PT2633865T - Uso de interleucina-22 no tratamento de hepatite viral - Google Patents

Description

ser facilmente convertidos em cirrose, insuficiência hepática e cancro do fígado. Calcula-se que existam cerca de 200 a 300 milhões de casos de hepatite B crónica a nível mundial e em que os Estados Unidos são responsáveis por 1,2 milhões de casos. A hepatite B é causada pelo vírus da hepatite B. Adicionalmente, existem cerca de 150 mil novos casos de hepatite C anualmente (a hepatite C era anteriormente conhecida como hepatite não-A não-B). Cerca de 50 a 70% dos casos de hepatite C são convertidos em casos de hepatite C crónica e os casos de hepatite C crónica podem ser facilmente convertidos em cirrose, insuficiência hepática e cancro do fígado. Estima-se que existam cerca de 3,5 milhões de casos de hepatite C crónica nos Estados Unidos. Tanto os casos de hepatite B como os de hepatite C podem ser convertidos em hepatite crónica. Na condição de hepatite crónica, o vírus da hepatite continua infeccioso e replica-se no fígado durante um longo período de tempo, o que ao mesmo tempo causa inflamação crónica do fígado, levando a cirrose, insuficieência hepática e cancro do fígado.

Por exemplo, na China, existem 500 a 600 mil novos casos de hepatite virai em que a hepatite A é responsável por 150 mil destes casos. O diagnóstico das hepatites virais baseia-se na detecção da presença de anticorpos contra o vírus, material genético virai, proteínas e antigénios virais. Os biomarcadores importantes no desenvolvimento de danos do tecido derivados da hepatite são o aumento da actividade de enzimas do sangue e transaminases, tais como aspartato aminotransferase (AST ou S(GOT)) e alanina aminotransferase (ALT ou SGPT).

Os métodos de tratamento de hepatite aguda e crónica são diferentes. Para o tratamento de hepatite virai aguda (hepatite A), o primeiro passo para o fazer é aliviar os sintomas de náusea, vómito e dor abdominal do doente. Presentemente, não existe cura para a hepatite A da perspectiva clinica e a terapia foca-se em assegurar que os doentes têm suplementos nutritivos suficientes e em evitar lesão hepática permanente. Os doentes com hepatite aguda podem ser tratados com imunoglobulina dentro de 2 semanas após o aparecimento da doença. 0 principal tratamento dos casos de hepatite B crónica é interferâo (interferão a-2b ou interferão A) e interferão peguilado a-2a (Pegasys), assim como fármacos antivirais tais como telbivudina (Tyzeka), entecavir (Baraclude), lamivudina (Epivir-HBV) e adefovir dipivoxil (Hepsera). 0 principal tratamento dos casos de hepatite C crónica são os antivirais e interferão ou composto de interferão, como sejam interferão a-2a peguilado e interferão a-2b peguilado em combinação com o fármaco antiviral ribavirina. Actualmente, não existe um fármaco eficaz para o tratamento de danos hepáticos causados por virus. IL-22, também conhecida como factor induzivel derivado de células T relacionado com interleucina-10 (IL- TIF), é uma glicoproteína secretada por células T. A expressão do mRNA de IL-22 foi originalmente demonstrada em linhas de células T estimuladas por IL-9, linha celular de mastócitos estimulada por IL-9, assim como células de baço de murganho activadas com concanavalina A. 0 mRNA de IL-22 humana é expresso principalmente em células T periféricas isoladas e quando da estimulação por anticorpo anti-CD-3 ou por ConA. 0 mRNA de IL-22 é igualmente expresso nas células NK estimuladas. As células T activadas são principalmente células CD4+, especialmente células Thl através da via CD2 8 . 0 precursor de IL-22 é composto por 179 resíduos de aminoácidos (o péptido maduro é composto por 146 resíduos de aminoácidos). Dumoutier descreveu pela primeira vez as sequências de DNA de IL-22 de murganho e humanas clonadas (Dumoutier, et al, JI 164:1814-1819, 2000). Ainda, Dumoutier é proprietário das patentes relacionadas com IL-22 (US 6,359,117 e US 6,274,710), enquanto Gurney é proprietário da patente relacionada com o uso de IL-22 no tratamento de doença pancreática humana (US 6,551,799). IL-22 é principalmente expressa em timo, cérebro, células T activadas e mastócitos, células do baço estimuladas por lectinas (Duroutier JI 2002), células NK estimuladas por interleucina-2/interleucina-12 (Wolk, K JI 2002), e numa série de órgãos e tecidos, incluindo tubo digestivo, fígado, estômago, rim, pulmão, coração, timo, baço, quando da estimulação com LPS (Dumoutier, artigo do PNAS), em que um aumento da expressão de IL-22 naqueles órgãos e tecidos pode ser medido. IL-22 expressa a sua função biológica através da combinação do receptor IL-22R1 e do receptor IL-10R2. IL-22R1 é um receptor específico de IL-22 e é expresso na pele, rim, sistema digestivo (pâncreas, intestino delgado, fígado, intestino grosso, cólon) e no sistema respiratório (pulmão, brônquios). Pesquisa relacionada com IL-22 como um agente regulador do sistema imunitário está também publicada. 0 uso médico de IL-22 na redução dos triglicéridos do soro e obesidade foi descrito nos pedidos de patente relacionados com os usos médicos de IL-22 (ver WO 2006/073 508 e CN 200510023103.0). O uso médico de monómeros de IL-22 no tratamento de hepatite virai foi divulgado em pedidos de patente relacionados com o rastreio genético para previsão do desfecho de infecção virai (ver WO 2002/029098) e medicamentos para o tratamento de doença hepática (ver CN 101 218 254).

No entanto, ainda não foi descoberto que os dímeros de IL-22 humana podem desempenhar um papel activo no tratamento de hepatite virai.

SUMARIO DA INVENÇÃO

Face aos antecedentes descritos, constitui um objecto da presente invenção proporcionar um fármaco alternativo para o tratamento de hepatite virai com melhor eficácia e o seu uso, i.e. o uso do dimero de interleucina-22 (IL-22) humana, no tratamento de hepatite virai em mamíferos.

Assim, a presente invenção, num aspecto, proporciona um uso de um dimero de IL-22 humana na produção de um fármaco para o tratamento de hepatite virai.

Numa realização exemplificativa da presente invenção, a hepatite virai compreende hepatite A, hepatite B, hepatite C, hepatite D e hepatite E.

Numa outra realização exemplificativa, o dimero de IL-22 humana está mostrada como a fórmula (I): (I) M1-L-M2 em que

Ml é um primeiro monómero de IL-22 humana; M2 é um segundo monómero de IL-22 humana; e L é um elemento de ligação que liga o primeiro monómero ao segundo monómero e colocado entre os dois, em que, o dimero de IL-22 retém a actividade biológica de IL-22 e possui uma semivida no soro de pelo menos duas vezes a semivida do primeiro ou do segundo monómero.

Numa realização exemplificativa da presente invenção, o elemento de ligação L é seleccionado do grupo que consiste em: i) . um péptido curto compreendendo 3 a 50 aminoácidos; e ii) . um polipéptido da fórmula (II): (II) -Z-Y-Z- em que Y é uma proteína de suporte; Z é zero ou um ou mais péptidos curtos compreendendo 1 a 30 aminoácidos; é uma ligação química ou uma ligação covalente.

Numa outra realização exemplificativa, o primeiro monómero e o segundo monómero são da mesma entidade.

Numa outra realização exemplificativa, o primeiro monómero e o segundo monómero são de entidades diferentes.

Numa outra realização exemplificativa, a actividade biológica inclui: (a) . Redução da probabilidade de inflamação hepática e de necrose hepatocelular, e protecção das células do fígado dos danos causados por vírus da hepatite; e (b) . inibição do aumento de ALT/AST causado pelo virus da hepatite.

Numa outra realização exemplificativa, a proteína de suporte é formada através da ligação de dois fragmentos Fc de IgG via ligação dissulfeto. Numa outra realização exemplificativa, existem 2-4 ligações dissulfeto entre os dois fragmentos Fc.

Numa outra realização exemplificativa, a proteína transportadora é albumina ou um fragmento Fc de IgG humana.

Numa outra realização exemplificativa, o é uma ligação peptídica.

Numa realização exemplificativa, a semivida no soro do dímero de IL-22 é pelo menos três, cinco ou dez vezes a semivida do primeiro e/ou do segundo monómero.

Numa outra realização exemplificativa, o dímero de IL-22 é um dímero formado por monómeros em que o monómero compreende uma sequência de aminoácidos seleccionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 2-5.

De acordo com um outro aspecto da presente invenção, é proporcionado um dímero de IL-22 humana da fórmula (I): (I) M1-L-M2 em que

Ml é um primeiro monómero de IL-22 humana; M2 é um segundo monómero de IL-22 humana; e L é um elemento de ligação que liga o primeiro monómero ao segundo monómero e colocado entre os dois. em que, o referido elemento de ligação L é um polipéptido da fórmula (II):

(II) -Z-Y-Z em que Y é uma proteína de suporte; Z é zero, ou um péptido curto compreendendo 1 a 30 aminoácidos; é uma ligação química ou uma ligação covalente em que, o dímero de IL-22 retém a actividade biológica de IL-22 e possui uma semivida no soro de pelo menos duas vezes a semivida do primeiro ou do segundo monómero; em que a proteína transportadora é formada pela ligação de dois fragmentos Fc de IgG2 humana através de ligações dissulfeto; e em que cada um dos fragmentos Fc consiste nos resíduos de aminoácidos 163-385 de SEQ ID NO:2.

