KR20240041399A - 항암 활성을 갖는 신규한 펩타이드 및 이의 용도 - Google Patents

항암 활성을 갖는 신규한 펩타이드 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 항암 활성을 갖는 신규한 펩타이드 및 이의 용도에 관한 것으로, 본 발명의 신규한 펩타이드는 암세포 특히 간암세포, 폐암세포 및 대장암세포에 대하여 우수한 세포 증식 억제능을 가지는 것을 확인하였다. 따라서, 본 발명에 따른 신규한 펩타이드는 우수한 항암 활성을 보유하여 이를 이용한 항암 치료용 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

항암 활성을 갖는 신규한 펩타이드 및 이의 용도{Novel peptide having anti-cancer activity and uses thereof}
본 발명은 항암 활성을 갖는 신규한 펩타이드 및 이의 용도에 관한 것이다.
암은 세계적으로 높은 사망률을 보이고 있으며, 서구 사회에서는 심혈관 질환 다음으로 가장 일반적인 사망 원인이다. 특히, 인구의 고령화, 식생활의 서구화로 인한 고지방식의 섭취의 일반화, 환경 오염 물질의 급격한 증가, 음주량의 증가 등으로 대장암, 유방암, 전립선암 등이 지속적으로 증가하는 추세에 있다. 이러한 실정에서 암의 조기 예방 및 치료를 가능하게 하여 인간 건강의 증진, 건강한 삶의 질 향상 및 인류 보건 증진에 기여할 수 있는 항암 물질의 창출이 절실히 요구되고 있다.
간암은 전 세계적으로 다섯 번째로 빈발하는 암이지만 그로 인한 사망률은 3위에 해당하는 공격적인 암이다. 치료목적의 수술은 단지 15%에서 25% 정도의 환자에게만 가능하고 대부분의 간암 환자들은 국부적으로 진행하거나 전이되는 질병들에 의해 비교적 단기간 내에 사망한다. 간암의 주요 원인으로 B형 간염 바이러스(hepatitis B virus), C형 간염 바이러스(hepatitis C virus), 및 아플라톡신 B1(aflatoxin B1) 등이 잘 알려져 있다. 하지만, 지난 20년 간 간암 환자의 전체적인 생존율은 크게 증가하지 않았고, 간암의 발달(development) 및 진전(progression) 기작은 여전히 잘 알려져 있지 않은 상태이다.
폐암은 현미경적으로 암세포의 크기와 형태에 따라 비소세포 폐암(non-small cell lung cancer: NSCLC)과 소세포 폐암(small cell lung cancer: SCLC)으로 구분된다. 이렇게 비소세포 폐암과 소세포 폐암을 구분하는 것은 임상적 경과와 치료가 다르기 때문인데, 전체 폐암의 80~85%를 차지하는 비소세포 폐암은 조기에 진단할 경우 수술적 요법으로 치료할 수 있으나, 조기 발견이 어려운 폐암의 특성상 늦게 발견되어 치료가 어려운 경우가 많다. 비소세포 폐암은 3종류의 서브 타입으로 구성된다: 40% 선암(adenocarcinoma), 40% 편평상피세포암 (squamous cell carcinoma) 및 20% 대세포암(large cell carcinoma). TMN 병기 구분법 (staging system)이 폐암의 관리에 널리 받아들여지고 있다. 일차 종양은 종양 크기, 부위 및 국부적 병발(local involvement)에 따라 4개의 T 카테고리 (T1-T4)로 구분된다. 림프 절 확산(spread)은 폐 내의 기관지/폐(bronchio/pulmonary)내로 전달(N1), 상기 일차 종양과 같은 측면 상의 종격동 확산(medistinal spread)(N2) 및 상기 일차 폐 종양의 맞은 편으로 종격동 확산 또는 상부클라비움 병발(supraclavilcular involvement)(N3)로 구분된다. 원격 또는 전이 확산(metastatic spread)은 없거나 있다(M0 또는 M1). 일반적으로 전이가 이루어지지 않은 폐암은 외과적 수술을 통하여 제거하는 방법으로 치료를 한다. 그러나, 폐암 제거 수술 후의 재발율은 20 내지 50%로 높다 (Cancer: Principles & Practice of Oncology, 56th. ed. In: Devita DV, Hellman S, Rosenberg SA, eds. Philadelphia, PA: Lippincott Williams & Wilkins, 2001).
