 치료와 관련해 상승작용적 치료 효과를 제공한다. 용어 "상승작용적"은 치료 효과가 단독치료로서 제공되는 각각의 제제의 효과를 더하는 것에 기초하여 예상되는 효과보다 크다는 것을 나타낸다.
본 발명의 방법으로 MDA-7과 COX-2 억제제 모두가 환자에게 제공된다. 다른 방법으로, MDA-7과 Hsp90 억제제 모두가 환자에게 제공된다. 또 다른 방법으로, MDA-7과 하나 이상의 비타민 E 화합물 모두가 환자에게 제공된다. 추가의 양태에서, MDA-7과 VEGF 억제제가 환자에게 제공된다. 또 다른 양태에서, MDA-7과 TNF 폴리펩타이드가 환자에게 제공된다. 또 다른 양태에서, MDA-7과 IL-10가 환자에게 제공된다. 용어 "제공된다"는 통상적으로 그대로의 의미로 사용된다: '사용을 위해 공급 또는 제공된다" (Oxford English Dictionary). 본 발명의 방법에서, 환자의 암세포 또는 환자의 암세포에 인접한 세포가 MDA-7 및 COX-2 억제제, Hsp90 억제제, 비타민 E 화합물, VEGF 억제제, 및/또는 TNF에 노출된다. MDA-7은 구경꾼 (bystander) 효과를 발휘하고, 그 결과 암세포에 인접한 세포가 MDA-7을 발현하고 암세포에게 이를 제공할 수 있다. 본 발명의 양태에서, 환자에게 MDA-7 및/또는 COX-2 억제제가 제공되도록 조성물이 환자에게 투여된다. 다른 양태에서, 환자에게 MDA-7 및/또는 Hsp90 억제제가 제공되도록 조성물이 환자에게 제공된다. 추가의 양태에서, 환자에게 MDA-7 및/또는 하나 이상의 비타민 E 화합물이 제공되도록 환자에게 조성물이 투여된다. 비타민 E 화합물의 에스테르 형태가 본 발명의 조성물에 포함될 수 있다는 것이 구체적으로 고찰된다. 또한, 일부 양태에서, 환자에게 MDA-7 및/또는 VEGF 억제제가 제공되도록 환자에게 조성물이 투여된다. 또 다른 추가의 양태에서 환자에게 MDA-7 및/또는 TNF 폴리펩타이드가 제공되도록 환자에게 조성물이 투여된다. 추가로 환자에게 MDA-7 및/또는 IL-10 억제제가 제공되도록 환자에게 조성물이 투여된다.
화합물 및 조성물은 환자에게 정맥내로, 피부내로, 동맥내로, 복강내로, 병소내로, 두개골내로, 관절내로, 전립선내로, 흉막내로, 기관내로, 비강내로, 유리체강내로 (intravitreally), 질내로, 직장내로, 국소적으로 (topically), 종양내로, 근육내로, 복강내로, 피하로, 결막하로, 소포내로, 점막으로, 심장막내로, 제대내로, 안내로, 경구적으로, 국지적으로 (locally), 흡입으로, 주사로, 주입으로, 연속 주입으로, 직접적으로 표적 세포의 국소 관류 목욕으로 (by localized perfusion bathing target cells directly), 카테터를 통해, 또는 세척을 통해 투여될 수 있다. 투여 경로의 병용이 이용될 수 있다는 것이 고찰된다. 예를 들어, MDA-7은 하나의 경로로 제공되고 MDA-7 병용제는 또 다른 경로로 제공될 수 있다. 달리, 일 용량의 a) MDA-7 또는 b) COX-2, Hsp90 억제제, 비타민 E 화합물, VEGF 억제제, TNF, 또는 IL-10 억제제 (MDA-7 병용제)가 환자에게 투여되고 또 다른 용량이 상이한 방식으로 환자에게 투여되는 것이 고찰된다.
특정 양태에서, 화합물(들) 또는 조성물(들)은 종양 내로 또는 종양에 직접적으로 주사된다. 달리 또는 부가적으로, 화합물(들 ) 또는 조성물(들)은 잔류하는 종양층에 적용되거나 투여된다. 또한, 특정 양태에서, COX-2 억제제는 환자에게 경구적으로 취해지거나 정맥내로 투여된다. 다른 양태에서, Hsp90 억제제는 경구적으로 취해지거나 주입 또는 주사에 의해 제공된다. 특정 양태에서, 비타민 E 화합물은 경구적으로 취해지거나 정맥내로 또는 복강으로 투여된다. 특정 양태에서, VEGF 억제제 또는 IL-10 억제제는 주입, 예를 들어 정맥내로 투여된다. 특정 양태에서, TNF는 종양 내로 또는 종양에 직접적으로 투여된다. 어떠한 MDA-7 병용 제도 근육내로 제공될 수 있다는 것이 구체적으로 고찰된다.
MDA-7, COX-2 억제제, Hsp90 억제제, 비타민 E 화합물, VEGF 억제제, TNF, 또는 IL-10 억제제가 치료의 일부로서 하기 횟수 또는 적어도 하기 횟수로 환자에게 제공될 수 있다: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50 이상. MDA-7 및 COX-2 억제제가 환자의 암 치료의 일부로서 1회 초과로 환자에게 제공되는 것이 고찰된다. 또한, 다른 양태에서, MDA-7 및 Hsp90 억제제가 환자의 암 치료의 일부로서 1회 초과로 환자에게 제공되는 것이 구체적으로 고찰된다. 추가의 양태에서, MDA-7 및 비타민 E 화합물이 환자의 암 치료의 일부로서 1회 초과로 환자에게 제공된다. 또한, 기술된 치료 경로가 있을 수 있으며, 그 경로는 필요한 경우 반복될 수 있다. 이는 임의의 다른 MDA-7 병용제를 함께 사용하는 치료에 적용된다.
MDA-7 병용제가 투여되기 전, 동시에 또는 후에 MDA-7이 환자에게 투여될 수 있다. 당업자라면 하나 초과의 치료제의 투여를 위한 치료 요법에 친숙 것이다. 예를 들어, MDA-7 병용제가 제공되는 24시간 내에 MDA-7이 환자에게 제공될 수 있다. 일부 양태에서, MDA-7 병용제가 제공되기 2시간 내에 MDA-7이 환자에게 제공된다. 추가의 양태에서, MDA-7 병용제가 제공되기 전에 MDA-7이 환자에게 제공된다. 추가의 양태에서 MDA-7이 제공되기 전에 MDA-7 병용제가 환자에게 제공된다.
본 발명은 세포에서 아폽토시스를 유발하는데 사용될 수 있다. 아폽토시스 유발이 암을 치료하기 위한 방법 및 조성물에 사용될 수 있다는 것이 고찰된다. 암은 하기 유형의 암 중의 임의의 것일 수 있다: 흑색종, 비소세포폐암, 소세포폐암, 폐암, 간암종, 망막모세포종, 성상세포종, 아교모세포종, 치은암, 설암, 백혈병, 신경모세포종, 두부암, 경부암, 유방암, 췌장암, 전립선암, 신장암, 골암, 고환암, 난소암, 중피종, 자궁경부암, 위장암, 림프종, 뇌종양, 결장암, 또는 방광암. 특정 양태에서, 암은 상피암세포를 포함한다. 특정 양태에서, 암은 유방암이다. 유방암의 경우, 환자는 HER-2/neu 음성일 수 있거나, 환자는 HER-2/neu 양성일 수 있다. 따라서, 처리는 환자의 HER-2/neu 상태에 대해 독립적일 수 있다.
또한, 본 발명은 암을 예방하거나 변질 형성, 형성 이상 및 과형성을 포함한 예비암 또는 예비악성 세포를 치료하는데 사용될 수 있다. 또한, 바람직하지 않으나 양성인 세포, 예를 들어 편평 변질 형성, 형성 이상, 양성 전립선 과증식 세포, 과증식성 병소 등을 억제하는데 사용될 수 있다. 암 또는 암이 보다 심각한 형태로의 진전이 본원에서 논의되는 바와 같은 MDA-7 결합 치료를 수반하는 본 발명의 방법에 의해 정지되거나 파괴되거나 지연될 수 있다.
또한, 암은 비절제성 또는 절제성 종양을 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 암은 방사선요법, 화학요법, 및/또는 면역요법 (예를 들어 트라스투주마브)에 대해, 또는 본원에서 논의되는 임의의 제제에 대해, 단 (MDA-7 결합 치료와 비교되는) 단독 치료로서, 내성인 것으로 보인다. 또한, 일부 양태에서는 단지 하나 이상의 원발성 종양에 관한 것이지만, 암은 전이된 종양 또는 2차적 종양을 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 방법 및 조성물은 종양의 전이를 억제하거나 종양의 추가 성장을 방지하고, 종양 또는 암을 감소시키거나 제거시키도록 할 수 있다는 것 이 고찰된다.
특정 양태에서, 본 발명은 암 환자에게 MDA-7 및 COX-2 억제제가 제공되는 암을 치료하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 기타 방법은 i) 환자에서 발현될 수 있는 프로모터의 조절하에 있는 MDA-7 암호화 핵산 서열을 포함하는 아데노바이러스 벡터; 및 ii) COX-2 억제제를 환자에게 투여함을 포함하여 유방암 환자를 치료하는 것에 관한 것이다.
본 발명의 일부 양태에서는, COX-2 억제제를 환자에게 직접적으로 투여함으로써 환자에게 COX-2 억제제가 제공된다는 것이 고찰된다. 다른 양태에서, COX-2 억제제의 프로드럭이 환자에게 투여된 후 환자의 신체 내부에서 COX-2 억제제의 활성 형태로 전환된다. 본 발명은 COX-2 억제제가 셀레콕시브, 로페콕시브, 발데콕시브, 루미라콕시브 및 에토리콕시브로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 것이 고찰된다. 또한, 하나 이상의 COX-2 억제제, 예를 들어 2, 3, 또는 4개의 이러한 억제제 (및/또는 이들의 관련 프로드럭)의 배합물이 사용될 수 있다.
보다 특정 양태에서, MDA-7 병용제는 COX-2 억제제이다. MDA-7 및 COX-2 억제제 억제제로의 방사선감작화는 세포 주기 중 방사선 민감성 G2/M상의 종양 세포를 저지함으로써 일어난다. 따라서, 암세포가 전형적으로 노출되는 방사선의 양은 방사선에 민감하게 된 후 낮아지거나 감소될 수 있다는 것이 고찰된다. 달리, 방사선 조사의 횟수 또는 조사 길이가 감소될 수 있다. 특정 양태에서, 임의의 단일 양, 총 양, 조사 횟수, 또는 조사 길이의 감소는 약, 적어도 약, 또는 기껏해야 약 약 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 600, 700, 800, 900, 1000% 이상, 또는 이로부터 유도가능한 임의의 범위이다.
또한, 본 발명은 MDA-7 및 Hsp90 억제제가 제공되는 암 환자의 치료 방법에 관한 것이다. 특정 양태에서, 본 방법은 i) 환자에서 발현될 수 있는 프로모터의 조절하에 있는 MDA-7 암호화 핵산 서열을 포함하는 아데노바이러스 벡터; 및 ii) Hsp90 억제제를 제공함으로써 암을 치료하는 것을 포함한다. 용어 "Hsp90 억제제"는 Hsp90의 기능을 특이적으로 및 직접적으로 억제하는 물질을 지칭한다. 특정 양태에서, Hsp90 억제제는 Hsp90 폴리펩타이드에 결합한다.
특정 양태에서, 본 방법은 i) 환자에서 발현될 수 있는 프로모터의 조절하에 있는 MDA-7 암호화 핵산 서열을 포함하는 아데노바이러스 벡터; 및 ii) Hsp90 억제제를 제공함으로써 암을 치료하는 것을 포함한다.
본 발명의 일부 양태에서는, 환자에게 Hsp90 억제제를 직접적으로 투여함으로써 환자에게 Hsp90 억제제가 제공된다. 다른 양태에서, Hsp90 억제제의 프로드럭은 환자에게 투여된 후 환자의 신체에서 Hsp90 억제제의 활성 형태로 전환된다. 본 발명은 Hsp90 억제제가 일부 양태에서 겔다나마이신 또는 이의 유도체 또는 유사체인 것을 고찰한다. 용어 "유도체"는 직접적으로나 변형 또는 부분적 치환에 의해 또 다른 물질로부터 생성되는 물질을 지칭한다. 용어 "유사체"는 또 다른 분자와 구조적으로 유사하거나 유사하거나 상응하는 특성을 공유하는 물질 (예를 들어 Hsp90을 특이적으로 결합할 수 있는 겔다나마이신 변형체)을 지칭한다. 또한, 하나 이상의 Hsp90 억제제, 예를 들어 2, 3 또는 4개의 이러한 억제제 (및/또는 이들의 관련 프로드럭)의 배합물이 사용될 수 있다.
특정 양태에서, 본 발명은 암 환자에게 MDA-7 및 비타민 E 화합물을 제공하여 암을 치료하는 방법에 관한 것이다. 용어 "비타민 E 화합물"은 토코페롤 및 토코트리에놀 서브부류의 지용성의 항산화 화합물 및 이러한 물질의 에스테르 형태 및 접합 형태인 천연 및 합성 물질을 지칭한다. 토코페롤 및 토코트리에놀 부류는 각각 구성물로서 알파 (α), 베타 (β), 감마 (γ), 및 델타 (δ) 비타머를 갖는다. 에스테르 형태는 아세테이트 및 숙시네이트 형태를 포함한다. 특정 양태에서, 비타민 E 화합물은 합성물이며, 다는 한편으로 이는 특정 비타머의 천연 형태이다. 특정 양태에서, 비타민 E 화합물은 알파-토코페릴 숙시네이트로도 공지된 비타민 E 숙시네이트 (VES)이다.
본 발명의 일부 양태에서, 비타민 E를 환자에게 직접적으로 투여함으로써 비타민 E 화합물가 환자에게 제공되는 것이 고찰된다. 용어 "비타민 E"는 8개의 지용성인 항산화 토코페롤 및 토코트리에놀 화합물 중 임의의 것으로 이해된다. 다른 양태에서, 비타민 E의 프로드럭은 환자에게 투여된 후 환자의 신체에서 비타민 E의 활성 형태로 전환된다. 특정 양태에서, 프로드럭은 비타민 E의 에스테르 형태, 예를 들어 아세테이트 또는 숙시네이트 형태이다. 본 발명은 일부 양태에서 비타민 E 화합물이 알파-토코페롤 또는 알파-토코페롤의 에스테르 형태, 예를 들어 알파-토코페릴 숙시네이트 또는 알파-토코페롤 아세테이트인 것이 고찰된다. 용어 "에스테르 형태"는 에스테르 그룹을 갖는 물질의 형태를 지칭한다. 특정의 다른 양태에서, 비타민 E 화합물 대신에 본 발명의 방법 및 조성물에 비타민 E 화합물의 유사체가 사용된다. 용어 "유사체"는 또 다른 분자 (예를 들어, 트롤록스 C: Trolox C)와 구조적으로 유사하거나 유사하거나 상응하는 특징을 공유하는 물질을 지칭한다. 추가의 양태에서, 비타민 E 접합체가 본 발명의 방법 및 조성물에 사용된다. 또한, 하나 이상의 비타민 E 화합물, 예를 들어 2, 3 또는 4개의 이러한 비타머 및/또는 에스테르 형태의 배합물이 사용될 수 있다.
또한, 본 발명은 환자에게 MDA-7 및 TNF를 제공함을 포함하여 암 환자를 치료하는 방법에 관한 것이다. TNF는 임의의 TNF, 예를 들어 TNF-알파, TNF-베타, TNF-감마, TNF-델다, 또는 TNF-엡실론일 수 있다. 본 발명의 특정 양태에서, TNF는 TNF-알파이다. TNF는 전체 길이의 아미노산 서열을 포함하거나, 이의 일부 길이의 서열이 TNF로서 기능할 수 있는 한, 일부 길이의 서열을 포함할 수 있다. 또한, TNF로서 작용할 수 있는 한, 전체 길이의 TNF 및 TNF의 일부 길이의 서열의 아미노산 서열 변형체가 TNF의 정의에 포함된다.
또한, 본 발명은 암 환자에게 MDA-7 및 VEGF 억제제가 제공되는 것을 포함하는 암 환자의 치료 방법에 관한 것이다. 암 치료와 관련지어, 항-맥관형성 인자는 혈관내피성장인자 (VEGF)와 이의 수용체 사이의 상호작용 억제에 의존할 수 있다. 종양 VEGF 발현은 유해의 견지에서 질환이 진행과 임상적으로 관련되어 있다. 이러한 관련은 내피 세포의 화학주성 및 유사분열을 자극하고, 또한 내피-관련된 프로테아제 활성을 증진시키며, 세포외 매트릭스 상호작용을 증진시키도록 미세혈관 세포의 인테그린 발현을 증가시킴으로써 종양 맥관형성을 유발하는 VEGF의 능력에 기인되는 되는 것을 생각된다. 타이로신 키나제 활성과 관련된 VEGF에 대한 2개의 고친화성 수용체가 사람 혈관 내피: Flt-1 및 KDR에서 확인되었다. 이러한 수용체에 결합하는 VEGF는 이량체화 및 수용체 타이로신 키나제 도메인의 후속적인 활성화를 일으키는 것으로 생각된다. VEGF 억제제는 당업자에게 공지된 임의의 VEGF 억제제일 수 있다. 예를 들어, 억제제는 DNA, RNA, 올리고뉴클레오타이드, 리보자임, 단백질, 폴리펩타이드, 펩타이드, 항체, 올리고사카라이드, 또는 소분자일 수 있다. 특정 양태에서, VEGF 억제제는 항체, 예를 들어 VEGF 또는 VEGF 수용체에 대해 지시되는 항체이다. 보다 특정한 양태에서, 항체는 모노클로날 항체, 예를 들어 VEGF 또는 VEGF 수용체에 특이적으로 결합하는 모노클로날 항체이다. 보다 특정한 양태에서, VEGF 억제제는 베바시주마브 (Avastin)이다. 일부 양태에서, VEGF 억제제는 소분자이다. 이러한 소분자의 예는 VEGF 수용체의 소분자 타이로신 키나제 억제제를 포함한다. 특정 양태에서, VEGF 억제제는 리보자임, 예를 들어, VEGF mRNA 또는 VEGF 수용체 mRNA를 특이적으로 표적하는 리보자임이다. 추가의 특정 양태에서, VEGF 억제제는 가용성 VEGF 수용체이다.
본 발명의 일부 양태에서, VEGF 신호전달을 억제하는 분자가 고찰된다. 특정 양태에서, VEGF 신호전달의 억제는 수용체 타이로신 키나제 억제제를 통할 수 있다. 고찰되는 수용체 타이로신 키나제 억제제는, 이로 제한됨이 없이, ZD4190, ZD6474, 및 AZD2171 (Astra-Zeneca, Wilmington, Del.], CEP-7055 (Cephalon, Frazer, Pa.), PTK787 (Novartis, Basel, Switzerland) 및 SU5416 (Sugen, South San Francisco, Calif.)를 포함한다.
또한, 본 발명은 환자에게 MDA-7 및 IL-10 억제제를 제공함으로써 암 환자를 치료하는 방법에 관한 것이다. IL-10의 억제제는 당업자에게 공지된 임의의 IL-10 억제제일 수 있다. 예를 들어, 억제제는 DNA, RNA, 리보자임, 올리고뉴클레오타이드, 단백질, 폴리펩타이드, 펩타이드, 항체 또는 소분자일 수 있다. 특정 양태에서, IL-10 억제제는 항체, 예를 들어 IL-10에 대한 항체이다. 일부 양태에서, 항체는 모노클로날 항체이다.
상기된 바와 같이, 환자에서 발현되는 MDA-7 폴리펩타이드를 암호화하는 서열을 갖는 핵산을 포함하는 조성물을 환자에게 투여함으로써 환자에게 MDA-7이 제공될 수 있다. 특정 양태에서, 조성물은 약제학적으로 허용되는 조성물이다. 달리는, 상술된 바와 같이, 정제된 MDA-7 단백질 조성물을 환자에게 제공함으로써 환자에게 MDA-7이 제공될 수 있다. 특정 양태에서, 조성물은 약제학적으로 허용되는 조성물이다.
MDA-7 및 TNF의 제공과 관련된 본 발명의 방법에서, 환자에서 발현되는 TNF 폴리펩타이드를 암호화하는 서열을 갖는 조성물을 환자에게 투여함으로써 환자에게 TNF가 제공될 수 있다. MDA-7 및 VEGF 억제제의 제공과 관련된 본 발명의 방법에서, 환자에서 발현되는 VEGF 억제제를 암호화하는 서열을 갖는 핵산을 포함하는 조성물을 환자에게 투여함으로써 환자에게 VEGF 억제제가 제공될 수 있다. MDA-7 및 IL-10 억제제의 투여를 수반하는 본 발명의 방법에서, IL-10 억제제를 암호화하는 서열을 갖는 핵산을 포함하는 조성물을 환자에게 투여함으로써 환자에게 IL-10 억제제가 제공될 수 있다.
MDA-7 및 COX-2 억제제가 일부 양태에서의 단일 조성물로 환자에게 제공된다는 것이 고찰된다. 환자에게 투여되는 조성물은 본원에 기술된 본 발명의 조성물을 포함한다. 또한, 일부 양태에서, COX-2 억제제 및 i) 정제된 MDA-7 단백질 또는 ii) MDA-7을 암호화하는 서열을 갖는 핵산을 포함하는 조성물이 환자에게 제공된다. 달리는, COX-2 억제제 대신에 조성물은 COX-2 억제제 프로드럭을 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 방법에서, MDA-7 및 Hsp90 억제제가 일부 양태에서의 단일 조성물 투여로 환자에게 제공된다는 것이 고찰된다. 환자에게 투여되는 조성물은 본원에 기술된 본 발명의 조성물을 포함한다. 또한, 일부 양태에서, Hsp90 억제제 및 i) 정제된 MDA-7 단백질 또는 ii) MDA-7을 암호화하는 서열을 갖는 핵산을 포함하는 조성물이 환자에게 제공된다. 달리는, Hsp90 억제제 대신에 조성물은 COX-2 억제제 프로드럭을 포함할 수 있다.
MDA-7 및 비타민 E 화합물이 일부 양태에서의 단일 조성물로 제공된다는 것이 고찰된다. 환자에게 투여되는 조성물은 본원에 기술된 본 발명의 조성물을 포함한다. 또한, 일부 양태에서, COX-2 억제제 및 i) 정제된 MDA-7 단백질 또는 ii) MDA-7을 암호화하는 서열을 갖는 핵산을 포함하는 조성물이 환자에게 제공된다. 달리, 비타민 E 대신, 이 조성물은 비타민 E의 에스테르 형태, 비타민 E 유사체, 또는 비타민 E 접합체를 포함할 수 있다.
또한, 단일 조성물에 대해 상술된 양태가 다른 MDA-7 병용제, 예를 들어 VEGF 억제제, TNF 또는 IL-10 억제제에도 적용된다는 것이 고찰된다.
다른 양태에서, MDA-7 및 COX-2 억제제 또는 다른 MDA-7 병용제는 환자에게 별도로 제공된다. 유사하게, MDA-7 및 Hsp90 억제제는 특정 양태에서 환자에게 별도로 제공된다. 또한, 추가의 양태에서, MDA-7 및 하나 이상의 비타민 E 화합물은 환자에게 별도로 제공된다. 이들 경우에, 환자에게 하나의 제제가 제공되며 다른 제제는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24시간, 및/또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7일 및/또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12주, 또는 이로부터 유도가능한 임의의 범위에서 제공되거나 투여된다는 것이 고찰된다. 특정 양태에서, COX-2 억제제, Hsp90 억제제, 또는 비타민 E 화합물 또는 다른 MDA-7 병용제가 제공되는 24시간 내에 환자에게 MDA-7이 제공된다는 것이 고찰된다. 다른 양태에서, COX-2 억제제, Hsp90 억제제, 또는 비타민 E 화합물 또는 다른 MDA-7 병용제가 제공되는 2시간 내에 환자에게 MDA-7이 제공된다. 일부 양태에서, COX-2 억제제, Hsp90 억제제, 또는 비타민 E 화합물 또는 다른 MDA-7 병용제가 환자에게 제공되기 전에 환자에게 MDA-7이 제공되며, 다른 한편으로 MDA-7이 제공되기 전에 환자에게 Hsp90 억제제, 또는 비타민 E 화합물 또는 다른 MDA-7 병용제가 제공된다. 또한, MDA-7으로의 처리 과정을 통해 환자에게 MDA-7 병용제가 투여될 수 있다는 것이 고찰된다. 예를 들어, 환자는 6주의 기간 동안 MDA-7 치료를 받을 수 있다는 것이 고찰된다. 이러한 시간 동안, 6주 기간을 통해, 예를 들어 적어도 매일 또는 주단위로, 예를 들어 COX-2 억제제, Hsp90 억제제, 또는 비타민 E 화합물이 환자에게 투여될 수 있다. 따라서, MDA-7이 제공되는 24시간 (또는 상기 명시된 임의의 시간 기간) 내에 COX-2 억제제, Hsp90 억제제, 비타민 E 화합물, 또는 다른 MDA-7 병용제가 MDA-7에게 제공될 수 있으며, MDA-7이 1회 초과로 제공될 수 있다는 것이 고찰된다. 따라서, (단백질로서 또는 단백질을 암호화하는 핵산으로서) MDA-7이 환자에게 제공되는 각각의 시간에 대해 24시간 내에 COX-2 억제제, Hsp90, 비타민 E 화합물, VEGF 억제제, TNF 또는 IL-10 억제제가 환자에게 제공될 것이다. 또한, 상기 명시된 시간 기간 내에, COX-2 억제제, Hsp90, 비타민 E 화합물, VEGF 억제제, TNF 또는 IL-10 억제제가 다수회 제공될 수 있다는 것이 고찰된다. 예를 들어, MDA-7이 제공되는 24시간 내에 3 용량의 COX-2 억제제가 환자에게 제공될 수 있다. 따라서, MDA-7이 제공되는 명시된 시간 기간 내에 MDA-7 병용제가 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 또는 그 이상의 개별적 횟수 또는 이로부터 유도가능한 임의의 범위로 환자에게 제공될 수 있다. 달리는, COX-2 억제제, Hsp90 억제제, 비타민 E 화합물 또는 다른 MDA-7 병용제가 MDA-7으로의 처리 동안 또는 계속해서 전신적으로 제공될 수 있다.
일부 양태에서, 환자는 MDA-7 및 COX-2 억제제 (또는 다른 MDA-7 병용제) 각각이 1회 이상 제공된 후 방사선치료된다. 추가의 양태에서, 환자에게 준치사량(sub-lethal dose)의 방사선요법이 수행된다. 용어 "준치사량"은, 방사선에 노출되는 환자의 세포에 대해 치사량 (즉, 세포가 죽는 양) 미만인, 환자에게 1회에 제공되는 방사선의 양을 지칭한다. 준치사량은 방사선감작화 치료가 처음으로 제공되는 것이 아닌 유사한 특성 (예를 들어, 암의 단계, 종양의 크기, 예후 등)을 갖는 암 환자에게 통상 제공되는 양 미만이다. 방사선감작화 치료는 약, 적어도 약, 또는 기껏해야 약 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60분, 및/또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24시간, 및/또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7일 이상, 또는 이로부터 유도가능한 임의의 범위로 방사선에 노출될 수 있다는 것이 고찰된다.
본 발명의 특정 양태에서, 본 발명은 또한 환자에게 방사선요법 및/또는 화학요법을 수행하는 것을 포함한다. 다른 양태에서, 환자는 면역요법을 받는다. 다른 특정 양태에서, 또한 본 방법은 환자의 종양의 전체 또는 일부를 절제하는 것을 수반한다. 다수의 종양이 제거 (전체 또는 일부)될 수 있다는 것이 고찰된다. 이들 경우 각각에서, 다른 얌치료 전, 동안 또는 후에, MDA-7 및/또는 COX-2 억제제, Hsp90 억제제, 비타민 E 화합물, VEGF 억제제, TNF, 및/또는 IL-10 억제제가 제공될 수 있다. 특정 양태에서, 예를 들어 적어도 생성된 종양층에 하나 또는 다수의 제제를 갖는 조성물을 투여함으로써, 종양 절제 후 환자에게 MDA-7 및/또는 MDA-7 병용제가 환자에게 제공된다.
다른 양태에서, 환자는 이의 종양의 전체 또는 일부가 절제된다. MDA-7 및 MDA-7 병용제는 환자의 종양의 전체 또는 일부가 절제되기 전, 동안 또는 후에 투여될 수 있다. 일부 양태에서, MDA-7 및 MDA-7 병용제는 환자의 종양의 전체 또는 일부를 절제한 후 제공된다. 일부 양태에서, 적어도 생성된 종양층에 조성물을 투여함으로써 환자에게 MDA-7 및 MDA-7 병용제가 제공된다.
MDA-7 및 MDA-7 병용제는 1회, 또는 1회 초과로 투여될 수 있다. MDA-7 또 는 MDA-7이 아데노바이러스 벡터인 특정 양태에서, 환자에게 아데노바이러스 벡터가 1회 또는 그 이상 투여될 수 있다.
본 발명의 다른 양태는 본 발명의 양태에서 MDA-7 대신에 다른 종양 억제제를 제공하는 것을 포함한다. 다른 종양 억제제는, 이로 제한됨이 없이, p53, FUS1, C-CAM, FHIT, DCC, Rb, 및 PTEN를 포함한다. 그러한 것으로서, 단백질 또는 종양 억제제를 암호화하는 핵산이 상술된 바와 같이 사용될 수 있다.
또한, 본 발명은 약제학적 조성물에 관한 것이다. 일부 양태에서, a) COX-2 억제제 또는 COX-2 억제제 프로드럭; 및 b) 정제된 활성 MDA-7 단백질 또는 MDA-7 폴리펩타이드를 암호화하는 서열을 갖는 핵산을 포함하는 약제학적 조성물이다. MDA-7 암호화 핵산을 수반하는 양태에서 핵산은 아데노바이러스 벡터일 수 있다는 것이 고찰된다. 약제학적 조성물은 하나 이상의 셀레콕시브, 로페콕시브, 발데콕시브, 루미라콕시브 및 에토리콕시브를 포함할 수 있다. 특정 양태에서, 이는 셀레콕시브를 포함한다.
다른 약제학적 조성물은 a) Hsp90 억제제 또는 Hsp90 억제제 프로드럭; 및 b) 정제된 활성 MDA-7 단백질 또는 MDA-7 폴리펩타이드를 암호화하는 서열을 갖는 핵산을 포함한다. MDA-7 암호화 핵산을 수반하는 양태에서, 핵산을 아데노바이러스 벡터일 수 있다는 것이 고찰된다. 특정 양태에서, 조성물은 GA 또는 17-GAA를 포함한다. 추가의 양태에서, 약제학적 조성물은 겔다나마이신 또는 겔다나마이신 유도체 또는 유사체, 또는 이의 프로드럭을 포함한다.
또한, 본 발명은 a) 하나 이상의 비타민 E 화합물; 및 b) 정제된 활성 MDA-7 단백질 또는 MDA-7 폴리펩타이드를 암호화하는 서열을 갖는 핵산을 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다. MDA-7 암호화 핵산을 수반하는 양태에서 핵산은 아데노바이러스일 수 있다는 것이 고찰된다. 특정 양태에서, 조성물은 VES를 포함한다.
일부 양태에서, TNF는 정제된 TNF를 포함하는 조성물을 환자에게 투여함으로써 환자에게 제공된다. 상기된 바와 같이, 이는 전체 길이의 TNF 아미노산 서열, 또는 TNF로서 생물학적 기능을 유지하는 일부 길이의 서열, 또는 서열이 일정 수준의 생물학적 활성을 유지하는 한, 전체 또는 일부 길이의 TNF의 서열 변이체일 수 있다. 유사하게는, MDA-7 및 VEGF 억제제의 투여에 관한 양태에서, VEGF 억제제는 단백질인 경우 정제된 단백질로서 투여될 수 있다. 유사하게, MDA-7 및 IL-10 억제제의 투여에 관한 양태에서, IL-10 억제제는 아미노산 서열인 경우 정제된 단백질을 포함하는 조성물로 환자에게 제공될 수 있다.
특정 양태에서, 정제된 MDA-7 단백질 또는 MDA-7을 암호화하는 서열을 갖는 핵산, 및 정제된 TNF 아미노산 서열을 포함하는 조성물이 환자에게 제공된다. 추가의 특정 양태에서, TNF 및 MDA-7 단백질 또는 MDA-7을 암호화하는 서열을 갖는 핵산을 포함하는 조성물이 환자에게 제공된다. 보다 특정 양태에서, TNF 단백질은 TNF-알파 단백질이다.
특정 양태에서, 적어도 (a) 정제된 MDA-7 단백질 또는 MDA-7 단백질을 암호화하는 서열을 갖는 핵산; 및 (b) VEGF에 특이적으로 결합하는 모노클로날 항체가 환자에게 제공된다. 특정 양태에서, 모노클로날 항체는 베바시주마브 (bevacizumab)이다.
추가의 양태에서, (a) 정제된 MDA-7 단백질 또는 MDA-7 단백질을 암호화하는 서열을 갖는 핵산; 및 (b) IL-10에 특이적으로 결합하는 항체 또는 IL-10에 특이적으로 결합하는 항체를 암호화하는 서열을 갖는 핵산을 포함하는 조성물이 환자에게 제공된다. 특정 양태에서, 모노클로날 항체는 베바시주마브이다.
또한, 본 발명은 (a) 정제된 활성 TNF 또는 TNF를 암호화하는 서열을 갖는 핵산; 및 (b) 정제된 활성 MDA-7 단백질 또는 MDA-7 폴리펩타이드를 암호화하는 서열을 갖는 핵산을 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다. 특정 양태에서, 정제된 활성 TNF는 정제된 활성 TNF-알파이다. 추가의 특정 양태에서, TNF를 암호화하는서열을 갖는 핵산은 TNF-알파 폴리펩타이드를 암호화하는 서열을 갖는 핵산이다.
특정 양태에서, 약제학적 조성물은 MDA-7 폴리펩타이드를 암호화하는 서열을 갖는 핵산을 포함한다. 특정 양태에서, MDA-7 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산은 아데노바이러스 벡터이다. 약제학적 조성물은 TNF 폴리펩타이드, 예를 들어 TNF-알파 폴리펩타이드를 암호화하는 서열을 갖는 핵산을 포함할 수 있다. TNF 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산은 아데노바이러스 벡터일 수 있다. 특정 양태에서, 약제학적 조성물은 (a) 제1 프로모터 서열에 작동적으로 커플링된 MDA-7 암호화 핵산 서열을 갖는 제1 아데노바이러스 벡터; 및 (b) 제2 프로모터에 작동적으로 연결된 TNF 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열을 갖는 제2 아데노바이러스 벡터를 포함한다. TNF 폴리펩타이드는, 예를 들어 TNF-알파 폴리펩타이드일 수 있다.
일부 양태에서, 제약학적 조성물은 MDA-7을 암호화하는 제1 핵산 서열 및 TNF 폴리펩타이드를 암호화하는 제2 핵산 서열을 갖는 아데노바이러스 벡터를 포함한다. 보다 특정한 양태에서, TNF 폴리펩타이드를 암호화하는 제2 핵산은 TNF-알파 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열이다. 제1 핵산 서열 및 제2 핵산 서열은 하나 이상의 프로모터에 작동적으로 연결되거나 그렇지 않을 수 있다.
본 발명은 MDA-7 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 및 지질을 포함하는 약제학적으로 허용되는 조성물을 환자에게 투여함을 포함하여 암 환자를 치료하거나 예방하는 방법을 포함한다. 암은 상기된 임의의 암일 수 있다. 특정 양태에서, 환자는 암을 앓는 환자이다. 예를 들어, 폐암은 비소세포폐암, 소세포폐암, 또는 전이성 폐암 (폐의 경계 바깥으로 퍼진 암)일 수 있다. 폐암으로부터의 2차적 종양의 치료 이외에 원발성 폐암의 치료가 수행될 수 있다. 추가의 양태에서, 이 방법은 전이성 폐암 환자를 치료하는 방법으로 추가로 정의된다.
약제학적 투여에 적합한 임의의 지질이 본 발명에서 고찰된다. 특정 양태에서, 조성물은 리포좀을 리포좀을 포함하는 것으로 추가 정의된다. 약제학적 투여에 적합한 임의의 리포좀이 본 발명의 방법에 포함되는 것으로 고찰된다. 특정 양태에서, 리포좀은 DOTAP:콜레스테롤 나노입자이다. 리포좀 및 나노입자는 하기에서와 같이 명세서에서 상당히 세부적으로 논의된다. 투여의 방법/경로는 당업자에게 공지된 임의의 방법, 예를 들어 정맥내로, 피부내로, 동맥내로, 복강내로, 병소내로, 두개골내로, 관절내로, 전립선내로, 흉막내로, 기관내로, 비강내로, 유리체강내로, 질내로, 직장내로, 국소적으로, 종양내로, 근육내로, 복강내로, 피하로, 결막하로, 소포내로, 점막으로, 심장막내로, 제대내로, 안내로, 경구적으로, 국지 적으로, 국부적으로, 흡입으로, 주사로, 주입으로, 연속 주입으로, 직접적으로 표적 세포의 국소 관류 목욕으로, 카테터를 통해, 또는 세척을 통해 투여될 수 있다.
본 발명의 다른 양태는 환자에게 MDA-7 및 탁소테레 (도세탁셀)를 제공함을 포함하여 암 환자를 치료하는 방법에 관한 것이다. MDA-7은 당업자에게 공지된 임의의 방법에 의해 환자에게 제공될 수 있다. 예를 들어, 환자에서 발현될 MDA-7 폴리펩타이드를 암호화하는 서열을 갖는 핵산을 포함하는 조성물을 환자에게 투여함으로써 MDA-7이 환자에게 제공될 수 있다.
일부 양태에서, 정제된 MDA-7 단백질을 포함하는 조성물을 환자에게 투여함으로써 MDA-7이 환자에게 제공된다. 조성물은 하나 이상의 부가적인 항암제, 예를 들어 화학요법제 또는 MDA-7 병용제를 포함할 수 있다. 예시적인 화학요법제가 하기하는 바와 같이 명세서에 제시된다. 추가의 양태에서, 환자는 하나 이상의 부가적인 항암 치료로 처리된다. 이러한 항암 치료의 예는 방사선요법, 부가적인 화학요법, 면역요법, 다른 형태의 유전자 요법 및 외과 수술치료를 포함한다.
일부 양태에서, 탁소테레 (taxotere) 및 i) 정제된 MDA-7 단백질 또는 ii) MDA-7을 암호화하는 서열을 갖는 핵산을 포함하는 조성물이 환자에게 제공된다. MDA-7은 탁소테레의 투여 전, 동안 또는 후에 제공될 수 있다. 일부 양태에서, 예를 들어, 탁소테레가 제공되는 24시간 내에 MDA-7이 환자에게 제공된다. 보다 특히, 탁솥레가 제공되는 2시간 내에 MDA-7이 환자에게 제공된다. 탁소테레가 제공되기 전에 MDA-7이 환자에게 제공될 수 있거나, MDA-7이 제공되기 전에 탁소테레가 환자에게 제공될 수 있다. 특정 양태에서, 환자에게 탁소테레를 투여함으로써 탁 소테레가 환자에게 제공된다.
암은 상술된 임의의 암일 수 있다. 특정의 양태에서, 암은 유방암이다. 일부 양태에서, 이 방법은 환자에게 방사선요법 및/또는 화학요법을 수행하는 것을 추가로 포함한다. 예를 들어, 환자에게 MDA-7 및 탁소테레 (taxotere)를 1회 이상 제공한 후 환자에게 방사선요법을 수행할 수 있다. 일부 양태에서, 환자는 준치사량의 방사선요법을 받는다. 일부 양태에서, 환자는 이로부터 종양의 전체 또는 일부가 절제된다. 탁소테레는 종양 절제 전, 동안 또는 후에 제공될 수 있다. 일부 양태에서, 적어도 생성된 종양층에 조성물을 투여함으로써 환장게 MDA-7 및/또는 탁소테레가 제공된다. 탁소테레는 1회 또는 그 이상 투여될 수 있다.
조성물이 핵산을 포함하는 양태에서, 핵산은 벡터에 포함될 수 있다. 예를 들어, 벡터는 바이러스 벡터일 수 있다. 특정 양태에서, 바이러스 벡터는 아데노바이러스 벡터이다. 일부 양태에서, 아데노바이러스는 프로타민과 함께 제형화된다. 임의의 수의 바이러스 입자가 환자에게 투여될 수 있다. 특정 양태에서, 투여 당 약 109 내지 약 1013개의 바이러스 입자가 환자에게 투여된다.
핵산 조성물이 투여되는 본 발명의 일부 양태에서, 핵산 조성물은 하나 이상의 지질을 포함할 수 있다. 상술되는 어떠한 지질도 이러한 지질-핵산 조성물에 포함될 수 있다. 이러한 지질의 예는 DOTAP 및 콜레스테롤, 또는 이의 유도체를 포함한다.
또한, 본 발명은 (a) 환자로부터의 세포를 포함하는 생물학적 샘플을 소정량의 IL-10 발현에 대해 검정하는 단계, 및 (b) IL-10의 발현 수준이 MDA-7 내성 세 포 또는 MDA-7-감수성 세포와 관련되는 지의 여부에 따라 MDA-7 암 치료를 적용하거나 적용하지 않는 단계를 포함하여 환자에서 MDA-7 암 치료의 효능을 예측하는 방법에 관한 것이다.
일부 양태에서, 대상은 화학요법, 방사선요법 또는 일부 다른 형태의 항암 치료로 치료된 바 있는 대상이다. 당업자에게 공지된 임의의 방법이 소정 수준의 IL-10 발현을 위한 생물학적 샘츨을 검정하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 일부 양태에서, IL-10 발현 수준은 IL-10을 특이적으로 인식하는 항체를 사용하여 검정된다. 다른 양태에서, IL-10 발현 수준은 IL-10 전사물에 상보적이거나 동일한 핵산 프라이머 또는 프로브를 사용하여 검정된다.
암을 포함하는 생물학적 샘플은, 하나 이상의 암세포를 포함하는 한, 임의의 유형의 생물학적 샘플일 수 있다. 예를 들어, 생물학적 샘플은 생체 유체 샘플, 예를 들어 혈장 샘플, 혈청 샘플, 혈액 샘플, 뇌척수액 샘플 또는 뇨 샘플일 수 있다. 특정 양태에서, 생물학적 샘플은 조직 샘플, 예를 들어 대상으로부터의 종양 조직의 샘플이다.
추가의 양태에서, 대상에서 MDA-7 암 치료 효능을 예측하는 방법은, 대상이 MDA-7 내성 세포와 연관되는 소정량의 IL-10을 발현하는 경우, IL-10 억제제를 대상에게 제공하는 것을 포함한다. 상기된 임의의 방법이 대상에게 IL-10 억제제를 투여하는데 적용될 수 있다. 또한, 본원의 교시에 따라, 당업자라면 대상에서 발현되는 IL-10의 수준이 MDA-7 내성 세포와 연관되는 지의 여부를 결정할 수 있다.
또한, 본 발명은 환자에게서 암을 예방하기에 충분한 MDA-7을 환자에게 제공 하는 것을 포함하여 환자에서 질환 또는 건강-관련 증상을 예방하는 방법에 관한 것이다. 질환 또는 건강-관련된 증상은, 예를 들어 예비악성 병소 또는 암일 수 있다. 암은 상술된 암 중 임의의 것일 수 있다. 상술된 바와 같이, 대상은 암이 발병될 위험이 있는 대상일 수 있다. 예를 들어, 대상은 유전적 소양을 가질 수 있거나 성공적으로 치료된 암의 병력을 가질 수 있다.
질환 또는 건강-관련된 증상의 예방을 위해 환자에게 MDA-7을 제공하는 방법은 상기된 임의의 방법을 포함한다. 특정 양태에서, MDA-7은 환자에서 발현되는 MDA-7 폴리펩타이드를 암호화하는 서열을 갖는 핵산을 포함하는 조성물을 환자에게 투여함으로써 환자에게 제공된다. 이 조성물은 약제학적으로 허용되는 조성물일 수 있다. 상술된 바와 같이, 이의 논의가 본 단락에 삽입되며, 핵산은 벡터, 예를 들어 바이러스 벡터일 수 있다. 투여는 당업자에게 공지된 임의의 방법, 예를 들어 상술된 임의의 방법일 수 있다.
또한, 본 발명은 환자에서 발현될 수 있는 프로모터의 조절하에 있는 MDA-7 암호화 핵산 서열을 포함하는 아데노바이러스 벡터를 환자에게 투여함을 포함하여 암 환자에서 암을 예방하는 방법에 관한 것이다. 아데노바이러스 벡터는 상기에 상술되어 있으며, 이의 논의가 본 단락에 삽입된다. 투여는 당업자에게 공지된 임의의 방법으로 수행될 수 있으며, 상술된 방법을 포함한다.
일부 양태에서, 환자는 화학요법, 방사선요법, 면역요법 및/또는 유전자 요법과 성공적으로 치료되었던 암의 병력을 갖는다. 일부 보다 특별한 양태에서, 환자는 방사선요법을 받는다. 예를 들어, 환자에게 MDA-7 및 MDA-7 병용제가 1회 이 상 제공된 후 방사선요법이 수행된다. 방사선요법의 용량은 당업자에게 공지된 임의의 용량일 수 있다. 예를 들어, 일부 양태에서, 그 용량은 방사선요법의 준치사량이다.
또한, 본 발명은 일반적으로 환자에게 MDA-7을 제공하는 것을 포함하여 환자의 예비악성 병소를 치료하는 방법을 포함한다. MDA-7의 제공은 당업자에게 공지된 임의의 방법, 예를 들어 환자에서 발현되는 MDA-7 폴리펩타이드를 암호화하는 서열을 갖는 핵산을 포함하는 조성물을 투여함으로써 수행될 수 있다. 조성물은 상술된 바와 같이 약제학적으로 허용되는 조성물일 수 있다. 특정 양태에서, 핵산은 벡터에 포함되어 있다. 벡터는 상술된 바와 같으며, 이에 대한 논의가 본 단락에 삽입된다.
조성물은 조성물을 경구, 정맥내, 및 직접 주사하는 것을 포함하여 본원에 기술되는 바와 같은 투여를 위해 제형될 수 있다.
본 발명의 하나의 측면에 대해 논의되는 임의의 양태는 또한 본 발명의 다른 측면에도 적용된다. 예를 들어, 하나의 MDA-7 병용제와 연관지어 논의된 임의의 양태는 임의의 다른 MDA-7 병용제에 대해서도 적용될 수 있다.
실시예에서의 양태는 본 발명의 모든 양상에 적용가능한 본 발명의 양태이다.
특허청구범위에서 용어 "또는"은, 비록 기술 내용이 단지 대체적인 것 및 "및/또는"을 지칭하는 정의를 지지하더라도, 대체적인 것만을 지칭한다고 명백히 기술되지 않거나 대체적인 것이 서로 배제적이지 않는 한, "및/또는"을 의미하도록 사용된다.
본 명세서를 통해서, 용어 "약"은 임의의 값이 그 값을 측정하기 위해 사용되는 장치 또는 방법에 대한 오차에 대한 표준편차를 포함한다는 것을 나타내기 위해 사용된다.
오랫동안의 특허 규칙에 따라, 특별히 명시되지 않는 한, 특허청구범위 또는 명세서에서 용어 "포함하는"과 함께 사용되는 용어 "하나, 임의 또는 어떤 (a)"은 하나 이상(의 것)을 나타낸다.
본 발명의 기타 목적, 특징 및 이점은 하기 상세한 설명으로부터 명백해질 것이다. 그러나, 당업자에게 있어 상세한 설명으로부터 본 발명의 취지 및 범위 내에서 다양한 변화 및 변경이 명백할 것이므로, 발명의 특정 양태를 나타내는 상세한 설명 및 특정 실시예는 단지 설명을 목적으로 제공된 것이라는 것을 알아야 한다.
아래의 도면은 명세서의 일부를 형성하며 본 발명의 특정 국면을 추가로 입증하도록 포함되어 있다. 본원에 제시된 구체적인 양태의 상세한 설명과 함께 하나 이상의 이들 도면을 참조하여 본 발명을 보다 양호하게 이해할 수 있다.
도 1A 및 1B는 72시간 동안의 셀레콕시브, Ad-mda7 또는 Ad-mda7과 셀레콕시브 처리 후의 세포 생존능력을 나타낸다. HER2- (MDA-MB-436) (a) 및 HER2+ (MCF7/Her18) (b) 유방암 세포를 대조군으로서의 PBS (인산완충용액), 리포터로서 의 Ad-luc (루시페라제), Ad-mda7, 셀레콕시브 또는 Ad-mda7과 셀레콕시브의 배합물 (M+C)로 처리하였다. 당해 배합물은 대조군 (PBS)에 비해 가장 유의하게 감소된 생존 비율을 나타내었다. 생존능력은 MTT 검정으로 측정하였다. 흡광도는 대조군에 대한 생존능력 백분율로서 플롯팅하였다. (* p<0.05)
도 2는 72시간 처리 후의 트리판 블루 배제에 의한 세포 사멸 측정을 나타낸다. Her2- (MDA-MB-436) 및 Her2+ (MCF7/Her18) 유방암 세포를 Ad-mda7, Ad-luc, 셀레콕시브 또는 Ad-mda7과 셀레콕시브의 배합물 (M+C)로 3일 동안 처리하고 세포 생존능력을 트리판 블루 배제에 의해 평가하였다. 세포주 둘 다 배합물 그룹 (M+C)에서 대조군 (PBS)에 비해 현저히 증가된 사멸 세포 수를 나타내었다. 데이타는 세포 사멸율(%) 대 처리로서 플롯팅하였다. (* p<0.05)
도 3A 및 3B는 72시간 처리 후의 세포 주기 분석을 나타낸다. Her2- (MDA-MB-436) (a) 및 Her2+ (MCF7/Her18) (b) 유방암 세포를 Ad-mda7, Ad-luc, 셀레콕시브 또는 Ad-mda7과 셀레콕시브의 배합물로 3일 동안 처리한 후 부유 및 부착 세포를 수집하여 세포 주기 분석을 수행하였다. MCF7/Her18 세포는, 배합물 (M+C)에서 대조군 (PBS)에 비해 세포 주기의 G1 단계가 유의하게 증가되었다.
도 4A 및 4B는 안넥신 V/FITC 및 TUNEL 검정에 의한 유동 세포측정을 나타낸다. MDA-MB-436 (a) 및 MCF7/Her18 (b) 세포를 72시간 처리 후에 수집한 다음 제조업자의 프로토콜에 따라 염색하였다. 안넥신 V/FITC 검정에 의하면, 셀레콕시브 및 mda7 처리는 증가된 아폽토시스를 나타내었고 (p<0.05), Ad-mda7과 셀레콕시브의 배합물 (M+C) 처리는 모든 그룹에 대해 가장 증가된 아폽토시스를 나타내었다 (p<0.05). TUNEL 검정에 의하면, 배합된 및 셀레콕시브 처리는 대조군 (PBS)에 비해 유의하게 증가된 아폽토시스를 나타내었다 (p<0.05). (* p<0.05)
도 5A 및 5B는 사람 폐암 세포에서 겔다나마이신 (GA)에 의한 아데노바이러스성 mda-7 매개된 세포 사멸의 증가를 나타낸다. (A) 상이한 투여량의 겔다나마이신 처리 후 A549 및 H460 세포의 세포 사멸 백분율. 처리한 지 48시간 후 유동 세포측정에 의해 세포를 분석하였다. 각 세포주에 대해 실험을 3회 반복 수행하였다. (B) Ad-mda7, Ad-luc, GA, Ad-mda7과 GA, 및 Ad-luc와 GA 처리 후 A549 및 H460 세포에서의 아폽토시스의 유동 세포측정 분석. 각 세포주에 대해 실험을 3회 반복 수행하였다.
도 6A 및 6B는 Ad-mda7 및 GA가 폐암 세포 운동성을 억제함을 나타낸다. (A) PBS, Ad-luc, Ad-mda7, Ad-mda7과 GA, Ad-luc와 GA 및 GA로 처리한 후 A549 및 H460 세포에서의 표면 E-카드헤린 수준의 유동 세포측정 분석. 각 세포주에 대해 실험을 3회 반복 수행하였다. (B) 폐암 세포 운동성을 "물질 및 방법"에 기재된 바와 같이 측정하였다. Ad-mda7과 배합된 GA는 A549 및 H460 폐암 세포의 운동성을 현저하게 감소시켰다. 도시된 데이타는 3회의 독립된 실험을 나타낸다.
도 7은 17AAG가 사람 폐암 세포에서 아데노바이러스성 mda-7 매개된 세포 사멸을 증가시킴을 나타낸다. Ad-mda7, Ad-luc, 17AAG, Ad-mda7과 17AAG 및 Ad-luc와 17AAG 처리 후 A549 및 H460 세포에서의 아폽토시스의 유동 세포측정 분석. 각 세포주에 대해 실험을 3회 반복 수행하였다.
도 8A 및 8B는 비타민 E 숙시네이트와 배합된 Ad-mda7 처리가 사람 난소암 세포의 성장은 억제하지만, 정상 세포의 성장은 억제하지 않음을 나타낸다. (A) 사람 난소암 세포 (MDAH 2774) 또는 (B) 정상 사람 섬유모세포 (MRC-9)를 Ad-luc (벡터 대조군), 토코페롤 (비타민 E 숙시네이트, 8μg/mL), Ad-mda7 (2000 vp/세포) 또는 이의 배합물로 처리하였다.
도 9는 Ad-luc (벡터 대조군), 토코페롤 (비타민 E 숙시네이트, 8μg/mL), Ad-mda7 (1000 vp/세포) 또는 이의 배합물로 처리한 MDAH 2774 세포에 대해, Fas에 대한 항체를 사용하는 웨스턴 블롯 분석을 수행한 결과를 나타낸다. 각 처리 조건하에 존재하는 Fas 단백질의 수준을, 미처리 세포와 비교한 Fas 단백질의 증가율(%)로서 Y축에 플롯팅하여 정량화하였다.
도 10A 내지 10C는 DOTAP:Chol-mda-7 복합체가 피하 종양의 성장을 억제함을 나타낸다. 피하 종양이 있는 (A549 또는 UV223m) 누드 마우스 및 C3H 마우스를 그룹들로 나누고 다음과 같이 매일 총 6회 투여량(50 g/투여량)으로 처리하였다: 미처리, PBS, DOTAP:Chol-LacZ 복합체 또는 DOTAP:Chol-CAT 복합체, 및 DOTAP:Chol-mda-7 복합체. (A) A549. (B) UV2237m. 각 시간 점은 각 그룹에 대한 평균 종양 용적을 나타낸다. 막대는 표준 오차를 나타낸다. (C) 피하 종양을 처리한 지 48시간 후 수집하고 MDA-7 단백질 발현을 분석하였다. DOTAP:Chol-mda-7 복합체로 처리한 종양에서, A549 종양 세포의 18% 및 UV2237m 종양 세포의 13%가 MDA-7 단백질을 생성한 반면, 대조군 종양은 MDA-7 단백질을 생성하지 않았다.
도 11은 DOTAP:Chol-mda-7 복합체로 처리 후 MDA-7이 아폽토시스성 세포 사멸을 유도함을 나타낸다. 미처리, PBS, DOTAP:Chol-LacZ 또는 DOTAP:Chol-CAT 복 합체, 또는 DOTAP:Chol-mda-7 복합체 처리한 동물로부터의 피하 종양 (A549, 및 UV2237m)을 수집하고 TUNEL 염색에 의해 아폽토시스성 세포 사멸을 분석하였다. DOTAP:Chol-mda-7 복합체로 처리한 종양에서 아폽토시스성 세포 사멸이 나타난 세포의 백분율(A549의 경우 13% 및 UV2237m의 경우 9%)은 다른 처리 그룹보다 유의하게 더 높았다(P = 0.001). 막대는 표준 편차를 나타낸다.
도 12는 DOTAP:Chol-mda-7 복합체가 종양 혈관신생을 억제함을 나타낸다. 미처리 또는 PBS, DOTAP:Chol-LacZ 또는 DOTAP:Chol-CAT 복합체, 또는 DOTAP:Chol-mda-7 복합체로 처리한 피하 종양 (A549, 및 UV2237m)을 CD31에 대해 염색하고 반정량 분석을 수행하였다. CD31-포지티브 내피 염색량은, 다른 처리 그룹의 종양보다 DOTAP:Chol-mda7-처리된 종양에서 유의하게 더 낮았다(P=0.01). 막대는 표준 편차를 나타낸다.
