CN101690801A - 白细胞介素-1受体拮抗剂的用途及其药物组合物 - Google Patents

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Abstract

一种生物医药领域的白细胞介素-1受体拮抗剂的用途及其药物组合物。本发明公开一种如下(a)或(b)的蛋白在制备预防或治疗肠道黏膜上皮细胞损伤疾病药物中的用途：(a)其氨基酸序列如SEQID NO：1所示的蛋白；(b)具有与(a)中的氨基酸序列至少70％同源性且具有预防或治疗肠道黏膜上皮细胞损伤疾病效果的蛋白。本发明所述蛋白能有效预防或治疗肠道黏膜上皮细胞损伤疾病，并且能够减少腹泻和体重降低的发生，降低和改善化疗对小肠的损伤。

Description

白细胞介素-1受体拮抗剂的用途及其药物组合物
技术领域
本发明涉及一种生物医药领域的用途及药物组合物，具体涉及一种白细胞介素-1受体拮抗剂的用途及其药物组合物。
背景技术
正常小肠黏膜由黏膜上皮、固有层和黏膜肌层组成，黏膜上皮由一连续的单层柱状上皮细胞组成，为黏膜最表层，它连同固有层向肠腔呈指状突起称为肠绒毛，绒毛根部的上皮下陷至固有层，形成管状的肠隐窝。原始上皮细胞在隐窝处分裂增殖然后向绒毛顶端移行，并在移行过程中达到生理成熟，一般上皮细胞达到绒毛中部即具备完好的功能。小肠绒毛的更新即通过绒毛顶端的老年上皮细胞不断脱落到肠腔、隐窝处的细胞不断增生向上补充来实现。小肠上皮的周转率很快，成人3～6天整个黏膜更新一次，估计每分钟小肠上皮丧失2～5×107个细胞。
肠黏膜损伤时肠道黏膜上皮细胞更新减慢，肠黏膜上皮细胞萎缩、变性及脱落。目前对肠黏膜损伤的防护措施主要采用肠内外营养的方法，通过营养液提供肠黏膜免疫细胞足够的营养基质。含谷氨酰胺、精氨酸等特殊营养物质的免疫增强型肠内营养制剂近年来越来越多地应用于临床，这些物质能够刺激黏膜免疫应答，调解细胞因子的产生和释放，减轻过度炎性反应，促进黏膜的修复(Li，Y.，Z.Yu，F.Liu，L.et al.Tumori 2006(92)：396～401；Barasch，A.，D.E.Peterson.Oral Oncol 2003(39)：91-100；Goncharova，G.I.，V.G.Dorofeichuk，A.Z.Smolianskaia，et al.Antibiot Khimioter 1998(34)：462-466)。另外，临床上也使用双歧杆菌制剂以及中草药来减轻化疗药物对肠黏膜的损害(Boerma，M.，J.Wang，A.F.Burnett，et al.Cancer Res 2007(67)：9501-9506)。小肠黏膜上皮细胞分泌的细胞因子和趋化因子对小肠功能的稳定起到重要调节作用，已经有越来越多的研究集中到这些因子在化疗中肠黏膜的损伤和修复所扮演的角色。IL-11可明显降低放化疗小鼠的黏膜损伤，并且在损伤前和损伤后对黏膜细胞可发挥不同的效应，达到保护黏膜降低损伤并促进损伤后再生的作用(Gibson，R.J.，D.M.Keefe，F.M.Thompson，et al.Dig DisSci 2002(47)：2751～2757；Naugler，K.M.，K.A.Baer，and M.J.Ropeleski.2008 Am JPhysiol Gastrointest Liver Physiol)。最新研究成果认为，其发挥作用是通过MEK相关的通路进行(Kim，K.A.，M.Kakitani，J.Zhao，et al.Science 2005(309)：1256-1259.)。2005年Klm等发现人生长因子R-spondin 1能够显著增加隐窝上皮细胞的增殖，导致小肠和大肠的变粗和延长，并且能够降低与化疗药物5-氟尿嘧啶有关的细胞损坏，减少腹泻和体重降低的发生(Kim，K.A.，J.Zhao，et al.Cell Cycle 2006(5)：23～26；Booth，D.，J.D.Haley，A.M.Bruskin，et al.Iht J Cancer 2000(86)：53～59.)。TGF-β3能够通过将上皮细胞抑制在细胞周期的G0或G1期从而起到化疗保护的作用(Farrell，C.L.，J.V.Bready，K.L.Rex，et al.Cancer Res 1998(58)：933～939)。KGF是另一个对黏膜上皮细胞具有促进增生和化疗保护作用的因子，在化疗中提前使用能够大大提高隐窝细胞存活的比例(Gibson，R.J.，J.M.Bowen，and D.M.Keefe.et al.Iht J Cancer2005(116)：464-470；Dinarello.Blood 1996(87)：2095～2147)。但是，这些生长因子的安全性尚未被完全证实，有学者认为生长因子能促进有生长因子受体的肿瘤细胞的生长，故而限制了此类药物的应用。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种白细胞介素-1受体拮抗
剂的用途及其药物组合物。本发明所述蛋白能有效预防或治疗肠道黏膜上皮细胞损伤疾病，并且能够减少腹泻和体重降低的发生，降低和改善化疗对小肠的损伤。
本发明一方面公开了一种如下(a)或(b)的蛋白在制备预防或治疗肠道黏膜上皮细胞损伤疾病药物中的用途：
(a)其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示的蛋白(IL-1Ra)；
(b)具有与(a)中的氨基酸序列至少70％同源性且具有预防或治疗肠道黏膜上皮细胞损伤疾病效果的蛋白。
在一些实施方式中，所述肠道黏膜上皮细胞损伤疾病为缺血缺氧、毒素、射线或药物导致的肠道黏膜上皮细胞损伤疾病。
在一些实施方式中，所述药物为化疗药物，其中化疗药物可为烷化剂类药物、抗代谢类药物、抗生素类药物、植物类药物、激素类药物、金属络合物或蛋白药物，其中优选为环磷酰胺或5-氟尿嘧啶。