대장암은 폐암과 유방암에 이어 전세계적으로 세 번째로 높은 발생률과 두 번째로 높은 사망률을 가지고 있다. 초기 단계의 대장암 환자의 5년 생존율은 90%에 육박하지만 소수의 환자만이 초기 상태에서 발견된다. 따라서 대장암의 발생 기전에 대한 분자적인 이해가 초기 대장암의 진단과 치료를 위해 필요하다. Fearon 과 Vogelstein은 대장암이 암 억제 유전자의 유전적 및 후성 유전적 변이의 누적으로 발생한다고 주장하였다. 정상 대장 상피세포는 선종-암종 서열(adenoma-carcinoma sequence)로 알려진 염색체 불안정성 경로(chromosomal instability pathway)를 통해 대장암으로 발전한다. 이 과정은 APC, TP53의 상실과 KRAS 유전자의 과발현을 동반한다. 암화의 첫 번째 과정으로 Wnt 경로의 길항자인 APC의 기능적 상실이 우선된다. APC의 기능 상실과 그 영향은 오랜 세월 동안 연구되었지만 유전적 변화에 이은 즉각적인 변화는 관측이 어렵기 때문에 널리 연구된바 없다.
현재 사용되고 있는 항암제의 대부분은 화학요법에 의해 개발된 것으로 암의 종류에 따라 약리작용이 다양하고, 독성에 의한 부작용이 다양하게 나타났기 때문에 암치료시 문제점으로 지적되고 있다. 또한 항암제는 암세포의 성장을 효과적으로 억제하기도 하지만, 때로는 정상조직에도 침투하여 정상조직, 특히 세포분열이 활발한 조직세포에도 손상을 입히기 때문에 골수기능저하, 위장장애, 탈모증을 유발하기도 하고 암세포가 성장, 증식과 전이를 일으키는 과정에서 변이되면서 항암제에 대한 저항성을 보이는 등 암 치료의 커다란 문제점으로 대두되고 있다.
따라서, 항암제가 지니는 정상세포에 대한 독성과 암세포의 저항성의 심각한 문제를 해결할 수 있는 효과적인 항암제의 개발에 관한 연구가 활발히 진행되어 오고 있다. 이러한 연구로서 지금까지는 주로 종양세포에 특이한 항원 및 이를 표적하는 항체를 개발하여 왔으나, 항체의 경우 면역반응의 우려 및 조직 내 침투의 낮은 효율성 등의 문제점이 존재하였다. 반면 펩타이드의 경우는 분자량이 작아 면역반응의 우려가 적고 조직 내 침투가 용이한 장점을 갖으므로 암 표적 펩타이드를 기존의 항암제와 연결하게 되면 종양에 선택적으로 약물을 전달하는 지능형 약물전달체로 활용되어 질 수 있어, 암 표적 펩타이드의 개발이 요구되고 있다.
그럼에도 불구하고, 대부분의 펩타이드가 상용화되기 어려운 이유는 구조가 복잡하고 아미노산 서열이 15개 이상으로 합성이 까다롭고 생산 비용이 많이 들기 때문이다. 따라서 구조가 단순하고, 아미노산 서열이 짧은 양친매성 항암 펩타이드 개발이 필요한 실정이다.
대한민국 공개특허 제10-2013-0006202호
본 발명의 목적은 서열번호 1, 2, 3, 4 또는 5의 아미노산 서열로 이루어진 구조가 단순하고 짧은 아미노산 서열의 합성이 용이한 신규 펩타이드를 제공하는 데 있다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 서열번호 1, 2, 3, 4 또는 5의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드 중 어느 하나 이상의 펩타이드를 유효성분으로 포함하는, 암 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 데 있다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 인간을 제외한 동물의 암을 치료하는 방법을 제공하는 데 있다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 서열번호 1, 2, 3, 4 또는 5의 아미노산 서열로 이루어진 신규 펩타이드를 제공한다.
나아가, 본 발명은 서열번호 1, 2, 3, 4 또는 5의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드 중 어느 하나 이상의 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
마지막으로, 본 발명은 서열번호 1, 2, 3, 4 또는 5의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드 중 어느 하나 이상의 펩타이드를 치료를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 인간을 제외한 동물의 암을 치료하는 방법을 제공한다.