도 13은 DOTAP:Chol-mda-7 복합체가 실험적 폐 전이를 억제함을 나타낸다. 폐 종양 (A549, UV2237m)이 있는 nu/nu 또는 C3H 마우스를 매일 총 6회 투여량 (50 μg/투여량)의 PBS, DOTAP:Chol-CAT 복합체 또는 DOTAP:Chol-mda-7 복합체로 처리하였다. 전이 종양 성장은, 두 가지 대조군 그룹의 경우에 비해 DOTAP:Chol-mda-7 복합체로 처리한 누드 마우스 및 C3H 마우스 둘 다에서 유의하게 억제되었다 (P = < 0.05). 막대는 표준 편차를 나타낸다.
도 14는 난소암 세포의 화학감작화를 나타낸다. Ad-luc 및 탁솔 또는 Ad-mda7 및 탁솔로 처리한 세포는 다른 처리 그룹에 비해 성장 억제를 나타내었다. 그러나, 부가적 내지 상승적인 유의적 성장 억제는 Ad-mda7 및 탁솔로 처리한 세포 에서만 관찰되었다 (P= <0.05). 실험은 삼중 웰에서 수행하였고 결과를 2회의 개별적인 실험의 평균값으로서 나타내었다. 막대는 표준 오차를 나타낸다.
도 15는 Ad-mda7이 유방 종양 세포 성장은 선택적으로 억제하지만 정상 세포의 성장은 억제하지 않음을 나타낸다. 세포주, p53 돌연변이 상태 (m: 돌연변이형; wt: 야생형) 및 IC50(삼중수소화 티미딘 검정 기준으로 50% 성장 억제에 필요한 벡터의 농도) 값에 대한 요약이 대조군 벡터 (*: Ad-luc 또는 Ad-부재 (Ad-empty))와 비교하여 Ad-mda7에 대해 나타나 있다. #.: Ad-대조군에 대한 IC50으로 나눈 Ad-mda7에 대한 IC50의 비로서 평가된 선택성 지수(S.I).
도 16A 내지 16E는 MDA-7이 PKR을 유도하고 종양 세포에 세포독성임을 나타낸다. (A) 2000 vp/세포의 MOI에서 Ad-mda7 (mda-7) 또는 Ad-luc (luc)로 처리한 MCF-7 및 MDA-MB-453 세포의 웨스턴 블롯 분석. MDA-7 단백질이 Ad-mda7-처리된 세포에는 존재하지만 대조군-처리된 세포에서는 존재하지 않았다. PKR 단백질이 MDA-7에 의해 유도된다. β-액틴은 동등한 단백질 로딩을 입증하기 위한 대조군이다. (B) Ad-mda7을 사용한 유방 암종 세포의 처리는 시험관내에서 종양 세포 성장을 억제한다. 삼중수소화 티미딘 검정을 T47D; MDA-MB-361; MCF-7; BT-20에서 수행하고; 세포를 Ad-mda7 또는 Ad-luc (0 내지 10,000 vp/세포; 0 내지 500 pfu/세포)로 4일 동안 처리한 후, 3H-티미딘 흡수로 성장을 모니터링하였다. 데이타는 평균값+SD로서 나타낸다. (C) MDA-7은 G2/M 세포 정지(arrest)를 나타낸다 (화살표). Ad-mda7, Ad-luc, 또는 비이클 대조군으로 형질도입된 종양 세포를 PI 및 유동 세포측정을 사용하여 세포 주기를 분석하였다. (D) Ad-mda7은 투여량- 및 시간-의존적 방식으로 종양 세포 사멸을 유도한다. Ad-mda7 또는 Ad-luc로 형질도입된 MDA-MB-453 세포를 형질도입 24 내지 72시간 후 트리판 블루 염색에 의해 분석하였다. 결과를 세포 사멸율(%) 대 벡터 투여량 및 시간으로서 나타내었다. 데이타는 평균값+SD로서 플롯팅하였다. (E) Ad-mda7은 HMEC 세포에서 세포 사멸을 유도하지 않는다. 세포를 Ad-mda7 또는 Ad-luc로 형질도입하고 4일 후 트리판 블루 염색으로 분석하였다. 결과는 세포 사멸율(%) 대 투여량 (0 내지 10,000 vp/세포)으로서 나타내었다. 데이타는 평균값+SD로서 플롯팅하였다.
도 17A 내지 17C는 Ad-mda7이 유방암 세포에서 아폽토시스를 유도함을 나타낸다. (A) 유방 종양 주를 Ad-mda7 또는 Ad-luc로 3일 동안 처리하고 안넥신 V를 사용하여 아폽토시스를 분석하였다. * p<0.01. 데이타는 평균값+SD로서 플롯팅하였다. (B) MDA-7은 T47D 세포에서 BAX를 유도한다. T47D 세포를 2000 vp/세포의 Ad-luc 또는 Ad-mda7으로 처리하고 분해물의 MDA-7 및 BAX 발현을 평가하였다. ZVAD를 사용한 처리는 아폽토시스를 감소시키지만 MDA-7 또는 BAX는 감소시키지 않았다. (C) MDA-7은 유방 암종 세포에서 아폽토시스-관련된 단백질을 유도한다. MDA-MB-468 세포를 Ad-mda7, Ad-luc로 처리하거나 미처리(UT)하였다. 세포 분해물을 카스파제 3, PARP, 및 MDA-7에 대한 항체로 검침하였다. 베타-액틴(β-액틴)이 동등한 단백질 로딩을 입증하기 위한 내부 대조군으로서 사용되었다.
도 18A 내지 18D는 Ad-mda7이 유방 종양 이종이식물의 성장을 억제함을 나타낸다. 유방암 세포: MCF-7 (A), MDA-MB-468 (B), 및 MDA-MB-361 (C)를 사용하여 누드 마우스에서 종양 형성을 유도하였다. 이어서, 종양에 Ad-mda7, Ad-luc 또는 PBS를 주사하여 이들을 성장시켰다. 결과는 종양 용적 (단위: mm3) 대 시간(단위: 일)으로 나타내었다. * MCF-7 및 MB-361의 경우 p<0.002 ; MB-468의 경우 p<0.004. (D) Ad-mda7은 MDA-MB-468 유방암 이종이식물에서 아폽토시스를 유도한다. 종양을 누드 마우스에서 확립시키고 PBS, Ad-Luc, 또는 Ad-mda7을 주사한 다음 24시간 후 수집하고 포르말린 속에 고정시켰다. 파라핀 매립된 영역을 MDA-7 단백질 또는 PKR 단백질에 대한 항체를 사용하여 면역조직화학 분석을 수행하였다. Ad-mda7 처리된 종양에서, MDA-7 및 PKR 발현 (블루 염색된 세포)의 유의적 증가가 관찰되었다. Ad-mda7 처리된 종양은 또한 높은 수준의 TUNEL 신호를 나타내었다 (화살표). 대조군 종양은 MDA-7 발현, PKR 유도 또는 아폽토시스를 나타내지 않았다.
도 19는 Ad-mda7이 다중 모델에서 유방 종양 성장을 유의적으로 억제함을 나타낸다. 종양 모델 및 p53 상태가 나타나 있다.
도 20A 및 20B는 Ad-mda7이 타목시펜과 배합되는 경우 상승적임을 나타낸다. (A) 타목시펜과 배합된 Ad-mda7 또는 Ad-부재로 처리된 T47D 세포의 성장 억제. 세포를 Ad 벡터 (0 내지 1000 vp/세포) 및 증가하는 투여량의 타목시펜 (0 내지 2 μg/mL)으로 3일 동안 처리하고 세포 증식을 분석하였다. (B) 단일요법으로서의 또는 타목시펜 1 μg/ml와 배합된 Ad-mda7 또는 Ad-luc로 처리된 MCF-7 및 T47D 세포. 데이타는 평균값+SD로서 나타내었다.
도 21A 및 21B는 탁소테레 및 Ad-mda7의 배합 처리가 유방암 세포 성장을 억제함을 나타낸다. 도시한 바와 같이, 유방암 세포주 (A) T47D 및 (B) MCF-7를 Ad-mda7 또는 Ad-luc (0 내지 2000 vp/세포), 및 탁소테레 (0 내지 2 ng/mL)로 처리하였다. 3일 후, 3H-티미딘 흡수를 사용하여 증식을 검정하였다. 데이타는 평균값+SD로서 나타내었다.
도 22A 내지 22D는 Ad-mda7과 아드리아마이신 또는 헤르셉틴과의 배합 처리가 종양 세포 성장을 억제함을 나타낸다. 도시된 바와 같이, (A) T47D 및 (B) MCF-7 유방 암종 세포주를 Ad-mda7 또는 Ad-luc 및 아드리아마이신 (0 내지 1 ng/mL)으로 처리하였다. 3일 후, 3H-티미딘 흡수를 사용하여 증식을 검정하였다. 데이타는 평균값+SD로서 나타내었다. (C) 단일요법 (대조군)으로서의 또는 탁소테레, 아드리아마이신 또는 헤르셉틴과 배합된 Ad-mda7 (M) 또는 Ad-luc (L)로 처리된 MDA-MB-453 세포로부터의 분해물의 웨스턴 분석. 블롯은 p53 및 BCL-2 패밀리 구성원에 대한 항체를 사용하여 검침하였다. 투불린 염색을 사용하여 동등한 로딩을 입증하였다. (D) Ad-mda7은 Her2+ 세포에서 헤르셉틴과 상승작용을 한다. 나타낸 바와 같이, 대조군 (UT); 1 μg/ml 헤르셉틴 (H); 2000 vp/세포 Ad-luc (L); Ad-mda7 (M) 또는 배합물을 사용한 3일 동안의 처리 후 MDA-MB-453 (Her2+) 및 MCF-7 (Her2-) 유방 종양 세포에서 트리판 블루 염색에 의해 세포 사멸을 측정하였다. 데이타는 평균값+SD로서 나타내었다.
도 23은 Ad-mda7이 화학요법과 병용되는 경우 상이한 아폽토시스 조절제를 조정함을 나타낸다. MDA-MB-453 세포를, 나타낸 치료제와 조합된 Ad-mda7, Ad-luc (2000 vp/세포) 또는 벡터로 처리하였다. 세포 분해물을 p53; BCL-2; BCL-XL; BAX에 대한 항체를 사용하여 면역블롯팅하고 투불린을 사용하여 정상화하였다. Ad-mda7 분해물에서의 신호를 상응하는 Ad-luc 처리와 비교하였다. ↓: Ad-luc 대 조군에 비해 감소된 발현; ↑: Ad-luc 대조군에 비해 증가된 발현; -: Ad-mda7 또는 Ad-luc 간에 차이가 없음; n.s.: 신호가 없음.
도 24A 및 24B는 Ad-mda7과 방사선요법의 병용 연구를 나타낸다. (A) Ad-mda7과 방사선(RT)과의 병용은 클론형성 검정에서 세포 생존을 감소시킨다. MDA-MB-468 유방암 세포를 2000 vp/세포에서 RT, Ad-부재 또는 Ad-mda7로 처리하고; 감염 48시간 후 세포를 방사선 조사하고 (0, 2, 또는 4 Gy), 클론형성 검정으로 평가하였다. Ad-mda7과 방사선 요법의 병용은 대조군 처리에 비해 유방암 세포에서의 콜로니 형성을 상승적으로 억제하였다. (B) 방사선 요법 (RT) 및 Ad-mda7의 병용은 생체내에서 유방암 성장을 현저하게 감소시킨다. MDA-MB-468 유방암 종양이 약 100 mm3에 도달하는 경우, 동물을 6개 처리 그룹 (각 그룹에서 n=5 마리); PBS, Ad-luc, Ad-luc + RT, RT, Ad-mda7 및 Ad-mda7 + RT로 나누었다. 재조합 아데노바이러스를 격일로 2x1010vp/ml의 투여량으로 종양내 주사에 의해 총 3회 전달하였다. 3번째 주사한 지 24시간 후, 5 Gy의 단일 조사량을 뒷다리에 조사하였다. 종양을 두 가지 칫수의 측정에 의해 성장을 평가하고 종양 용적을 기록하였다. 처리 그룹 간 종양 크기에 현저한 차이가 있었다. Ad-mda7 단일요법은 RT 단독 또는 Ad-luc/RT보다 더 큰 종양 성장 억제를 나타내었다. 가장 현저한 성장 억제는 XRT 및 Ad-mda7의 배합물로 처리된 동물에서 나타났다. *: p<0.002
도 25는 Ad-mda7 벡터 감염된 유방암 세포가 IL-24 단백질을 발현하여 세포를 사멸시킴을 나타낸다. 나타낸 바와 같이 MDA-MB231 및 MDA-MB453를 다양한 양의 Ad-mda7 또는 Ad-luc로 72시간 동안 형질도입하였다. 트리판 블루 배제 검정에 의한 세포 계수 결과를, 3회 반복 샘플을 사용한 2회의 독립적인 실험의 평균값+SD로서 플롯팅하였다. ** Ad-luc와 비교하여 p<0.01.
도 26은 Ad-mda7이 세포 주기 정지 및 아폽토시스를 유도함을 나타낸다. (A) 나타낸 바와 같이 MDA-MB453 세포를 Ad-mda7 또는 Ad-luc로 형질도입하였다. 세포를 72시간 배양 후 FACS 검정에 의해 분석하였다. 도면은 PI 염색된 세포 분포를 나타낸다. 화살표는 G2/M 세포 수를 나타내며 이는 대조군 또는 Ad-luc 처리된 세포보다 유의적으로 더 많은 것이다 (p<0.05). 결과를 2회의 독립적인 실험의 평균값+SD로서 플롯팅하였다. (B) 5000 vp/세포의 Ad-mda7 또는 Ad-luc를 MDA-MB231 및 MDA-MB453 세포에 3시간 동안 가하고 아폽토시스성 세포 백분율을 안넥신 V 분석으로 정량화하였다. *는 대조군보다 유의적으로 더 많은 아폽토시스성 세포 수를 나타낸다(p<0.05). 결과를 3회의 독립적인 실험의 평균값+SD로서 플롯팅하였다.
도 27은 IL-24 단백질이 포스포-STAT3을 활성화하고 유방암 세포의 세포 사멸을 유도함을 나타낸다. MDA-MB231 및 MDA-MB453 유방암 세포 및 MeWo 흑색종 세포 (포지티브 대조군)를 3000 vp/세포 Ad-mda7 및 나타낸 농도의 정상 마우스 IgG 또는 항-IL24 모노클로날 항체로 처리하였다. 3일 동안의 배양 후, 세포 사멸을 처리에 대해 플롯팅하였다. 데이타는 3회 반복 샘플을 사용한 2회의 독립적인 실험의 평균값+SD로서 플롯팅하였다. * Ad-mda7 매개된 사멸과 비교하여 p<0.01.
도 28A 및 28B는 유방암 세포의 Il-24 매개된 사멸이 IL-20R1을 통해 발생함을 나타낸다. (A) MDA-MB231 및 MDA-MB453 세포를 96시간 동안 단독의 또는 500 ng/ml의 나타낸 항체 (항-MDA7, 항-IL-20R1, 항-IL-22R1 또는 정상 마우스 IgG)와 배합된 30 ng/ml의 IL-24로 처리하였다. * IL-24 매개된 사멸과 비교하여 p<0.01. 데이타는 3회 반복 샘플의 평균값+SD로서 나타내었다. (B) IL-24 단백질은 MDA-MB 453 세포에서 아폽토시스를 유도한다. 각종 희석 비율의 사람 IL-24 단백질을 MDA-MB453 세포 배양 배지에 첨가하였다. IL-24의 웨스턴 블롯을 상부 패널에 나타내었다. 96시간 처리 후 세포를 수거하고 TUNEL 염색을 사용하여 아폽토시스성 세포 수를 측정하였다.
도 29는 IL-10이 IL-24의 사멸 활성을 억제함을 나타낸다. (A) MDA-MB231 및 MDA-MB453 세포를 30 ng/ml의 IL-10, IL-19, IL-20, IL-22 또는 IL-24로 96시간 동안 처리하였다. 트리판 블루 배제 검정에 의한 세포 계수 결과를 3회 반복 샘플을 사용한 2회의 독립적인 실험의 평균값+SD로서 플롯팅하였다. * IL-10과 비교하여 p<0.01. (B) MDA-MB231 및 MDA-MB453 세포를 30 ng/ml의 IL-24 또는 증가하는 농도의 IL-10 (0 내지 300 ng/ml) 또는 변성된 비등시킨 IL-10과 배합된 IL-24로 처리하였다. * p<0.05는 IL-24 단독에 비해 세포 사멸을 유의적으로 억제함을 나타낸다. 데이타는 3회 반복 샘플을 사용한 2회의 독립적인 실험의 평균값+SD로서 나타내었다.
도 30A 및 30B는 MDA-7/IL-24가 폐 종양 세포에서 VEGF를 억제함을 나타낸다. 폐 종양 세포를 PBS, Ad-Luc, 또는 Ad-mda7로 처리하였다. 세포 및 배지 상청액을 처리한 지 72시간 후 수집하고 외인성 MDA-7 단백질 발현, 웨스턴 블롯팅에 의해 세포 분해물로부터의 VEGF 및 ELISA에 의해 상청액 중의 VEGF를 분석 하였다. (A) MDA-7 및 VEGF 발현 PBS- Ad-luc- 및 Ad-mda7-처리된 세포. β-액틴을 내부 로딩 대조군으로서 사용하였다. (B) ELISA에 의해 측정되고 PBS에 대한 억제율(%)로서 표시된 VEGF 발현.
도 31A 및 31B는 MDA-7-매개된 VEGF 억제가 종양 세포 사멸과 독립적임을 나타낸다. 종양 세포를 PBS, Ad-Luc, 또는 Ad-mda7 (1000 vp/세포)로 처리하였다. (A) 세포를 처리 후 다양한 시점에서 수집하고 세포 생존능력을 측정하였다. 24 내지 72시간 동안 3가지 처리 그룹에서 유의적 종양 세포 억제는 관찰되지 않았다. (B) 처리 후 48시간 및 72시간에 배지 상청액 분석에 의하면 VEGF 수준이 Ad-luc 처리에 비해 Ad-mda7-처리된 상청액에서 감소하였다. Ad-mda7에 의한 VEGF의 억제는 세포 생존능력 검정에서 관찰된 바와 같이 세포 사멸과는 독립적인 것으로 관찰되었다.
도 32는 MDA-7-매개된 VEGF 억제가 Src를 억제함으로써 발생함을 나타낸다. 종양 세포를 PBS, Ad-Luc, 또는 Ad-mda7로 처리하고 수집한 후 실시예 8에 기재한 바와 같이 Src 키나제 활성의 발현을 분석하였다. Ad-mda7에 의한 Src 키나제의 억제는 PBS 및 Ad-luc 처리된 세포에서의 Src 활성에 비해 현저히 증가하였다.
도 33은 종양 세포에서 MDA-7-매개된 VEGF 억제가 내피 세포 증식 및 세포 신호전달에 영향을 미침을 나타낸다. (A) PBS, Ad-luc, 또는 Ad-mda7로 처리된 H1299 세포로부터의 조절된 배지를 처리 후 48시간에 수집하고 과량의 항-MDA7 중성화 항체 (10 μg/ml), 또는 재조합 사람 VEGF165 단백질 (50 ng/ml)의 존재 또는 부재하에 HUVEC에 첨가하였다. 트리판 블루 검정에 의해 세포 증식 및 실시예 8에 기재한 바와 같이 웨스턴 블롯팅에 의해 VEGFR2 신호전달을 분석하였다. Ad-mda7-처리된 H1299 세포로부터의 조절된 배지는 PBS- 및 Ad-luc 처리된 세포로부터의 조절된 배지에 비해 HUVEC 증식을 유의적으로 억제하였다. (B) 5, 10 및 60분에 HUVEC에서 VEGF 수용체 신호전달의 다운스트림 표적, VEGFR2 및 pAKT에 대한 분석은 PBS- 및 Ad-luc-처리된 종양 세포로부터의 조절된 배지로 처리된 HUVEC에서 VEGFR2 및 AKT이 활성화됨을 보여주었다. 그러나, 항-MDA7 중성화 항체의 존재 또는 부재하에 Ad-mda7-처리된 종양 세포로부터의 배지로 처리된 HUVEC에서 VEGFR2 및 AKT 활성화는 관찰되지 않았다. HUVEC에서의 VEGFR2 및 AKT 활성화는, rhVEGF 단백질을 Ad-mda7-처리된 종양 세포로부터의 조절된 배지에 첨가하는 경우 회복되었다.
도 34는 베비시주마브는 내피 세포 증식을 억제하지만, MDA-7는 내피 세포 증식을 억제하지 않음을 나타낸다. 종양 (H1299) 세포 및 내피 (HUVEC) 세포를 PBS, Ad-luc, Ad-mda7, 아바스틴, Ad-luc와 아바스틴 또는 Ad-mda7과 아바스틴으로 처리하였다. 세가지 상이한 농도의 아바스틴을 Ad-luc 또는 Ad-mda7과 배합하여 시험하였다. 세포를 처리 후 48시간 및 72시간에 수집하고 트리판 블루 배제 검정에 의해 세포 생존능력을 평가하였다. 종양 세포의 경우, 어떠한 처리 그룹에서도 유의적 억제는 관찰되지 않았다. 그러나, 내피 세포의 경우, 아바스틴, Ad-luc와 아바스틴 및 Ad-mda7과 아바스틴으로 처리된 세포에서 유의적 억제가 관찰되었다. 그러나, 가장 큰 억제는 내피 세포가 투여량-의존적 방식으로 Ad-mda7 및 아바스틴으로 처리된 경우에 관찰되었다.
도 35는 종양 세포에서 MDA-7과 아바스틴의 배합물에 의한 VEGF 억제가 내피 세포 증식에 영향을 미침을 나타낸다. PBS, Ad-luc, Ad-mda7, 아바스틴, Ad-luc와 아바스틴 또는 Ad-mda7과 아바스틴으로 처리된 H1299 세포로부터의 조절된 배지를 처리 후 48시간에 수집하고 HUVEC에 가하였다. "Materials and Methods"에서 트리판 블루 검정에 의해 세포 증식을 분석하였다. Ad-mda7-, 아바스틴-, Ad-luc와 아바스틴- 및 Ad-mda7과 아바스틴으로 처리된 H1299 세포는 PBS- 및 Ad-luc 처리된 세포로부터의 조절된 배지에 비해 HUVEC 증식을 유의적으로 억제하였다. 그러나, 억제 효과는 HUVEC가 Ad-mda7과 아바스틴으로 처리된 종양 세포로부터의 조절된 배지로 처리된 경우에 가장 크게 나타났다.
도 36은 Ad-mda7과 아바스틴의 배합물이 생체내에서 VEGF를 유의적으로 감소시켰음을 나타낸다.
도 37은 MDA-7과 아바스틴의 배합물이 생체내에서 종양 성장을 억제함을 나타낸다. H1299 종양 세포 (5x106)를 주사함으로써 누드 마우스에 피하 H1299 종양 세포를 확립시켰다. 동물들을 그룹들로 나누고 (n = 8/그룹) 다음과 같이 처리하였다: PBS, Ad-luc, Ad-mda7, 아바스틴, Ad-luc과 아바스틴, 및 Ad-mda7과 아바스틴. Ad-mda7 또는 Ad-luc (1x1010 vp/주사)를 종양내 주사하고 아바스틴 (5mg/Kg)을 복강내 주사하였다. 처리는 매주 2회씩 4주 동안 수행하고 종양 크기를 매주 3회 측정하였다. 실험 종료시 동물을 안락사시키고 종양을 분리하여 면역조직화학적 분석 및 웨스턴 블롯팅을 수행하였다. 다른 처리 그룹에 비해 Ad-mda7과 아바스틴의 배합물로 처리한 마우스에서 유의적인 종양 성장 억제가 관찰되었다. 또한, PBS 또는 Ad-luc로 처리한 마우스로부터의 종양에 비해 Ad-mda7-, 아바스틴- 및 Ad-luc와 아바스틴의 배합물-처리된 마우스에서 유의적인 종양 성장 억제가 관찰되었다. 어떠한 처리 그룹에서도 체중의 유의적 감소는 관찰되지 않았다 (28일까지 측정).
도 37은 Ad-mda7과 TNF-α의 배합 처리가 종양 세포 증식을 억제함을 나타낸다. 전립선 종양 (LNCaP) 종양 세포를 PBS (P), TNF-α (T), Ad-Luc (L), Ad-mda7 (M), Ad-luc와 TNF (L+T) 또는 Ad-mda7과 TNF (M+T)로 처리하였다. 바이러스 처리는 1500 vp/세포, TNF 처리는 5 ng/ml로 수행하였다. 처리한 지 48시간 및 72시간 후에 세포에 XTT 검정을 수행하여 세포 생존능력을 측정하였다. Ad-mda7과 TNF의 배합물로 처리된 세포는 다른 처리 그룹에 비해 유의적인 성장 억제를 나타내었다.
도 38은 TNF-α가 형질도입 효율을 증가시킴을 나타낸다. 종양 (LNCaP) 세포를 TNF-α (10ng/ml)의 존재 또는 부재하에 100, 300, 600 및 1200 vp/세포의 Ad-GFP로 처리하였다. 미처리 세포를 대조군으로 하였다. TNF-α 처리한 지 48시간 후, 세포를 수집하고 PBS로 3회 세척한 다음 500 ul PBS에 재현탁시키고 FACS 분석을 수행하였다. Ad-GFP 단독 처리된 세포는 형질도입 효율이 100 vp/세포의 Ad-GFP의 경우 73.5%로부터 출발하여 투여량-의존적으로 증가하였다. 그러나, TNF-α의 존재하에 형질도입 효율은 증가하고 100 vp/세포의 Ad-GFP에 대해 92.8%인 것으로 관찰되었다. 형질도입의 증가는 TNF-α의 존재하에 300 vp/세포의 Ad-GFP로부터 포화되는 것 같다.
도 39는 Ad-mda7과 TNF-α의 배합 처리가 SubG0/G1 단계에서 세포 개수를 증가시킴을 나타낸다. 종양 (LNCaP) 세포 PBS (P), TNF-α (T; 10 ng/ml), Ad-Luc (L; 1500 vp/세포), Ad-mda7 (M; 1500 vp/세포), Ad-luc와 TNF (L+T), Ad-mda7과 TNF (M+T), Ad-luc와 항-TNF 항체(L+A; 1ug/ml) 또는 Ad-mda7과 항-TNF 항체(M+A)로 처리하였다. 처리한 지 48시간 후, 세포를 수집하고 PBS로 3회 세척한 후 프로피디움 요오다이드를 함유하는 500 ul의 PBS에 재현탁시켰다 (0.5ug/ml). 세포를 FACS 분석하였다. Ad-mda7과 TNF로 처리된 상당수의 세포(70%)가 SubG0/G1 단계에서 관찰된 아폽토시스성 세포이고, 반면에 다른 처리 그룹은 0.45% 내지 26.3%의 범위로 나타났다.
A. MDA-7 조성물
본 발명의 조성물 및 방법은 MDA-7 폴리펩티드 및 당해 폴리펩티드를 암호화하는 핵산을 사용한다. MDA-7은 p53-야생형, p53-부재(null) 및 p53-돌연변이인 암 세포의 성장을 억제하는 것으로 나타난 종양 억제제이다. 또한, p53 부재 세포에서 아폽토시스-관련된 B 유전자의 상향조절이 관찰된 것은 MDA-7이 p53-독립적 메카니즘을 사용하여 암 세포의 파괴를 유도할 수 있음을 나타낸다.
B. MDA-7
Mda-7 mRNA는 사람 PBMC에서 동정되었고 (Ekmekcioglu et al., 2001), 사람 MDA-7 단백질의 시토킨 기능은 보고되지 않았다. MDA-7은 유전자 및 단백질 서열 특징을 기준으로 하여 IL-24로서 지정되었다 (NCBI 데이타베이스 기탁번호 XM_001405). 마우스의 MDA-7 단백질 동족체 FISP (IL-4-유도 분비된 단백질)가 Th2 특이적 시토킨으로서 보고되었다 (Schaefer et al., 2001). FISP의 전사는 녹아웃(knockout) 연구에 의해 입증된 바와 같이 TCR 및 IL-4 수용체 결합 및 이후의 PKC 및 STAT6 활성화에 의해 유도된다. FISP의 발현이 특징화되었지만, 당해 추정의 시토킨에 어떠한 기능도 부여되지 않았다 (Denkert et al., 2004). 래트 MDA-7 동족체 C49a (Mob-5)는 mda-7 유전자에 대해 78% 상동성이고 상처 치료에 관련되어 있다 (Soo et al. 1999; Zhang et al., 2000). Mob-5는 또한 분비된 단백질인 것으로 나타났고 추정의 세포 표면 수용체가 ras 형질전환된 세포 상에서 동정되었다 (Zhang et al., 2000). 따라서, MDA-7 유전자 및 분비된 MDA-7 단백질의 동족체가 다양한 종에서 발현 및 분비된다. 그러나, MDA-7가 시토킨 활성을 갖는다는 것을 보여주는 데이타는 없었다. 이러한 활성은 항원의 면역원성을 향상시킴으로써 광범위한 다양한 질병 및 감염의 치료를 세분화한다.
사람 mda-7 cDNA (서열번호 1)는 206개 아미노산의 진화론적으로 보존된 단백질(서열번호 2)을 암호화하며, 이의 예상 크기는 23.8 kDa이다. 추론된 아미노산 서열은 대략 아미노산 26 내지 45로부터의 소수성 스트레치를 함유하며, 이는 신호 서열의 특징을 갖는다. 구조적 데이타의 조합, 공지된 시토킨에 대한 상동성, 염색체 위치결정, 예상 N-말단 분비 신호 펩티드 및 시토킨 분비에 대한 이의 조절의 증거 모두 MDA-7/IL-24가 IL-10 패밀리 시토킨으로서 분류됨을 뒷받침한다 (참조: Chada et al., 2004 review). 49 아미노산 리더 서열은 이를 분비된 단백질로서 확인한다. 최근 연구에 의하면 이것이 확인되며 Ad-mda7 형질도입된 세포가, 이형이량체 수용체 IL-20R1/IL-20R2 및 IL-22R2/IL-20R1에 결합할 수 있는 40 kDa 형태의 MDA-7 단백질을 다량 방출하는 것으로 보고되고 있다. 세포내 형태인 당해 단백질 (23 내지 30 kDa)이 분해되고 광범위하게 변성된 후 (주로 글리코실화에 의함) 세포외 부분으로 방출된다 (참조: Chada et al., 2004 review, 본원에 참고로 인용됨).
일차성 및 전이성 흑색종에 비해 정상 멜라닌 세포에서 mRNA 수준이 증가된 것 뿐만 아니라 누드 마우스에서 향상된 종양 형성을 위해 선택된 초기 수직 성장 단계 흑색종 세포에서 MDA-7 발현이 감소된 것에 의해 입증된 바와 같이, MDA-7의 발현은 흑색종 진행과 반비례 관계를 갖는다. 보고에 의하면, MDA-7은 종양 세포 아폽토시스 활성을 갖는 IL-10 패밀리 시토킨이고 이것이 유도하는 세포독성 효과는 종양 세포에 특이적이다 (참조: Chada et al., 2004 review). 몇몇 연구에서 mda-7의 아폽토시스 활성을 매개하는 신호전달 경로를 조사하였다. 이들은 다중의, 세포-유형 특이적인 것 같고 단백질의 세포내 형태 및 분비된 형태에 의해 유도된 효과(방관자 효과)를 포함한다 (참조: 본원에 참고로 인용된 USN 10/791,692). MDA-7에 관한 추가의 정보 및 데이타는 문헌에 기재되어 있다(미국 특허원 09/615,154, 10/017,472, 10/378,590, 및 10/791,692, 이들 모두 전문이 본원에 참고로 인용됨).
추가의 연구에 의하면, MDA-7의 상승된 발현이 시험관내에서 암 세포 성장을 억제하고 사람 유방암 세포에서 아폽토시스를 선택적으로 유도할 뿐만 아니라 누드 마우스에서 종양 성장을 억제하였다 (Jiang et al., 1996 and Su et al., 1998). Jiang 등(1996)은 MDA-7이 유방, 중추신경계, 자궁경부, 결장, 전립선 및 연결 조직을 포함하는 다양한 기관의 암 세포에서 강력한 성장 억제 유전자라는 것을 밝혔다. 콜로니 억제 검정을 사용하여, MDA-7의 발현 증가가 사람 자궁경부 암종 (HeLa), 사람 유방 암종 (MCF-7 및 T47D), 결장 암종 (LS174T 및 SW480), 코인두 암종 (HONE-1), 전립선 암종 (DU-145), 흑색종 (HO-1 및 C8161), 다형성아교모세포종 (GBM-18 및 T98G), 및 골육종 (Saos-2)의 성장 억제를 증가시킴을 입증하였다. 정상 세포 (HMECs, HBL-100, 및 CREF-Trans6)에서의 MDA-7 과발현은 제한된 성장 억제를 나타냈고, 이는 mda-7 유전자도입 효과가 정상 세포에서는 명백하지 않음을 나타낸다. 이들 모두를 고려하면, 데이타는 MDA-7의 발현 증가에 의한 성장 억제가 시험관내에서 정상 세포보다는 암 세포에서 효과적임을 나타낸다.
Su 등(1998)은 MDA-7이 암 세포 성장을 억제하는 메카니즘에 대한 연구를 보고하였다. 이 연구에 의하면, 유방암 세포주 MCF-7 및 T47D에서 MDA-7의 전위(ectopic) 발현이 세포 주기 분석 및 TUNEL 검정에 의해 검출된 바와 같이 아폽토시스를 유도하되, 정상 HBL-100 세포에는 영향을 미치지 않았다. 아데노바이러스 mda-7 ("Ad-mda7")로 감염된 세포로부터의 세포 분해물에 대한 웨스턴 블롯 분석은 아폽토시스 촉진 단백질인 BAX의 상향조절을 보여주었다. Ad-mda7 감염은 BAX 단백질의 수준을 MCF-7 및 T47D 세포에서만 상승시키고, 정상 HBL-100 또는 HMEC 세포에서는 상승시키지 않았다. 당해 데이타는 연구자들이 MCF-7 종양 세포의 이종이식 종양 형성에 대한 생체외 Ad-mda7 형질도입의 영향을 평가하도록 유도하였다. 생체외 형질도입은 종양 이종이식 모델에서 종양 형성 및 진행을 억제하였다.
유전자 요법을 사용하여 암을 치료하는 주요 방식은 아폽토시스의 유도이다. 이는 암 세포를 다른 제제에 감작화시키거나, 세포내 경로를 촉진시켜 직접 아폽토시스를 유도함으로써 달성된다. 다른 암 요법은 종양이 성장하는 종양에 필요한 영양분을 공급하기 위해 혈관신생을 유도해야 한다는 것을 이용한다. 엔도스타틴 및 안지오스타틴은 두가지 이러한 요법의 예이다 (WO 00/05356 및 WO 00/26368).
이들 작제물의 작동성(operability)과 관련하여 특정 이론에 얽매이지 않더라도, 수용체 결합과 관련된 C-말단에 위치하는 D-나선형 영역에서 IL-10에 대한 mda-7의 현저한 아미노산 상동성이 종들에 존재한다. 따라서, 바람직하게는 당해 30 내지 35 아미노산 영역을 포함하는 분자가 특히 바람직하다.
따라서, 본 발명의 한 양태에서, 혈관신생-관련된 질병의 치료는 치료학적 펩티드 또는 폴리펩티드의 투여를 포함한다. 또 다른 양태에서, 치료는 mda-7을 암호화하는 핵산 발현 작제물을 질병 세포 또는 내피세포를 포함하는 표적에 투여함을 포함한다. 표적 세포가 작제물을 흡수하고, 핵산에 의해 암호화되는 치료학적 폴리펩티드를 발현시켜 표적 세포에서의 분화를 억제한다고 생각된다. 또한 MDA-7을 발현하는 세포는, 발현 작제물에 의해 형질도입 또는 감염되지 않은 주변 세포와 상호작용할 수 있는 단백질을 분비할 수 있다. 이러한 방식으로, 종양을 위한 새로운 혈관을 확립하는 데 필요한 복합 상호작용이 억제되고 종양이 치료된다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 혈관신생-관련된 질병이 MDA-7 또는 이를 발현하는 작제물을 사용하여 치료될 수 있다고 생각된다. 본 발명에서 치료용으로 고려되는 혈관신생-관련된 몇몇 질병은 건선, 류마티스성 관절염 (RA), 염증성 장 질환 (IBD), 골관절염 (OA) 및 폐의 전암(pre-neoplastic) 병변이다.
또 다른 양태에서, 광범위한 각종 암 상태의 치료는 본 발명의 범위 내에 존재한다. 예를 들면, 흑색종, 비-소형 세포 폐, 소형 세포 폐, 폐, 간암종(hepatocarcinoma), 망막모세포종, 성상세포종, 아교모세포종, 백혈병, 신경모세포종, 두부, 경부, 유방, 췌장, 전립선, 신장, 골, 고환, 난소, 중피종, 자궁경부, 위장관, 림프종, 뇌, 결장 또는 방광이다. 보다 더 바람직한 양태에서, 당해 혈관신생-관련된 질병은 류마티스성 관절염, 염증성 장 질환, 골관절염, 평활근종, 선종, 지방종, 혈관종, 섬유종, 혈관 폐색, 재협착, 동맥경화증, 전암 병변, 상피내 암종(carcinoma in situ), 구강유모백반증(oral hairy leukoplakia) 또는 건선이고 치료 대상일 수 있다. 특정 양태에서, 암은 절제 가능 또는 불가능한 종양을 포함한다. 또한, 암은 전이암(들) 또는 전이가 가능할 수 있는 종양을 포함할 수 있다.
본 발명의 방법 및 조성물로 치료할 수 있는 암 세포는 또한 방광, 혈액, 골, 골수, 뇌, 유방, 결장, 식도, 위장관, 잇몸, 두부, 신장, 간, 폐, 코인두, 경부, 난소, 전립선, 피부, 위장, 고환, 혀 또는 자궁으로부터의 세포를 포함한다. 추가로, 암은 다음의 조직학적 유형일 수 있지만, 이들로 제한되는 것은 아니다: 신생물, 악성; 암종; 미분화된 암종; 거대 및 방추 세포 암종; 소형 세포 암종; 유두 암종; 편평 세포 암종; 림프상피 암종; 기저 세포 암종; 필로매트릭스(pilomatrix) 암종; 이행 세포 암종; 유두 이행 세포 암종; 선암종; 가스트리노마, 악성; 담관암종; 간세포 암종; 조합된 간세포 암종 및 담관암종; 섬유주 선암종; 선양 낭성 암종; 선종성 폴립에서의 선암종; 선암종, 가족성 폴립증 (familial polyposis coli); 고형 암종; 카르시노이드 종양, 악성; 기관지-폐포 선암종; 유두 선암종; 혐색소성 암종; 호산 암종; 호산세포 선암종; 호염기 암종; 투명 세포 선암종; 과립 세포 암종; 소포 선암종; 유두 및 소포 선암종; 비캡슐화 경화(nonencapsulating sclerosing) 암종; 부신 피질 암종; 자궁내막양 암종; 피부 부속기관 암종; 아포크린 선암종; 피지 선암종; 귀지 선암종; 점막표피양 암종; 낭선암종; 유두 낭선암종; 유두 장액 낭선암종; 점액 낭선암종; 점액 선암종; 반지 세포 암종; 침윤 관 암종; 수질 암종; 소엽 암종; 염증성 암종; 유방의 파제트병 (paget's disease); 세엽 세포 암종; 선편평세포 암종; 선암종 w/편평상피화생; 흉선종, 악성; 난소 기질 종양, 악성; 난포막종, 악성; 과립막 세포 종양, 악성; 남성모세포종, 악성; 버팀 세포 암종; 라이디히(leydig) 세포 종양, 악성; 지방 세포 종양, 악성; 부신경절종, 악성; 유방외(extra-mammary) 부신경절종, 악성; 갈색세포종; 사구맥관육종; 악성 흑색종; 무색소성 흑색종; 표재 확장성 흑색종; 거대 색소 모반에서의 말리그(malig) 흑색종; 상피 세포 흑색종; 청색 모반, 악성; 육종; 섬유육종; 섬유조직구종, 악성; 점액육종; 지방육종; 평활근육종; 횡문근육종; 배아 횡문근육종; 폐포 횡문근육종; 기질 육종; 혼합 종양, 악성; 혼합 뮬러리안 종양 (mullerian mixed tumor); 신장모세포종; 간모세포종; 암육종; 중간엽종, 악성; 브렌너 종양 (brenner tumor), 악성; 엽상 종양, 악성; 윤활막 육종; 중피종, 악성; 미분화세포종; 배아 암종; 기형종, 악성; 난소갑상선종, 악성; 융모막암종; 중간신장암(mesonephroma), 악성; 혈관육종; 혈관내피종, 악성; 카포시 육종 (kaposi's sarcoma); 혈관주위세포종, 악성; 림프관육종; 골육종; 측피질 골육종; 연골육종; 연골모세포종, 악성; 중간엽 연골육종; 뼈의 거대 세포 종양; 유잉 육종 (ewing's sarcoma); 치원성 종양, 악성; 사기질모세포 치아육종; 사기질모세포종, 악성; 사기질모세포 섬유육종; 송과체종, 악성; 척삭종; 신경아교종 악성; 뇌실막세포종; 성상세포종; 원형질성 성상세포종; 세동 성상세포종; 성상모세포종; 아교모세포종; 핍지교종; 핍지모세포종; 원시성 신경외배엽 종양; 소뇌 육종; 신경절신경모세포종; 신경모세포종; 망막모세포종; 후각 신경성 종양; 수막종, 악성; 신경섬유육종; 신경집종, 악성; 과립 세포 종양, 악성; 악성 림프종; 호지킨병 (hodgkin's disease); 호지킨; 부육아종; 악성 림프종, 소형 림프구; 악성 림프종, 대형 세포, 확산성; 악성 림프종, 소포; 균상식육종; 다른 구체화된 비-호지킨 림프종; 악성 조직구증; 다발 골수종; 비만 세포 육종; 면역증식성 소장 질환; 백혈병; 림프양 백혈병; 혈장 세포 백혈병; 적백혈병; 림프육종 세포 백혈병; 골수성 백혈병; 호염구성 백혈병; 호산구성 백혈병; 단핵구 백혈병; 비만 세포 백혈병; 거핵아구성 백혈병; 골수성 육종; 및 털 세포 백혈병.
본 발명의 몇몇 양태에서, mda-7이 MDA-7 폴리펩티드를 발현하는 핵산으로서 제공된다. 구체적 양태에서, 핵산은 바이러스성 벡터이며, 여기서 바이러스성 벡터 용량은 적어도 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 1010, 1011, 1012, 1013, 1014, 1015 pfu 또는 바이러스 입자 또는 그 이상이다. 특정 양태에서, 바이러스성 벡터는 아데노바이러스성 벡터, 레트로바이러스성 벡터, 우두 바이러스성 벡터, 아데노-관련된 바이러스성 벡터, 폴리오바이러스성 벡터, 알파바이러스성 벡터, 랍도바이러스성 벡터, 또는 헤르페스 바이러스성 벡터이다. 가장 바람직하게는, 바이러스성 벡터는 아데노바이러스성 벡터이다. 다른 구체적 양태에서, 핵산은 비-바이러스성 벡터이다.
몇몇 양태에서, 당해 폴리펩티드를 발현하는 핵산은 프로모터에 작동가능하게 연결되어 있다. 본 발명에 적합한 프로모터의 비제한적 예는 CMV IE, 덱틴-1, 덱틴-2, 사람 CD11c, F4/80, SM22 또는 MHC 부류 II 프로모터를 포함하지만, 본원에 기재한 바와 같은 본 발명의 mda-7 유전자 또는 면역유전자의 발현을 유도하는 데 유용한 임의의 다른 프로모터가 본 발명의 실시에 적용될 수 있다고 생각된다.
바람직하게는, 본 발명의 핵산은 주사에 의해 투여된다. 다른 양태는 다중 주사에 의한 핵산의 투여를 포함한다. 몇몇 양태에서, 주사는 질병 또는 종양 부위에 대해 국소적으로, 부분적으로 또는 말단에서 수행된다. 몇몇 양태에서, 핵산의 투여는 지속적 주입, 종양내 주사, 복강내 또는 정맥내 주사를 통해 수행된다. 다른 양태에서, 핵산은 종양의 절제 전 또는 후, 또는 종양의 절제 전과 후에 종양 상(tumor bed)에 투여된다. 또한, 핵산은 화학요법, 생체요법, 면역요법, 수술 또는 방사선요법 동안 또는 그 전 또는 후에 환자에게 투여된다. 바람직하게는, 환자는 사람이다. 다른 양태에서, 환자는 암 환자이다.
C. 핵산, 벡터 및 조절 신호
본 발명은 mda-7 유전자 및 이의 유전자 생성물인 MDA-7에 관한 폴리뉴클레오티드 또는 핵산 분자에 관한 것이다. 추가로, 본 발명은 면역성 분자에 관한 폴리뉴클레오티드 또는 핵산 분자에 관한 것이다. 이들 폴리뉴클레오티드 또는 핵산 분자는 포유동물 세포로부터 분리 및 정제 가능하다. 분비된 또는 전장(full-length)의 분리 및 정제된 MDA-7 핵산 분자는 mda-7 유전자 생성물과 관련된 핵산 분자로서 RNA 또는 DNA의 형태일 수 있다고 생각된다. 본원에 사용된 용어 "RNA 전사물"은 DNA 핵산 분자로부터의 전사 생성물인 RNA 분자를 의미한다. 이러한 전사물은 하나 이상의 폴리펩티드를 암호화할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "폴리뉴클레오티드"는 전체 게놈 핵산이 포함되지 않게 분리된 핵산 분자, RNA 또는 DNA를 의미한다. 따라서, "MDA-7을 암호화하는 폴리뉴클레오티드"는 MDA-7 암호화 서열을 함유하는 핵산 단편으로서, 전체 게놈 DNA 및 단백질로부터 분리되거나 이를 정제 및 제거한 것이다. 본원에서 MDA-7-암호화 폴리뉴클레오티드 또는 핵산의 기능 또는 활성을 언급하는 경우, 폴리뉴클레오티드가 암 세포의 아폽토시스를 유도하는 능력을 갖는 분자를 암호화함을 의미한다.
용어 "cDNA"는 주형으로서 RNA를 사용하여 제조된 DNA를 의미한다. 게놈 DNA 또는 RNA 전사물과 대조적으로, cDNA 사용시의 이점은 안정성 및 재조합 DNA 기술을 사용하여 서열을 조작하는 능력이다 (참조: Sambrook, 2001; Ausubel, 1996). 전체 또는 부분 게놈 서열이 약간 있는 시점이 있을 수 있다. 또한, cDNA는, 폴리펩티드의 코딩 영역을 나타내고 인트론 및 기타 조절 영역을 제거하기 때문에 유리할 수 있다.
또한, 해당 세포로부터의 해당 MDA-7-암호화 핵산 또는 mda-7 유전자가, 약간 상이한 핵산 서열을 갖지만 그럼에도 불구하고 MDA-7 폴리펩티드를 암호화하는 천연 변이체 또는 균주에 의해 제시될 수 있다고 생각된다. 특정 경우에, 사람 MDA-7 폴리펩티드는 구체적 양태이다. 결과적으로, 본 발명은 또한 최소 아미노산 변화를 갖지만 동일한 활성을 갖는 MDA-7 유도체를 포함한다.
용어 "유전자"는 간단히 작용성 단백질, 폴리펩티드, 또는 펩티드-암호화 핵산 단위를 의미하도록 사용된다. 당업자들이 이해하는 바와 같이, 이러한 작용성 용어는 게놈 서열, cDNA 서열, 및 단백질, 폴리펩티드, 도메인, 펩티드, 융합 단백질 및 돌연변이체를 발현하거나 발현하도록 적용될 수 있는 더 작은 조작된 유전자 단편을 포함한다. MDA-7을 암호화하는 핵산 분자는 다음의 길이 또는 적어도 다음의 길이를 갖는 인접 핵산 서열, 뉴클레오티드, 뉴클레오시드, 또는 염기 쌍을 포함할 수 있다: 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 441, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600, 610, 620, 630,640, 650, 660, 670, 680, 690, 700, 710, 720, 730, 740, 750, 760, 770, 780, 790, 800, 810, 820, 830, 840, 850, 860, 870, 880, 890, 900, 910, 920, 930, 940, 950, 960, 970, 980, 990, 1000, 1010, 1020, 1030, 1040, 1050, 1060, 1070, 1080, 1090, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 2000, 2100, 2200, 2300, 2400, 2500, 2600, 2700, 2800, 2900, 3000, 3100, 3200, 3300, 3400, 3500, 3600, 3700, 3800, 3900, 4000, 4100, 4200, 4300, 4400, 4500, 4600, 4700, 4800, 4900, 5000, 5100, 5200, 5300, 5400, 5500, 5600, 5700, 5800, 5900, 6000, 6100, 6200, 6300, 6400, 6500, 6600, 6700, 6800, 6900, 7000, 7100, 7200, 7300, 7400, 7500, 7600, 7700, 7800, 7900, 8000, 8100, 8200, 8300, 8400, 8500, 8600, 8700, 8800, 8900, 9000, 9100, 9200, 9300, 9400, 9500, 9600, 9700, 9800,9900, 10000, 10100, 10200, 10300, 10400, 10500, 10600, 10700, 10800, 10900, 11000, 11100, 11200, 11300, 11400, 11500, 11600, 11700, 11800, 11900, 12000 또는 그 이상. 이러한 서열은 서열번호 1 (MDA-7 암호화 서열)과 동일하거나 상보적일 수 있다.
"다른 암호화 서열로부터 실질적으로 분리된"은 관심 대상인 유전자가 핵산 단편의 코딩 영역의 일부를 형성하고 당해 단편이 대부분의 천연 코딩 핵산, 예를 들면, 대형 염색체 파편 또는 다른 작용성 유전자 또는 cDNA 코딩 영역은 함유하지 않음을 의미한다. 물론, 이는 원래 분리된 바와 같은 핵산 단편을 나타내고, 나중에 인공적 조작에 의해 단편에 부가된 코딩 영역 또는 유전자를 제외하지는 않는다.
특정 양태에서, 본 발명은 MDA-7 표기된 "사람 MDA-7" 또는 "MDA-7 폴리펩티드"에 상응하는 서열번호 2에 따르거나 필수적으로 서열번호 2에 기재된 바와 같은 인접 아미노산 서열을 아미노산 서열 내에 포함하는 MDA-7 단백질, 폴리펩티드 또는 펩티드를 암호화하는 분리된 DNA 또는 DNA 서열이 도입된 재조합 벡터에 관한 것이다.
용어 "필수적으로 서열번호 2에 기재된 바와 같은 서열"은 서열이 서열번호 2의 일부분에 실질적으로 상응하고 서열번호 2의 아미노산과 동일하지 않거나 서열번호 2의 아미노산의 생물학적 작용성 등가물이 아닌 아미노산은 비교적 거의 없음을 의미한다.
용어 "생물학적 작용성 등가물"은 당해 분야에서 익히 알고 있으며 본원에 추가로 상세히 정의되어 있다. 따라서, 서열번호 2의 아미노산과 동일하거나 작용성 등가물인 아미노산을 약 70%, 약 71%, 약 72%, 약 73%, 약 74%, 약 75%, 약 76%, 약 77%, 약 78%, 약 79%, 약 80%, 약 81%, 약 82%, 약 83%, 약 84%, 약 85%, 약 86%, 약 87%, 약 88%, 약 89%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 또는 약 99%, 및 여기서 유도할 수 있는 범위, 예를 들면, 약 70% 내지 약 80%, 및 더욱 바람직하게는 약 81% 및 약 90%; 또는 보다 더욱 바람직하게는 약 91% 내지 약 99% 포함하는 서열은, 당해 단백질의 생물학적 활성이 아폽토시스 유도와 관련하여 유지되는 한 "필수적으로 서열번호 2에 기재된 바와 같은" 서열일 것이다. 특정 양태에서, MDA-7 단백질, 폴리펩티드 또는 펩티드, 또는 생물학적 작용성 등가물의 생물학적 활성은 면역 반응을 향상시킴을 포함한다. 몇몇 다른 양태에서, 본 발명은 필수적으로 서열번호 1에 기재된 바와 같은 핵산 서열을 서열 내에 포함하는 분리된 DNA 단편 및 재조합 벡터에 관한 것이다. 용어 "필수적으로 서열번호 1에 기재된 바와 같은"은 위에 기재한 바와 동일 의미로 사용되고, 핵산 서열이 서열번호 1의 일부분에 실질적으로 상응하고 서열번호 2의 코돈과 동일하지 않거나 이의 작용성 등가물이 아닌 코돈은 비교적 거의 없음을 의미한다. 다시, MDA-7 활성을 나타내는 단백질, 폴리펩티드 또는 펩티드를 암호화하는 DNA 단편이 본 발명의 양태에서 사용될 것이다.
특정 양태에서, 본 발명은 MDA-7 폴리펩티드에 따르거나 이에 필수적으로 상응하는 인접 아미노산 서열을 아미노산 서열 내에 포함하는 MDA-7 폴리펩티드 또는 펩티드를 암호화하는 DNA 서열이 도입된 재조합 벡터 및 분리된 핵산 단편에 관한 것이다.
본 발명의 벡터는 주로 진핵 프로모터(즉, 구조적, 유도가능한, 억제가능한, 조직 특이적)의 조절 하에 치료학적 mda-7 유전자 또는 MDA-7 암호화 핵산 서열로 세포를 형질전환하도록 고안되어 있다. 또한, 벡터는 다른 이유는 없고 시험관내에서 이들의 조작을 용이하게 하기 위해, 선택가능한 마커를 함유할 수 있다. 그러나, 선택가능한 마커는 재조합 세포 생산에서 중요한 역할을 할 수 있다.
아래의 표 1 및 2에는 본 발명에 따라 사용되는 다양한 조절 신호가 기재되어 있다.