在一些实施方式中，所述(b)的蛋白为具有与(a)中的氨基酸序列至少77％同源性且具有预防或治疗肠道黏膜上皮细胞损伤疾病效果的蛋白。
另一方面，本发明公开了一种药物组合物，包含如下(a)或(b)的蛋白作为活性成分和药学上可接受的载体或赋形剂：
(a)其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示的蛋白；
(b)具有与(a)中的氨基酸序列至少70％同源性且具有预防或治疗肠道黏膜上皮细胞损伤疾病效果的蛋白。
在一些实施方式中，所述(b)的蛋白为具有与(a)中的氨基酸序列至少77％同源性且具有预防或治疗肠道黏膜上皮细胞损伤疾病效果的蛋白。
另一方面，本发明公开了所述蛋白作为活性成分可以预防或治疗肠道黏膜上皮细胞损伤疾病的方法，该方法包括给予患者有效剂量的上述(a)或(b)所述的蛋白。
在一些实施方式中，所述肠道黏膜上皮细胞损伤疾病为化疗药物导致的肠道黏膜上皮细胞损伤疾病时，所述方法可通过化疗药物给药前、化疗药物给药后、或化疗药物给药前和化疗药物给药后中任一方式给予患者有效剂量的上述(a)或(b)所述的蛋白。
与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：本发明提供一种可以促进肠道黏膜上皮细胞增殖或预防或治疗肠道黏膜细胞上皮损伤疾病的药物。本发明所述蛋白能有效预防或治疗肠道黏膜上皮细胞损伤疾病，并且能够减少腹泻和体重降低的发生，降低和改善化疗对小肠的损伤，将极有可能成为一种新的对抗化疗肠黏膜损伤的药物，改善临床肿瘤治疗过程中的不良反应。
附图说明
图1：单次环磷酰胺化疗小鼠中IL-1Ra预防性用药对小肠绒毛长度变化；
图2：单次环磷酰胺化疗小鼠中IL-1Ra预防性用药后小肠HE染色切片；
图3：连续三天环磷酰胺化疗小鼠中IL-1Ra预防性用药对体重的影响；
图4：连续三天环磷酰胺化疗小鼠中IL-1Ra预防性用药对腹泻评分指数的影响；
图5：连续三天环磷酰胺化疗小鼠中IL-1Ra预防性用药对生存曲线的影响；
图6：两次环磷酰胺化疗小鼠中IL-1Ra预防性用药对小鼠体重的影响；
图7：两次环磷酰胺化疗小鼠中IL-1Ra预防性用药对小鼠生存率的影响；
图8：两次环磷酰胺化疗小鼠中IL-1Ra预防性用药对小鼠体重的影响；
图9：三次环磷酰胺化疗小鼠中IL-1Ra预防性用药对小鼠生存率的影响；
图10：单次5-Fu化疗中IL-1Ra治疗性用药对小鼠体重的影响；
图11：单次5-Fu化疗中IL-1Ra治疗性用药对小肠绒毛长度及小肠隐窝深度的作用；
图12：单次5-Fu化疗中IL-1Ra治疗性用药后小肠HE染色切片；
图13：单次5-Fu化疗中IL-1Ra治疗性用药后小肠切片PCNA免疫组化染色；
图14：单次环磷酰胺化疗小鼠中IL-1Ra预防性加治疗性用药对小鼠生存率的影响；
图15：单次环磷酰胺化疗小鼠中IL-1Ra预防性加治疗性用药对腹泻评分指数的影响；
图16：单次环磷酰胺化疗小鼠中IL-1Ra预防性加治疗性用药对小肠绒毛长度及小肠隐窝深度的作用；
图17：单次环磷酰胺化疗小鼠中IL-1Ra预防性加治疗性用药后小肠切片HE染色；
图18：单次环磷酰胺化疗小鼠中IL-1Ra预防性加治疗性用药对对腹泻评分指数的影响；
图19：单次环磷酰胺化疗小鼠中IL-1Ra预防性加治疗性用药对小鼠生存率的影响；
图20：白介素1家族的信号转导途径示意图。
具体实施方式
以下实例将结合附图对本发明作进一步说明。本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。
在本文，术语“肠道黏膜细胞上皮损伤疾病”指因肠道黏膜上皮细胞损伤、死亡或增殖障碍而导致的疾病，包括腹泻、肠炎、因肠道损伤导致的营养功能障碍等。
“白细胞介素-1受体拮抗剂”(interleukin-1 receptor antagonist，IL-1Ra)，与IL-1α、IL-1β三者共同属于IL-1家族成员。IL-1Ra是IL-1α、IL-1β共同的拮抗剂，它的蛋白序列与IL-1α、IL-1β在受体结合部位即C-末端区显著相似。hIL-1Ra的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所述，人(hIL-1Ra)和小鼠的IL-1Ra有77％的同源性，IL-1Ra的生物学作用没有种属特异性。不同细胞产生的IL-1Ra分子量的差异主要由糖基化程度不同所致。已证实，糖基化对IL-1Ra生物学活性无影响(R Daig，G Rogler，E Aschenbrenner，et al.Gut2000(46)：350～358)。
本发明的所述蛋白质优选该物质是hIL-1Ra蛋白质及其突变体；其功能性活性片段或其类似物；具有高度同源性的同系物以及编码包含SEQ ID NO：1描述的氨基酸序列的蛋白质的载体例如DNA载体(质粒或病毒)。功能性活性片段或类似物可通过添加、插入、修饰、取代或缺失以上所列的氨基酸序列中的一或多个氨基酸残基而形成。
术语“类似物”也包括嵌合蛋白质、融合蛋白、抗独特型杭体、上述化合物的前体和其它功能等效物或模拟物。也包括模拟IL-1Ra结合蛋白活性的合成体。
术语“突变体”是指氨基酸序列如SEQ ID NO：1所述hIL-1Ra的突变体。相比于天然的IL-1Ra蛋白，该突变体与它们野生型相比，具有增强的活性和/或改变了的立体专一性。天然蛋白的氨基酸序列突变体可通过向本发明的核苷酸中引入适当的核苷酸变化、或通过体外合成所需多肽来制备。这些突变体包括，例如缺失、插入或替换该氨基酸序列中的残基。可以通过缺失、插入和替换的组合以得到最终的构建体，提供最终的蛋白产品。