본 발명의 신규한 펩타이드는 간암세포, 폐암세포 및 대장암세포에 대하여 우수한 세포 증식 억제능을 가지는 것을 확인하였다. 따라서, 본 발명에 따른 신규한 펩타이드는 우수한 항암 활성을 보유하여 이를 이용한 항암 치료용 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 있어서, 본 발명의 신규한 펩타이드의 구조를 나타낸 도이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 있어서, 본 발명의 신규한 펩타이드의 간암 세포(HepG2 세포)에 대한 항암 활성을 나타낸 도이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 있어서, 본 발명의 신규한 펩타이드의 폐암 세포(A549 세포)에 대한 항암 활성을 나타낸 도이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 있어서, 본 발명의 신규한 펩타이드의 대장암 세포(SW480 세포)에 대한 항암 활성을 나타낸 도이다.
이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 구현예로 본 발명을 상세히 설명하기로 한다. 다만, 하기 구현 예는 본 발명에 대한 예시로 제시되는 것으로, 당업자에게 주지 저명한 기술 또는 구성에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우에는 그 상세한 설명을 생략할 수 있고, 이에 의해 본 발명이 제한되지는 않는다. 본 발명은 후술하는 특허 청구범위의 기재 및 그로부터 해석되는 균등 범주 내에서 다양한 변형 및 응용이 가능하다.
또한, 본 명세서에서 사용되는 용어(Terminology)들은 본 발명의 바람직한 실시 예를 적절히 표현하기 위해 사용된 용어들로서, 이는 사용자, 운용자의 의도 또는 본 발명이 속하는 분야의 관례 등에 따라 달라질 수 있다. 따라서 본 용어들에 대한 정의는 본 명세서 전반에 걸친 내용을 토대로 내려져야 할 것이다. 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 “포함”한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.
본 명세서 전체에 걸쳐, 특정 물질의 농도를 나타내기 위하여 사용되는 '%'는 별도의 언급이 없는 경우, 고체/고체는 (w/w) %, 고체/액체는 (w/v) %, 그리고 액체/액체는 (v/v) %이다.
이하, 본 발명에 대하여 보다 상세하게 설명하도록 한다.
일 측면에서, 본 발명은 서열번호 1, 2, 3, 4 또는 5의 아미노산 서열로 이루어진 신규 펩타이드를 제공한다.
본 발명에서 사용되는 용어 "아미노산"이란 자연적으로 펩타이드로 통합되는 22개의 표준 아미노산들 뿐만 아니라 D-아이소머 및 변형된 아미노산들을 포함한다. 이에 따라, 상기 펩타이드는 D-아미노산을 포함하는 펩타이드일 수 있다. 한편, 본 명세서 내에서 사용된 아미노산 서열은 IUPAC-IUB 명명법에 따라 약어로 기재하였다.
본 발명에서 사용되는 용어 “펩타이드”란 아미드 결합(또는 펩타이드 결합)으로 연결된 2개 이상의 아미노산으로 이루어진 폴리머를 의미한다.
또한, 상기 펩타이드는 기능에 영향을 미치지 않는 범위 내에서, 아미노산 잔기의 결실, 삽입, 치환 등 번역 후 변형(post-translational modification)에 의해서 상이한 서열을 가지는 아미노산의 변이체들 또는 단편들일 수 있다. 번역 후 변형의 예는 인산화(phosphorylation), 당화(glycosylation), 아실화(acylation) (예컨대, 아세틸화(acetylation), 미리스토일화(myristoylation) 및 팔미토일화(palmitoylation)를 포함), 알킬화(alkylation), 카르복실화(carboxylation), 히드록실화(hydroxylation), 당화반응(glycation), 비오티닐화(biotinylation), 유비퀴티닐화(ubiquitinylation), 화학적 성질의 변화(예컨대, 베타-제거 탈이미드화, 탈아미드화) 및 구조적 변화(예컨대, 이황화물 브릿지의 형성) 를 포함한다. 또한, 펩타이드 컨쥬게이트를 형성하기 위한 가교제(crosslinker)들과의 결합과정에서 일어나는 화학 반응들에 의해 생기는 아미노산의 변화, 예컨대 아미노기, 카르복시기 또는 사이드 체인에서의 변화와 같은 아미노산의 변화를 포함한다.
따라서, 본 발명은 서열번호 1, 2, 3, 4 또는 5의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드와 실질적으로 동일한 펩타이드 및 이의 변이체 또는 이의 활성 단편을 포함한다.