유도성 요소
요소 유도제 참조문헌
MT II 포르볼 에스테르(TFA)
중금속		 Palmiter et al., 1982; Haslinger et al., 1985; Searle et al., 1985; Stuart et al., 1985; Imagawa et al., 1987, Karin et al., 1987; Angel et al., 1987b; McNeall et al., 1989
MMTV(마우스 유선 종양 바이러스) 글루코코르티코이드 Huang et al., 1981; Lee et al., 1981; Majors et al., 1983 ; Chandler et al., 1983; Lee et al., 1984; Ponta et al., 1985 ; Sakai et al., 1988
β-인터페론 폴리(rI)x
폴리(rc)		 Tavaernier et al., 1983
아데노바이러스 5 E2 ElA Imperiale et al., 1984
콜라게나제 포르볼 에스테르(TPA) Angel et al., 1987a
스토로멜리신 포르볼 에스테르(TPA) Angel et al., 1987b
SV40 포르볼 에스테르(TPA) Angel et al., 1987b
쥐 MX 유전자 인터페론 뉴캣슬병 바이러스 Hug et al., 1988
GRP78 유전자 A23187 Resendez et al., 1988
α-2-마크로글로불린 IL-6 Kunz et al., 1989
비멘틴 혈청 Rittling et al., 1989
MHC I형 유전자 H-2Kb 인터페론 Blanar et al., 1989
HSP70 E1A, SV40 대형 T 항원 Taylor et al., 1989,1990a, 1990b
프로리페린 포르볼 에스테르-TPA Mordacq et al., 1989
종양 괴사 인자 PMA Hensel et al., 1989
갑상선 자극 α유전자 갑상선 호르몬 Chatterjee et al., 1989
기타 프로모터 및/또는 인핸서 요소
프로모터/인핸서 참조문헌
면역글로불린 중쇄 Banerji et al., 1983; Gilles et al., 1983 ; Grosschedl et al., 1985; Atchinson et al., 1986, 1987; Imler et al., 1987; Weinberger et al., 1984; Kiledjian et al., 1988; Porton et cul. ; 1990
면역글로불린 경쇄 Queen et al., 1983; Picard et al., 1984
T-세포 수용체 Luria et al., 1987; Winoto et al., 1989; Redondo et al. ; 1990
HLA DQ α 및/또는 DQ β Sullivan et al., 1987
β-인터페론 Goodbournet aL, 1986 ; Fujitan et al., 1987; Goodbourn et al., 1988
인터류킨-2 Greene et al., 1989
인터류킨-2 수용체 Greene et al., 1989; Lin et al., 1990
MHC 제II형 5 Koch et al., 1989
MHC 제II형 HLA-Dra Sherman et al., 1989
β-액틴 Kawamoto et al., 1988; Ng et al., ; 1989
근육 크레아틴 키나제(MCK) Jaynes et al., 1988; Horlick et al., 1989 ; Johnson et al., 1989
전구알부민(트랜스티레틴) Costa et al., 1988
엘라스타제 I Omitz et al., 1987
메탈로티오네인 (MTII) Karin et al, 1987; Culotta et al., 1989
콜라게나제 Pinkert et al., 1987; Angel et al., 1987
알부민 Pinkert et al., 1987; Tronche et al., 1989,1990
α-태아단백 Godbout et al., 1988; Campere et al., 1989
γ-글로빈 Bodine et al., 1987; Perez-Stable et al., 1990
P-글로빈 Trudel et al., 1987
c-fos Cohen et al., 1987
c-HA-ras Triesman, 1986; Deschamps et al., 1985
인슐린 Edlund et al., 1985
신경 세포 부착 분자(NCAM) Hirsh et al., 1990
αl-안티트리파인 Latimer et al., 1990
H2B (TH2B) 히스톤 Hwang et al., 1990
마우스 및/또는 I형 콜라겐 Ripe et al., 1989
프로모터 및/또는 인핸서
프로모터/인핸서 참조문헌
글루코스-조절된 단백질
(GRP94 및 GRP78)		 Chang et al., 1989
랫트 성장 호르몬 Larsen et al., 1986
사람 혈청 아밀로이드 A (SAA) Edbrooke et al., 1989
트로포닌 I (TN I) Yutzey et al., 1989
혈소판 유래의 성장 인자 (PDGF) Pech et al., 1989
뒤시엔느 근이영양증 Klamut et al., 1990
SV40 Banerji et al., 1981; Moreau et al., 1981; Sleigh et al., 1985; Firak et al., 1986; Herr et al., 1986; Imbra et al., 1986; Kadesch et al., 1986; Wang et al., 1986; Ondek et al., 1987; Kuhl et al., 1987; Schaffner et al., 1988
폴리오마 Swartzendruber et al., 1975; Vasseur et al., 1980; Katinka et al., 1980, 1981; Tyndell et al., 1981; Dandolo et al., 1983; de Villiers et al., 1984; Hen et al., 1986; Satake et al., 1988; Campbell et al., 1988
레트로바이러스 Kriegler et al., 1982, 1983; Levinson et al., 1982; Kriegler et al., 1983, 1984a, b, 1988; Bosze et al., 1986; Miksicek et al., 1986; Celander et al., 1987; Thiesen et al., 1988; Celander et al., 1988; Chol et al., 1988; Reisman et al., 1989
파필로마 바이러스 Campo et al., 1983; Lusky et al., 1983; Spandidos and Wilkie, 1983; Spalholz et al., 1985; Lusky et al., 1986; Cripe et al., 1987; Gloss et al., 1987; Hirochika et al., 1987; Stephens et al., 1987
B형 간염 바이러스 Bulla et al., 1986; Jameel et al., 1986; Shaul et al., 1987; Spandau et al., 1988; Vannice et al., 1988
사람 면역결핍 바이러스 Muesing et al., 1987; Hauber et al., 1988; Jakobovits et al., 1988; Feng et al., 1988; Takebe et al., 1988; Rosen et al., 1988; Berkhout et al., 1989; Laspia et al., 1989; Sharp et al., 1989; Braddock et al., 1989
사이토메갈로바이러스(CMV) Weber et al., 1984; Boshart et al., 1985; Foecking et al., 1986
기본 원숭이 백혈병 바이러스 Holbrook et al., 1987; Quinn et al., 1989
진핵 세포에서 단백질 암호화 유전자의 전사를 조절하는 프로모터와 인핸서는 다수의 유전 요소로 구성되어 있다. 세포 기구는 각 인자에 의해 전달된 조절 정보를 수집하고 통합하여 상이한 유전자에 의한 독특하고 종종 복잡한 전사 조절 패턴을 발생시킨다.
본원에 사용된 "프로모터"란 용어는 RNA 폴리머라제 II의 개시 부위 주위에 군집되어 있는 전사 조절 모듈 그룹을 의미한다. 프로모터가 구성되는 방식에 대한 대부분의 사고는 HSV 티미딘 키나제(tk)용 프로모터 및 SV40 초기 전사 단위를 비롯한 여러 바이러스 프로모터의 분석으로부터 도출된 것이다. 이러한 연구들은 최근 많은 작업을 통해 보강되어, 프로모터가 각각 약 7 내지 20bp의 DNA로 구성되고 전사 활성인자 단백질에 대한 하나 이상의 인식 부위를 함유하고 있는 분리된 기능성 모듈로 구성되어 있음을 밝히고 있다.
각 프로모터 중의 하나 이상의 모듈은 RNA 합성에 대한 개시 부위에 위치하는 작용을 한다. 이러한 프로모터로서 가장 널리 알려진 예는 TATA 박스이지만, 일부 프로모터, 예를 들면 포유동물의 말단 데옥시뉴클레오티딜 트란스퍼라제 유전자의 프로모터 및 SV40 후기 유전자의 프로모터에는 TATA 박스가 없고, 개시 부위 자체와 중첩되는 별개 요소가 개시 위치에 고정되도록 돕는다.
또 다른 프로모터 요소는 전사 개시 빈도를 조절한다. 일반적으로, 이러한 프로모터는 개시 부위의 상류에서 30 내지 110bp 영역에 위치해 있지만, 최근에는 다수의 프로모터가 이러한 기능성 요소를 개시 부위의 하류에 함유하는 것으로 밝혀지기도 하였다. 요소들 사이의 간격은 유동적이어서, 요소들이 서로 전위되거나 이동될 때에도 프로모터 기능은 보존되어진다. tk 프로모터의 경우, 요소들 사이의 간격은 50bp 떨어진 곳까지 증가될 수 있다. 활성이 경감되기 시작하기 전에 프로모터에 따라서, 각 요소들은 협동적으로 또는 독립적으로 전사를 활성화하는 기능을 할 수 있는 것으로 나타난다.
인핸서는 본래 동일 DNA 분자 상의 먼 거리에 위치한 프로모터로부터 전사를 증가시키는 유전 요소로서 검출되었다. 이러한 상당한 거리 너머로 작용하는 능력은 원핵세포 전사 조절에 관한 고전적인 연구에서는 선례가 거의 없는 것이다. 인핸서 활성을 갖는 DNA 영역이 프로모터와 매우 유사하게 구성된다는 사실은 이후 연구에서 밝혀졌다. 즉, 인핸서는 1종 이상의 전사 단백질에 각각 결합하는 많은 개별 인자들로 구성되어진다.
인핸서와 프로모터 사이의 기본적인 차이는 작동성이다. 인핸서 영역은 모두 일정 거리를 두고 전사를 자극할 수 있어야 하는 반면, 프로모터 영역이나 이의 성분 요소는 그럴 필요가 없다. 반면에, 프로모터는 특정 부위에서 특정 배향으로 RNA 합성 개시를 유도하는 하나 이상의 요소를 갖고 있어야 하는 반면, 인핸서는 이러한 특이성이 없다. 이러한 작동성의 차이 외에는 인핸서와 프로모터는 매우 유사한 실체이다.
프로모터와 인핸서는 세포내에서 전사를 활성화시키는 동일한 일반 기능을 갖고 있다. 이들은 종종 중첩되고 인접되어 있어서, 종종 모듈 구성이 매우 유사한 것으로 보인다. 이러한 고찰을 종합해보면, 인핸서와 프로모터는 상동성 실체로서, 이들 서열에 결합된 전사 활성화 단백질은 세포 전사 기구와 기본적으로 동일한 방식으로 상호작용할 수 있을 것으로 생각된다.
일부 양태에서, 본 발명에 사용되는 프로모터는 사이토메갈로바이러스(CMV) 이미디어트 얼리(immediate early) 프로모터이다. 이 프로모터는 벡터 pcDNAIII 중에서 인비트로겐으로부터 상업적으로 입수할 수 있는데, 이는 본 발명에 일부 사용되고 있다. 또한, 본 발명에는 덱틴-1 프로모터 및 덱틴-2 프로모터도 유용하다. 이하에는 본 발명과 함께 사용될 수 있는 또 다른 바이러스 프로모터, 세포 프로모터/인핸서 및 유도성 프로모터/인핸서를 기재하였다. 또한, 임의의 프로모터/인핸서 조합(진핵세포 프로모터 데이터 베이스 EPDB에 따라서)은 올리고사카라이드 프로세싱 효소, 단백질 폴딩 부속 단백질, 선별가능한 마커 단백질 또는 관심대상의 이종 단백질을 암호화하는 구조 유전자의 발현을 유도하는데 사용될 수도 있다.
유용성이 입증된 또 다른 시그날에는 폴리아데닐화 시그날이 있다. 이 시그날은 사람 성장 호르몬(hGH) 유전자, 소 성장 호르몬(BGH) 유전자 또는 SV40으로부터 수득할 수 있다.
내부 리보솜 결합 부위(IRES) 요소의 사용은 다중유전자 정보 또는 폴리시스트론성 정보 생성에 이용될 수 있다. IRES 인자는 5-메틸화된 캡에 의존적인 해독의 리보솜 스캐닝 모델을 대체하고 내부 부위에서 해독을 개시할 수 있다(Pelletier and Sonenberg, 1988). 피코나바이러스 과에 속하는 두 성분(소아마비 및 뇌척수심근염) 유래의 IRES 인자(Pelletier and Sonenberg, 1988) 및 포유동물 정보 유래의 IRES(Macejak and Sarnow, 1991)도 개시되어 있다. IRES 인자는 이종의 오픈 리딩 프레임에 연결될 수 있다. 다수의 오픈 리딩 프레임은 각각 IRES에 의해 이격되면서 함께 전사되어 폴리시스트론성 정보를 생성할 수 있다. IRES 인자에 의하면 각각의 오픈 리딩 프레임을 효과적인 해독을 위해 리보솜에 접근될 수 있다. 다수 유전자는 하나의 프로모터/인핸서를 사용하여 효과적으로 발현되어 단일 정보를 전사시킬 수 있다.
어떤 경우든지, 프로모터는 유전자 상류에 기능적으로 위치되었을 때 그 유전자의 발현을 유도하는 DNA 인자로서 이해되어야 한다. 본 발명에 따른 대부분의 이식유전자 작제물은 프로모터 인자의 하류에 기능적으로 배치되어진다.
본 발명의 조성물 및 방법은 본 발명의 조성물을 환자에게 투여하기 위해 제공된다.
D. 벡터
MDA-7 폴리펩타이드는 벡터내에 포함된 핵산 분자에 의해 암호화될 수 있다. 이러한 방식으로, MDA-7 폴리펩타이드는 당해 폴리펩타이드가 환자에서 발현되는 한, 이러한 벡터의 투여를 통해 환자에게 제공될 수 있다.
"벡터"란 용어는 핵산 서열이 당해 핵산 서열이 복제될 세포로의 도입을 위해 삽입되어질 수 있는 운반체 핵산 분자를 의미하기 위해 사용된다. 핵산 서열은 "외인성"일 수 있는데, 이는 당해 핵산 서열이 벡터가 도입되어지는 세포에 대해 외래 물질이거나, 당해 핵산 서열이 세포내의 서열에 대해 상동이지만 당해 핵산 서열이 본래 발견되지 않는 숙주 세포 내의 위치에서는 상동이 아님을 의미한다. 벡터에는 플라스미드, 코스미드, 바이러스(박테리오파아지, 동물 바이러스 및 식물 바이러스) 및 인공 염색체(예: YAC)가 포함된다. 당업자는 표준 재조합 기술을 통해 벡터를 작제하는 것에 잘 알고 있으며, 이는 문헌[참조: Sambrook et al., (2001) and Ausubel et al., 1996, 둘다 본원에서 참조로 인용됨]에 기재되어 있다. 변형된 겔로닌과 같은 변형된 폴리펩타이드를 암호화하는 것 이외에도, 벡터는 태그 또는 표적화 분자와 같은 비-변형된 폴리펩타이드 서열을 암호화할 수 있다. 융합 단백질을 암호화하는 유용한 벡터에는 pIN 벡터[참조: Inouye et al., 1985], 히스티딘의 신장부(stretch)를 암호화하는 벡터 및 이후의 정제 및 분리 또는 전달을 위해 글루타티온 S-트랜스퍼라제(GST) 가용성 융합 단백질을 생성하는데 사용하기 위한 pGEX 벡터가 포함된다. 표적화 분자는 변형된 폴리펩타이드를 특정 기관, 조직, 세포 또는 피험체의 신체내의 기타 위치로 지시하는 분자이다.
"발현 벡터"란 용어는 전사될 수 있는 유전자 산물의 적어도 일부분을 암호화하는 핵산 서열을 함유하는 벡터를 의미한다. 일부 경우에, RNA 분자는 이어서 단백질, 폴리펩타이드 또는 펩타이드로 해독된다. 발현 벡터는 특정 숙주 유기체에서 작동적으로 연결된 암호화 서열의 전사 및 가능하게는 해독을 위해 필수적인 핵산 서열을 의미하는 다양한 "제어 서열"을 함유할 수 있다. 전사 및 해독을 통제하는 제어 서열 이외에, 벡터 및 발현 벡터는 다른 기능을 또한 수행하고 하기 기술하는 핵산 서열을 함유할 수 있다.
1. 바이러스 벡터
a. 아데노바이러스 감염
재조합 DNA를 전달하는 1가지 방법은 아데노바이러스 발현 벡터를 사용하는 것이다. 아데노바이러스 벡터는 게놈 DNA로의 통합능이 낮은 것으로 알려져 있지만, 이러한 특징은 이들 벡터의 높은 유전자 전이율에 의해 상쇄되어진다. "아데노바이러스 발현 벡터"란 표현은 (a) 작제물의 패키징을 보조하기에 충분하고, (b) 클로닝된 재조합 유전자 작제물을 궁극적으로 발현시키기에 충분한 아데노바이러스 서열을 함유하는 작제물을 포함하는 것이다.
아데노바이러스 벡터는 복제 결손형이거나 또는 적어도 조건 결손형일 수 있으나, 이러한 아데노바이러스 벡터의 본성은 본 발명의 성공적인 실시에 중요한 역할을 하는 것으로 생각되지 않는다. 아데노바이러스는 42종의 공지된 혈청형 또는 서브그룹 A 내지 F 중 하나일 수 있다. 아데노바이러스 5형(서브그룹 C)는 본 발명에 유용한 조건 복제 결손 아데노바이러스 벡터를 수득하기 위한 일부 출발 물질이다. 이는, 아데노바이러스 5형이 상당한 생화학적, 유전적 정보가 공지되고 오래전부터 벡터로서 아데노바이러스를 이용하는 다양한 작제에 사용되어 온 사람 아데노바이러스이기 때문이다.
상기한 바와 같이, 본 발명에 따른 벡터 전형은 복제 결손성이고 아데노바이러스 E1 영역이 없는 것으로서, 이러한 벡터는 E1 암호화 서열이 제거된 위치에 형질전환용 작제물을 도입시킬 수 있어 매우 편리하다. 그러나, 아데노바이러스 서열 내의 작제물 삽입 위치는 본 발명에 중요한 요소가 아니다. 즉, 당해 유전자를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 칼슨 등(Karlsson et al., 1986)에 의해 기술된 바와 같은 E3 치환 벡터 중의 결실된 E3 영역 대신 삽입되거나 또는 헬퍼 세포주 또는 헬퍼 바이러스가 E4 결손을 보충하고 있는 E4 영역에 삽입될 수도 있다.
아데노바이러스 성장과 조작은 당업계에 공지되어 있고, 시험관내 및 생체내에서 다양한 숙주 범위를 나타낸다. 이 그룹의 바이러스는 높은 역가, 예를 들면, 1ml 당 109 내지 1011 플라크 형성 단위로 수득될 수 있고 감염성도 높다. 아데노바이러스의 생활사에는 숙주 세포 게놈으로의 통합이 요구되지 않는다. 아데노바이러스 벡터에 의해 전달되는 외래 유전자는 에피솜이어서 숙주 세포에 미치는 유전자독성이 낮다.
b. 레트로바이러스 감염
레트로바이러스는 이의 RNA를 역전사 과정을 통해 감염 세포 중에서 이본쇄 DNA로 전환시키는 성질을 특징으로 하는 일본쇄 RNA 바이러스 그룹이다[참조: Coffin, 1990]. 그 결과 수득되는 DNA는 이어서 프로바이러스로서 세포 염색체 중에 안정적으로 통합되고 바이러스 단백질의 합성을 유도한다. 이러한 통합은 바이러스 유전자 서열을 수용체 세포 및 그 후손들 중에 잔류시킨다.
레트로바이러스 벡터 작제를 위해서, 당해 유전자를 암호하는 핵산을 바이러스 게놈 중의 특정 바이러스 서열 위치에 삽입하여 복제 결손형 바이러스를 작제한다. 비리온 제조를 위해서는 gag, pol 및 env 유전자를 함유하고 LTR과 패키징 성분은 함유하지 않는 패키징 세포주를 작제한다[참조: Mann et al., 1983]. 이러한 세포주로, 레트로바이러스 LTR 및 패키징 서열과 함께 cDNA를 함유하는 재조합 플라스미드를 도입시키면(예를 들면, 인산칼슘 침전법에 의해), 패키징 서열은 재조합 플라스미드의 RNA 전사체는 바이러스 입자 중으로 패키징되어, 배양액 중으로 분비되어진다[참조: Nicolas and Rubenstein; 1988; Temin, 1986; Mann et al. 1983]. 그 다음, 재조합 레트로바이러스를 함유하는 배지를 수집하고, 경우에 따라 농축시킨 뒤, 유전자 전달용으로 사용한다. 레트로바이러스 벡터는 다양한 종류의 세포를 감염시킬 수 있다. 그러나, 통합과 안정한 발현은 숙주 세포의 분열을 필요로 한다[참조: Paskind et al., 1975].
c. AAV 감염
아데노관련 바이러스(AAV)는 본 발명에 사용되기에 바람직한 벡터 시스템인데, 그 이유는 이 바이러스가 통합 빈도가 높고 비분열 세포도 감염시킬 수 있어 조직 배양 중의 포유동물 세포로 유전자를 전달하기에 유용하기 때문이다[참조: Muzyczka, 1992]. AAV는 감염의 다양한 숙주 범위를 갖고 있고[참조: Tratschin et al., 1984 ; Laughlin et al., 1986 ; Lebkowski et al., 1988 ; McLaughlin et al., 1988], 이는 본 발명에 사용하기에 적당하다는 것을 의미한다. rAAV 벡터의 작제 및 사용에 관한 상세한 설명은 본원에 참고로 인용되는 미국 특허 제5,139,941호 및 미국 특허 제4,797,368호에 기술되어 있다.
유전자 전달에서의 AAV의 용도를 입증한 연구는 문헌[LaFace et al. (1988); Zhou et al.(1993); Flotte et al.(1993); 및 Walsh et al.(1994)]에 기술되어 있다. 재조합 AAV 벡터는 마커 유전자[참조: Kaplitt et aL, 1994; Lebkowski et al., 1988 ; Samulski et al., 1989; Shelling and Smith, 1994; Yoder et al., 1994; Zhou et al., 1994; Hermonat and Muzyczka, 1984 ; Tratschin et al., 1985; McLaughlin et al., 1988] 및 사람 질환 관련 유전자[참조: Flotte et al., 1992; Ohi et al., 1990; Walsh et al., 1994; Wei et al., 1994]의 시험관내 및 생체내 형질도입에 성공적으로 사용되었다. 최근, AAV 벡터는 낭섬유증 치료의 I기 인체 실험에서 인정받은 바 있다.
전형적으로, 재조합 AAV(rAAV) 바이러스는 2개의 AAV 말단 반복체와 인접되어 있는 당해 유전자를 함유하는 플라스미드[참조: McLaughlin et al., 1988 ; Samulski et al., 1989; 각각 본원에 참고로 인용된다]와 말단 반복체 없이 야생형 AAV 암호화 서열을 함유하는 발현 플라스미드, 예를 들면 pIM45[참조: McCarty et al., 1991; 본원에서 참고로 인용된다]를 공동형질감염시켜 제조한다. 이러한 세포들은 또한 AAV 헬퍼 기능에 필요한 아데노바이러스 유전자를 보유하는 플라스미드 또는 아데노바이러스로 감염되거나 형질감염되기도 한다. 이러한 방식으로 제조된 rAAV 바이러스 스톡은 아데노바이러스로 오염되어 있는 바, rAAV 입자로부터 아데노바이러스의 물리적 분리가 요구된다(예를 들면, 염화세슘 밀도 원심분리를 이용한다). 또는, AAV 암호 영역을 함유하는 아데노바이러스 벡터 또는 AAV 암호 영역과 아데노바이러스 헬퍼 유전자의 일부 또는 전부를 함유하는 세포주가 사용될 수도 있다(Yang et al., 1994a ; Clark et al., 1995). 또한, 통합된 프로바이러스로서 rAAV DNA를 보유하는 세포주가 사용될 수도 있다(Flotte et al., 1995).
d. 프로타민
프로타민도 또한 발현 작제물과 복합체를 형성할 수 있다. 이러한 복합체는 이후 세포에 투여될 수 있는 전술한 바와 같은 지질 조성물로 조제될 수 있다. 프로타민은 DNA와 결합되는 작은 고염기성 핵단백질이다. 이의 핵산 전달 용도는 본원에 참고원용되는 미국 특허 5,187,260에 기술되어 있다. 특히, 프로타민 분자와 바이러스 벡터를 결합시켜 바이러스 벡터의 형질도입 효율을 증가시키는 방법 및 조성물에 관한 미국 특허 출원 10/391,068(2003.3.24)을 참고할 수 있다.
2. 비-바이러스 전달
MDA-7 단백질을 암호화하는 핵산의 바이러스 전달 외에도, 재조합 유전자를 소정의 숙주 세포 중으로 전달할 수 있는 또 다른 방법이 있으며, 이 역시 본 발명에 속하는 것이다.
a. 지질 매개성 형질전환
본 발명의 또 다른 양태에서, 발현 벡터는 리포좀 또는 지질 제형에 내포될 수 있다. 리포좀은 인지질 이중막과 내부 수성 매질을 특징으로 하는 소포성 구조물이다. 다중라멜라형 리포좀은 다수의 지질 층이 수성 매질에 의해 분리되어 있는 것이다. 이러한 리포좀은 인지질을 과량의 수용액에 현탁시키면 자발적으로 형성된다. 지질 성분은 폐쇄 구조를 형성하기 전에 자가재배열을 일으키고 지질 이중층 상에 물과 용해된 용질을 내포시킨다[참조: Ghosh and Bachhawat, 1991]. 또한, 리포펙타민(Gibco BRL)과 결합된 유전자 작제물도 고려된다.
최근 지질 제형의 발전은 생체내 유전자 전달 효율을 향상시켰다[참조: Smyth-Templeton et al., 1997; WO 98/07408]. 1,2-비스(올레오일옥시)-3-(트리메틸암모니오)프로판(DOTAP) 및 콜레스테롤의 등몰비로 구성된 신규 지질 제형은 전신 생체내 유전자 전달을 유의적으로, 약 150배 향상시킨다. 이러한 DOTAP:콜레스테롤 지질 제형은 "샌드위치 리포좀"이라는 독특한 구조를 형성한다고 언급된다. 이러한 제형은 함입된 이중층 또는 '꽃병' 구조 사이에 DNA를 "샌드위치"시키는 것으로 보고되어 있다. 이러한 지질 구조물의 유익한 특징에는 콜레스테롤에 의한 양성 콜로이드성 안정화, 2차원 DNA 팩킹 및 증가된 혈청 안정성이 포함된다.
이러한 암 치료용 제형의 제조 및 용도는 본원에서 참조로 인용되는 09/575,473에 제공되어 있다.
추가의 양태에서, 리포좀은 나노입자로서 추가 정의된다. "나노입자"는 본원에서 서브마이크론 입자를 의미하는 것으로 정의된다. 서브마이크론 입자는 어떠한 크기의 것이라도 될 수 있다. 예를 들면, 나노입자는 직경이 약 0.1, 1, 10, 100, 300, 500, 700, 1000㎚ 이상일 수 있다. 피험체에게 투여되는 나노입자는 1가지 크기를 초과하는 것일 수 있다.
당업자에게 공지된 임의의 방법을 사용하여 나노입자를 제조할 수 있다. 일부 양태에서, 나노입자는 제조 공정 동안에 압출된다. 나노입자의 제조에 관한 예시적 정보는 미국 특허출원 공보 제20050143336호, 미국 특허출원 공보 제20030223938호, 미국 특허출원 공보 제20030147966호 및 미국 특허원 제60/661,680호[각각 본 단락에서 구체적으로 참조로 인용된다]에서 찾아볼 수 있다.
특정 양태에서, 지질: 핵산 복합체의 투여에 의해 부수적으로 발생한 염증을 예방 또는 감소시키기 위해 소염제가 지질과 함께 투여된다. 예를 들면, 소염제는 비-스테로이드성 소염제, 살리실레이트, 항류마티스제, 스테로이이드 또는 면역억제제일 수 있다. 지질-핵산 복합체와 소염제의 병용 투여에 관한 정보는 본원에서 구체적으로 참조로 인용되는 미국 특허출원 공보 제20050143336호에서 찾아볼 수 있다.
DOTAP:Chol 나노입자의 합성은 당업자에게 공지된 어떠한 방법에 의해서도 이루어진다. 예를 들면, 당해 방법은 문헌[참조: Chada et al., 2003, 또는 Templeton et al., 1997, 둘다 본원에서 구체적으로 참조로 인용된다]에 제시된 방법에 따를 수 있다. DOTAP:Chol-DNA 복합체는 마우스에서 주사하기 바호 2시간 내지 3시간 전에 제조되었다.
당업자는 핵산 서열을 내포하기 위한 리포좀 또는 지리 제형의 용도에 대해 친숙하다. 리포좀은 인지질 2층 막 및 내부 수성 매질을 특징으로 하는 소포성 구조물이다. 다중라멜라형 리포좀은 다수의 지질 층이 수성 매질에 의해 분리되어 있는 것이다. 이러한 리포좀은 인지질을 과량의 수용액에 현탁시키면 자발적으로 형성된다. 지질 성분은 폐쇄 구조를 형성하기 전에 자가재배열을 일으키고 지질 이중층 상에 물과 용해된 용질을 내포시킨다[참조: Ghosh and Bachhawat, 1991]. 또한, 리포펙타민(Gibco BRL)과 결합된 유전자 작제물도 고려된다.
시험관내 외래 DNA의 지질 매개성 핵산 전달 및 발현은 매우 성공적이었다[참조: Nicolau and Sene, 1982; Fraley et al., 1979; Nicolau et al., 1987). 왕 등[참조: Wong et al. (1980)]은 배양된 닭 배아, HeLa 및 간암 세포에서 외래 DNA의 지질 매개성 전달 및 발현의 가능성을 입증하였다.
지질 기반 비-바이러스성 제형은 아데노바이러스 유전자 요법에 대한 대안을 제공한다. 많은 세포 배양 연구가 지질 기반 비-바이러스성 유전자 전달을 입증하였으나, 기질 기반 제형을 통한 전신 유전자 전달은 제한되어 왔다. 비-바이러스성 지질 기반 유전자 전달의 주요 제약은 비-바이러스성 전달 비히클을 포함하는 양이온성 지질의 독성이다. 리포좀의 생체내 독성이 시험관내 및 생체내 유전자 전달 결과 사이의 불일치를 부분적으로 설명해준다. 이러한 모순된 데이타에 기여하는 또 다른 용인은 혈청 단백질의 존재 및 부재하의 리포좀 안정성의 차이이다. 리포좀과 혈청 단백질 간의 상호작용은 리포좀의 안정성 특징에 극적인 영향을 준다[참조: Yang and Huang, 1997]. 양이온성 리포좀은 음하전된 혈청 단백질을 유인하여 이에 결합한다. 혈청 단백질로 피복된 리포좀은 대식세포에 의해 용해되거나 섭취됨으로써 순환계로부터 제거되어진다. 현재의 생체내 리포좀 전달은 순환계내 양이온성 지질과 관련된 독성 및 안정성 문제를 피하기 위해서 피하, 피내, 종양내 또는 두개내 주사를 사용한다. 리포좀과 혈장 단백질의 상호작용은 시험관내 유전자 전달[참조: Felgner et al., 1987] 및 생체내 유전자 전달[참조: Zhu et al., 1993; Solodin et al., 1995; Liu et al., 1995; Thierry et al., 1995; Tsukamoto et al., 1995; Aksentijevich et al., 1996]의 효율 간의 차이에 대한 원인이 된다.
최근 지질 제형의 발전은 생체내 유전자 전달 효율을 향상시켰다[참조: Smyth-Templeton et al., 1997; WO 98/07408]. 1,2-비스(올레오일옥시)-3-(트리메틸암모니오)프로판(DOTAP) 및 콜레스테롤의 등몰비로 구성된 신규 지질 제형은 전신 생체내 유전자 전달을 유의적으로, 약 150배 향상시킨다. 이러한 DOTAP:콜레스테롤 지질 제형은 "샌드위치 리포좀"이라는 독특한 구조를 형성한다고 언급된다. 이러한 제형은 함입된 이중층 또는 '꽃병' 구조 사이에 DNA를 "샌드위치"시키는 것으로 보고되어 있다. 이러한 지질 구조물의 유익한 특징에는 콜레스테롤에 의한 양성 콜로이드성 안정화, 2차원 DNA 팩킹 및 증가된 혈청 안정성이 포함된다.
지질 제형의 제조는 (I) 역상 증발, (II) 탈수-재수화, (III) 세제 투석 및 (IV) 박막 수화 후에 리포좀 혼합물의 초음파 처리 또는 일련의 압출에 의해 달성된다. 일단 제조되면, 지질 구조물을 사용하여, 순환계내에 있는 경우에 독성이거나(화학요법제) 불안정한(핵산) 화합물을 봉입할 수 있다. 리포좀 봉입은 이러한 화합물의 독성을 저하시키고 이의 혈청 반감기를 증가시켰다[참조: Gabizon et al., 1990]. 수많은 질환 치료법은 종래의 요법을 향상시키거나 신규 요법, 특히 과증식성 질환을 치료하기 위한 요법을 확립하기 위해 지질 기반 유전자 전달 전략을 사용하고 있다.
리포좀은 적혈구응집 바이러스(HVJ)와 복합체화될 수 있다. 이러한 복합체화는 세포 막과의 융합을 용이하게 하고 리포좀-봉입된 DNA의 세포 진입을 촉진하는 것으로 나타났다[참조: Kaneda et al., 1989]. 다른 양태에서, 리포좀은 핵 비-히스톤 염색체 단백질(HMG-1)과 복합체화되거나 이와 함께 사용될 수 있다[참조: Kato et al., 1991]. 또 다른 양태에서, 리포좀은 HVJ 및 HMG-1 둘다와 복합체화되거나 이들과 함께 사용될 수 있다.
비-바이러스성 전달을 위한 핵산은 폴리아크릴아미드 겔, 염화세슘 원심분리 구배, 컬럼 크로마토그래피 또는 당업자에게 공지된 임의의 기타 수단에 의해 정제될 수 있다[참조: Sambrook et al., 2001, 이는 본원에서 참조로 인용된다]. 특정 측면에서, 본 발명은 분리된 핵산인 핵산에 관한 것이다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "분리된 핵산"이란 용어는 다량의 세포성 성분 또는 시험관내 반응 성분 및/또는 하나 이상의 세포의 다량의 총 게놈 및 전사된 핵산을 함유하지 않도록 분리된 또는 이를 함유하지 않는 핵산 분자(예: RNA 또는 DNA 분자)를 의미한다. 핵산의 분리방법(예: 평형 밀도 원심분리, 전기영동 분리, 컬럼 크로마토그래피)는 당업자에게 널리 공지되어 있다.
E. 단백질, 펩타이드 및 폴리펩타이드
본 발명은 MDA-7 폴리펩타이드의 조성물 및 방법에 관한 것이다. 특정 양태에서, MDA-폴리펩타이드는 암의 치료에 사용된다. 특정 양태에서, MDA-7 폴리펩타이드는 직접 제공되기도 한다. 본원에 사용된 "단백질"과 "폴리펩타이드"란 용어는 상호교환적으로 사용된다.
본 발명의 추가의 양태는 MDA-7 단백질 및 이의 내인성 시그날 서열이 결여된 MDA-7의 절두된 형태 또는 이종 시그날 서열을 함유하는 MDA-7 폴리펩타이드를 포함하는 정제된 단백질 조성물의 용도를 포함한다. MDA-7의 절두된 분자에는, 예를 들면, MDA-7 아미노산 잔기 약 46 내지 49에서부터 시작되는 분자 및 추가의 N-말단 절두가 포함된다. 구체적으로, 다음과 같은 잔기에서 시작하고 잔기 206에서 종결되는 분자가 의도된다: 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181 및 182. 추가의 양태에서, 잔기 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47 및 48은 서열번호 2에 제시된 바와 같은 MDA-7의 다른 인접 잔기들과 함께 포함된다.
본 발명은 또한 (a) TNF, (b) VEGF 억제제 또는 (c) IL-10 억제제 중 하나 이상과 배합된 MDA-7 또는 MDA-7을 암호화하는 핵산의 방법 및 조성물에 관한 것이다.
당업자가 잘 이해하고 있는 바와 같이, MDA-7 폴리펩타이드 또는 펩타이드, TNF 폴리펩타이드 또는 펩타이드, VEGF 억제제 폴리펩타이드 또는 펩타이드, 또는 IL-10 억제제의 구조에는 변형과 변화가 이루어질 수 있지만, 여전히 바람직한 유사 특성 또는 바람직한 기타 다른 특성을 보유한 분자를 생산할 수 있다. 예를 들어, 특정 아미노산은 구조물과 인지가능한 상호작용성 결합능의 손실 없이 단백질 구조 중에서 다른 아미노산으로 치환되거나, 결실, 부가 또는 절두를 포함할 수 있다. 이러한 상호작용능과 단백질의 성질이 단백질의 생물학적 기능성을 좌우하기 때문에, 단백질 서열(또는 물론 이의 기본 DNA 암호화 서열)에는 특정 아미노산 서열의 치환이 이루어질 수 있고, 이러한 치환에도 불구하고 유사한 종양 억제, 아폽토시스-유도, 항혈관신생 또는 사이토킨 특성을 갖는 단백질이 수득될 수 있다. 따라서, 본 발명자들은 생물학적 유용성 또는 활성의 인지가능한 상실없이 MDA-7 폴리펩타이드 또는 펩타이드(또는 기본 DNA) 서열에 다양한 변화가 이루어질 수 있을 것으로 의도한다. TNF-알파의 전체길이 아미노산 및 핵산 서열은 각각 서열번호 3 및 서열번호 4로서 본원에 첨부된다. TNF-베타의 전체길이 아미노산 및 핵산 서열은 각각 서열번호 5 및 서열번호 6으로서 본원에 첨부된다.
VEGF-A는 선택적 스플라이싱(alternative splicing)에 의해 단일 유전자로부터 유래된 몇가지 동종형으로 존재한다. VEGF-A의 동종형 121의 전체길이 아미노산 서열 및 핵산 서열은 각각 서열번호 7 및 서열번호 8로서 본원에 제시된다. VEGF-A의 동종형 165의 전체길이 아미노산 서열 및 핵산 서열은 각각 서열번호 9 및 서열번호 10으로서 본원에 제시된다. VEGF-A의 동종형 189의 전체길이 아미노산 서열은 각각 서열번호 11 및 서열번호 12로서 본원에 제시된다. VEGF-A의 동종형 206의 전체길이 아미노산 서열 및 핵산 서열은 각각 서열번호 13 및 서열번호 14로서 본원에 제시된다. VEGF-B의 전체길이 아미노산 서열 및 핵산 서열은 각각 서열번호 15 및 서열번호 16으로서 본원에 제시된다. VEGF-C의 전체길이 아미노산 서열 및 핵산 서열은 각각 서열번호 17 및 서열번호 18로서 본원에 제시된다. VEGF-D의 전체길이 아미노산 서열 및 핵산 서열은 각각 서열번호 19 및 서열번호 20으로서 본원에 제시된다. VEGF 계열의 구성원인 태반 성장 인자의 전체길이 아미노산 서열 및 핵산 서열은 각각 서열번호 21 및 서열번호 22로서 본원에 제시된다
기능성 등가물의 측면에서, 당업자는 생물학적 기능상 등가인 단백질 또는 펩타이드의 정의에 허용되는 수준의 동등한 생물학적 활성을 가진 분자를 제공하는 분자의 소정 부위에서 이루어질 수 있는 변화의 수로의 제한 개념이 본래 내재되어 있음을 잘 알고 있을 것이다. 따라서, 본원에서 생물학적 기능성 등가 펩타이드는 아미노산 중 일부(대부분 또는 전부가 아니다)가 치환될 수 있는 펩타이드로서 정의된다. 구체적으로, 펩타이드가 작은 경우에는 더 적은 수의 아미노산이 변화될 수 있다. 물론, 다른 치환을 가진 다수의 상이한 단백질/펩타이드가 본 발명에 따라 용이하게 제조 및 사용될 수 있음은 자명한 것이다.
또한, 특정 잔기가 단백질 또는 펩타이드의 생물학적 또는 구조적 성질에 특히 중요한 것으로 밝혀진 경우, 예를 들어, 효소의 활성 부위에 존재하는 잔기, 또는 RNA 폴리머라제 II 결합 영역에 존재하는 잔기 등의 잔기들은 일반적으로 치환될 수 없다는 것은 공지되어 있다.
아미노산 치환은 일반적으로 아미노산 측쇄 치환체의 상대적 유사성, 예를 들어 소수성, 친수성, 하전, 크기 등에 근거하여 이루어진다. 아미노산 측쇄 치환체의 크기, 형태 및 종류를 분석해보면, 아르기닌, 리신 및 히스티딘은 모두 양하전 잔기이고; 알라닌, 글리신 및 세린은 모두 크기가 유사하며, 페닐알라닌, 트립토판 및 타이로신은 모두 일반적으로 형태가 유사하다. 따라서, 이러한 고찰에 근거하여 다음과 같은 서브세트를 생물학적 기능성 등가물로서 본원에 정의한다: 아르기닌, 리신 및 히스티딘; 알라닌, 글리신 및 세린; 페닐알라닌, 트립토판 및 타이로신.
보다 정량적 변화를 실시하기 위해서는 아미노산의 하이드로패틱 지수(hydropathic index)를 고려할 수 있다. 각 아미노산의 하이드로패틱 지수는 이들의 소수성 및 하전 특성에 근거해 할당된다: 즉 이소류신(+4.5); 발린(+4.2); 류신(+3.8); 페닐알라닌(+2.8); 시스테인/시스틴(+2.5); 메티오닌(+1.9); 알라닌(+1.8); 글리신(-0.4); 트레오닌(-0.7); 세린(-0.8); 트립토판(-0.9); 타이로신(-1.3); 프롤린(-1.6); 히스티딘(-3.2); 글루타메이트(-3.5); 글루타민(-3.5); 아스파테이트(-3.5); 아스파라긴(-3.5); 리신(-3.9); 및 아르기닌(-4.5)이다.
단백질에 생물학적 상호작용 기능을 부여하는데 있어서 아미노산 하이드로패틱 지수의 중요성은 일반적으로 당업계에 공지되어 있다[참조: Kyte & Doolittle, 1982, 본원에 참고로 인용됨]. 특정 아미노산은 유사한 하이드로패틱 지수 또는 점수를 갖는 다른 아미노산으로 치환되어 유사한 생물학적 활성을 그대로 제공할 수 있다는 것은 공지되어 있다. 하이드로패틱 지수에 근거하여 변화를 시도하는 경우에, 하이드로패틱 지수가 ±2 이내인 아미노산간의 치환이 바람직하고, ±1 이내인 것이 특히 바람직하고, ±0.5 이내 것이 보다 더욱 바람직하다.
또한, 유사 아미노산의 치환은 특히 본 발명에서와 같이 형성되는 생물학적 기능성 등가 단백질 또는 펩타이드가 면역학적 측면에서 사용하기 위해 의도되는 경우, 친수성에 근거하여 효과적으로 이루어질 수 있음은 당해 기술분야에 잘 알려져 있다. 본원에 참고원용된 미국 특허 제4,554,101호는 인접 아미노산의 친수성에 의해 좌우되는, 단백질 최대 국소 평균 친수성이 단백질의 면역원성 및 항원성, 즉 단백질의 생물학적 성질과 상관성이 있다고 기술하고 있다.
미국 특허 제4,554,101호에 상세히 설명된 바와 같이, 아미노산 잔기에 할당된 친수성 값은 다음과 같다: 아르기닌(+3.0); 리신(+3.0); 아스파테이트(+3.0±1); 글루타메이트(+3.0±1); 세린(+0.3); 아스파라긴(+0.2); 글루타민(+0.2); 글리신(0); 트레오닌(-0.4); 프롤린(-0.5±1); 알라닌(-0.5); 히스티딘(-0.5); 시스테인(-1.0); 메티오닌(-1.3); 발린(-1.5); 류신(-1.8); 이소류신(-1.8); 타이로신(-2.3); 페닐알라닌(-2.5); 트립토판(-3.4).
유사한 친수성 값에 근거하여 변화를 실시하는 경우에, 바람직하게는 친수성 값이 ±2 이내인 아미노산의 치환, 특히 바람직하게는 ±1 이내인 것, 보다 더 특히 바람직하게는 ±0.5 이내인 것이다.
아미노산 변화에 기인하는 기능성 등가 폴리펩타이드에 대해서만 집중하여 논의하였지만, 유전자 코드가 축퇴성이어서 2종 이상의 코돈이 동일 아미노산을 암호할 수 있다는 점을 고려해 볼 때, 이러한 변화는 암호 DNA의 변경에 의해 실현될 수음은 명백한 것이다.
1. 시험관내 단백질 생산
실시예에 제시된 정제 방법 외에도, 시험관내 단백질 생산의 일반적 과정이 논의된다. 본 발명의 일부 양태에 따른 바이러스 벡터로 형질도입 후, 원시 포유동물 세포 배양물은 다양한 방법으로 제조할 수 있다. 세포가 시험관내에서 발현 작제물과 접촉되는 동안 생존성을 유지하도록 하기 위해, 세포는 미생물 오염으로부터 보호되면서 적당한 비율의 산소 및 이산화탄소와 영양소와 지속적인 접촉을 이루어야 한다. 세포 배양 기술은 공지되어 있으며 본원에 참고로 인용된다[참조: Freshney, 1992].
상기한 한 양태는 단백질 생산 및/또는 제공을 위해 세포를 무한증식화하는 유전자 전달의 사용을 포함한다. 당해 단백질의 유전자는 전술한 바와 같이 적당한 숙주 세포로 전달된 후 적당한 조건 하에서 세포 배양될 수 있다. 사실상 모든 폴리펩타이드의 유전자가 이러한 방식으로 이용될 수 있다. 재조합 발현 벡터의 작제 및 이 벡터에 함유된 인자들은 전술한 바와 같다. 또한, 생산될 단백질은 당해 세포에서 보통 합성되는 내인성 단백질일 수도 있다.
본 발명의 다른 양태는 자가 B 림프구 세포주를 이용하기도 하는데, 이 세포주는 면역원 산물, 보다 구체적으로 면역원성 활성을 보유한 단백질을 발현하는 바이러스 벡터로 형질감염된다. 다른 포유동물 숙주 세포주의 예에는 Vero 세포, HeLa 세포, 기타 다른 B 세포주 및 T 세포주, 예를 들면 CEM, 721.221, H9, Jurkat, Raji 등, 뿐만 아니라 중국 햄스터 난소 세포주, W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, 3T3, RIN 및 MDCK 세포도 포함된다. 또한, 숙주 세포 균주는 삽입된 서열의 발현을 조절하는 균주, 또는 유전자 산물을 바람직한 방식으로 변형 및 프로세싱하는 균주가 선택될 수 있다. 이와 같은 단백질 산물의 변형(예, 글리코실화) 및 프로세싱(예, 절단)은 단백질 기능에 중요한 역할을 한다. 상이한 숙주 세포는 단백질의 해독후 프로세싱 및 변형에 특징적이고 특이적인 기구를 갖고 있다. 따라서, 적절한 세포주 또는 숙주계는 발현되는 이종 단백질을 정확하게 변형 및 프로세싱을 보장하는 것으로 선택할 수 있다.
tk-, hgprt- 또는 aprt-세포 각각에서 HSV 티미딘 키나제, 하이포크산틴-구아닌 포스포리보실트란스퍼라제 및 아데닌 포스포리보실트란스퍼라제 유전자를 포함하여 수많은 선별 시스템이 사용될 수 있다. 또한, 항대사산물 내성도 선별 기준으로 사용될 수 있다: 즉, 내성을 부여하는 dhfr; 마이코페놀산에 대한 내성을 부여하는 gpt; 아미노글리코사이드 G418에 대한 내성을 부여하는 neo; 및 하이그로마이신에 대한 내성을 부여하는 hygro.
동물 세포는 2가지 방식으로 시험관내에서 증식될 수 있다: 즉 배양물 부피 전반에서 현탁상태로 증식하는 비고착형 세포 또는 증식에 고체 기질에 대한 부착을 필요로 하는 고착형 세포(즉, 단일층 유형의 세포 성장).
연속적인 확립된 세포주로부터의 비고착형 또는 현탁 배양물은 대량 세포 생산 및 세포 산물 생산에 가장 널리 이용되는 수단이다. 그러나, 현탁 배양 세포는 부착 세포보다 낮은 단백질 생산능 및 종양원능과 같은 단점을 갖고 있다.
2. ER-표적화 서열
본 발명의 폴리펩타이드는 하나 이상의 소포체 표적화 서열을 함유한다. 세포 중의 단백질의 최종 위치는 단백질 서열 내에 암호화된 표적화 서열에 따라 달라진다. 가장 단순한 경우로서, 시그날 부족은 단백질을 세포질인 디폴트 경로로 유도한다. ER에 잔류되도록 정해진 단백질은 ER에 단백질을 잔류시키는 특정 시그날 펩타이드를 갖고 있어야 한다. 이러한 본 발명의 폴리펩타이드는 N-말단이나 C-말단에 추가 아미노산 잔기를 포함하거나 포함하지 않을 수 있다.
ER은 핵막에서부터 세포질을 통해 뻗어있는 망형의 막에 싸인 세관 및 낭(수조) 구조물이다. 단백질의 분비 경로는 다음과 같다: 조면 ER → 골지 → 분비소포 → 세포 외부.
분비되는 단백질은, 일반적으로 ER에서부터 골지로 이동해야 한다. 그러나, ER 내에 유지되어야 하는 특정 단백질도 있으며, 그 예에는 BiP, 시그날 펩타다제, 단백질 디설파이드 이소머라제가 있다. 특정 국재화 시그날은 단백질을 ER로 표적화한다.
카복시 말단에 ER 표적화 서열 Lys-Asp-Glu-Leu(1문자 코드로는 KDEL) 존재로 인해 특정 단백질은 ER 내강에 잔류한다. 이 서열은 단백질의 일부는 아니지만, 그 대신 단백질을 골지로 이동시켜 세포로부터 분비시킨다. 카르복시 말단(KKXX 서열)에 KKXX서열이나 KDEL 서열의 존재는 단백질을 ER 중에 잔류시킨다. 이러한 서열의 존재는 이 구역의 막에 있는 특정 재순환 수용체에 단백질을 결합시킨 뒤의 ER로 선택적으로 재이송시킨다.
ER로부터 단백질의 배출은 대량 흐름 뿐만 아니라 골지체로의 단백질의 선택적 수송을 매개하는 표적화 시그날을 특이적으로 인식하는 조절 경로에 의해서도 일어난다. 16 내지 30 잔기의 ER 시그날 서열의 존재는 리보좀을 ER 막으로 유도하고, ER 막을 따라 단백질 이동을 개시한다.
ER 시그날 서열은 일반적으로 단백질의 N-말단에 위치한다. 이러한 표적화 서열은 종종 하나 이상의 양하전된 아미노산과 그 이후에 6 내지 12의 소수성 잔기의 연속 스트레치를 함유한다. 시그날 서열은 일반적으로 단백질이 리보좀에서 성장되는 동안에 단백질로부터 절단되어진다. 시그날 서열로부터 여러 소수성 아미노산의 특정 결실이나 이러한 아미노산 중 한 아미노산의 하전성 아미노산으로의 돌연변이는 ER 막을 따라 내강으로 단백질을 이동시키지 못한다. 랜덤 N-말단 아미노산 서열의 부가는 세포질 단백질을 ER 내강으로 이동시키는데, 이는 소수성 잔기가 ER 표적화에 중요한 결합 부위를 형성함을 시사한다.
소포체 표적화 서열은 아미노산 잔기가 폴리펩타이드의 목적지를 소포체로 표적화하기만 한다면 아미노산 잔기 수는 임의의 수일 수 있다. 본 발명의 폴리펩타이드는 ER 표적화 서열을 하나만 함유할 수 있고, 1개 이상 함유할 수도 있다. ER 표적화 시그날에 관한 추가 정보는 전문이 본원에 참고로 인용되는 인비트론 카탈로그[V890-21, V891-20, V892-20 및 V893-20, "pShooter Vector Manual I(pEF/myc Vector)", 인터넷 주소: invitrogen.com/content/sfs/manuals/pshooter_pef_man.pdf]에서 찾아볼 수 있다. 시그날 서열 인식 및 ER을 표적으로 하는 단백질에 대한 개관은 본원에 참고로 인용되는 문헌[Walter and Johnson, 1994; Koch et al., 2003; Kabat et al., 1987]에서도 찾아볼 수 있다.
3. MDA-7의 정제방법
본 발명은 본 발명의 일부 양태에서 정제된 MDA-7을 사용한다. 다음의 방법 및 당업자에게 공지된 유사한 방법을 사용하여 본원에 개시된 MDA-7의 정제 방법을 실시할 수 있다. 이러한 방법은 본원에서 참조로 인용되는 10/791,692에 개시되어 있다. 상기 개시내용의 일부는 하기에 제공된다(도면 없이).
F. 항체 생산
1. MDA-7에 결합하는 항체
재조합 his-태그된 MDA-7 단백질은 이. 콜라이에서 생산하고 니켈 NTA 아가로스 컬럼에서 정제하였다. 이 물질은 배취 방식으로 니켈 수지에 45분 동안 결합시킨 다음, 컬럼에 주입하고 용출물을 컬럼 베드를 통해 용출시켰다. 단백질을 0.5% chap를 함유하는 10mM Tris pH 8.0으로 세척하고, 마지막에는 10mM Tris pH 8.0+400mM 이미다졸로 용출시켰다. 용출된 MDA-7은 10mM Tris pH 8.0으로 투석하였다. 최종 산물은 분자량이 약 23kDa인 단일 밴드로 관찰되었다. 아미노 말단 단백질 서열분석 결과 정확한 단백질로 관찰되었고 순도는 90%를 넘는 것으로 추정되었다.
이 물질을 다음과 같은 프로토콜에 따라 토끼에게 주사하였다: IFA 함유 MDA-7 단백질 400mg 및 MDP 100mg을 피하 주사하고, 3주 후 IFA 함유 MDA-7 단백질 200㎍을 주사하고, 3주 후 다시 MDA-7 단백질 100mg을 정맥내 주사하였다. 항혈청의 역가는 ELISA 분석에 근거해 1/100,000을 넘는 것으로 관찰되었다. 필요에 따라, 동물을 부스팅시켰다.
MDA-7 단백질은 설포하이드릴 결합을 통해 고체 지지체 수지에 커플링되었다. 이 수지와 결합된 단백질은 철저하게 세척하였다. 세척된 물질을 사용하여 항체 정제용 MDA-7 컬럼을 제조하였다. 토끼 폴리클로날 혈청을 MDA-7 컬럼에 주입하기에 앞서, 혈청을 20mM Tris 완충액(pH 8.0)과 1:1로 희석하고 0.2㎛ 필터를 통해 여과시켰다. 그 다음, 컬럼을 흡광도가 기준값이 될 때까지 동일한 20mM Tris 완충액(pH 8.0)으로 세척하였다. 항체는 0.1M 아세트산을 이용하여 컬럼으로부터 용출시켰다. 항체를 함유하는 용출물을 용출 즉시 pH 8.0으로 재조정하였다. 이와같이 친화성 정제된 항체는 그 다음 10mM Tris(pH 8.0)에 대해 투석하고 농축시켰다.
2. IL-10 및 VEGF에 결합하는 항체
본 발명의 일부 양태는 MDA-7과 함께, 항체인 IL-10의 억제제를 포함하는 방법 및 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 또한 MDA-7과 함께, 항체인 VEGF-억제제를 포함하는 방법 및 조성물에 관한 것이다.
IL-10과 같은 면역조절제에 결합하는 항체에 관한 정보는 본원에서 상세히 참조로 인용되는 미국 특허 제6,168,791호에서 찾아볼 수 있다. 미국 특허 제6,168,791호는 IL-10 또는 IL-10의 효능제와 같은 면역조절제에 결합하는 항체 및 이의 제조방법을 교시하고 있다. IL-10 항체 생산에 관한 추가 정보는 각각 본원에서 상세히 참조로 인용되는 미국 특허 제6,407,218호 및 미국 특허원 제20050101770호에서 찾아볼 수 있다. 또한, MDA-7 정제를 위한 항체에 관해서 VEGF 또는 IL-10-특이적 항체의 범주에서 하기와 같이 논의될 수 있다.
IL-10 항체 서열의 예에는, CDR1(서열번호 23), CDR2(서열번호 24) 및 CDR3(서열번호 25)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 포함하는 하나 이상의 항체 경쇄 가변 영역 또는 이의 결합 단편; 및 아미노산 서열이 모든 또는 실질적으로 모든 사람 면역글로불린 아미노산 서열인 골격 영역; 및 상보성 결정 영역 1(CDR1)(서열번호 26), CDR2(서열번호 27) 및 CDR3(서열번호 28)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 포함하는 하나 이상의 항체 중쇄 가변 영역 또는 이의 결합 단편; 및 아미노산 서열이 모든 또는 실질적으로 모든 사람 면역글로불린 아미노산 서열인 골격 영역을 포함하는, IL-10 또는 이의 결합 단편에 결합하는 항체 분자가 포함된다. 항체는 감마-1, 감마-2, 감마-3 또는 감마-4 사람 중쇄 불변 영역 또는 이의 변이체를 포함하는 중쇄 불변 영역을 추가로 포함할 수 있다. 항체는 람다 또는 카파 경쇄 불변 영역을 포함하는 경쇄 불변 영역을 추가로 포함할 수 있다.
항-사람 IL-10 항체에 관한 추가 정보는 본원에서 참조로 인용되는 인터넷 웹[sigmaaldrich.com/sigma/datasheet/i5020dat.pdf]에서 찾아볼 수 있다.
본원에서 "항체"란 용어는 목적하는 생물학적 활성을 나타내는 임의의 형태의 항체 또는 이의 단편을 의미한다. 따라서, 이는 광의적 의미로 사용되며, 목적하는 생물학적 활성을 나타내는 한, 구체적으로는 모노클로날 항체(전체길이 모노클로날 항체를 포함), 폴리클로날 항체, 다중특이적 항체(예: 이특이적 항체) 및 항체 단편을 포괄한다.
IL-10에 결합하는 항체의 정의에는 IL-10 항체 결합 단편이 포함된다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "IL-10 결합 단편" 또는 "이의 결합 단편"이란 용어는 IL-10 활성을 억제하는 생물학적 활성을 실질적으로 여전히 보유하는 항체의 단편 또는 유도체를 포함한다. 따라서, "항체 단편" 또는 IL-10 결합 단편은 전체길이 항체의 일부분, 일반적으로는 이의 항원 결합 또는 가변성 영역을 의미한다. 항체 단편의 예에는 Fab, Fab', F(ab')2 및 Fv 단편; 디아바디(diabody); 선형(linear) 항체; 일본쇄 항체 분자, 예를 들면, sc-Fv; 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이적 항체가 포함된다. 전형적으로, 결합 단편 또는 유도체는 IL-10 억제 활성의 50% 이상을 보유한다. 바람직하게는, 결합 단편 또는 유도체는 IL-10 억제 활성의 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% 또는 100%를 보유한다. IL-10 결합 단편은 실질적으로 이의 생물학적 활성을 변경하지 않는 보존적 아미노산 치환을 포함할 수 있는 것도 또한 의도된다.
