WO2011050709A1 - 白细胞介素-1受体拮抗剂用于制备预防或治疗肠道黏膜上皮细胞损伤的药物的用途 - Google Patents

白细胞介素-1受体拮抗剂用于制备预防或治疗肠道黏膜上皮细胞损伤的药物的用途 Download PDF

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day
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mice
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韩伟
向砥
吴祯乾
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上海交通大学
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    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/54—Interleukins [IL]

Definitions

  • the intestinal mucosal epithelial cell injury disease is an intestinal mucosal epithelial cell injury disease caused by ischemia, hypoxia, toxins, radiation, or drugs.
  • Figure 1 Changes in length of small intestine villi in IL-lRa prophylactic administration in mice treated with single cyclophosphamide chemotherapy;
  • Figure 3 Effect of IL-lRa prophylactic administration on body weight in mice treated with cyclophosphamide for three consecutive days;
  • Figure 10 Effect of IL-lRa therapeutic use on body weight in mice in a single 5-Fu chemotherapy
  • Figure 11 Effect of IL-lRa therapeutic use on small intestine villus length and small intestine crypt depth in a single 5-Fu chemotherapy
  • Figure 12 HE staining of small intestine after IL-lRa therapeutic use in a single 5-Fu chemotherapy;
  • Figure 17 HE staining of small intestine sections after IL-lRa prophylactic plus therapeutic use in a single cyclophosphamide-treated mouse
  • Figure 18 IL-lRa prophylactic plus therapeutic versus treatment in a single cyclophosphamide-treated mouse The impact of the diarrhea score index
  • Figure 21 Tissue section showing the protection of mouse small bowel injury by injection of mouse recombinant IL-lRa (rmlL-IRa) (protein with SEQ ID NO: 2) for 5 consecutive days prior to 5-Fu chemotherapy;
  • Figure 22 Protection of mouse small bowel injury by injection of mouse recombinant IL-lRa (rmlL-IRa) (protein with SEQ ID NO: 2) for 5 consecutive days prior to 5-Fu chemotherapy. detailed description
  • the present invention also relates to a method for preventing and/or treating diarrhea, enteritis, nutritional dysfunction caused by ischemia, hypoxia, toxins, radiation, or drugs, particularly chemotherapeutic drugs, which method, after undergoing ischemia or hypoxia,
  • the protein of (a) or (b) above is administered to the individual simultaneously with and/or after administration of the drug, such as a chemotherapeutic agent, after exposure to the toxin or radiation.
  • the organism or mutant may also be at least 70% homologous to the hIL-IRa described above, preferably having at least 75% homology, more preferably having at least 80% homology, more preferably having at least 85% homology, more preferably having at least 90% homology, more preferably having at least 95% homology, more preferably having at least 96%, 97%, 98%, 99% homology, and still A protein shield with the same biological activity as hIL-IRa.
  • the present invention includes DNA encoding the IL-1Ra protein of the present invention, and vectors and transformants containing the DNA.
  • the term "transformant" is used, that is, a host cell carrying a heterologous DNA molecule.
  • the invention also encompasses methods of producing the proteins of the invention by synthetic and recombinant techniques. Polynucleotides (DNA or RNA), vectors, transformants and organisms can be isolated and purified by methods known in the art.
  • a variety of methods have been developed for operably linking polynucleotides to vectors via complementary cohesive ends. For example, a complementary homomeric sequence fragment can be added to the DNA segment to be inserted into the vector DNA. The vector and DNA segments are then joined by hydrogen bonding between the complementary homomeric tails to form a recombinant DNA molecule.
  • a synthetic linker containing one or more restriction sites provides another means of joining the DNA segments to the vector.
  • the DNA segment produced by endonuclease restriction digestion is treated with phage T4 DNA polymerase or E. coli DNA polymerase I, and the two polymerases are excised by their 3', 5'-nucleic acid excision activity. Y-single-chain end, and using its polymerization activity to fill the 3'-concave end.
  • the combination of these activities produces a blunt-ended DNA segment.
  • the blunt-ended segment is then incubated with a molar excess of linker molecule in the presence of an enzyme that catalyzes the ligation of the blunt-ended DNA molecule, such as phage T4 DNA ligase.
  • the polynucleotide insert should be operably linked to a suitable promoter compatible with the host cell expressing the polynucleotide.
  • the promoter may be a strong promoter and/or an inducible promoter. Examples of some of the promoters listed include the bacteriophage lambda PL promoter, the large intestine 4 stem lac, the trP, the phoA, the tac promoter, the SV40 early and late promoters, and the retroviral LTR promoter. Other suitable promoters are known to those skilled in the art.
  • the expression recombinant vector further contains a transcription initiation and termination site, and contains a ribosome binding site for translation in the transcribed region.
  • the coding portion of the transcript expressed by the recombinant vector may include a translation initiation codon at the start and a stop codon (UAA, UGA or UAG) suitably located at the end of the translated polypeptide.
  • a tagged protein or a tag polypeptide which facilitates isolation and purification.
  • GST glutathione S-transferase
  • Hi s. Tag hexahistidine peptide
  • protein shield A protein A
  • cel lulose Binding doma in cel lulose Binding doma in
  • the specific protein or polypeptide forms a fusion protein with the target protein, and the target protein can be separated and purified by using the specific shield of the tagged protein or the tag polypeptide.
  • Hi s. Tag specifically binds to the Ni-Chelating Sepharose column.
  • the tagged protein or tag polypeptide can be purified by site-specific protease digestion to remove the fusion sequence, such as thrombin, enterokinase and factor Xa, to obtain the target protein.
  • the invention also includes host cells comprising a nucleotide sequence of the invention, the nucleotide sequence being operable by one or more heterologous control regions (such as promoters and/or enhancers) by techniques known in the art. Connected.
  • the expression of the inserted gene sequence can be selected, or the host strain can be modified and processed in a specific manner as desired. In the presence of certain inducers, expression of certain promoters is increased; therefore, expression of the genetically engineered polypeptide can be controlled.
  • different host cells have characteristic and specific mechanisms for translation, post-translational processing, and modification (eg, phosphorylation, cleavage) of protein shields. Appropriate cell lines can be selected to ensure desirable modification and labor for the expressed foreign protein shield.
  • nucleic acid and nucleic acid recombinant vector of the present invention can be introduced into a host cell by infection or other methods. The method is described in a number of standard laboratory manuals, such as Dav is et al., Bas ic Methods In Mo lecular Biology (1986).
  • the protein of the invention can be purified using one or more of the chromatographic methods described above.
  • the fusion protein of the invention may be purified using one or more of the following columns: Q sepharose FF column, SP sepharose FF column, Q sepharose H igh Perf Ormance column, Blue sepharose FF column, Blue column, Phenyl Sepharose FF column, DEAE Sepharose FF, Ni-Che la ing Sepharose FF column or Methyl column.
  • the invention further relates to pharmaceutical compositions containing the proteins of the invention.
  • the protein may be mixed with one or more pharmaceutically acceptable carriers or excipients to prepare pharmaceutical dosage forms of different administration routes, such as tablets and capsules. , powders, granules, syrups, solutions, oral liquids, elixirs, tinctures, aerosols, powders, injections, sterile powders for injection, suppositories, etc.
  • a “pharmaceutically acceptable” ingredient is a physical shield that is suitable for use in humans and/or animals without excessive adverse side effects (eg, toxicity, irritation, and allergies), ie, having a reasonable benefit/risk ratio.
  • “Pharmaceutically acceptable carrier” is used to integrate the invention The conjugated protein is delivered to a pharmaceutically or food acceptable solvent, suspending agent or excipient of the animal or human.
  • the carrier can be a liquid or a solid.
  • the dosage forms which can be orally administered in the above dosage forms are: tablets, capsules, powders, granules, syrups, solutions, elixirs.
  • Solid carriers include: starch, lactose, calcium hydrogen phosphate, microcrystalline cellulose, sucrose, kaolin, micronized silica gel, talc, low-substituted hydroxypropylcellulose, sodium carboxymethyl starch, polyvinylpyrrolidone.
  • Liquid carriers include: sterile water, ethanol, polyethylene glycol, nonionic surfactants, and edible oils such as corn oil, peanut oil, and sesame oil.
  • the dosage forms of the above dosage forms which can be administered by the injection route include: injections, sterile powder for injection, which are prepared by mixing the drug with one or more pharmaceutically acceptable excipients for administration by injection.
  • Solvents include: sterile water, ethanol, glycerol, propylene glycol, polyethylene glycol.
  • bacteriostatic agents such as benzyl alcohol, hydroxyphenyl butyl ketone, thimerosal
  • isotonicity regulators such as sodium chloride, glucose
  • suspending agents such as sodium carboxymethyl cellulose, methyl cellulose).
  • solubilizer Teween-80, lecithin
  • antioxidants such as vitamin E, vitamins (, sodium metabisulfite) and fillers (such as lactose, mannitol).
  • compositions of the present invention are solid compositions, especially frozen powders.
  • the pharmaceutical compositions of the present invention can be prepared according to well known and recognized methods of pharmaceutical manufacturing requirements.
  • the pharmaceutical compositions suitably comprise a protein shield of the invention together with a pharmaceutically acceptable carrier, and are suitably in unit dosage form.
  • the pharmaceutical compositions of the present invention may comprise a protein shield of the invention in the form of a prodrug which is metabolically converted in the recipient host to the active form of the invention.