No terceiro aspecto da presente invenção, é proporcionada uma composição farmacêutica para o tratamento de hepatite virai, a qual compreende um dimero de IL-22 humana e um veiculo aceitável em termos farmacêuticos, em que o referido dimero de IL-22 é mostrado pela fórmula (I): (I) M1-L-M2 em que

Ml é um primeiro monómero de IL-22 humana; M2 é um segundo monómero de IL-22 humana; e L é um elemento de ligação que liga o primeiro monómero ao segundo monómero e colocado entre os dois, em que, o dimero de IL-22 retém a actividade biológica de IL-22 e possui uma semivida no soro de pelo menos duas vezes a semivida do primeiro ou do segundo monómero.

Também é divulgado um dimero de IL-22 humana da fórmula (I): (I) M1-L-M2 em que

Ml é um primeiro monómero de IL-22 humana; M2 é um segundo monómero de IL-22 humana; e L é um elemento de ligação que liga o primeiro monómero ao segundo monómero e colocado entre os dois, em que o dimero de IL-22 retém a actividade biológica de IL-22 e possui uma semivida no soro de pelo menos duas vezes a semivida do primeiro ou do segundo monómero. É igualmente divulgada uma composição farmacêutica proporcionada para o tratamento de hepatite virai, que compreende um veiculo aceitável em termos farmacêuticos e um dimero de IL-22 humana da fórmula (I): (I) M1-L-M2 em que

Ml é um primeiro monómero de IL-22 humana; M2 é um segundo monómero de IL-22 humana; e L é um elemento de ligação que liga o primeiro monómero ao segundo monómero e colocado entre os dois, em que o dimero de IL-22 retém a actividade biológica de IL-22 e possui uma semivida no soro de pelo menos duas vezes a semivida do primeiro ou do segundo monómero.

Numa outra realização exemplificativa, o dimero de IL-22 é um dimero formado por monómeros em que o monómero compreende uma sequência de aminoácidos seleccionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 3 e 5.

Um método de preparação do dimero de IL-22 compreende os passos de:

a) transformação de células de mamífero com um vector de expressão compreendendo uma sequência de DNA codificadora de um complexo IL-22-Fc; b) cultura das células de mamífero transformadas; e c) isolamento e purificação do dimero de IL-22 obtido a partir do passo (b). É claro para os familiarizados com a arte que as caracteristicas técnicas acima mencionadas e discutidas nos exemplos abaixo da presente invenção poderão ser combinadas umas com as outras para resultarem numa nova solução técnica ou numa solução técnica ainda melhor.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS A Fig. 1 ilustra a estrutura de um dimero de IL-22 da presente invenção em que representa o elemento de ligação e o objecto de forma oval marcado com "IL-22" representa um monómero de IL-22.

Numa realização especifica, a sequência de aminoácidos do dimero de IL-22 é mostrada em SEQ ID N0:1, na qual os resíduos de aminoácidos 1-146 representam os resíduos de aminoácidos de IL-22, os resíduos de aminoácidos 147-162 representam o elemento de ligação e os resíduos 163-308 representam uma outra IL-22. A Fig. 2A e 2B ilustram a estrutura de um dimero de IL-22 da presente invenção em que representa o elemento de ligação de aminoácidos e o objecto em forma oval marcado com "IL-22" representa um monómero de IL-22. 0 objecto de forma oval marcado com "C" representa uma proteína de suporte em que o monómero de IL-22 está disposto no extremo N-terminal da proteína transportadora. A acoplagem de dois fragmentos Fc via ligação dissulfeto é igualmente mostrada na Fig. 2B. A sequência de aminoácidos do monómero de IL-22 com fragmentos Fc, que é usada para formar o dimero de IL-22 desta realização, está mostrada em SEQ ID N0:2 em que os resíduos de aminoácidos 1-146 representam uma IL-22, os resíduos de aminoácidos 147-162 representam o elemento de ligação e os resíduos 163-385 representam o fragmento Fc de IgG2 humana. Um dimero de IL-22 é formado por dois monómeros de IL-22 com fragmentos Fc através da acoplagem dos fragmentos Fc. A sequência de aminoácidos de um monómero de IL-22 com fragmentos Fc, que é usado para formar o dimero de IL-22 desta realização, é mostrado em SEQ ID NO:3 em que os resíduos de aminoácidos 1-146 representam uma IL-22, os resíduos de aminoácidos 147-152 representam o elemento de ligação e os resíduos 153-375 representam o fragmento Fc de IgG2 humana. Um dimero de IL-22 é formado por dois monómeros de IL-22 com fragmentos Fc através da acoplagem dos fragmentos Fc.

As Figs. 3A e 3B ilustram a estrutura de um dimero de IL-22 da presente invenção em que representa o elemento de ligação de aminoácidos e o objecto em forma oval marcado com "IL-22" representa um monómero de IL-22. 0 objecto de forma oval marcado com "C" representa uma proteína de suporte em que o monómero de IL-22 está colocado no extremo C-terminal da proteína transportadora. A acoplagem de dois fragmentos Fc via ligação dissulfeto é igualmente mostrada na Fig. 3B. A sequência de aminoácidos de um monómero de IL-22 com fragmentos Fc, que é usada para formar o dimero de IL-22 desta realização, é mostrada em SEQ ID NO:4 em que os resíduos de aminoácidos 1-223 representam o fragmento Fc de IgG2 humana, os resíduos de aminoácidos 224-239 representam o elemento de ligação e os resíduos 240-385 representam uma IL-22. Um dimero de IL-22 é formado por dois monómeros de IL-22 com fragmentos Fc através da acoplagem dos fragmentos Fc. A sequência de aminoácidos de um monómero de IL-22 com fragmentos Fc, que é usado para formar o dimero de IL-22 desta realização, é mostrado em SEQ ID NO:5 em que os resíduos de aminoácidos 1-223 representam o fragmento Fc de IgG2 humana, os resíduos de aminoácidos 224-229 representam o elemento de ligação e os resíduos 230-375 representam uma IL-22. Um dimero de IL-22 é formado por dois monómeros de IL-22 com fragmentos Fc através da acoplagem dos fragmentos Fc. A Fig. 4 mostra o efeito de IL-22 e do dimero de IL-22 (IL-22-Fc) na estimulação de STAT3 do fígado de murganho. 0 resultado ilustrou que a bioactividade de estimulação do dimero de IL-22 foi obviamente superior à bioactividade de estimulação de IL-22. A Fig. 5 mostra a alteração dos níveis de ALT no soro de murganhos infectados com vírus de hepatite. Observou-se que o monómero de IL-22 humana recombinante (IL-22, IL-22 peguilada) e o dimero de IL-22 inibem o aumento dos níveis de ALT causado por vírus da hepatite, em que o efeito inibidor do dimero de IL-22 é particularmente significativo.

Fig. 6 mostra a alteração dos níveis de AST no soro de murganhos infectados com vírus de hepatite. Observou-se que o monómero de IL-22 humana recombinante (IL-22, IL-22 peguilada) e o dimero de IL-22 inibem de forma evidente o aumento dos níveis de AST causado por vírus da hepatite, em que o efeito inibidor do dimero de IL-22 é particularmente significativo. A Fig. 7 mostra as alterações morfológicas da histologia hepática dos murganhos infectados com o vírus da hepatite. Cinco dias após a infecção de murganhos com vírus MHV-A59, observou-se inflamação grave do tecido hepático, necrose celular e alterações morfológicas anormais. Quando do tratamento com IL-22 ou com o seu dimero, a morfologia da histologia do fígado dos animais foi obviamente protegida, com uma redução significativa da inflamação e necrose celular. A Fig. 8 mostra os resultados da análise na bioactividade in vitro do dímero de IL-22 e do monómero de IL-22.

DESCRIÇÃO DETALHADA DAS REALIZAÇÕES PREFERIDAS

Quando de um estudo extenso e profundo, os inventores descobriram, pela primeira vez, que o dímero de IL-22 humana tem um efeito terapêutico significativo na hepatite induzida por vírus. Mostrou-se que IL-22 protege eficazmente as funções do fígado e reduz significativamente o aumento de ALT/AST no sangue causado por vírus. Ainda, comparativamente com o monómero de IL-22, observou-se que o dímero de IL-22 a semivida in vivo prolongada, melhora as propriedades farmacocinéticas do seu fármaco, reduz a frequência de injecção; especialmente, observou-se que aumenta a actividade in vivo significativamente e assim pode tratar a hepatite virai mais eficazmente. Esta invenção foi feita com base nesta descoberta.