蛋白的同源性百分比由GAP(Needleman和Wunsh，1970)分析(GCG程序)确定，其中参数gap creation penalty＝5，gap extension penalty＝0.3。被分析的序列长度至少为15个氨基酸时，GAP分析就在参与测试的两个序列的至少为15个氨基酸的区域进行测试。更优选地，被分析的序列长度至少为50个氨基酸时，GAP分析就在参与测试的两个序列的至少为50个氨基酸的区域进行测试。更优选地，被分析的序列长度至少为100个氨基酸时，GAP分析就在参与测试的两个序列的至少为100个氨基酸的区域进行测试。更优选地，被分析的序列长度至少为250个氨基酸时，GAP分析就在参与测试的两个序列的至少为250个氨基酸的区域进行测试。甚至更优选地，被分析的序列长度至少为500个氨基酸时，GAP分析就在参与测试的两个序列的至少为500个氨基酸的区域进行测试。
本发明涉及的方面还包括IL-1Ra蛋白类似物，在它们合成期间或合成后进行了不同的修饰，例如，通过生物素化、苄基化、糖基化、乙酰化、磷酸化、由已知保护/封闭基团的衍生作用、蛋白水解的切割作用、连接到抗体分子或其它细胞配体上等。这些修饰可以用来增加本发明IL-1RA蛋白的稳定性和/或生物活性。
蛋白的表达
本发明包括编码本发明的IL-1Ra蛋白的DNA以及含有这些DNA的载体、转化体。
本发明中，使用的术语“转化体”(transformant)，即带有异源DNA分子的宿主细胞。
本发明还包括通过合成和重组技术生产本发明所述蛋白的方法。通过本领域已知的方法可以分离和纯化多核苷酸(DNA或RNA)、载体、转化体和生物体。
用于本发明的载体可以是如噬菌体、质粒、粘粒、微型染色体、病毒或逆转录病毒载体。可用于克隆和/或表达本发明的多核苷酸的载体是能在需复制和/或表达多核苷酸的宿主细胞中复制和/或表达多核苷酸的载体。一般说来，多核苷酸和/或载体可用于任何真核或原核细胞，包括哺乳动物细胞(如人(如HeLa)、猴(如Cos)、兔(如兔网织红细胞)、大鼠、仓鼠(如CHO、NSO和幼仓鼠肾细胞)或小鼠细胞(如L细胞))、植物细胞、酵母细胞、昆虫细胞或细菌细胞(如大肠杆菌)。有关适用于多种类型宿主细胞的适当载体的例子可参见例如F.Ausubel et al.，Current Protocols in Molecular Biology.Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience(1992)和Sambrook etal.(1989)。可以使用含有这些多核苷酸的宿主细胞来大量表达可用于例如药物、诊断试剂、疫苗和治疗剂的蛋白质。
已开发出多种方法用于经由互补的粘性末端使多核苷酸与载体可操作相连。例如，可在欲插入载体DNA内的DNA区段添加互补的同聚体序列片段。然后通过互补同聚体尾之间的氢键连接载体和DNA区段以形成重组DNA分子。
含有一或多种限制性位点的合成接头提供了另一种连接DNA区段与载体的方法。用噬菌体T4 DNA聚合酶或大肠杆菌DNA聚合酶I处理通过内切核酸酶限制性消化产生的DNA区段，所述的两种聚合酶用其3’，5’-核酸外切活性除去突出的γ-单链末端，并用其聚合活性补平3’-凹端。因此，这些活性的联合产生了平端DNA区段。然后在能催化平端DNA分子连接的酶，如噬菌体T4 DNA连接酶的存在下将平端区段与摩尔过量的接头分子一起保温。因此，反应产物是末端携有聚合接头序列的DNA区段。然后用适当的限制性酶裂解这些DNA区段，并连接至已用酶裂解的表达载体中，所述酶能产生与所述DNA区段相容的末端。从多个商家可以买到含有多个限制性内切核酸酶位点的合成接头。
多核苷酸插入物应该可操作地连接于同表达多核苷酸的宿主细胞相容的适当启动子上。启动子可以是强启动子和/或诱导型启动子。列举的一些启动子的例子包括噬菌体l PL启动子、大肠杆菌lac、trP、phoA、tac启动子、SV40早期和晚期启动子以及逆转录病毒LTR启动子。其它适当启动子是本领域技术人员已知的。表达重组载体进一步含有转录起始、终止位点，并在转录区含有用于翻译的核糖体结合位点。重组载体表达的转录物的编码部分可包括位于起点处的翻译起始密码子和适当地位于被翻译多肽的末端的终止密码子(UAA，UGA或UAG)。
如上所述，表达载体可包括至少一个选择标记。所述标记包括对真核细胞培养物而言的二氢叶酸还原酶、G418、谷氨酰胺合酶或新霉素抗性；以及用于大肠杆菌和其它细菌培养的四环素、卡那霉素或氨苄青霉素抗性基因。适当宿主的代表性例子包括但不限于：细菌细胞，如大肠杆菌、链霉菌和鼠伤寒沙门氏菌细胞；真菌细胞，如酵母细胞(如酿酒酵母或巴斯德毕赤酵母)；昆虫细胞，如果蝇S2和夜蛾SF9细胞；动物细胞，如CHO，COS，NSO，293和Bowes黑素瘤细胞；和植物细胞。上述宿主细胞的适当培养基和培养条件是本领域已知的。
为了有效地分离纯化或分泌目标蛋白，常常还可利用便于分离纯化的标签蛋白或标签多肽(Tag)。常用的有谷胱甘肽-S-转移酶(glutathione S-transferase，GST)、六聚组氨酸肽(His.Tag)、蛋白质A(protein A)和纤维素结合位点(cellulose binding domain)等。通过特殊性蛋白或多肽与目标蛋白构成融合蛋白的形式，表达后利用所述的标签蛋白或标签多肽的特殊性质可对目标蛋白进行分离和纯化。如His.Tag与Ni-ChelatingSepharose柱特异性结合。所述的标签蛋白或标签多肽可以在纯化后用位点特异性蛋白酶消化去除融合序列，如可用凝血酶、肠激酶和Xa因子等，以获得目标蛋白。
本发明还包括含有本发明的核苷酸序列的宿主细胞，所述核苷酸序列经本领域已知的技术与一或多种异源控制区(如启动子和/或增强子)可操作相连。可以选择能调节插入的基因序列的表达，或能按照所需的特殊方式修饰和加工基因产物的宿主菌株。在某些诱导物的存在下，某些启动子启动的表达会升高；因此，可以控制经基因改造的多肽的表达。另外，不同宿主细胞具有特征性的和特殊的翻译、翻译后加工和修饰(如磷酸化、裂解)蛋白质的机制。可以选择适当的细胞系以确保对表达的外源蛋白质进行合乎需要的修饰和加工。