  • compositions of the invention may also be used in combination with other therapies, such as simultaneous, sequential or separate application.
  • the pharmaceutical compositions of the present invention may contain other active compounds.
  • a method for preventing or treating intestinal mucosal epithelial cell damage disease by using the protein as an active ingredient comprises administering to a patient an effective amount of the protein of (a) or (b) above.
  • Chemotherapeutic drugs A drug used to treat diseases caused by bacteria, fungi, viruses, parasites, and malignant cells. These include anti-microbial, antifungal, antiviral, antiparasitic, and anti-neoplastic agents.
  • the "chemotherapeutic drugs” of the present invention refer to anti-malignant drugs, which are classified into several categories according to their mechanism of action:
  • Alkylating agent acts directly on the DNA to prevent cancer cells from regenerating. These drugs are effective against chronic leukemia, malignant lymphoma, Hodgkin's disease, multiple myeloma, lung cancer, breast cancer, and ovarian cancer.
  • the alkylating agent mainly has Busulfan, cisplatin, cyclophosphamide (cancer star), azomethamine, ifosfamide, dichloromethaneamine (hydrochloric acid mustard) and phenylalanine mustard.
  • Antimetabolites interfere with the synthesis of DNA and RNA for the treatment of chronic leukemia, breast cancer, ovarian cancer, stomach cancer and colorectal cancer.
  • the antimetabolites are mainly 5-fluorouracil, methotrexate, cytarabine and cyclocytidine.
  • anti-tumor antibiotics interfere with the role of inhibition of enzymes and mitosis or change the cell membrane
  • Anti-tumor antibiotics are cell cycle non-specific drugs that are widely used in the treatment of cancer. Antitumor antibiotics are mainly bleomycin, dactinomycin, erythromycin, doxorubicin and phosin.
  • Plant anticancer drugs are plant bases and natural products, which can inhibit the action of mitosis or enzymes, thereby preventing the synthesis of protein shields necessary for cell regeneration. Plant anticancer drugs are often used in combination with other anticancer drugs for the treatment of a variety of cancers. Plant anticancer drugs mainly include vinblastine, vincristine, harringtonine, etoposide and weimeng.
  • hormones skin shield steroid hormones for the treatment of lymphoma, leukemia and multiple myeloma and other cancers. When hormones are used to kill cancer cells or slow the growth of cancer cells, they can be considered as chemotherapy drugs.
  • the skin shield steroid hormones are prednisone and dexamethasone. Sex hormones are used to slow the growth of breast, prostate and endometrial cancer. It includes estrogen, antiestrogens, progesterone and male hormones. Sex hormones work differently than cytotoxic drugs and are part of a special chemotherapy category.
  • Immunological preparations can stimulate the immune system of cancer patients to more effectively recognize and attack cancer cells. They belong to a special category of chemotherapy.
  • Effective dose refers to an amount sufficient to produce a therapeutic effect.
  • An effective amount can be administered in one or more divided doses. Generally, an effective amount is sufficient to alleviate, improve, stabilize, slow or delay further progression of the disease.
  • the appropriate dose of the IL-1R protein of the present invention will depend on the type of disease to be treated, the severity and progression of the disease, whether the drug is administered for prophylactic or therapeutic purposes, and the attending physician's Subjective judgment.
  • the effective dose of the active ingredient employed will vary with the mode of administration and the severity of the condition being treated. For most large mammals, the total daily dose of active ingredient is about 0.01-1000 mg. Usually, the clinical dose of the adult is in the range of from 0.01 to 200 mg/day, preferably from 0.05 to 100 mg/day. Generally, the effective amount of the drug can be determined by standard methods in the art.
  • Figure 20 is a schematic diagram of the signal transduction pathway of the interleukin 1 family (see published literature "Charles A. Dinare l lo. Bio log ica l Bas is for Inter leuk in-1 in Di sease. Blood, Vo l 87, No 6 (March 15), 1996: pp 2095-2147. » ), Figure 20:
  • IL-1 binds to IL-1RI and forms high affinity ligand and receptor binding with the help of IL-1RIAcP, Thereby IL-1 signal transduction is initiated.
  • This signal transduction is regulated by a number of factors, as noted below:
  • IL-lRa binds to IL-1RI, which does not induce signaling (No s igna l ), while reducing the amount of IL-1RI that can bind to IL-1 on the cell surface;
  • IL-l sRI binds to IL-1 and reduces free IL-1, thereby reducing the binding of IL-1 to IL-1RI;
  • IL-l sRI I binds to IL-1, reducing free IL-1, thereby reducing the binding of IL-1 to IL-1RI;
  • IL-1RI I binds to IL-1, which does not induce signaling (No s igna l ), reduces free IL-1, and thus reduces IL-1 binding to IL-1RI.
  • the antibody since the antibody has a specific binding antigen, when the antibody binds to the antigen, it directly blocks the binding of the antigen to its natural protein, thereby affecting the biological function of the antigen protein. According to Fig. 20, the following methods for blocking IL-1 signaling are readily known to those skilled in the art:
  • An anti-IL-1 antibody that binds to IL-1 and prevents it from binding to IL-1RI, thereby blocking the IL-1 signaling pathway;
  • the first group was injected continuously for 3 days from day -3 to day -1 to recombinant human IL-lRa (rhe-IRa).
  • X has an amino acid sequence of X lmg/kg bw IP as shown in SEQ ID No. 1, injected every 24 hours), and the second group is injected with an equal volume of physiological saline (IP, once every 24 hours).
  • IP physiological saline
  • CTX cyclophosphamide
  • Observation index HE staining of small intestine sections. Each mouse took a small intestine section 15 cm below the stomach, and counted 4 sections. Each section counted 10 fluffs and 10 crypts, and the length was averaged.
  • the first group was injected continuously for 5 days rhIL-IRa (lmg/kg bw L) from day -5 to day -1. P.), injected every 24 hours), the second group was injected with an equal volume of normal saline (IP, once every 24 hours).
  • CTX was injected 24 hours after the last injection of protein or saline, and three consecutive injections from day 0 to day 2 (200 mg/kg bw IP, injected every 24 hours) Once). Observation indicators: body weight, eating, water intake, diarrhea and death.
  • the average food intake per mouse in the drug-administered group was 1.97 g / day * day, and the average food intake per mouse in the control group was
  • the average water intake per mouse in the drug-administered group was 3. 08 g / day * day, and the average water intake per mouse in the control group was 2. 50 g / day * day.
  • the water intake of the drug-administered group was higher than that of the control group.
  • the average water intake per mouse in the drug-administered group was more than 40% higher than that in the control group.
  • Fig. 3 Diarrhea, during the observation period of the experimental period, the diarrhea in the administration group was not higher than the control group every day.
  • the average diarrhea score for each mouse in the drug-administered group was 0. 206, and the average diarrhea score for each mouse in the control group was 0.614.
  • RESULTS Body weight levels in mice after two cyclophosphamide chemotherapy (300 mg/kg*2 times). During the experiment, the average body weight of the rhIL-IRa group was higher than that of the control after the sixth day. On the 9th day, the rhIL-IRa was significantly different from the control group (two-tailed t-test, p ⁇ 0.01). On day 8 ⁇ 10 ⁇ 11, rhIL-IRa was significantly different from the control group (two-tailed t-test, p ⁇ 0.05). (Fig. 8) Example 5
  • IL-lRa therapeutic drug which is given to protein after 5-Fu chemotherapy.
  • mice Eight weeks old Ba lb/c female mice were injected intraperitoneally with 5-fluorouracil (200 mg/kg) on day 0. After 2 hours, rhIL-lRa (1 mg/kg) was injected subcutaneously, followed by daily injection for 5 times. The control group was injected with the same dose of PBS. The mice were sacrificed on days 1, 3, 5, and 7, respectively, and the body weight of the mice was weighed, and the small intestine was washed and weighed to obtain the wet weight. The small intestine 2cm at the stomach end was fixed in 4% paraformaldehyde solution, and the tissue was sectioned. The degree of injury was observed by HE staining. The proliferation of the cells was observed by PCNA (cell proliferation core antigen) staining.
  • PCNA cell proliferation core antigen
  • mice 7-8 weeks old Balb/c mice were given intraperitoneal injection of 1 mg/kg of rhIL-IRa from day 5 to day 2 for 8 consecutive days, and the control group was injected with PBS (on day -5 to day 2). Day); On the 0th day, a single tail vein injection of 400mg/kg Ring of the amide. Mice were observed for survival, diarrhea, and HE staining of small intestine sections. Each mouse was taken from a small intestine section 15-20 cm below the stomach, and 4 sections were counted. Each section counted 5 villi and 5 crypts, and the length was averaged.
  • the third day of the control group On the third day of the control group, the first one was 'J, the mouse was 0. 00%, and the third day of the control group was the average.
  • the first day of the control group was the first 'J, the mouse 42. 24%
  • mice The protective effect of IL-lRa prophylactic plus therapeutic drugs on the small intestine of chemotherapy mice: in the 5th day to On day 2, 7-8 weeks old Ba lb/c mice were given intraperitoneal injection of 1 mg/kg of rhIL-IRa for 8 consecutive days, and the control group was injected with PBS (on day -5 to Day 2); On day 0, a single tail vein was injected with 550 mg/kg of tombamide. Observe the survival of the mice and count the diarrhea.