본원에서 사용되는 "모노클로날 항체"란 용어는 실질적으로 동종인 항체의 집단으로부터 수득된 항체를 의미하는데, 즉 소량으로 존재할 수 있는 가능한 천연 발생 돌연변이를 제외한다면 상기 집단을 포함하는 개별적 항체는 동일한 것이다. 모노클로날 항체는 매우 특이적이어서 단일 항원 에피토프에 대해 지시된다. 대조적으로, 통상의 (폴리클로날) 항체 제제는 전형적으로 상이한 에피토프에 대해 지시된(또는 이에 대해 특이적인) 다수의 항체를 포함한다. 수식어 "모노클로날"은 실질적으로 균일한 항체 집단으로부터 수득된 항체의 특징을 나타내고, 임의의 특정 방법에 의한 항체의 생산을 필요로 하는 것으로 해석되지 않을 것이다. 예를 들면, 본 발명에 따라 사용될 모노클로날 항체는 문헌[참조: Kohler et al., Nature 256: 495 (1975)]에 최초로 기술된 하이브리도마 방법으로 제조할 수 있거나, 재조합 DNA 방법[참조: 미국 특허 제4,816,567호]으로 제조할 수 있다. "모노클로날 항체"는 또한, 예를 들면, 문헌[참조: Clackson et al., Nature 352: 624-628 (1991) 및 Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1991)]에 기재된 기술을 사용하여 파아지 항체 라이브러리로부터 분리될 수 있다.
본원에서 사용되는 "사람화된 항체"란 용어는 비-사람(예: 쥐) 항체 뿐만 아니라 사람 항체로부터의 서열을 함유하는 항체 형태를 의미한다. 이러한 항체는 비-사람 면역글로불린으로부터 유래된 최소 서열을 함유하는 키메릭 항체이다. 일반적으로, 사람화된 항체는 모든 또는 실질적으로 모든 초가변 루프가 비-사람 면역글로불린의 것과 상응하고 모든 또는 실질적으로 모든 FR 영역이 사람 면역글로불린 서열의 것인 하나 이상, 전형적으로는 2개의 가변 도메인을 실질적으로 모두 포함할 것이다. 또한, 사람화된 항체는 임의로 면역글로불린 불변 영역(Fc), 전형적으로는 사람 면역글로불린의 불변 영역의 적어도 일부분을 포함할 것이다.
모노클로날 항체를 생산하기에 적합한 어떠한 방법이라도 사용할 수 있다. 예를 들면, 수용자를 IL-10 또는 이이 단편으로 면역화시킬 수 있다. 어떠한 적합한 면역화 방법이라도 사용할 수 있다. 이러한 방법은 보조제, 기타 면역자극제, 관련 부스터 면역화 및 하나 이상의 면역화 경로의 사용을 포함할 수 있다.
임의의 적합한 IL-10 또는 VEGF 공급원을 본원에 개시된 조성물 및 방법의 비-사람 항체를 생산하기 위한 면역원으로서 사용할 수 있다. 이러한 형태에는 당업계에 공지된 재조합, 합성, 화학적 또는 효소적 분해 수단을 통해 생산되는, 전체 단백질, 펩타이드(들) 및 에피토프가 포함되나 이에 제한되지 않는다.
생물학적 활성 항체를 생산하기에 충분한 항체를 생산하기 위해 어떠한 형태의 항원이라도 사용할 수 있다. 따라서, 유도성 항원은 단독의 또는 당업계에 공지된 하나 이상의 면역원성 증강제와 배합된 단일 에피토프, 다중 에피토프 또는 전체 단백질일 수 있다. 유도성 항원은 분리된 전체길이 단백질, 세포 표면 단백질(예를 들면, 항원의 적어도 일부분으로 형질감염된 세포를 이용한 면역화) 또는 가용성 단백질(예를 들면, 오로지 단백질의 세포외 도메인 부분만을 이용한 면역화)일 수 있다. 항원은 유전적으로 변형된 세포에서 생산될 수 있다. 이러한 항원을 암호화하는 DNA는 게놈 DNA 또는 비-게놈 DNA(예; cDNA)일 수 있으며 세포외 도메인의 적어도 일부분을 암호화한다. 본원에서 사용되는 "일부분"이란 용어는 경우에 따라 관심대상의 항원의 면역원성 에피토프를 구성하는 최소 개수의 아미노산 또는 핵산을 의미한다. 아데노바이러스 벡터, 플라스미드, 및 비-바이러스성 벡터(예: 양이온성 벡터)를 포함하여, 관심대상의 세포의 형질전환에 적합한 어떠한 유전적 벡터라도 사용할 수 있다.
G. 폴리클로날 항체를 이용한 분비형 MDA-7의 정제 및 특성화
1. 친화성 컬럼 제조
먼저, 토끼 혈청으로부터 사람 MDA-7에 대한 상이한 폴리클로날 항체를 정제하였다. 동결된 토끼 혈청 샘플을 해동시키고 멸균 1X PBS 완충액과 1:1로 희석하였다. 희석된 샘플을 각각 4℃, 밤새 욕법(浴法)으로 단백질 A-세파로스(SIGMA) 2ml에 완만한 진탕하에 노출시켰다. 4개의 다른 컬럼을 작제하였다. 수지는 pH 7.0이 되도록 20mM 이염기성 인산나트륨(61ml) 10배 컬럼 부피로 세척하였다. 이 컬럼을 3배 컬럼 용적의 0.15M NaCl(pH 3.0)을 3회 분취량으로 사용하여 용출시킨 뒤 0.5M HEPES로 중화시켰다. 브래드포드 단백질 분석법(BioRad)을 사용하여 용출된 항체를 정량하였다. 이러한 항체를 그 다음 10,000 MWCO 투석 카세트에서 밤새 투석하여 0.5M NaCl을 함유하는 0.1M NaHCO3(pH 8.3)로 교환시켰다.
건조된 CNBr-세파로즈의 활성화를 위해, 1g을 10 내지 15 컬럼 용적의 1mM 냉 HCl로 세척하였다. 연속 5ml 용적을 사용하여 슈크로스를 제거하였다. 그 다음, 활성화된 CNBr-세파로즈를 1 컬럼 용적의 연속 세척을 통해 10배 컬럼 용적으로 세척하여 0.1M NaHCO3(pH 8.3)으로 교환시켰다. 각각의 경우마다. 약 80 내지 90mg의 항체가 정제 및 완충액 교환 후 회수되었다. 그 다음, 팽윤된 활성화 CNBr-세파로즈 5ml을 0.1M NaHCO3(pH 8.3) 중의 정제 항체 80 내지 90mg과 완만한 진탕하에 실온에서 4시간 동안 항온처리하였다.
항체 결합능은 브래드포드 단백질 분석법으로 측정하고, 각각 활성화 CNBr-세파로즈에 결합된 항체가 95%를 넘는 것으로 관찰되었다. 커플링 후, 미반응 그룹은 0.1M Tris(pH 8.0) 25 내지 30배 컬럼 부피로 세척하여 차단시켰다. 그 다음, 컬럼을 0.1M Tris(pH 8.0), 0.5M NaCl (5X 컬럼 용적)으로 연속 5회 세척한 뒤, 0.1M 아세테이트 완충액(pH 4.0), 0.5M NaCl로 교환시켰다. 세척시 단백질 측정을 실시하였으나, 단백질이 검출되지 않았다.
2. 친화성 크로마토그래피 정제
가용성의 글리코실화된 MDA-7을 분비하는 안정하게 형질감염된 293 t 세포를 입수하여 5% 태아 송아지 혈청, 1:100 L-글루타민, 1:100 pen/strep 및 1:100 HEPES를 함유하는 RPMI에서 높은 컨플루언시를 유지시켰다. 세포는 2 내지 3일 마다 분열하였고, 7일마다 번갈아 1:1000 희석율의 하이그로마이신(20mg/ml 스톡)에서 유지시켰다. 그 다음, 상청액 400ml을 2 내지 3일 마다 수거하여, 분자량 컷오프가 10,000 이상인 막에서 AMICON 교반 셀로 농축시켰다. 농축된 상청액 50ml을 배취법으로 5ml 베드부피의 항체-CNBr-세파로즈(친화성 수지)에 4℃에서 2일 동안 완만한 진탕하에 노출시켰다. 그 다음, 이러한 친화성 수지를 파마시아 XK26 컬럼에 주입하고 상청액을 3회 통과시켜 항원이 항체에 최대한 결합되게 하였다. 친화성 수지는 5x20ml의 0.1M Tris(pH 8.0)으로 중력 유동에 따라 세척하였다. MDA-7은 3x5ml 1M NaCl, 0.1M 글리신 (pH 3.0)으로 용출시키고, 그 즉시 0.5ml HEPES 완충액으로 중화시켰다. 용출 및 중화 직후, 사람 알부민 2mg을 첨가하여 단백질 손실을 방지하였다. 용출된 단백질은 그 다음 분자량 컷오프가 10,000인 스핀 컬럼(AMICON)을 통해 농축하고, 멸균 1X PBS로 교환시켰다. 그 다음, 1X PBS로 교환된 친화성 정제 단백질 1 내지 1.5ml을 200㎕의 3x 세척된 단백질-A 세파로즈(SIGMA)에 교반하에 실온에서 2시간 또는 교반하에 4℃에서 밤새 노출시켰다. 단백질 A 노출은 용출 분획으로 침출된 항체를 흡수한다.
본 명세서에 기술된 바와 같이 제조된 4가지 상이한 폴리클로날 항체를 친화성 정제로 시험하였다. 친화성 정제에 앞서 크기 분리 정제(크기 배제 참조)를 이용하여 상청액으로부터 상량량의 오염 단백질을 제거했는데, 이 오염 단백질 중 대부분은 소혈청 알부민(BSA)이었다. 그러나, 이러한 방식으로 분리된 MDA-7의 노출은 컬럼 상의 항체가 MDA-7을 보유할 수 있게 하지 못하였다. 그 이유는 아마도 BSA의 부재하에 MDA-7을 보유할 수 있는 BSA 차단성 비특이적 결합 부위 때문인 것으로 생각된다. MDA-7은 다량의 글리코실화된 단백질로서 플라스틱 및 다른 표면에 매우 잘 점착할 수 있는 것으로 생각된다.
MDA-7을 함유하는 상청액으로부터 BSA 제거는 친화성 크로마토그래피에 의한 MDA-7 정제를 방해한다. 대부분의 단백질은 통류물 중에 존재했고, MDA-7 단백질도 용출될 때까지 친화성 컬럼에 잔류되지 않았다. 유의적인 양의 BSA(2 내지 3mg/ml, 은염색 시)를 함유한 친화성 정제는 BSA 오염이 유의적으로 적은 정제 시 보다 오랫동안 생물학적 기능을 유지시켰다. 또한, BSA 존재하의 친화성 정제는 높은 몰량의 NaCl과 낮은 pH를 이용한 용출이 이루어질 때까지 친화성 컬럼 상에 MDA-7을 잔류시켰다. 폴리클로날 친화성 수지를 이용한 친화성 정제는 MDA-7 함량이 비교적 비슷한 상이한 분획을 생산하였다. 쿠마시 분석 결과, 비교적 소량의 오염 단백질이 확인되었다. MDA-7은 균질성이 약 20%를 넘게 정제되었다.
친화성 정제는 반복가능했고, MDA-7을 12% 폴리아크릴아미드 겔의 쿠마시 염색 분석에 의해 상대적 순도까지 농축시켰다. 웨스턴 블롯에서 검출되는 밴드의 강도를 통해, 항원을 친화성 수지에 오랫동안 노출시킬수록 MDA-7 잔류량이 증가됨을 알 수 있었다. 투석 카세트와 스핀 컬럼 비교시, 1X PBS로의 교환 방법 사이에는 차이가 거의 없다.
3. 음이온 교환 정제
친화성 정제된 MDA-7의 2 내지 3개 롯트를 모아, 10,000 MWCO 투석 카세트에서 2 내지 12시간 동안 실온에서 50mM MES, pH5.0으로 교환시켰다. 단백질을 그 다음 5ml 층용적의 음이온 교환 컬럼 상에 1ml/분의 유속으로 부하시켰다. 통류물 10ml을 취하여, 결합된 단백질을 1M NaCl(50ml MES 중에, pH 5.0)의 단계 구배로 용출시켰다. 용출 프로그램은 50mM MES(pH 5.0) 10ml 세척액으로 2ml/min의 유속으로 시작하였다. 1단계 용출에서는 0M 내지 0.25M NaCl, 5분과 50mM MES, 0.25M NaCl(pH 5.0), 5분 세척을 사용하였다. 2단계 구배에서는 0.25M NaCl에서 0.5M NaCl, 5분과 그 다음 5분 세척을 실시하였다. 최종 용출 단계에서는 0.5M NaCl 내지 1M NaCl을 사용하였다. MDA-7은 0.9 내지 1.0M NaCl에 의한 용출이 이루어질 때까지 컬럼 상에 잔류하였다. 그 결과, MDA-7은 약 90% 내지 95% 균질성으로 정제되었다.
18kDa의 비글리코실화 단백질은 pH 5.0에서 음이온 교환 컬럼에 결합하지 않았다. MDA-7의 친화성 음이온 교환 후 분획의 은 염색 분석에서는 MDA-7의 비글리코실화 형태가 함께 정제된 글리코실화 단백질과 결합되지 않은 것으로 나타났다. 천연 MDA-7 복합체는 분자량 31, 28 및 27/26인 적어도 3종의 단백질을 함유하는 것으로 보인다. 종래에는 1단계 음이온 교환 정제를 이용하여 MDA-7을 정제하는 시도가 이루어졌는데, 여기서 MDA-7을 함유하는 상청액은 50mM MES, pH 6.0으로 교환되었다. 이러한 1단계 음이온 교환 정제에서는, 음이온 교환 컬럼의 각 피크가, 웨스턴 블롯에서 폴리클로날 항MDA-7에 의해 검출되는 MDA-7을 함유하고 있음이 증명되었다. 이러한 방법에 의한 정제는 MDA-7이 사용된 모든 NaCl 몰 농도에서 컬럼으로부터 침출됨에 따라, 임의의 이온 강도 범위에서 MDA-7을 유의적으로 농축시키지 못하였다.
4. 크기 배제 크로마토그래피
층용적이 200ml인 크기 배제 크로마토그래피 컬럼은 XK26 1 미터 컬럼(파마시아)에 주입한 S200 세파덱스(Pharmacia)를 이용하여 제조하였다. 상기 컬럼을 중력 침강시키고, 이어서 BioRad BioLogic Workstation으로 3.5ml/min의 속도로 압착시켰다.
293 t 세포에 의해 분비되는 MDA-7의 겉보기 분자량을 측정하기 위하여, 상대적 체류 시간을 측정하기 위한 단백질 분자량 표준물(마우스 IgG 5mg, 알칼리성 포스파타제 3mg, BSA 10mg 및 사람 베타2 마이크로글로블린 3mg)을 합하였다. 분자량 표준물에 상대적인 정제 단백질의 용출 시간을 플롯팅했으며, 0.97의 R2 값이 유도되었다. MDA-7을 함유하는 293 t 세포 상청액 200ml은 AMICO 교반 셀 중의 10,000 MWCO 필터를 통해 10ml로 농축시키고, 크기 분리 컬럼 상에서 1X PBS로 2ml/분씩 부하하였다. 5ml씩 분획을 취하고, 일련의 샘플에 대한 웨스턴 블롯 분석을 실시하여 상대적 체류 시간을 측정하여 공지의 표준물 유래의 그래프 선과 비교하였다. 결합된 MDA-7의 겉보기 분자량은 80 내지 100kDa으로 확인되었다. 존재하는 총 MDA-7 중 0.1% 미만은 단량체 31kDa 형태로 관찰되었다. 도 15는 분자량과 잔류시간을 비교한 것이다. MDA-7 복합체는 약 85 내지 95kDa의 분자량 사이에서 용출되었다.
5. 크기, 음이온 및 렉틴 정제
콘카나발린 A-세파로즈 컬럼 상에서의 렉틴 정제를 이용하여 MDA-7 정제를 시도하였다. 그러나, 상대적 순도의 총 증가는 수득되지 않았다. 크기 배제, 음이온 및 렉틴 정제법을 모두 조합한 조합 정제법을 이용하여 MDA-7을 농축시켰다. 그러나, 이러한 방법의 조합은 친화성 크로마토그래피 후 음이온 크로마토그래피를 이용한 경우 보다 MDA-7 정제량을 증가시키지 못하였다. 이러한 결과는, MDA-7이 친화성 및 음이온 교환 크로마토그래피를 통해 적어도 90 내지 95% 균질성으로 정제될 수 있음을 증명한다.
H. 모노클로날 항체를 이용한 분비형 MDA-7의 정제 및 특성화
1. 항체 생산
7G11F.2(모노클로날 항체)로 지칭된 하이브리도마 클론은, 브레펠딘(Brefeldin) A로 처리된 안정하게 형질감염된 293t 세포의 세포내 FACS 분석 결과, IL-24/mda-7 양성 세포를 검출하는데 있어서 가장 효과적인 항체를 생산하는 것으로 관찰되었다. 이러한 예시실험 결과를 바탕으로, 이 클론을 이용하여 상청액 5리터를 생산하였다. 간략히 설명하면, 세포(7G11F.2)를 1x106 세포/ml의 농도로, 10% 태아 송아지 혈청과 1:100 L-글루타민, 1:100 pen/strep 및 1:100 HEPES가 보충된 DMEM 50ml에 접종하였다. 접종 후, 세포를 10일 동안 성장시킨 다음, 상청액을 수거하였다.
2. 항체 정제
상청액을 2000rpm에서 10분 동안 원심분리하여 세포를 제거하고 경사 분리하였다. 청정한 상청액을 그 다음 0.22㎛의 셀룰로스아세테이트 필터를 통해 멸균 여과시키고, YMCO 30kDa 막을 이용하는 Amicon Stirred Cell을 질소 하에 사용하여 50ml로 농축시켰다. 농축된 상청액을, 4℃에서 밤새 rProtein G 가교결합된 세파로즈(Sigma)에 노출시켰다. 항체는 1M NaCl pH 3.0, 3 컬럼 용적을 3회 분취량으로 사용하여 용출시키고 0.5M HEPES로 중화시켰다. 오염성원인 소 IgG를 제거하기 위해, 수득된 용출물을 투석 카세트(Pierce/Endogen, YMCO 30kDa)를 통해 0.4M NaCl을 함유하는 1X PBS(총량)으로 교환시켰다. 수득되는 단백질을 rProtein A 가교결합된 세파로즈(Sigma)에 4℃에서 밤새 노출시켰다. 컬럼 통류물을 취해, 단백질 A가 마우스 IgG1a 보다 소의 IgG에 보다 높은 친화성으로 결합함을 확인하였다. 상대적 순도를 SDS PAGE 분석으로 측정한 결과, 소 IgG가 유일한 오염 단백질인 90% 순도의 7G11F.2로 확인되었다. 브래드포드 단백질 분석법(BioRad)을 이용하여 용출된 항체를 정량 분석하였다. 그 다음, 항체는 10,000 MWCO 투석 카세트에서 밤새 투석하여 0.5M NaCl을 함유하는 0.1M NaHCO3(pH 8.3)로 교환시켰다.
3. 친화성 컬럼 제조
건조된 CNBr-세파로즈의 활성화를 위해, 1g을 10 내지 15 컬럼 용적의 1mM 냉 HCl로 세척하였다. 일련의 5ml 용적을 사용하여 슈크로스를 제거하였다. 그 다음, 활성화된 CNBr-세파로즈를 1 컬럼 용적의 연속 세척을 통해 10배 컬럼 용적으로 세척하여 0.1M NaHCO3(pH 8.3)으로 교환시켰다. 정제 및 완충액 교환 후, 25mg의 항체(7G11F.2)가 회수되었다. 그 다음, 팽윤된 활성화 CNBr-세파로즈 2ml을 0.1M NaHCO3(pH 8.3) 중의 정제된 항체와 함께 완만한 진탕하에 실온에서 4시간 동안 항온처리하였다.
항체 결합 효율은 브래드포드 단백질 분석법으로 측정하고, 활성화 CNBr-세파로즈에 결합된 항체가 95%를 넘는 것으로 관찰되었다.
커플링 후, 미반응 그룹을 0.1M Tris(pH 8.0) 중에서 25 내지 30 컬럼 부피로 세척하여 차단시켰다. 마지막으로, 컬럼을 0.1M Tris(pH 8.0), 5X 컬럼 용적의 0.5M NaCl로 0.1M 아세테이트 완충액(pH 4.), 0.5M NaCl와 번갈아 5회 세척하였다. 세척시 단백질 측정을 실시하였으나, 단백질이 검출되지 않았다.
4. 친화성 정제
가용성의 글리코실화된 IL-24를 분비하는 안정하게 형질감염된 293 t 세포를 인트로겐(Introgen)으로부터 입수하여 5% 태아 송아지 혈청, 1:100 L-글루타민, 1:100 pen/strep 및 1:100 HEPES를 함유하는 RPMI에서 고융합성을 유지시켰다. 세포는 2 내지 3일 마다 분열하였고, 7일마다 번갈아 1:1000 희석율의 하이그로마이신(20mg/ml 스톡)에서 유지시켰다. 그 다음, 상청액 400ml을 2 내지 3일 마다 수거하여, 분자량 컷오프가 10,000 이상인 막에서 AMICON 교반 셀로 농축시켰다. 농축된 상청액 50ml을 배취법으로 5ml 베드부피의 항체-CNBr-세파로즈(친화성 수지)에 4℃에서 2일 동안 완만한 진탕하에 노출시켰다. 이러한 친화성 수지를 그 다음 파마시아 XK26 컬럼에 주입하고 상청액을 3회 통과시켜 항원이 항체에 최대한 결합되게 하였다. 친화성 수지는 5x20ml의 0.1M Tris(pH 8.0)으로 중력 유동에 따라 세척하였다. IL-24는 3x5ml 1M NaCl, 0.1M 글리신 (pH 3.0)으로 용출시키고, 그 즉시 0.5ml HEPES 완충액으로 중화시켰다. 용출 및 중화 직후, 사람 알부민 2mg을 첨가하여 단백질 손실을 방지하였다. 용출된 단백질은 그 다음 분자량 컷오프가 10,000인 스핀 컬럼(AMICON)을 통해 농축하고, 멸균 1X PBS로 교환시켰다. 그 다음, 1X PBS로 교환된 친화성 정제 단백질 1 내지 1.5ml을 200㎕의 3x 세척된 단백질-A 세파로즈(Sigma)에 교반하에 실온에서 2시간 또는 교반하에 4℃에서 밤새 노출시켰다. 단백질 A 노출은 용출 분획으로 침출된 항체를 흡수했으며, 이의 제거는 IL-24 기능 유지에 중요하다.
7G11F.2 모노클로날 항체 컬럼은 실시예 11의 폴리클로날 컬럼에서와 유사한 양의 IL-24/mda-7을 생산하였다.
다음 일반적 기술도 또한 공지되어 있으며 정제 방법을 실시하는데 사용할 수 있다.
1. 겔 전기영동
겔 전기영동은 정제 과정 중에 사용될 수 있는 공지의 기술이다. 이러한 정제방법에는, 아가로스, 아가로스-아크릴아마이드 또는 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동을 이용한 표준 방법(Sambrook et al., 2001)이 사용될 수 있다.
2. 크로마토그래피 기술
또는, 크로마토그래피 기술을 이용하여 MDA-7의 분리 및 정제를 실시할 수도 있다. 본 발명에 사용할 수 있는 크로마토그래피법에는 다수의 종류가 있다. 즉, 흡착, 친화성, 분배, 이온교환 및 분자체. 이들을 이용하는 특수 기술에는 컬럼, 종이, 박층 및 기체 크로마토그래피를 비롯하여 다수가 있다(Freifelder, 1982).
3. 면역 시약
본 발명의 특정 양태에는 면역 시약의 사용도 포함된다. 본 발명의 특정 양태에서, 면역 시약은 MDA-7의 정제 또는 제조에 사용된다. 본 명세서에 논의되고 있는 항체도 본 발명에 사용되는 것으로 이해되어야 한다. 항체는 정제 방법과 함께 사용하는 것이 의도된다. 이러한 항체는 용이하게 생성시킬 수 있고/있거나 용이하게 입수가능하다.
본 명세서에 사용된, "항체"란 용어는 모든 면역 병용제, 예를 들면 IgG, IgM, IgA, IgD 및 IgE를 포괄적으로 의미하는 것이다. 일반적으로, IgG 및/또는 IgM은 생리적 상태에서 가장 일반적인 항체이고 실험실 조건에서 가장 용이하게 제조될 수 있기 때문에 바람직하다.
"항체"란 용어는 항원 결합 영역을 보유한 임의의 항체 유사 분자를 의미하기도 하며, 그 예에는 Fab', Fab, F(ab')2. 단일 도메인 항체(DAB), Fv, scFv(일본쇄 Fv) 등과 같은 항체 단편이 있다. 각종 항체계 작제물과 단편을 제조 및 사용하는 기술은 당업계에 공지되어 있다. 항체를 제조 및 특성분석하는 방법도 당업계에 공지되어 있다[참조: Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988; 본원에서 참고로 인용됨].
모노클로날 항체(MAb)는 특정 장점, 예를 들면 재현성 및 대량 생산의 장점을 갖고, 이러한 항체의 사용은 일반적으로 바람직한 것으로 인식되고 있다. 따라서, 본 발명은 사람, 쥐, 원숭이, 랫트, 햄스터, 토끼 및 심지어 병아리 기원의 모노클로날 항체를 제공한다. 제조 용이성과 시약의 용이한 입수용이성으로 인하여, 쥐 모노클로날 항체가 보통 바람직하다.
그러나, "사람화된" 항체도 본 발명에 포함되며, 그 예에는 사람의 불변 영역 및/또는 가변 영역 도메인을 보유하는 마우스, 랫트 또는 다른 종 유래의 키메라 항체, 이중특이 항체, 재조합 및 조작된 항체 및 이의 단편이 있다. 이와 유사하게, 환자의 치아 질환에 대한 "주문제작식(custom-tailored)" 항체의 개발 방법도 공지되어 있으며, 이러한 주문제작식 항체도 본 발명에 포함되는 것이다.
모노클로날 항체(MAb)의 생산 방법은 당업자에게 널리 공지되어 있다.
I. NSAID 및 COX-2 억제제
NSAID는 스테로이드가 아닌 소염제이다. 소염제 작용 이외에, NSAID는 진정, 해열 및 혈소판-억제성 작용을 갖는다. 이는 만성 관절염 상태, 및 통증 및 염증을 동반한 특정 연조직 질환의 치료에서 주로 사용된다. 이는 아라키돈산을 프로스타글란딘의 전구체인 엔도퍼옥시다로 전환시키는 사이클로옥시게나제를 억제함으로써 프로스타글란딘의 합성을 차단하는 작용을 한다. 본 발명은 효소 COX-2를 선택적으로 억제하는 이러한 NSAID의 용도를 의도한다.
NSAID는 결장 종양 세포주 및 동물 조직 둘다에서 아폽토시스를 유도하고 종양에서는 Ki-ras 활성화를 억제하는 것으로 보이지만, Ki-ras의 활성화는 아직 NSAID-매개성 세포독성의 기작으로서 조사되지 않았다. 이러한 세포독성이 NSAID의 소염 특성에 의존적이라는 것 또한 공지되어 있지 않다. Ki-ras 활성화를 또한 억제하는 NSAID 술린닥은 2가지 상이한 분자로 대사되며, 이러한 2가지 분자는 COX를 억제하는 능력에 있어 상이하지만, 둘다 아폽토시스의 유도를 통해서 화학적예방 효과를 발휘할 수 있다. 그러나 술린닥 술폰은 COX-억제 활성이 결여되어 있으며, 프로스타글란딘 활성과 독립적 방식으로 아폽토시스의 유도를 촉진할 가능성이매우 크다. 다시, 본 발명은 사이클로옥시게나제를 특이적으로 그리고 직접적으로 억제하는 화합물 또는 제제를 의미하는 COX-2 선택적 억제제를 포함한다.
COX-2 선택적 억제제에는 셀레콕시브 (CELEBREXTM), 로페콕시브 (VIOXXTM), 발데콕시브 (BEXTRATM), 루미라콕시브 (PREXIGETM) 또는 에토리콕시브 (ARCOXIATM)가 포함된다. 셀레콕시브 및 로페콕시브의 시판 형태는 최근에 심혈관계에 대한 이의 효과 및 심혈관 질환의 인지된 위험 증가에 관한 염려 때문에 회수되었다. PREXIGE 및 ARCOXIA는 다른 국가에서는 승인되었지만, 미국에서는 아직 FDA에 의해 사용이 승인되지 않았다.
1. 셀레콕시브
특정 양태에서, 본 발명은 COX-2 억제제 셀레콕시브와 관련된다. Searle에 의해 상표명 CELEBREXTM으로 시판되는 셀레콕시브는 화학적으로 4-[5-(4-메틸페닐)-3-(트리플루오로메틸)-1H-피라졸-1-일]벤젠술폰아미드로서 명명된다. 실험식은C17H14F3N3O2S이고, 분자량은 381.38이다. CELEBREXTM는 100 또는 200mg 경구 캡슐제로서 시판되고 있다.
셀레콕시브는 동물 모델에서 소염, 진통 및 해열 활성을 나타낸다. 작용 기작은 프로스타글란딘 합성의 억제의 결과인 것으로 사료된다. 효소 사이클로옥시게나제-2 또는 "COX-2"는 이러한 경로에서 중요한 효소이다. COX-2의 선택적 억제(관련 효소 COX-1는 억제되지 않는다)는 셀레콕시브의 특징이며, COX-1의 억제와 관련된 잠재적 위장관 독성을 감소시키는 것으로 사료된다.
a. 약동학
셀레콕시브의 최고 혈장 수준은 경구 투여 후 대략 3시간째이다. 고지방 식이와 함께 섭최한 경우, 혈장 수준은 약 1 내지 2시간 지연되었으며, 최대 흡수율은 10 내지 20% 증가하였다. 알루미늄 또는 마그네슘 함유 제산제는 혈장 농도를 감소시킨다. 셀레콕시브는 임상적 용량 범위를 갖는 고도로 단백질 결합성 물질로서, 시험관내 연구는 알부민 및 알파1-산 당단백질이 주요 결합 종임을 나탄내다. 사이토크롬 P450 2C9는 셀레콕시브의 주요 대사 효소이다. 3가지 주요 대사산물은 알코올, 상응하는 카복실산 및 이의 글루쿠로나이드 접합체이며, 이들 대사산물은 COX-1 및 COX-2 억제제로서는 불활성적이다. 단이 투여 후, 용량의 57%가 대변으로 배출되고 27%가 뇨로 배출된다. 유효 반감기는 절식 상태하에 대략 11시간이다.
b. 환자 집단
노인 환자들은 최대 혈청 농도가 높으며, 중장년층 남성은 중장년층 여성보다 최대 혈청 농도가 높다. 50kg 미만의 중장년층 환자들의 경우, 초기에는 낮은 용량이 사용되어야 한다. 흑인은 코커서스인보다 높은 혈청 농도를 나타낸다. 간 부전은 혈청 농도를 증가시키는 반면, 신 부전은 농도를 감소시킨다.
c. 약물 상호작용
환자들은 사이토크롬 P450 2C9를 억제하는 약물의 사용에 관해 문의를 받아야 한다. 구체적인 잠재적 약물 상호작용은 플루코나졸 및 리튬 및 가능하게는 프로세미드 및 ACE 억제제를 포함한다.
d. 부작용 및 금기
NSAID에 대한 부작용은 전형적으로 위십이지장 및 위장관 자극을 포함한다. 그러나, 셀레콕시브는 NSAID보다 이러한 부작용을 훨씬 덜 나타낸다. 셀레콕시브에 대해서는 부작용도 보고된 바 없으나, 기타 가능한 부작용은 아나필락시스 반응을 포함한다. 또한, 진행된 신장 질환 환자 및 임산부도 셀렉콕시브를 피해야 한다.
e. NSAID의 배합물
다양한 COX-2 억제제의 배합물을 또한 본 발명에 따라 사용할 수 있다. 예를 들면, 저 용량의 다수의 COX-2 억제제 및 MDA-7를 사용함으로써 고 용량의 개개 화합물과 관련된 부작용 또는 부작용을 감소시킬 수 있다. 구체적으로는, 본 발명에 개요된 목적을 위해, 셀레콕시브는 이러한 방식으로 기타 COX-2 억제제와 함께 사용될 수 있다.
2. VIOXXTM
특정 양태에서, 본 발명은 COX-2 억제제 로페콕시브와 관련된다. Merck에 의해 상표명 VIOXXTM으로 시판되는 레오페콕시브는 화학적으로 4-[4-(메틸설포닐)페닐]-3-페닐-2-(5H)푸라논으로 명명된다. 실험식은 C17H14O4S이고, 분자량은 314.36이다. VIOXXTM은 12.5, 25 또는 50mg 경구 캡슐제 또는 12.5 또는 25 mg/5 ml 농도를 갖는 경구 현탁제로서 시판되고 있다.
셀레콕시브는 동물 모델에서 소염, 진통 및 해열 활성을 나타낸다. 작용 기작은 COX-2를 선택적으로 억제함(COX-1는 억제하지 않음)에 의한 프로스타글란딘의 억제의 결과인 것으로 사료된다.
a. 약동학
로페콕시브의 최고 혈장 수준은 경구 투여 후 2 내지 3시간이다. 최고 수준이 고지방 식이 후 1 내지 2시간 지연되었다는 것을 제외하고는 식품은 혈장 수준에 영향을 주지 않았다. 이는 주로 세포질 효소의 환원을 통해 대사된다.
b. 약물 상호작용
구체적인 잠재적 약물 상호작용은 리팜핀, 테오필린 및 와르파린을 포함한다.
c. 부작용 및 금기
결정된 중증 심혈관 혈전증의 높은 발생율이 환자에서 관찰되었다.
3. 발데콕시브
특정 양태에서, 본 발명은 COX-2 억제제 발데콕시브와 관련된다. Pfizer에 의해 상표명 BEXTRA으로 시판되는 셀레콕시브는 화학적으로 4-(5-메틸-3-페닐-4-이속사졸릴) 벤젠술폰아미드이다. 실험식은 C16H14N2O3S이고, 분자량은 314.36이다. BEXTRA는 10 또는 20mg 경구 캡슐제로서 시판되고 있다.
셀레콕시브는 소염, 진통 및 해열 활성을 갖는다. 이는 혈장에서 발견되는 양에서 COX-2는 선택적으로 억제하지만 COX-1는 억제하지 않는 것으로 사료된다.
a. 약동학
발데콕시브의 최고 혈장 수준은 약 3시간 후에 달성된다. 식품에 의해 유발되는 유의적 효과는 없었지만, 고지방 식이와 함께 섭취하는 경우 혈장 수준은 약 1 내지 2시간 지연되었다.
발데콕시브는 P450 동종효소 3A4 및 2C9 뿐만 아니라, 글루쿠론산화(glucuronidation)를 통해 글루비-P450 효소에 의해서도 대사된다. 플루코나졸 및 에토코나졸과 같은, 3A4 및/또는 2C9를 억제하는 약물은 혈장 농도를 증가시킬 수 있다.
b. 환자 집단
차이는 확인된 바도 없고 연구되지도 않았다.
c. 약물 상호작용
환자는 사이토크롬 P450 2C9 및 3A4의 사용에 관해 문의를 받아야 한다. 구체적인 잠재적 약물 상호작용은 플루코나졸 및 케토코나졸을 포함한다. 또한, 발데콕시브에 대한 약 10%의 농도에서 사람 혈장 중의 발데콕시브에 대한 활성 대사산물이 있다.
d. 부작용 및 금기
심각한 피부 반응이 나타났다. 또한, 위장관 독성이 관찰되었다.
J. Hsp90 억제제
본 발명은 Hsp90에 직접 결합하고 항종양 활성을 갖는 화합물을 의미하는 Hsp90 억제제에 관한 것이다. Hsp90은 종양 세포의 성장 및/또는 생존을 촉진하는 각종 돌연변이된 및 과발현된 신호전달 단백질의 폴딩, 어셈블리 및 활성을 위해 중요한 분자 샤프론(chaperone)이다. Hsp90 의뢰 단백질(client protein)은 돌연변이된 p53, Raf-1, Akt, ErbB2 및 저산소증 유도성 인자 1α (HIF-1α)를 포함한다[참조: Neckers, 2002].
특정 양태에서, 당해 화합물은 벤조퀴논 안사마이신 및 이의 유사체와 같은 천연 및 합성 소분자이다. 구체적 양태에서, Hsp90 억제제는 겔다나마이신 및 이의 유사체 및 유도체이다.
겔다나마이신(GA)은 스트렙토마이세스 하이드고스코피쿠스(Streptomyces hygroscopicus)에 의해 생산되는 벤조퀴논 안사마이신 항생제이다. 겔다나마이신은 열 쇼크 단백질 Hsp 90에 특이적으로 결합하여 이의 의뢰 단백질의 탈안정화 및 분해를 야기하는 이의 능력에 의해 야기되는 것으로 사료되는 항종양 특성을 갖는 것으로 나타났다[참조: Whitesell et al., 1994; Neckers et al., 1999].
임상 시험에서 GA의 유사체는 17-알랄아미노-17-데메톡시겔다나마이신(17AAG)으로서, 이는 겔다나마이신(GA)의, 독성이 덜하고 보다 안정한 유사체이다[참조: Schulte et al., 1998]. Hsp90에 결합하는 17AAG가 GA보다 약하지만, 17AAG는 GA와 유사한 항종양 효과를 나타내며 보다 우수한 독성 프로파일을 갖는다. I기 임상 시험으로부터의 정보는 17AAG가 최대 허용 용량 미만의 농도에서 항종양 활성을 갖는다는 것을 입증한다[참조: Agnew et al., 2001].
본 발명에는 GA의 표적화된 형태가 포함된다. 예를 들면, 고형 종양의 요법용으로 승인된 최초의 mAb인 헤르셉틴은 Her2를 표적화여, GA를 Her2-과발현 종양으로 표적화시키기 위해 선택되었다. NCI는 이러한 접합체가 단독의 헤르셉틴보다 강력한 선택적 세포독성 효과를 전달함을 보고하였다. 이러한 접합체를 제조하기 위해, GA을 변형시켜 잠재적 1급 아민을 유도한다[참조: Mandler et al, 2002]. 탈보호 후, 상기 1급 아민은 단백질에 연결될 수 있는 말레이미드 그룹의 유도를 위한 부위를 제공한다[참조: Mandler et al., 2004]. InvivoGen이란 명칭의 업체는 겔다나마이신의 말레이미도 유도체인 17-(3-(4-말레이미도부티르카복스아미도)프로필-아미도) 겔다나마이신(GMB-APA-GA)을 제조하였으며, 이는 헤르셉틴 또는 기타 mAb와 용이하게 접합될 수 있다. 다른 양태의 범주에서 본 출원에서 기술한 바와 같은 기타 항체도 본 발명에서의 사용이 의도된다.
겔다나마이신 유사체 및 유도체에는 17AAG, NSC 255110, NSC 682300, NSC 683661, NSC 683663, 17DMAG, 15-하이드록시겔다나마이신, 트리사이클릭 겔다나마이신 유사체(KOSN-1633), 메틸-겔다나마이시네이트, 17-포르밀-17-데메톡시-18-O,-21-O-디하이드로겔다나마이신 및 17-하이드록시메틸-17-데메톡시겔다나마이신이 포함되나, 이에 제한되지 않는다[참조: Patel et al. (2004); Smith et al. (2004); Tian et al. (2004); Hu et al. (2004); Le Brazadec et al. (2004), 이는 본원에서 참조로 인용된다].
특정 양태에서, GA 또는 GA의 유도체 또는 유사체는 26S 프로테아좀의 키모트립신-유사 활성의 가연적 억제제인 보르테조미브(Bortezomib)을 이용한 치료 요법의 일부분으로서 제공된다. 용량은 약, 적어도 약 또는 최대 약 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2.0, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9, 3.0, 3.1, 3.2, 3.3, 3.4, 3.5, 3.6, 3.7. 3.8, 3.9, 4.0, 4.1, 4.2, 4.3, 4.4, 4.5, 4.6, 4.7, 4.8, 4.9, 5.0 mg/m2 (종양 크기에 대해) 또는 mg/일 또는 이 범위에서 추론할 수 있는 임의의 범위일 수 있다. 특정한 양태에서, 보르테조미브는 정맥내 투여된다.
특정 양태에서, 환자에게 GA 또는 이의 유사체 또는 유도체가 28일 주기중 1일, 8일 및 15일째에 300mg/m2의 용량에서 정맥내 주입으로서 투여된다. 필요에 따라, 다수의 요법 주기가 의도된다.
K. 비타민 E 화합물
"비타민 E 화합물"이란 용어는 8개의 관련된 지용성 항산화 화합물(알파(α)-토코페롤, 베타(β)-토코페롤, 감마(γ)-토코페롤, 델타(δ)-토코페롤, α-토코트리에놀, β-토코트리에놀, γ-토코트리에놀 및 δ-토코트리에놀)을 의미한다. 토코페롤 및 토코트리에놀 아계열은 각각 특유의 생물학적 효과를 갖는 알파, 베타, 감마 및 델타 비타머로 이루어진다. 토코페롤은 불포화 이소프레닐 측쇄가 아니라 포화된 피틸 측쇄를 갖는다는 점에서 토코트리에놀과 다르다.
알파-토코페롤은 사람 체내에서 활성적으로 유지되는 비타민 E의 유일한 형태이며, 따라서 혈중 및 조직에서 발견되는 비타민 E의 가장 풍부한 형태이다[참조: Traber, 1999]. 사람에서 알파-토코페롤의 주요 기능은 항산화제로서 작용하는 이의 능력인 것으로 보인다[참조: 인터넷 웹(lpi.oregonstate.edu/infocenter/ vitamins/vitaminE). 비타민 E의 합성 형태가 이용될 수 있다(12.5% 진정한(authentic) RRR-α-토코페롤 및 87.5% 입체이성체로 이루어진 화학적 혼합물; 즉, 동일한 순서로 연결되었지만 공간적 배열에 있어 상이한 RRR-α-토코페롤에서 발견되는 동일한 개수와 종류의 원자를 갖는, 제조 공정 동안 제조된 7개의 분자)[참조:"Dietary Reference Intakes for Vitamine C, Vitamine E, Selenium, and Carotenoids," 2000, and Kline et al., 2003]. 따라서, 천연의 진정한 비타민 E(RRR-α-토코페롤 또는 d--토코페롤로서 지칭됨) 및 합성 비타민 E(all-rac[emic]--토코페롤 또는 dl--토코페롤)은 화학적으로 등가물이 아니다.
진정한 RRR-α-토코페롤 및 합성 비타민 E는 둘다 아세테이트 또는 숙시네이트 유도체로서 구입할 수 있다. RRR-α-토코페롤의 크로만 헤드의 변형은 공기에 노출시 산화로부터 C-6 위치의 하이드록실 잔기를 보호하기 위해 수행되고, 항산화능을 회복하기 위해 제거되어야만 한다[참조: Kline et al., 2003]. α-TEA로 지칭되는, RRR-α-토코페롤의 비가수분해성 에테르 유사체가 동정되었다[참조: Lawson et al., 2003]. 구체적으로는, α-TEA를 본 발명의 방법 및 조성물에서 비타민 E 유사체로서 사용될 수 있는 것으로 의도된다. 비링거(Birringer) 등의 논문은 비타민 E 유사체를 논의하고 있으며 본원에서 참조로 인용된다[참조: Birringer et al., 2003].
비타민 E 화합물은 일반적으로 알파-토코페릴 또는 알파-토코페릴 숙시네이트와 같은 에스테르화된 형태로 제조되고 이용될 수 있다. 이들 형태중 어느 것도 장내의 아세테이트 또는 숙시네이트 잔기의 제거에 의해 체내에서 알-토코페롤로 전환될 때까지 임이의 항산화 활성을 갖지 않는다. 에스테르화된 형태는 산화에 대해 보다 내성이 있으며 저장 시간 및 온도에 있어 비에스테르화된 형태보다 훨씬 더 안정하다. 숙시네이트 형태의 활성화는 아세테이트 형태보다 느리지만, 숙시네이트 형태는 다른 형태가 이용될 수 없는 조직 영역에 접근하여 이득을 주는 것으로 보인다.
비타민 E는 체내에서 하나 이상의 기작을 갖는다. 이는 유리 라디칼을 파괴하고(항산화 작용), 막을 안정화시키고, 프로스타글란딘의 합성을 억제하고, 혈소판 응집을 방지하고, 일부 암 세포(시험관내 흑색종 세포)에서 세포 분화를 유도하고, 일부 종양 세포(쥐 신경모세포종, 랫트 신경아교종 및 사람 전립선)의 성장을 억제한다. 이의 암-퇴치 능력은 이것이 프로스타글란딘 합성을 억제하는 것과 관련될 수 있는데, 이는 과량의 프로스타글란딘이 면역계를 억제할 수 있기 때문이다[참조: 인터넷 웹(springboard4health.com/notebook/v_e.html)].
몇몇 연구는 RRR-α-토코페롤의 가수분해성 에스테르 유도체인 RRR-α-토코페릴 숙시네이트(비타민 E 숙시네이트; VES)의 잠재적 항종양 활성을 기술하였다. 프라사드 및 에드워드-프라사드(Prasad and Edwards-Prasad)는 최초로, 비타민 E의 다른 형태가 아닌 비타민 E 숙시네이트가 마우스 흑색종 B-16 세포의 형태학적 변경 및 성장 억제를 유도하는 능력을 기술하였고 비타민 E 숙시네이트가 유용한 종양 치료제임을 제시하였다[참조: Prasad et al., 1982]. 추가의 연구는 비타민 E 숙시네이트가 유방암, 전립선암, 폐암 및 결장암을 포함하는 광범위한 상피 암 세포 유형 뿐만 아니라 시험관내 조혈-림프계 백혈병 및 림프종 세포의 잠재적 성장 억제제임을 입증하였다[참조: Fariss et al., 1994; Kline et al., 1998; Kline et al., 2001; Neuzil et al., 2000 ; Prasad et al., 1992; Schwartz et al., 1992]. 최근의 연구는 비타민 E 숙시네이트가 동물 이종이식 및 동종이식 모델에서 복강내(i.p.) 투여되는 경우에 항종양 활성을 갖는다고 입증하였으며[참조: Malafa et al., 2000; Malafa et al., 2002; Neuzil et al., 2001; Weber et al., 2002], 이는 가능한 치료학적 잠재성을 시사한다. 복강내 또는 경구(p.o.) 투여된 비타민 E 숙시네이트는 또한 마우스에서 발암물질 [벤조(자)피렌]-유도된 전위(forestomach) 암형성에 대해 억제 효과를 갖는 것으로 나타났으며, 이는 항-암형성제로서의 잠재성을 시사한다[참조: Wu et al., 2001]. 조사에 의해, 비타민 E 숙시네이트가 DNA 합성 차단, 세포 분화의 유도 및 아폽토시스의 유도를 통해서 암 세포 성장의 농도- 및 시간-의존적 억제를 유도한다는 것이 입증되었다[참조: Kline et al., 1998; Kline et al., 2001; Neuzil et al., 2001; You et al., 2001; You et al., 2002; Yu et al., 2001].
비타민 E 숙시네이트는 종양 세포에 대한 이의 성장 억제 효과의 유도 뿐만 아니라 정상 세포 및 조직에 대한 독성이 결여되었다는 점에서도 주목할 만하다[참조: Fariss et al., 1994; Kline et al., 1998; Kline et al., 2001; Neuzil et al., 2000 ; Prasad et al., 1992; Schwartz et al., 1992; Weber et al., 2002]. 비-가수분해성 비타민 E 숙시네이트 유도체의 사용은, 항-증식 효과를 책임지는 것은 온전한 화합물이며 이의 분해 산물(즉, RRR-α-토코페롤 또는 숙신산)이 아님을 보여주었다[참조: Fariss et al., 1994]. 따라서, 이러한 비타민 E 유도체의 항-증식 작용은 비-항산화 특성 때문인 것으로 고려된다. RRR-α-토코페릴 숙시네이트(VES)는 에스테르 연결을 통해서 구조적으로 변형되어 크로만 헤드의 6-위치에 하이드록실 잔기 대신에 숙시닐 잔기를 함유하는 RRR-α-토코페롤의 유도체이다. 이러한 RRR-α-토코페롤의 에스테르 연결된 숙시네이트 잔기는 아폽토시를 촉발시키고 DNA 합성을 억제하는 생물학적 작용을 발휘하는 가장 강력한 형태의 비타민 E였다. 이러한 형태의 비타민 E는 종양 세포가 아폽토시스를 일으키도록 유도하는 반면, 정상 세포에는 아폽토시스 유도 효과를 갖지 않는다. 비타민 E의 숙시네이트화 형태는 온전한 제제로서 항암제로서 효과적이지만, 숙시네이트 잔기를 절단하여 RRR-α-토코페롤의 숙시네이트 형태를 유리 RRR-α-토코페롤로 전환시킬 수 있는 세포성 및 조직 에스테라제는 당해 화합물이 항암제로서 효과가 없게 만든다. RRR-α-토코페롤은 상피 또는 면역 기원의 세포에서 항증식 또는 아폽토시스촉진성 생물학적 활성 어떠한 것도 나타내지 않는다.
비타민 E는 통상적으로 식물에서 발견되며 종자에서 보다 풍부하게 발견되며, 이로부터 유래된 토코페롤은 천연 상태에서 사람 및 야생 및 사육 동물에서 용이하게 흡수되고 사용된다[참조: 미국 특허 제5,179,122호, 이는 본원에서 참조로 인용된다]. 장기 저장을 위한 식품 및 사료 가공업은 비타민 E 함량의 분해를 가속화시켰다. 식품원으로부터 천연 비타민 E의 손실을 보충하기 위해, 천연 또는 합성 비타민 E의 영양 보충물이 주사에 의해 또는 경구로 투여된다. 토코페롤이 불안정한 화합물임은 널리 공지되어 있다. 토코페롤 안정성을 향상시키기 위해, 제조공정은 일반적으로 아세테이트 또는 숙시네이트 그룹을 토코페롤에 결합시켜 비타민 E 아세테이트 또는 숙시네이트 (d- 또는 dl-알파-토코페릴 아세테이트 또는 숙시네이트)를 제조한다. 비타민 E의 장내 흡수시 수성 비타민 E 용액 및 분산액의 친수성 성질의 효능이 정상 및 약화된 장에 의한 친수성 비타민 E의 증가된 흡수로 나타날 수 있다는 것은 널리 공지되어 있다. 당업계에는 비타민 E의 천연 또는 합성 공급원도 또한 이의 생체이용율에 영향을 주는 것으로 공지되어 있다. 약화된 장에서, 비타민 E 흡수는 담즙정체 간과 같은 지질 흡수장애 증후군 및 낭성 섬유증 환자에서 연구되었다. 이러한 환자는 비타민 E 또는 기타 식이성 지질을 흡수하지 못한다. 비타민 E의 수용성 형태 (d-알파-토코페릴 폴리에틸렌 글리콜 1000 숙시네이트 또는 "TPGS")가 이러한 환자에게 경구로 투여된 경우, 혈중 토코페롤의 상승이 1주 내에 탐지되었다. 동일한 환자에게 식물성 오일 중의 토코페롤을 투여한 경우에, 혈중 토코페롤의 유의적 증가는 없었다[참조: Traber et al., 1988]. 따라서, 토코페롤의 천연 또는 합성 유형, 및 TPGS의 친수성 성질은 사람과 동물에서 비타민 E의 흡수 및 생체이용율을 결정하는데 있어 중요할 수 있다. 비타민 E를 수-분산성 제형으로 투여하는 경우의 이점은 바테만(Bateman) 등(1984)에 의해, 비타민 A, E 및 B2를 지질 비히클(Aqua Biosorb) 내로 제형화하고 경구로 투여되는 연질 젤라틴 캡슐내로 봉입한 사람 임상 시험에서 제시되었다. 당해 제형에서, B2는 입자 직경이 100nm 이하인 현탁액으로서 제형내로 혼입되었다. 연질 탄성 젤라틴 캡슐은 중량%를 기준으로 하여, 20% 폴리소르베이트 80, 1% 소르비탄 모노올레에이트 및 수-분산성 기재로서 79% 증류된 모노글리세라이드를 함유하였다. 바테만은, 그의 투여 제형 중의 지용성 비타민 A 및 E에 추가하여 수용성 비타민 B2의 친수성 성질이 증진된 흡수를 나타냈음을 입증하였다. 비타민 E의 이러한 형태들중 어떠한 것이라도 본 발명의 일부로서의 사용이 의도된다.
비타민 E 접합체에는 비타민 E 숙신산(VESA) 피로글루타메이트 접합체, 비타민 E 숙신산(VESA) 폴리에틸렌 글리콜 아민 피로글루타메이트 접합체, 비타민 E 아민 피로글루타메이트 접합체를 포함하는 비타민 E 피로글루탐산(피로글루타메이트) 접합체; 비타민 E 숙신산(VESA) 피롤리돈 접합체를 포함하는 비타민 E 피롤리돈 접합체; 비타민 E 겐티스산 접합체를 포함하는 비타민 E 겐티스산 접합체가 포함되나, 이에 제한되지 않는다[참조: 미국 특허 제6,858,227호, 이는 본원에서 참조로 인용된다].
L. 혈관 내피 성장 인자 억제제
혈관 내피 성장 인자(VEGF)는 혈관 내피 세포에 대한 매우 특이적인 미토겐이다. 단일 VEGF 유전자로부터 선택적 스플라이싱됨으로써 5가지의 VEGF 동종형이 생산된다. 이들 동종형은 분자량 및 세포-표면 헤파린-설페이트 프로테오글리칸에 결합하는 능력과 같은 생물학적 특성에 있어 상이하다. VEGF의 발현은 저산소증에 반응하여, 활성화된 종양유전자 및 다양한 사이토킨에 의해 강화된다. VEGF는 내피 세포 증식을 유도하고, 세포 이동을 촉진하고, 아폽토시스를 억제한다. 시험관내 VEGF는 혈관신생(angiogenesis) 뿐만 아니라 혈관의 투과성증진(permeabilization)을 유도하고 혈관형성의 조절에서 중요한 역할을 한다. 하향조절된 VEGF 발현은 종양 혈관신생을 촉진하여 고형 종양의 발달에 기여하고 비정상적 혈관신생을 특지응로 하는 몇가지 추가 질환의 병인에 기여한다. 따라서, VEGF 신호전달의 억제는 광범위한 종양의 발달을 저해한다.
VEGF 억제제는, 당해 분자의 부재하의 VEGF의 활성과 비교해 VEGF의 활성을 차단하거나 감소시키는 DNA, RNA, 올리고뉴클레오타이드, 단백질, 폴리뉴클레오타이드, 펩타이드 또는 소분자와 같은 임의의 분자이다. 당업자에게 공지된 어떠한 검정을 사용해서도 VEGF 활성을 평가하고 분자의 존재 및 부재하의 VEGF 활성을 측정할 수 있다. VEGF 억제제의 예는 본원 명세서의 다른 곳에 충분히 논의되어 있다.
VEGF 억제제의 용량은 당업자에게 공지된 임의의 용량일 수 있다. 예를 들면, VEGF 억제제가 베바시주맙(bevacizumab)인 경우, 용량은 정맥내 주입에 의해 약 0.1 내지 약 10 mg/kg 이상일 수 있다. 용량은 요법에 대한 반응과 같은 임상 기준 및 부작용에 따라서 맞게 조절할 수 있다. 베바시주맙은 위장관 천공, 의학적 시술을 요구하는 창상 열개, 심각한 출혈, 신장 증후군 또는 고혈압성 발작(hypertensive crisis)이 발생한 환자에서는 영구 중단되어야 한다.
M. IL-10 억제제
인터류킨-10(IL-10)은 쥐 및 사람 유기체 둘다에서 동정된, 최근에 기술된 천연의 내인성 사이토킨이다. 쥐 인터류킨-10(mIL-10)은 본래는 T 헬퍼 T-세포 클론으로부터 방출되는 사이토킨 합성 억제 인자로서 기술되었으나, 이는 CD4-,8+ 쥐 비장 T 세포의 클로닝 효능에 대한 증진 효과를 포함하여 림프구의 다양한 서브세트에 대한 증식 효과를 또한 부여한다. 사람 인터류킨 10(hIL-10)은 최근에 서열이 확인되었으며 DNA 서열 수준 및 아미노산 수준에서 mIL10과 높은 상동성을 갖는 것으로 밝혀졌다. 게다가, 돼지 인터류킨 10도 최근에 서열 확인되었으며 DNA 서열 수준 및 아미노산 수준에서 사람 IL-10과 높은 상동성을 갖는 것으로 밝혀졌다. 또한, hIL-10은 엡스타인-바르 바이러스(Epstein-Barr virus) 게놈에서 발견되는 오픈 리딩 프레임과 높은 상동성을 가지며, BCRF1 및 바이러스성 IL-10은 hIL-10과 유사한 몇가지 활성을 나타낸다.