通过磷酸钙转染、DEAE-葡聚糖介导的转染、阳离子脂质介导的转染、电穿孔、转导、感染或其它方法，即可将本发明的核酸和核酸重组载体导入宿主细胞。所述方法描述于多个标准的实验室手册中，如Davis et al.，Basic Methods In Molecular Biology(1986)。
编码本发明的所述蛋白的多核苷酸可以与含有选择标记的载体连接以在宿主中增殖。一般说来，可在沉淀物，如磷酸钙沉淀物或其与带电脂质的复合物中导入质粒载体。如果载体是病毒，可使用适当的包装细胞系在体外对其进行包装，再转导至宿主细胞。
通过众所周知的技术可以鉴定出被成功转化的细胞，即含有本发明的DNA重组载体的细胞。例如，可培养导入表达重组载体所得的细胞以产生所需多肽。收集并裂解细胞，使用如Southem(1975)J.Mol.Biol.95，503或Berent et al(1985)Biotech.3，208所述的方法，检测其DNA内容物中DNA的存在。或者，使用抗体检测上清液中蛋白质的存在。
通过众所周知的方法从重组细胞培养物中回收和纯化本发明的所述蛋白较为有利，所述方法包括硫酸按或乙醇沉淀、酸提取、阴离子或阳离子交换层析、磷酸纤维素层析、疏水作用层析、亲和层析、羟基磷灰石层析、疏水电荷作用层析和凝集素层析。在一些实施方案中，可使用高效液相层析(HPLC)进行纯化。
在一些实施方案中，可使用上述的一种或多种层析方法纯化本发明的所述蛋白。在其它实施方案中，可使用下述的一种或多种层析柱纯化本发明的所述融合蛋白，所述层析柱有：Q sepharose FF柱、SP sepharose FF柱、Q sepharose High Performance柱、Bluesepharose FF柱、Blue柱、Phenyl Sepharose FF柱、DEAE Sepharose FF、Ni-ChelatingSepharose FF柱或Methyl柱等。
另外，可使用国际公开号WO00/44772(全文列入本文作为参考)中描述的方法纯化本发明的蛋白。本领域技术人员可以容易地改动其中所述的方法以用于纯化本发明的蛋白。可以从包括例如细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞的原核或真核宿主经重组技术产生的产物中回收本发明的蛋白。
组合物
用于本发明或者含有本发明所述蛋白的组合物。通常，当本发明组合物用于上述用途时，所述蛋白可与一种或多种药学上可接受的载体或赋形剂混合制成不同给药途径的药物剂型，如片剂、胶囊、散剂、颗粒剂、糖浆剂、溶液剂、口服液、醑剂、酊剂、气雾剂、粉雾剂、注射剂、注射用无菌粉末、栓剂等。
“药学上可接受的”成分是适用于人和/或动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)即有合理的效益/风险比的物质。“药学上可接受的载体”是用于将本发明的融合体蛋白传送给动物或人的药学上或食品上可接受的溶剂、悬浮剂或赋形剂。载体可以是液体或固体。
本发明的蛋白可经过口服、静脉内、肌内或皮下途径给药。
上述剂型中可经口服给药的剂型为：片剂、胶囊、散剂、颗粒剂、糖浆剂、溶液剂、醑剂。固态载体包括：淀粉、乳糖、磷酸氢钙、微晶纤维素、蔗糖、白陶土、微粉硅胶、滑石粉、低取代羟丙基纤维素、羧甲基淀粉钠、聚乙烯吡咯烷酮。而液态载体包括：无菌水、乙醇、聚乙二醇、非离子型表面活性剂和食用油(如玉米油、花生油和芝麻油)。在制备药物组合物的过程中通常使用的佐剂包括：调味剂、着色剂、防腐剂(如羟苯烷基丁酯、苯甲酸钠、山梨酸)和抗氧化剂(如维生素E、维生素C、焦亚硫酸钠和二丁基羟基甲苯)。
上述剂型中可用于注射途径给药的剂型包括：注射剂、注射用无菌粉末，它们是将药物与一种或多种药学上可接受的赋形剂混合制成以供注射给药的形式。溶剂包括：无菌水、乙醇、甘油、丙二醇、聚乙二醇。此外，还需加入抑菌剂(如苯甲醇、羟苯丁酯、硫柳汞)、等渗调节剂(如氯化钠、葡萄糖)、助悬剂(如羧甲基纤维素钠、甲基纤维素)、增溶剂(吐温-80、卵磷酯)、抗氧化剂(如维生素E、维生素C、焦亚硫酸钠)和填充剂(如乳糖、甘露醇)。
从易于制备和给药的立场看，优选的药物组合物是固态组合物，尤其是冻干粉针剂。
本发明的药用组合物可根据熟知的及公认的制药生产要求的方法制备。药用组合物适宜包含本发明的蛋白质以及药学上可接受的载体，并适宜为单位剂量形式。本发明的药用组合物可包含前药形式的本发明的蛋白质，该前药可在接受者宿主体内代谢转化成本发明物的活性形式。
本发明的药用组合物还可与其它疗法联合应用，如同时、序贯或分别应用。本发明的药用组合物可包含有其它活性作用物。
用途
公开了所述蛋白作为活性成分可以预防或治疗肠道黏膜上皮细胞损伤疾病的方法，该方法包括给予患者有效剂量的上述(a)或(b)所述的蛋白。
在一些实施方式中，所述肠道黏膜上皮细胞损伤疾病为化疗药物导致的肠道黏膜上皮细胞损伤疾病时，所述方法可通过化疗药物给药前、化疗药物给药后、或化疗药物给药前和化疗药物给药后任一方式给予患者有效剂量的上述(a)或(b)所述的蛋白。
化疗药物(chemotherapeutic drugs)：是指用于治疗细菌、真菌、病毒、寄生虫和恶性肿瘤细胞所致疾病的药物，简称化疗药。包括抗(细)菌药、抗真菌药、抗病毒药、抗寄生虫药和抗恶性肿瘤药。本发明“化疗药物”是指抗恶性肿瘤药，其依据它们的作用机制分为几大类：
1、烷化剂：烷化剂直接作用于DNA上，防止癌细胞再生。此类药物对慢性白血病、恶性淋巴瘤、何杰金氏病、多发性骨髓瘤、肺癌、乳腺癌和卵巢癌具有疗效。烷化剂主要有白消安、顺氯氨铂、环磷酰胺(癌得星)、氮烯咪胺、异环磷酰胺、二氯甲二乙胺(盐酸氮芥)和苯丙氨酸氮芥。