  • mice Protective effect of IL-lRa prophylactic drug on small intestine in a single 5-fluorouracil (5-Fu) chemotherapy mouse: 7 weeks old Ba lB/c
  • an IL-1Ra homologous sequence protein that is, a recombinantly synthesized mouse IL-1Ra (rmlL-IRa) (the amino acid sequence thereof is shown as SEQ ID No. 2); Inject 1 mg/kg of rmlL-IRa (77% homology with rhIL-IRa) once a day, subcutaneously once daily (diluted with a pH 7.

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Description

白细胞介素 -1受体拮抗剂用于制备预防或治疗肠道黏膜上皮细胞损伤
的药物的用途 技术领域
本发明涉及一种生物医药领域的用途及药物组合物，具体涉及一种白细胞介素 -1受体 拮抗剂的用途及其药物组合物。 背景技术
正常小肠黏膜由黏膜上皮、 固有层和黏膜肌层组成， 黏膜上皮由一连续的单层柱状上 皮细胞组成， 为黏膜最表层， 它连同固有层向肠腔呈指状突起称为肠绒毛， 绒毛根部的上 皮下陷至固有层， 形成管状的肠隐窝。 原始上皮细胞在隐窝处分裂增殖然后向绒毛顶端移 行， 并在移行过程中达到生理成熟， 一般上皮细胞达到绒毛中部即具备完好的功能。 小肠 绒毛的更新即通过绒毛顶端的老年上皮细胞不断脱落到肠腔、 隐窝处的细胞不断增生向上 补充来实现。 小肠上皮的周转率很快， 成人 3-6 天整个黏膜更新一次， 估计每分钟小肠上 皮丧失 2 ~ 5 X 107个细胞。
肠黏膜损伤时肠道黏膜上皮细胞更新减慢， 肠黏膜上皮细胞萎缩、 变性及脱落。 目前 对肠黏膜损伤的防护措施主要釆用肠内外营养的方法， 通过营养液提供肠黏膜免疫细胞足 够的营养基盾。 含谷氨酰胺、 精氨酸等特殊营养物盾的免疫增强型肠内营养制剂近年来越 来越多地应用于临床， 这些物盾能够刺激黏膜免疫应答， 调解细胞因子的产生和释放， 减 轻过度炎性反应， 促进黏膜的修复（Li, Y. , Z. Yu, F. Liu, L. et a l. Tumor i 2006 (92) : 396-401; Barasch, A. , D. E. Peterson. Ora l Oncol 2003 (39) : 91-100; Goncharova, G. I. , V. G. Dorof eichuk, A. Z. Smol ianska ia, et a l. Ant ibiot Khimioter 1998 (34) : 462-466)。 另外， 临床上也使用双歧杆菌制剂以及中草药来减轻化疗药物对肠黏 膜的损害（Boerma, M. , J. Wang, A. F. Burnet t, et a l. Cancer Res 2007 (67)： 9501-9506) 0 小肠黏膜上皮细胞分泌的细胞因子和趋化因子对小肠功能的稳定起到重要调节作用， 已经 有越来越多的研究集中到这些因子在化疗中肠黏膜的损伤和修复所扮演的角色。 IL-11可明 显降低放化疗小鼠的黏膜损伤， 并且在损伤前和损伤后对黏膜细胞可发挥不同的效应 , 达 到保护黏膜降低损伤并促进损伤后再生的作用 (Gibson, R. J. , D. M. Keefe, F. M. Thompson, et a l. Dig Di s Sci 2002 (47) : 2751-2757; Naugler, K. M. , K. A. Baer, and M. J. Ropeleski. 2008 Am J Phys iol Gas trointes t Liver Phys iol)。 最新研究成果认为， 其 发挥作用是通过 MEK相关的通路进行（Kim, K. A. , M. Kaki tani, J. Zhao, et a l. Science 2005 (309)： 1256-1259. )。 2005年 Kim等发现人生长因子 R-spondin 1能够显著增加隐窝上 皮细胞的增殖， 导致小肠和大肠的变粗和延长， 并且能够降低与化疗药物 5-氟尿嘧啶有关 的细胞损坏， 减少腹泻和体重降低的发生（Kim, K. A. , J. Zhao, et a l. Ce l l Cyc le
2006 (5)： 23-26; Booth, D. , J. D. Ha ley, A. M. Brusk in, et a l. Int J Cancer 2000 (86)： 53-59. )。 TGF- β 3能够通过将上皮细胞抑制在细胞周期的 G0或 G1期从而起到化 疗保护的作用 （Farre l l , C. L. , J. V. Bready, K. L. Rex, et a l. Cancer Res 1998 (58 )： 933-939)。 KGF是另一个对黏膜上皮细胞具有促进增生和化疗保护作用的因子， 在化疗中提前使用能够大大提高隐窝细胞存活的比例（G ibson, R. J. , J. M. Bowen, and D. M. Keefe. et a l. Int J Cancer 2005 (116)： 464-470; Dinare l lo. Blood 1996 (87) : 2095-2147) 0 但是， 这些生长因子的安全性尚未被完全证实， 有学者认为生长因子能促进有生长因子受 体的肿瘤细胞的生长， 故而限制了此类药物的应用。 发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种白细胞介素 -1受体拮抗剂的用途及 其药物组合物。 本发明所述蛋白能有效预防或治疗肠道黏膜上皮细胞损伤疾病， 并且能减 少腹泻和体重降低的发生， 降低和改善化疗对小肠的损伤。
本发明一方面公开了一种如下（a)或（b)的蛋白在制备预防或治疗肠道黏膜上皮细胞损 伤疾病药物中的用途：
(a) 其氨基酸序列如 SEQ ID NO: 1 ( rhIL-IRa )所述的蛋白；
(b) 具有与（a)中的氨基酸序列至少 70 %同源性且具有预防或治疗肠道黏膜上皮细胞 损伤疾病效果的蛋白。 在一些实施方式中， 所述肠道黏膜上皮细胞损伤疾病为缺血缺氧、 毒素、 射线、 或药 物导致的肠道黏膜上皮细胞损伤疾病。
在一些实施方式中， 所述药物为化疗药物， 其中化疗药物可为烷化剂类药物、 抗代谢 类药物、 抗生素类药物、 植物类药物、 激素类药物、 金属络合物、 或蛋白药物， 其中优选 为环磷酰胺或 5-氟尿嘧啶。
在一些实施方式中，所述（b)的蛋白为具有与（a)中的氨基酸序列至少 77 %同源性且具 有预防或治疗肠道黏膜上皮细胞损伤疾病效果的蛋白。
另一方面， 本发明公开了一种药物组合物， 包含如下（a)或（b)的蛋白作为活性成分和 药学上可接受的载体或赋形剂： (a) 包含 SEQ ID NO: 1所示氨基酸序列的蛋白；
(b) 具有与（a)中的氨基酸序列至少 70 %同源性且具有预防或治疗肠道黏膜上皮细胞 损伤疾病效果的蛋白。
在一些实施方式中，所述（b)的蛋白为具有与（a)中的氨基酸序列至少 77 %同源性且具 有预防或治疗肠道黏膜上皮细胞损伤疾病效果的蛋白。
另一方面， 本发明公开了所述蛋白作为活性成分预防或治疗肠道黏膜上皮细胞损伤疾 病的方法， 该方法包括给予患者有效剂量的上述（a)或（b)所述的蛋白。
在一些实施方式中， 所述肠道黏膜上皮细胞损伤疾病为化疗药物导致的肠道黏膜上皮 细胞损伤疾病， 在该实施方案中， 所述方法包括化疗药物给药前、 同时、 和 /或化疗药物给 药后给予患者有效剂量的上述（a)或（b)所述的蛋白。
与现有技术相比， 本发明具有如下的有益效果： 本发明提供一种可以促进肠道黏膜上 皮细胞增殖或预防和 /或治疗肠道黏膜上皮细胞损伤疾病的药物。 本发明所述蛋白能有效预 防或治疗肠道黏膜上皮细胞损伤疾病， 并且能够减少腹泻和体重降低的发生， 降低和改善 化疗对小肠的损伤， 将极有可能成为一种新的对抗化疗所致肠黏膜损伤的药物， 改善临床 肿瘤治疗过程中的不良反应。 附图说明
图 1： 单次环磷酰胺化疗小鼠中 IL-lRa预防性用药对小肠绒毛长度变化；
图 2： 单次环磷酰胺化疗小鼠中 IL-lRa预防性用药后小肠 HE染色切片；