Termos 0 termo "essencialmente a mesma sequência de aminoácidos" significa que a sequência de aminoácidos é idêntica; ou que dentro da sequência de aminoácidos, existe uma alteração num ou mais resíduos de aminoácidos (deleção, adição ou substituição de um ou mais resíduos) e tal alteração essencialmente não reduzirá a sua actividade biológica, em que a sequência de aminoácidos pode ainda expressar a sua função biológica quando da ligação aos receptores de IL-22 nas células alvo. Qualquer destes "essencialmente a mesma" IL-22, glicosilada (derivada do sistema de expressão natural ou eucariótico) ou não glicosilada (derivada de sistema de expressão procariótico ou obtida por síntese química), está dentro do âmbito da presente invenção. 0 termo "terapia" refere-se à administração de IL-22 a um indivíduo necessitado da mesma de modo a curar, melhorar, reduzir ou afectar a doença, sintoma ou predisposição do indivíduo. 0 termo "indivíduo" refere-se a murganho, ser humano ou outros mamíferos. 0 termo "dose eficaz em termos terapêuticos" refere-se a uma dose de IL-22 que pode atingir o objectivo do tratamento no indivíduo necessitado do mesmo. Deve ser entendido pelos familiarizados com a arte que, a "dose eficaz em termos terapêuticos" pode variar dependendo das vias de administração, dos tipos de excipientes usados e da combinação com outros medicamentos. IL-22 e o método da sua preparação 0 termo "Interleucina-22" ou "IL-22" refere-se a uma proteína, que (a) possui esssencialmente a mesma sequência de aminoácidos da IL-22 humana/murina como descrito por Dumoutier et al. em US Patent No. 6,359,117 e (b) a mesma actividade biológica da IL-22 natural. A IL-22 da presente invenção inclui, mas não lhes está limitada, IL-22 humana, IL-22 humana recombinante. São igualmente divulgadas IL-22 murina e/ou IL-22 murina recombinante. "IL-22" também inclui IL-22 peguilada e proteínas IL-22 modificadas covalentemente. Por exemplo, a IL-22 na presente invenção pode ser polimerizada através da modificação com qualquer polietilenoglicol activado (PEG) com massa molecular de 5000-100000 com o fim de prolongar o seu tempo de semivida. Protocolos detalhados podem ser encontrados em Greenwald et al., Bioorg. Med.Chem. Lett. 1994, 4, 2465; Caliceti et al., IL Farmaco, 1993, 48,919; Zalipsky and Lee, Polyethylene Glycol Chemistry: Biotechnical and Biomedical Applications, J. M. Harris, Plenus Press, New York (1992) . Prefere-se PEG ramificado com múltiplos braços (CN ZL02101672.0, W09932139, PCT/US 95/0 7 55, PCT/US94/13013, US Pat Nos. 4, 640, 835, 4,496,689, 4,301,144, 4,670,417, 4,791,192, 4,179,337). A IL-22 da presente invenção é expressa através de tecnologia de recombinação de genes. A célula hospedeira de expressão inclui célula procariótica, levedura ou célula eucariótica superior. Células hospedeiras procarióticas adequadas incluem, mas não lhes estão limitadas, bactérias G+ ou G~, como seja E. coli. As estirpes de E. coli publicamente disponíveis incluem K12 MM294 (ATCC 31,446), X1776 (ATCC 31,537), W3110 (ATCC 27,325) e K5 772 (ATCC 53,635), etc. Outras células procarióticas adequadas incluem, mas não lhes estão limitadas, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, como seja Salmonella typhimurium, Serratia como seja Serratia marcescans, Shigella, B. subtilis, B. lichen!formis, Pseudomonas como seja P. aeruginosa e Streptomyces. E. coli W3110 é preferida uma vez que é frequentemente usada acomo célula hospedeira para o produto de DNA recombinante.

Além das células procarióticas, as células eucarióticas como sejam fungos filamentosos ou leveduras são igualmente adequados para a expressão ou clonagem de IL-22 da presente invenção. Saccharomyces é um microrganismo hospedeiro eucariótico inferior. Outras células hospedeiras incluem Schizosaccharomyces pombe (Beach and Nurse, Nature, 290:140 [ ]19 81; EP 139,383); hospedeiros Kluyveromyces (US Patent. No. 4,943,529; Flee et al., Bio/Technology, 9:968-975 (1991)); como sejam K. lactis (MW98-8C, CBS683, CBS4574; Louvencourt et al., J. Bacteriol., 154 (2):737-742 [1983]), K. fragilis (ATCC 12,424), K. waltii (ATCC 56,500), K. drosophilarum (ATCC 36,906; Van den Berg et al., Bio/Technology, 8:135 (1990)), K. thermotolerans, K. marxianus; K. yarrowia (EP 402,226); Pichia Pastoris (EP 183,070; Sreekrishna et al., J. Basic Microbiol., 28:265-278 [1988]); Candida; Trichoderma reesia (EP 244,234); Neurospora crassa (Case et al.r Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76:5259-5263 [1979]); Schwanniomyces como seja Schwanniomyces occidentalis (EP 394,538); fungos filamentosos como sejam Neurospora, Penicillium, Tolypocladium (WO 91/00357), Aspergillus como sejam A. nidulans (Balance et al., Biochem. Biophys. Res. Commum., 112:284 — 289 [1983]; Tilburm et.al., Gene, 26:205-221 [198 3]; Yelton et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 1470-1474 [1984] ) e A. niger (Kelly and Hynes, EMBO J., 4:475-479 [1985] ). As leveduras metilotrópicas podem ser igualmente usadas para expressar a IL-22 da presente invenção, incluindo, mas não lhes estando limitados, vários tipos de levedura que podem crescer em metanol como seja Hansenula, Candida, Kloeckera, Pichia, Saccharomyces, Torulopsis, Rhodotorula. Metilotrópicos típicos podem ser encontrados em C. Anthony, The biochemistry of Methylotrophs, 269 (1982) . Células hospedeiras usadas para expressar a IL-22 da presente invenção são principalmente derivadas de organismos multicelulares. Exemplos de células invertebradas incluem as de insectos, tais como S2 de Drosophila e Sf9 de Spodoptera, e células vegetais. Células de mamífero adequadas incluem células de ovário de hamster chinês (CHO), células COS; em particular, a linha celular CVl de rim de macaco transfrmado com SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); linha celular de rim embrionário humano 293 (Graham et al., J.Gen Virol., 36:59 (1997)); CHO/-DHFR (Urlaub and Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980)); células trofoblásticas de testículo murino (TM4, Mather, Biol. Reprod., 23:243-251) (1980)); células de pulmão humano (W138, ATCC CCL 75); células de fígado humano (Hep G2, HB 8065); células murinas de cancro da mama (MMT 060562, ATCC CCL51) . Os familiarizados com a arte deverão saber como seleccionar as células hospedeiras adequadas.

As células hospedeiras acima mencionadas podem ser crescidas em meios nutritivos convencionais após transformadas ou transfectadas com o vector de expressão ou o vector de clonagem de IL-22. Os meios nutritivos referidos, quando modificados, são adequados para indução do promotor, selecção do transformante ou amplificação da sequência codificadora de IL-22. As condições de nutrição, como seja deleção de meio nutritivo, temperatura e pH são do conhecimento dos familiarizados com a arte. Para os princípios gerais de optimização da proliferação das células cultvadas, protocolos e técnicas dos mesmos, ver Mammalian Cell Biotechnology: a Practical Approach, M. Butler, ed. (IRL Press, 1991) e Sambrook et. al., supra. O método de transfecção de células eucarióticas e de transformação de células procarióticas será claro para os familiarizados com a arte, como seja o método de utilização de cloreto de cálcio (CaCl2) , precipitação com fosfato de cálcio, lipofectamina ou electroporação. Os familiarizados com a arte serão capazes de seleccionar o método adequado dependendo das diferentes células hospedeiras usadas. Por exemplo, o método de utilização de

CaCl2 (Sambrook et al., supra.) ou electroporação é geralmente adequado para células eucarióticas; Agrobacterium tumefaciens é principalmente usada para a transformação de células vegetais (Shaw et.al., Gene, 23:315 (1983) e WO 89/05859); a precipitação com fosfato de cálcio pode ser usada para as células de mamífero sem paredes celulares (Graham and van der Eb, Virology, 52:456-457 (1978)). Para uma descrição compreensiva do método para a transfecção de células de mamífero, ver US Patent No.4,399,216. Para técnicas de transfecção de leveduras, ver Van Solingen et al., J. Bact. , 130:946 (1977) e Hsiao et al., Proc. Natl. Acad. Sei. (USA), 76:3829 (1979). Outras técnicas para introdução de DNA em células, como seja microinjecção de ácido nucleico, electroporação, fusão de protoplastos bacterianos com células intactas ou policatiões como seja polibreno, poliornitina, etc. podem ser usadas na presente divulgação. Para várias técnicas que podem ser usadas para transformar células de mamífero, ver Keown et al., Methods in Enzymology, 185:527-537 (1990) e Mansour et al., Nature, 336:348-352 (1988). A sequência nucleotídica codificadora de IL-22 da presente invenção pode ser inserida num vector replicável para a clonagem de genes ou expressão de proteínas. Todos os vectores, como sejam plasmídeos, cosmídeos, viriões ou bacteriófagos estão publicamente disponíveis. Com a utilização de técnicas comuns neste campo, os familiarizados com a arte podem inserir a sequência nucleotídica codificadora de IL-22 nos locais de endonucleases de restrição adequados. Um vector replicável geralmente inclui, mas não lhes está limitado, as seguintes partes: uma ou mais sequências sinal, uma origem de replicação, um ou mais genes de marcas, um elemento intensificador, um promotor e uma sequência de terminação da transcrição. Com o uso de técnicas de ligação convencionais neste campo, os familiarizados com a arte podem construir um vector adequado replicável incluindo uma ou mais partes acima. A IL-22 da presente invenção pode não só ser directamente expressa através de DNA recombinante, mas também ser produzida através da fusão de polipéptidos heterólogos. Estes últimos podem ser uma sequência sinal localizada numa proteína madura ou um polipéptido N-terminal, e podem também ser outros fragmentos polipeptídicos com locais de digestão específicos localizados na proteína madura ou num extremo N-terminal do polipéptido. Geralmente, a sequência sinal é parte do vector replicável acima, ou parte da sequência nucleotídica codificadora de IL-22 da presente divulgação inserida num vector replicável. A sequência sinal pode ser uma sequência sinal procariótica, como seja da fosfatase alcalina, penicilinase, lpp ou a sequência líder de enterotoxina II estável ao calor. Na secreção de levedura, a sequência sinal pode ser a sequência líder da invertase de levedura, a sequência líder do factor α (incluindo a sequência líder do factor α da levedura Saccharomyces ou de Kluyveromyces, ver US Pat. No. 5,010,182) ou a sequência líder da fosfatase ácida, a sequência líder da glucose amilase de C. albicans (EP 362,179). No sistema de expressão de mamífero, a sequência sinal de mamífero pode ser directamente usada na secreção da proteína alvo. Tal sequência inclui uma sequência sinal derivada da mesma espécie ou de uma espécie semelhante de mamífero e a sequência líder de secreção do vírus.