상기 실질적으로 동일한 펩타이드란 상기 서열번호 1, 2, 3, 4 또는 5의 아미노산 서열과 75% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 예컨대, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열을 의미하나 이에 한정되지 않으며, 75% 이상의 아미노산 서열의 상동성을 가지며 동일한 활성을 가진다면 본 발명의 범위에 포함된다. 또한, 본 발명의 펩타이드는 표적화 서열, 태그(tag), 표지된 잔기, 반감기 또는 펩타이드 안정성을 증가시키기 위한 특정 목적으로 제조된 아미노산 서열을 추가적으로 포함할 수 있다.
또한, 상기 펩타이드는 화학적 안정성, 강화된 약리 특성(반감기, 흡수성, 역가, 효능 등), 변경된 특이성(예를 들어, 광범위한 생물학적 활성 스펙트럼), 감소된 항원성을 획득하기 위하여, 펩타이드의 N- 또는 C-말단에 보호기가 결합되어 있을 수 있다. 일 구체예에 있어서, 상기 펩타이드의 N-말단은 아세틸기(acetyl group), 플루오레닐메톡시카르보닐기(fluoreonylmethoxycarbonyl group), 포르밀기(formyl group), 팔미토일기(palmitoyl group), 미리스틸기(myristyl group), 스테아릴기(stearyl group), 부톡시카르보닐기(butoxycarbonyl group), 아릴옥시카르보닐기(allyloxycarbonyl group) 및 폴리에틸렌글리콜(polyethylene glycol; PEG)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 보호기와 결합될 수 있고; 및/또는 상기 펩타이드의 C-말단은 아미노기(amino group, -NH2), 삼차 알킬기(tertiary alkyl group) 및 아자이드(azide, -NHNH2)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 보호기와 결합될 수 있다. 또한, 상기 펩타이드는 선택적으로, 표적화 서열, 태그(tag), 표지된 잔기, 반감기 또는 펩타이드 안정성을 증가시키기 위한 특정 목적으로 제조된 아미노산 서열도 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 “안정성”은 생체 내 단백질 절단효소의 공격으로부터 상기 펩타이드를 보호하는 in vivo 안정성뿐만 아니라, 저장 안정성(예컨대, 상온 저장 안정성)도 의미할 수 있다.
본 발명의 펩타이드는 당업자에게 알려진 통상의 펩타이드 합성 방법 혹은 제조 방법을 통하여 각 펩타이드의 순도가 90% 이상이 되도록 제작할 수 있으며, 예컨대 직접 합성하거나 펩타이드 제조회사에 제조를 의뢰한 후 구입하여 사용할 수 있다. 상기 펩타이드는 당업자에게 알려진 통상의 펩타이드 합성 방법 혹은 제조 방법을 통하여 D-form이나 L-form, 서열 중 일부만 D-form이나 L-form으로 구성된 펩타이드, 또는 이들의 라세미체 형태로 모두 제작하여 사용될 수 있다. 또한, 펩타이드의 안정성을 높이기 위해 그 외의 당업계에 공지된 통상적인 변형이 가능하다. 본 발명에서는 바람직하게 고체상 펩타이드 합성(Solid state peptide synthesis) 방법을 이용하여 펩타이드를 합성하였으나, 전술한 바와 같이 펩타이드 합성 방법 및 조건이 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 상기 펩타이드는 고리형 구조를 가지는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 상기 펩타이드는 암세포의 증식을 억제하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 암은 간암, 폐암, 및 대장암으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 펩타이드는 암세포에 독성을 나타내어 암세포의 생장을 억제할 수 있는 바, 암을 예방 내지 치료하기 위해 활용될 수 있다.
나아가, 본 발명은 서열번호 1, 2, 3, 4 또는 5의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드 중 어느 하나 이상의 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
상기 암은 간암, 폐암, 및 대장암으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 사용되는 용어 “암”은 세포 자체의 조절 기능에 문제가 생겨 정상적으로는 사멸해야 할 비정상 세포들이 과다 증식하여 주위 조직 및 장기에 침입하여 덩어리를 형성하고 기존의 구조를 파괴하거나 변형시키는 상태를 의미하며, 악성 종양과 동일한 의미로 사용된다.