사람 IL-10은 활성화된 T 세포 클론 및 불멸화된 B 세포에 의해 생산되고, 몇가지 염증촉진성 사이토킨 및 콜로니-자극 인자의 생산을 억제하는 이의 사이토킨 합성 억제 인자(CSIF) 활성 이외에도, 사람 IL-10은 단핵구에 의한 천연 인터류킨-1 수용체 길항제 단백질/펩타이드(IRAP)의 생산을 유도하여 IL-1 활성을 간접적으로 억제한다. IL-10은 또한 단핵구에 의한 이의 생산 자체를 하향조절하며 II형 MHC 발현을 억제한다.
IL-10 억제제는, 당해 분자의 부재하의 IL-10의 활성과 비교해 IL-10의 활성을 차단하거나 감소시키는 DNA, RNA, 올리고뉴클레오타이드, 단백질, 폴리뉴클레오타이드, 펩타이드 또는 소분자와 같은 임의의 분자이다. 특정 IL-10 억제제에 관한 정보는 본원 명세서의 다른 곳에 제시되어 있다. 당업자에게 공지된 어떠한 검정을 사용해서도 IL-10 활성을 평가하고 분자의 존재 및 부재하의 IL-10 활성을 측정할 수 있다.
IL-10 억제제의 용량은 당업자에게 공지된 임의의 용량일 수 있다. 예를 들면, 용량은 정맥내 주입에 의해 약 0.1 내지 약 10mg/kg 이상일 수 있다. 용량은 요법에 대한 반응과 같은 임상적 기준 및 부작용에 따라서 조절할 수 있다.
N. TNF
TNF는 모두 급성기 반응을 자극하는 기타 사이토킨 그룹의 구성원이다. 이러한 계열에는 TNF-알파 및 TNF-베타와 같은 다양한 구성원이 있다. TNF-알파는 대식세포의 표면상에서 212개의 아미노산 길이의 프로펩타이드로부터 절단된 185개 아미노산 당단백질 펩타이드이다. 일부 세포는 보다 짧거나 보다 긴 동종형을 분비한다. TNFα는 예를 들면 감염에 의한 손상의 과정중에 백혈구, 내피 및 몇몇 기타 조직에 의해 방출된다. 이의 방출은 인터류킨 1 및 세균 내독소와 같은 몇가지 기타 매개체에 의해 자극된다. 이는 일반적으로 인터류킨 1 및 6과 함께 다양한 기관계에 수많은 작용을 발휘한다.
TNF의 용량은 당업자에게 공지된 임의의 용량일 수 있다. 예를 들면, 용량은 정맥내 주입에 의해 약 0.1 내지 약 10 mg/kg 이상일 수 있다. 용량은 요법에 대한 반응과 같은 임상적 기준 및 부작용에 따라서 조절할 수 있다.
O. 탁소테레
도세탁셀(탁소테레, 제조원: Aventis)는 항신생물 화학요법제이다. 탁소테레는 이전의 화학요법이 실패한 후 국소 진행된 또는 전이성 유방암 환자의 치료용으로 처방된다. 탁소테레의 용량은 당업자에게 공지된 임의의 용량일 수 있다. 예를 들면, 용량은 약 1 mg/m2 내지 약 1,500 mg/m2 이상일 수 있다.
P. 약제학적 제형 및 전달
본 발명의 특정 양태에서는 MDA-7 단백질을 암호화하는 발현 작제물의 전달을 포함하는 방법이 고려된다. 일부 양태에서, 이러한 방법은 면역원을 암호화하는 발현 작제물의 전달에 관한 것이다. 대안적으로, 발현 작제물은 MDA-7 폴리펩타이드와 면역원을 암호화하는 서열을 포함한다. 면역반응을 수반하는 질환 및 증상의 예에는 백신에 의해 예방되거나 치료되는 질환이 포함된다. 폐암, 두경부암, 유방암, 췌장암, 전립선암, 신장암, 골암, 정소암, 자궁경부암, 위장암, 림프종, 폐의 전암 병변, 결장암, 유방암, 방광암 및 기타 유도성 면역반응을 향상시키는 MDA-7 폴리단백질의 투여로 치료될 수 있는 면역반응과 관련있는 질환 또는 증상이 있다.
1. 유효량
약제학적 조성물의 "유효량"은 일반적으로 전술한 목적한 결과를 검출가능하고 반복적으로 달성하기에 충분한 양, 예를 들면 상기 질환이나 이의 증후군의 정도를 경감, 감소, 최소화 또는 제한시키기에 충분한 양을 의미한다. 이 용어의 정의가 보다 엄격히 적용되는 예에는 질환의 제거, 근절 또는 치료가 있다.
2. 투여
특정 양태에서, 본 발명은 본 발명의 방법 및 조성물을 사용하여 세포 사멸, 세포 성장 억제, 전이 억제, 종양이나 조직 크기 감소, 기타 종양 세포의 악성 표현형 전환 또는 감소, 면역 반응 유도 또는 혈관신생 억제를 제공하는 것이 요구된다. 투여 경로는 본래 표적 병변 또는 부위의 위치 및 성질에 따라 달라지는데, 그 예에는 피내, 피하, 국부, 비경구, 정맥내, 근육내, 비내, 전신 및 경구 투여 및 배합이 있다.
특히, 불연속, 고형, 접근가능한 종양 또는 다른 접근가능한 표적 부위에 대해서는 직접 주사, 종양내 주사 또는 종양 혈관구조로의 주사가 고려된다. 국소, 국부 또는 전신계적 투여 또한 적용가능하다. 4㎝ 초과의 종양에 대해, 투여될 용적은 약 4 내지 10㎖(바람직하게는 10㎖)일 것인 반면, 4㎝ 미만의 종양에 대해서는 약 1 내지 3㎖의 양이 사용될 것이다(바람직하게는 3㎖).
단일 용량으로서 전달되는 다중 주사는 약 0.1 내지 약 0.5㎖ 용적을 포함한다. 바이러스 입자는 다중 주사로 투여함으로써 약 1㎝ 간격으로 위치해 있는 종양에 유리하게 접촉될 수 있다.
외과술적 중재에 있어, 본 발명은 수술불가능한 종양을 절제술에 대해 적용하도록 하기 위해 수술 전에 사용될 수 있다. 대안적으로, 본 발명은 수술, 및/또는 수술 후에 잔류 질병 또는 전이성 질병을 치료하기 위해 사용할 수 있다. 예를 들면, MDA-7 또는 MDA-7-암호화 작제물을 포함하는 제형을 면역원성 분자와 함께 또는 면역원성 분자의 부재하에 절제된 종양층에 주사하거나 이로 관류시킬 수 있다. 관류는 절제 후, 예를 들면, 수술 위치에 삽입된 도관을 남겨둠으로써 계속될 수 있다. 주기적 수술후 치료 또한 고려된다.
발현 작제물 또는 바이러스 작제물의 연속적 관류도 또한 고려된다. 연속적 관류로서 전달되는 작제물 또는 펩타이드의 양은 목적하는 흡수량에 의해 측정할 수 있다.
또한, 바람직한 경우, 예를 들면, 종양이 제거되고 종양상이 치료되어 잔류, 미세 질병이 제거된 경우, 연속적 투여를 적용할 수 있다. 주사 또는 도관을 통한 전달이 바람직하다. 이러한 연속적 관류는 치료 개시 후 약 1 내지 2시간, 약 2 내지 6시간, 약 6 내지 12시간, 약 12 내지 24시간, 약 1 내지 2일, 약 1 내지 2주 또는 보다 장기간에 걸쳐 발생할 수 있다. 일반적으로, 연속적 관류를 통한 치료적 조성물의 용량은 관류가 발생되는 동안의 시간에 걸쳐 조정된 단일 또는 다중 주사에 의해 제공되는 것과 동량일 것이다.
치료 요법은 흔히 종양 유형, 종양 위치, 질병 진행 및 환자의 건강 및 연령에 따라 다양할 수 있다. 명백하게는, 종양의 특정 유형은 보다 공격적인 치료를 필요로 할 것인 반면, 동시에, 특정 환자는 보다 힘든 프로토콜을 견딜 수 없다. 임상의는 치료학적 제형의 공지된 효능 및 독성(만약 있다면)을 기준으로 하여 이러한 결정을 내리는 데 가장 적합할 것이다.
특정 양태에서, 치료될 종양 또는 질환 부위는 최소한 초기에 절제될 수 없다. 치료적 바이러스 작제물을 사용한 치료는 경계에서의 수축 또는 특정한 두드러진 침략적 부위의 제거에 기인하여 종양의 절제가능성을 증가시킬 수 있다. 치료 후, 절제가 가능할 수 있다. 종양 위치에서 극미 잔류 질병을 제거하기 위해 절제에 이은 추가의 치료가 제공될 것이다.
원발성 종양 또는 절제 후 종양층에 대한 통상의 치료 과정은 다중 용량을 포함할 것이다. 통상의 원발성 종양 치료는 2주에 걸친 6회의 용량 적용을 포함한다. 2주간의 섭생을 1회, 2회, 3회, 4회, 5회, 6회 또는 그 이상 반복할 수 있다. 치료 과정 중, 계획된 투여를 완료하기 위해 재평가가 필요할 수 있다.
치료는 각종 "단위 용량"을 포함할 수 있다. 단위 용량은 치료적 조성물의 예비측정량을 함유하는 것으로 정의된다. 투여될 양 및 특정 경로 및 제형이 임상 분야의 숙련가에게 공지되어 있다. 단위 용량은 단일 주사로 투여될 필요는 없지만, 기간 세트에 걸친 연속적 주사를 포함할 수 있다. 본 발명의 단위 용량은 통상적으로 바이러스 작제물에 대한 플라크 형성 단위(pfu)의 용어로 기술될 수 있다. 단위 용량은 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 1010, 1011, 1012, 1013 pfu 또는 바이러스 입자(vp) 이상의 범위이다. 대안으로, 특정된 양은 평균 매일, 평균 매주 또는 평균 매월 용량으로서 투여되는 양일 수 있다.
단백질은 환자에게 약 또는 적어도 약 0.01, 0.05, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 2.0, 3.0, 4.0, 5.0, 6.0, 7.0, 8.0, 9.0, 10, 15, 20, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000 또는 10000ng/ml 이상 또는 이 범위에서 추론할 수 있는 임의의 범위의 용량으로 투여될 수 있다. 대안으로, 본원에 특정된 임의의 양은 평균 매일, 평균 매주 또는 평균 매월 용량으로서 투여되는 양일 수 있다.
COX-2 억제제는 환자에게 약 또는 적어도 약 0.5, 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600, 610, 620, 630, 640, 650, 660, 670, 680, 690, 700, 710, 720, 730, 740, 750, 760, 770, 780, 790, 800, 810, 820, 830, 840, 850, 860, 870, 880, 890, 900, 910, 920, 930, 940, 950, 960, 970, 980, 990, 1000mg 이상 또는 이 범위에서 추론할 수 있는 임의의 범위의 용량으로 투여될 수 있다. 대안으로, 본원에 특정된 임의의 양은 평균 매일, 평균 매주 또는 평균 매월 용량으로서 투여되는 양일 수 있거나, mg/kg(여기서, kg는 환자의 체중을 의미하고, mg은 상기 특정된 양이다)으로 환산하여 표현될 수 있다. 다른 양태에서, 특정된 양은 상기 논의된 임의의 수이지만 mg/m2(종양 크기 또는 환자 표면적에 대해)로서 표현된다.
GA 또는 이의 유사체 및 유도체의 농도는 약, 적어도 약 또는 최대 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 441, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600, 610, 620, 630, 640, 650, 660, 670, 680, 690, 700, 710, 720, 730, 740, 750, 760, 770, 780, 790, 800, 810, 820, 830, 840, 850, 860, 870, 880, 890, 900, 910, 920, 930, 940, 950, 960, 970, 980, 990, 1000 mg 또는 mg/m2(종양 크기 또는 환자 표면적에 대해) 이상 또는 이 범위에서 추론할 수 있는 임의의 범위의 용량일 수 있다. 대안으로, 본원에 특정된 임의의 양은 평균 매일, 평균 매주 또는 평균 매월 용량으로서 투여되는 양일 수 있거나, mg/kg(여기서, kg는 환자의 체중을 의미하고, mg은 상기 특정된 양이다)으로 환산하여 표현될 수 있다.
비타민 E 화합물 또는 이의 유사체의 농도는 약, 적어도 약 또는 최대 약0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 441, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600, 610, 620, 630, 640, 650, 660, 670, 680, 690, 700, 710, 720, 730, 740, 750, 760, 770, 780, 790, 800, 810, 820, 830, 840, 850, 860, 870, 880, 890, 900, 910, 920, 930, 940, 950, 960, 970, 980, 990, 1000 mg, ㎍/ml, mg/kg(환자 체중에 대해) 또는 mg/m2(종양 크기 또는 환자 표면적에 대해) 이상 또는 이 범위에서 추론할 수 있는 임의의 범위의 용량일 수 있다. 대안으로, 비타민 E 화합물 또는 유사체의 양은 I.U.(국제 단위)로 환산하여 표현될 수 있다. 특정 양태에서, 비타민 E 화합물의 양은 약, 적어도 약 또는 최대 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 441, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600, 610, 620, 630, 640, 650, 660, 670, 680, 690, 700, 710, 720, 730, 740, 750, 760, 770, 780, 790, 800, 810, 820, 830, 840, 850, 860, 870, 880, 890, 900, 910, 920, 930, 940, 950, 960, 970, 980, 990, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 2000, 2100, 2200, 2300, 2400, 2500, 2600, 2700, 2800, 2900, 3000, 3100, 3200, 3300, 3400, 3500, 3600, 3700, 3800, 3900, 4000, 4100, 4200, 4300, 4400, 4500, 4600, 4700, 4800, 4900, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 10000 I.U 이상 또는 이 범위에서 추론할 수 있는 임의의 범위이다.
3. 주사가능한 조성물 및 제형
일부 양태에서, 면역원성 분자, MDA-7 단백질을 암호화하는 발현 작제물, MDA-7 단백질 및/또는 면역원의 전달 방법은 전신 투여이다. 그러나, 본 명세서에 개시된 약제학적 조성물은 대안적으로 비경구, 피하, 직접, 기관내, 정맥내, 피내, 근육내, 또는 심지어 복강내로 투여될 수도 있다(본 발명에 각각 전문이 인용된 미국 특허 5,543,158; 미국 특허 5,641,515 및 미국 특허 5,399,363 참조).
핵산 작제물의 주사는 발현 작제물이 주사를 위해 필요한 특정 게이지의 바늘을 통해 통과될 수 있는 한 주사기 또는 용액의 주사를 위해 사용되는 임의의 다른 방법에 의해 전달될 수 있다. 용액을 저장하기 위한 앰플 챔버를 한정하기 위한 노즐 및 용액을 노즐로부터 전달 위치로 밀어내기 위한 에너지 장치를 갖는 신규한 무바늘 주사 시스템이 최근에 기술되어 있다(미국 특허 제5,846,233호). 또한 주사기 시스템은 임의의 깊이에서 정확하게 미리 측정된 양의 용액을 다중 주사할 수 있는 유전자 요법에서의 용도에 대해 기술되어 있다(미국 특허 제5,846,225호).
유리 염기 또는 약리학적으로 허용되는 염으로서의 활성 화합물의 용액은 하이드록시프로필셀룰로스와 같은 계면활성제와 적합하게 혼합된 물에서 제조될 수 있다. 또한 분산제는 글리세롤, 액체 폴리에틸렌 글리콜 및 이의 혼합물 및 오일에서 제조될 수 있다. 저장 및 사용의 일반적인 조건하에서, 이들 제제는 미생물의 성장을 예방하기 위한 보존제를 함유한다. 주사가능한 용도에 적합한 약제학적 형태는 멸균 주사액 또는 분산제의 즉석 제조용 멸균 수용액 또는 분산제 및 멸균 산제를 포함한다(미국 특허 제5,466,468호, 이의 전문이 본원에 참조로서 명확히 인용되어 있음). 모든 경우에, 당해 형태는 멸균되어야 하며 용이한 주사가능성이 존재하는 범위로 유동적이어야 한다. 이는 제조 및 저장 조건하에서 안정적이어야 하며 세균 및 진균과 같은 미생물의 오염 작용에 대항하여 보존되어야 한다. 담체는 용매 또는 예를 들면, 물, 에탄올, 폴리올(예를 들면, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등)을 함유하는 분산 매질, 적합한 이의 혼합물 및/또는 식물성 오일일 수 있다. 적합한 유동성은 예를 들면, 레시틴과 같은 피복물의 사용, 분산제의 경우 요구되는 입자 크기의 유지 및 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 미생물의 작용의 예방은 각종 항세균제 및 항진균제, 예를 들면, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르브산, 티메로살 등에 의해 수행될 수 있다. 많은 경우에, 등장제, 예를 들면, 당 또는 염화나트륨을 포함하는 것이 바람직할 것이다. 조성물에서 흡수를 지연시키는 제제(예를 들면, 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴)를 사용함으로써 주사가능한 조성물을 지속적으로 흡수시킬 수 있다.
특정 양태에서, 수성 제형이 사용되는 한편, 지질 기반 제형이 사용될 수 있다. 본 발명의 특정 양태에서, MDA-7(또는 암호화 핵산) 및/또는 MDA-7 병용제를 포함하는 조성물은 수성 제형이다. 다른 양태에서, 제형은 지질 기반 제형이다. 구체적으로는, 비타민 E 화합물은 수성 또는 지질 기반 제형 중에 존재할 수 있음이 의도된다.
수용액 중의 비경구 투여를 위해, 예를 들면, 당해 용액은 필요에 따라 적합하게 완충되거나 액체 희석제는 우선 적합한 염수 또는 글루코스로 등장성이 되어야 한다. 이들 특정 수용액은 특히 정맥내, 근육내, 피하, 종양내 및 복강내 투여에 적합하다. 이와 관련하여, 사용될 수 있는 멸균 수성 매질은 본원을 고려하여 당업자에게 공지될 것이다. 예를 들면, 하나의 투여량은 등장성 NaCl 용액 1㎖에 용해될 수 있으며 피하주사 용액 1000㎖에 첨가되거나 제안된 주사 위치로 주사될 수 있다[참조: Remington's Pharmaceutical Sciences" 15th Edition, pages 1035-1038 및 1570-1580]. 치료될 피검체의 상태에 따라 투여량에 일부 변형이 필요할 것이다. 투여를 담당하는 사람은 어떠한 경우에도 개별 피검체에 대한 적합한 용량을 결정할 것이다. 추가로, 사람 투여를 위해, 생물학적 표준의 FDA 관청에 의해 요구되는 바와 같은 멸균성, 발열성, 일반적 안정성 및 순도 표준을 충족시켜야 한다.
멸균 주사액은 필요에 따라, 상기한 각종 다른 성분과 적합한 용매의 요구량의 활성 화합물을 혼입시킨 후 여과 멸균하여 제조한다. 일반적으로, 분산액은 기본 분산 매질 및 상기한 바와 같은 필요한 다른 성분을 함유하는 멸균 비히클내로 각종 멸균된 활성 성분을 혼입시킴으로써 제조한다. 멸균 주사액의 제조를 위한 멸균 산제의 경우, 바람직한 제조방법은 활성 성분의 산제와 임의의 추가의 바람직한 성분을 미리 멸균-여과시킨 이의 용액으로부터 생성시키는 진공-건조 및 동결-건조 기술이다.
본원에 개시된 조성물은 중성 또는 염 형태로 제형될 수 있다. 약제학적으로 허용되는 염은 산부가 염(단백질의 유리 아미노 그룹으로 형성된)을 포함하며 이는 예를 들면, 염산 또는 인산과 같은 무기산, 또는 아세트산, 옥살산, 타르타르산, 만델산 등과 같은 유기산으로 형성된다. 유리 카복실 그룹으로 형성된 염은 또한 예를 들면, 나트륨, 칼륨, 암모늄, 칼슘 또는 수산화제2철과 같은 무기 염기 및 이소프로필아민, 트리메틸아민, 히스티딘, 프로카인 등과 같은 유기 염기로부터 유래할 수 있다. 제형에 따라서, 용액은 투여량 제형과 혼화가능한 방식 및 치료학적으로 유효한 양으로 투여될 것이다. 당해 제형은 주사액, 약물 방출 캡슐 등과 같은 각종 투여 형태로 용이하게 투여된다.
본원에 사용된 바와 같은 "담체"는 임의의 그리고 모든 용매, 분산 매질, 비히클, 피복물, 희석제, 항세균제 및 항진균제, 등장제 및 흡수지연제, 완충제, 담체 용액, 현탁액, 콜로이드 등을 포함한다. 약제학적 활성 물질을 위한 이러한 매질 및 제제의 용도가 당해 분야에 널리 공지되어 있다. 임의의 통상적인 매질 또는 제제가 활성 물질과 비혼화성인 경우를 제외하고는, 치료학적 조성물에서의 이의 용도가 고려된다. 또한, 보충적 활성 성분을 당해 조성물에 혼입시킬 수 있다.
어구 "약제학적으로 허용되는" 또는 "약리학적으로 허용되는"은 사람에게 투여될 시, 알러지 또는 유사한 바람직하지 않은 반응을 유발하지 않는 분자 물질 및 조성물을 지칭한다. 활성 성분으로서 단백질을 함유하는 수성 조성물의 제조가 당해 분야에서 널리 이해되고 있다. 전형적으로, 이러한 조성물은 주사용, 액체 용액 또는 현탁액; 용액 또는 현탁액에 적합한 고체 형태로 제조되며, 주사 전 액체로도 또한 제조될 수 있다.
화합물 및 제제는 통상적으로 비경구 투여, 주사 투여, 예를 들면 피하 주사 또는 근육내 주사로 투여될 수 있다. 다른 투여 방식에 적당한 또 다른 배합물에는 좌약 및 일부 예로서 경구 배합물이 있다. 좌약인 경우에는 통상적인 병용제 및 담체, 예를 들면 폴리알킬렌글리콜 또는 트리글리세라이드가 포함될 수 있으며, 이러한 좌약은 활성 성분을 약 0.5% 내지 약 10%, 바람직하게는 약 1% 내지 약 2% 범위로 함유하는 혼합물로 제조할 수 있다. 경구 배합물은 약제 등급의 만니톨, 락토스, 전분, 스테아르산마그네슘, 나트륨사카린, 셀룰로스, 탄산마그네슘 등과 같은 일반적으로 이용되는 부형제를 함유한다. 이러한 조성물은 용액, 현탁액, 정제, 환제, 캡슐, 서방출 제형 또는 분말 형태일 수 있고, 약 10% 내지 약 95%의 활성 성분, 바람직하게는 약 25% 내지 약 70%의 활성 성분을 함유할 수 있다.
MDA-7 단백질(또는 이의 단편) 또는 MDA-7 전체 또는 일부를 암호화하는 핵산은 중성 또는 염 형태로서 백신으로 조제될 수 있다. 약제학적으로 허용되는 염에는 무기산, 예를 들면, 염산 또는 인산, 또는 유기산, 예를 들면, 아세트산, 옥살산, 타르타르산, 만델산 등과 함께 제조된 산 부가 염(단백질의 유리 아미노 기에 의해 형성됨)이 있다. 또한, 유리 카르복실 기에 형성된 염은 무기 염기(예를 들면, 나트륨, 칼륨, 암모늄, 칼슘 또는 철 수산화물) 또는 유기 염기(예를 들면, 이소프로필아민, 트리메틸아민, 2-에틸아미노 에탄올, 히스티딘, 프로카인 등)로부터 유도될 수 있다.
특정 제형에서, MDA-7 병용제는 무수 분말로서 제형화된다. 본 발명의 추가 목적은 가공을 위해, 순수한 탄수화물 대신에 유제품 부산물 형태의 용이하게 접근가능한 저렴한 원료를 사용하는 것이다. 이러한 목적은 본원에서 참조로 인용되는 미국 특허 제4,262,017호에 제시된 바와 같이, 비타민 E 에스테르를 잔류 액체의 고체 함량을 기준으로 하여 카제이네이트 2 내지 30중량%의 존재하에, 락토스 제조로부터의 알칼리 토금속 이온이 적고 락토스가 풍부한 잔류 액체 중에 분산시키고, 분산액을 스프레이 건조시키는, 단백질 콜로이드 및 디사카라이드를 함유하는 비타민 E 무수 분말의 제조방법에 의해 달성될 수 있다. 상기 방법은 풍미가 좋고 식료품 및 동물 사료용 첨가제로서 사용될 수 있는 자유 유동성 비타민 E 무수 분말을 제공한다. 적합한 비타민 E 에스테르는 d- 및 d,1-α-토코페롤의 통상적 에스테르이다. 구체적 예로는 타민 E 아세테이트, 비타민 E 숙시네이트, 비타민 E 팔미테이트 및 비타민 E 니코티네이트가 있다. 이 중에서 아세테이트가 바람직하다.
단백질, 핵산 또는 COX-2 억제제(들), Hsp90 억제제 또는 비타민 E 화합물은 투여 제형과 적합한 방식으로 치료학적으로 효과적으로 양으로 투여된다. 투여될 양은 예를 들면, 암의 공격성, 임의의 종양(들)의 크기, 이전의 또는 기타 치료 과정을 포함하여 치료될 피험체에 따라 좌우된다. 투여되는데 필요한 활성 성분의 정확한 양은 주치의의 판단에 따라 좌우된다. 초기 투여 및 후속적 투여를 위한 적합한 요법도 또한 가변적이지만, 전형적으로 초기 투여에 이어 기타 투여를 수행한다. 이러한 투여는 10, 20, 30, 40, 50, 60분 및/또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24시간 이상 및/또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7일 이상의 기간에 걸쳐서 연속되는, 단일 용량으로서의 전신 투여일 수 있다. 또한, 투여는 제형 및/또는 투여방식에 의해 실시되는 지속성(time release) 또는 서방성 기작을 통한 투여일 수 있다.
적용 방식은 매우 다양할 수 있다. 통상적인 투여방법 중 임의의 방법을 사용할 수 있다. 그 예에는, 고체 생리학적 허용성 베이스 상의 경구용, 또는 생리적 허용성 분산액 중의 경구용, 비경구용, 주사용 등이 포함될 수 있을 것으로 생각된다. 투여량은 투여 경로 및 숙주의 크기에 따라 달라질 수 있다.
많은 경우에, 치료제(MDA-7 및 COX-2 억제제, Hsp90 억제제 또는 비타민 E 화합물)의 2개중 각각을 다중 투여하는 것이 바람직할 수 있다.
Q. 병용 요법
특정 양태에서, 본 발명의 조성물 및 방법은, MDA-7 폴리펩타이드 또는 이를 암호하는 발현 작제물 및 COX-2 억제제 또는 Hsp90 억제제와 함께, MDA-7의 효과를 향상시키거나 또는 MDA-7을 이용하여 달성할 수 있는 임의의 치료, 진단 또는 예후 효과를 증가시키는 다른 제제 또는 조성물을 포함한다. 이러한 조성물은 암세포 사멸이나 혈관신생 억제와 같은 목적 효과를 달성하기에 효과적인 혼합 함량으로 제공될 수 있다. 이러한 과정은 세포를 발현 작제물 및 상기 제제(들) 또는 다수의 인자(들)와 동시에 접촉시키는 것을 포함할 수 있다. 이는, 상기 제제들을 함께 함유하는 단일 조성물 또는 약리학적 제형과 세포를 접촉시키거나, 또는 한 조성물이 1) MDA-7(단백질로서 또는 핵산으로서); 및/또는 2) COX-2 억제제(들) 또는 Hsp90 억제제(또는 기타 MDA-7 병용제); 및/또는 3) 제3의 제제(들)을 제공하는 2개의 별개의 조성물을 세포와 동시에 접촉시켜 수행할 수 있다.
본 발명의 양태에서, mda-7 유전자(또는 cDNA) 또는 단백질 요법은, 제2 또는 기타 항암제 또는 항암 요법 이외에, COX-2 억제제와 함께 사용되는 것이 의도된다("MDA-7/COX-2 억제제 요법"으로서 지칭됨). 다른 양태에서, mda-7 유전자(또는 cDNA) 또는 단백질 요법은 제2 또는 기타 항암제 또는 항암 요법 이외에, Hsp90 억제제("MDA-7/Hsp90 억제제 요법"으로서 지칭됨)와 함께 사용됨이 의도된다. 대안으로, MDA-7/COX-2 억제제 요법 또는 MDA-7/Hsp90 억제제 요법은 수분 내지 수주의 범위의 간격만큼 다른 항암 치료를 선행하거나 이에 후속할 수 있다. MDA 유전자 또는 단백질 요법이 환자에게 COX-2 억제제 또는 Hsp90 억제제와 별도로 제공되는 양태에서는, 일반적으로, 2개의 화합물이 여전히 환자에게 유리하게 조합된 효과를 발휘할 수 있도록 각 전달 시간 사이에 상당한 시간이 경과하지 않았이 보장되어야 한다; 대안으로, MDA-7/COX-2 억제제 요법 또는 MDA-7/Hsp90 억제제 요법이 환자에게 제2 항암 요법과 별도로 제공되는 양태에서는, 일반적으로 두 요법이 여전히 환자에게 유리하게 조합된 효과를 발휘할 수 있도록 각 전달 시간 사이에 상당한 시간이 경과하지 않았음이 보장되어야 한다. 이러한 경우에, 환자에게 1) MDA-7/COX-2 억제제 요법 또는 2) the MDA-7/Hsp90 억제제 요법 및 제2 항암 요법을 서로 약 12 내지 24시간 이내에, 보다 바람직하게는 서로 약 6 내지 12시간 내에 제공할 수 있음이 의도된다. 그러나, 일부 상황에서는, 각각의 투여 간의 간격이 수일(2, 3, 4, 5, 6 또는 7일) 내지 수주(1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8주)인 경우에 치료 기간을 유의적으로 연장시키는 것이 바람직할 수 있다. COX-3 억제제 또는 Hsp-90 억제제 대신에, 본 발명은 다른 MDA-7 병용제의 범주에서 실시될 수 있다.
특정 양태에서, 치료 과정은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90일 이상 지속된다. 한 제제를 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89 및/또는 90일째 및 이들의 임의의 조합에서 제공하고, 다른 제제를 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89 및/또는 90일째 및 이들의 임의의 조합에서 제공하는 것이 의도된다. 하루(24시간) 이내에, 환자에게 제제(들)을 1회 또는 수차례 투여할 수 있다. 또한, 치료 과정 후에, 항암 치료를 실시하지 않는 기간이 있는 것으로 의도된다. 이러한 기간은 환자의 예후, 체력, 건강 등과 같은 환자의 상태에 따라서 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7일 및/또는 1, 2, 3, 4, 5주 및/또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12개월 이상 지속될 수 있다.
다양한 조합이 사용될 수 있는데, 예를 들면, MDA 유전자 또는 단백질 요법은 "A"이고, MDA-7 병용제는 "B"이다:
A/B/A B/A/B B/B/A A/A/B A/B/B B/A/A A/B/B/B B/A/B/B B/B/B/A
B/B/A/B A/A/B/B A/B/A/B A/B/B/A B/B/A/A B/A/B/A B/A/A/B A/A/A/B
B/A/A/A A/B/A/A A/A/B/A
대안으로, "A"는 MDA-7/병용제 요법의 실시일 수 있고, "B"는 제2 항암 요법의 실시일 수 있다. 다른 양태에서, MDA-7 유전자 또는 단백질 요법은 "A"이고, MDA-7 병용제는 "B"이거나, "A는 MDA-7/MDA-7 병용제 요법의 실시일 수 있고, "B"는 제2 항암 요법의 실시일 수 있다.
환자에게 본 발명의 임의의 화합물을 투여하거나 본 발명의 임의의 요법을 실시하는 것은 벡터 또는 임의의 단백질 또는 기타 제제의 독성(존재한다면)을 고려하여 이러한 화합물의 투여를 위한 일반적 프로토콜에 후속할 수 있다. 따라서, 일부 양태에서, MDA-7 및/또는 MDA-7 병용제에 기인할 수 있는 독성을 모니터링하는 단계가 있다. 치료 주기는 필요에 따라 반복될 수 있는 것으로 예상된다. 또한, 기술한 요법과 함께 다양한 표준 요법 뿐만 아니라 외과술적 시술을 적용할 수 있는 것도 의도된다.
구체적 양태에서, 화학요법, 방사선요법, 면역요법 또는 기타 유전자 요법과 같은 제2 하암 요법을 예를 들면, MDA-7/COX-2 억제제 요법 또는 MDA-7/Hsp90 억제제 요법 또는 본원에 기술한 바와 같은 임의의 기타 MDA-7 병용 요법과 병용하여 사용되는 것이 의도된다.
1. 화학요법
암 요법은 또한 화학 및 방사선 기초 치료 둘 다를 사용한 각종 병용 요법을 포함한다. 병용 화학요법제는 예를 들면, 시스플라틴(CDDP), 카보플라틴, 프로카바진, 메클로르에타민, 사이클로포스파미드, 캄프토테신, 이포스파미드, 멜팔란, 클로르암부실, 부설판, 니트로스우레아, 닥티노마이신, 다우노루비신, 독소루비신, 블레오마이신, 플리코마이신, 미토마이신, 에토포시드(VP16), 타목시펜, 랄록시펜, 에스트로겐 수용체 결합 제제, 탁솔, 겜시타비엔, 나벨빈, 파네실-단백질 트랜스퍼라제 억제제, 전이백금, 5-플루오로우라실, 빈크리스틴, 빈블라스틴 및 메토트렉세이트, 또는 전술한 화합물의 임의의 유사체 또는 유도적 변형체를 포함한다.
2. 방사선요법
DNA 손상을 유도하고 광범위하게 사용되는 다른 인자는 통상 γ-선, X-선 및/또는 종양 세포로의 방사선동위원소의 지시적 전달로서 공지된 것을 포함한다. 마이크로파, 양성자빔 조사(미국 특허 제5,760,395호 및 미국 특허 제4,870,287호) 및 UV-조사와 같은 DNA 손상 인자의 다른 형태가 또한 고려된다. 이들 인자 모두 필시 DNA, DNA 전구체, DNA의 복제 및 수복 및 염색체의 조합 및 유지에 대한 넓은 범위의 손상에 영향을 준다. X-선에 대한 선량 범위는 연장된 기간(3주 내지 4주) 동안 50 내지 200뢴트겐의 1일 선량 내지 2000 내지 6000 뢴트겐의 단일 선량에 이른다. 방사선동위원소에 대한 선량 범위는 매우 다양하며, 동위원소의 반감기, 방출되는 방사선의 강도 및 유형, 및 신생물 세포에 의한 흡수에 따라 좌우된다.
용어 "접촉된" 및 "노출된"(세포에 적용된 경우)은 본원에 사용되어 치료적 작제물 및 화학요법제 또는 방사선요법제가 표적 세포에 전달되거나 표적 세포와 직렬로 위치하는 방법을 기술한다. 세포 치사를 성취하기 위해, 예를 들면, 둘 다의 제제를 세포를 치사시키거나 분열을 방지하는데 유효한 배합량으로 세포에 전달한다.
3. 면역요법
암 치료의 측면에서, 일반적으로 면역요법은 암 세포를 표적으로 하거나 파괴하기 위한 면역 효과기 세포 및 분자의 사용에 의존한다. Trastuzumab(Herceptin™)는 이러한 한가지 예이다. 면역 효과기는 예를 들어 종양 세포의 표면에 존재하는 일부 마커에 특이적인 항체일 수 있다. 이러한 항체는 단독으로 치료 효과기로서 작용하거나 또는 실제 세포 사멸을 실시하는 다른 세포를 모집할 수 있다. 또한, 항체는 약물 또는 독소(화학요법제, 방사선핵종, 리신 A쇄, 콜레라 독소, 백일해 독소 등)에 접합되어, 단순히 표적화 제제로서 작용할 수도 있다. 대안적으로, 효과기는 직접 또는 간접적으로 종양 세포 표적과 상호작용하는 표면 분자가 실린 림프구일 수 있다. 다양한 주효세포에는 세포독성 T 세포 및 NK 세포가 있다. 치료 양태의 조합, 즉 직접 세포독성 활성과 ErbB2의 억제 또는 감소는 ErbB2 과발현 암의 치료에 치료적 효과를 제공할 수 있다.
또한, 또 다른 면역요법도 MDA-7/COX-2 억제제 요법 또는 MDA-7/Hsp90 억제제 요법과의 병용 요법의 일부로서 사용될 수 있다. 병용 요법의 일반적 방법은 이하에 설명되는 바와 같다. 면역요법의 한 측면에서, 종양 세포는 표적화되기 쉬운, 즉 다른 세포 대부분에 존재하지 않는 일부 마커를 보유해야 한다. 다수의 종양 마커가 존재하고, 이 중 임의의 것이 본 발명의 측면에서 표적화하기에 적합할 수 있다. 통상의 종양 마커는 암배아 항원, 전립선 특이적 항원, 비뇨기 종양 관련 항원, 태아 항원, 티로시나제(p97), gp68, TAG-72, HMFG, 시알릴 루이스 항원, MucA, MucB, PLAP, 에스트로겐 수용체, 라미닌 수용체, erb B 및 p155를 포함한다. 면역요법의 대안적 측면은 항암 효과와 면역 자극 효과를 조합하기 위한 것이다. IL-2, IL-4, IL-12, GM-CSF, 감마-IFN과 같은 사이토카인, MIP-1, MCP-1, IL-8과 같은 키모카인 및 FLT3 리간드와 같은 성장 인자를 포함하는 면역자극 분자가 또한 존재한다. MDA-7과 같은 종양 억제인자와 배합된 단백질로서 또는 유전자 전달을 이용한 면역자극 분자를 조합하는 것은 항암 효과를 증가시키는 것으로 확인되었다[참조: Ju et al., 2000].
또한, 이들 화합물 중 어느 하나에 대한 항체를 사용하여 본원에 논의된 항암제를 표적화할 수 있다.
앞서 논의한 바와 같이, 현재 연구 중이거나 사용 중인 면역요법의 예에는 마이코박테리움 보비스(Mycobacterium bovis), 플라스모듐 팔시파럼(Plasmodium falciparum), 디니트로클로로벤젠 및 방향족 화합물과 같은 면역 보조제[참조: 미국 특허 제5,801,005호; 미국 특허 제5,739,169호; Hui and Hashimoto, 1998; Christodoulides et al., 1998], 인터페론 α,β 및 γ와 같은 사이토킨 치료; IL-1, GM-CSF 및 TNF[참조: Bukowski et al., 1998; Davidson et al., 1998 ; Hellstrand et al., 1998] 유전자 요법, 예를 들면, TNF, IL-1, IL-2, p53[참조: Qin et al., 1998; Austin-Ward and Villaseca, 1998; 미국 특허 제5,830,880호 및 미국 특허 제5,846,945호] 및 모노클로날 항체, 예를 들면 항강글리오사이드 GM2, 항-HER-2, 항-pl85[참조: Pietras et al., 1998 ; Hanibuchi et al., 1998; 미국 특허 제5,824,311호]가 있다. 헤르셉틴(trastuzumab)은 HER2-neu 수용체를 차단하는 키메릭(마우스-사람) 모노클로날 항체이다. 이는 항암 활성이 있고, 악성 종양의 치료에 유용하다는 인정을 받고 있다[참조: Dillman, 1999]. 이러한 항암 요법 중 하나 이상을 본원에 기술된 MDA-7 요법과 함께 사용되는 것도 본 발명에 포함된다.
암의 수동적 면역요법을 위한 다수의 상이한 접근방법이 존재한다. 이들은 다음과 같이 넓게 범주화될 수 있다: 항체 단독의 주사; 독소 또는 화학요법제와 커플링된 항체의 주사; 방사선 동위원소와 커플링된 항체의 주사; 항-유전형 항체의 주사; 및 마지막으로, 골수내의 종양 세포의 제거.
4. 유전자 요법
다른 양태에서, 병용 요법은 치료적 폴리뉴클레오타이드를 MDA-7 폴리펩타이드 또는 이러한 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산을 투여하기 전, 후 또는 동시에 투여하는 유전자 요법을 포함한다. 다음의 유전자 생성물 중 하나를 암호화하는 벡터와 함께 MDA-7 폴리펩타이드 또는 이러한 폴리펩타이드의 전달은 표적 조직상에 조합된 항암 효과를 가질 것이다.
5. 수술
암 환자 중 약 60%는 예방, 진단 또는 시기결정, 치료 및 완화 수술을 포함하는 일부 유형의 수술을 받을 것이다. 치유적 수술은 본 발명의 치료, 화학요법, 방사선요법, 호르몬 요법, 유전자 요법, 면역요법 및/또는 대안적 요법과 같은 다른 요법과 함께 사용될 수 있는 암 치료이다.
치유적 수술은 암 조직의 모두 또는 이의 일부를 물리적으로 제거, 삭제 및/또는 파괴하는 절제를 포함한다. 종양 절제는 최소한 종양의 일부의 물리적 제거를 지칭한다. 종양 절제 외에, 수술에 의한 치료는 레이저 수술, 저온수술, 전자수술 및 현미경에 의해 조절되는 수술(모즈 수술)을 포함한다. 또한, 본 발명은 표재 암, 전암 또는 지엽적인 양의 정상 조직의 제거와 함께 사용될 수 있는 것으로 사료된다.
모든 암성 세포, 조직 또는 종양 중 일부의 절제에 따라, 체내에 공동이 형성될 수 있다. 추가의 항암 치료와 함께 해당 영역의 관류, 직접 주사 또는 국소 적용에 의해 치료를 수행할 수 있다. 이러한 치료는 예를 들면, 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7일마다 또는 1, 2, 3, 4 및 5주마다 또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12개월마다 반복할 수 있다. 이들 치료는 또한 다양한 투여량으로 수행할 수 있다.
6. 호르몬 요법
또한, 호르몬 요법을 본 발명과 함께 또는 상기한 임의의 다른 암 치료와 함께 사용할 수 있다. 호르몬을 유방, 전립선, 난소 또는 자궁암과 같은 특정 암의 치료에 사용하여 테스토스테론 또는 에스트로겐과 같은 특정 호르몬의 효과의 수준을 저하시키거나 차단할 수 있다. 이러한 치료는 흔히 치료 옵션으로서 또는 전이의 위험을 감소시키기 위해 하나 이상의 다른 암 치료와 함께 사용된다.
다음 실시예는 본 발명의 특정 양태를 증명하는 것이다. 이러한 실시예에 개시된 기술은 본 발명자들에 의해 개발된 대표적인 기술로서 본 발명의 실시에 양호하게 작용하는 기술로서, 본 발명의 실시에 사용되는 일부 방식을 구성하는 것으로 간주될 수 있음을 당업자라면 잘 알고 있을 것이다. 또한, 당업자는 본 발명의 개시에 비추어, 개시된 특정 양태에 다양한 변화를 실시하여 본 발명의 취지 및 범위에 벗어나지 않는 유사 결과를 수득할 수 있음을 잘 알고 있을 것이다.
실시예 1
셀레콕시브와 AD-MDA7을 사용한 상승적 종양세포치사 효과
A. 물질 및 방법
1. 세포주
상승된 수준의 HER-2/neu를 발현하도록 조작된 에스트로겐 수용체 포지티브 MCF7 세포(MCF7/Her18 세포)는 Mien-Chie Hung 박사로부터 증여되었다. 에스트로겐 수용체 네거티브 및 HER-2/neu를 과발현하지 않는 MDA-MB-436 사람 유방암 세포는 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(ATCC, Manassas, Virginia)으로부터 입수하였다. 세포들을 습윤된 37℃, 5% CO2 대기에서 10mM L-글루타민, 100U/ml 페니실린 및 100㎍/ml 스트렙토마이신을 함유한 10% 소태아 혈청으로 보충된 고 글루코스 DMEM/F-12 배지(GIBCO Invitrogen Corporation, Grand island, NY)에서 유지시켰다.
2. 아데노바이러스 형질도입 & 셀레콕시브 처리
mda-7 유전자를 함유한 재조합 아데노바이러스 벡터(Ad-mda7) 및 루시페라제 리포터 유전자를 함유한 재조합 아데노바이러스 벡터(Ad-luc)를 Introgen Therapeutics사(Introgen Therapeutics, Houston, TX)로부터 입수하였다. 각각 MCF7/Her18 및 MDA-MB-436 세포주에 있어서 100-mm 배양 플레이트내 1 x 106개 세포를 세포당 2000 또는 1000 바이러스 입자(vp)의 MOI(100 또는 50 플라크 형성 단위/세포)의 Ad-mda7 또는 Ad-luc로 형질도입하였다. 셀레콕시브를 DMSO 중에 용해시키고, 세포 배양 배지에 (세포 생존에 영향을 미치지 않기 위해) 0.1% 미만의 최종 농도로 첨가한 후, 각각 MCF7/Her18 및 MDA-MB-436 세포에 대하여 20 또는 50μM의 용량으로 배양물내에 도입하였다. 벡터 및 셀레콕시브 용량은 Ad-mda7 및 셀레콕시브의 배합된 효과와 비교하기 위해 50% 미만의 독성이 확실하도록 선택하였다.
3. 세포 증식 분석
사람 유방암 세포 성장에 미치는 셀레콕시브 및 Ad-mda7의 효과를 트리판 블루(Invitrogen Co., Carlsbad, CA) 배제 및 MTT(3-[4,5-디메틸티아졸-2-일]-2,5-디페닐 테트라졸륨 브로마이드)(Sigma, St. Louis, MO) 분석후 세포 계수에 의해 측정하였다. 간단하게는, 세포를 60-mm 배양 플레이트마다 6 x 105 개 세포의 농도로 육종하였다. 24시간 후, 배지를 제거하고, 셀레콕시브를 함유하거나 함유하지 않은 배양 배지를 계획된 대로 첨가하여 바이러스 형질도입을 기재된 바와 같이 수행하였다. 72시간 배양후, 부유하고 있는 세포 및 부착 세포를 수거하고, 합한 세포 집단을 적혈구분석기를 사용하여 계수하였다. 세포 생존력을 트리판 블루 배제 염색으로 측정하였다. MTT 분석을 위해, 1,000개 세포를 96웰 플레이트에 삼중으로 육종하고, 72시간 후 분석하였다. 배양후, 세포를 DMSO로 고정시키고, MTT 용액(5mg/ml)로 염색하였다. 흡광도를 자동 분광광도 미니플레이트 판독기(EL808 Ultramicroplate reader, Bio-Tek Instruments, Inc., Winooski, VT)를 사용하여 570nm에서 판독하였다. 값을 표준화하고, 대조군 세포와 비교한 변화율(%)로서 플롯팅하였다(평균 ± S.E.M.).
4. 세포 주기 및 아폽토시스 분석
모든 배양물은 수거시 조금 융합되어 있었다. 수거한 세포를 빙냉 80% 에탄올로 고정시키고, 프로피디움 요오드화물(PI)(Sigma, St. Louis, MO)을 사용하여 염색한 후, 유세포분석기(FCM)(EPICS XL-MCL, Coulter, Miami, FL)를 사용하여 상기 기재된 바와 같이 분석하였다. 배지내 부유하고 있는 세포 및 트립신 처리된 부착 세포를 수거하여 펠렛화하였다. 수거한 세포를 세척한 후, 아넥신 V/FITC 아폽토시스 검출 키트(BD Biosciences, Franklin Lake, NJ)를 사용하여 아넥신 V-플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC)/PI로 염색하였다. BrdU(5-브로모-2-데옥시우리딘)/말단 데옥시뉴클레오티딜 트랜스퍼라제(TdT)-매개된 2'-데옥시우리딘 5'-트리포스페이트(dUTP)-바이오틴 닉 말단 표지화(TUNEL) 분석(APO-Direct, BD Biosciences, Franklin Lake, NJ)을 제조사의 프로토콜에 따라 수행하였다. 간단하게는, 파라포름알데하이드-고정시킨 세포를 세척하고, 염색 용액(10㎕의 TdT 반 응 완충액, 0.75㎕의 TdT 효소 및 8㎕의 FITC-dUTP)과 함께 밤새 배양하였다. 다음날, 세포를 세정하고, 1ml의 PI/RNase 용액중에 재현탁시켰다. 실온에서 30분 동안 암 배양 후, 유세포분석기를 수행하여 아폽토시스 세포율(%)을 수득하였다. 세포 주기를 FCM(Multicycle, Phoenix Flow System, San Diego, CA)과 배합된 프로그램을 사용하여 분석하였다.
5. 프로스타글란딘 E2(PGE2) 측정
PGE2의 농도를 측정하기 위해, 세포를 100-mm 플레이트마다 1 x 106개 세포의 농도로 육종하고, 셀레콕시브, Ad-mda7 또는 이들 두 제제의 배합물로 처리하였다. 72시간 배양 후, 30분 동안 PGE2 생성물을 증가시키기 위해 3㎕의 아라키돈산(1mM)을 배양 배지에 첨가하였다. 상청액을 수거하고, 효소-결합된 면역분석 키트(Cayman Chemical, Ann Arbor, MI)를 제조사의 취급설명서에 따라 사용하여 PGE2 농도를 측정할 때까지 -80℃에서 저장하였다. 3회 값들의 최종 결과를 pg/ml로서 나타내었다.
6. 웨스턴 블롯팅
세포를 용해시켜 단백질 농도를 BioRad 분석(Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA)을 사용하여 측정하였다. 세포용해물을 10% SDS 겔을 사용한 웨스턴 블롯 분석으로 분석하였다. 레인에 50㎍의 단백질을 부하하고, 90V에서 2시간 동안 전기영동하였다. 겔을 5% 탈지분유로 차단된 니트로셀룰로스 막에 전달시키고, 1차 항체(COX-2(Cayman Chemical Co., Ann Arbor, MI), β-카테닌(Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA), Akt(Cell Signaling, Beverly, MA) 및 p- Akt(Cell Signaling, Beverly, MA))와 함께 4℃에서 밤새 배양하였다. 막을 세척하고, 2차 항체와 실온에서 1시간 동안 배양하였다. 이어서, 막을 전개시키고, 증강된 화학발광(ECL) 웨스턴 블롯팅 검출 시약(Amersham Biosciences, Buckinghamshire, UK)을 사용하여 단백질 시그날을 검출하였다. 막을 β-액틴에 대한 항체(Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA)와 함께 배양하여 동일한 단백질 부하를 평가하였다. 결과물에 대해 농도계측기를 수행하였다.
7. 통계적 분석
대조군과 처리 그룹 사이에, 및 상이한 실험 그룹들 사이에 통계적 분석을 수행하였다. 스튜던츠 t 시험을 사용하여 평균을 비교하였다. 또한, 웨스턴 블롯의 농도계측기로 스튜던츠 t 시험에 의한 유의성에 대하여 분석하였다. p<0.05의 값을 갖는 차이는 통계적으로 유의적인 것으로 간주되었다.
B. 결과
1. Ad-mda7과 셀레콕시브의 공동 처리는 유방암 세포의 성장을 억제한다.
Ad-mda7 및/또는 셀레콕시브로 처리한 후, 세포 생존력을 트리판 블루 배제 및 MTT 분석을 사용하여 평가하였다. MTT 분석을 사용하여 도 1에 제시한 바와 같이, 배합 처리 그룹은 HER-2/neu의 발현 상태와 상관없이, 대조군과 비교하여 배양 48시간 및 72시간 후 유의적으로 감소된 세포 생존력을 나타내었다. HER-2/neu(+) 세포는 24시간 처리 후 Ad-mda7과 배합된 처리 사이에 생존 세포의 수에서 차이를 나타내었고(p=0.04), 48시간 처리 후 대조군과 비교하여 배합 그룹 생존력에서 유의적 감소를 나타내었으며(p=0.045), 모든 처리 그룹들은 대조군과 비교하여 생존 에서 통계적으로 유의적인 감소를 나타내었다(셀레콕시브의 경우 p=0.002, Ad-mda7의 경우 p=0.02, 및 배합의 경우 p=0.009). HER-2/neu(-) 세포는 24시간 후 그룹들 사이에 차이가 없음을 나타내었지만, 배합은 대조군과 비교하여 차이를 보이기 시작하였다(p=0.049). 배합 처리 및 Ad-mda7 처리는 셀레콕시브보다 HER2/neu(-) 세포를 사멸시키는데 더 효과적인 것으로 보였고(각각, p=0.03 및 p=0.02), 배합은 2일째에 종양 세포 사멸에서 Ad-mda7보다 더 우수하였다(p=0.02).
72시간 처리 후, Ad-mda7은 대조군보다 더 효과적이었고(p=0.02), 배합은 세포독성에서 셀레콕시브보다 더 우수하였다(p=0.01). 트리판 블루 배제를 사용하여 도 2에 제시한 바와 같이, 셀레콕시브 및 배합 처리는 HER-2/neu(+) 세포에서 대조군과 비교하여 종양 세포 사멸 수에서 더 우수한 능력을 나타내었다(각각, p=0.04 및 p=0.01). MCF7/Her18 세포에서 3개의 처리 그룹 사이에, 셀레콕시브와 Ad-mda7은 배합과 비교하여 증가된 세포독성을 증명하지는 못했다(p=0.01). MDA-MB-436 세포에서, 배합된 처리는 대조군, Ad-mda7 또는 셀레콕시브과 비교하여 가장 효과적인 처리 암(arm)이었다(각각, p=0.01, 0.01 및 0.01). 또한, PGE2 생성에 미치는 배합 처리의 효과를 이러한 세포에서 측정하였다(표 4). 재현하자면, 배합은 대조군과 비교하여 더 우수한 PGE2 생성 억제를 나타내었다(HER-2/neu(+) 세포의 경우 p=0.01 및 HER-2/neu(-) 세포의 경우 p=0.049). MDA-MB-436 세포에서 Ad-mda7 단일요법을 사용한 처리는, MCF7/Her18 세포에서 발견된 상당한 감소와는 대조적으로(p=0.04), 생성된 PGE2의 양에서 유의적 감소를 보이지는 못했다(p=0.06). 셀레콕시브는 세포주 둘다에서 PGE2 생성을 감소시켰다(MCF7/Her18의 경우 p=0.03 및 MDA-MB-436의 경우 p=0.049).
Figure 112007065305055-pct00001
2. Ad-mda7과 셀레콕시브 배합은 개별적 처리와 비교하여 아폽토시스를 증가시킨다.
종양 세포주를 사용한 종래 연구로 Ad-mda7은 G2/M 세포 주기 정지를 유도하는 반면 셀레콕시브는 G1 차단을 유도하는 것으로 증명되었다. Ad-mda7과 셀레콕시브 배합은 세포 주기의 G1 기에서 MCF7/Her18 세포를 차단하였고(p=0.03), 셀레콕시브 단독에 의해 매개된 G1 차단보다 유의적으로 보다 더 두드러졌다. HER2/neu(-) 세포에서, 배합 처리는 셀레콕시브 또는 Ad-mda7과 비교하여 S-기의 세포에서 증가를 야기하였다(도 3). MCF7/Her18 및 MDA-MB-436 세포에서, 셀레콕시브는 Ad-mda7보다 G1 체크포인트에서 더 많은 세포를 차단한 반면(p=0.02), Ad-mda7 단일요법은 G2/M 차단을 야기하였다(도 3).
아넥신 V-FITC 및 TUNEL 분석을 사용하여 조기 및 말기 아폽토시스 발생을 평가하였다(도 4); 2가지 분석 모두에서 단일요법 또는 대조군과 비교하여 배합 처리에 의해 유도된 아폽토시스에서 유의적인 증가가 증명되었다. 또한, 증가된 아폽토시스는 HER-2/neu 발현 상태에 상관없이 관찰되었다(p<0.05). 아넥신 V/FITC 분석에 의하면 셀레콕시브 및 Ad-mda7은 세포주 둘다에서 아폽토시스를 촉진시켰다(p<0.05). HER-2/neu(+) 세포에서 TUNEL과 비교하여 증가된 아넥신 V 염색은 MDA-MB-436과 비교하여 MCF7/Her18 세포에서 더 빠른 아폽토시스의 동역학을 반영할 수 있다.
3. Ad-mda7과 셀레콕시브 배합은 COX-2, Akt 및 p-Akt의 발현을 감소시킨다.
Ad-mda7 처리는 Akt 및 p-Akt의 발현을 네거티브로 조절하는 것으로 공지되어 있다[참조: Mhashilkar et al.,, 2003]. 유사한 효과는 Ad-mda7 형질도입 후 β-카테닌 발현에 대해서도 관찰되었다. Ad-mda7과 셀레콕시브의 배합 후 대표적인 생존촉진(prosurvival) 마커의 발현에 미치는 Ad-mda7 및 셀레콕시브의 역할을 설명하기 위해서, 웨스턴 블롯을 수행하여 COX-2, Akt, p-Akt 및 β-카테닌의 안정상태 수준을 분석하였다.