图 3: 连续三天环磷酰胺化疗小鼠中 IL-lRa预防性用药对体重的影响；
图 4： 连续三天环磷酰胺化疗小鼠中 IL-lRa预防性用药对腹泻评分指数的影响； 图 5： 连续三天环磷酰胺化疗小鼠中 IL-lRa预防性用药对生存曲线的影响； 图 6: 两次环磷酰胺化疗小鼠中 IL-lRa预防性用药对小鼠体重的影响；
图 7: 两次环磷酰胺化疗小鼠中 IL-lRa预防性用药对小鼠生存率的影响；
图 8: 两次环磷酰胺化疗小鼠中 IL-lRa预防性用药对小鼠体重的影响；
图 9: 三次环磷酰胺化疗小鼠中 IL-lRa预防性用药对小鼠生存率的影响；
图 10: 单次 5-Fu化疗中 IL-lRa治疗性用药对小鼠体重的影响；
图 11： 单次 5-Fu化疗中 IL-lRa治疗性用药对小肠绒毛长度及小肠隐窝深度的作用； 图 12： 单次 5-Fu化疗中 IL-lRa治疗性用药后小肠 HE染色切片；
图 13: 单次 5-Fu化疗中 IL-lRa治疗性用药后小肠切片 PCNA免疫组化染色； 图 14： 单次环磷酰胺化疗小鼠中 IL-lRa预防性加治疗性用药对小鼠生存率的影响； 图 15 : 单次环磷酰胺化疗小鼠中 IL-lRa预防性加治疗性用药对腹泻评分指数的影响； 图 16: 单次环磷酰胺化疗小鼠中 IL-lRa预防性加治疗性用药对小肠绒毛长度及小肠 隐窝深度的作用；
图 17 : 单次环磷酰胺化疗小鼠中 IL-lRa预防性加治疗性用药后小肠切片 HE染色； 图 18 : 单次环磷酰胺化疗小鼠中 IL-lRa预防性加治疗性用药对对腹泻评分指数的影 响；
图 19: 单次环磷酰胺化疗小鼠中 IL-lRa预防性加治疗性用药对小鼠生存率的影响； 图 20: 白介素 1家族信号转导途径示意图；
图 21 : 组织切片显示 5-Fu化疗前连续 5天注射小鼠重组 IL-lRa ( rmlL-IRa ) (具有 SEQ ID NO: 2的蛋白）对小鼠小肠损伤的保护；
图 22 : 5-Fu化疗前连续 5天注射小鼠重组 IL-lRa ( rmlL-IRa ) (具有 SEQ ID NO: 2 的蛋白）对小鼠小肠损伤的保护。 具体实施方式
以下示例将结合附图对本发明作进一步说明。 本实施例在以本发明技术方案为前提下 进行实施， 给出了详细的实施方式和过程， 但本发明的保护范围不限于下述的实施例。 下 列实施例中未注明具体条件的实验方法， 通常按照常规条件， 或按照制造厂商所建议的条 件。
在本文， 术语 "肠道黏膜细胞上皮损伤疾病" 指因肠道黏膜上皮细胞损伤、 死亡或增 殖障碍而导致的疾病， 包括腹泻、 肠炎、 因肠道损伤导致的营养功能障碍等。 因此， 本发 明还涉及（ a ) 包含 SEQ ID NO: 1所示氨基酸序列的蛋白； 或（b)具有与（a)中的氨基酸序列 至少 70 %同源性且具有预防或治疗肠道黏膜上皮细胞损伤疾病效果的蛋白，在制备预防和 / 或治疗缺血、 缺氧、 毒素、 射线、 或药物， 尤其是化疗药物导致的腹泻、 肠炎、 营养功能 障碍的药物中的用途。 本发明还涉及预防和 /或治疗缺血、 缺氧、 毒素、 射线、 或药物， 尤 其是化疗药物导致的腹泻、 肠炎、 营养功能障碍的方法， 该方法包括在经历缺血或缺氧后、 接触毒素或射线后， 或在施用药物， 例如化疗药物之前， 同时和 /或之后给予个体上述（a ) 或（b)的蛋白。
"白细包介素 _1受体 4吉抗剂，， ( inter leuk in-1 receptor antagoni s t , IL-lRa ) , 与 IL—l α、 IL-1 β三者共同属于 IL-1家族成员。 IL-lRa是 IL-l a、 IL-1 β共同的拮抗剂， 它的蛋白 序列与 IL-l a、 IL-1 β在受体结合部位即 C-末端区显著相似。 人白细胞介素 -1受体拮抗剂 ( hIL-IRa )的氨基酸序列如 SEQ ID NO: 1所示， hIL-IRa和小鼠的 IL-lRa (氨基酸序列如 SEQ ID NO: 2所示）有 77 %的同源性， IL-lRa的生物学作用没有种属特异性。 因此， 本发明 "白细胞 介素 -1受体拮抗剂" 的术语涵盖来自不同物种 （例如来自牲畜 （诸如牛、 马） 、 宠物 （诸如 猫、 犬） 、 灵长类动物、 啮齿类动物 （诸如小鼠、 大鼠） ， 最优选人的白细胞介素 -1受体拮 抗剂蛋白。 同时， 该术语还涵盖天然的蛋白盾和利用生物工程技术人工合成的型式。 不同细 胞产生的 IL-lRa分子量的差异主要由糖基化程度不同所致。 已证实， 糖基化对 IL-lRa生物学 活性无影响 ( R Da ig, G Rogler, E Aschenbrenner, et a l. Gut 2000 (46) : 350-358 ) 。
在本发明中， 术语 "白细胞介素 -1受体拮抗剂" 涵盖具有 SEQ ID NO: 1所示氨基酸序 列的 hIL-lRa、 其突变体、 其功能性活性片段或其类似物以及具有高度同源性的同系物（例 如直向同系物）。
所述突变体或衍生物是指包含在 SEQ ID NO: 1 所示氨基酸序列中通过取代、 缺失和 / 或插入一个或更多氨基酸所得的蛋白， 且仍具有与 hIL-IRa相同的生物活性的蛋白盾， 例 如通过保守取代 1-50个、 1-25个、 1-10个、 1-5个氨基酸而获得的具有与 hIL-IRa相同的 生物活性的 hIL-IRa突变体或^"生物。 所述^ "生物或突变体还可以是与上述 hIL-IRa具有 至少 70%同源性， 优选为具有至少 75%同源性， 更优选为具有至少 80%同源性， 更优选为具 有至少 85%同源性， 更优选为具有至少 90%同源性， 更优选为具有至少 95%同源性， 更优选 为具有至少 96%, 97%, 98%, 99%同源性， 且仍具有与 hIL-IRa相同的生物活性的蛋白盾。
上述衍生物或突变体可使用本领域已知的方法产生，诸如寡核苷酸介导的（定点）诱变、 丙氨酸扫描、及 PCR诱变方法。可对克隆的 DNA进行定点诱变（Carter等， Nucl. Acids Res. 13: 4331 (1986) ; Zol ler等， Nucl. Acids Res. 10: 6487 (1987) )、 盒式诱变（Wel l s等, Gene 34: 315 (1985) )、 限制性选择诱变（Wei I s等， Phi los. Trans. R. Soc. London SerA 317: 415 (1986) )或其它已知技术以产生上述 hIL-IRa蛋白衍生物或突变体。
本发明上述的 "功能性活性片段" 指含有至少 20个， 优选 50个， 更优选 100个来自 上述 hIL-IRa蛋白基酸序列的连续氨基酸， 且仍具有与 hIL-IRa相同的生物活性的蛋白盾。
蛋白的同源性百分比由 GAP ( Needleman 和 Wunsh , 1970 )分析 ( GCG 程序）确定， 其中参数 gap creat ion pena l ty = 5 , gap extens ion pena l ty = 0. 3。 被分析的序列长 度至少为 15个氨基酸时， GAP 分析就在参与测试的两个序列的至少为 15个氨基酸的区域 进行测试。 更优选地， 被分析的序列长度至少为 50个氨基酸时， GAP 分析就在参与测试的 两个序列的至少为 50 个氨基酸的区域进行测试。更优选地，被分析的序列长度至少为 100 个氨基酸时， GAP 分析就在参与测试的两个序列的至少为 100 个氨基酸的区域进行测试。 更优选地， 被分析的序列长度至少为 250 个氨基酸时， GAP 分析就在参与测试的两个序列 的至少为 250 个氨基酸的区域进行测试。甚至更优选地，被分析的序列长度至少为 500 个 氨基酸时， GAP 分析就在参与测试的两个序列的至少为 500 个氨基酸的区域进行测试。 本发明涉及的方面还包括 I L- 1 Ra蛋白类似物，在它们合成期间或合成后进行了不同的 修饰， 例如， 通过生物素化、 苄基化、 糖基化、 乙酰化、 磷酸化、 由已知保护 /封闭基团 的衍生作用、 蛋白水解的切割作用、 连接到抗体分子、 连接到延长体内半衰期的多聚物或 其它细胞配体上等。 这些修饰可以用来在保持天然 IL-lRa蛋白的生物活性同时， 增强其溶 解性、 稳定性、 生物利用度和 /或半衰期物等物理、 化学性能。 蛋白的表达
本发明包括编码本发明的 IL-lRa蛋白的 DNA以及含有这些 DNA的载体、 转化体。 本发明中， 使用的术语 "转化体" （transformant) , 即带有异源 DNA分子的宿主细胞。 本发明还包括通过合成和重组技术生产本发明所述蛋白的方法。 通过本领域已知的方 法可以分离和纯化多核苷酸（DNA或 RNA )、 载体、 转化体和生物体。