Tanto o vector de expressão como o vector de clonagem possuem um segmento de sequência nucleotídica, que permite ao vector replicar-se numa ou mais células hospedeiras correspondentes. As sequências nucleotídicas correspondentes a hospedeiros bacterianos, leveduras ou virais são conhecidas dos familiarizados com a arte. Por exemplo, a origem de replicação do plasmídeo pBR322 é adequada para a maioria das bactérias G~, a origem de replicação do plasmídeo 2.mu. é adequada para levedura, enquanto a origem de replicação dos vírus (SV40, vírus do polioma, adenovirus, VSV ou BPV) é adequada para o vector de clonagem em células de mamífero.

Tanto o vector de expressão como o vector de clonagem possui um segmento do gene de selecção, também referido como "marca de selecção". A proteína típica expressa pelo gene de selecção é (a) resistente a alguns antibióticos como sejam ampicilina, neomicina, metotrexato, tetraciclina etc, ou toxina; (b) capaz de remediar as deficiências auxotróficas; e (c) suplementar de alguns factores nutritivos chave, como seja a sequência codificadora da D-alanina racemase necessária para hospedeiros de bacilos, que não podem ser proporcionados por meios complexos. 0 gene de selecção adequado para células hospedeiras de mamífero deverá ser capaz de distinguir as células hospedeiras que aceitam o gene codificador de IL-22 da presente divulgação, como seja DHFR ou timidina cinase. A célula hospedeira adequada usando DHFR selvagem como gene de selecção é a estirpe de CHO sem actividade DHFR. 0 método de preparação e cultura desta estirpe pode ser visto em Urlaub et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 77:4216 (1980). O gene de selecção adequado para células de levedura é o gene trpl expresso no plasmídeo de levedura Yrp7 (Stinchcomb et al., Nature, 282:39(1979); Kingsman et al., Gene, 7:141(1979); Tschemperet al., Gene, 10:157(1980)). O gene trpl pode ser usado para rastrear os mutantes de levedura que não podem crescer em triptofano, como seja ATCC No.44047 ou PEP4-1 (Jones, Genetics, 85:12 (1977)).

Tanto o vector de expressão como o vector de clonagem geralmente incluem um promotor, o qual pode ser ligado manualmente à sequência nucleotídica codificadora da IL-22 da presente invenção para dirigir a síntese de mRNA. Promotores correspondendo a todos os tipos de hospedeiro são conhecidos dos familiarizados com a arte. Os promotores adequados para hospedeiros procarióticos incluem o sistema promotor da β-lactamase e da lactose (Chang et al., Nature, 275:615 (1978); Goeddel et al., Nature, 281;544 (1979)), o sistema promotor da fosfatase alcalina e trp (Goeddel, Nucleic Acids Res., 8:4057 (1980); EP 36,776), heteropromotor como seja o promotor tac (deBoer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:21-25 (1983)). 0 promotor do hospedeiro bacteriano também inclui um segmento com a sequência de Shine-Dalgamo (SD) que pode ser ligada manualmente à sequência nucleotidica codificadora de IL-22 da presente invenção.

Promotores adequados para o hospedeiro levedura incluem o promotor da cinase 3-fosfoglicérica (Hitzeman et al., J. Biol. Chem., 255:2073(1980)) ou outros promotores de enzimas glicoliticas (Hess et al., J. Adv. Enzyme Reg., 7:149 (1968); Holland, Biochemistry, 17:4900 (1978)), como seja enolase, gliceraldeido-3-fosfato desidrogenase, hexocinase, piruvato descarboxilase, fructose cinase, glucose-6-fosfato isomerase, trifosfoglicerato mutase, piruvato cinase, triose fosfato isomerase, glucose fosfato isomerase e glucose cinase.

Alguns outros promotores induziveis de levedura podem regular a transcrição de acordo com diferentes condições de crescimento, incluindo promotores da álcool desidrogenase 2, isocitocrómio C, fosfatase ácida, enzimas de degradação relacionadas com a degradação de azoto, metalotioneina, gliceraldeido-3-fosfato, enzimas da degradação de maltose e galactose. A descrição detalhada dos vectores e promotores adequados para o sistema de expressão em levedura pode ser vista em EP 73,657.

Os promotores podem controlar a transcrição da sequência do gene de IL-22 da presente divulgação no vector replicável em células hospedeiras de mamífero. Estes promotores incluem os de genomas virais como sejam do vírus do polioma, poxvirus das galinhas (UK 2,211,504), adenovirus, vírus do papiloma bovino, vírus do sarcoma aviário, citomegalovírus, retrovirus, vírus da hepatite B ou SV40; os de mamíferos diferentes como sejam o promotor da β-actina ou o promotor da imunoglobulina; e os do promotor das proteínas de choque térmico. No entanto, estes promotores deverão ser compatíveis com o sistema de expressão do hospedeiro. A transcrição da sequência nucleotídica codificadora de IL-22 da presente divulgação no sistema de expressão eucariótico pode ser potenciada através da inserção de intensificador nos vectores replicáveis. O intensificador é um tipo de elemento da molécula de DNA de actuação em cis e tem geralmente o comprimento de 10-300 pb, o qual pode potenciar a transcrição de moléculas de DNA ao actuarem sobre os promotores. Presentemente, é conhecido que existe uma série de intensificadores com origem em genes de mamífero (haptoglobina, elastase, albumina, a-fetoproteína e insulina). Os intensificadores mais largamente usados são de vírus de células eucarióticas, como seja o intensif icador de SV40 (100-270 pb) no lado tardio da origem, o intensificador do promotor precoce de citomegalovírus, o intensificador do vírus polioma no lado tardio da origem e o intensificador de adenovirus. Os intensificadores podem ser inseridos no extremo 5' ou 3' da sequência codificadora de IL-22 da presente divulgação nos vectores replicáveis, mas prefere-se o extremo 5'.

Os vectores de expressão em células hospedeiras eucarióticas (células de levedura, células de fungos, células de insectos, células vegetais, células animais, células humanas ou outras células nucleadas de outros organismos multicelulares) também incluem a sequência nucleotídica para terminar a transcrição e estabilização do mRNA. Este tipo de sequência é geralmente derivada da região não traduzida do extremo 5' em células eucarióticas, DNA virai ou cDNA, e é por vezes derivada do extremo 3'. A sequência nucleotídica dentro da "região não traduzida" pode ser transcrita como sequência poliA acilada na região não traduzida de IL-22 da presente divulgação.

Outros métodos, vectores e células hospedeiras para a síntese de IL-22 da presente divulgação em sistema recombinante de células de vertebrado em cultura podem ser vistos em Gething et al., Nature, 293:620-625 (1981);

Mantei et al., Nature, 281:40-46 (1979); EP 117,060 and EP 117,058 .

Dimero de IL-22 A estrutura do dimero de IL-22 da presente invenção está mostrada na Fórmula I. As Figs. 1-3 ilustram a estrutura representativa do dimero de IL-22 da presente invenção, em que a proteína de suporte inclui, mas não lhe está limitada, o fragmento Fc de IgG humana (1, 2, 3, 4) ou da albumina humana. IL-22 pode estar localizada no extremo C ou no extremo N da proteína de suporte.

Como aqui usado e nas reivindicações, "elemento de ligação" refere-se a um péptido curto que liga os dois monómeros de IL-22 e que está colocado entre eles. Não existe restrição especial ao comprimento do elemento de ligação. Um elemento de ligação tem geralmente 5-50 resíduos de aminoácidos de comprimento. Em geral, um elemento de ligação não afecta ou afecta significativamente o enrolamento e conformação correctos formados pela configuração dos dois monómeros de IL-22. Exemplos de elementos de ligação incluem, mas não lhes estão limitados:

Numa outra realização preferida, o elemento de ligação compreende a sequência de aminoácidos seleccionada do grupo que consiste em: (a). uma sequência de aminoácidos com 3-16 resíduos de aminoácidos formada pelos aminoácidos hidrofóbicos glicina (Gly) ou prolina (Pro), como seja Gly-Pro-Gly-Pro-Gly-Pro; (b) . uma sequência de aminoácidos codificada pr múltiplos locais de clonagem. Tal sequência geralmente possui 5-20 resíduos de aminoácidos; numa realização preferida, tal sequência possui 10-20 resíduos de aminoácidos; (c) . uma sequência de aminoácidos compreendendo proteína(s) que não são o monómero de IL-22, como seja uma sequência de aminoácidos de IgG ou de albumina; e (d) . uma sequência de aminoácidos compreendendo qualquer combinação de (a), (b) e (c) acima.

Numa realização preferida, o elemento de ligação possui a sequência GSGGGSGGGGSGGGGS (i.e. 147-162 resíduos de aminoácidos de SEQ ID NO:l) e ASTKGP (i.e. 147-152 resíduos de aminoácidos de SEQ ID NO:3).

Ainda, uma sequência de aminoácidos que não afecte a actividade biológica do monómero de IL-22 pode ser adicionada ao extremo N ou C da proteína de fusão. Numa realização preferida, tal sequência de aminoácidos apensa é benéfica para a expressão (e.g. péptido sinal), purificação (e.g. sequência de 6 x His, o local de corte do péptido sinal do factor α de Saccharomyces cerevisiae (Glu-Lys-Arg)) ou estimulação da actividade biológica da proteína de fusão. Método de preparação do dimero

As sequências de DNA codificadoras do dimero de IL-22 ou da proteína de fusão da presente invenção podem ser sintetizadas artificialmente na sua totalidade. Como alternativa, as sequências de DNA codificadoras do primeiro monómero de IL-22 e/ou do segundo monómero de IL-22 podem ser obtidas através de amplificação por PCR ou síntese e depois ligadas umas às outras para formar a sequência de DNA codificadora do dimero de IL-22 ou da proteína de fusão da presente invenção.