2、抗代谢药：抗代谢药干扰DNA和RNA的合成，用于治疗慢性白血病、乳腺癌、卵巢癌、胃癌和结直肠癌。抗代谢药主要有5-氟脲嘧啶、甲氨蝶呤、阿糖胞苷和环胞苷。
3、抗肿瘤抗生素：抗肿瘤抗生素通过抑制酶的作用和有丝分裂或改变细胞膜来干扰DNA。抗肿瘤抗生素为细胞周期非特异性药物，广泛用于对癌症的治疗。抗肿瘤抗生素主要有博来霉素、更生霉素、红必霉素、阿霉素和黄胆素。
4、植物类抗癌药：植物类抗癌药都是植物碱和天然产品，它们可以抑制有丝分裂或酶的作用，从而防止细胞再生必需的蛋白质合成。植物类抗癌药常与其它抗癌药合用于多种癌瘤的治疗。植物类抗癌药主要有长春碱、长春新碱、三尖杉酯碱、足叶乙甙和威蒙。
5、杂类：另外一些化疗药物具有不同的作用机制，不属于上面几类。其中包括门冬酰胺酶和维甲酸。
6、激素：皮质类固醇激素用于治疗淋巴瘤、白血病和多发性骨髓瘤等癌症。当激素用于杀死癌细胞或减缓癌细胞生长时，可以把它们看成化疗药物。皮质类固醇激素有强的松和氟美松。性激素用于减缓乳腺癌、前列腺癌和子宫内膜癌的生长。它包括雌激素、抗雌激素、黄体酮和男性激素。性激素的作用方式不同于细胞毒素药物，属于特殊的化疗范畴。
7、免疫制剂：免疫制剂可以刺激癌症病人的免疫系统更有效地识别和攻击癌细胞。它们属于特殊的化疗范畴。
“有效剂量”或“治疗量”均是指足以产生疗效的量。有效量可分一或多次给药。通常，有效量足以缓和、改善、稳定、减慢或延迟疾病的进一步发展。
所用的活性成分的有效剂量可随给药模式和待治疗疾病的严重程度而变化。对大部分大型哺乳动物而言，每天施以有效成分的总剂量约为0.01-1000mg。通常，成人临床给药量的范围为0.01-200mg/日，优选为0.05-100mg/日。
图20为白介素1家族的信号转导途径示意图(见已经公开的文献《Charles A.Dinarello.Biologic Basis for Interleukin-l in Disease.Blood，Vol 87，No 6(March 15)，1996：pp2095～2147.》)，图20中：
IL-1Ra，    白介素-1受体拮抗剂；
IL-1sRI，   白介素-1可溶性受体I；
IL-1，      白介素-1；
IL-1sRII，  白介素-1可溶性受体II；
IL-1RI，    白介素-1受体I；
Il-1R AcP， 白介素-1受体附属蛋白；
IL-1RII，   白介素-1受体II。
结合该附图以及现有技术公开的内容，本领域技术人员可以很容易知晓以下内容：
IL-1与IL-1RI结合后，在IL-1RI AcP的帮助下形成高亲和力配体和受体结合，从而启动IL-1信号转导。该信号转导受到多种因素的调控，注释如下：
IL-1Ra与IL-1RI结合，该结合不诱导信号传到(no signal)，同时
减少细胞表面可以IL-1结合的IL-1RI数量；
IL-1sRI与IL-1结合，减少游离IL-1，从而减少IL-1与IL-1RI的结合；
(3)IL-1sRII与IL-1结合，减少游离IL-1，从而减少IL-1与IL-1RI的结合；
(4)IL-1RII与IL-1结合，该结合不诱导信号传到(no signal)，减少游离IL-1，从而减少IL-1与IL-1RI的结合。
另外，由于抗体具有特异结合抗原的特性，当抗体与抗原结合后会直接阻断抗原与其天然蛋白结合，从而影响抗原蛋白的生物学功能。根据图20，本领域技术人员很容易知晓以下阻断IL-1信号传导的方法：
(1)抗IL-1抗体，该抗体与IL-1结合后，阻止其与IL-1RI结合，从而阻断IL-1信号通路；
(2)抗IL-1RI抗体，该抗体与IL-1RI结合后，阻止其与IL-1结合，从而阻断IL-1信号通路；
(3)抗IL-1RAcP抗体，该抗体与IL-1RAcP结合后，阻止其与IL-1和IL-1RI复合体的结合，从而使得IL-1和IL-1RI不能形成高亲和力结合，从而阻断IL-1信号通路。
实施例1
(IL-1Ra预防性用药对化疗小鼠小肠的保护作用)单次环磷酰胺化疗小鼠中IL-1Ra预防性用药对小肠的保护作用。
Balb/c小鼠，SPF级8周，体重23～28克，随机分为两组，第一组在Day-3至Day-1连续注射3天rhIL-1Ra(1mg/kg b.w.I.P.，每隔24小时注射一次)，第二组注射等体积生理盐水(I.P.，每隔24小时注射一次)。最后一次注射蛋白或生理盐水之后12小时后注射CTX，一次(300mg/kg b.w.I.P.)。观察指标：小肠切片HE染色。每只小鼠取胃下15厘米处小肠切片，统计4个切面，每个切面统计10根绒毛和10个隐窝，取长度平均。
结果：
小肠HE染色统计，在化疗后，小鼠小肠受损，具体表现在小肠绒毛长度变短，隐窝深度缩短。在化疗前给小鼠注射IL-1Ra，可有效保护小肠绒毛长度及隐窝深度。在第1.5天、第3天、第11天，给药组相比对照组，小肠绒毛长度显著增加(P＜0.05，双尾t-test)。在第7天，给药组相比对照组，小肠绒毛长度显著增加(P＜0.05，单尾t-test)。在第7天，给药组相比对照组，小肠隐窝深度显著增加(P＜0.05，双尾t-test)。(图1、2及表1、2)
表1绒毛长度(μm)
绒毛长度 第0天 第1.5天 第3天 第7天 第11天 第30天
对照组 448.65 344.68 273.59 282.36 244.89 375.96
对照组标准差 29.94 67.6 40.13 13.99 62.38 47.27
绒毛长度 第0天 第1.5天 第3天 第7天 第11天 第30天
给药组 371.08 454.39 343.14 307.1 362.92 331.58
给药组标准差 102.94 46.18 39.77 15 13.41 24.41
P值 0.414 0.011 0.049 0.052 0.01 0.146
表2隐窝深度(μm)
隐窝深度 第0天 第1.5天 第3天 第7天 第11天 第30天