用于本发明的载体可以是如噬菌体、 盾粒、 粘粒、 微型染色体、 病毒或逆转录病毒载 体。 可用于克隆和 /或表达本发明的多核苷酸的载体是能在需复制和 /或表达多核苷酸的 宿主细胞中复制和 /或表达多核苷酸的载体。 一般说来， 多核苷酸和 /或载体可用于任何 真核或原核细包， 包括哺乳动物细包（如人（如 HeLa )、 猴（如 Cos )、 兔（如兔网织红细 胞）、 大鼠、 仓鼠（如 CH0、 NS0 和幼仓鼠肾细胞）或小鼠细胞（如 L 细胞））、 植物细胞、 酵母细胞、 昆虫细胞或细菌细胞（如大肠杆菌）。 有关适用于多种类型宿主细胞的适当载体 的例子可参见例如 F. Ausubel et a l. , Current Protocol s in Molecular Biology. Greene Publ i shing As sociates and Wi ley-Inter science (1992)和 Sambrook et a l. (1989)。 可 以使用含有这些多核苷酸的宿主细胞来大量表达可用于例如药物、 诊断试剂、 疫苗和治疗 剂的蛋白盾。
已开发出多种方法用于经由互补的粘性末端使多核苷酸与载体可操作相连。 例如， 可 在欲插入载体 DNA 内的 DNA 区段添加互补的同聚体序列片段。 然后通过互补同聚体尾之 间的氢键连接载体和 DNA 区段以形成重组 DNA 分子。
含有一或多种限制性位点的合成接头提供了另一种连接 DNA 区段与载体的方法。用噬 菌体 T4 DNA 聚合酶或大肠杆菌 DNA 聚合酶 I 处理通过内切核酸酶限制性消化产生的 DNA 区段， 所述的两种聚合酶用其 3' , 5' -核酸外切活性除去突出的 Y -单链末端， 并用其 聚合活性补平 3' -凹端。 因此， 这些活性的联合产生了平端 DNA 区段。 然后在能催化平 端 DNA 分子连接的酶， 如噬菌体 T4 DNA 连接酶的存在下将平端区段与摩尔过量的接头分 子一起保温。 因此， 反应产物是末端携有聚合接头序列的 DNA 区段。 然后用适当的限制性 酶裂解这些 DNA 区段， 并连接至已用酶裂解的表达载体中， 所述酶能产生与所述 DNA 区 段相容的末端。 从多个商家可以买到含有多个限制性内切核酸酶位点的合成接头。
多核苷酸插入物应该可操作地连接于同表达多核苷酸的宿主细胞相容的适当启动子 上。 启动子可以是强启动子和 /或诱导型启动子。 列举的一些启动子的例子包括噬菌体 λ PL 启动子、 大肠 4干菌 lac、 trP 、 phoA、 tac 启动子、 SV40 早期和晚期启动子以及逆转录病 毒 LTR 启动子。 其它适当启动子是本领域技术人员已知的。 表达重组载体进一步含有转录 起始、 终止位点， 并在转录区含有用于翻译的核糖体结合位点。 重组载体表达的转录物的 编码部分可包括位于起点处的翻译起始密码子和适当地位于被翻译多肽的末端的终止密码 子 （ UAA, UGA或 UAG )。
如上所述， 表达载体可包括至少一个选择标记。 所述标记包括对真核细胞培养物而言 的二氢叶酸还原酶、 G418 、 谷氨酰胺合酶或新霉素抗性； 以及用于大肠杆菌和其它细菌 培养的四环素、 卡那霉素或氨苄青霉素抗性基因。 适当宿主的代表性例子包括但不限于： 细菌细胞， 如大肠杆菌、 链霉菌和鼠伤寒沙门氏菌细胞； 真菌细胞， 如酵母细胞（如酿酒 酵母或巴斯德毕赤酵母）； 昆虫细胞，如果蝇 S2 和夜蛾 SF9细胞；动物细胞，如 CH0 , COS , NS0 , 293 和 Bowes 黑素瘤细胞； 和植物细胞。 上述宿主细胞的适当培养基和培养条件是 本领 i或已 口的。
为了有效地分离纯化或分泌目标蛋白， 常常还可利用便于分离纯化的标签蛋白或标签 多肽（Tag )。 常用的有谷胱甘肽 -S-转移酶（ glutathione S- transferase, GST ), 六聚组 氨酸肽 ( Hi s. Tag )、蛋白盾 A ( protein A )和纤维素结合位点 ( cel lulose binding doma in ) 等。 通过特殊性蛋白或多肽与目标蛋白构成融合蛋白的形式， 表达后利用所述的标签蛋白 或标签多肽的特殊性盾可对目标蛋白进行分离和纯化。 如 Hi s. Tag 与 Ni-Chelat ing Sepharose柱特异性结合。所述的标签蛋白或标签多肽可以在纯化后用位点特异性蛋白酶消 化去除融合序列， 如可用凝血酶、 肠激酶和 Xa因子等， 以获得目标蛋白。
本发明还包括含有本发明的核苷酸序列的宿主细胞， 所述核苷酸序列经本领域已知的 技术与一或多种异源控制区 （如启动子和 /或增强子）可操作相连。 可以选择能调节插入 的基因序列的表达， 或能按照所需的特殊方式修饰和加工基因产物的宿主菌株。 在某些诱 导物的存在下， 某些启动子启动的表达会升高； 因此， 可以控制经基因改造的多肽的表达。 另外， 不同宿主细胞具有特征性的和特殊的翻译、 翻译后加工和修饰 （如磷酸化、 裂解） 蛋白盾的机制。 可以选择适当的细胞系以确保对表达的外源蛋白盾进行合乎需要的修饰和 力口工。
通过碑酸钙转染、 DEAE-葡聚糖介导的转染、 阳离子脂盾介导的转染、 电穿孔、 转导、 感染或其它方法， 即可将本发明的核酸和核酸重组载体导入宿主细胞。 所述方法描述于多 个标准的实-验室手册中， 如 Dav i s et a l. , Bas ic Methods In Mo lecular Bio logy (1986)。
编码本发明的所述蛋白的多核苷酸可以与含有选择标记的载体连接以在宿主中增殖。 一般说来， 可在沉淀物， 如磷酸钙沉淀物或其与带电脂盾的复合物中导入盾粒载体。 如果 载体是病毒， 可使用适当的包装细胞系在体外对其进行包装， 再转导至宿主细胞。
通过众所周知的技术可以鉴定出被成功转化的细胞， 即含有本发明的 DNA 重组载体的 细胞。 例如， 可培养导入表达重组载体所得的细胞以产生所需多肽。 收集并裂解细胞， 使 用如 Southern (1975) J. Mo l. Bio l. 95, 503或 Berent et a l (1985) Biotech. 3, 208 所述的方法， 检测其 DNA内容物中 DNA的存在。 或者， 使用抗体检测上清液中蛋白盾的存 在。
通过众所周知的方法从重组细胞培养物中回收和纯化本发明的所述蛋白较为有利， 所 述方法包括硫酸按或乙醇沉淀、 酸提取、 阴离子或阳离子交换层析、 磷酸纤维素层析、 疏
7J作用层析、 亲和层析、 羟基磷灰石层析、 疏水电荷作用层析和凝集素层析。 在一些实施 方案中， 可使用高效液相层析（HPLC )进行纯化。
在一些实施方案中， 可使用上述的一种或多种层析方法纯化本发明的所述蛋白。 在其 它实施方案中， 可使用下述的一种或多种层析柱纯化本发明的所述融合蛋白， 所述层析柱 有： Q sepharose FF柱、 SP sepharose FF 柱、 Q sepharose H igh Perf ormance柱、 Blue sepharose FF柱、 Blue柱、 Phenyl Sepharose FF柱、 DEAE Sepharose FF、 Ni-Che la t ing Sepharose FF柱或 Methyl 柱等。
另外， 可使用国际公开号 WO00/44772 (全文列入本文作为参考） 中描述的方法纯化 本发明的蛋白。 本领域技术人员可以容易地改动其中所述的方法以用于纯化本发明的蛋白。 可以从包括例如细菌、 酵母、 高等植物、 昆虫和哺乳动物细胞的原核或真核宿主经重组技 术产生的产物中回收本发明的蛋白。 组合物
本发明还涉及含有本发明所述蛋白的药用组合物。 通常， 当本发明组合物用于上述用 途时， 所述蛋白可与一种或多种药学上可接受的载体或赋形剂混合制成不同给药途径的药 物剂型， 如片剂、 胶嚢、 散剂、 颗粒剂、 糖浆剂、 溶液剂、 口服液、 醑剂、 酊剂、 气雾剂、 粉雾剂、 注射剂、 注射用无菌粉末、 栓剂等。
"药学上可接受的"成分是适用于人和 /或动物而无过度不良副反应 (如毒性、刺激和 变态反应） 即有合理的效益 /风险比的物盾。 "药学上可接受的载体" 是用于将本发明的融 合体蛋白传送给动物或人的药学上或食品上可接受的溶剂、 悬浮剂或赋形剂。 载体可以是 液体或固体。
本发明的蛋白可经过口服、 静脉内、 肌内或皮下途径给药。