Para aumentar o volume de expressão das células hospedeiras, pode ser feita modificação da sequência codificadora do dimero de IL-22. Por exemplo, o enviesamento de codões das células hospedeiras pode ser usado para eliminar as sequências que não são benéficas para a transcrição e tradução. Na presente divulgação, o enviesamento de codões das células de levedura ou das células de mamífero pode ser usado em combinação com programas de DNA para detecção de genes de dímeros de IL-22 de modo a eliminar sequências que não sejam benéficas para a transcrião e tradução. As sequências eliminadas podem ser locais de corte de intrões, sequências de terminação da transcrição, etc.

Após ser obtida a sequência de DNA codificador da nova proteína de fusão da presente invenção, ela é primeiro inserida num veículo de expressão adequado, seguido de uma célula hospedeira adequada. Finalmente, a célula hospedeira transformada é cultivada e purificada para se obter a nova proteína de fusão da presente invenção.

Como aqui usado e nas reivindicações, "veículo" refere-se a plasmídeo, cosmídeo, vector de expressão, vector de clonagem, vector viral, etc.

Na presente divulgação, podem ser usados vectores conhecidos na arte, tais como os vectres disponíveis no mercado. Por exemplo, com o uso de vectores obtidos no mercado, a sequência nucleotídica codificadora da nova proteína de fusão da presente invenção é operacionalmente ligada à sequência de expressão e controlo para formar o veículo de expressão da proteína.

Como usado aqui e nas reivindicações, "operacionalmente ligado" refere-se a um cenário em que algumas partes de uma sequência de DNA linear pode afectar a acividade biológica de outras partes da mesma sequência de DNA linear. Por exemplo, se um DNA de sequência sinal for usado na expressão de um precursor e participar na secreção de polipéptidos, o DNA da sequência sinal (sequência líder da secreção) está "operacionalmente ligado" aos polipéptidos. Se um promotor controla a transcrição da sequência, o promotor está "ligado operacionalmente" à sequência codificadora. Se um local de ligação aos ribossomas estiver situado numa posição em que a tradução é tornada possível, o local de ligação ao ribossoma está "ligado operacionalmente" à sequência codificadora. Em geral, "ligado operacionalmente" significa que os resíduos em causa estão na proximidade; para a sequência líder da secreção, "ligado operacionalmente" refere-se à proximidade dentro da grelha de leitura aberta.

Como aqui usado, "células hospedeiras" refere-se a células procarióticas e células eucarióticas. As células hospedeiras procarióticas frequentemente usadas incluem E. coli, B. subtilis, etc. As células hospedeiras eucarióticas frequentemente usadas incluem células de levedura, células de insecto e células de mamífero, etc. Num aspecto preferido, as células hospedeiras usadas são células eucarióticas; num outro aspecto preferido, as células hospedeiras usadas são células de mamífero.

Após serem obtidas as células hospedeiras transformadas, elas podem ser cultivadas num ambiente adequado para expressar a proteína de fusão da presente invenção para expressar a proteína de fusão. A proteína de fusão expressa é então separada.

Composição farmacêutica e método da sua administração

Uma vez que o dímero de IL-22 da presente invenção pode gerar um sinal de activação do receptor mais forte e possui uma excelente semivida no soro, o dímero de IL-22 e uma composição farmacêutica compreendendo o dímero de IL-22 como principal ingrediente activo podem ser usados para o tratamento de hepatite virai. Numa realização preferida, a hepatite virai compreende: hepatite A, hepatite B, hepatite C, hepatite D e hepatite E. A composição farmacêutica da presente invenção compreende uma quantidade segura e eficaz do dimero de IL-22 da presente invenção e um excipiente ou veiculo aceitável em termos farmacêuticos. "Quantidade segura e eficaz" refere-se a uma quantidade de um composto suficiente para melhorar significativamente a condição do doente necessitado, sem causar efeitos secundários graves. Em geral, a composição farmacêutica compreende 0,001-1000 mg de IL-22 ou do seu dimero por dose; numa realização preferida, a composição farmacêutica compreende 0,05-300 mg de IL-22 ou do seu dimero por dose; numa outra realização preferida, a composição farmacêutica compreende 0,5-200 mg de IL-22 ou do seu dimero por dose. "Excipiente ou veiculo aceitável em termos farmacêuticos" refere-se a um agente de enchimento sólido ou liquido ou material de gelatina com um ou mais tipos de compatibilidades que seja adequado para uso humano com pureza suficiente e toxicidade suficientemente baixa. "Compatibilidade" refere-se à capacidade de cada ingrediente da composição de mutuamente se misturar com o composto da presente invenção e a capacidade de mutuamente se misturarem entre eles, sem reduzir substancialmente a eficácia clinica do composto. Alguns dos exemplos de excipiente ou veículo aceitável em termos farmacêuticos incluem celulose e os seus derivados (e.g. carboximetilcelulose sódica, etilcelulose sódica, acetato de celulose, etc), gelatina, partículas de rocha, agente lubrificante sólido (e.g. ácido esteárico, estearato de magnésio), sulfato de cálcio, óleo vegetal (e.g. óleo de ervilha, óleo de sésamo, óleo de amendoim, azeite, etc.), polióis (e.g. propilenoglicol, glicerol, manitol, sorbitol, etc.), emulsionante (e.g. Tween®), agente molhante (e.g alurilsulfato de sódio), corante, agente aromatizante, estabilizador, antioxidante, antiséptico, água apirogénica, etc. A via de administração da IL-22 ou do dímero da presente invenção compreende a administração oral, administração rectal, administração parentérica (intravenosa, intramuscular ou subcutânea) e administração parcial. A forma sólida para administração oral compreende cápsulas, comprimidos, pílulas, pó e grânulos. Nestas forma sólidas, o composto activo é misturado com pelo menos um dos excipientes convencionalmente inertes (ou veículos), como seja citrato de sódio, fosfato dicálcico ou qualquer um dos seguintes ingredientes: (a) agente de enchimento ou de preenchimento, e.g. amido, lactose, sucrose, glucose, manitol e ácido salícico; (b) agente de adesão, e.g. carboximetilcelulose, alginato, gelatina, polivinilpirrolidona, sucrose e acácia; (c) humidificantes, e.g. glicerol; (d) agente de desintegração, e.g. agar, carbonato de cálcio, amido de batata ou amido de mandioca, ácido alginico, silicato composto e carbonato de sódio; (e) agente tamponante, e.g. cera de parafina; (f) agente acelerador da absorção, e.g. composto de amina quaternária; (g) agente molhante, e.g. cetanol e glicerina monostearato; (h) absorvente, e.g. caulino; e (i) lubrificante, e.g. partículas de rocha, estearato de cálcio, estearato de sódio, polietilenoglicol sólido, laurilsulfato de sódio ou qualquer mistura dos mesmos. Cápsulas, comprimidos e pílulas podem também comprender agente tamponante.

Formas sólidas tais como comprimidos, pílulas de açúcar, cápsulas, pílulas e grânulos podem ser preparadas com revestimento e materiais do tipo núcleo-invólucro, como seja cobertura e outros materiais conhecidos na arte. Estes materiais compreendem um agente opacificante e o composto activo ou composto da composição que pode ser libertado numa forma retardada numa determinada parte do canal alimentar. Podem ser usados componentes de embebição tais como materiais poliméricos e materiais de ceras. Se necessário, os compostos activos podem ser misturados com um ou mais dos excipientes acima descritos para formular uma forma de microcápsula. A forma líquida para administração oral compreende emulsão, solução, suspensão, xarope ou tintura aceitável em termos farmacêuticos. Para além dos compostos activos, a forma líquida também compreende diluentes inertes convencionalmente usados na arte como seja água ou outro solvente, agente solubilizante e emulsionante como seja etanol, isopropanol, carbonato acetato, acetato de etilo, propan-2-ol, 1,3-butan-2-ol, dimetilfomamida e óleo; em particular óleo de semente de algodoeiro, óleo de amendoim, óleo de embrião de milho, azeite, óleo de castor e óleo de sésamo ou quaisquer misturas dos mesmos.

Para além dos diluentes inertes, o composto pode também compreender aditivos, como seja agente molhante, agente emulsionante, agente de suspensão, agente edulcorante, correctivos e especiarias.

Para além dos compostos activos, a suspensão pode também compreender agente de suspensão, como seja álcool etoxil isosteárico, polioxietileno sorbitol, sorbitano, celulose microcristalina, metóxido de alumínio, agar ou quaisquer misturas dos mesmos.

Os compostos usados para administração parentérica podem também compreender água ou solução anidra, solução de dispersão, suspensão ou emulsão estéril aceitável em termos fisiológicos e pó estéril que pode ser redissolvido em solução injectável estéril ou solução de dispersão. Veículos hidratados ou anidros adequados, agente de diluição, solvente ou excipiente compreende água, etanol, polióis e misturas adequadas dos mesmos.