对照组 80.02 63.3 61.66 61.15 65.73 68.25
对照组标准差 12.13 8.26 8.73 2.46 7.96 5.93
给药组 80.05 68.37 63.55 66.89 74.9 71.9
给药组标准差 6.95 5.24 8.86 1.99 11.6 6.08
P值 0.91 0.228 0.77 0.01 0.249 0.423
实施例2
(IL-1Ra预防性用药对化疗小鼠小肠的保护作用)连续三天环磷酰胺化疗小鼠中IL-1Ra预防性用药对小肠的保护作用。
Balb/c小鼠，SPF级8周，体重23-28克，随机分为两组，第一组在Day-5至Day-1连续注射5天rhIL-1Ra(1mg/kg b.w.I.P.)，每隔24小时注射一次)，第二组注射等体积生理盐水(I.P.，每隔24小时注射一次)。最后一次注射蛋白或生理盐水之后24小时后开始注射CTX，在Day0至Day2连续注射三次(200mg/kg b.w.I.P.，每隔24小时注射一次)。观察指标：体重，进食，进水，腹泻及死亡情况。
结果：
体重：在Day0及以后的观察期内，给药组体重平均值均高于对照组，其中Day2/3/12/15差异极显著，Day1/4/6/13/16差异显著。(图3)
进食：给药组每只小鼠平均进食量为1.97克/只*天，对照组每只小鼠平均进食量为2.00克/只*天。其中在Day-3/-2/1/2/3/4/5/6/8/10/11/12/13/15，给药组进食量均高于对照组。在Day1/3/4/5/6/10/11/12/13/15，给药组平均每只小鼠的进食量比对照组高40％以上。(图3)
进水：给药组每只小鼠平均进水量为3.08克/只*天，对照组每只小鼠平均进水量为2.50克/只*天。其中在Day0/1/5/7/8/9/11/12/13/14/15/17，给药组进水量均高于对照组。在Day0/5/7/8/11/14/17，给药组平均每只小鼠的进水量比对照组高40％以上。(图3)
腹泻，实验过程观察期内，给药组腹泻情况在每一天均不高于对照组。给药组平均每只小鼠每天的腹泻评分指数为0.206，对照组平均每只小鼠每天的腹泻评分指数为0.614。(图4)
生存曲线，平均生存时间由对照组的14天提高到IL-1Ra给药组的18.87天，提高了35％，生存率由对照组的40％提高到IL-1Ra给药组的80％，差异显著(P＜0.05)。(图5)
实施例3
(IL-1Ra预防性用药对化疗小鼠小肠的保护作用)两次环磷酰胺化疗小鼠中IL-1Ra预防性用药对小肠的保护作用：Balb/c小鼠，SPF级8周，体重23～30克，随机分为两组，在Day-3至Day-1连续腹腔注射1mg/kg的RhIL-1Ra，每天一次连续3天，对照组注射NS(Day-3至Day-1)；Day0一次性腹腔注射200mg/kg的环磷酰胺。一个月之后第二次注射IL-1Ra及CTX，方法及剂量同上，两次CTX注射之间间隔30天。在第二次注射CTX后观察小鼠体重及生存率
结果：
两次环磷酰胺化疗(200mg/kg*2次)后小鼠体重水平。实验过程中RhIL-1Ra组小鼠平均体重均高于对照，其中在Day4至Day9，Day12至Day14，RhIL-1Ra与对照组差异极显著(双尾t检验，p＜0.01)。在Day3\10\11\15\16，RhIL-1Ra与对照组差异显著(双尾t检验，p＜0.05)，在Day2及Day17，RhIL-1Ra与对照组有差异(单尾t检验，p＜0.05)。(图6)
生存率。观察21天，平均生存时间：IL-1Ra组：21天。对照组：15.8天。生存率：IL-1Ra组：100％。对照组：20％。生存率差异：p＝0.013.(图7)
实施例4
(IL-1Ra预防性用药对化疗小鼠小肠的保护作用)两次环磷酰胺化疗小鼠中IL-1Ra预防性用药对小肠的保护作用：Balb/c小鼠，SPF级8周，体重23-30克，随机分为两组，在Day-3至Day-1连续腹腔注射1mg/kg的RhIL-1Ra，每天一次连续3天，对照组注射NS(Day-3至Day-1)；Day0一次性腹腔注射300mg/kg的环磷酰胺。一个月之后第二次注射IL-1Ra及CTX，方法及剂量同上，两次CTX注射之间间隔30天。在第二次注射CTX后观察小鼠体重及生存率(连续取血，n＝8)
结果：两次环磷酰胺化疗(300mg/kg*2次)后小鼠体重水平。实验过程中RhIL-1Ra组小鼠平均体重在Day6之后均高于对照，其中在Day9，RhIL-1Ra与对照组差异极显著(双尾t检验，p＜0.01)。在Day8\10\11，RhIL-1Ra与对照组差异显著(双尾t检验，p＜0.05)。(图8)
实施例5
(IL-1Ra预防性用药对化疗小鼠小肠的保护作用)三次环磷酰胺化疗小鼠中IL-1Ra预防性用药对小肠的保护作用
在Day-3至Day-1给7-8周龄SPF级雌性Balb/c小鼠连续腹腔注射1mg/kg的RhIL-1Ra，每天一次连续3天，对照组注射NS(Day-3至Day-1)；Day0一次性腹腔注射300mg/kg的环磷酰胺。一个月之后第二次注射IL-1Ra及CTX，方法及剂量同上，两次CTX注射之间间隔30天。一个月之后第三次注射IL-1Ra及CTX，方法及剂量同上，两次CTX注射之间间隔30天。在第三次注射CTX后观察小鼠体重及生存率。
结果：生存率。观察14天，平均生存时间：IL-1Ra组：11.57天。对照组：7.29天。生存率：IL-1Ra组：71.4％。对照组：28.6％。生存率差异：p＝0.014。(图9)
实施例6
(IL-1Ra治疗性用药对化疗小鼠小肠的保护作用)IL-1Ra治疗性用药，在5-Fu化疗之后给蛋白。