上述剂型中可经口服给药的剂型为： 片剂、 胶嚢、 散剂、 颗粒剂、 糖浆剂、 溶液剂、 醑剂。 固态载体包括： 淀粉、 乳糖、 磷酸氢钙、 微晶纤维素、 蔗糖、 白陶土、 微粉硅胶、 滑石粉、 低取代羟丙基纤维素、 羧甲基淀粉钠、 聚乙烯吡咯烷酮。 而液态载体包括： 无菌 水、 乙醇、 聚乙二醇、 非离子型表面活性剂和食用油（如玉米油、 花生油和芝麻油）。 在制 备药物组合物的过程中通常使用的佐剂包括： 调味剂、 着色剂、 防腐剂（如羟苯烷基丁酯、 苯甲酸钠、 山梨酸)和抗氧化剂（如维生素 E、 维生素 (、 焦亚硫酸钠和二丁基羟基甲苯）。
上述剂型中可用于注射途径给药的剂型包括： 注射剂、 注射用无菌粉末， 它们是将药 物与一种或多种药学上可接受的赋形剂混合制成以供注射给药的形式。 溶剂包括： 无菌水、 乙醇、 甘油、 丙二醇、 聚乙二醇。 此外， 还需加入抑菌剂（如苯甲醇、 羟苯丁酯、 硫柳汞）、 等渗调节剂（如氯化钠、 葡萄糖）、 助悬剂（如羧甲基纤维素钠、 甲基纤维素）、 增溶剂（吐温 -80、 卵磷酯）、 抗氧化剂（如维生素 E、 维生素 (、 焦亚硫酸钠）和填充剂（如乳糖、 甘露醇）。
从易于制备和给药的立场看， 优选的药物组合物是固态组合物， 尤其是冻千粉针剂。 本发明的药用组合物可根据熟知的及公认的制药生产要求的方法制备。 药用组合物适 宜包含本发明的蛋白盾以及药学上可接受的载体， 并适宜为单位剂量形式。 本发明的药用 组合物可包含前药形式的本发明的蛋白盾， 该前药可在接受者宿主体内代谢转化成本发明 物的活性形式。
本发明的药用组合物还可与其它疗法联合应用， 如同时、 序贯或分别应用。 本发明的 药用组合物可包含有其它活性化合物。 用途
公开了所述蛋白作为活性成分可以预防或治疗肠道黏膜上皮细胞损伤疾病的方法， 该 方法包括给予患者有效剂量的上述（a)或（b)所述的蛋白。
化疗药物（ chemotherapeut ic drugs ): 是指用于治疗细菌、 真菌、 病毒、 寄生虫和恶 性肿瘤细胞所致疾病的药物， 筒称化疗药。 包括抗（细） 菌药、 抗真菌药、 抗病毒药、 抗 寄生虫药和抗恶性肿瘤药。 本发明 "化疗药物" 是指抗恶性肿瘤药， 其依据它们的作用机 制分为几大类：
1、 烷化剂： 烷化剂直接作用于 DNA上， 防止癌细胞再生。 此类药物对慢性白血病、 恶 性淋巴瘤、 何杰金氏病、 多发性骨髓瘤、 肺癌、 乳腺癌和卵巢癌具有疗效。 烷化剂主要有 白消安、 顺氯氨鉑、 环磷酰胺（癌得星）、 氮烯咪胺、 异环磷酰胺、 二氯甲二乙胺（盐酸氮 芥）和苯丙氨酸氮芥。
2、 抗代谢药： 抗代谢药千扰 DNA和 RNA的合成， 用于治疗慢性白血病、 乳腺癌、 卵巢 癌、 胃癌和结直肠癌。 抗代谢药主要有 5-氟脲嘧啶、 甲氨蝶呤、 阿糖胞苷和环胞苷。
3、 抗肿瘤抗生素： 抗肿瘤抗生素通过抑制酶的作用和有丝分裂或改变细胞膜来千扰
DNA。 抗肿瘤抗生素为细胞周期非特异性药物， 广泛用于对癌症的治疗。 抗肿瘤抗生素主要 有博来霉素、 更生霉素、 红必霉素、 阿霉素和黄胆素。
4、植物类抗癌药： 植物类抗癌药都是植物碱和天然产品， 它们可以抑制有丝分裂或酶 的作用， 从而防止细胞再生必需的蛋白盾合成。 植物类抗癌药常与其它抗癌药合用于多种 癌瘤的治疗。 植物类抗癌药主要有长春碱、 长春新碱、 三尖杉酯碱、 足叶乙甙和威蒙。
5、 杂类： 另外一些化疗药物具有不同的作用机制， 不属于上面几类。 其中包括门冬酰 胺酶和维甲酸。
6、 激素： 皮盾类固醇激素用于治疗淋巴瘤、 白血病和多发性骨髓瘤等癌症。 当激素用 于杀死癌细胞或减緩癌细胞生长时， 可以把它们看成化疗药物。 皮盾类固醇激素有强的松 和氟美松。 性激素用于减緩乳腺癌、 前列腺癌和子宫内膜癌的生长。 它包括雌激素、 抗雌 激素、黄体酮和男性激素。性激素的作用方式不同于细胞毒素药 物，属于特殊的化疗范畴。
7、免疫制剂： 免疫制剂可以刺激癌症病人的免疫系统更有效地识别和攻击癌细胞。 它 们属于特殊的化疗范畴。
"有效剂量" 或 "治疗量" 均是指足以产生疗效的量。 有效量可分一或多次给药。 通 常， 有效量足以緩和、 改善、 稳定、 减慢或延迟疾病的进一步发展。
对于上述所述疾病的预防或治疗， 本发明 I L- 1 Ra蛋白的适宜剂量将取决于待治疗疾病的 类型、 疾病的严重程度和进程、施用药物是出于预防还是治疗目的以及主治医师的主观判断。 所用的活性成分的有效剂量可随给药模式和待治疗疾病的严重程度而变化。 对大部分大型哺 乳动物而言， 每天施以有效成分的总剂量约为 0. 01-1000mg。 通常， 成人临床给药量的范围为 0. 01-200mg/日， 优选为 0. 05-100mg/日。 通常， 药物的有效量可通过本领域标准方法确定。 图 20为白介素 1家族的信号转导途径示意图（见已公开的文献《Char les A. Dinare l lo. Bio log ica l Bas i s for Inter leuk in-1 in Di sease. Blood, Vo l 87, No 6 (March 15) , 1996: pp 2095-2147. » ), 图 20中：
IL-lRa 白介素 _1受体拮抗剂
IL-l sRI 白介素 -1可溶性受体 I IL-l sRI I 白介素 -1可溶性受体 I I
IL-1RI 白介素 -1受体 I
IL-lRAcP 白介素 -1受体附属蛋白
IL-1RI I 白介素 -1受体 I I
结合该附图以及现有技术公开的内容， 本领域技术人员可以很容易知晓以下内容： IL-1与 IL-1RI结合后， 在 IL-lRIAcP的帮助下形成高亲和力配体和受体结合， 从而 启动 IL-1信号转导。 该信号转导受到多种因素的调控， 注释如下：
IL-lRa与 IL-1RI结合， 该结合不诱导信号传导 （No s igna l ), 同时减少细胞表面可 以与 IL-1结合的 IL-1RI数量；
IL-l sRI与 IL-1结合， 减少游离 IL-1 , 从而减少 IL-1与 IL-1RI的结合；
IL-l sRI I与 IL-1结合， 减少游离 IL-1 , 从而减少 IL-1与 IL-1RI的结合；
IL-1RI I与 IL-1结合， 该结合不诱导信号传导（No s igna l ), 减少游离 IL-1 , 从而减 少 IL-1与 IL-1RI的结合。
另外， 由于抗体具有特异结合抗原的特性， 当抗体与抗原结合后会直接阻断抗原与其 天然蛋白结合， 从而影响抗原蛋白的生物学功能。 根据图 20, 本领域技术人员很容易知晓 以下阻断 IL-1信号传导的方法：
( 1 ) 抗 IL-1抗体， 该抗体与 IL-1结合后， 阻止其与 IL-1RI结合， 从而阻断 IL-1 信号通路；
( 2 ) 抗 IL-1RI抗体，该抗体与 IL-1RI结合后， 阻止其与 IL-1结合，从而阻断 IL-1 信号通路;
( 3 ) 抗 IL-1R AcP抗体， 该抗体与 IL-1R AcP结合后， 阻止其与 IL-1和 IL-1RI复 合体的结合， 从而使得 IL-1和 IL-1RI不能形成高亲和力结合， 从而阻断 IL-1信号通路。 实施例 1
( IL-lRa 预防性用药对化疗小鼠小肠的保护作用）单次环磷酰胺化疗小鼠中 IL-lRa 预防性用药对小肠的保护作用。
Ba lb/c小鼠， SPF级 8周， 体重 23-28克， 随机分为两组， 第一组在第 -3天至第 -1 天连续注射 3天重组人 IL-lRa( rhIL-IRa X其氨基酸序列如 SEQ ID No. 1所示 X lmg/kg b. w. I. P. ,每隔 24小时注射一次），第二组注射等体积生理盐水（ I. P. ,每隔 24小时注射一次）。 在第 Q 天， 即最后一次注射蛋白或生理盐水之后 12 小时后注射环磷酰胺（CTX ), —次 ( 300mg/kg b. w. L P. )。 观察指标： 小肠切片 HE染色。 每只小鼠取胃下 15厘米处小肠切 片， 统计 4个切面， 每个切面统计 10根绒毛和 10个隐窝， 取长度平均。
结果：
小肠 HE染色统计， 在化疗后， 小鼠小肠受损， 具体表现在小肠绒毛长度变短， 隐窝深 度缩短。 在化疗前给小鼠注射 rhIL-IRa , 可有效保护小肠绒毛长度及隐窝深度。 在第 1. 5 天、第 3天、第 11天，给药组相比对照组， 小肠绒毛长度显著增加（P<0. 05 ,双尾 t-tes t )。 在第 7天， 给药组相比对照组， 小肠绒毛长度显著增加（P<0. 05 , 单尾 t-tes t )。在第 7天， 给药组相比对照组， 小肠隐窝深度显著增加（P<0. 05 , 双尾 t-tes t )。 （图 1、 2及表 1、 2 )
Figure imgf000013_0001