본 발명에서 사용되는 용어 “예방”이란 본 발명에 따른 조성물의 투여에 의해 암의 발생, 발달 및 재발을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에서 사용된 용어 “치료”란 본 발명에 따른 조성물의 투여로 암 및 이로 인한 합병증의 증세를 호전시키거나 이롭게 변경하는 모든 행위를 의미한다. 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면, 대한의학협회 등에서 제시된 자료를 참조하여 본원의 조성물이 효과가 있는 질환의 정확한 기준을 알고, 개선, 향상 및 치료된 정도를 판단할 수 있을 것이다.
본 발명에 따른 조성물은 약학적으로 유효한 양의 서열번호 1, 2, 3, 4 또는 5의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드 중 어느 하나 이상의 펩타이드를 단독으로 포함하거나 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 포함할 수 있다. 상기에서 약학적으로 유효한 양이란 면역질환의 증상을 예방, 개선 및 치료하기에 충분한 양을 말한다. 상기에서 "약학적으로 허용되는"이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 조성물을 말한다.
또한, 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 조성물은 경구 또는 비경구의 여러 가지 제형일 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 상기 담체, 부형제 및 희석제로는 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 생리식염수, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시 벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유, 덱스트린, 칼슘카보네이트, 프로필렌글리콜 및 리퀴드 파라핀으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 통상의 담체, 부형제 또는 희석제 모두 사용 가능하다. 상기 성분들은 상기 유효성분인 서열번호 1, 2, 3, 4 또는 5의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드 중 어느 하나 이상의 펩타이드에 독립적으로 또는 조합하여 추가될 수 있다.
또한, 경구 투여를 위한 고형제제에는 정제환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함될 수 있으며, 이러한 고형제제는 하나 이상의 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로오스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 스테아린산 마그네슘, 탈크 등과 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.
비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁용제, 유제, 동결건조제제, 좌제 등이 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세롤, 젤라틴 등이 사용될 수 있다.
또한, 본 발명의 약학 조성물은 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제, 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제, 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제 및 좌제로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 제형을 가질 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세롤, 젤라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구 투여(예를 들어, 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)할 수 있으며, 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다.
본 발명의 약학 조성물은 암의 예방 또는 치료 효과를 위하여 단독으로, 또는 수술, 호르몬 치료, 약물 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.
마지막으로, 본 발명은 서열번호 1, 2, 3, 4 또는 5의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드 중 어느 하나 이상의 펩타이드를 치료를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 인간을 제외한 동물의 암을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.
또한, 상기 암은 간암, 폐암 및 대장암으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 사용되는 용어 "개체"란 암을 예방 또는 치료를 목적으로 하는 개체이면 특별히 한정되지 않고, 인간을 제외한 말, 양, 돼지, 염소, 낙타, 영양, 개, 설치류, 예컨대 마우스, 유전자 조작된 마우스 등 제한 없이 사용될 수 있다. 보다 구체적으로는, 비-인간인 영장류, 생쥐(mouse), 쥐(rat), 개, 고양이, 말, 소 등의 포유류를 의미한다.
본 발명의 약학 조성물은 치료학적으로 유효한 양 또는 약학적으로 유효한 양으로 투여될 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 "치료학적으로 유효한 양"은 대상 질환을 예방 또는 치료하는데 유효한 조성물의 약학적으로 허용가능한 염의 양을 의미하며, 본 발명의 조성물의 치료적으로 유효한 양은 여러 요소, 예를 들면 투여방법, 목적부위, 환자의 상태 등에 따라 달라질 수 있다. 따라서, 인체에 사용 시 투여량은 안전성 및 효율성을 함께 고려하여 적정량으로 결정되어야 한다. 동물실험을 통해 결정한 유효량으로부터 인간에 사용되는 양을 추정하는 것도 가능하다. 유효한 양의 결정시 고려할 이러한 사항은, 예를 들면 Hardman and Limbird, eds., Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 10th ed. (2001), Pergamon Press; 및 E.W. Martin ed., Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th ed. (1990), Mack Publishing Co.에 기술되어있다.
본 발명에서, 용어 “약학적으로 유효한 양”은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분하며 부작용을 일으키지 않을 정도의 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 건강상태, 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 방법, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 배합 또는 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고, 종래의 치료제와 순차적으로 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여, 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
이하, 본 발명의 실시예를 첨부된 도면을 참고하여 보다 상세하게 설명하도록 한다. 그러나, 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 구체화하기 위한 것일 뿐, 이에 의해 본 발명이 한정되는 것은 아닐 것이다.