Akt 및 p-Akt의 수준을 웨스턴 블롯팅 분석 및 농도계측기로 측정하였다. HER2-(MDA-MB-436) 및 HER2+(MCF7/Her18) 세포는 대조군(PBS)과 비교하여 배합된 처리 후 유의적으로 감소된 Akt 및 p-Akt의 발현을 보였다. HER2+ 세포에서 Akt에 대한 상대적인 농도계측기 수는 셀레콕시브(1.01), Ad-mda7(0.99) 및 둘다(0.53*)였다(* p<0.05). HER2+ 세포에서 pAkt에 대한 상대적인 농도계측기 수는 셀레콕시브(0.61*), Ad-mda7(1.85) 및 둘다(0.36*)였다(* p<0.05). HER2- 세포에서 Akt에 대한 상대적인 농도계측기 수는 셀레콕시브(0.72), Ad-mda7(1.00) 및 둘다(0.44*)였다(* p<0.05). HER2- 세포에서 pAkt에 대한 상대적인 농도계측기 수는 셀레콕시브(0.67), Ad-mda7(1.61) 및 둘다(0.37*)였다(* p<0.05).
COX-2의 상대적 수준을 웨스턴 블롯팅 분석 및 농도계측기에 의해 측정하였다. HER2-(MDA-MB-436) 및 HER2+(MCF7/Her18) 세포는 대조군(PBS)과 비교하여 배합된 처리 후 유의적으로 감소된 COX-2의 발현을 보였다. HER2+ 세포에서 COX-2에 대한 상대적 농도계측기 수는 셀레콕시브(0.53), Ad-mda7(0.78) 및 둘다(0.53*)였다(* p<0.05). HER2 세포에서 COX-2에 대한 상대적 농도계측기 수는 셀레콕시브(0.74), Ad-mda7(0.78) 및 둘다(0.45*)였다(*p<0.05).
β-카테닌의 상대적 수준을 웨스턴 블롯팅 분석 및 농도계측기에 의해 측정하였다. HER2-(MDA-MB-436) 및 HER2+(MCF7/Her18) 세포는 β-카테닌의 발현에서 어떠한 유의적인 차이도 보이지 않았다. HER2+ 세포에서 β-카테닌에 대한 상대적인 농도계측기 수는 셀레콕시브(0.78), Ad-mda7(0.64) 및 둘다(0.85)였다. HER2- 세포에서 β-카테닌에 대한 상대적인 농도계측기 수는 셀레콕시브(0.82), Ad-mda7(0.97) 및 둘다(0.61)였다.
Akt, p-Akt 및 COX-2의 유의적으로 감소된 수준은 HER-2/neu 발현에 상관없이 처리 후 기록되었다(p<0.05). 배합 처리 이외에, 셀레콕시브는 MCF7/Her18 세포에서 대조군보다 Akt의 인산화를 억제하는 보다 더 우수한 능력을 보였다(p=0.04). Akt의 발현은 MDA-MB-436 세포에서 대조군과 비교하여 셀레콕시브에 의해 다소 억제되었다(p=0.054). Ad-mda7은 2개의 세포주 모두에서 p-Akt를 증가시켰고, 상기 증가는 비록 Ad-luc에서도 관찰되었지만, 이는, 그 효과가 MDA-7 단백질 의존성이 아님을 나타내는 것이다. Ad-mda7과 셀레콕시브의 배합은 대조군과 비교하여 70% 초과까지 및 셀레콕시브 단독요법과 비교하여 대략 50%까지 p-Akt를 감소시켰다. Ad-mda7 및 셀레콕시브 둘다 COX-2 발현을 감소시켰고, 추가로 COX-2 억제가 MDA-MB-436 세포에서 배합에 의해 관찰되었다. Ad-mda7 및 셀레콕시브 둘다 MCF7/Her18 세포에서 β-카테닌을 감소시켰고, MDA-MB-436 세포에서 β-카테닌 수준을 경미하게만 감소시켰다. 상기 배합은 세포주 둘다에서 β-카테닌 수준을 감소시켰지만, 하향 조절이 통계적으로 유의적이지는 않았다.
C. 논의
Ad-mda7의 특이한 특성은 정상 세포에 영향을 미치지 않으면서 암 세포 증식 억제 및 아폽토시스 유도이다[참조: Mhashilkar et al., 2003; Pataer et al., 2002; Jiang et al., 1996; Saeki et al., 2000]. 종양 세포를 사멸시킬 수 있는 암 세포내 하나의 작용 기작은 생존촉진 매개자 Akt 및 인산화된 Akt의 하향-조절이다[참조: Mhashilkar et al., 2003; McKenzie et al., 2004]. 사이클로옥시게나제 2(COX-2)는 다양한 종류의 프로스타글란딘 생성을 위한 아라키돈산을 대사하는데 필요한 효소중 하나이다. 연쇄증폭반응에서 다른 효소인 사이클로옥시게나제 1은 세포에서 구조적으로 발현되지만, COX-2는 종종 종양 세포에서 유도되거나 상향 조절되는 점이 구별된다. 최근에, 다양한 종류의 사람 암에서 증강된 COX-2의 발현은 많은 연구가들에게 암을 예방하거나 처리하기 위한 선택적 또는 비특이적 COX-2 억제제의 역할을 연구하고자 유도하는 것으로 인지되었다. 아스피린 및 기타 비스테로이드성 소염제는 많은 암, 특히 결장암에서 화학예방 용도에 효과적인 것으로 증명되었다[참조: Steinbach et al., 2000; Thun et al., 1991]. 보다 최근에, 유방암을 포함한 다양한 암의 예방 및 치료에서 셀레콕시브를 포함한 선택적 COX-2 억제제의 잠재적 적용을 연구하고 있는 보고서의 수가 증가하고 있다[참조: Basu et al., 2004; Liu et al., 2003; Howe et al., 2002].
복합 신호전달 중에, 아폽토시스 및 생존 경로 조절에서 PI3K/Akt의 역할에 대해 상당한 주의가 집중되었다[참조: Mhashilkar et al., 2003]. 레트로바이러스 종양유전자로서 가장 먼저 분리된 PI3K는 수개의 사람 암에서 생존촉진 경로를 유도한다[참조: Fry, 2001]. 인지질의 세포내 수준에 의해 조절된 세린-트레오닌 단백질 키나제인 PKB/Akt는 종양형성에 중요한 역할을 하는 것으로 보인다[참조: Knuefermann et al., 2003]. 세린-트레오닌 단백질 키나제인 PKB/Akt가 PI3K의 하향흐름 표적이므로, 이는 다양한 사람 암에서 Thr308 및 Ser473에서의 인산화에 의해 증폭되거나 활성화된다[참조: Marte 및 Downward, 1997]. PI3K/Akt 생존 경로는 NF-카파B(NF-κB) 신호전달 경로를 조절하고 종양 괴사 인자(TNF)-유도된 아폽토시스의 유도를 억제하는 것으로 보여졌다[참조: Burow et al., 2000]. HER-2/neu는 NF-κB를 활성화하는 PI3K/Akt 경로의 활성화를 촉진시켜 아폽토시스 억제를 야기한다. 또한, PI3K/Akt 신호전달 경로는 형질변환 성장 인자 베타(TGF-β)에 의해 매개된 암 세포 이동을 일으킬 수 있다[참조: Bakin et al., 2000]. 따라서, 최근의 연구는 다양한 암 치료에서 Akt 활성의 조절 또는 억제에 초점이 맞춰졌다. 강력하고 선택적인 COX-2 억제제 중 하나인 셀레콕시브가 Akt 활성화의 억제를 통해 시험관내 암 세포에서 아폽토시스를 유도하였다고 최근에 보고되었다[참조: Hsu et al., 2000]. 아데노바이러스 벡터는 치료학적 유전자를 시험관내 및 생체내로 전달하는데 성공적으로 광범위하게 사용되었다.
Ad-mda7과 셀레콕시브의 배합이 Akt의 인산화를 감소시킬 수 있고, 증강된 종양세포치사 효과가 PGE2와 HER-2/neu 수용체 발현 사이에 포지티브 피드백 루프로 인하여 HER-2/neu를 과발현하는 세포에서 더 현저함을 예측할 수 있었다[참조: Benoit et al., 2004]. 실제로, 이들 실험에서, HER-2/neu-포지티브 및 HER-2/neu-네거티브 유방암 세포 둘다에서 셀레콕시브와 Ad-mda7을 배합함으로써 증강된 항-종양 활성이 성공적으로 증명되었다. 이는 COX-2 발현의 직접 억제를 통해 및 PI3K/Akt 생존촉진 경로의 하향-조절을 통해 발생하였다. Ad-mda7과 셀레콕시브의 배합 사용은 단일요법으로서 효과적인 둘중 하나의 제제에 필요한 용량보다 더 적은 용량으로 수개의 이점, 예를 들어 아폽토시스 증강 및 종양 세포 성장의 억제를 제공할 수 있다.
실시예 2
MDA7 및 셀레콕시브를 사용한 방사선민감성
A. 물질 및 방법
MDA-MB-436 및 MDA-MB-468 사람 유방암 세포(실시예 1 참조)를 방사선조사 전 3일 동안 Ad-mda7 단독, 셀레콕시브 단독 또는 이들 2개의 배합으로 예비처리하거나 예비처리 없이 상이한 양의 방사선에 노출시켰다. 3개의 상이한 처리 암(arm)의 방사선민감성 효과를 비교하기 위해 클론형성 생존에 대해 세포를 분석하였다. 유세포분석기 및 세포 주기 분석을 수행하여 세포 주기 변화 및 아폽토시스 유도를 평가하였다. 통계적 평가를 스튜던츠 t-시험으로 수행하였다.
B. 결과
클론형성 생존 분석에서, Ad-mda7과 셀레콕시브의 배합이 유방암 세포주 둘다에서 종양 세포 방사선민감성을 유의적으로 증강시킨 것으로 나타났다. 셀레콕시브의 50% 미만의 종양세포치사 효과(MB436의 경우 50μM 및 MB468의 경우 30μM) 및 Ad-mda7의 50% 미만의 종양세포치사 효과(MB436의 경우 1,000의 감염다중도(MOI) 및 MB468의 경우 2,000의 MOI)의 치사량에 가까운 용량에서, 배합은 세포주 둘다에서 유의적으로 증강된 방사선민감성을 나타내었다(p<0.05). 대조군과 비교하여 병용 요법 그룹에서 아폽토시스 세포의 비율이 증가하였지만, 통계적으로 유의적이지는 않았다. 세포 주기 분석으로 대조군과 비교하여 배합 그룹에서 G2/M 세포 주기에서의 증가가 증명되었다.
실시예 3
겔다나마이신 및 이의 유사체를 사용한 AD-MDA7 세포 사멸의 증강
A. 물질 및 방법
1. 세포주 및 시약
A549 및 H460 사람 폐암 세포주를 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션으로부터 입수하였다. 모든 세포를 5% CO2 대기에서 37℃로 10% 소태아 혈청, 10mM 글루타민, 100유닛/ml 페니실린, 100㎍/ml 스트렙토마이신으로 보충된 RPMI 1640(Life Technologies, Inc., Grand Island, NY)중에 유지시켰다. 겔다나마이신(GA)은 Calbiochem(San Diego, CA)으로부터 입수하였다. 17-알릴-아미노겔다나마이신(17AAG)은 친절하게도 Nguyen Dao 박사(National Cancer Institute, Bethesda, MD)로부터 제공받았다. 17AAG를 10mM 모액으로서 DMSO(Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) 중에 제형화하고, -20℃에서 보관하였다. 최종 작업 용액을 0.01% 미만의 DMSO를 함유하도록 배지중에 희석하였다. 이러한 화합물을 사용한 모든 실험을 약한 빛 조건하에서 수행하였다.
2. 아데노바이러스 생성
Ad-mda7, Ad-LacZ 및 Ad-Luc 벡터의 작제는 이전에 보고되어 있다[참조: Pataer et al., 2002]. A549 및 H460 암 세포주에서 아데노바이러스 벡터의 형질도입 효율은, 세포를 Ad-LacZ로 감염시킨 후 70% 이상의 세포를 형질도입하는데 필요한 역가를 측정함으로써 측정하였다.
3. 유세포분석기 분석
세포의 아폽토시스를 프로피디움 요오드화물 염색 및 FACS 분석으로 측정하였다. 세포를 수거하여 원심분리로 펠렛화한 후, 50㎍/ml 프로피디움 요오드화물, 0.1% Triton X-1OO 및 0.1% 시트르산나트륨을 함유하는 인산염-완충화된 염수 중에 재현탁하고, FACS 분석(Becton-Dickenson FACScan, Mountain View, CA; FL-3 채널) 전 볼텍싱하였다.
4. 웨스턴 블롯 분석
형질감염 48시간 후, 세포 추출물을 제조하고, 면역블롯 분석을 상기 기재된 바와 같이 수행하였다[참조: Pataer et al., 2002]. 다음의 항체를 사용하였다: PKR(K-17), HSP90, β-카테닌, E-카데린, Raf-1 및 β-액틴 항체를 Santa Cruz Biotechnology사(Santa Cruz, CA)로부터 구입하였다. 포스포-PKR[pT451] 및 포스포-eIF-2α[pS51] 항체를 BioSource International사(BioSource International, Camarillo, CA)로부터 구입하였다. Akt 및 포스포-Akt(Ser473)를 Cell Signaling사(Cell Signaling; Beverly, MA)로부터 구입하였다. MDA-7에 대한 폴리클로날 또는 모노클로날 항체를 Introgen Therapeutics Inc.사(Houston, TX)로부터 입수하였다.
5. 면역형광 분석
A549 세포(5x104개 세포/웰)를 70% 군집까지 챔버 슬라이드상에서 증식시킨 후, Ad-luc, Ad-mda7, GA, Ad-mda7 + GA 또는 Ad-luc + GA로 처리하였다. 48시간 후, 세포를 PBS로 세척하고, 신선하게 제조된 4% 파라포름알데하이드/PBS로 15분 동안 고정시켰다. 이어서, 세포를 20분 동안 4℃에서 0.2% Triton X-100으로 투과시키고, 1% 정상 염소 혈청으로 1시간 차단하였다. 토끼 폴리클로날 항-베타-카테닌을 4℃에서 밤새 배양하고, 로다민 2차 항체와 함께 37℃에서 30분 동안 전개시켰다. 이어서, 세포를 형광 현미경(Olympus BX50 형광 현미경)하에 가시화하였다[참조: Vorburger et al., 2002].
6. 면역침전 분석
세포를 PBS, Ad-mda7, Ad-mda7 + GA 또는 GA 단독으로 48시간 동안 처리한 후, RIPA 완충액(1 x PBS, 1% Nonidet P-40, 0.5% 나트륨 데옥시콜레이트, 0.1% SDS) 중에 용해시켰다. 500㎕(500㎍) 세포 용해물을 1차 항체와 4℃에서 밤새 배양하였다. 단백질 A/G 아가로스를 상기 혼합물에 첨가하고, 4시간 동안 배양하였다. 비드를 2500rpm에서 4℃로 5분 동안 원심분리로 펠렛화하였다. 펠렛을 1ml의 RIPA 완충액으로 4회 세척하였다. 마지막 세척 후, 50㎕의 1X SDS-PAGE 샘플 완충액을 비드에 첨가한 후, 이를 볼텍싱하고, 5분 동안 비등시켰다. 이어서, 이를 2500rpm에서 1시간 동안 원심분리한 후 겔상에 상청액을 부하하였다.
7. 운동성 분석
배지(0.7ml)를 24웰 플레이트(Costar)의 각각의 웰에 첨가하였다. 세포 배양 삽입물(Fisher; 8μm 구멍 크기, Falcon 3097)을 각각의 웰내에 위치시켰다. A549 및 H460 세포를 5 x 105개 세포/ml 농도로 조절하고, 500㎕의 세포를 각각의 삽입물내로 위치시켰다. 세포를 36시간 동안 PBS, Ad-luc, Ad-mda7, GA, Ad-mda7 + GA 및 Ad-luc + GA와 함께 배양하였다. 36시간 후, 웰 바닥에 부착된 세포 수를 계수하였다. 운동성을 36시간 후 웰에 부착하고 있는 약제를 함유하고 있지 않은 웰에서 세포 수의 퍼센트로서 표현한다.
8. 통계적 분석
보고된 데이터는 3개 이상의 독립적 실험의 평균을 나타내고, 바(bar)는 표준 편차(SD)를 나타낸다. ANOVA 및 양측(two-tailed) 스튜던츠 t 시험은 각각 다수 그룹의 통계적 분석 및 그룹간 비교를 위해 사용하였고, P<0.05는 유의적인 것으로 간주되었다.
B. 결과
1. 겔다나마이신(GA)은 사람 폐암 세포에서 아데노바이러스 mda-7 매개된 세포 사멸을 증강시킨다.
많은 연구가들은, 겔다나마이신(GA)이 유방 및 결장 암 세포상에 세포 사멸을 유도할 수 있는 것으로 제시하였다. GA가 사람 폐암 A549 및 H460 세포에서 아폽토시스를 유도할 수 있는지 여부를 연구하였다. 상이한 용량의 GA에 노출시킨 48시간 후, 유세포분석기 분석을 A549 및 H460 세포주에서 수행하였다. 도 5A는, 폐암 세포를 GA로 처리한 것이 세포주 둘다에서 높은 비율의 세포 사멸을 야기하였음을 나타내고 있다. 세포 사멸은 이들 암 세포주에서 GA에 의해 용량-의존적으로 유도되었다. 50nm 및 150nm 용량의 GA와 배합된 Ad-mda7의 효과를 48시간 동안 A549 및 H460 세포주 둘다에서 시험하였다. 유세포분석기 분석에서, Ad-mda-7 단독은 각각 A549 및 H460 세포에서 15 및 12%의 아폽토시스를 야기한 것으로 나타났다. 50nm에서 GA 단독은 각각 48시간에 A549 및 H460 세포에서 6.3 및 5.7%의 아폽토시스를 야기하였다. 150nm에서 GA 단독은 각각 48시간에 A549 및 H460 세포에서 23.6 및 21%의 아폽토시스를 야기하였다. GA와 Ad-mda7의 배합은 A549(25.3 및 44%) 및 H460(21.7 및 37.5%) 세포 둘다에서 아폽토시스 세포의 실질적 증강을 야기하였다(도 5B). 아폽토시스 효과의 이러한 증강은 이들 암 세포에서 GA와 Ad-luc 배합의 경우 나타나지 않는다. 추가로, 배합된 효과는 각각 제제의 추가된 효과보다 더 컸다.
2. Ad-mda7 및 GA 배합 처리는 PKR의 발현을 증가시키지 않는다.
본 발명자들은, Ad-mda7이 ds-RNA 의존적 단백질 키나제(PKR)를 유도하고 활성화하며, 이는 eIF-2α의 인산화 및 폐암 세포에서 아폽토시스의 유도를 야기한다고 이전에 보고하였다. 따라서, Ad-mda7 및 GA 배합 처리가 PKR의 발현 수준 및 인산화 상태를 증가시켰는지 여부를 시험하였다. Ad-mda7로 처리한 A549 및 H460 세포는 PKR의 양 및 인산화된 PKR의 증가를 나타내었다. 대조적으로, PBS, GA 또는 Ad-luc 처리는 PKR의 증가 또는 PKR의 인산화를 야기하지 않았다. Ad-mda7과 GA의 배합은 A549 및 H460 세포 둘다에서 PKR 수준 또는 이의 인산화 상태를 증가시키지 않았다. 대조적으로, 이들 암 세포를 GA로 처리한 것은 AKT, P-AKT, Raf 표적의 분해를 야기하였고, 이는, Hsp90의 입체구조적 성숙에 필요하다. 흥미롭게도, Ad-mda7은 A549 및 H460 세포 둘다에서 AKT를 분해하였지만, 동시에 AKT의 인산화 상태는 증가시켰다. Ad-mda7 및 GA 공동 처리는 이들 암 세포에서 인산화된 AKT를 유의적으로 분해시켰다. 이들 결과는, AKT의 Ad-mda7 매개된 활성화의 억제가 부분적으로 Ad-mda7 및 GA의 상승적 효과에 의한 것일 수 있음을 제시하는 것이다.
3. Ad-mda7 및 GA 배합은 폐암 세포에서 β-카테닌/E-카데린 결합의 증가 및 표면 E-카데린을 상향 조절한다
이전 보고에는, Ad-mda7이 사람 폐암 세포에서 E-카데린을 상향조절할 수 있다고 제시되어 왔다[참조: Mhashilkar et al., 2003]. 연구가들은, Ad-mda7과 GA의 배합이 사람 폐암 세포에서 E-카데린의 상향 조절을 증강시킬 수 있는지 여부를 조사하였다. 도 6A에 제시된 바와 같이, Ad-mda7 단독 및 GA 단독은 각각 항-E-카데린 모노클로날 항체를 사용한 표면 염색 및 유세포분석기에 의해 측정된 바와 같이 A549 및 H460 세포에서 E-카데린 수준을 증가시킬 수 있었다. PBS, Ad-luc, Ad-mda7, GA 단독 또는 Ad-luc + GA 처리와 비교하여, Ad-mda7과 GA(50nm)의 배합 처리는 이들 세포에서 E-카데린의 수준을 더 증가시켰다. 면역형광 염색에서, Ad-mda7 단독 및 GA 단독이 A549 세포에서 각각 β-카테닌 수준을 증가시킬 수 있는 것으로 나타났다. 또한, 염색 실험에서, Ad-mda7과 GA의 배합이 이들 세포에서 β-카테닌 수준을 현저하게 증가시킨 것으로 나타났다.
또한, 이전의 연구는, 겔다나마이신이 β-카테닌의 타이로신 탈인산화 및 증가된 β-카테닌/E-카데린 결합을 촉진시켜, 실질적으로 감소된 세포 운동성을 야기하는 것으로 증명되었다[참조: Bonvini et al., 2001]. 따라서, Ad-mda7과 GA의 배합이 β-카테닌/E-카데린 결합을 증가시킬 수 있는지 여부를 조사하였다. PBS-, Ad-mda7-, GA- 또는 배합-처리된 세포를 먼저 항-E-카데린 항체로 면역침전시키고, β-카테닌-특이적 항체로 면역블롯팅하였다. 이는, E-카데린과 동시면역침전된 β-카테닌의 양이 PBS, Ad-mda7 또는 GA 단독으로 처리한 A549 및 H460 세포 둘다에서 보여진 수준과 비교하여 MDA-7과 GA의 배합물로 처리한 세포에서 상당히 증가하였음을 나타내었다. 세포주 둘다에서 면역침전물이 항-E-카데린 항체와 함께 면역블롯팅되는 경우, 동일한 수준의 E-카데린이 또한 검출될 수 있었다.
다량의 막-결합된 β-카테닌-E-카데린 복합체는 세포 운동성과는 반대로 관계가 있으므로, Ad-mda7과 GA의 배합이 A549 및 H460 세포의 운동성을 감소킬 수 있는지 여부를 시험관내 조사하였다. 36시간 시험관내 운동성 분석에 부가한 경우, Ad-mda7 또는 GA(50nM) 단독은 트리판 블루 염색에 의해 평가된 바와 같이 세포 생존력에는 영향을 미치지 않으면서 세포주 둘다에서 운동성을 감소시켰다(도 6B). Ad-mda7과 GA의 공동 처리는 A549 및 H460 세포 둘다상에 실질적으로 감소된 세포 운동성을 야기하였다(도 6B). 이러한 결과는, Ad-luc와 GA로 동시 처리된 경우 세포주 둘다에서 나타나지 않았다(도 6B).
다음으로, GA 유사체인 17AAG가 MDA-7로 처리한 사람 폐암 세포상에서 GA와 동일한 효과를 가질 수 있는지 여부를 조사하였다. 유세포분석기 분석을 2개의 상이한 용량의 17AAG로 노출시킨 48시간 후 A549 및 H460 세포주 상에서 수행하였다. 도 7은, 폐암 세포를 17AAG 또는 Ad-mda7 단독으로 처리한 것이 세포주 둘다에서 세포 사멸을 야기하였음을 나타내었다. Ad-luc과 17AAG의 배합과 비교하여, 17AAG과 Ad-mda7의 배합은 A549 및 H460 세포 둘다에서 아폽토시스의 유의적 증강을 야기하였다(도 7).
실시예 4
비타민 E 숙시네이트(VES)와의 배합으로 AD-MDA7 성장 억제 효과의 증강
A. 물질 및 방법
1. 세포주 및 시약
사람 난소암 세포 MDAH 2774를 MD Anderson Cancer Center의 Judith Wolf 박사로부터 입수하였다. 정상 섬유아 세포주 MRC-9를 ATCC로부터 입수하였다. Ad-루시퍼라제 및 Ad-MDA7 벡터를 Introgen Therapeutics사로부터 입수하였다[참조, 예를 들어 Mhashilkar et al., 2001, 이는 본원 참조로서 인용된다]. 비타민 E 숙시네이트를 Sigma Chemicals사(St. Louis, MO)로부터 입수하였다.
2. 성장 억제에 대한 분석
사람 난소암 세포(MDAH 2774) 또는 정상 사람 섬유아세포(MRC-9)를 Ad-luc(벡터 대조군), 토코페롤(비타민 E 숙시네이트, 8μg/mL), Ad-mda7(2000vp/세포) 또는 이들 배합물로 72시간(3일)동안 처리하였다.
세포를 혈청 비함유 배지에서 Ad-luc 또는 Ad-mda7로 3시간 동안 감염시켰다. 배양 3시간 후, 세포에게 완전 배지를 공급하였다. 이때, DMSO 중에 용해된 토코페롤을 세포에 부가하여 8μg/ml의 최종 농도를 수득하였다. 배양 72시간 후, 세포를 수거하고, 성장 억제율(%)을 트리판 배제법에 의해 측정하였다.
3. 웨스턴 블롯 분석
웨스턴 블롯 분석을 위해, 총 단백질을 세포 용해 완충액(20mM HEPES, pH 7.5; 10mM KCl, 1mM MgCl2, 1mM EDTA, 1mM DTT, 250mM 슈크로스 및 1X 프로테아제 억제제)을 첨가함으로써 Ad-luc(벡터 대조군), 토코페롤(비타민 E 숙시네이트, 8μg/mL), Ad-mda7(2000vp/세포) 또는 이의 배합물로 처리한 MDAH 2774 세포로부터 분리하였다. 단백질을 SDS 폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의해 분리하고, 나일론 막상에 고정시켰다. 막을 카스파제-9(Cell Signaling, Boston, MA) 및 카스파제-3, 폴리(ADP-리보스) 폴리머라제 PARP, Bid 및 카스파제-8(BD-Pharmingen, San Diego, CA); Fas 및 MDA-7(Introgen Therapeutics); 사이토크롬 C(Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA); 및 β-액틴에 대한 1차 항체로 프로브화하였다. 단백질 발현을 적합한 서양고추냉이 퍼옥시다제(HRP)-접합된 2차 항체를 사용하여 측정하고, Amersham사의 증강된 화학발광 웨스턴 블롯팅 검출 시스템을 적용하여 증강된 화학발광 필름(Hyperfilm, Amersham)상에 가시화하였다.
4. 세포 분획화
세포를 상기 기재된 바와 같이 사이토크롬 C 방출의 검출을 위해 세포질 및 미토콘트리아 분획물로 분획시켰다[참조: Gewies et al., Cancer Res., 60:2163-2168, 2000]. 간단하게는, 종양 세포를 PBS, Ad-luc, Ad-mda7, 토코페롤 또는 이의 배합물로 72시간 동안 처리하였다. 처리 72시간 후, 세포를 PBS로 세척하고, 세포를 긁어내어 튜브내로 수거한 후, 100㎕ 빙냉 완충액(20mM HEPES (pH 7.5), 10mM KCl, 1.5mM MgCl2, 1mM EGTA, 1mM EDTA, 1mM DTT, 250mM 슈크로스, 0.1mM PMSF, 2μg/ml 펩스타틴, 2μg/ml 류펩틴 및 2μg/ml 아프로티닌) 중의 Teflon 방망이(빙상 50회 치기)를 사용한 작은 유리 균질기에서 균질화하였다. 균질물을 4℃에서 20분 동안 16,000 x g로 회전시키고, 상청액(미토콘드리아 분획물) 및 세포 펠렛(세포질 분획물)을 웨스턴 블롯 분석에 의한 사이토크롬 검출을 위해 사용하였다.
B. 결과
1. 난소암 세포의 증식 억제는 Ad-mda7을 비타민 E(토코페롤)과 배합하여 처리함으로써 증강된다.
Ad-mda7 성장 억제 효과가 비타민 E에 의해 증강될 수 있는지 여부를 측정하기 위해서, 세포를 Ad-luc(벡터 대조군), 토코페롤(비타민 E 숙시네이트), Ad-mda7 또는 이의 배합물로 처리하였다. 도 8A에 제시된 바와 같이, Ad-mda7과 비타민 E 숙시네이트의 배합은 Ad-mda7 또는 비타민 E 숙시네이트 단독 처리와 비교하여 성장 억제를 향상시켰다. 도 8B는, Ad-mda7과 비타민 E를 사용한 정상 섬유아 세포의 처리가 Ad-mda7 단독으로 처리한 후 관찰된 것보다 증식 억제가 증가하지는 않음을 증명하고 있다.
2. Ad-mda7과 비타민 E(토코페롤)로 처리한 난소암 세포에서 아폽토시스가 증가된다는 지표
비타민 E 숙시네이트와 배합된 Ad-mda7의 향상된 성장 억제 효과가 아폽토시스에 기여할 수 있는지 여부를 측정하기 위해, 웨스턴 블롯 분석을 Ad-luc, Ad-mda7, 비타민 E 숙시네이트 또는 이의 배합물로 처리한 사람 난소암 세포상에서 수행하였다. 이러한 분석으로, MDA-7 단백질의 생성이 비타민 E 숙시네이트의 존재하에 상당히 증강되는 것으로 밝혀졌다. MDA-7 단백질의 증가된 생성과 일치하게, 웨스턴 블롯 분석에서, 또한 Ad-mda7과 비타민 E 숙시네이트를 배합하여 처리한 암 세포에서 아폽토시스의 특징의 증강된 관찰이 밝혀졌다. 구체적으로, 카스파제-3, 카스파제-8, 카스파제-9, PARP 및 Bid의 절단이, Ad-mda7 또는 비타민 E 숙시네이트 단독으로 처리한 세포와 비교한 경우 Ad-mda7과 비타민 E 숙시네이트로 처리한 암 세포에서 더 높은 정도로 관찰되었다. 이외에, 감소된 사이토크롬 C 단백질 발현에 의해 지시된 바와 같이 미토콘드리아로부터 사이토크롬 C의 증강된 방출은 또한 Ad-mda7과 비타민 E 숙시네이트로 처리한 세포에서 아폽토시스의 증가를 나타내었다. 마지막으로, 아폽토시스-관련 Fas 단백질은 Ad-mda7 또는 비타민 E 숙시네이트 단독보다 Ad-mda7과 비타민 E 숙시네이트로 처리한 암 세포에서 보다 용이하게 검출되었다(도 9).
실시예 5
리포솜 매개된 mda-7/IL-24 유전자 전달 후 폐 종양 성장의 국부적 및 전신적 억제
A. 물질 및 방법
1. 물질
모든 지질(DOTAP, 콜레스테롤)은 Avanti Polar Lipids사(Albaster, AL)로부터 구입하였다. Ham's/F12 배지 및 소태아 혈청(FBS)은 GIBCO-BRL-Life Technologies사(New York, NY)로부터 구입하였다. 폴리클로날 토끼 항-사람 MDA-7 항체를 Introgen Therapeutics, Inc.사(Houston, TX)로부터 입수하고, 항마우스 CD31은 Santa Cruz Biotechnology, Inc.사(Palo Alto, CA)로부터 입수하였다.
2. 세포주 및 동물
사람 비-소세포 폐 암종 세포주 A549를 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션으로부터 입수하고, 10% FBS, 1% 글루타메이트 및 항생제로 보충된 Ham's-F12 배지중에 유지시켰다. 쥐 UV2237M 세포는 Isaiah J. Fidler 박사(M. D. Anderson Cancer Center)로부터 입수하였고, 다른 경우에 기재된 바와 같이 유지시켰다[참조: Ramesh et al., 2001]. 세포를 규칙적으로 통과시키고, 마이코플라즈마의 존재에 대해 시험하였다. 본 연구에 사용된 4 내지 6주령의 암컷 BALB/c 누드 (nu/nu) 마우스(Harlan-Sprague Dawley Inc., Indianapolis, IN) 및 C3H/Ncr 마우스(National Cancer Institute, Fredericksburg, MD)를 병원균이 없는 환경에서 유지시키고, 동물 관리 및 사용을 위해 수립된 제도적 지침에 따라 취급하였다.
3. 플라스미드의 정제
본 연구에 사용된 플라스미드를 pVax 플라스미드 벡터(Invitrogen, Carlsbad, CA)에서 클로닝하고, 다른 경우에 기재된 바와 같이 정제하였다[참조: Templeton et al., 1997; Gaensler et al., 1999]. 간단하게는, 세균성 β-갈락토시다제(Lac-Z), 클로르암페니콜 아세틸 트랜스퍼라제(CAT) 또는 사람 mda-7 cDNA를 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터의 조절하에 함유하고 있는 플라스미드를 에스케리키아 콜라이 숙주 균주 DH5α에서 카나마이신 선택하에 성장시켰다. 정제된 플라스미드의 내독소 수준을 발색성 리물루수 변형세포 용해물 동역학 분석 키트(Kinetic-QCL; Biowhittaker, Walkersville, MD)를 사용하여 측정하였다. 정제된 플라스미드 DNA의 농도 및 순도를 OD 260/280 비로 측정하였다.
4. DOTAP:Chol 리포솜의 합성 및 DOTAP:Chol-DNA 혼합물의 제조
DOTAP:Chol 리포솜을 합성하고, 다른 경우에 기재된 바와 같이 감소하는 크기(1.0, 0.45, 0.2 및 0.1μm)의 Whatman 필터(Kent, UK)를 통해 밀어냈다[참조: Chada et al., 2003; Templeton et al., 1997]. DOTAP:Chol-DNA 복합체를 마우스에게 주사하기 2 내지 3시간 전에 신선하게 제조하였다.
5. 입자 크기 분석
신선하게 제조된 DOTAP:Chol-DNA 복합체를 N4 입자 크기 분석기(Coulter, Miami, FL)를 사용하여 평균 입자 크기에 대해 분석하였다. 리포솜-DNA 복합체의 평균 입자 크기는 300nm 내지 325nm 사이의 범위였다.
6. DOTAP:Chol-mda7 복합체의 피하 종양 이종이식에 미치는 효과
모든 실험에서, 100㎕ 멸균 인산염 완충화된 염수(PBS)중에 현탁된 5 x 106개 종양 세포(A549)를 우측 등 옆구리내로 주사하였다. 종양이 4 내지 5mm2 크기에 이르렀을 때, 동물을 무작위 그룹으로 나누고, 처리를 개시하였다. 종양을 함유하고 있는 동물을 6마리의 동물의 4개 그룹으로 나누었다. 그룹 1에게는 어떠한 처리도 제공하지 않았고, 그룹 2에게는 PBS를 제공했으며, 그룹 3에는 DOTAP:Chol-LacZ 복합체(50μg/용량)를 제공했고, 그룹 4에는 DOTAP:Chol-mda-7 복합체(50μg/용량)를 제공했으며; 모든 처리는 종양내로 실행되었고, 총 6회 투약을 위해 매일 제공하였다. 동물들을 제도적 지침에 따라 종양내 주사를 위해 메톡시플루란(Schering-Plough, Kenilworth, NJ)으로 마취시켰다. 종양 측정을 처리 그룹에 대한 지식이 없는 관찰자에 의해 격일로 기록하였고, 종양 용적을 수학식 V(mm3) = a x b2/2(이때, "a"는 가장 큰 용적이고, "b"는 수직 직경이다)을 사용하여 계산하였다[참조: Saeki et al., 2002; Ramesh et al., 2001]. 항종양 효능 데이터는 종양의 크기 및 수 둘다를 설명하기 위해 각 그룹에서 모든 동물에 대해 누적 종양 용적으로서 제시한다. 모든 실험에서, 종양 크기 변화의 통계적 유의성을 ANOVA에 의해 21 및 24일째에 측정하였다.
마우스 종양 세포에 미치는 mda-7의 효과를 시험하기 위해, 선천성 종양 모델을 사용하였다. 이를 위해, C3H 마우스에게 쥐 UV2237m 섬유육종 세포(1x106)를 피하로 주사하고, 3개 그룹으로 나누었다(n=8/그룹). 종양 크기가 4 내지 5mm2에 이르렀을 때, 동물에게 다음과 같은 종양내 처리를 제공하였다: 처리하지 않음(대조군), DOTAP:Chol-CAT 복합체 또는 DOTAP:Chol-mda-7 복합체. 처리 일정 및 처리적 효과의 분석은 A549 동물 모델에 대해 이미 기재한 것과 동일하였다. 실험을 통계적 분석을 위해 2회 반복하고, 유의성은 ANOVA에 의해 21일 및 23일째에 계산하였다.
7. MDA-7, 아폽토시스 및 CD31의 측정
nu/nu 또는 C3H 마우스에서 각각 확립된 피하 A549 또는 UV2237m 종양을 수거하고, 4% 완충화된 포르말린 중에 고정시킨 후, 파라핀에 봉입하고, 4-μm 절편으로 절단하였다. 조직 절편을 다른 경우에 기재된 바와 같이 MDA-7 트랜스유전자 발현에 대해 면역염색하였다[참조: Saeki et al., 2002; Ramesh et al., 2003]. MDA-7에 대해 포지티브 염색인 종양 세포를 광학현미경하에 분석하고, 처리 그룹의 지식이 없는 관찰자에 의해 정량하였다. 표본마다 5개 이상의 부분을 분석하였다. 처리 후 종양 세포의 사멸을 측정하기 위해, 종양의 절편을 말단 데옥시뉴클레오타이드 트랜스퍼라제(Tdt) 키트(Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN)를 사용하여 아폽토시스 세포 사멸에 대해 염색하고, 상기 기재된 바와 같이 메틸렌 블루 또는 메틸 그린으로 대비염색하였다[참조: Saeki et al., 2002; Ramesh et al., 2001]. 모든 염색 과정에서, 적합한 네거티브 대조군이 포함되었다.
CD-31 염색을 위해, 조직을 상기 기재된 바와 같이 항-CD31 항체로 염색하고[참조: Saeki et al., 2002; Ramesh et al., 2003], 맹검법으로 현미경하에 관찰하였다. 미세혈관 밀도(MVD)를 종양 조직마다 무작위로 선택된 5개의 부분에서 CD31 포지티브 염색 혈관의 수를 고배율(x400)하에 계수함으로써 반정량적으로 측정하였다. 처리 그룹마다 3개 종양 조직을 나타내는 총 15개 부분을 시험하고 정량하였으며, 결과를 혈관 평균수/부분으로서 제시하였다.
8. 처리 후 종양 특성
mda-7 유전자의 치료학적 효과를 측정하기 위해, 종양을 마지막 처리 후 마우스로부터 수거하고, 병리조직학적 시험을 수행하였다. 처리 그룹의 사전 지식 없는 병리학자가 분석하였다.
9. 실험적 폐 전이에 미치는 DOTAP:Chol-mda7 복합체의 효과
폐 전이에 미치는 DOTAP:Chol-mda-7 복합체의 효과를 시험하기 위해, 암컷 누드 마우스에게 꼬리 정맥을 통해 100㎕의 멸균 PBS 중에 현탁된 106 A549 종양 세포를 주사하였다. 6일 후, 마우스를 3개 그룹으로 나누고, 다음과 같이 처리하였다: 처리하지 않음(그룹 1), DOTAP:Chol-CAT 보합체(그룹 2) 및 DOTAP:Chol-mda-7 복합체(그룹 3). 각각의 그룹에는 8마리가 마우스가 있었다. 모든 처리는 50μg의 리포솜-DNA 복합체를 포함하였고, 총 6회 투약을 위해 27-게이지 바늘을 사용하여 꼬리 정맥을 통해 매일 투여하였다. 마지막 투약 3주 후, 동물을 CO2 흡입으로 마취시켰다. 각각의 마우스 폐에 인디아 잉크를 기도부내로 주사하고, Feketes 용액에 고정시켰다[참조: Ramesh et al., 2001]. 전신성 mda-7 유전자 요법의 치료학적 효과는 처리 그룹의 지식이 없는 관찰자에 의해 해부현미경하에 각각 폐의 전이 종양의 수를 계수함으로써 측정하였다. 데이터를 분석하고, 그룹 사이의 차이는 맨-휘트니(Mann-Whitney) 순위-합 시험(rank-sum)에 의해 P값이 0.05 미만인 경우 통계적으로 유의한 것으로서 해석하였다.
선천성 폐 종양 모델로서, C3H 마우스에게 쥐 UV2237m 섬유육종 세포를 주사하고(1 x 1O6), 3개 그룹으로 나누었다(n=7/그룹). 주사 6일 후, 동물을 다음과 같이 처리하였다: 처리하지 않음, DOTAP/Chol-CAT 복합체 또는 DOTAP:Chol-mda-7 복합체. 치료 일정 및 치료학적 효과의 분석은 A549 모델에 대해 상기 기재한 바와 동일하였다. 실험을 통계적 유의성을 위해 2회 수행하였다.
B. 결과
1. DOTAP:Chol-mda-7 복합체를 사용한 종양 세포의 시험관내 형질감염
플라스미드 DNA를 사람(A549) 및 마우스(UV2237m) 종양 세포에 전달하는 DOTAP:Chol 리포솜의 능력은 사람 MDA-7/IL-24 단백질을 암호화하는 발현 플라스미드를 사용함으로써 평가하였다. mda-7 플라스미드 DNA와 복합체를 이룬 DOTAP:Chol 리포솜을 사용한 형질감염은 24 및 48시간에 A549 및 UV2237m 종양 세포 둘다에서 외인성 MDA-7 단백질의 발현을 야기하였다. MDA-7 발현은 PBS 처리한 대조군 세포에서는 관찰되지 않았다. DOTAP:Chol-mda-7 형질감염된 A549 및 UV2237m 세포로부터의 조직 배양물 상청액의 분석에서 24시간째가 아니라 48시간째에 분비된 MDA-7 단백질이 나타났다. 48시간째에 분비된 MDA-7 단백질의 검출은, 분비된 MDA-7 단백질이 24시간째에 검출가능한 경우 Ad-mda7 처리된 세포에서 관찰된 것과 유사하지 않다[참조: Mhashilkar et al., 2001]. 이는, DOTAP:Chol 리포솜의 사용으로 달성된 형질도입 MDA-7 발현이 Ad-mda7로 수득된 것보다 적음을 나타내는 것이다. 분비된 MDA-7 단백질은 PBS 처리된 세포에서는 관찰되지 않았다. 따라서, DOTAP:Chol 리포솜은 mda-7 DNA를 종양 세포에 효과적으로 전달하여 Ad-mda7보다 적은 세포내로 분비된 형질도입 MDA-7 생성을 야기하였다.
2. MDA-7은 피하 종양 성장을 억제한다.
nu/nu 마우스에서 A549 사람 폐 피하 종양의 성장을 억제하는 DOTAP:Chol-mda-7 복합체의 능력을 평가하였다. 종양을 함유하고 있는 마우스를 종양내 경로를 통해 DOTAP:Chol-mda-7 복합체로 처리한 것은 처리하지 않은 동물, PBS로 처리한 동물 또는 DOTAP:Chol-LacZ 복합체로 처리한 동물에서의 종양 성장과 비교하여 종양 증식을 유의적으로 억제하였다(P=0.001)(도 1OA). 종양의 병리조직학적 분석에서, 다양한 처리 그룹 사이에 종양 침투 세포에서의 어떠한 유의적 변화도 없는 것으로 밝혀졌다.
다음으로, C3H 마우스에서 피하 쥐 종양상에 미치는 mda-7 유전자의 치료학적 효과를 평가하였다. UV223M 종양을 함유하고 있는 마우스를 3개의 그룹으로 나누고, 1개의 그룹은 처리하지 않고, 2번째 그룹은 DOTAP:Chol-CAT 복합체 처리를 제공하며, 3번째 그룹은 DOTAP:Chol-mda-7 복합체 처리를 제공하였다. UV2237m 종양의 성장은 2개의 대조군 그룹에서의 종양 성장과 비교하여 DOTAP:Chol-mda-7 복합체의 종양내 투여로 처리한 마우스에서 19일째부터 시작하여 억제되었다(도 lOB). 그러나, 유의적 종양 억제는 23일째에 관찰되었다(P=0.01). 종양 억제(P=0.24)는 또한 처리하지 않은 대조군 마우스와 비교하여 DOTAP:Chol-CAT 복합체로 처리한 마우스에서도 발견되었다. 그러나, DOTAP:Chol-CAT 복합체로 처리한 마우스에서 관찰된 억제 효과는 비-특이적 효과에 의한 것이고, 본 발명자들의 상기 연구에서와 일치한다[참조: Ramesh et al., 2001].
관찰된 종양-억제 효과가 mda-7 유전자 발현에 의한 것인지를 증명하기 위해, 주사 48시간 후 수득한 피하 A549 및 UV2237m 종양을 MDA-7 단백질 발현에 대해 면역조직화학적 분석을 수행하였다. MDA-7 단백질 발현은 DOTAP:Chol-mda-7 복합체로 처리한 A549 및 UV223m 종양의 각각 18% 및 13%로 관찰되었고(P=0.001; 도 10C), 이는, 처리하지 않은 동물, PBS로 처리한 동물, DOTAP:Chol LacZ로 처리한 동물 또는 DOTAP:Chol-CAT 복합체로 처리한 동물에서보다 유의적으로 더 높은 수이다. 몇몇 수준의 비-특이적 염색이 DOTAP:Chol-CAT 복합체로 처리한 A549 종양에서 관찰되었다. MDA-7 발현 패턴의 분석에서, 세포외인 것으로 보이는 보다 퍼진 염색 패턴 이외에 집중적 세포내 염색이 밝혀졌다. 이러한 염색 패턴은 사람 종양 이종이식 및 쥐 선천성 종양 둘다에서 관찰되었다.
3. DOTAP:Chol-mda7 복합체로 처리된 폐 종양내 아폽토시스 세포 사멸
DOTAP:Chol-mda-7 복합체로 처리 후 종양 세포의 사멸을 측정하기 위해, nu/nu 마우스 및 C3H 마우스로부터의 피하 종양(A549, UV2237m)을 상기 기재된 바와 같이 아폽토시스 세포 사멸에 대해 분석하였다[참조: Saeki et al., 2002]. 아폽토시스 세포 사멸을 나타내는 유의적(P=0.001) 수준의 TUNEL 포지티브 세포(13% A549 및 9% UV2237m)가 처리하지 않은 대조군 동물, PBS로 처리한 대조군 동물, DOTAP:Chol-CAT로 처리한 대조군 또는 DOTAP:Chol-LacZ로 처리한 대조군 동물로부터의 종양과 비교하여 DOTAP:Chol-mda-7로 처리한 종양에서 관찰되었다(도 11).
4. DOTAP:Chol-mda-7 복합체로 처리된 폐 종양내 감소된 CD31-포지티브 염색
종양 혈관신생에 미치는 mda-7 처리의 효과를 평가하기 위해, 종양 조직을 상기 기재된 바와 같이 CD31 염색하였다[참조: Saeki et al., 2002; Ramesh et al., 2003]. CD31-포지티브 염색 수준은 처리하지 않은 마우스, PBS-처리한 마우스, DOTAP:Chol-LacZ 복합체 처리한 마우스 및 DOTAP:Chol-CAT 처리한 마우스로부터 수득한 종양 조직과 비교하여 DOTAP:Chol-mda7 처리된 A549(10%) 및 UV2237m(5.8%) 종양 조직에서 유의적으로(P=0.01) 감소하였다(도 12). 감소된 CD31 염색은 감소된 혈관신생을 나타낸다.
5. MDA-7은 실험적 폐 전이를 억제한다.
다음으로, DOTAP:Chol-mda-7 복합체의 활성을 사람 A549 폐암 세포 또는 마우스 UV227m 세포를 사용한 실험적 폐 전이 모델에서 조사하였다. 종양 세포의 정맥내 전달은 폐의 급속한 종양 육종을 야기하고, 동물은 30일 후 폐 종양 압도로 쓰러진다. A549 및 UV2237m 폐 종양을 함유하는 누드 또는 C3H 마우스의 DOTAP:Chol-mda-7 복합체로의 전신적 처리는 PBS 또는 DOTAP:Chol-C4T 복합체로 처리한 것보다 유의적으로(P<0.05) 더 낮은 수의 폐 전이를 야기하였다(도 13). UV2237m 마우스에서, DOTAP :Chol-CAT 복합체로의 처리는 PBS로 처리한 것과 비교시 종양 결절의 수에서 유의적 감소를 야기하였고, 이는, 몇몇 비-특이적 항종양 활성을 제시하는 것이다(도 13). 추가로, 상기 처리는 질병율 및 사망율의 결여로 증명되는 바와 같이 어떠한 관찰된 치료 관련 독성 없이 우수하게 허용되었다.
실시예 6
Ad-mda7은 난소암 세포의 화학민감성을 유도한다.
6-웰 배양 플레이트에 육종된 MDAH 2774 난소암 세포(5 x lO5/웰)를 탁솔(0.5nM), Ad-luc(500vp/세포), Ad-luc와 탁솔 또는 Ad-mda7과 탁솔로 처리하였다. 세포를 처리 72시간 후 수거하고, 트리판 블루 배제 분석에 의해 세포 생존력에 대해 분석하였다. 처리되지 않은 세포를 대조군으로서 제공하였다. Ad-luc와 탁솔 또는 Ad-mda7과 탁솔로 처리된 세포는 다른 처리 그룹과 비교하여 증식 억제를 나타냈다(도 14). 그러나, 상승적 효과에 부가한 유의적 성장 억제가 Ad-mda7과 탁솔로 처리한 세포에서만 관찰되었다(P≤0.05)(도 14). 실험들은 3중 웰에서 수행되고, 결과는 2개의 개별적 실험의 평균으로서 나타내었다.
실시예 7
mda-7 유전자 전달은 화학요법, 생물학적 요법 및 방사선요법에 대해 유방 암종을 감작시킨다: blc-2 부류 구성원 발현과의 상관관계
A. 물질 및 방법
1. 세포 및 시약
모든 세포주를 아메리칸 타입 걸쳐 컬렉션(ATCC, Rockville, MD)으로부터 입수하였다. 평가된 유방암 세포주는 T47D, MCF-7, MDA-MB-453, SKBr3, MDA-MB-231, MDA-MB-468, MDA-MB-361, HBL-100 및 BT-20이었다. 1차 사람 포유동물 상피세포(HMEC), 사람 혈관 내피세포(HUVEC) 및 MJ-90 사람 섬유아세포를 Clonetics사(San Diego, CA)로부터 입수하였다. 세포를 DMEM 배지(GIBCO, Grand Island, NY) 및 소태아 혈청(각각의 세포주에 따라 5-10%) 중에 증식시키고, 통상적으로 마이코플라즈마에 대해 시험하였다. 헤르셉틴(Genentech, San Francisco, CA), 탁소테레(Aventis-RPR, Collegeville, PA), 타목시펜(Sigma-Aldrich, St Louis, MO) 및 아드리아마이신(Adria Labs, Columbus OH)은 MD Anderson Cancer Center pharmacy사로부터 입수하였다.
2. 재조합 아데노바이러스
mda-7 유전자(Ad-mda7), 루시퍼라제 리포터 유전자(Ad-luc) 및 공벡터(Ad-CMVp(A))를 함유하는 복제-결핍 사람 타입 5 아데노바이러스(Ad5)의 생성은 이전에 보고되어 있다[참조: Mhashilkar, 2001]. Ad-mda7의 작제는 mda-7 cDNA를 CMV-IE 프로모터에 이어 SV40 폴리아데닐화[[p](A)] 서열과 연결하는 것을 포함한다; 이러한 발현 카셋트를 Ad5의 E1 영역에 위치시켰다. PCRTM, 제한 엔도뉴클레아제 분해 및 DNA 서열화 분석을 사용하여 바이러스 모액을 입증하였다.
웨스턴 블롯 분석: 세포 용해물에 대해 10% SDS 폴리아크릴 아미드 겔 전기영동을 수행하고, 서양고추냉이 퍼옥시다제(Pierce, Inc.)에 대한 초-시그날 기질을 사용한 웨스턴 블롯으로 분석하였다. MDA-7에 대한 폴리클로날 및 모노클로날 항체를 Introgen Therapeutics사에 의해 제조하였다. 본 연구에 사용된 기타 모노클로날 항체는 PKR, p53, BCL-2, BCL-XL, BAX, α-투불린 및 β-액틴(Santa Cruz Biotechnology)이었다. 2차 항체는 Santa-Cruz Biotechnology사(Santa Cruz, CA) 및 Amersham Biosciences사(Piscataway, NJ)로부터 구입하였다.
3. 형질도입 및 약물 치료
세포를, 제시된 약제(타목시펜 1-10μg/mL; 타목테레 1-10ng/mL; 아드리아마이신 1-10ng/mL 및 헤르셉틴 1μg/mL)의 존재 또는 부재하에 감염다중도(MOI)를 증가시키면서 Ad-mda7, Ad-공 또는 Ad-luc로 형질도입하였다. 세포를 3H-티미딘 혼입 분석을 위한 96-웰 형식으로 500-2000세포/웰로 또는 단백질 발현, 트리판 블루 생존력 또는 아폽토시스 분석을 위한 6-웰 플레이트 형식으로 105-106개 세포/웰로 도말하였다. 약물 배합 연구에서, 약물을 벡터 첨가 직전 1회 첨가하고, 세포를 제제에 연속적으로 노출시켰다.
4. 세포 증식 분석
세포의 성장 억제는 활성으로 복제하는 세포의 DNA내로의 3H-티미딘 혼입에 의해 측정되었다. 3H-티미딘을 세포에 첨가하고(1μCi/mL), 수혜자 세포로부터 상청액을 제거함으로써 15시간 후에 반응을 정지시켰다. 세포를 트립신/EDTA(GIBCO)를 사용하여 수거하고, Packard Filtermate 세포 수거기를 사용하여 수집하며, 제조사의 프로토콜에 따라 탈이온수 및 메탄올로 세정하였다. 필터를 건조시키고, Matrix 9600(Packard)을 사용하여 분석하였다.
5. 아폽토시스 및 세포 생존력 분석
아폽토시스를 TUNEL 및 아넥신 V 분석에 의해 측정하였다. TUNEL 분석을 위해, 종양 절편을 제조사의 프로토콜에 따라 발색성 TUNEL-POD(Roche Diagnostics, Indianapolis, IN) 분석을 사용하여 아폽토시스에 대해 분석하였고[참조: Saeki et al., 2000], TUNEL 포지티브 세포는 암갈색 염색으로 동정하였다. 아넥신 V 분석은 ApoAlert 아넥신 V-FITC 키트(CLONTECH, Palo Alto, CA)를 사용하여 수행하였다[참조: Saeki et al., 2000]. 세포 생존력을 트리판-블루 배제 분석에 의해 측정하였다.
프로피디움 요오드화물(PI) 염색을 사용한 세포 주기 분석: 세포 주기 진행을 세포의 DNA의 PI 염색에 의해 측정하였다. 세포를 1 내지 2 x lO6세포/mL의 PBS의 단일 세포 현탁액으로서 제조하고, 냉 70% 에탄올로 2시간 동안 고정시킨 후, 원심분리하였다. 고정액을 경사배출시키고, 세포를 PBS 중에 세척하며, 프로피디움 요오드화물(PI, 50μg/mL) 및 RNAse(PBS 중의 20μg/mL)로 염색하였다. 처리된 세포를 FACS 분석에 의해 평가하였다.
클론형성 생존 분석: 클론형성 생존 분석은 Ad-mda7 및 Ad-CMVp(A)(MOI 2000 바이러스 입자/세포)를 XRT(0, 2 또는 4 Gy)와 배합하여 사용하여 수행하였다. MDA-MB-468 유방암 세포를 공 아데노바이러스 벡터(Ad-CMVp(A)) 또는 Ad-mda7과 함께 1 x 1O5개 세포로 2일 동안 배양한 후, 방사선 요법(XRT)으로 처리하였다. 세포를 2.5 x 1O5개 세포의 농도로 다시 육종하였다. 클론형성 생존을 3주 후에 평가하였다; 콜로니를 고정시키고, Giemsa로 염색하여 계수하였다[참조: Nishikawa et al., 2004].