As formas do dímero IL-22 da presente invenção usados para administração parcial compreendem pomada, pó, emplastro, em pulverizador e em inalador. Em condições estéreis, os componentes activos podem ser misturados com veiculo e quaisquer anti-sépticos, agentes tamponantes aceitáveis em termos farmacêuticos; se necessário, os componentes activos podem ser misturados com propelente. 0 dimero de IL-22 da presente invenção pode ser administrado por si só ou administrado conjuntamente com quaisquer compostos aceitáveis em termos farmacêuticos. A microcápsula contendo IL-22 ou o seu dimero da presente invenção pode ser usado como um sistema de libertação controlada. 0 sistema de microcápsula de libertação controlada da proteína recombinante foi aplicado com êxito a rhGH, rhIFN, IL-2 e MNrgpl20 (Johnson et al., Nat. Med., 2:795-799 (1996); Yasuda, Biomed. Ther 27:1221-1223 (1993); WO 97/03692, WO 96/40072, WO 96/07399; U.S. Pat. No.5, 654,010) . O sistema de libertação controlada de IL-22 ou do seu dimero da presente invenção pode ser preparado com PLGA que possui uma boa compatibilidade biológica e degradabilidade. O ácido lático e o ácido glicólico, os produtos da degradação de PLGA, podem ser eliminados rapidamente no corpo humano. Ainda, a degrabilidade daquele polímero pode variar entre vários meses e vários anos dependendo da sua massa molecular e composição (Lewis, "Controlled release of bioactive agents form lactide/glycolide polymer," in: M. Chasin and R. Langer (Eds.), Biodegradable Polymers as Drug Delivery Systems (Marcel Dekker: New York, 1990), pp.1-41)). A dosagem e concentração da composição farmacêutica da presente invenção podem ser ajustadas de acordo com a situação actual. Os familiarizados com a arte deverão saber como escolher a dosagem adequada e meios de injecção de acordo com necessidades práticas. O princípio para o ajuste entre diferentes espécies tais como murganho e ser humano pode ser visto em Mordenti, J. and Chappell, W. "The use of interspecies scaling in toxicokinetics" In Toxicokinetics and New Drug Development, Yacobi et al.; Pergamon Press, New York 1989, pp.42-96.

Quando da utilização da composição farmacêutica, uma quantidade segura e eficaz do dímero de IL-22 da presente invenção é administrada a um mamífero (e.g. ser humano) necessitado, em que a dosagem administrada é uma dosagem de administração eficaz aceitável em termos farmacêuticos. Para um ser humano de 60kg, a dosagem de administração é geralmente 0,01-300 mg; numa realização preferida, a dosagem de administração é 0,5-100 mg. Na determinação da dosagem real, factores conhecidos na arte como sejam a via de administração, condição dos doentes, etc. têm de ser considerados.

Existem muitas vantagens da presente invenção incluindo, mas não lhes estando limitadas, as seguintes: 1. Demonstrou-se que IL-22 ou o seu dímero é eficaz no tratamento de hepatite virai em modelos animais. 2. 0 dimero de IL-22 pode prolongar a semivida in vivo, melhorar as propriedades farmacocinéticas do seu fármaco, reduzir a frequência de injecção e significantivamente aumentar a bioactividade in vivo. 3. Numa proporção molar de IL-22 igual, também se demonstrou que o dimero de IL-22 apresenta sinal de activação de STAT3 in vivo mais forte comparativamente com o monómero de IL-22, aumentando assim o efeito terapêutico.

As realizações exemplificativas que se seguem descrevem melhor a presente invenção. Apesar da descrição se referir a realizações particulares, será claro para os familiarizados com a arte que a presente invenção pode ser executada com variações destes detalhes específicos. Assim esta invenção não deverá ser considerada como limitada às realizações aqui descritas. Ainda, para as realizações em que os detalhes dos métodos experimentais não são descritos, tais métodos são realizados de acordo com condições convencionais como sejam as descritas em Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (New York: Cold Spring Harbor Laboratory Pres, 1989), ou sugerido pelos fabricantes.

Exemplo 1 0 dímero de IL-22 com a estrutura descrita nas Figs. 1-3 foi purificado e preparado por métodos convencionais. SEQ ID N0:1 representa o dimero de IL-22 e SEQ ID NOs:2-5 representa o monómero de IL-22.

Exemplo 2 - Semivida in vivo do dimero de IL-22

Os ratos receberam uma única injecção subcutânea do dimero de IL-22 (que é formado por dois monómeros de IL-22 de SEQ ID NO: 2) com uma dosagem de 100 yg/kg. Os parâmetros farmacocinéticos (n=6) foram calculados e listados na Tabela 1 abaixo. A semivida in vivo do monómero de IL-22 em ratos é cerca de 1,3 horas.

Exemplo 3 - Efeito de IL-22 ou do seu dimero no pSTAT3 hepático de murganho

Testaram-se 52 murganhos ICR normais em que metade deles eram machos com peso de 20-22 g. Os murganhos foram divididos em 13 grupos com 4 murganhos por grupo. Um grupo de murganhos foi sacrificado antes da administração do fármaco e os tecidos hepáticos foram removidos e guardados em azoto liquido para determinação do nivel básico de fosforilação de STAT3 (pSTAT3) do fígado. 6 grupos de murganhos receberam uma única injecção subcutânea de IL-22 recombinante numa dosagem de 40 yg/kg; enquanto outros 6 grupos de murganhos receberam uma única injecção subcutânea de doses equimolares do dímero de IL-22 recombinante numa dosagem de 100 yg/kg (o dímero de IL-22 foi formado por dois monómeros de IL-22-Fc com uma sequência como se mostra em SEQ ID NO: 4, em que a IL-22 numa mole do dímero é calculada como 2 moles). Após injecção, o tecido hepático respectivo foi removido às 2a, 4a, 8a, 24a, 48a, 72a hora e guardado em azoto líquido. Em seguida o homogenato de tecido hepático foi preparado e o seu teor proteico foi determinado. O nível de pSTAT3 foi detectado pelo método de ELISA (STAT3 [pY705] phosphor ELISA Kit, Invitrogen Corporation).

Como se mostra na Fig. 4, a injecção de IL-22 (40 yg/kg) em murganhos normais pode aumentar significativamente o nível de pSTAT3 hepático em que o nível era máximo por volta da 2a hora e voltou ao nível básico na 8a hora. A injecção do dímero de IL-22 (100 yg/kg), em dose equimolar de IL-22, em murganhos normais pode aumentar significativamente o nível de pSTAT3 hepático, em que o nível atingiu um máximo por volta da 24a hora, permaneceu relativamente elevado à 48a hora, e basicamente voltou ao nível básico na 72a hora.

Como ilustrado pelo resultado acima, tanto IL-22 como o dímero de IL-22 podem activar a actividade biológica da transdução de sinal e o activador do factor de transcrição 3 (STAT3).

Deve-se notar que, em dose equimolar de IL-22, a actividade biológica do dímero de IL-22 foi significativamente melhor que a actividade biológica do monómero de IL-22.

Exemplo 4 - Efeito de IL-22 ou do seu dimero no tratamento de hepatite induzida por virus em murganhos 50 murganhos C57/BL fêmeas com 6-8 semanas de idade foram divididos em 5 grupos com 10 murganhos por grupo. Quatro grupos de murganhos foram injectados intraperitonealmente com vírus MHV-A59 numa dose de 2><104 pfu por murganho. A preparação e titulação de MHV-A59 pode ser a referida em Chin J Clin Pharmacol Ther 2005, 10(11): 1253. 2 horas após a injecção do vírus, o grupo de tratamento recebeu injecção subcutânea com IL-22 humana recombinante numa dose de 100 yg/kg uma vez por dia; ou com IL-22 peguilada numa dose de 100 yg/kg em dias alternados; ou com o dímero de IL-22 recombinante (proteína de fusão IL-22-IgG-Fc) (o dímero de IL-22 foi formado por dois monómeros de IL-22-Fc com uma sequência mostrada em SEQ ID NO: 2, em que a IL-22 numa mole do dímero é calculada como 2 moles) numa dose de 100 yg/kg em dias alternados. O grupo de IL-22 humana recombinante recebeu um total de 5 injecções, enquanto o grupo de IL-22 humana peguilada e o grupo de tratamento com dímero humano recombinante de IL-22 respectivamente receberam um total de 3 injecções. O grupo do controlo negativo 1 incluiu murganhos C57/BL fêmeas normais e o grupo controlo negativo 2 incluiu murganhos infectados com vírus MHV-A59 que receberam injecção de veículo solvente (0,5% soro de murganho, PBS, pH 7,0) . Antes da injecção do vírus, dois animais foram retirados de cada grupo e 100 μΐ de sangue foi colhido da órbita para determinar os níveis de ALT, AST na linha de base. 3 dias e 5 dias após a infecção de vírus MHV-A59, as amostras de sangue foram colhidas de cada grupo para determinação dos níveis de ALT, AST. No 5o dia, usou-se 2% pentobarbital para anestesiar os animais e os fígados foram separados e fixados com 4% formalina para biópsia e coloração com HE.

Como se mostra nas Figs. 5-7, a injecção diária do monómero de IL-22 humana recombinante (IL-22 ou IL-22 peguilada) e dímero de IL-22 pode suprimir o aumento de várias vezes do nível de ALT/AST causado pelo vírus da hepatite, reduzir a probabilidade de inflamação do fígado e a necrose hepatocelular e proteger as células hepáticas de danos causados pelo vírus da hepatite.

Deve-se salientar que, na dose equimolar convertida de IL-22, o efeito terapêutico é dímero de IL-22 > IL-22 peguilada > IL-22. Por outras palavras, o efeito terapêutico na hepatite virai em murganhos injectados com o dimero de IL-22 não só foi melhor que o grupo de animais injectados com o monómero de IL-22, como também melhor que o grupo de animais injectados com o monómero de IL-22 peguilado com semivida maior. Assim, o efeito terapêutico do dimero de IL-22 foi significativamente melhor que o do monómero de IL-22 e IL-22 peguilado. A proporção da massa molecullar de proteína do monómero de IL-22 ou IL-22 peguilada relativamente ao dimero de IL-22 é cerca de 1:5. Assim, na condição de a dose molar de administração da IL-22 ser inferior à de IL-22 ou de IL-22 peguilada, o dimero de IL-22 mostrou um efeito terapêutico mais sgnificativo.