<실시예 1> 항암 활성을 가지는 후보 펩타이드 선정 및 합성
효율적인 항암 활성을 가지는 펩타이드를 제작하기 위해, 양친매성 펩타이드를 만들기위해 무작위적으로 아미노산을 조합하였다. 이후 고리형 구조를 만들 수 있도록 일부 아미노산을 치환하여 펩타이드 디자인을 완성하였다. 디자인된 펩타이드 중에서 항암 효능이 있는 펩타이드 5종을 후보 펩타이드로 선정하였다.
상기 5종의 펩타이드의 합성은 고체상 방법(solid phase method)으로 Peptron (Daejeon, Korea)에 의뢰하여 진행하였다. C-terminal로 왕 레진(wang resin)을 이용하였고 Fmoc-L-amino acids의 coupling은 O-Benzotriazole-N,N,N, HBTU (N'-tetramethyl-uronium-hexafluoro-phosphate)로 수행하였다. 아미노산 사이드 체인(Amino acid side chains)은 터트-부틸과 터트-부틸옥시카보닐(tert-butyloxycarbonyl)로 보호하였고 트리플루오로아세트산(trifluoroacetic acid), 물, 티오아니솔(thioanisole) 및 1,2-에탄디올(1,2-ethandithiol)(87.5, 5.0, 5.0, 2.5, v/v)의 혼합물을 이용하여 deprotection과 절단을 수행하였다. 고리화는 서열 내의 시스테인 잔기의 이황화 결합으로 완성하였다.
Crude 펩타이드는 디에틸에테르(diethylether)로 반복 수세 후 진공 건조 시키고 RP-HPLC, Shimadzu 5-μm Shimpak ODS C18 칼럼(20Х250 mm)으로 정제하였다. 정제된 펩타이드는 분석용 RP-HPLC, Shimpak ODS C18 칼럼(4.6Х250 mm)으로 확인하였다. 합성한 펩타이드의 분자 질량(molecular masses)은 matrix-assisted laser desorption ionization MALDI-mass spectrometer(Shimadzu Axima Assurance)를 이용하여 확인하였다.
<실시예 2> 항암 활성을 가지는 후보 펩타이드의 물리화학적 특성 확인
본 발명에서 새롭게 디자인한 5종의 후보 펩타이드의 2차 구조를 분석하고 이의 특성을 파악하기 위하여, 펩타이드의 특성 분석은 ExPASy(the Expert Protein Analysis System)과 ProtParam algorithm을 이용하여 확인하였다.
그 결과, 도 1 및 표 1에 나타낸 바와 같이 본 발명의 후보 펩타이드 중 RSLCRRGVC 펩타이드(서열번호 1), RSICTRGFC 펩타이드(서열번호 2), KMNFCRRGVC 펩타이드(서열번호 3), KMNFCTRGFC 펩타이드(서열번호 4) 및 IMTFCTRGFC 펩타이드(서열번호 5)는 2개의 시스테인(cys, C)를 포함하여 1개의 disulfide bond를 가지며 C/N terminal이 노출된 고리형 구조를 가지고, 10-mer이며, 분자량은 평균적으로 약 1209.5 g/mol을 가지는 것을 확인하였다.
의약용도 사용되는 펩타이드의 경우 펩타이드가 크면 클수록 세포내로 전달력이 떨어지고 생체내 이용률이 떨어지며, cyclic한 구조를 갖고 있다고 하더라고 10-mer가 넘는 펩타이드는 세포 내로 전달력이 떨어지며, 아미노산 중 시스테인(cysteine, C)에 의한 disulfide bond(S-S 결합)의 개수가 많거나, C/N terminal 연결된 환형 구조의 펩타이드의 경우 화학적 합성이 어려운 것으로 알려져 있다.
따라서, 본 발명의 서열번호 1 내지 5의 후보 펩타이드는 10-mer 크기의 펩타이드로 화학적 합성이 용이하고, 기존 항암 펩타이드에 비해 disulfide bond(S-S 결합)의 개수가 적으며, C/N terminal이 노출되어 있는 고리형 구조를 가져 생체내 안정성, 전달력 및 생체내 이용률이 높다는 것을 의미한다.