取8周龄Balb/c雌性小鼠，第0天腹腔注射5-氟尿嘧啶(200mg/kg)，2小时后皮下注射连续注射IL-1Ra(1mg/kg)，之后每天注射一次，共5次，对照组注射相同剂量的PBS。分别在第1、3、5、7天处死小鼠，称量小鼠体重，并取小肠经过冲洗后称量其湿重，取近胃端40％处小肠2cm放4％多聚甲醛液中固定，做组织切片，HE染色观察损伤程度，用PCNA(细胞增殖核心抗原)染色观察细胞的增殖情况。
结果显示：注射IL-1Ra后，两组小鼠体重变化有差异，体重曲线在化疗后前三天没有差异，但是第四天开始，蛋白组小鼠的体重明显恢复的要比对照组快，至第七天蛋白组的体重基本恢复到了化疗前水平(图10)。化疗后蛋白组第3、5、7天的小肠绒毛高度显著高于对照组(图11A，B)，且在第三天时，对照组的小肠损伤较严重，可见小肠基底部大量中性粒细胞浸润，而蛋白组小肠在第三天时损伤明显减轻(图12)；我们还对化疗后第三天小肠的切片做了PCNA(细胞核增殖抗原)的免疫组化，结果显示蛋白组的小肠隐窝中阳性细胞要明显多于对照组，而且蛋白组中可以看到较为完整的隐窝，增殖明显(图13)另外，相关文献采用小肠湿重/体重的比值代替湿重作为评价化疗后小鼠小肠病变状况，因此我们也采用该比值作为评价小肠病理改变的指标之一。表3可以看出，注射IL-1Ra组在化疗后不同天小肠的湿重/体重的比值都要高于对照组组，说明小肠保存的较为完整，其中两组之间在第三天表现出显著差异(p＜0.01)。与此同时，小鼠腹泻情况给蛋白组也较对照减轻(表4)。
表3小肠湿重(g/1000g体重)
Control 5-FU+PBS 5-FU+IL-1ra
Day 1 42.89±2.12◆ 47.82±2.43*
Day 3 35.07±1.37◆◆ 42.23±1.46**
Day 5 50.47±2.39◆ 58.32±2.18*
Day 7 54.35±2.17 58.05±2.45 61.64±2.12
表4
实施例7
(IL-1Ra预防性加治疗性用药对化疗小鼠小肠的保护作用)单次环磷酰胺化疗小鼠中IL-1Ra预防性加治疗性用药对小肠的保护作用
在Day-5至Day2给7-8周龄Balb/c小鼠连续腹腔注射1mg/kg的rhIL-1Ra，每天一次连续8天，对照组注射PBS(Day-5至Day2)；Day0一次性尾静脉注射400mg/kg的环磷酰胺。观察小鼠生存、腹泻情况并对小肠切片HE染色。每只小鼠取胃下15-20厘米处小肠切片，统计4个切面，每个切面统计5根绒毛和5个隐窝，取长度平均。
结果：
单次环磷酰胺化疗(400mg/kg.天)后小鼠死亡率(每组20只小鼠)。以K-M进程计算，平均生存时间由对照组的19.15天延长至rhIL-1Ra组的24.9天，存活率由对照组的50％提高到80％，差异显著(Log-Rank，p＜0.05)。(图14)
单次环磷酰胺化疗(400mg/kg)后小鼠腹泻水平。实验过程中RhIL-1Ra组小鼠腹泻情况明显低于对照。(图15)
小肠HE染色统计，在化疗后，小鼠小肠受损，具体表现在小肠绒毛长度变短，隐窝深度缩短。在化疗前给小鼠注射IL-1Ra，可有效保护小肠绒毛长度及隐窝深度。在第1.5天、第3天、第11天，给药组相比对照组，小肠绒毛长度显著增加(P＜0.05，双尾t-test)。在第7天，给药组相比对照组，小肠绒毛长度显著增加(P＜0.05，单尾t-test)。在第7天，给药组相比对照组，小肠隐窝深度显著增加(P＜0.05，双尾t-test)。(表5-8，图16、17)
对照组有部分小鼠，在化疗后小肠壁受损严重，隐窝层完全被破坏，而给药组无此情况出现。(表9)
表5绒毛长度(μm)
绒毛长度 第0天 第3天 第7天 第11天 第18天
给药组 371.077 201.757 256.845 352.705 434.256
给药组标准差 102.943 32.636 156.324 38.53 32.491
对照组 448.65 237.174 151.795 289.642 408.852
绒毛长度 第0天 第3天 第7天 第11天 第18天
对照组标准差 29.943 99.527 27.053 25.357 9.429
P值 0.414 0.524 0.232 0.034 0.184
表6绒毛宽度(μm)
绒毛宽度 第0天 第3天 第7天 第11天 第18天
给药组 110.103 65.190 74.793 121.962 121.204
给药组标准差 39.797 7.663 37.098 15.334 10.623
对照组 127.009 61.980 55.694 67.357 120.562
对照组标准差 18.915 16.010 8.637 7.688 11.580
P值 0.642 0.730 0.352 0.001 0.938
表7隐窝深度(μm)
隐窝长度 第0天 第3天 第7天 第11天 第18天
给药组 134.945 161.13 137.855 141.377 127.591
给药组标准差 24.888 40.114 7.137 4.854 4.249
对照组 137.27 145.952 101.056 83.178 115.422
对照组标准差 6.948 1.718 13.459 13.931 10.113
P值 0.91 0.478 0.008 0 0.068
表8隐窝宽度(μm)
Figure G2009103087557D0000161
Figure G2009103087557D0000171
表9完全损毁的小肠壁占总肠壁的面积比
Figure G2009103087557D0000172
IL-1RA组第三天和第七天均没有这种情况产生。
实施例8
(IL-1Ra预防性加治疗性用药对化疗小鼠小肠的保护作用)单次环磷酰胺化疗小鼠中IL-1Ra预防性加治疗性用药对小肠的保护作用：在Day-5至Day2给7-8周龄Balb/c小鼠连续腹腔注射1mg/kg的RhIL-1Ra，每天一次连续8天，对照组注射PBS(Day-5至Day2)；Day0一次性尾静脉注射550mg/kg的环磷酰胺。观察小鼠生存情况并统计腹泻情况。