实施例 2
( IL-lRa 预防性用药对化疗小鼠小肠的保护作用） 连续三天环磷酰胺化疗小鼠中 IL-lRa预防性用药对小肠的保护作用。
Ba lb/c小鼠， SPF级 8周， 体重 23-28克， 随机分为两组， 第一组在第 -5天至第 -1 天连续注射 5天 rhIL-IRa ( lmg/kg b. w. L P. ), 每隔 24小时注射一次）， 第二组注射等体 积生理盐水（ I. P. , 每隔 24小时注射一次）。 最后一次注射蛋白或生理盐水之后 24小时后 开始注射 CTX, 在第 0天至第 2天连续注射三次（ 200mg/kg b. w. I. P. , 每隔 24小时注射 一次）。 观察指标： 体重， 进食， 进水， 腹泻及死亡情况。
结果：
体重：在第 0天及以后的观察期内，给药组体重平均值均高于对照组，其中第 2/ 3/12/15 天差异极显著， 第 1 /4/6/13/16天差异显著。 （图 3 )
进食： 给药组每只小鼠平均进食量为 1. 97 克 /只 *天， 对照组每只小鼠平均进食量为
2. 00克 /只 *天。 其中在第- 3/- 2/1 /2/ 3/4/5/6/8/10/11 /12/13/15天， 给药组进食量均高于 对照组。在第 1 / 3/4/5/6/10/11 /12/13/15天，给药组平均每只小鼠的进食量比对照组高 40% 以上。 （图 3 )
进水： 给药组每只小鼠平均进水量为 3. 08 克 /只 *天， 对照组每只小鼠平均进水量为 2. 50克 /只 *天。 其中在第 0/1 /5/7/8/9/11 /12/13/14/15/17天， 给药组进水量均高于对照 组。在第 0/5/7/8/11 /14/17天，给药组平均每只小鼠的进水量比对照组高 40%以上。（图 3 ) 腹泻， 实验过程观察期内， 给药组腹泻情况在每一天均不高于对照组。 给药组平均每 只小鼠每天的腹泻评分指数为 0. 206 , 对照组平均每只小鼠每天的腹泻评分指数为 0. 614。 (图 4 )
生存曲线， 平均生存时间由对照组的 14天提高到 rhIL-IRa给药组的 18. 87天， 提高 了 35%, 生存率由对照组的 40%提高到 rhIL-IRa给药组的 80%, 差异显著（P<0. 05 )。（图 5 ) 实施例 3
( IL-lRa 预防性用药对化疗小鼠小肠的保护作用） 两次环磷酰胺化疗小鼠中 IL-lRa 预防性用药对小肠的保护作用： Ba lb/c小鼠， SPF级 8周， 体重 23-30克， 随机分为两组， 在第 -3天至第 -1天连续腹腔注射 lmg/kg的 rhIL-IRa , 每天一次连续 3天， 对照组注射 NS (第 -3天至第 -1天）； 第 0天一次性腹腔注射 200mg/kg的环碑酰胺。 一个月之后第二次注 射 rhIL-IRa及 CTX, 方法及剂量同上， 两次 CTX注射之间间隔 30天。 在第二次注射 CTX后 观察小鼠体重及生存率。
结果：
两次环磷酰胺化疗 （ 200mg/kg*2次）后小鼠体重水平。 实-验过程中 rhIL-IRa组小鼠 平均体重均高于对照， 其中在第 4至第 9天， 第 12至第 14天， rhIL-IRa与对照组差异极 显著（双尾 t检验， <0. 01 )。 在第 3\10\11 \15\16天， rhIL-IRa与对照组差异显著（双尾 t检验， p<0. 05 ), 在第 1及第 17天， rhIL-IRa与对照组有差异（单尾 t检验， p<0. 05 )。 (图 6 )
生存率。 观察 21天， 平均生存时间： rhIL-IRa组： 21天。 对照组： 15. 8天。 生存率： rhIL-IRa组： 100%。 对照组： 20%。 生存率差异： ρ<0· 05. (图 7 ) 实施例 4
( IL-lRa 预防性用药对化疗小鼠小肠的保护作用） 两次环磷酰胺化疗小鼠中 IL-lRa 预防性用药对小肠的保护作用： Ba lb/c小鼠， SPF级 8周， 体重 23-30克， 随机分为两组， 在第 -3天至第 -1天连续腹腔注射 lmg/kg的 rhIL-IRa , 每天一次连续 3天， 对照组注射 NS (第 -3天至第 -1天）； 第 0天一次性腹腔注射 300mg/kg的环碑酰胺。 一个月之后第二次注 射 rhIL-IRa及 CTX, 方法及剂量同上， 两次 CTX注射之间间隔 30天。 在第二次注射 CTX后 观察小鼠体重及生存率 （连续取血， n=8 )。
结果： 两次环磷酰胺化疗 （ 300mg/kg*2 次）后小鼠体重水平。 实验过程中 rhIL-IRa 组小鼠平均体重在第 6天之后均高于对照， 其中在第 9天， rhIL-IRa与对照组差异极显著 (双尾 t检验，p<0. 01 )。在第 8\10\11天， rhIL-IRa与对照组差异显著（双尾 t检验，p<0. 05 )。 (图 8 ) 实施例 5
( IL-lRa 预防性用药对化疗小鼠小肠的保护作用）三次环磷酰胺化疗小鼠中 IL-lRa 预防性用药对小肠的保护作用
在第 -3 天至第 -1 天给 7-8 周龄 SPF 级雌性 Ba lb/c 小鼠连续腹腔注射 lmg/kg 的 rhIL-IRa , 每天一次连续 3天， 对照组注射 NS (第 -3天至第 -1天）； 第 Q天一次性腹腔注 射 300mg/kg的环磷酰胺。一个月之后第二次注射 rhIL-IRa及 CTX, 方法及剂量同上， 两次 CTX注射之间间隔 30天。 一个月之后第三次注射 rhIL-IRa及 CTX, 方法及剂量同上， 两次 CTX注射之间间隔 30天。 在第三次注射 CTX后观察小鼠体重及生存率。
结果： 生存率。 观察 14天， 平均生存时间： rhIL-IRa组： 11. 57天。 对照组： 7. 29 天。 生存率： rhIL-IRa组： 71. 4%。 对照组： 28. 6%。 生存率差异： p<0. 05。 （图 9 ) 实施例 6
( IL-lRa治疗性用药对化疗小鼠小肠的保护作用 ) IL-lRa治疗性用药， 在 5-Fu化疗 之后给蛋白。
取 8周龄 Ba lb/c雌性小鼠， 第 0天腹腔注射 5-氟尿嘧啶（ 200mg/kg ) , 2小时后皮下 注射连续注射 rhIL-lRa ( lmg/kg ) ,之后每天注射一次，共 5次，对照组注射相同剂量的 PBS。 分别在第 1、 3、 5、 7天处死小鼠， 称量小鼠体重， 并取小肠经过冲洗后称量其湿重， 取近 胃端 40%处小肠 2cm放 4%多聚甲醛液中固定， 做组织切片， HE染色观察损伤程度， 用 PCNA (细胞增殖核心抗原） 染色观察细胞的增殖情况。
结果显示： 注射 rhIL-IRa后， 两组小鼠体重变化有差异， 体重曲线在化疗后前三天没 有差异， 但是第四天开始， 蛋白组小鼠的体重明显恢复的要比对照组快， 至第七天蛋白组 的体重基本恢复到了化疗前水平（图 10)。 化疗后蛋白组第 3、 5、 7天的小肠绒毛高度显著 高于对照组（图 11A, B), 且在第三天时， 对照组的小肠损伤较严重， 可见小肠基底部大量 中性粒细胞浸润， 而蛋白组小肠在第三天时损伤明显减轻（图 12 ); 我们还对化疗后第三天 小肠的切片做了 PCNA (细胞核增殖抗原） 的免疫组化， 结果显示蛋白组的小肠隐窝中阳性 细胞要明显多于对照组， 而且蛋白组中可以看到较为完整的隐窝，增殖明显（图 13 ) 另夕卜， 相关文献釆用小肠湿重 /体重的比值代替湿重作为评价化疗后小鼠小肠病变状况， 因此我们 也釆用该比值作为评价小肠病理改变的指标之一。 表 3可以看出， 注射 rhIL-IRa组在化疗 后不同天小肠的湿重 /体重的比值都要高于对照组组， 说明 、肠保存的较为完整， 其中两组 之间在第三天表现出显著差异（p<0.01)。 与此同时， 小鼠腹泻情况给蛋白组也较对照减轻 (表 4)。
表 3
小肠湿重 （g/1000g体重）
对照 5-FU + PBS 5-FU + rh!L-1Ra 第 1天 42.89 ±2.12 * 47.82 ± 2.43* 第 3天 35.07 ±1.37 *♦ 42,23 ± 1.46 **
^5穴 - 50.47 ± 2.39 * 58.32 ±2.18*
一弔 7 54.35 ±2.17 58.05 ± 2.45 61,.M±2.12 表 4
5-FU r IL-1 a 腹泻评分
3天 5天
+ _ „
- 2.5 1.6
+ 0,8 0.3 实施例 7
( IL-lRa预防性加治疗性用药对化疗小鼠小肠的保护作用）单次环磷酰胺化疗小鼠中
IL-lRa预防性加治疗性用药对小肠的保护作用