Exemplo 5 - Formação do dimero de IL-22 pelo complexo IL-22-Fc a. Construção de uma linha celular de expressão do dimero de IL-22

Sintetizaram-se as sequências de cDNA codificadoras dos complexos IL-22-Fc (como se mostra em SEQ ID NO: 6 ou SEQ ID NO: 7, em que SEQ ID NO: 6 codifica o monómero mostrado em SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO.: 7 codifica o monómero mostrado em SEQ ID NO: 3). A sequência de cDNA do monómero de IL-22 foi ligada à sequência de cDNA dos fragmentos Fc de IgG2. 0 local EcoRI e os componentes necessários para a expresão em células de mamífero, como seja a sequência Kozak e a sequência do péptido sinal, foram introduzidas no extremo 5', enquanto o local Xbal foi introduzido no extremo 3'. Clonou-se num plasmideo comercial pUC19 e designou-se pIL-22-Fc, e foi usado para transformar E. coli TG1. 0 plasmideo pUC19 foi digerido com EcoRI e Xbal, e aproximadamente 1300bp do fragmento IL-22-Fc foi colhido e ligado ao plasmideo de expressão pcDNA3, digerido com EcoRI e Xbal (Invitrogen), para construir o plasmideo de expressão pEX-IL-22-Fc. 0 plasmideo de expressão pEX-IL-22-Fc foi linearizado e transfectado em células CHO para expressarem o dimero de IL-22. 0 nivel de expressão foi detectado pelo método de ELISA e as linhas celulares com maior rendimento de proteína foram testadas e preprada uma biblioteca de células. b. Separação e purificação do dimero de IL-22 Células CHO recombinantes foram cultivadas pelo método convencional para expressarem proteína recombinante. Após cultura das células, o sobrenadante celular foi colhido (contendo complexos de IL-22, dímeros de IL-22, multímeros de IL-22 e metabolitos). 0 sobrenadante colhido foi filtrado e purificado através de uma série de métodos de cromatografia. Por exemplo, foi capturado por rProtein A Sepharose FF (GE Healthcare, cat # 17-1279-04), e eluído com um tampão citrato 20-50 mM e NaCl 0,1 - 2M a pH 3,5-3,8 para se obter o dimero de IL-22 de pureza superior a 90%, em seguida o passo seguinte foi executado usando cromatografia PPA "modo misto" (PALL Life Sciences Cat #: k364-01) e a proteína alvo foi eluída com uma solução tampão de 20-50 mM NaAc/HAC a pH 3,0-5,0. Neste processo, a inactivação a pH baixo e a filtração através de membrana Nano 20 foram usados para remoção de virus. O dimero de IL-22 foi finalmente obtido. A pureza do dimero de IL-22 purificado foi superior a 95% (usando análise por HPLC de fase reversa) . Conforme ilustrado por electroforese, a massa molecular do dimero de IL-22 purificado (formado por dois monómeros mostrados em SEQ ID NO: 2) foi 52 ± 10 KD (usando análise por SDS-PAGE em condições redutoras) o que corresponde ao valor previsto. O comprimento de onda de absorção máxima de UV é 280nm. Os dimeros de IL-22 podem estimular células Colo205 para produzirem IL-10 in vitro. (ED50 é 10-1000 ng/ml)

Exemplo 6 - Farmacocinética do dimero de IL-22 em macacos rhesus 8 macacos rhesus adultos saudáveis em que metade deles eram machos com um peso de 3-5 kg foram distribuídos aleatoriamente por 2 grupos de acordo com o peso do animal. Os grupos foram tratados com o dimero de IL-22, numa dose de 30 ou 100yg/kg, em que cada grupo de tratamento tinha 4 animais, metade deles era machos. Cada um dos grupos recebeu injecção subcutânea da dose correspondente do dimero de IL-22 (formado por dois monómeros mostrados em SEQ ID NO: 2) num volume de administração de 0,2 ml/kg do corpo numa única administração. Colheu-se 0,6 ml de sangue das veias safenas da extremidade inferior antes da administração e à meia hora, Ia, 2a, 4a, 8a, 16a, 24a, 48a, 72a, 96a, 120a, 144a, 168a hora após administração e quando da permanência à temperatura ambiente durante 30 min, o soro foi separado e a concentração do dimero de IL-22 no soro foi detectada usando um kit de ELISA (Biolegend, Cat # 434507). Os parâmetros farmacocinéticos foram analisados usando um modelo não compartimentado nos resultados detectados e os resultados estão mostrados na Tabela 1. A semivida in vivo (tl/2z) de IL-22 é cerca de 2hr.

Tabela 1 - Parâmetros farmacocinéticos (média ± SD , n = 4)

Exemplo 7 - Análise da bioactividade in vitro do dimero de IL-22 e de IL-22

Células Colo205 foram cultivadas em meio RPMI1640 10% FBS e as células foram crescidas até à fase logarítmica. O sobrenadante foi rejeitado e PBS foi adicionado para remoção do meio de cultura residual, seguido da adição de 2 - 5ml de 0,25% Tripsina-EDTA para digestão. Em seguida o meio foi adicionado e misturado até à uniformidade. A mistura foi centrifugada a 1500rpm durante 5 min e as células foram colhidas e preparadas numa suspensão de 5,0 χ 105 células/ml com meio básico. A suspensão foi adicionada aos alvéolos de uma placa de 96 alvéolos (10Ομΐ/alvéolo) e deixadas durante a noite a 37 C, numa incubadora de 5% de CO2. No dia seguinte, a placa de 96 alvéolos for removida da incubadora de CO2 e centrifugada a 800 rpm durante 5 minutos a 4°C. Em seguida, 90 μΐ de sobrenadante celular foi removido de cada alvéolo e adicionada com 90 μΐ de 0,1% BSA/RPMI164 0, seguido da adição do dimero de IL-22 (formado pelos dois monómeros mostrados em SEQ ID NO: 2) para a concentração final de 1,4, 4,1, 12,3, 37,0, 111,1, 333,3, 1000, 3000ng/ml, IL-22 para a concentração final de 0,01, 0,04, 0,12, 0,37, 1,1, 3,3, 10, 30ng/ml. A mistura foi incubada durante 20 horas numa incubadora de 5% CO2 e o sobrenadante celular foi colhido e o seu valor da DO foi testado usando um kit de ELISA para IL-22 (R&amp;D Cat#S1000B). Como se mostra na Fig. 8, o valor de ED50 do dimero de IL-22 é 229ng/ml (2675pM) e o de IL-22 é 0,54ng/ml (32,4pM).

Como se mostra nos resultados acima, apesar da bioactividade in vitro de IL-22 ser ligeiramente melhor que a do dimero de IL-22, os parâmetros farmacocinéticos in vivo e o efeito do dimero de IL-22 são melhores que os de IL-22. Assim, os modelos in vivo deverão ser usados para avaliar a actividade biológica dos dimeros de IL-22.

Apesar da descrição se referir a realizações particulares, será claro para os familiarizados com a arte que a presente invenção pode ser realizada com variação destes detalhes específicos.

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> GENERON (SHANGHAI) CORPORATION LTD.

<120> USO DE INTERLEUCINA-22 NO TRATAMENTO DE HEPATITE VIRAL <130> P2011-0360 <150> CN 201010268320.7 <151> 2010-08-31 <160> 7

<170> Patentln version 3.5 <210> 1 <211 >308 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <221 > misc_feature <223> Dímero de IL-22 <400> 1

Ala Pro lie Ser Ser His Cys Arg Leu Asp Lys Ser Asn Phe Gin Gin 15 10 15

Pro Tyr lie Thr Asn Arg Thr Phe Met Leu Ala Lys Glu Ala Ser Leu 20 25 30

Ala Asp Asn Asn Thr Asp Val Arg Leu lie Gly Glu Lys Leu Phe His 35 40 45

Gly Val Ser Met Ser Glu Arg Cys Tyr Leu Met Lys Gin Val Leu Asn 50 55 60

Phe Thr Leu Glu Glu Val Leu Phe Pro Gin Ser Asp Arg Phe Gin Pro 65 70 75 80

Tyr Met Gin Glu Val Val Pro Phe Leu Ala Arg Leu Ser Asn Arg Leu 85 90 95

Ser Thr Cys His lie Glu Gly Asp Asp Leu His lie Gin Arg Asn Val 100 105 110

Gin Lys Leu Lys Asp Thr Val Lys Lys Leu Gly Glu Ser Gly Glu lie 115 120 125

Lys Ala lie Gly Glu Leu Asp Leu Leu Phe Met Ser Leu Arg Asn Ala 130 135 140

Cys lie Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 145 150 155 160

Gly Ser Ala Pro lie Ser Ser His Cys Arg Leu Asp Lys Ser Asn Phe 165 170 175

Gin Gin Pro Tyr lie Thr Asn Arg Thr Phe Met Leu Ala Lys Glu Ala 180 185 190

Ser Leu Ala Asp Asn Asn Thr Asp Val Arg Leu lie Gly Glu Lys Leu 195 200 205

Phe His Gly Val Ser Met Ser Glu Arg Cys Tyr Leu Met Lys Gin Val 210 215 220

Leu Asn Phe Thr Leu Glu Glu Val Leu Phe Pro Gin Ser Asp Arg Phe 225 230 235 240

Gin Pro Tyr Met Gin Glu Val Val Pro Phe Leu Ala Arg Leu Ser Asn 245 250 255

Arg Leu Ser Thr Cys His lie Glu Gly Asp Asp Leu His lie Gin Arg 260 265 270

Asn Val Gin Lys Leu Lys Asp Thr Val Lys Lys Leu Gly Glu Ser Gly 275 280 285

Glu lie Lys Ala lie Gly Glu Leu Asp Leu Leu Phe Met Ser Leu Arg 290 295 300

Asn Ala Cys lie 305

<210>2 <211 >385 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <221 > misc_feature <223> Monómero de IL-22 com fragmento Fc <400>2