6. 동물 연구 및 면역조직화학적 분석
Balb C nu/nu 마우스를 Charles River Laboratories사(Wilmington, MA)로부터 입수하였다. 6주령의 암컷 마우스에게 유방암 세포를 우측 뒷다리내로 주사하고, 종양 성장을 관찰하였다. 모든 실험에서, 100㎕ 멸균 인산염 완충화된 염수(PBS) 중에 현탁된 종양 세포(MDA-MB-361; MCF-7 또는 MDA-MB-468)를 우측 등 옆구리내로 주사하고, 대략 100mm3까지 성장시켰다. 이어서, 동물을 무작위로 그룹짓고(n=5-10동물/그룹), 처리를 다음과 같이 개시하였다: 그룹 1에는 PBS를 제공하고, 그룹 2에는 Ad-luc를 제공하며, 그룹 3에는 Ad-mda7을 제공하였다. 투약 일정은 상이한 모델에 대해 달라졌다: MB-361 이종이식 모델에서, 종양이 130mm3에 이르렀을 때, 10마리의 동물/그룹에게 PBS, Ad-luc 또는 Ad-mda7을 1 x 1010vp 용량으로 총 3회 투약을 위해 격일로 주사하였다. MDA-MB-468 모델에서, 130mm3의 종양을 갖는 5마리의 동물 각각에게 PBS, Ad-luc 또는 Ad-mda7을 2 x 1010vp의 용량으로 총 3회 주사를 위해 격일로 주사하였다. MCF-7 이종이식 모델에서, 10마리의 동물/그룹에게, 종양이 85mm3에 이르렀을 때 PBS, Ad-luc 또는 Ad-mda7을 1 x 1010, 3 x 1010 또는 1 x 1011vp로 6회 주사를 위해 격일로 주사하였다.
방사선요법 병용을 평가하기 위해, 마우스를 6개 처리 그룹으로 나누었다(n=5/그룹): 인산염 완충화된 염수(PBS), Ad-luc, Ad-luc + XRT, XRT 단독, Ad-mda7, Ad-mda7 + XRT. 2 x 1010vp/ml의 용량의 PBS 또는 아데노바이러스 벡터를 1, 3 및 5일째에 직접 주사하여 종양을 처리하였다. 6일째에, 뒷다리에 방사선(5 Gy)을 단일 적용하여 동물을 처리하였다. 종양을 격일로 측정하고, 용적을 계산하였다. 선택된 마우스로부터 종양을 수거하고, 동물을 희생시킨 직후 파라핀에 봉입하였다. 종양 샘플을 BCIP/NBT 기질 키트(Vector Laboratories, Burlingame, CA)를 사용한 면역조직화학에 의해 MDA-7 및 PKR 발현에 대해 분석하였다. 종양내 주사는 제도적 지침에 따라 메톡시플루란(Schering Plough, Kenilworth, NJ)을 사용하여 마취하에 수행하였다. 종양 측정을 처리 그룹의 지식 없이 격일로 기록하고, 용적을 수학식 V(mm3) = a x b2/2(이때, "a"는 가장 큰 용적이고, "b"는 수직 직경(15,23)이다)를 사용하여 계산하였다. 종양 크기가 1.5cm에 이르렀을 때 마우스를 안락사시켰다.
7. 통계적 분석
종양 측정치에 대한 실험적 결과의 통계적 유의성은 스튜던츠 t-시험을 사용하여 계산하였다. ANOVA 및 양방적 스튜던츠 t 시험은 각각 다수 그룹의 통계적 분석 및 그룹간 비교를 위해 사용하였고, P<0.05는 유의적인 것으로 간주되었다.
B. 결과
1. MDA-7은 Ad-mda7로 처리 후 유방암 세포에서 과발현된다.
9개의 유방암 세포주의 패널을 사용하였다; 모체 종양 유형 및 p53 돌연변이 상태는 도 15에 요약되어 있다. 2개의 대표적 유방 암종주: MDA-MB-453(돌연변이 p53) 및 MCF-7(야생형 p53)의 웨스턴 블롯 분석에서, MDA-7 단백질이 p53 상태와는 상관없이 Ad-mda7 형질도입 후 현저하게 과발현되는 것으로 보이고(도 16A); MDA-7 단백질은 Ad-luc 또는 PBS 처리된 세포의 용해물에서 명백하지는 않았다. β-액틴을 내부 대조군으로서 사용하여 동일한 단백질의 부하를 확인하였다. MDA-7의 전위적 발현은 높은 수준의 ds RNA 활성화된 ser/thr 키나제 PKR을 유도하였지만, Ad-luc로 형질도입된 세포는 유도하지 않은 결과가 보여진다. 추가의 유방암 세포(T47D; MB-231; MB-361; MB-468; SKBr3; BT-20; HBL-100)로부터의 용해물의 웨스턴 블롯 분석에서, 또한 Ad-mda7 처리된 세포에서 MDA-7의 높은 발현이 나타났다.
2. Ad-mda7은 시험관내 유방암 세포에서 세포 사멸을 유도한다.
유방암 세포주: MCF-7, T47D, SKBr3, HBL-100, BT-20, MDA-MB-231, MDA-MB-468, MDA-MB-453 및 MDA-MB-361, 및 3개의 정상 세포형: HMEC(포유동물 상피); MJ90(섬유아세포) 및 HUVEC(내피세포)를 Ad-mda7 또는 대조군 벡터 - Ad-루시퍼라제(Ad-luc) 또는 Ad-CMVp(A)(Ad-공)의 용량을 증가시키면서 처리하고, 성장 억제에 대해 평가하였다. 50%까지 성장 억제하는데 필요한 벡터 농도(IC50)를 각각의 세포주에 대하여 계산하였고, 도 15에 나열한다. Ad-mda7에 의한 성장 억제의 IC50 값을 대조군 벡터에서 수득한 IC50 값으로 나누어, 선택 지수(S.I.)를 산출하였다. SI는 대조군 Ad 벡터와 비교한 Ad-mda7에 의한 세포 성장 억제에 대한 상대 능력을 나타낸다. 정상 세포의 모든 SI 값이 1에 상응하는 반면; 유방 종양 세포의 SI 값은, Ad-mda7이 대조군보다 >2 내지 >30-배(평균 >8) 더 세포독성임을 나타낸다(도 15). S.I. 값은 넓은 범위에 걸쳐있지만, 이들은, mda-7 활성은 형질전환된 세포에 대하여 선택적이고, MDA-7 단백질의 발현은 정상 세포에서 독성을 유도하지 않음을 증명하는 것이다. Ad-mda7의 종양 세포 선택적 효과의 또다른 예는 3H-티미딘 혼입 분석으로부터 얻어진다(도 16A); 이러한 결과는 Ad-mda7로 형질도입된 T47D, BT-20, MDA-MB-361 및 MCF-7 유방암 세포에서 유의적인 용량-의존적 성장 억제를 나타낸다(pO.OOl). MDA-7 발현은 96%까지 세포 증식을 억제하면서, Ad-luc-형질도입된 세포의 증식은 최소로 변화시켰다. 이러한 결과는, Ad-mda7이 세포 주기 정지를 유도할 수 있음을 제시하는 것이고, 따라서 처리되지 않았거나, 본 발명자들은 Ad-luc 및 Ad-mda7 형질도입된 MDA-MB-453 및 MCF-7 세포의 세포 주기 분석(PI 염색)을 수행하였다. 도 16C에 제시된 바와 같이, Ad-mda7로 형질도입된 세포는 처리되지 않았거나 Ad-luc 처리된 세포와 비교하여 G2/M 세포의 분획물에서 2-3배 증가한 세포 주기 차단을 겪었다.
세포 사멸의 동역학 및 용량-반응을 평가하였고, 대표적인 데이터를 MDA-MB-453 세포에 대하여 제시하고 있다(도 16D): 낮은 Ad-mda7 용량(1000vp/세포: 50pfu/세포)에서, 유의적인 세포 사멸(p<0.001)가 처리 후 2일째에 관찰되었고; 보다 더 높은 용량에서, 유의적인 사멸이 1일째에 관찰되었으며, 시간에 따라 증가하였다. 요약하자면, MDA-7 발현은 시간- 및 용량-의존적 방식 모두로 유방 종양 세포를 사멸시키지만, Ad-luc는 오직 최소 효과를 나타낸다(도 16D). 대조적으로, 상응하는 정상 세포인 사람 포유동물 상피세포(HMEC)는 더 긴 시간 지점에서조차 Ad-luc 및 Ad-mda7로부터 어떠한 유의적인 독성도 나타내지 않는다(도 16E). 정상 섬유아세포 및 1차 내피세포를 사용한 추가의 연구로, 정상 세포에 대한 세포독성이 없음을 확인하였다(도 15).
3. Ad-mda7에 의한 아폽토시스 유도
종양 세포에서 MDA-7의 발현은 세포 성장 억제와 관련한 것 이외의 시그날에 영향을 미칠 수 있고, 다양한 암 세포형에서 아폽토시스 경로를 활성화시키는 것으로 보고되어 있다[참조: Mhashilkar et al., 2001; Su et al., 1998; Saeki et al., 2000; Chada et al., 2004]. 이러한 발견과 일치하게, Ad-mda7로의 형질도입은 T47D, MCF-7, MDA-MB-453 및 MDA-MB-468 세포주에서 아폽토시스를 유발하는 것으로 관찰되었다(각각, 41, 52, 43 및 32%)(도 17A). 대조적으로, 이러한 세포주들을 대조군 Ad-luc 또는 Ad-공으로 형질도입한 경우, 아폽토시스를 겪는 세포의 수는 비히클 처리된 세포에서 관찰된 것과 유사하였다. 이러한 세포주의 추가의 분석에서, Ad-mda7이 용량-의존적으로 아폽토시스를 유도하고, T47D 유방암 세포에서 BAX를 상향조절함이 확인되었다(도 17B). pan-카스파제 억제제 ZVAD를 사용한 처리가 40%까지 아폽토시스를 감소시켰지만: BAX의 MDA-7 유도는 감소되지 않았다. Ad-luc를 사용한 처리는 BAX 또는 아폽토시스를 활성화하지 않았다(도 17B). 이어서, 아폽토시스 유도의 기작을 평가하였다. Ad-mda7은 미토콘드리아 매개된 아폽토시스 유도와 일치하게 카스파제 3 및 PARP의 절단을 유도하였다(도 17C).
4. mda-7의 발현은 생체내 종양 성장을 감소시킨다.
Ad-mda7에 의해 유도된 유방암 세포의 시험관내 증식 억제가 생체내 종양 성장에도 유사한 효과로 해독되는지 여부를 측정하기 위해, 누드 마우스 모델에서 MDA-MB-361, MDA-MB-468 및 MCF-7 세포를 사용하여 생성된 이종이식 종양을 평가하였다. 종양이 대략 100mm3에 이르렀을 때, 동물들을 처리 그룹(n=5-10마리 동물/그룹)으로 나누고, PBS, Ad-luc 또는 Ad-mda7로 처리하였다. 도 18A-D에 제시된 바와 같이, Ad-mda7을 종양에 직접 주사한 것은 모든 3개의 이종이식 모델상에 10일째에 명백하게 종양 용적의 유의적 감소를 유도하였다(p=0.002-0.004). 20일째에, Ad-luc 또는 PBS로 처리한 대조군 종양은 800mm3 이상의 최대 용적에 이르면서 4- 내지 8배 용적 증가를 겪었다. 대조적으로, Ad-mda7 처리한 종양은 적은 종양 성장(MDA-MB-361 및 MDA-MB-468)을 나타내거나, 이들 처음 용적의 대략 3배로 성장하였다(MCF-7). Ad-luc는, MB-361 모델에서 최대 효과를 가지면서 종양 성장에 다양한 효과를 유도하였지만; Ad-mda7은 훨씬 더 강하고 안정한 성장 억제를 일관되게 유도하였고, 모든 3개의 모델에서 장기의 종양 성장 조절을 야기하였다. 유의적인 성장 억제는 p53에 대한 돌연변이 종양 세포 및 야생형 종양 세포 둘다에서 명백했다(도 19 참조). 용량의 단계적증가 연구를 p53 야생형 MCF-7 종양에서 수행하였고, 이때, 낮은 용량은 종양 성장을 차단하는데 효과가 없었던 반면, 3배 더 많은 용량은 다소 종양 성장 억제를 야기하였으며(p=0.08), 로그 더 많은 용량은 이러한 침윤성 종양의 강한 종양 성장 억제를 발생시킨 것으로(p=0.002) 발견되었다(도 19 및 도 18A-D). 종양 성장율은, 이들 종양이 2배 크기가 되는데 필요한 시간에 반영되는 바와 같이, Ad-mda7 처리에 의해 유의적으로 감소하였다(도 18C 참조). 이러한 결과는, MDA-7의 발현이 p53 야생형 및 p53 돌연변이 유방암 세포 둘다에서 시험관내 및 생체내 모두에서 항-증식성 활성을 가짐을 나타낸다. MDA-MB-468 이종이식을 또한 MDA-7 발현 및 아폽토시스 유도에 대해 분석하였다. 강한 MDA-7 면역염색은 Ad-mda7 처리된 종양에서 관찰되지만, PBS 또는 Ad-luc 처리된 종양에서는 관찰되지 않았다(도 18D). TUNEL 분석에서, MDA-7 단백질 발현이 아폽토시스와 관련있는 것으로 나타났다. MDA-7을 발현하는 종양은 시험관내에서 관찰된 것과 유사하게(도 16A), PKR 단백질의 높은 발현을 나타내었다(도 18D).
5. Ad-mda7 형질도입과 타목시펜, 탁소테레 또는 아드리아마이신 처리의 병용은 유방 종양 세포 사멸에 부가적 효과를 갖는다.
상기 제시된 바와 같이, Ad-mda7을 사용한 단일 제제 요법은 유방암 세포에 대한 가망있는 항종양 활성을 나타낸다. 그러나, 유방암에 대한 최근 치료는 세포독성 화학요법, 방사선요법, 호르몬요법 및 새로운 생물학적 요법, 예를 들어 헤르셉틴과 배합한 다중-양식 치료 접근을 사용한다[참조: Winer et al., 2000; Fisher et al., 1997; Amat et al., 2003; Bonnadona, 1989; Tantivejkul et al., 2003; Pegram et al., 2004]. Ad-mda7과 화학요법제와의 배합이 세포독성을 증강시킬 수 있는지 여부를 조사하기 위해, 유방암 세포주를 Ad-mda7 + 일련의 화학요법제로 처리하고, 세포 증식 및 세포 생존력 분석을 사용하여 분석하였다. 이들 세포를 먼저 표적 조직에서 수용체의 결합 부위에 대해 에스트로겐과 경쟁함으로써 작용하는 비스테로이드성 제제인, 에스트로겐 길항제 타목시펜으로 처리하였다[참조: Winer et al., 2000; Fisher et al., 1997]. 배합 약제 상호작용의 평가를 용이하게 하기 위해, 각각의 제제의 치료학적 용량 이하를 사용하였다.
Ad-mda7과 타목시펜 사이의 용량 반응(도 20A)을 먼저 확립하였다. 저용량 Ad-공(0-1000vp/세포) 또는 타목시펜(2μg/ml 이하)은 T47D 세포에서 20% 미만까지 세포 증식을 감소시켰다. Ad-mda7의 상당히 낮은 용량의 부가(100vp/세포)는 세포 성장에 영향을 미치지 못한 반면, 500vp/세포 및 1000vp/세포의 Ad-mda7은 타목시펜과 배합한 경우 용량-의존적 성장 억제를 야기하였다(각각, 60% 및 80% 억제). 도 2OB(상부 패널)에 제시된 바와 같이, MCF-7 세포는 타목시펜(1μg/mL) 및 Ad-mda7(1000vp/세포에서) 단독보다 적은 반응(<15%)을 나타냈지만, 상기 제제 둘다를 배합하여 처리한 경우 상승적 효과를 가졌고, 60% 이상까지 세포 증식을 감소시켰다(p<0.001). 추가의 연구를 수행하여 p53 돌연변이 T47D 세포를 평가하였다: 이 경우, 단일 제제로서 Ad-mda7을 사용한 처리는 성장을 유의적으로 감소시켰다. 그러나, p53 wt MCF-7 세포의 경우에서와 같이, 2개의 배합된 요법의 효과는 상승적이었고, 티미딘 수를 80%까지 감소시켰다(p<0.01). 종양 세포의 Ad-luc 또는 Ad-공으로의 형질도입은 성장을 ≤15%까지 감소시켰다. 유사한 상승적 상호작용은 또한 MDA-MB-361 세포에서도 관찰되었다.
Ad-mda7이 탁산계에 속하는 제제의 효과를 증강시킬 수 있는지 여부를 조사하기 위해, 유방암 세포를 탁소테레(도세탁셀, 0.5-2ng/mL)로 처리하였다. 탁소테레는 미세소관 조직을 붕괴시키고, 세포가 유사분열 및 휴지기를 완료하지 못하도록 예방하는 항신생물제이다[참조: Winer et al., 2000; Fisher et al., 1997; Amat et al., 2003]. 세포 성장 분석은 탁소테레를 투약한 T47D 및 MCF-7에 대해 수행하였고, 이는, 대략 티미딘 혼입의 40% 억제를 야기하였다(도 21A-B). 세포들은 Ad-mda7에 대해 민감하였지만, Ad-luc에 대해서는 민감하지 않았다; Ad-mda7을 탁소테레와 배합한 경우, 증강된 민감성이 세포주 둘다에서 관찰되었다. 동일한 결과가 MDA-MB-361 세포에서 관찰되었다. 이어서, 뉴클레오타이드 염기 삽입 및 세포막 지질 결합 활성화에 의해 그 효과가 매개되는 것으로 여겨지는 세포독성 안트라사이클린 항생제인 아드리아마이신(독소루비신)을 시험하였다[참조: Winer et al., 2000; Tantivejkul et al., 2003]. DNA-절단가능한 복합체를 형성하는 이러한 제제와 복구 효소 토포이소머라제 II와의 직접 상호작용은 이러한 약제의 세포독성에 일정 역할을 하는 것으로 여겨진다. 단일 제제로서 사용된 Ad-mda7(200-2500vp/세포) 또는 아드리아마이신(1ng/mL)을 사용한 T47D 또는 MCF-7 세포의 처리는 세포 증식을 감소시켰고; Ad-mda7과 아드리아마이신의 배합 처리는 초-부가적인(상승적) 효과를 증명하였다(도 22A-B). 상승적 효과는 낮은 약물 농도에서도 명확했다. T47D 세포에서, 200vp/세포 Ad-mda7 또는 1ng/ml 아드리아마이신은 세포 성장에서 더 적은(17-23%) 감소를 야기하였지만, 상기 두 약제의 배합은 유의적으로 더 많은(>60%) 성장 억제를 야기하였다(p<0.01).
이어서, 탁소테레, 아드리아마이신, 타목시펜 및 헤르셉틴와 배합하여 Ad-mda7로 처리한 유방암 세포에서의 아폽토시스 신호전달(p53; BCL-XL; BCL-2 및 BAX)을 평가하였다(도 15C 및 도 16). 유방 종양 세포의 단일 제제 Ad-mda7 처리는 p53 또는 BCL-XL의 정상 상태 수준을 실질적으로 변화시키지 못했지만, T47D 세포에서 관찰된 효과와 유사하게 BCL-2의 발현을 감소시켰고, BAX를 상향조절하였다(도 22C). 탁소테레, 아드리아마이신 또는 헤르셉틴으로 처리한 세포에서, p53 및 BCL-XL에서의 어떠한 유의적 변화도 Ad-mda7 처리 후 주지되지 않았다(도 23). BCL-2 및 BCL-XL의 정상 상태 수준은 상기 화학요법 둘다로 처리한 세포에서 감소되었다. Ad-mda7은 탁소테레 또는 아드리아마이신으로 처리한 세포에서 BAX의 상향 조절을 유도하였지만, MDA-7 발현은 헤르셉틴과 배합된 경우 BCL-2에서 감소를 야기하였다(도 22C). p53 및 BCL-2 부류 구성원에서의 분자 변화를 도 23에 요약하고 있다. 이들 아폽토시스 매개자는 사용된 약제 및 벡터를 근거로 상이한 조절을 증명한다. Ad-mda7은 단일요법으로서 또는 화학요법과의 병용하여 전달되는 경우 유방암 세포에서 BAX를 일관되게 상향 조절하였다.
헤르셉틴은 사람 상피 성장 인자 수용체-2(HER-2)에 대한 길항제로서 개발된 사람화된 항체이다[참조: Pegram et al., 2004]. 이러한 연구에서, Ad-mda7의 발현에 의해 증강된 MDA-MB-453(HER2를 과발현시킴) 및 MCF-7(HER2 네거티브) 세포에 미치는 헤르셉틴의 세포독성을 평가하는 연구를 수행하였다(도 22D). 실제로, 세포를 헤르셉틴과 배합하여 Ad-mda7로 형질도입한 경우, 처리하지 않은 대조군과 비교하여 MDA-MB-453 세포의 세포 사멸에서 5배 초과의 상승적 증가가 관찰되었다(p<0.001). 대조적으로, MCF-7 세포는 Her-2 수용체 발현이 없는 것에서 예측되는 바와 같이 헤르셉틴 내성이었다. Ad-mda7은 MCF-7 세포에서 사멸을 유도하였지만; Ad-mda7/헤르셉틴과의 배합은 증강된 활성을 나타내지는 않았다. 상기와 유사한 조건하에서 단일 제제로서 또는 헤르셉틴과 배합하여 Ad-luc로 처리한 것은 관찰된 세포 사멸 비율을 유의적으로 증가시키지 않았다. 이러한 결과는, Ad-mda7과 화학요법제, 호르몬제 또는 생물학적 제제와의 배합된 사용이 단일요법 처리과 비교하여 종양 세포 사멸에 필요한 치료 농도를 감소시킬 수 있고, 따라서, 관련 독성을 잠재적으로 감소시킬 수 있음을 나타낸다.
6. Ad-mda7과 방사선 요법의 배합은 유방암 세포 클론형성 생존 및 종양 성장에 상승적 효과를 갖는다.
이어서, MDA-MB-468 유방암 세포에 미치는 Ad-mda7과 XRT 병용 요법의 효과를 조사하는 연구를 수행하였다. MDA-MB-468 세포를 (둘다 2000vp/세포의 MOI로) 공 아데노바이러스 벡터(Ad-p(A)) 또는 Ad-mda7로 처리하고 방사선조사하였다. 항-종양 활성을 콜로니 형성 분석을 사용하여 평가하였다. 도 24A에 제시된 바와 같이, XRT 또는 Ad-p(A)와 비교하여 Ad-mda7 + XRT 처리된 세포의 생존에서 유의적 감소가 관찰되었다. MDA-7 매개된 종양 세포 사멸의 증강은 2 및 4 Gy XRT 둘다에서 관찰되었다(도 24A). 이러한 결과는, Ad-mda7과 방사선요법의 배합이 MDA-MB-468 세포에서 시험관내 초-부가적 방식으로 콜로니 형성을 억제함을 나타낸다.
병용된 Ad-mda7 및 XRT 요법의 생체내 효과를 조사하기 위해, 큰(>130mm3) MDA-MB-468 유방암 이종이식 종양을 Ad-mda7, Ad-luc 또는 PBS로 개별적으로 또는 XRT(5 Gy)와 배합하여 처리하였다. 동물들을 처리 그룹으로 나누고(n=5/그룹), PBS, Ad-luc, Ad-luc + XRT, XRT, Ad-mda7 또는 Ad-mda7 + XRT로 처리하였다. 처리 그룹 사이의 종양 크기에서 유의차가 처리 정지 1주 내에 명확했다. XRT 단독, Ad-mda7 단독 및 Ad-luc와 XRT 배합 처리 모두 종양 성장에서 유의적 감소를 야기하였다(p<0.05). 그러나, 가장 현저한 변화는 XRT와 Ad-mda7의 배합을 제공한 동물에서 보여졌다. 도 24B에 제시된 바와 같이, Ad-mda7 처리된 동물에서 종양 진행의 실질적 억제가 관찰되었다. 그러나, Ad-mda7과 XRT를 배합하여 사용한 경우, 종양 성장의 복귀가 관찰되었다(p=0.0017). Ad-mda7/XRT 처리한 동물로부터의 종양은 초기에 대략 50%까지 크기가 증가하였지만, 결과적으로 80% 이하까지 복귀하였다. Ad-mda7/XRT 그룹의 모든 동물이, 종양 측정치가 42mm3의 최저점에 이르면서 복귀를 경험하였다. 대조군 종양은 크기에서 500% 이상 증가한 반면, XRT로 처리한 종양은 >350%까지 증가하였다. Ad-mda7/XRT 그룹에서의 종양은 장기의 안정화를 나타낸 반면, XRT, Ad-luc 또는 Ad-luc/XRT 종양은 점진적으로 더 크게 성장하였다. 종양 크기가 2배가 되는 시간에 대해 평가한 경우, PBS 및 Ad-luc 처리한 동물은 각각 10일 및 11째에 그 크기에 이르렀고; XRT 및 Ad-luc/XRT 그룹 둘다의 동물은 16일이 걸린 반면, Ad-mda7 처리한 종양은 25일이 걸렸다. Ad-mda7/XRT 처리한 동물로부터의 종양은 >30일까지도 크기가 2배가 되지 않았고, 이들이 출발 크기보다 평균 25% 더 작았다. 형질도입 MDA-7 단백질의 상승된 발현은 Ad-mda7 처리한 종양에서만 관찰되었고, PBS- 또는 Ad-luc 처리한 종양에서는 관찰되지 않았다(도 18D).
실시예 8
사람 인터루킨 24(IL-24) 단백질은 IL-20 수용체를 통해 유방암 세포를 사멸시키고, IL-10에 의해 길항된다.
A. 물질 및 방법
1. 세포 배양 및 시약
MDA-MB231 및 MDA-MB453 유방암 세포주를 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(ATCC, Manassas, VA)으로부터 입수하여, 10% 소태아 혈청(Life Technologies, Inc.), 100유닛/ml 페니실린, 100μg/ml 스트렙토마이신, 2mM L-글루타민 및 HEPES 완충액(Life Technologies, Inc., Grand Island, NY)으로 보충된 DMEM(Hyclone, Inc., Logan, Utah) 중에 유지시켰다. 세포를 통상적으로 스크리닝하여 마이코플라즈마 오염이 없음을 확인하였고, 증식의 로그 상에서 사용하였다. 모노클로날 항-IL-24 항체를 상기 기재한 바와 같이 제조하였다[참조: Caudell et al., 2002]. 토끼 포스포-Stat3(Tyr705) 항체를 Cell Signaling Technology Inc.사(Beverly, MA)로부터 구입하고, β-액틴 모노클로날 항체 및 말단 데옥시뉴클레오티딜 트랜스퍼라제-매개된 dUTP-바이오틴 닉-말단 표지화(TUNEL) 키트를 Oncogene Research Products사(San Diego, CA)로부터 구입하였으며, 모든 다른 1차 및 2차 항체는 Santa Cruz Biotechnology사(Santa Cruz, CA)로부터 구입하였다. 세포 생존력을 트리판 블루 배제 분석으로 분석하였다. 세포를 트립신 처리하고, 분취량을 1:1 용적으로 0.4% 트리판 블루로 현탁시켰다. 총 세포 수 및 세포 생존 수를 광학현미경에 의한 적혈구계산기를 사용하여 평가하였다[참조: Chada et al., 2005].
2. 정제 및 사람 IL-24로의 처리
전장 mda-7 cDNA를 CMV 프로모터를 함유하는 pCEP4 FLAG 벡터(Invitrogen, San Diego, CA)내로 클로닝하였다. 플라스미드를 HEK 293 세포내로 형질감염시키고, 안정한 서브-클론을 하이그로마이신(0.4μg/ml)을 사용하여 분리하였다. 293-IL24 세포로부터의 상청액을 농축시키고, 문헌[참조: Caudell et al., 2002]에 기재된 친화 크로마토그래피를 사용하여 정제하였다. 세포를 정제된 0-30ng/ml의 IL-24 단백질로 처리하거나, 트랜스웰 시스템을 사용하여 293-IL24 생산자 세포와 동시 배양하였다[참조: Chada et al., 2005; Chada et al., 2004].
3. 유전자 전달
mda-7 유전자를 함유하는 복제 결핍 사람 타입 5 아데노바이러스(Ad5)는 상기 기재되어 있다[참조: Mhashilkar et al., 2001]. mda-7 유전자는 내부 CMV-IE 프로모터에 이어 SV40 폴리아데닐화 서열과 결합하였다. 루시퍼라제(Ad-luc) 발현을 위한 서열을 함유하는 동일한 아데노바이러스 벡터를 대조군 바이러스로서 사용하였다. 세포를 감염 1일 전 도말하였다. 표적 세포를 625-10,000개 바이러스 입자/세포(33-500pfu/세포)를 사용하여 아데노바이러스 벡터(Ad-mda7 또는 Ad-luc)로 감염시켰다. 실험적 조건을 최적화하여 면역조직화학적 염색의 결과를 근거로 세포의 >70%로 IL-24 단백질 발현이 달성되도록 하였다.
4. 면역블롯팅
다양한 항체 및 표준 순서를 사용한 면역블롯팅을 상기 기재된 바와 같이 수행하였다[참조: Chada et al., 2005]. 시험된 1차 항체는, p-STAT3, 카스파제-3, p-cdc2(tyr-15), p-cdc25(ser-216)(Cell Signaling Technologies, Beverly, MA), 항-p27 토끼 폴리클로날, 항-β-카테닌 모노클로날, 항-p-Akt 항-Akt, β-액틴(Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz CA) 또는 항-IL-24 항체(Introgen Therapeutics, Houston, TX)였다. 단백질을 증강된 화학발광(Amersham Biosciences)을 사용하여 가시화하였다. STAT-3의 활성화를 포스포-STAT3-특이적 항체를 사용한 면역형광 분석에 의해 측정하였다[참조: Chada et al., 2005]. 염색 1-2시간 후 형광 현미경을 사용하여 사진 찍었다.
5. FACS 분석
세포 표면 수용체 아단위 IL-20R1 및 IL-22R1을 유세포분석기에 의해 시험하였다. 간단하게는, 단층 세포를 0.2% EDTA/PBS를 부가하여 검출하고, 빙냉 PBS로 1회 세척한 후, 펠렛화하고 PBS 중의 0.1ml 1% FBS에 현탁시키며, 항-IL-20R1, 항-IL-22R1 또는 정상 IgG 대조군 항체와 실온에서 60분 동안 배양하였다. 세포를 세척하고, PBS 중의 1% FBS에서 FITC-접합된 2차 항체에서 빙상에 30분 동안 배양하였다. 세포를 PBS 중의 0.1% Tween 20으로 3회 세척하고, 펠렛화하며, 500㎕의 1% 파라포름알데하이드로 재현탁시키고, 데이터를 수득하고, 분석하였다. 아폽토시스를 제조사의 프로토콜에 따라 수행된 아넥신 V 분석 또는 FACS 분석을 통해 측정하였다. 세포를 FACScalibur 유세포분석기(BD Biosciences, San Jose CA) 상의 유세포분석에 의해 분석하였다. 10,000개 세포의 샘플 집단을 분석을 위해 사용하였다.
6. 면역형광 분석
챔버 슬라이드에서 성장하는 세포를 다양한 농도(0-20ng/ml)의 사람 IL-24 단백질로 30분 동안 처리하였다. 세포를 에탄올:아세트산(9.5:0.5)으로 고정시킨 후, 포스포-Stat3 1차 항체 및 FITC-표지된 2차 항체로 염색하였다. 슬라이드를 Nikon 형광 현미경을 사용하여 분석하였다.
7. 통계적 분석
실험적 결과의 통계적 유의성을 스튜던츠 t-시험을 사용하여 평가하였다. 유의성은 p<0.05로 제시되었다.
B. 결과
1. Ad-mda7 벡터는 유방암 세포에서 높은 수준의 IL-24 발현 및 세포 사멸을 유도한다.
이 연구를 위해, 2개의 잘 확립된 유방암 세포주 모델인 MDA-MB231 및 MDA-MB453을 평가하였다. 이들 유방암 세포를 다양한 용량(0 내지 10,000개 바이러스 입자/세포; 0-500pfu/세포)으로 Ad-mda7로 형질도입하고, 72시간 후, 상청액 및 세포 용해물을 수거하여 IL-24 단백질 발현에 대해 웨스턴 블롯팅으로 조사하였다. 세포주 둘다 Ad-mda7의 용량과 관련하여 증가한 IL-24의 높은 수준의 발현 및 분비를 보였다. 다중 밴드가 블롯 상에 관찰되었고, 이는, IL-24가 성숙 글리코실화 형태로 프로세싱하는 것을 반영하는 것이다. 처리하지 않은 세포 또는 루시퍼라제 유전자(Ad-luc)를 함유하는 대조군 벡터로 처리한 세포가 어떠한 IL-24 발현도 나타내지 못한 것과 같이, IL-24 발현은 유전자 전달의 직접적 결과이다.
또한, 세포 배양물을 3일 후 트리판 블루 배제 분석에 의해 생존력에 대해 모니터하였다. 루시퍼라제 대조군 벡터로의 형질도입은 처리하지 않은 세포와 비교하여 오직 적은 사멸만을 야기한 반면, Ad-mda7은 용량-의존적 방식으로 유의적으로 더 큰(P<0.001) 사멸을 유도하였다(도 25). 세포 사멸은 Ad-mda7에 의해 매개된 분비된 IL-24의 발현과 강하게 관련있었으며, 각각 MDA-MB231 및 MDA-MB453 세포에 있어서 상관 계수는 0.98 및 0.93이었다(표 5).
Figure 112007065305055-pct00002
이들 데이터는, 관찰된 세포 사멸 효과가 증가하는 수준의 IL-24 단백질 발현의 결과임을 강하게 제시하고 있다.
2. Ad-mda7은 세포 주기 진행을 차단하고, 유방암 세포에서 아폽토시스를 유도한다.
유방암 세포에서 Ad-mda7에 의해 유도된 세포 사멸의 기작을 이해하기 위해서, PI 염색 및 유세포분석기에 의한 세포 주기 분석을 수행하였다. Ad-mda7 형질도입된 세포에서 세포 주기의 분석은 처리하지 않은 대조군 또는 Ad-luc 형질도입된 세포와 비교하여 G2/M 기에서 세포 주기 정지를 나타내면서 G2/M 집단에서 유의적 증가(p<0.05)를 나타낸다(도 26A). 세포 주기 진행을 차단하는 Ad-mda7에 대한 추가의 지지는 세포 주기 단백질의 분석에 의해 수득되었다. Ad-mda7을 사용한 처리는 CDC-25의 증가된 인산화 및 총 p27 수준의 증가를 야기하였다. CDC-25는 Ser216 상의 인산화로 불활성화되는 G2에서 M으로의 세포 주기 진행과 관련된 포스파타제이다. CDC-25의 불활성화는, 세포 주기 진행을 가능하게 하는 하류흐름 표적의 탈인산화를 예방한다. p27은 또다른 결정적인 세포 주기 조절 단백질로, 이의 수준은 정지 세포에서 증가한다. 증가된 세포 주기 차단은 CDC-2의 감소된 인산화와 관련있었다. 처리하지 않은 세포 및 Ad-Luc 대조군 벡터로 형질도입된 세포는 p27 또는 p-CDC-25 또는 p-cdc2 수준에서 어떠한 변화도 보이지 않았다.
계획된 세포 사멸 경로의 활성화에서 Ad-mda7의 역할을 평가하기 위해, 아넥신 V 분석을 수행하여 초기 아폽토시스 발생을 분석하였다. Ad-mda7을 사용한 MDA-MB231 및 MDA-MB453 세포 둘다의 처리는 아넥신 V 포지티브 세포에서 유의적 증가를 야기하였고(p<0.01), 이는, Ad-luc 처리된 대조군과 비교하여 아폽토시스의 더 큰 분획을 나타내는 것이다(도 26B). 웨스턴 분석에서, Ad-mda7 처리 후 유방 종양 세포에서 카스파제-3의 활성화 및 용량-의존적 절단이 증명되었다. PI3K 생존 경로는 유방 종양형성 및 화학내성과 관련있었고; 따라서, PI3K에서 단백질 발현의 조절 및 MDA-MB 453 세포에서 Wnt 생존 신호전달 경로를 조사하였다[참고: Nicholson and Anderson, 2002; Campbell et al., 2004; Simstein et al., 2003]. 웨스턴 블롯 분석에서, MDA-7/IL-24 발현의 증가 수준이 세포 생존 경로와 관련된 단백질의 억제와 관련있음을 나타내었다. IL-24 수준이 세포내에서 증가함에 따라, Akt, p-Akt 및 β-카테닌에서의 수반된 감소가 관찰되었다.
3. 외인성 IL-24 단백질은 STAT3을 활성화시키고, 유방암 세포를 사멸시킨다.
IL-24 단백질은 Ad-mda7 형질도입된 세포의 상청액 및 세포내 구획물 모두에 존재하므로, 유방암 세포의 성장 억제에서 세포내 대 세포외 IL-24의 기능을 조사하였다. IL-24가 리간드-수용체 맞물림을 통해 흑색종 세포를 효과적으로 사멸시키는 것으로 보고되어 있으므로[참조: Chada et al., 2004], MeWo 흑색종 세포를 포지티브 대조군 세포주로서 제공한다. 증가시킨 농도의 항-MDA7 중화 항체를 Ad-mda7 형질도입된 세포의 배양물에 첨가하였다. 유방 및 흑색종 세포주에서, IL-24의 중화는 비특이적 IgG 항체의 첨가와 비교하여 세포 사멸을 유의적으로 감소시켰고(p<0.01)(도 27), 이는, 상기 효과가 IL-24 특이적임을 나타내는 것이다. 항-IL-24가 세포 사멸을 완전하게 없앨 수 없었음을 주지해야 하고, 이는, Ad-mda7이 세포내 및 세포외 기작 모두에 의해 유방암 세포를 사멸시킴을 제시하는 것이다.
MDA-7/IL-24를 포함한 모든 IL-10 사이토킨 부류 구성원은 수용체-포지티브 세포주에서 STAT3의 활성화를 유도하는 것으로 나타났다[참조: Pestka et al., 2004]. 따라서, IL-24 수용체 맞물림은, 유방암 세포에서 STAT3 인산화 및 핵으로의 전좌를 시험함으로써 평가하였다. IL-24에 대한 수용체는 타입 1 IL-20R(IL-20R1/IL-20R2) 및 타입 2 IL-20R(IL-22R1/IL-20R2)로 명칭된 이종이량체 사이토킨 수용체이다. 포스포-STAT3에 대해 지시된 항체를 사용한 면역형광 현미경에서, IL-24 및 IL-10 둘다 유방암 세포주 모두에서 STAT3을 활성화할 수 있었던 것으로 나타난다.
4. IL-24는 아폽토시스를 유도하기 위해 IL-20 수용체와의 결합을 필요로 한다.
IL-24 및 IL-10 둘다 관련된 수용체와 결합하여 STAT3을 활성화하고, 또한 IL-24는 세포를 사멸시키는 능력을 가지므로, 어떠한 수용체가 IL-24에 의해 세포 사멸을 매개하는지 동정하는 연구를 수행하였다. MDA-MB453 및 MDA-MB231 세포를 IL-24, IL-20R1 또는 IL-22R1에 대한 중화 항체로 처리한 후, IL-24에 노출시키고, 트리판 블루 염색을 사용하여 세포 사멸에 대해 모니터하였다. 항-IL-24는 IL-24 매개된 세포 사멸을 ≥80%까지 유의적으로 억제할 수 있었다(p<0.01). 항-IL-22R1이 적당한 감소를 나타낸 반면(MB231에서 16% 및 MB453에서 22%), 항-IL-20R1은 세포주 둘다에서 ≥60%까지 사멸을 유의적으로 감소시켰다(p<0.01)(도 28A). 2개의 수용체 중화 항체 모두를 배합하는 경우, 대조군과 유사한 수준으로 사멸을 유의적으로 더 감소시켰다.
IL-20R1 및 IL-22R1 수용체에 대한 특이적 항체 및 FACS 분석을 사용하여 IL-20R1 및 IL-22R1의 세포 표면 발현을 조사하는 연구를 수행하였다. 그 결과는, IL-20R1 염색이 IL-22R1 염색보다 거의 4배 더 높은 것으로 나타났고, 이는, IL-20R1이 세포 표면상에 더 많이 풍부하거나, 항-IL-22R1 항체가 항-IL-20R1보다 더 낮은 결합 친화성을 가짐을 제시하는 것이다(표 6).
Figure 112007065305055-pct00003
포지티브 대조군 MeWo 흑색종 세포주는 높은 수준의 세포 표면 IL-20R1 및 IL-22R1 수용체 아단위 둘다를 발현하지만, 이들 수용체 수준은 A549 세포(폐암 세포) 상에서 상당히 낮았다.
5. 기타 IL-10 부류 구성원을 제외한 IL-24는 유방암 세포에서 용량-의존적 아폽토시스를 유도한다.
IL-24 단백질에 의해 매개된 세포 사멸 기작을 평가하기 위해, 아넥신 V 분석을 사용하여 IL-24 단백질에 노출 후 유방 종양 세포에서의 아폽토시스를 평가하였다. 나란한 배양 상청액을 웨스턴 블롯팅에 의해 안정 상태의 IL-24 단백질 수준에 대해 분석하였다. IL-24 단백질을 사용한 유방 종양 세포주의 처리는 IL-24의 용량과 직접적으로 관련있는 아폽토시스의 수준을 증가시키면서 유의적 세포 사멸 유도를 야기하였다(도 28B). 이러한 결과는 다른 IL-10 부류의 사이토킨에서는 관찰되지 않았다. IL-10, IL-19, IL-20 및 IL-22를 유방 종양 세포에 대한 세포독성에 대해 평가하였지만, 이들 중 어떠한 것도 기준 수준 이상의 세포 사멸을 유도하지는 않았다(도 29A). 유방암 세포에서, 비록 IL-10 및 모든 다른 부류 구성원은 STAT3을 활성화시킬 수 있지만, IL-24가 세포독성 특성을 지시하는 유일한 부류 구성원이다.
6. IL-10은 IL-24 단백질에 의해 매개된 사멸을 길항한다.
이전 연구로 IL-10이 PBMC에서 IL-24에 의해 유도된 IL-6, 인터페론-γ, TNF-α 및 기타 사이토킨의 발현을 차단함이 증명되었으므로[참조: Caudell et al., 2002; Wang et al., 2002], IL-10 및 IL-24가 신호전달 및 세포 증식에서 서로 길항하는지 여부를 평가하는 연구를 수행하였다. IL-10이 IL-24 유도된 성장 억제를 조절할 수 있는지 여부를 결정하기 위해, MDA-MB231 및 MDA-MB453 세포를 둘다 동량의 IL-24 단백질 및 증가시킨 양의 재조합 IL-10으로 처리하였다. 그 결과는, IL-10이 IL-24-단백질-유도된 사멸을 용량-의존적 방식으로 유의적으로 억제하였음을 보인다(도 29B). IL-10 단독은 세포 증식 및 유방암 세포주의 사멸을 촉진시키지는 않았다(도 29A). 특이성에 대한 부가의 대조군으로서, IL-10을 비등시켜 이의 기능을 차단하였다. IL-10을 비등시킴으로써 IL-24에 의해 매개된 사멸을 억제하는 이의 능력을 없앴다(도 29B).
실시예 9
베바시주마브(Bevacizumab)은 폐암 세포에 대한 Ad-mda7-매개된 항종양 활성을 증강시킨다.
A. 물질 및 방법
1. 재조합 아데노바이러스 벡터
Ad-mda7 및 Ad-루시퍼라제(luc) 벡터를 작제하고, 상기 보고된 바와 같이 정제하였다[참조: Mhashilkar et al., 2001; Saeki et al., 2000]. 세포주에 대한 형질도입 효율을 GFP를 함유하는 아데노바이러스 벡터(Ad-GFP)를 사용하여 측정하였다. 형질도입 효율은 3000vp/세포로 감염시킨 경우, 각각의 세포주에서 80보다 더 컸다. 세포를 적합한 바이러스 입자로 처리하였다.
2. 세포 배양 및 시약
비-소세포 폐암 세포주 H1299 및 A549를 상기 기재된 바와 같이 배양하였다[참조: Saeki et al., 2000]. HUVEC를 clonetics사(Walkersville, MD)로부터 구입하여 5% 소태아 혈청을 함유한 내피세포 기본 배지에서 성장시키고, 부가의 시약을 제조자에 의해 총알(bullet) 키트로서 제공하였다. 내피세포를 통로 3-8에서 사용하였다.
3. 세포 증식 분석
비-세포독성 용량을 측정하기 위해, 용량-역가측정 연구를 수행하였다. 이러한 예비 연구에 따르면, 1000vp/세포의 Ad-mda7은 4일째까지 폐 종양 세포에 대해 세포독성이 아닌 반면, 2000 및 3000vp/세포 용량은 세포독성이었다. 이러한 결과를 근거로 하여, 하기 기재된 모든 후속적 분석은 Ad-luc 또는 Ad-mda7을 1000vp/세포로 사용하여 수행하였다.
종양 세포(H1299 및 A549)를 6웰 플레이트에 육종하고(2 x 105개 세포/웰), 루시퍼라제(luc) 유전자를 발현하는 아데노바이러스 벡터(Ad-luc) 또는 Ad-mda7(1000개 바이러스 입자[vp]/세포)로 처리하였다. PBS로 처리된 세포를 대조군으로서 제공하였다. 세포를 도면들에 나열된 바와 같이 다양한 시점에서 수거하고, 상기 기재된 바와 같이 세포 생존력 분석을 수행하였다[참조: Saeki et al., 2000].
Ad-mda7-처리된 H1299로부터 수득한 조건화된 배지의 내피세포 증식에 미치는 효과의 분석을 위해, 사람 제대정맥 내피세포(HUVECs)를 6웰 플레이트에 육종하였다(3x105개 세포/웰). 배양 24시간 후, 배양 배지를 PBS, Ad-luc 또는 Ad-mda7로 처리한 종양 세포로부터 제조한 조건화된 배지로 교체하였다. HUVEC를 3일 더 배양한 후, 수거하여 세포 생존력 분석을 수행하였다[참조: Ramesh et al., 2003; Mhashilkar et al., 2001].
개별적 설정 실험에서, HUVEC을 재조합 사람 VEGF165 또는 항-MDA-7 항체(10μg/ml; Introgen Therapeutics, Houston, TX)를 함유한 Ad-mda7-처리된 세포로부터의 조건화된 배지로 처리하고, 세포 생존력을 상기 기재된 바와 같이 측정하였다.
4. 웨스턴 블롯팅.
PBS, Ad-luc 또는 Ad-mda7로 처리한 종양 세포를 처리 후 지정된 시점에서 수거하였다. 세포 용해물을 수거하고, 상기 기재된 바와 같이 웨스턴 블롯팅으로 분석하였다[참조: Mhashilkar et al., 2001; Saeki et al., 2000]. 다음의 항-사람 1차 항체를 검출을 위해 사용하였다: VEGFR2(Chemicon, Temecula, CA), 인산화된 VEGFR2(pVEGFR2, Y1214; Biosource, Camarillo, CA) VEGF(Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA); β-액틴(Sigma Chemical Co., St. Louis, MO); AKT, 인산화된 AKT(pAKT), 카스파제-3(Cell Signaling Technology Inc., Beverly, CA); 및 MDA-7(Introgen Therapeutics).
5. 효소-결합된 면역흡착 분석(ELISA).
종양 세포를 6웰 플레이트에 육종하고, PBS, Ad-luc 또는 Ad-mda7로 처리하였다(1000vp/세포). 조건화된 배지를 처리 후 48 및 72시간째에 수거하고, 세포 잔해를 제거하기 위해 13,000rpm으로 15분 동안 원심분리하였다. 상청액을 시판중인 ELISA 키트(Quantikine human VEGF, R&D Systems)를 사용하여 사람 VEGF에 대해 3회 분석하였다. 제조사의 프로토콜에 따라 분석을 수행하고, VEGF 농도를 측정하였다. Ad-luc 또는 Ad-mda7 처리된 세포의 조건화된 배지내 VEGF 농도를 PBS-처리한 세포의 배지내 VEGF 농도 이상의 억제율로서 표현하였다. 실험을 3회 수행하고, 결과를 3개의 개별적 실험의 평균으로서 표현하였다.
6. Src 키나제 분석
Src 키나제 분석을 상기 기재된 바와 같이 수행하였다[참조: Boyd et al., 2004]. 간단하게는, PBS-, Ad-luc- 및 Ad-mda7-처리한 종양 세포로부터의 세포 용해물을 방사선면역침전 분석 완충액 중에 제조하고, 항-c-Src 모노클로날 항체 327(Oncogene Science Inc., Cambridge, MA)과 반응시켰다. 면역 복합체가 토끼 항마우스 IgG 및 포르말린-고정된 Pandorbin으로 형성되었다. 키나제 반응은 10μCi의 [γ-32P] ATP, 10mM Mg2+, 10μg의 토끼 근육 에놀라제(Sigma), 및 20mM HEPES 중의 100μM 오르토 바나듐산나트륨을 첨가함으로써 개시되었다. 나트륨 도데실레이트로 반응을 종결시켰다. 방사선표지된 단백질 생성물은 8% 폴리아크릴아미드 겔 중에 분리하고, 자가방사선기록을 수행하였다. 블롯은 밀도계를 사용한 반정량적 분석을 수행하고, 값은 PBS 이상의 억제율로서 나타내었다.
7. VEGF 수용체 활성화 분석
HUVEC를 6웰 플레이트에 육종하고(5x1O5/웰), 1% FBS를 함유하는 성장 인자 비함유 배지로 밤새 굶겼다. 다음날, 배지를 PBS, Ad-luc, Ad-mda7, Ad-mda7 + 항-MDA7 항체, Ad-mda7 + 재조합사람 VEGF(rhVEGF)로 처리한 종양 세포로부터 수거한 조건화된 배지로 교체하였다. 상이한 설정의 실험에서, 세포를 또한 아바스틴, 아바스틴 + Ad-luc 및 아바스틴 + Ad-mda7로 처리한 조건화된 배지로 처리하였다. 조건화된 배지에 첨가하지 않은 HUVEC를 대조군으로서 제공하였다. 세포를 조건화된 배지 첨가 5, 10 및 60분 후 수거하고, 세포 용해물을 제조하고, 웨스턴 블롯팅에 의해 VEGF 수용체의 인산화 및 AKT의 인산화, VEGF 수용체의 하류흐름 표적에 대해 분석하였다.
8. 생체내 분석
Ad-mda7 + 비바시주마브(Bivacizumab) 배합이 생체내 종양 성장 억제를 증강시키는지 여부를 측정하기 위해, H1299 종양 세포(5x106)를 흉선을 제거한 BALB/c 암컷 누드 마우스(n=50)의 하부 우측 옆구리내로 피하 주사하였다. 마우스를 그룹들로 나누고, 종양 크기가 50 내지 100mm3에 이르렀을 때 다음과 같이 처리하였다: PBS(n=8), Ad-luc(n=8), Ad-mda7(n=8), 비바시주마브(n=9), Ad-luc + 비바시주마브(n=8), Ad-mda7 + 비바시주마브(n=9). 마우스를 Ad-luc 또는 Ad-mda7로 주 2회 종양내로 (1 x 1010vp/용량) 처리하였다. 비바시주마브(100ug/몸통)을 주 2회 복강내로 제공하였다. 동물들은 매주 체중을 측정하고, 종양 성장을 상기 기재된 바와 같이 주 3회 측정하였다[참조: Saeki et al., 2002; Ramesh et al., 2003]. 1차 처리 후 28일째에, 모든 동물을 CO2 흡입으로 희생시키고, 종양을 병리조직학적 조사 및 웨스턴 블롯 분석을 위해 수거하였다. 2개의 상이한 설정의 실험을 수행하였다.
9. 통계적 분석.
모든 실험은 3회 수행하였고, 스튜던츠 t-시험 및 분산 분석을 사용하여 실험적 결과의 통계적 유의성을 계산하였다. 유의성 수준은 P<0.05으로 설정되었다.
B. 결과
1. Ad-mda7은 이의 사멸 효과와 독립적으로 NSCLC에서 VEGF를 억제하였다.
H1299 및 A549를 6웰 조직 배양 플레이트에서 성장시키고(2 x 105), 1000VP/세포의 Ad-mda7로 처리하였다. PBS 및 Ad-luc(lOOOvp/세포)로 처리한 세포를 대조군으로서 제공하였다. 세포 추출물 및 세포 상청액을 처리 48시간 및 72시간 후 수거하였다. Ad-mda7은 PBS 및 Ad-luc과 비교하여 2개의 NSCLC 모두에서 VEGF 발현을 현저하게 감소시켰다(도 30A). 그리고, MDA-7 단백질 발현은 시간 의존적인 것으로 관찰되었다. 세포 생존력 분석에서, 1000vp/세포의 Ad-mda7은 처리 후 72시간째까지 2개의 폐암 세포주 모두에 어떠한 사멸 효과도 나타내지 않은 것으로 밝혀졌다(도 31A-B). 배양 상청액내 VEGF의 분석에서, Ad-mda7이 Ad-luc와 비교하여 2개의 NSCLC 모두에서 VEGF를 유의적으로 억제하는 것으로 나타났다(도 30B, 도 31B). 이들 데이터는, Ad-mda7이 종양 세포에 대한 이의 독성 효과와는 독립적으로 NSCLC에서 VEGF 발현을 억제함을 제시하는 것이다.
2. Ad-mda7은 NSCLC에서 Src 활성화를 하향조절하였다.
이전의 수개의 연구로, 비 수용체 키나제인 c-Src가 VEGF 발현을 조절하는데 일정 역할을 하는 것으로 제시되었고, Src의 높은 발현은 증가된 VEGF 발현과 관련있는 것으로 보고되어 왔다[참조: Inoue et al., 2005; Irby and Yeatman, 2000; Bromann et al., 2004]. 이러한 보고를 근거로 하여, Ad-mda7-매개된 VEGF 억제가 NSCLC에서 c-Src와 관련있는지 여부를 Src 키나제 분석에 의해 조사하였다.
H1299 및 A549 세포를 6웰 플레이트에 육종하고, 용해물을 PBS, Ad-luc 및 Ad-mda7로 처리한 48시간 후 수거하였다. Src 활성을 키나제 분석 키트를 사용하여 분석하였다. Ad-mda7은 2개의 NSCLC 모두에서 Src 활성을 유의적으로 감소시켰다(도 32). 이러한 데이터는, Ad-mda7에 의한 Src 활성의 억제가 폐암 세포에서 VEGF의 하향조절을 야기함을 제시하는 것이다.
3. 폐 종양 세포에서 MDA-7-매개된 VEGF 억제는 내피세포 증식 및 VEGF 수용체 신호전달에 영향을 미친다.
VEGF는 내피세포 증식 및 생존에 중요한 성장 인자인 것으로 제시되어 왔다[참조: Gerber et al., 1998]. 따라서, VEGF의 억제는 내피세포 세포 사멸을 제공해야만 한다. 종양 세포에 의해 감소된 VEGF 생성이 내피세포 증식 및 신호전달에 영향을 미치는지 여부를 조사하기 위해, 세포 생존력 분석 및 HUVEC상의 VEGF 수용체 신호전달에 대한 웨스턴 블롯 분석을 수행하였다.
Ad-mda7-처리한 종양 세포로부터 수거한 조건화된 배지로 HUVEC를 처리한 것은, 데이터를 PBS 그룹 이상의 억제율로 나타내는 경우 Ad-luc-처리한 종양 세포로부터의 조건화된 배지로 처리한 것(도 33A)과 비교하여 세포 증식의 유의적 억제를 보였다(도 33A). HUVEC 증식의 억제가 감소된 VEGF로 인한 것인지 여부를 추가로 평가하기 위해, 혈청-고갈된 HUVEC를 상기 기재된 바와 같이 처리하고, VEGF 수용체 신호전달에 대해 분석하였다. 또한, 과량의 항-MDA7 중화 항체를 첨가하여 MDA-7 단백질의 분비 형태가 HUVEC 증식에 영향을 미칠 수 있는 가능성을 배제시켰다. VEGFR2 신호전달 경로에 대한 하류흐름 표적인 VEGFR2 및 AKT를, HUVEC를 PBS 및 Ad-luc 처리한 종양 세포로부터의 조건화된 배지로 처리한 경우, 인산화하였다. VEGFR2 및 AKT 활성화 어느쪽도 항-MDA7 중화 항체의 존재 또는 부재하에 Ad-mda7-처리한 세포로부터의 조건화된 배지로 처리한 HUVEC에서 관찰되지 않았다. rh VEGF165를 Ad-mda7-처리한 세포로부터의 조건화된 배지에 첨가하여 VEGFR2 및 AKT 활성화를 회복시켰다(도 33B).