Peptide Sequence Molecular weight
(Da)		 Structure Length
(-mer)		 서열
번호
FD-A1 RSLCRRGVC 1046.5 Cyclic C4-C9 9 1
FD-A2 RSICTRGFC 1039.5 Cyclic C4-C9 9 2
FD-A3 KMNFCRRGVC 1210.5 Cyclic C5-C10 10 3
FD-A4 KMNFCTRGFC 1203.5 Cyclic C5-C10 10 4
FD-A5 IMTFCTRGFC 1175.5 Cyclic C5-C10 10 5
<실시예 3> 후보 펩타이드의 항암 활성 확인
폐암 A549(ATCC, human lung adenocarcinoma cell line), 대장암 SW480(ATCC, Human colon adenocarcinoma cell line) 및 간암 HepG2(ATCC, human hepatocellular carcinoma cell line) 세포주를 CO2(5%)를 포함한 습한 환경에서 37℃의 멸균 조건하에 배양하였다. 배양 배지는 FBS(10%) 및 페니실린/스트렙토마이신으로 보충된 DMEM으로 구성되었다. 배양된 세포를 96-웰 플레이트에 1 × 105 cells(single-cell suspension) 농도로 각 웰에 분주하고, 다양한 농도(250, 500, 1000 ㎍/ml)의 후보 펩타이드를 A549(ATCC, human lung adenocarcinoma cell line), SW480(ATCC, Human colon adenocarcinoma cell line) 및 HepG2(ATCC, human hepatocellular carcinoma cell line) 세포주에 24 시간 동안 처리하였다. CCK8 용액을 각 웰에 첨가하고, 배양 배지 제거 전에 반응이 일어나도록 플레이트를 37 ℃에서 2시간 배양하였다. 세포 생존능을 분광광도계(spectrophotometer)를 이용하여 흡광도 450 nm에서 측정하였다. 세포 생존능은 대조군(무처리군)에 대한 비율(%)로 계산되었다. 펩타이드에 대한 용량-반응 곡선을 설정하고 세포 생존율을 50 % 감소시키기에 충분한 농도(IC50)를 계산하였다. 그 결과는 표 2 및 도 3 내지 도 5에 나타내었다.
그 결과, RSLCRRGVC 펩타이드(서열번호 1) 및 KMNFCRRGVC 펩타이드(서열번호 3)의 경우, HepG2 세포주에 대하여 다른 후보 펩타이드에 비해 우수한 항암 활성을 나타내었다. 특히, A549 세포주의 경우 모든 후보 펩타이드가 농도에 상관없이 높은 항암활성을 가지는 것을 확인하였다(도 3). 또한, IMTFCTRGFC 펩타이드(서열번호 5)는 저농도(250 ㎍/ml)에서는 다른 후보 펩타이드와 유사한 항암 활성을 보였으나, 고농도(500 ㎍/ml 및 1000 ㎍/ml)에서 서열번호 1 내지 4의 펩타이드와 달리 대장암에 대하여 높은 항암 활성을 나타냈다(도 4).
서열번호 Peptide Sequence Target cancer cells IC50(mM)
1 FD-A1 RSLCRRGVC HepG2 1.43
A549 0.42
SW480 0.88
2 FD-A2 RSICTRGFC HepG2 1.09
A549 0.35
SW480 1.15
3 FD-A3 KMNFCRRGVC HepG2 1.18
A549 0.28
SW480 1.47
4 FD-A4 KMNFCTRGFC HepG2 0.95
A549 0.32
SW480 1.99
5 FD-A5 IMTFCTRGFC HepG2 1.69
A549 0.49
SW480 0.74
이상에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 구체적인 실시예를 상세하게 설명되었으나, 본 발명의 사상을 이해하는 당업자는 동일한 사상의 범위 내에서 다른 구성요소를 추가, 변경, 삭제 등을 통하여, 퇴보적인 다른 발명이나 본 발명 사상의 범위 내에 포함되는 다른 실시예를 용이하게 제안할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상술한 상세한 설명보다는 후술하는 특허청구의 범위에 의하여 나타내어지며, 특허청구의 범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (5)

  1. 서열번호 1, 2, 3, 4 또는 5의 아미노산 서열로 이루어진, 신규 펩타이드.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 펩타이드는 고리형 구조를 가지는 것인, 신규 펩타이드.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 펩타이드는 항암 활성을 가지는 것인, 신규 펩타이드.
  4. 서열번호 1, 2, 3, 4 또는 5의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  5. 서열번호 1, 2, 3, 4 또는 5의 아미노산 서열로 이루어진 신규 펩타이드를 암 치료를 필요로 하는 인간을 제외한 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암을 치료하는 방법.
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