结果
单次环磷酰胺化疗(550mg/kg)后小鼠体重水平。实验过程中rhIL-1Ra组小鼠腹泻情况明显低于对照。(图18)
单次环磷酰胺化疗(550mg/kg.天)后小鼠死亡率(每组10只小鼠)。以K-M进程计算，平均生存时间由对照组的8.5天延长至RhIL-1Ra组的16.6天，存活率由对照组的10％提高到50％。(图19)
本发明的范围不受所述具体实施方案的限制，所述实施方案只作为阐明本发明各个方面的单个例子，本发明范围内还包括功能等同的方法和组分。实际上，除了本文所述的内容外，本领域技术人员参照上文的描述和附图可以容易地掌握对本发明的多种改进。所述改进也落入所附权利要求书的范围之内。上文提及的每篇参考文献皆全文列入本文作为参考。
序列表
<110>上海交通大学
<120>白细胞介素-1受体拮抗剂的用途及其药物组合物
<160>1
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>152
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>1
Arg Pro Ser Gly Arg Lys Ser Ser Lys Met Gln Ala Phe Arg Ile Trp
1               5                   10                  15
Asp Val Asn Gln Lys Thr Phe Tyr Leu Arg Asn Asn Gln Leu Val Ala
            20                  25                  30
Gly Tyr Leu Gln Gly Pro Asn Val Asn Leu Glu Glu Lys Ile Asp Val
        35                  40                  45
Val Pro Ile Glu Pro His Ala Leu Phe Leu Gly Ile His Gly Gly Lys
    50                  55                  60
Met Cys Leu Ser Cys Val Lys Ser Gly Asp Glu Thr Arg Leu Gln Leu
65                  70                  75                  80
Glu Ala Val Asn Ile Thr Asp Leu Ser Glu Asn Arg Lys Gln Asp Lys
                85                  90                  95
Arg Phe Ala Phe Ile Arg Ser Asp Ser Gly Pro Thr Thr Ser Phe Glu
            100                 105                 110
Ser Ala Ala Cys Pro Gly Trp Phe Leu Cys Thr Ala Met Glu Ala Asp
        115                 120                 125
Gln Pro Val Ser Leu Thr Asn Met Pro Asp Glu Gly Val Met Val Thr
    130                 135                 140
Lys Phe Tyr Phe Gln Glu Asp Glu
145                 150

Claims (8)

1.一种如下(a)或(b)的蛋白在制备预防或治疗肠道黏膜上皮细胞损伤疾病药物中的用途：
(a)其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示的蛋白；
(b)具有与(a)中的氨基酸序列至少70％同源性且具有预防或治疗肠道黏膜上皮细胞损伤疾病效果的蛋白。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述肠道黏膜上皮细胞损伤疾病为缺血缺氧、毒素、射线或药物导致的肠道黏膜上皮细胞损伤疾病。
3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，所述药物为化疗药物。
4.根据权利要求3所述的用途，其特征在于，所述化疗药物为烷化剂类药物、抗代谢类药物、抗生素类药物、植物类药物、激素类药物、金属络合物或蛋白药物
5.根据权利要求3所述的用途，其特征在于，所述化疗药物为环磷酰胺或5-氟尿嘧啶。
6.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述(b)的蛋白为具有与(a)中的氨基酸序列至少77％同源性且具有预防或治疗肠道黏膜上皮细胞损伤疾病效果的蛋白。
7.一种药物组合物，包含如下(a)或(b)的蛋白作为活性成分和药学上可接受的载体或赋形剂：
(a)其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示的蛋白；
(b)具有与(a)中的氨基酸序列至少70％同源性且具有预防或治疗肠道黏膜上皮细胞损伤疾病效果的蛋白。
8.根据权利要求7所述的药物组合物，其特征在于，所述(b)的蛋白为具有与(a)中的氨基酸序列至少77％同源性且具有预防或治疗肠道黏膜上皮细胞损伤疾病效果的蛋白。
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