4. Ad-mda7은 HUVEC 상에 어떠한 사멸 효과도 나타내지 못했고, 아바스틴은 HUVEC 세포 증식을 억제하였지만, H1299 세포 증식에는 영향을 미치지 못했다.
Ad-mda7 및 비바시주마브 배합이 폐암에 대해 효과적인지 여부를 조사하기 위한 연구를 수행하였다. 종양 세포 및 내피세포에 대한 Ad-mda7 및 비바코주마브(Bivacozumab) 둘다의 독성을 평가하기 위해, 세포 생존력 분석을 수행하였다. H1299 세포(2 x 1O5/웰) 및 HUVEC(3 x 1O5/웰)를 6웰 플레이트에 육종하였다. 다음날, 세포를 PBS, Ad-luc(1000vp/세포), Ad-mda7(1000vp/세포) 및 비바시주마브(0.78ug/ml, 1.56ug/ml, 3,125ug/ml), Ad-luc + 비바시주마브 및 Ad-mda7 + 비바시주마브로 각각 처리하였다. 처리 48시간 및 73시간 후, 세포를 트립신 처리하고, 트리판 블루 세포 배제 분석에 대해 분석하였다. 이전 데이터와 일치하게, 1000vp/세포의 Ad-mda7은 H1299 및 HUVEC 둘다에 어떠한 독성도 나타내지 않았다. 비바시주마브는 HUVEC 생존력을 억제한 반면, 베바시주마브는 H1299 상에 유해한 효과를 나타내지 않았다(도 34).
5. 폐 종양 세포에서 MDA-7 및 아바스틴에 의한 VEGF 억제는 내피세포 증식에 영향을 미친다.
데이터를 PBS 그룹 이상의 억제율로 나타내는 경우, Ad-luc-처리한 종양 세포로부터의 조건화된 배지로 처리한 경우(도 35)와 비교하여 Ad-mda7-처리한 종양 세포로부터 수거한 조건화된 배지로 HUVEC를 처리한 것은 세포 증식의 유의적 억제를 나타내었다(P≤0.05; 도 34).
6. HUVEC 상에 VEGFR2 신호전달의 차단은 Ad-mda7을 비바시주마브와 배합한 경우 유의적으로 증강되었다.
Ad-mda7이 비바시주마브와 함께 HUVEC 상에 VEGFR2 신호전달 경로의 억제 효과를 증강시키는지 여부를 평가하기 위해, Ad-mda7을 비바시주마브와 배합한 것만 제외하고 상기 언급된 것과 동일한 설정의 실험을 수행하였다. 또한, PBS 및 Ad-luc 처리한 종양 세포로부터의 조건화된 배지는 VEGFR2 신호전달을 활성화하였다. 보다 적은 VEGFR2 및 AKT의 활성화가 Ad-mda7-처리한 세포 및 베바시주마브-처리한 세포로부터의 조건화된 배지로 처리한 HUVEC에서 관찰되었다. 또한, 비바시주마브-처리한 상청액에 의한 HUVEC 상의 VEGFR2 및 AKT 활성화의 억제 효과는 Ad-mda7-처리한 상청액 및 Ad-luc + 비바시주마브-처리한 상청액의 경우와 유사하였다. HUVEC를 Ad-mda7 + 비바시주마브로 처리한 배양 상청액으로 처리한 경우, VEGFR2 신호전달의 활성화는 현저하게 감소되었다(도 36).
7. Ad-mda7 + 비바시주마브 배합은 생체내 종양 성장 억제를 증강시킨다.
Ad-mda7 + 비바시주마브 배합 처리가 종양 성장 억제를 증강시키는지 여부를 평가하기 위해, 생체내 실험을 이종이식 모델을 사용하여 수행하였다. Ad-mda7 + 베바시주마브로 처리한 마우스는, PBS, Ad-luc, 비바시주마브 또는 Ad-luc + 베바시주마브로 처리한 마우스와 비교하여 유의적으로 종양 성장을 억제하였다. 또한, 각각의 제제 또는 배합과 관련된 부작용, 예를 들어 체중 감소, 질병율 또는 사망의 어떠한 것도 관찰되지 않았고, 이는 모든 처리가 허용됨을 제시하는 것이다.
종양 억제의 분자 기작을 조사하기 위해, 동물들을 마지막 처리 24시간 후 안락사시키고, 종양 샘플을 수거하고, 급히 냉동시키고, 포르말린에 고정시켰다. 총 단백질을 급히 냉동시킨 종양 조직으로부터 추출하고, VEGF, MDA-7 및 카스파제-3에 대해 웨스턴 블롯 분석으로 분석하였다. mda-7 유전자는 종양 세포내로 성공적으로 형질감염되었다. 종양 샘플에서 VEGF는 Ad-mda7 처리에 의해 억제된 반면, PBS 및 Ad-luc는 억제하지 않았다(도 37). 종양을 Ad-mda7 + 비바시주마브로 처리한 경우 VEGF 발현은 유의적으로 감소되었다. 또한, 절단된 카스파제-3은 Ad-mda7로 처리한 종양에서 관찰되었다. 흥미롭게도, 종양을 Ad-mda7 + 비바시주마브로 처리한 경우 더 많은 카스파제-3 절단이 관찰되었다.
MDA-7, VEGF, CD31 및 TUNEL에 대한 종양 조직의 면역조직화학적 분석에서, AD-mda7 및 베바시주마브로 처리한 마우스로부터의 종양이 모든 다른 처리 그룹과 비교하여 VEGF, CD31 및 증가된 TUNEL 포지티브 염색에서 유의적인 감소를 보였던 것으로 나타났다. 부가적으로, 관찰된 효과는 MDA-7 단백질 발현과 관련있다.
요약하자면, Ad-mda7은 Src 키나제 활성의 억제를 통해 NSCLC에서 VEGF를 억제한다. Ad-mda7을 비바시주마브와 배합한 경우, HUVEC 상의 VEGFR2 신호전달의 차단은 유의적으로 증강되었다. 폐 종양 세포에서 MDA-7-매개된 VEGF 억제는 내피세포 증식 및 VEGF 수용체 신호전달에 영향을 미친다. Ad-mda7 + 비바시주마브 배합은 생체내 종양 성장 억제를 증강시킨다. Ad-mda7 + 비바시주마브 배합은 생체내 VEGF의 억제 효과 및 종양 아폽토시스를 증강시킨다.
실시예 10
Ad-mda7 + TNF-α 처리는 전립선 종양 세포 사멸을 증강시킨다.
A. 물질 및 방법
1. 재조합 아데노바이러스 벡터
Ad-mda7 및 Ad-루시퍼라제(luc) 벡터를 작제하고, 정제하고, Introgen Therapeutics, Inc.사(Houston, Texas)에서 공급받았다.
2. 형질도입 효율
전립선암 세포주 LNCaP에 대한 형질도입 효율을 GFP를 함유하는 아데노바이러스 벡터(Ad-GFP)로 측정하였다. 세포를 6웰 플레이트에 육종하고, 상이한 용량의 Ad-GFP(100, 300, 600 및 1200vp/세포)로 처리하였다. Ad-GFP 처리한 세포를 재조합 사람 TNF-α 단백질(10ng/ml)로 후속적으로 처리하거나 처리하지 않았다. 세포를 트립신 처리에 의해 TNF-α 처리 24시간 후 수거하고, PBS로 3회 세척한 후, FACS 분석하였다. PBS로 처리한 세포를 대조군으로서 제공하였다.
3. 세포 배양 및 시약
전립선 암 세포주 LNCaP 및 DU145를 ATCC에 의해 권고된 바와 같이 배양하였다.
4. 세포 증식 분석
종양 세포(LNCaP)를 6웰 플레이트(5 x 104) 또는 96웰 플레이트(2 x 103개 세포/웰)에 육종하고, 루시퍼라제(luc) 유전자(Ad-luc)를 발현하는 아데노바이러스 벡터 또는 Ad-mda7(1500-2000개 바이러스 입자[vp]/세포) 단독 또는 TNF-α(5ng/ml)와 배합하여 처리하였다. PBS로 처리한 세포를 대조군으로서 제공하였다. 세포를 상기 기재된 XTT 방법을 사용하여 처리 48시간 및 72시간 후 세포 생존력을 분석하였다.
5. 웨스턴 블롯팅
Ad-mda7(1000-2000vp/세포), Ad-mda7 + TNF-α(10-20ng/ml) 또는 Ad-mda7 + 항-TNF-α 항체(0.5-1ug/ml)로 처리한 종양 세포를 처리 24시간 후 수거하였다. 세포 용해물을 수거하고, 웨스턴 블롯팅으로 MDA-7 단백질 발현에 대해 분석하였다.
6. 세포 주기
종양 세포(LNCaP)를 6웰 플레이트에 육종하고, Ad-mda7 또는 Ad-luc(1500vp/세포), Ad-mda7 + TNF-α(10ng/ml), Ad-mda7 + 항-TNF 항체(1ug/ml), Ad-luc + TNF-α 또는 Ad-luc + 항-TNF 항체로 처리하였다. 세포를 처리 48시간 후 수거하고, 유세포분석기에 의해 SubG0/G1 기에서 세포의 수에 대해 분석하였다. PBS로 처리한 세포를 대조군으로서 제공하였다.
B. 결과
1. Ad-mda7 + TNF-α 처리는 전립선 종양 세포 사멸을 증강시킨다.
전립선 종양(LNCaP) 종양 세포를 PBS, TNF-α, Ad-Luc, Ad-mda7, Ad-luc + TNF 또는 Ad-mda7 + TNF로 처리하였다. 바이러스 처리는 2000vp/세포였고, TNF 처리는 5ng/ml였다. 처리 48시간 후, 세포를 광학 현미경하에 가시화하였다. Ad-mda7 + TNF로 처리한 세포는 다른 처리 그룹과 비교하여 세포 증식의 유의적 억제를 나타내었다.
2. Ad-mda7 + TNF-α 처리는 종양 세포 증식을 억제한다.
전립선 종양(LNCaP) 종양 세포를 PBS, TNF-α, Ad-Luc, Ad-mda7, Ad-luc + TNF 또는 Ad-mda7 + TNF로 처리하였다. 바이러스 처리는 1500vp/세포였고, TNF 처리는 5ng/ml였다. 처리 48 및 72시간 후, 세포를 XTT 분석하여 세포 생존력을 측정하였다. Ad-mda7 + TNF로 처리한 세포는 다른 처리 그룹과 비교하여 유의적 성장 억제를 보였다(도 37). 억제 효과는 상승적이었다.
3. Ad-mda7 + TNF-α 처리는 외인성 MDA-7 단백질 발현을 증가시킨다.
6웰 플레이트에 육종한 전립선 종양 세포(LNCaP 및 DU145)를 Ad-mda7(1000-2000vp/세포), Ad-mda7 + TNF-α(10-20ng/ml) 및 Ad-mda7 + 항-TNF 항체(0.5-1ug/ml)로 처리하였다. 세포를 처리 24시간 후 수거하고, 웨스턴 블롯팅으로 MDA-7 단백질 발현에 대해 분석하였다. Ad-mda7(2000vp/세포)로 처리한 LNCaP 세포는 MDA-7 발현을 나타냈다. 그러나, Ad-mda7 + TNF-α(20ng/ml)로 처리한 세포는 항-TNF 항체(0.5ug/ml)의 존재하에 억제된 외인성 MDA-7 단백질 발현에서 현저한 증가를 나타냈다. Ad-mda7(1500vp/세포)로 처리한 LNCaP 및 DU145 세포는 MDA-7 발현을 보였다. 그러나, Ad-mda7 + TNF-α(10ng/ml)로 처리한 세포는 항-TNF 항체(1.0ug/ml)의 존재하에 없어진 외인성 MDA-7 단백질 발현의 현저한 증가를 보였다.
4. TNF-α는 형질도입 효율을 증가시킨다.
종양(LNCaP) 세포를 TNF-α(lOng/ml)의 존재 또는 부재하에 100, 300, 600 및 1200vp/세포의 Ad-GFP로 처리하였다. 어떠한 처리도 제공하지 않은 세포를 대조군으로서 제공하였다. TNF-α 처리 24시간 후 세포를 수거하고, PBS로 3회 세척한 후, 500㎕ PBS 중에 재현탁시키고, FACS 분석하였다. Ad-GFP 단독으로 처리한 세포는 73.5% for 100vp/세포의 Ad-GFP의 경우 73.5%부터 시작하는 형질도입 효율에서 용량-의존적 증가를 보였다(도 38). 그러나, TNF-α의 존재하에, 형질도입 효율은 증가되었고, 100vp/세포의 Ad-GFP에 있어서 92.8%인 것으로 관찰되었다. 형질도입의 증가는 TNF-α의 존재하에 300vp/세포의 Ad-GFP로부터 포화되는 것으로 보였다.
5. Ad-mda7 + TNF-α 처리는 SubG0/G1 기에서 증가된 세포 수를 야기한다.
종양(LNCaP) 세포를 PBS, TNF-α(10ng/ml), Ad-Luc(1500vp/세포), Ad-mda7(1500vp/세포), Ad-luc + TNF, Ad-mda7 + TNF, Ad-luc + 항-TNF 항체(1ug/ml) 또는 Ad-mda7 + 항-TNF 항체로 처리하였다. 처리 48시간 후, 세포를 수거하고, PBS로 3회 세척한 후, 프로피디움 요오드화물(0.5ug/ml)을 함유하는 500㎕의 PBS 중에 재현탁시켰다. 세포를 FACS 분석하였다. Ad-mda7 + TNF로 처리한 유의적인 수의 세포가 0.45% 내지 26.3% 범위였던 다른 처리 그룹과 비교하여 SubG0/G1 기에서 지시된 아폽토시스 세포로 관찰되었다(70%).
본원에 기재되고 청구된 모든 조성물 및 방법은 본 기재의 견지에서 부적당한 실험 없이 제조되고 실행되었다. 본 발명의 조성물 및 방법이 바람직한 양태로 기재되어 있지만, 본 발명의 개념, 취지 및 범위로부터 벗어남이 없이 본원에 기재된 조성물 및 방법 및 단계에서 또는 방법의 단계 순서에서 변형이 적용될 수 있음은 당해 기술분야 숙련가에게 명백할 것이다. 보다 구체적으로, 화학적이고 생리학적으로 관련된 특정 제제가 동일하거나 유사한 결과를 달성하면서 본원에 기재된 제제를 대신할 수 있음이 명백할 것이다. 당해 기술분야 숙련가에게 명백한 모든 이러한 유사 대체 및 변형은 첨부된 청구항에 의해 정의된 본 발명의 취지, 범위 및 개념내에 있는 것으로 간주된다.
참조문헌
하기 참조문헌들은 본원에 제시된 내용을 보충하는 예시적인 과정 또는 기타 상세한 사항을 제공하는 정도로 본원에서 구체적으로 참조로 인용된다.
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<110> BOARD OF REGENTS, THE UNIVERSITY OF TEXAS SYSTEM <120> Compositions and methods involving MDA-7 for the treatment of cancer <130> UTSC:924US/INGN:133US <150> US 60/650,807 <151> 2005-02-08 <150> US 60/661,679 <151> 2005-03-14 <150> US 60/676,096 <151> 2005-04-29 <150> US 60/749,374 <151> 2005-12-12 <160> 28 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 718 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 acaagacatg actgtgatga ggagctgctt tcgccaattt aacaccaaga agaattgagg 60 ctgcttggga ggaaggccag gaggaacacg agactgagag atgaattttc aacagaggct 120 gcaaagcctg tggactttag ccagaccctt ctgccctcct ttgctggcga cagcctctca 180 aatgcagatg gttgtgctcc cttgcctggg ttttaccctg cttctctgga gccaggtatc 240 aggggcccag ggccaagaat tccactttgg gccctgccaa gtgaaggggg ttgttcccca 300 gaaactgtgg gaagccttct gggctgtgaa agacactatg caagctcagg ataacatcac 360 gagtgcccgg ctgctgcagc aggaggttct gcagaacgtc tcggatgctg agagctgtta 420 ccttgtccac accctgctgg agttctactt gaaaactgtt ttcaaaaact accacaatag 480 aacagttgaa gtcaggactc tgaagtcatt ctctactctg 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Gln Glu Asn Glu Met Phe 145 150 155 160 Ser Ile Arg Asp Ser Ala His Arg Arg Phe Leu Leu Phe Arg Arg Ala 165 170 175 Phe Lys Gln Leu Asp Val Glu Ala Ala Leu Thr Lys Ala Leu Gly Glu 180 185 190 Val Asp Ile Leu Leu Thr Trp Met Gln Lys Phe Tyr Lys Leu 195 200 205 <210> 3 <211> 3634 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 3 gaattccggg tgatttcact cccggctgtc caggcttgtc ctgctacccc acccagcctt 60 tcctgaggcc tcaagcctgc caccaagccc ccagctcctt ctccccgcag gacccaaaca 120 caggcctcag gactcaacac agcttttccc tccaacccgt tttctctccc tcaacggact 180 cagctttctg aagcccctcc cagttctagt tctatctttt tcctgcatcc tgtctggaag 240 ttagaaggaa acagaccaca gacctggtcc ccaaaagaaa tggaggcaat aggttttgag 300 gggcatgggg acggggttca gcctccaggg tcctacacac aaatcagtca gtggcccaga 360 agacccccct cggaatcgga gcagggagga tggggagtgt gaggggtatc cttgatgctt 420 gtgtgtcccc aactttccaa atccccgccc ccgcgatgga gaagaaaccg agacagaagg 480 tgcagggccc actaccgctt cctccagatg agctcatggg tttctccacc aaggaagttt 540 tccgctggtt gaatgattct ttccccgccc tcctctcgcc ccagggacat 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tcctggggga cccaatgtag gagctgcctt ggctcagaca tgttttccgt gaaaacggag 3180 ctgaacaata ggctgttccc atgtagcccc ctggcctctg tgccttcttt tgattatgtt 3240 ttttaaaata tttatctgat taagttgtct aaacaatgct gatttggtga ccaactgtca 3300 ctcattgctg agcctctgct ccccagggga gttgtgtctg taatcgccct actattcagt 3360 ggcgagaaat aaagtttgct tagaaaagaa acatggtctc cttcttggaa ttaattctgc 3420 atctgcctct tcttgtgggt gggaagaagc tccctaagtc ctctctccac aggctttaag 3480 atccctcgga cccagtccca tccttagact cctagggccc tggagaccct acataaacaa 3540 agcccaacag aatattcccc atcccccagg aaacaagagc ctgaacctaa ttacctctcc 3600 ctcagggcat gggaatttcc aactctggga attc 3634 <210> 4 <211> 233 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Met Ser Thr Glu Ser Met Ile Arg Asp Val Glu Leu Ala Glu Glu Ala 1 5 10 15 Leu Pro Lys Lys Thr Gly Gly Pro Gln Gly Ser Arg Arg Cys Leu Phe 20 25 30 Leu Ser Leu Phe Ser Phe Leu Ile Val Ala Gly Ala Thr Thr Leu Phe 35 40 45 Cys Leu Leu His Phe Gly Val Ile Gly Pro Gln Arg Glu Glu Phe Pro 50 55 60 Arg Asp Leu Ser Leu Ile Ser Pro Leu Ala 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cacttcctca gggattgaga 1020 cctctgatcc agacccctga tctcccaccc ccatccccta tggctcttcc taggagaccc 1080 cagcaagcag aactcactgc tctggagagc aaacacggac cgtgccttcc tccaggatgg 1140 tttctccttg agcaacaatt ctctcctggt ccccaccagt ggcatctact tcgtctactc 1200 ccaggtggtc ttctctggga aagcctactc tcccaaggcc ccctcctccc cactctacct 1260 ggcccatgag gtccagctct tctcctccca gtaccccttc catgtgcctc tcctcagctc 1320 ccagaagatg gtgtatccag ggctgcagga accctggctg cactcgatgt accacggggc 1380 tgcgttccag ctcacccagg gagaccagct atccacccac acagatggca tcccccacct 1440 agtcctcagc cctagtactg tcttctttgg agccttcgct ctgtagaact tggaaaaatc 1500 cagaaagaaa aaataattga tttcaagacc ttctccccat tctgcctcca ttctgaccat 1560 ttcaggggtc gtcaccacct ctcctttggc cattccaaca gctcaagtct tccctgatca 1620 agtcaccgga gctttcaaag aaggaattct aggcatccca ggggaccaca cctccctgaa 1680 ccatccctga tgtctgtctg gctgaggatt tcaagcctgc ctaggaattc ccagcccaaa 1740 gctgttggtc ttgtccacca gctaggtggg gcctagatcc acacacagag gaagagcagg 1800 cacatggagg agcttggggg atgactagag gcagggaggg 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caacatcacc atgcagatta tgcggatcaa acctcaccaa ggccagcaca 1380 taggagagat gagcttccta cagcacaaca aatgtgaatg cagaccaaag aaagatagag 1440 caagacaaga aaaatgtgac aagccgaggc ggtgagccgg gcaggaggaa ggagcctccc 1500 tcagggtttc gggaaccaga tctctcacca ggaaagactg atacagaacg atcgatacag 1560 aaaccacgct gccgccacca caccatcacc atcgacagaa cagtccttaa tccagaaacc 1620 tgaaatgaag gaagaggaga ctctgcgcag agcactttgg gtccggaggg cgagactccg 1680 gcggaagcat tcccgggcgg gtgacccagc acggtccctc ttggaattgg attcgccatt 1740 ttatttttct tgctgctaaa tcaccgagcc cggaagatta gagagtttta tttctgggat 1800 tcctgtagac acacccaccc acatacatac atttatatat atatatatta tatatatata 1860 aaaataaata tctctatttt atatatataa aatatatata ttcttttttt aaattaacag 1920 tgctaatgtt attggtgtct tcactggatg tatttgactg ctgtggactt gagttgggag 1980 gggaatgttc ccactcagat cctgacaggg aagaggagga gatgagagac tctggcatga 2040 tctttttttt gtcccacttg gtggggccag ggtcctctcc cctgcccagg aatgtgcaag 2100 gccagggcat gggggcaaat atgacccagt tttgggaaca ccgacaaacc cagccctggc 2160 gctgagcctc tctaccccag gtcagacgga cagaaagaca gatcacaggt acagggatga 2220 ggacaccggc tctgaccagg agtttgggga gcttcaggac attgctgtgc tttggggatt 2280 ccctccacat gctgcacgcg catctcgccc ccaggggcac tgcctggaag attcaggagc 2340 ctgggcggcc ttcgcttact ctcacctgct tctgagttgc ccaggagacc actggcagat 2400 gtcccggcga agagaagaga cacattgttg gaagaagcag cccatgacag ctccccttcc 2460 tgggactcgc cctcatcctc ttcctgctcc ccttcctggg gtgcagccta aaaggaccta 2520 tgtcctcaca ccattgaaac cactagttct gtccccccag gagacctggt tgtgtgtgtg 2580 tgagtggttg accttcctcc atcccctggt ccttcccttc ccttcccgag gcacagagag 2640 acagggcagg atccacgtgc ccattgtgga ggcagagaaa agagaaagtg ttttatatac 2700 ggtacttatt taatatccct ttttaattag aaattaaaac agttaattta attaaagagt 2760 agggtttttt ttcagtattc ttggttaata tttaatttca actatttatg agatgtatct 2820 tttgctctct cttgctctct tatttgtacc ggtttttgta tataaaattc atgtttccaa 2880 tctctctctc cctgatcggt gacagtcact agcttatctt gaacagatat ttaattttgc 2940 taacactcag ctctgccctc cccgatcccc tggctcccca gcacacattc ctttgaaata 3000 aggtttcaat 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agctcgggcc gggaggagcc gcagccggag gagggggagg 780 aggaagaaga gaaggaagag gagagggggc cgcagtggcg actcggcgct cggaagccgg 840 gctcatggac gggtgaggcg gcggtgtgcg cagacagtgc tccagccgcg cgcgctcccc 900 aggccctggc ccgggcctcg ggccggggag gaagagtagc tcgccgaggc gccgaggaga 960 gcgggccgcc ccacagcccg agccggagag ggagcgcgag ccgcgccggc cccggtcggg 1020 cctccgaaac catgaacttt ctgctgtctt gggtgcattg gagccttgcc ttgctgctct 1080 acctccacca tgccaagtgg tcccaggctg cacccatggc agaaggagga gggcagaatc 1140 atcacgaagt ggtgaagttc atggatgtct atcagcgcag ctactgccat ccaatcgaga 1200 ccctggtgga catcttccag gagtaccctg atgagatcga gtacatcttc aagccatcct 1260 gtgtgcccct gatgcgatgc gggggctgct gcaatgacga gggcctggag tgtgtgccca 1320 ctgaggagtc caacatcacc atgcagatta tgcggatcaa acctcaccaa ggccagcaca 1380 taggagagat gagcttccta cagcacaaca aatgtgaatg cagaccaaag aaagatagag 1440 caagacaaga aaatccctgt gggccttgct cagagcggag aaagcatttg tttgtacaag 1500 atccgcagac gtgtaaatgt tcctgcaaaa acacagactc gcgttgcaag gcgaggcagc 1560 ttgagttaaa cgaacgtact tgcagatgtg 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cgcatctcgc ccccaggggc actgcctgga 2460 agattcagga gcctgggcgg ccttcgctta ctctcacctg cttctgagtt gcccaggaga 2520 ccactggcag atgtcccggc gaagagaaga gacacattgt tggaagaagc agcccatgac 2580 agctcccctt cctgggactc gccctcatcc tcttcctgct ccccttcctg gggtgcagcc 2640 taaaaggacc tatgtcctca caccattgaa accactagtt ctgtcccccc aggagacctg 2700 gttgtgtgtg tgtgagtggt tgaccttcct ccatcccctg gtccttccct tcccttcccg 2760 aggcacagag agacagggca ggatccacgt gcccattgtg gaggcagaga aaagagaaag 2820 tgttttatat acggtactta tttaatatcc ctttttaatt agaaattaaa acagttaatt 2880 taattaaaga gtagggtttt ttttcagtat tcttggttaa tatttaattt caactattta 2940 tgagatgtat cttttgctct ctcttgctct cttatttgta ccggtttttg tatataaaat 3000 tcatgtttcc aatctctctc tccctgatcg gtgacagtca ctagcttatc ttgaacagat 3060 atttaatttt gctaacactc agctctgccc tccccgatcc cctggctccc cagcacacat 3120 tcctttgaaa taaggtttca atatacatct acatactata tatatatttg gcaacttgta 3180 tttgtgtgta tatatatata tatatgttta tgtatatatg tgattctgat aaaatagaca 3240 ttgctattct gttttttata tgtaaaaaca aaacaagaaa aaatagagaa ttctacatac 3300 taaatctctc tcctttttta attttaatat ttgttatcat ttatttattg gtgctactgt 3360 ttatccgtaa taattgtggg gaaaagatat taacatcacg tctttgtctc tagtgcagtt 3420 tttcgagata ttccgtagta catatttatt tttaaacaac gacaaagaaa tacagatata 3480 tcttaaaaaa aaaaaagcat tttgtattaa agaatttaat tctgatctca aaaaaaaaaa 3540 aa 3542 <210> 10 <211> 371 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 10 Met Thr Asp Arg Gln Thr Asp Thr Ala Pro Ser Pro Ser Tyr His Leu 1 5 10 15 Leu Pro Gly Arg Arg Arg Thr Val Asp Ala Ala Ala Ser Arg Gly Gln 20 25 30 Gly Pro Glu Pro Ala Pro Gly Gly Gly Val Glu Gly Val Gly Ala Arg 35 40 45 Gly Val Ala Leu Lys Leu Phe Val Gln Leu Leu Gly Cys Ser Arg Phe 50 55 60 Gly Gly Ala Val Val Arg Ala Gly Glu Ala Glu Pro Ser Gly Ala Ala 65 70 75 80 Arg Ser Ala Ser Ser Gly Arg Glu Glu Pro Gln Pro Glu Glu Gly Glu 85 90 95 Glu Glu Glu Glu Lys Glu Glu Glu Arg Gly Pro Gln Trp Arg Leu Gly 100 105 110 Ala Arg Lys Pro Gly Ser Trp Thr Gly Glu Ala Ala Val Cys Ala Asp 115 120 125 Ser Ala Pro Ala Ala 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Ser Arg Gly Gln 20 25 30 Gly Pro Glu Pro Ala Pro Gly Gly Gly Val Glu Gly Val Gly Ala Arg 35 40 45 Gly Val Ala Leu Lys Leu Phe Val Gln Leu Leu Gly Cys Ser Arg Phe 50 55 60 Gly Gly Ala Val Val Arg Ala Gly Glu Ala Glu Pro Ser Gly Ala Ala 65 70 75 80 Arg Ser Ala Ser Ser Gly Arg Glu Glu Pro Gln Pro Glu Glu Gly Glu 85 90 95 Glu Glu Glu Glu Lys Glu Glu Glu Arg Gly Pro Gln Trp Arg Leu Gly 100 105 110 Ala Arg Lys Pro Gly Ser Trp Thr Gly Glu Ala Ala Val Cys Ala Asp 115 120 125 Ser Ala Pro Ala Ala Arg Ala Pro Gln Ala Leu Ala Arg Ala Ser Gly 130 135 140 Arg Gly Gly Arg Val Ala Arg Arg Gly Ala Glu Glu Ser Gly Pro Pro 145 150 155 160 His Ser Pro Ser Arg Arg Gly Ser Ala Ser Arg Ala Gly Pro Gly Arg 165 170 175 Ala Ser Glu Thr Met Asn Phe Leu Leu Ser Trp Val His Trp Ser Leu 180 185 190 Ala Leu Leu Leu Tyr Leu His His Ala Lys Trp Ser Gln Ala Ala Pro 195 200 205 Met Ala Glu Gly Gly Gly Gln Asn His His Glu Val Val Lys Phe Met 210 215 220 Asp Val Tyr Gln Arg Ser Tyr Cys His Pro Ile Glu Thr Leu Val Asp 225 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ccccgcccag gcccctgtct cccagcctga 120 tgcccctggc caccagagga aagtggtgtc atggatagat gtgtatactc gcgctacctg 180 ccagccccgg gaggtggtgg tgcccttgac tgtggagctc atgggcaccg tggccaaaca 240 gctggtgccc agctgcgtga ctgtgcagcg ctgtggtggc tgctgccctg acgatggcct 300 ggagtgtgtg cccactgggc agcaccaagt ccggatgcag atcctcatga tccggtaccc 360 gagcagtcag ctgggggaga tgtccctgga agaacacagc cagtgtgaat gcagacctaa 420 aaaaaaggac agtgctgtga agccagacag ggctgccact ccccaccacc gtccccagcc 480 ccgttctgtt ccgggctggg actctgcccc cggagcaccc tccccagctg acatcaccca 540 tcccactcca gccccaggcc cctctgccca cgctgcaccc agcaccacca gcgccctgac 600 ccccggacct gccgctgccg ctgccgacgc cgcagcttcc tccgttgcca agggcggggc 660 ttagagctca acccagacac ctgcaggtgc cggaagctgc gaaggtgaca catggctttt 720 cagactcagc agggtgactt gcctcagagg ctatatccca gtgggggaac aaagaggagc 780 ctggtaaaaa acagccaagc ccccaagacc tcagcccagg cagaagctgc tctaggacct 840 gggcctctca gagggctctt ctgccatccc ttgtctccct gaggccatca tcaaacagga 900 cagagttgga agaggagact gggaggcagc aagaggggtc acataccagc tcaggggaga 960 atggagtact gtctcagttt ctaaccactc tgtgcaagta agcatcttac aactggctct 1020 tcctcccctc actaagaaga cccaaacctc tgcataatgg gatttgggct ttggtacaag 1080 aactgtgacc cccaaccctg ataaaagaga tggaaggaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1140 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aa 1172 <210> 16 <211> 207 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 16 Met Ser Pro Leu Leu Arg Arg Leu Leu Leu Ala Ala Leu Leu Gln Leu 1 5 10 15 Ala Pro Ala Gln Ala Pro Val Ser Gln Pro Asp Ala Pro Gly His Gln 20 25 30 Arg Lys Val Val Ser Trp Ile Asp Val Tyr Thr Arg Ala Thr Cys Gln 35 40 45 Pro Arg Glu Val Val Val Pro Leu Thr Val Glu Leu Met Gly Thr Val 50 55 60 Ala Lys Gln Leu Val Pro Ser Cys Val Thr Val Gln Arg Cys Gly Gly 65 70 75 80 Cys Cys Pro Asp Asp Gly Leu Glu Cys Val Pro Thr Gly Gln His Gln 85 90 95 Val Arg Met Gln Ile Leu Met Ile Arg Tyr Pro Ser Ser Gln Leu Gly 100 105 110 Glu Met Ser Leu Glu Glu His Ser Gln Cys Glu Cys Arg Pro Lys Lys 115 120 125 Lys Asp Ser Ala Val Lys Pro Asp Arg Ala Ala Thr Pro His His Arg 130 135 140 Pro Gln Pro Arg Ser Val Pro Gly Trp Asp Ser Ala Pro Gly Ala Pro 145 150 155 160 Ser Pro Ala Asp Ile Thr His Pro Thr Pro Ala Pro Gly Pro Ser Ala 165 170 175 His Ala Ala Pro Ser Thr Thr Ser Ala Leu Thr Pro Gly Pro Ala Ala 180 185 190 Ala Ala Ala Asp Ala Ala Ala Ser Ser Val Ala Lys Gly Gly Ala 195 200 205 <210> 17 <211> 2076 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 17 cggggaaggg gagggaggag ggggacgagg gctctggcgg gtttggaggg gctgaacatc 60 gcggggtgtt ctggtgtccc ccgccccgcc tctccaaaaa gctacaccga cgcggaccgc 120 ggcggcgtcc tccctcgccc tcgcttcacc tcgcgggctc cgaatgcggg gagctcggat 180 gtccggtttc ctgtgaggct tttacctgac acccgccgcc tttccccggc actggctggg 240 agggcgccct gcaaagttgg gaacgcggag ccccggaccc gctcccgccg cctccggctc 300 gcccaggggg ggtcgccggg aggagcccgg gggagaggga ccaggagggg cccgcggcct 360 cgcaggggcg cccgcgcccc cacccctgcc cccgccagcg gaccggtccc ccacccccgg 420 tccttccacc atgcacttgc tgggcttctt ctctgtggcg tgttctctgc tcgccgctgc 480 gctgctcccg ggtcctcgcg aggcgcccgc cgccgccgcc gccttcgagt ccggactcga 540 cctctcggac gcggagcccg acgcgggcga ggccacggct tatgcaagca aagatctgga 600 ggagcagtta cggtctgtgt ccagtgtaga tgaactcatg actgtactct acccagaata 660 ttggaaaatg tacaagtgtc agctaaggaa aggaggctgg caacataaca gagaacaggc 720 caacctcaac tcaaggacag aagagactat aaaatttgct gcagcacatt ataatacaga 780 gatcttgaaa agtattgata atgagtggag aaagactcaa tgcatgccac gggaggtgtg 840 tatagatgtg gggaaggagt ttggagtcgc gacaaacacc ttctttaaac ctccatgtgt 900 gtccgtctac agatgtgggg gttgctgcaa tagtgagggg ctgcagtgca tgaacaccag 960 cacgagctac ctcagcaaga cgttatttga aattacagtg cctctctctc aaggccccaa 1020 accagtaaca atcagttttg ccaatcacac ttcctgccga tgcatgtcta aactggatgt 1080 ttacagacaa gttcattcca ttattagacg ttccctgcca gcaacactac cacagtgtca 1140 ggcagcgaac aagacctgcc ccaccaatta catgtggaat aatcacatct gcagatgcct 1200 ggctcaggaa gattttatgt tttcctcgga tgctggagat gactcaacag atggattcca 1260 tgacatctgt ggaccaaaca aggagctgga tgaagagacc tgtcagtgtg tctgcagagc 1320 ggggcttcgg cctgccagct gtggacccca caaagaacta gacagaaact catgccagtg 1380 tgtctgtaaa aacaaactct tccccagcca atgtggggcc aaccgagaat ttgatgaaaa 1440 cacatgccag tgtgtatgta aaagaacctg ccccagaaat caacccctaa atcctggaaa 1500 atgtgcctgt gaatgtacag aaagtccaca gaaatgcttg ttaaaaggaa agaagttcca 1560 ccaccaaaca tgcagctgtt acagacggcc atgtacgaac cgccagaagg cttgtgagcc 1620 aggattttca tatagtgaag aagtgtgtcg ttgtgtccct tcatattgga aaagaccaca 1680 aatgagctaa gattgtactg ttttccagtt catcgatttt ctattatgga aaactgtgtt 1740 gccacagtag aactgtctgt gaacagagag acccttgtgg gtccatgcta acaaagacaa 1800 aagtctgtct ttcctgaacc atgtggataa ctttacagaa atggactgga gctcatctgc 1860 aaaaggcctc ttgtaaagac tggttttctg ccaatgacca aacagccaag attttcctct 1920 tgtgatttct ttaaaagaat gactatataa tttatttcca ctaaaaatat tgtttctgca 1980 ttcattttta tagcaacaac aattggtaaa actcactgtg atcaatattt ttatatcatg 2040 caaaatatgt ttaaaataaa atgaaaattg tattat 2076 <210> 18 <211> 419 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 18 Met His Leu Leu Gly Phe Phe Ser Val Ala Cys Ser Leu Leu Ala Ala 1 5 10 15 Ala Leu Leu Pro Gly Pro Arg Glu Ala Pro Ala Ala Ala Ala Ala Phe 20 25 30 Glu Ser Gly Leu Asp Leu Ser Asp Ala Glu Pro Asp Ala Gly Glu Ala 35 40 45 Thr Ala Tyr Ala Ser Lys Asp Leu Glu Glu Gln Leu Arg Ser Val Ser 50 55 60 Ser Val Asp Glu Leu Met Thr Val Leu Tyr Pro Glu Tyr Trp Lys Met 65 70 75 80 Tyr Lys Cys Gln Leu Arg Lys Gly Gly Trp Gln His Asn Arg Glu Gln 85 90 95 Ala Asn Leu Asn Ser Arg Thr Glu Glu Thr Ile Lys Phe Ala Ala Ala 100 105 110 His Tyr Asn Thr Glu Ile Leu Lys Ser Ile Asp Asn Glu Trp Arg Lys 115 120 125 Thr Gln Cys Met Pro Arg Glu Val Cys Ile Asp Val Gly Lys Glu Phe 130 135 140 Gly Val Ala Thr Asn Thr Phe Phe Lys Pro Pro Cys Val Ser Val Tyr 145 150 155 160 Arg Cys Gly Gly Cys Cys Asn Ser Glu Gly Leu Gln Cys Met Asn Thr 165 170 175 Ser Thr Ser Tyr Leu Ser Lys Thr Leu Phe Glu Ile Thr Val Pro Leu 180 185 190 Ser Gln Gly Pro Lys Pro Val Thr Ile Ser Phe Ala Asn His Thr Ser 195 200 205 Cys Arg Cys Met Ser Lys Leu Asp Val Tyr Arg Gln Val His Ser Ile 210 215 220 Ile Arg Arg Ser Leu Pro Ala Thr Leu Pro Gln Cys Gln Ala Ala Asn 225 230 235 240 Lys Thr Cys Pro Thr Asn Tyr Met Trp Asn Asn His Ile Cys Arg Cys 245 250 255 Leu Ala Gln Glu Asp Phe Met Phe Ser Ser Asp Ala Gly Asp Asp Ser 260 265 270 Thr Asp Gly Phe His Asp Ile Cys Gly Pro Asn Lys Glu Leu Asp Glu 275 280 285 Glu Thr Cys Gln Cys Val Cys Arg Ala Gly Leu Arg Pro Ala Ser Cys 290 295 300 Gly Pro His Lys Glu Leu Asp Arg Asn Ser Cys Gln Cys Val Cys Lys 305 310 315 320 Asn Lys Leu Phe Pro Ser Gln Cys Gly Ala Asn Arg Glu Phe Asp Glu 325 330 335 Asn Thr Cys Gln Cys Val Cys Lys Arg Thr Cys Pro Arg Asn Gln Pro 340 345 350 Leu Asn Pro Gly Lys Cys Ala Cys Glu Cys Thr Glu Ser Pro Gln Lys 355 360 365 Cys Leu Leu Lys Gly Lys Lys Phe His His Gln Thr Cys Ser Cys Tyr 370 375 380 Arg Arg Pro Cys Thr Asn Arg Gln Lys Ala Cys Glu Pro Gly Phe Ser 385 390 395 400 Tyr Ser Glu Glu Val Cys Arg Cys Val Pro Ser Tyr Trp Lys Arg Pro 405 410 415 Gln Met Ser <210> 19 <211> 2128 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 19 caagacttct ctgcattttc tgccaaaatc tgtgtcagat ttaagacaca tgcttctgca 60 agcttccatg aaggttgtgc aaaaaagttt caatccagag ttgggttcca gctttctgta 120 gctgtaagca ttggtggcca caccacctcc ttacaaagca actagaacct gcggcataca 180 ttggagagat ttttttaatt ttctggacat gaagtaaatt tagagtgctt tctaatttca 240 ggtagaagac atgtccacct tctgattatt tttggagaac attttgattt ttttcatctc 300 tctctcccca cccctaagat tgtgcaaaaa aagcgtacct tgcctaattg aaataatttc 360 attggatttt gatcagaact gattatttgg ttttctgtgt gaagttttga ggtttcaaac 420 tttccttctg gagaatgcct tttgaaacaa ttttctctag ctgcctgatg tcaactgctt 480 agtaatcagt ggatattgaa atattcaaaa tgtacagaga gtgggtagtg gtgaatgttt 540 tcatgatgtt gtacgtccag ctggtgcagg gctccagtaa tgaacatgga ccagtgaagc 600 gatcatctca gtccacattg gaacgatctg aacagcagat cagggctgct tctagtttgg 660 aggaactact tcgaattact cactctgagg actggaagct gtggagatgc aggctgaggc 720 tcaaaagttt taccagtatg gactctcgct cagcatccca tcggtccact aggtttgcgg 780 caactttcta tgacattgaa acactaaaag ttatagatga agaatggcaa agaactcagt 840 gcagccctag agaaacgtgc gtggaggtgg ccagtgagct ggggaagagt accaacacat 900 tcttcaagcc cccttgtgtg aacgtgttcc gatgtggtgg ctgttgcaat gaagagagcc 960 ttatctgtat gaacaccagc acctcgtaca tttccaaaca gctctttgag atatcagtgc 1020 ctttgacatc agtacctgaa ttagtgcctg ttaaagttgc caatcataca ggttgtaagt 1080 gcttgccaac agccccccgc catccatact caattatcag aagatccatc cagatccctg 1140 aagaagatcg ctgttcccat tccaagaaac tctgtcctat tgacatgcta tgggatagca 1200 acaaatgtaa atgtgttttg caggaggaaa atccacttgc tggaacagaa gaccactctc 1260 atctccagga accagctctc tgtgggccac acatgatgtt tgacgaagat cgttgcgagt 1320 gtgtctgtaa aacaccatgt cccaaagatc taatccagca ccccaaaaac tgcagttgct 1380 ttgagtgcaa agaaagtctg gagacctgct gccagaagca caagctattt cacccagaca 1440 cctgcagctg tgaggacaga tgcccctttc ataccagacc atgtgcaagt ggcaaaacag 1500 catgtgcaaa gcattgccgc tttccaaagg agaaaagggc tgcccagggg ccccacagcc 1560 gaaagaatcc ttgattcagc gttccaagtt ccccatccct gtcattttta acagcatgct 1620 gctttgccaa gttgctgtca ctgttttttt cccaggtgtt aaaaaaaaaa tccattttac 1680 acagcaccac agtgaatcca gaccaacctt ccattcacac cagctaagga gtccctggtt 1740 cattgatgga tgtcttctag ctgcagatgc ctctgcgcac caaggaatgg agaggagggg 1800 acccatgtaa tccttttgtt tagttttgtt tttgtttttt ggtgaatgag aaaggtgtgc 1860 tggtcatgga atggcaggtg tcatatgact gattactcag agcagatgag gaaaactgta 1920 gtctctgagt cctttgctaa tcgcaactct tgtgaattat tctgattctt ttttatgcag 1980 aatttgattc gtatgatcag tactgacttt ctgattactg tccagcttat agtcttccag 2040 tttaatgaac taccatctga tgtttcatat ttaagtgtat ttaaagaaaa taaacaccat 2100 tattcaagcc aaaaaaaaaa aaaaaaaa 2128 <210> 20 <211> 354 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 20 Met Tyr Arg Glu Trp Val Val Val Asn Val Phe Met Met Leu Tyr Val 1 5 10 15 Gln Leu Val Gln Gly Ser Ser Asn Glu His Gly Pro Val Lys Arg Ser 20 25 30 Ser Gln Ser Thr Leu Glu Arg Ser Glu Gln Gln Ile Arg Ala Ala Ser 35 40 45 Ser Leu Glu Glu Leu Leu Arg Ile Thr His Ser Glu Asp Trp Lys Leu 50 55 60 Trp Arg Cys Arg Leu Arg Leu Lys Ser Phe Thr Ser Met Asp Ser Arg 65 70 75 80 Ser Ala Ser His Arg Ser Thr Arg Phe Ala Ala Thr Phe Tyr Asp Ile 85 90 95 Glu Thr Leu Lys Val Ile Asp Glu Glu Trp Gln Arg Thr Gln Cys Ser 100 105 110 Pro Arg Glu Thr Cys Val Glu Val Ala Ser Glu Leu Gly Lys Ser Thr 115 120 125 Asn Thr Phe Phe Lys Pro Pro Cys Val Asn Val Phe Arg Cys Gly Gly 130 135 140 Cys Cys Asn Glu Glu Ser Leu Ile Cys Met Asn Thr Ser Thr Ser Tyr 145 150 155 160 Ile Ser Lys Gln Leu Phe Glu Ile Ser Val Pro Leu Thr Ser Val Pro 165 170 175 Glu Leu Val Pro Val Lys Val Ala Asn His Thr Gly Cys Lys Cys Leu 180 185 190 Pro Thr Ala Pro Arg His Pro Tyr Ser Ile Ile Arg Arg Ser Ile Gln 195 200 205 Ile Pro Glu Glu Asp Arg Cys Ser His Ser Lys Lys Leu Cys Pro Ile 210 215 220 Asp Met Leu Trp Asp Ser Asn Lys Cys Lys Cys Val Leu Gln Glu Glu 225 230 235 240 Asn Pro Leu Ala Gly Thr Glu Asp His Ser His Leu Gln Glu Pro Ala 245 250 255 Leu Cys Gly Pro His Met Met Phe Asp Glu Asp Arg Cys Glu Cys Val 260 265 270 Cys Lys Thr Pro Cys Pro Lys Asp Leu Ile Gln His Pro Lys Asn Cys 275 280 285 Ser Cys Phe Glu Cys Lys Glu Ser Leu Glu Thr Cys Cys Gln Lys His 290 295 300 Lys Leu Phe His Pro Asp Thr Cys Ser Cys Glu Asp Arg Cys Pro Phe 305 310 315 320 His Thr Arg Pro Cys Ala Ser Gly Lys Thr Ala Cys Ala Lys His Cys 325 330 335 Arg Phe Pro Lys Glu Lys Arg Ala Ala Gln Gly Pro His Ser Arg Lys 340 345 350 Asn Pro <210> 21 <211> 1758 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 21 ctgctgtctg cggaggaaac tgcatcgacg gacggccgcc cagctacggg aggacctgga 60 gtggcactgg gcgcccgacg gaccatcccc gggacccgcc tgcccctcgg cgccccgccc 120 cgccgggccg ctccccgtcg ggttccccag ccacagcctt acctacgggc tcctgactcc 180 gcaaggcttc cagaagatgc tcgaaccacc ggccggggcc tcggggcagc agtgagggag 240 gcgtccagcc ccccactcag ctcttctcct cctgtgccag gggctccccg ggggatgagc 300 atggtggttt tccctcggag ccccctggct cgggacgtct gagaagatgc cggtcatgag 360 gctgttccct tgcttcctgc agctcctggc cgggctggcg ctgcctgctg tgccccccca 420 gcagtgggcc ttgtctgctg ggaacggctc gtcagaggtg gaagtggtac ccttccagga 480 agtgtggggc cgcagctact gccgggcgct ggagaggctg gtggacgtcg tgtccgagta 540 ccccagcgag gtggagcaca tgttcagccc atcctgtgtc tccctgctgc gctgcaccgg 600 ctgctgcggc gatgagaatc tgcactgtgt gccggtggag acggccaatg tcaccatgca 660 gctcctaaag atccgttctg gggaccggcc ctcctacgtg gagctgacgt tctctcagca 720 cgttcgctgc gaatgccggc ctctgcggga gaagatgaag ccggaaagga ggagacccaa 780 gggcaggggg aagaggagga gagagaagca gagacccaca gactgccacc tgtgcggcga 840 tgctgttccc cggaggtaac ccaccccttg gaggagagag accccgcacc cggctcgtgt 900 atttattacc gtcacactct tcagtgactc ctgctggtac ctgccctcta tttattagcc 960 aactgtttcc ctgctgaatg cctcgctccc ttcaagacga ggggcaggga aggacaggac 1020 cctcaggaat tcagtgcctt caacaacgtg agagaaagag agaagccagc cacagacccc 1080 tgggagcttc cgctttgaaa gaagcaagac acgtggcctc gtgaggggca agctaggccc 1140 cagaggccct ggaggtctcc aggggcctgc agaaggaaag aagggggccc tgctacctgt 1200 tcttgggcct caggctctgc acagacaagc agcccttgct ttcggagctc ctgtccaaag 1260 tagggatgcg gatcctgctg gggccgccac ggcctggctg gtgggaaggc cggcagcggg 1320 cggaggggat ccagccactt ccccctcttc ttctgaagat cagaacattc agctctggag 1380 aacagtggtt gcctgggggc ttttgccact ccttgtcccc cgtgatctcc cctcacactt 1440 tgccatttgc ttgtactggg acattgttct ttccggccaa ggtgccacca ccctgccccc 1500 cctaagagac acatacagag tgggccccgg gctggagaaa gagctgcctg gatgagaaac 1560 agctcagcca gtggggatga ggtcaccagg ggaggagcct gtgcgtccca gctgaaggca 1620 gtggcagggg agcaggttcc ccaagggccc tggcaccccc acaagctgtc cctgcagggc 1680 catctgactg ccaagccaga ttctcttgaa taaagtattc tagtgtggaa aaaaaaaaaa 1740 aaaaaaaaaa aaaaaaaa 1758 <210> 22 <211> 170 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 22 Met Pro Val Met Arg Leu Phe Pro Cys Phe Leu Gln Leu Leu Ala Gly 1 5 10 15 Leu Ala Leu Pro Ala Val Pro Pro Gln Gln Trp Ala Leu Ser Ala Gly 20 25 30 Asn Gly Ser Ser Glu Val Glu Val Val Pro Phe Gln Glu Val Trp Gly 35 40 45 Arg Ser Tyr Cys Arg Ala Leu Glu Arg Leu Val Asp Val Val Ser Glu 50 55 60 Tyr Pro Ser Glu Val Glu His Met Phe Ser Pro Ser Cys Val Ser Leu 65 70 75 80 Leu Arg Cys Thr Gly Cys Cys Gly Asp Glu Asn Leu His Cys Val Pro 85 90 95 Val Glu Thr Ala Asn Val Thr Met Gln Leu Leu Lys Ile Arg Ser Gly 100 105 110 Asp Arg Pro Ser Tyr Val Glu Leu Thr Phe Ser Gln His Val Arg Cys 115 120 125 Glu Cys Arg Pro Leu Arg Glu Lys Met Lys Pro Glu Arg Arg Arg Pro 130 135 140 Lys Gly Arg Gly Lys Arg Arg Arg Glu Lys Gln Arg Pro Thr Asp Cys 145 150 155 160 His Leu Cys Gly Asp Ala Val Pro Arg Arg 165 170 <210> 23 <211> 11 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <400> 23 Lys Thr Ser Gln Asn Ile Phe Glu Asn Leu Ala 1 5 10 <210> 24 <211> 7 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <400> 24 Asn Ala Ser Pro Leu Gln Ala 1 5 <210> 25 <211> 8 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <400> 25 His Gln Tyr Tyr Ser Gly Tyr Thr 1 5 <210> 26 <211> 10 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <400> 26 Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr His Met Ala 1 5 10 <210> 27 <211> 17 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <400> 27 Ser Ile Thr Leu Asp Ala Thr Tyr Thr Tyr Tyr Arg Asp Ser Val Arg 1 5 10 15 Gly <210> 28 <211> 10 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <400> 28 His Arg Gly Phe Ser Val Trp Leu Asp Tyr 1 5 10

Claims (320)

  1. 흑색종 분화-관련 유전자 7(melanoma differentiation-associated gene 7: MDA-7)과 MDA-7 병용제를 포함하고, 당해 병용제가 베바시주마브, 셀레콕시브, 겔다나마이신, 비타민 E 숙시네이트 또는 TNF-α인, 암 치료용 약제학적 조성물.
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  5. 제1항에 있어서, 상기 MDA-7 병용제가 베바시주마브인, 약제학적 조성물.
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  11. 제1항에 있어서, 상기 MDA-7 병용제가 셀레콕시브인, 약제학적 조성물.
  12. 제1항에 있어서, 상기 MDA-7 병용제가 TNF-α인, 약제학적 조성물.
  13. 제1항에 있어서, 상기 겔다나마이신이 17-GAA인, 약제학적 조성물.
  14. 제1항에 있어서, 상기 MDA-7 병용제가 비타민 E 숙시네이트인, 약제학적 조성물.
  15. 제1항에 있어서, 상기 MDA-7이 환자에서 발현되는 MDA-7 폴리펩타이드를 암호화하는 서열을 갖는 핵산의 형태로 존재하는, 약제학적 조성물.
  16. 제15항에 있어서, 상기 핵산이 바이러스 벡터 중에 존재하는, 약제학적 조성물.
  17. 제16항에 있어서, 상기 바이러스 벡터가 아데노바이러스 벡터인, 약제학적 조성물.
  18. 제1항에 있어서, 하나 이상의 지질을 포함하는 약제학적 조성물.
  19. 제18항에 있어서, DOTAP 및 콜레스테롤 또는 이들의 유도체를 포함하는 약제학적 조성물.
  20. 제1항에 있어서, 상기 MDA-7이 MDA-7 단백질의 형태로 존재하는, 약제학적 조성물.
  21. 제1항에 있어서, 상기 MDA-7이 환자에게 정맥내로, 피부내로, 동맥내로, 복강내로, 병소내로, 두개골내로, 관절내로, 전립선내로, 흉막내로, 기관내로, 비강내로, 유리체강내로, 질내로, 직장내로, 국소적으로, 종양내로, 근육내로, 피하로, 결막하로, 소포내로, 점막으로, 심장막내로, 제대내로, 안내로, 경구적으로, 국지적으로, 국부적으로, 흡입으로, 주사로, 주입으로, 연속 주입으로, 직접적으로 표적 세포의 국소 관류 목욕(localized perfusion bathing)으로, 카테터를 통해, 또는 세척을 통해 투여되는, 약제학적 조성물.
  22. 제1항에 있어서, 상기 암이 흑색종, 비소세포폐암, 소세포폐암, 폐암, 간암종, 망막모세포종, 성상세포종, 아교모세포종, 치은암, 설암, 백혈병, 신경모세포종, 두부암, 경부암, 유방암, 췌장암, 전립선암, 신장암, 골암, 고환암, 난소암, 중피종, 자궁경부암, 위장암, 림프종, 뇌종양, 결장암, 또는 방광암인, 약제학적 조성물.
  23. 제1항에 있어서, 방사선요법 및/또는 화학요법과 병용되는 약제학적 조성물.
  24. 제23항에 있어서, 방사선요법과 병용되는 약제학적 조성물.
  25. 제23항에 있어서, 화학요법과 병용되는 약제학적 조성물.
  26. 제1항에 있어서, 상기 MDA-7이 MDA-7 병용제 전에 투여되는, 약제학적 조성물.
  27. 제1항에 있어서, 상기 MDA-7이 MDA-7 병용제 후에 투여되는, 약제학적 조성물.
  28. 제1항에 있어서, 상기 MDA-7이 MDA-7 병용제와 동시에 투여되는, 약제학적 조성물.
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