在第 -5天至第 2天给 7-8周龄 Balb/c小鼠连续腹腔注射 lmg/kg的 rhIL-IRa,每天一 次连续 8天， 对照组注射 PBS (在第 -5天至第 2天）； 第 0天一次性尾静脉注射 400mg/kg 的环碑酰胺。 观察小鼠生存、 腹泻情况并对小肠切片 HE染色。 每只小鼠取胃下 15-20厘米 处小肠切片， 统计 4个切面， 每个切面统计 5根绒毛和 5个隐窝， 取长度平均。
结果：
单次环磷酰胺化疗（ 400mg/kg.天）后小鼠死亡率（每组 20只小鼠）。以 K-M进程计算， 平均生存时间由对照组的 19. 15天延长至 rhIL-IRa组的 24. 9天， 存活率由对照组的 50% 提高到 80%, 差异显著 ( Log-Rank , p<0. 05 )。 (图 14 )
单次环磷酰胺化疗（ 400mg/kg )后小鼠腹泻水平。 实验过程中 rhIL-IRa组小鼠腹泻情 况明显低于对照。 （图 15 )
小肠 HE染色统计， 在化疗后， 小鼠小肠受损， 具体表现在小肠绒毛长度变短， 隐窝深 度缩短。 在化疗前给小鼠注射 rhIL-IRa , 可有效保护小肠绒毛长度及隐窝深度。 在第 1. 5 天、第 3天、第 11天，给药组相比对照组， 小肠绒毛长度显著增加（P<0. 05 ,双尾 t-tes t )。 在第 7天， 给药组相比对照组， 小肠绒毛长度显著增加（P<0. 05 , 单尾 t-tes t )。在第 7天， 给药组相比对照组， 小肠隐窝深度显著增加（P<0. 05 , 双尾 t-tes t )。 （表 5-8 , 图 16、 17 ) 对照组有部分小鼠， 在化疗后小肠壁受损严重， 隐窝层完全被破坏， 而给药组无此情 况出现。 （表 9 )
表 5: 绒毛长度 ( μ ιη )
绒毛长度 第 0天 第 3天 第 7天 第 11天 第 18天 给药组 371. 077 201. 757 256. 845 352. 705 434. 256 给药组标准差 102. 943 32. 636 156. 324 38. 53 32. 491
对照组 448. 65 237. 174 151. 795 289. 642 408. 852 对照组标准差 29. 943 99. 527 27. 053 9. 429
P值 0. 414 0. 524 0. 232 0. 034 0. 184 表 6: 绒毛宽度（ μ ιη )
绒毛宽度 第 0天 第 3天 第 7天 第 11天 第 18天 给药组 110. 103 65. 190 74. 793 121. 962 121. 204 给药组标准差 39. 797 7. 663 37. 098 15. 334 10. 623 对照组 127. 009 61. 980 55. 694 120. 562 对照组标准差 18. 915 16. 010 8. 637 7. 688 11. 580
Ρ值 0. 642 0. 730 0. 352 0. 001 0. 938 表 7： 隐窝深度 ( μ ιη )
隐窝长度 第 0天 第 3天 第 7天 第 11天 第 18天
给药组 134. 945 161. 13
给药组标准差 24. 888 40. 114
对照组 145. 952 83. 178 115. 422 对照组标准差 1. 718 13. 931 10. 113
P值 0. 91 0. 478 0. 008 0 0. 068 表 8 ：: 隐窝宽度 ( μ ιη )
隐窝宽度 第 0天 第 S 3天 第 7天 第 11天 第 18天
给药组 52. 47 5
给药组标准差 o o 2. 58
对照组 48. 444
对照组标准差 5. 353
P值 0. 412 0. 252 0. 204 0 0. 465 表 9: 完全损毁的小肠壁占总肠壁的面积比 S
对照组第 3天第 1只 ' J、鼠 28. 17%
对照组第 3天第 1只 ' J、鼠 0. 00% 对照组第 3天平均值
对照组第 3天第 3只 ' J、鼠 18. 47%
对照组第 3天第 4只 ' J、鼠 0. 00% 11. 66%
对照组第 7天第 1只 ' J、鼠 42. 24%
对照组第 7天第 1只 ' J、鼠 0. 00% 对照组第 7天平均值
对照组第 7天第 3只 ' J、鼠 41. 84%
对照组第 7天第 4只 ' J、鼠 15. 83% 24. 98%
rhIL-IRa组第三天和第七天均没有这种情况产生 实施例 8
( IL-lRa预防性加治疗性用药对化疗小鼠小肠的保护作用）单次环磷酰胺化疗小鼠中 IL-lRa预防性加治疗性用药对小肠的保护作用： 在在第 -5天至第 2天给 7-8周龄 Ba lb/c 小鼠连续腹腔注射 lmg/kg的 rhIL-IRa , 每天一次连续 8天， 对照组注射 PBS (在第 -5天至 第 2天）； 第 0天一次性尾静脉注射 550mg/kg的环碑酰胺。 观察小鼠生存情况并统计腹泻 情况。
结 果
单次环磷酰胺化疗（ 550mg/kg )后小鼠体重水平。 实验过程中 rhIL-IRa组小鼠腹泻情 况明显低于对照。 （图 18 )
单次环磷酰胺化疗（ 550mg/kg.天）后小鼠死亡率（每组 10只小鼠）。以 K-M进程计算， 平均生存时间由对照组的 8. 5天延长至 rhIL-IRa组的 16. 6天，存活率由对照组的 10%提高 到 50%。 (图 19 ) 实施例 9
( IL-lRa预防性用药对化疗小鼠小肠的保护作用）单次 5-氟尿嘧啶（5-Fu)化疗小鼠中 IL-lRa预防性用药对小肠的保护作用：选取 7周龄 Ba lB/c小鼠，分为 PBS对照组和 IL-lRa 同源序列蛋白， 即重组合成的小鼠 IL-lRa ( rmlL-IRa ) (其氨基酸序列如 SEQ ID No. 2所示） 给药组； 连续 5天注射 1 mg/kg的 rmlL-IRa (与 rhIL-IRa同源性为 77% ), 每天一次皮下 注射（注射前将蛋白用 pH 7. 4 的无热源 PBS稀释至 100 μΐ的体积）， 对照组注射 100 μΐ Η 7. 4 的 PBS。 在第 0天尾静脉注射 5-Fu, 剂量为 200 mg/kg体重。 在 5-Fu注射后第 3天处 死小鼠， 取小肠进行检测， 检测指标为小肠绒毛长度及隐窝深度。
结 果
单次 5-Fu化疗 （ 200 mg/kg )后 rmlL-IRa注射小鼠与对照组相比， 注射蛋白组小肠绒 毛长度及隐窝深度显著高于对照组， 说明其受损程度较轻（图 21 , 22 )。 本发明的范围不受所述具体实施方案的限制， 所述实施方案只作为阐明本发明各个方 面的单个例子， 本发明范围内还包括功能等同的方法和组分。 实际上， 除了本文所述的内 容外， 本领域技术人员参照上文的描述和附图可以容易地掌握对本发明的多种改进。 所述 改进也落入所附权利要求书的范围之内。 上文提及的每篇参考文献皆全文列入本文作为参 考。

Claims

权 利 要求 书
1. 一种如下（a)或（b)的蛋白在制备预防或治疗肠道黏膜上皮细胞损伤疾病药物中的 用途：
(a) 其氨基酸序列如 SEQ ID NO: 1所述的蛋白；
(b) 具有与（a)中的氨基酸序列至少 70 %同源性且具有预防或治疗肠道黏膜上皮细胞 损伤疾病效果的蛋白。
2. 根据权利要求 1所述的用途，其特征在于，所述肠道黏膜上皮细胞损伤疾病为缺血 缺氧、 毒素、 射线、 或药物导致的肠道黏膜上皮细胞损伤疾病。
3. 根据权利要求 2所述的用途， 其特征在于， 所述药物为化疗药物。
4. 根据权利要求 3所述的用途， 其特征在于， 所述化疗药物为烷化剂类药物、抗代谢 类药物、 抗生素类药物、 植物类药物、 激素类药物、 金属络合物或蛋白药物。
5. 根据权利要求 3所述的用途， 其特征在于， 所述化疗药物为环磷酰胺或 5-氟尿嘧 啶。
6. 根据权利要求 1所述的用途，其特征在于，所述（b)的蛋白为具有与（a)中的氨基酸 序列至少 77 %同源性且具有预防或治疗肠道黏膜上皮细胞损伤疾病效果的蛋白。
7. 一种药物组合物，包含如下（a)或（b)的蛋白作为活性成分和药学上可接受的载体或 赋形剂：
(a) 其氨基酸序列如 SEQ ID NO: 1所述的蛋白；
(b) 具有与（a)中的氨基酸序列至少 70 %同源性且具有预防或治疗肠道黏膜上皮细胞 损伤疾病效果的蛋白。
8. 根据权利要求 7所述的药物组合物，其特征在于，所述（b)的蛋白为具有与（a)中的 氨基酸序列至少 77 %同源性且具有预防或治疗肠道黏膜上皮细胞损伤疾病效果的蛋白。
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