Ala Pro lie Ser Ser His Cys Arg Leu Asp Lys Ser Asn Phe Gin Gin 15 10 15

Pro Tyr lie Thr Asn Arg Thr Phe Met Leu Ala Lys Glu Ala Ser Leu 20 25 30

Ala Asp Asn Asn Thr Asp Val Arg Leu lie Gly Glu Lys Leu Phe His 35 40 45

Gly Val Ser Met Ser Glu Arg Cys Tyr Leu Met Lys Gin Val Leu Asn 50 55 60

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Ser Thr Cys His lie Glu Gly Asp Asp Leu His lie Gin Arg Asn Val 100 105 110

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Gly Ser Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro 165 170 175

Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met lie Ser 180 185 190

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Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val 225 230 235 240

Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu 245 250 255

Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu Thr 290 295 300

Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp lie Ala Val Glu Trp Glu 305 310 315 320

Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu 325 330 335

Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys 340 345 350

Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu 355 360 365

Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 370 375 380

Lys 385

<210>3 <211 >375 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <221 > misc_feature <223> Monómero de IL-22 com fragento Fc <400>3

Ala Pro lie Ser Ser His Cys Arg Leu Asp Lys Ser Asn Phe Gin Gin 15 10 15

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Ala Asp Asn Asn Thr Asp Val Arg Leu lie Gly Glu Lys Leu Phe His 35 40 45

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Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 165 170 175

Asp Thr Leu Met lie Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 180 185 190

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Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu 245 250 255

Pro Ala Ser lie Glu Lys Thr lie Ser Lys Thr Lys Gly Gin Pro Arg 260 265 270

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Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 290 295 300 lie Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 305 310 315 320

Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 325 330 335

Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser 340 345 350

Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser 355 360 365

Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 370 375

<210>4 <211 >385 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <221 > misc_feature <223> Monómero de IL-22 com fragmento Fc <400>4

Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val 15 10 15

Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met lie Ser Arg Thr 20 25 30

Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu 35 40 45

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Ser Lys Thr Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro 115 120 125

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<210>5 <211 >375 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> ^OO 1 nnicr* fnoti im <223> Monómero de IL-22 com fragmento Fc <400>5

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Leu Ser Asn Arg Leu Ser Thr Cys His lie Glu Gly Asp Asp Leu His 325 330 335 lie Gin Arg Asn Val Gin Lys Leu Lys Asp Thr Val Lys Lys Leu Gly 340 345 350

Glu Ser Gly Glu lie Lys Ala lie Gly Glu Leu Asp Leu Leu Phe Met 355 360 365

Ser Leu Arg Asn Ala Cys lie 370 375

<210>6 <211 >1278 <212> DNA <213> Sequência artificial <220> <221 > misc_feature <223> Sequência de DNA codificadora do monómero de IL-22 com fragmento Fc <400>6 gaattcccca gacccatggc cgccctgcag aaatctgtga gctctttcct tatggggacc 60 ctggccacca gctgcctcct tctcttggcc ctcttggtac agggaggagc agctgcgccc 120 atcagctccc actgcaggct tgacaagtcc aacttccagc agccctatat caccaaccgc 180 accttcatgc tggctaagga ggctagcttg gctgataaca acacagacgt tcgtctcatt 240 ggggagaaac tgttccacgg agtcagtatg agtgagcgct gctatctgat gaagcaggtg 300 ctgaacttca cccttgaaga agtgctgttc cctcaatctg ataggttcca gccttatatg 360 caggaggtgg tgcccttcct ggccaggctc agcaacaggc taagcacatg tcatattgaa 420 ggtgatgacc tgcatatcca gaggaatgtg caaaagctga aggacacagt gaaaaagctt 480 ggagagagtg gagagatcaa agcaattgga gaactggatt tgctgtttat gtctctgaga 540 aatgcctgca ttggatccgg tggcggttcc ggtggaggcg gaagcggcgg tggaggatca 600 gtcgagtgcc caccgtgccc agcaccacct gtggcaggac cgtcagtctt cctcttcccc 660 ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc cggacccctg aggtcacgtg cgtggtggtg 720 gacgtgagcc acgaagaccc cgaggtccag ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg 780 cataatgcca agacaaagcc acgggaggag cagttcaaca gcacgttccg tgtggtcagc 840 gtcctcaccg ttgtgcacca ggactggctg aacggcaagg agtacaagtg caaggtctcc 900 aacaaaggcc tcccagcctc catcgagaaa accatctcca aaaccaaagg gcagccccga 960 craaccacaaa tcrtacaccct acccccatcc caaaacraaaa taaccaaaaa ccaoatcaac 1020

<210>7 <211>1248 <212> DNA <213> Sequência artificial <220> <221 > misc_feature <223> Sequência de DNA codificadora do monómero de IL-22 com fragmento Fc <400>7 gaattcccca gacccatggc cgccctgcag aaatctgtga gctctttcct tatggggacc 60 ctggccacca gctgcctcct tctcttggcc ctcttggtac agggaggagc agctgcgccc 120 atcagctccc actgcaggct tgacaagtcc aacttccagc agccctatat caccaaccgc 180 accttcatgc tggctaagga ggctagcttg gctgataaca acacagacgt tcgtctcatt 240 ggggagaaac tgttccacgg agtcagtatg agtgagcgct gctatctgat gaagcaggtg 300 ctgaacttca cccttgaaga agtgctgttc cctcaatctg ataggttcca gccttatatg 360 caggaggtgg tgcccttcct ggccaggctc agcaacaggc taagcacatg tcatattgaa 420 ggtgatgacc tgcatatcca gaggaatgtg caaaagctga aggacacagt gaaaaagctt 480 ggagagagtg gagagatcaa agcaattgga gaactggatt tgctgtttat gtctctgaga 540 aatgcctgca ttgccagcac aaagggacca gtcgagtgcc caccgtgccc agcaccacct 600 gtggcaggac cgtcagtctt cctcttcccc ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc 660 cggacccctg aggtcacgtg cgtggtggtg gacgtgagcc acgaagaccc cgaggtccag 720 ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg cataatgcca agacaaagcc acgggaggag 780 cagttcaaca gcacgttccg tgtggtcagc gtcctcaccg ttgtgcacca ggactggctg 840 aacggcaagg agtacaagtg caaggtctcc aacaaaggcc tcccagcctc catcgagaaa 900 accatctcca aaaccaaagg gcagccccga gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc 960 cgggaggaga tgaccaagaa ccaggtcagc ctgacctgcc tggtcaaagg cttctacccc 1020 agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaat gggcagccgg agaacaacta caagaccaca 1080 cctcccatgc tggactccga cggctccttc ttcctctaca gcaagctcac cgtggacaag 1140 agcaggtggc agcaggggaa cgtcttctca tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac 1200 cactacacgc agaagagcct ctccctgtct ccgggtaaat gatctaga 1248

Lisboa, 06 de março de 2018

REIVINDICAÇÕES 1. Uso de um dímero de IL-22 humana na produção de um fármaco para o tratamento de hepatite virai. 2. 0 uso da reivindicação 1 em que a referida hepatite virai é hepatite A, hepatite B, hepatite C, hepatite D ou hepatite E. 3. 0 uso da reivindicação 1 ou da reivindicação 2 em que o referido dimero de IL-22 humana é mostrado como a fórmula (I): (I) M1-L-M2 em que

Ml é um primeiro monómero de IL-22 humana; M2 é um segundo monómero de IL-22 humana; e L é um elemento de ligação que liga o referido primeiro monómero IL-22 ao referido segundo monómero IL-22 e colocado entre os dois, em que, o dimero de IL-22 retém a actividade biológica de IL-22 e possui uma semivida no soro de pelo menos duas vezes a semivida do referido primeiro ou do referido segundo monómero IL-22. 4. 0 uso da reivindicação 3 em que o referido

Claims (11)

1. elemento de ligação L é seleccionado do grupo consistindo em: i) um péptido curto compreendendo 3 a 50 aminoácidos; e ii) um polipéptido da fórmula (II): (II) -Z-Y-Z- em que Y é uma proteína de suporte; Z é zero, ou um ou mais péptidos curtos compreendendo 1 a 30 aminoácidos; é uma ligação química ou uma ligação covalente.
2. 5. O uso da reivindicação 3 ou reivindicação 4 em que o referido primeiro monómero de IL-22 humana e o referido segundo monómero de IL-22 humana são da mesma entidade.
3. 6. O uso da reivindicação 4 ou reivindicação 5 em que a referida proteína de suporte é albumina ou fragmento Fc de IgG humana.
4. 7. O uso de qualquer uma das reivindicações 4-6 em que o referido dímero de IL-22 compreende uma sequência de aminoácidos seleccionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 2-5. 8. 0 dímero de IL-22 como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 7 para usar no tratamento de hepatite virai.
5. 9. Um dimero de IL-22 humana em que o referido dimero é mostrado como a fórmula (I): (I) M1-L-M2 em que Ml é um primeiro monómero de IL-22 humana; M2 é um segundo monómero de IL-22 humana; e L é um elemento de ligação que liga o referido primeiro monómero IL-22 ao referido segundo monómero IL-22 e localizado entre os dois; em que o referido elemento de ligação L é um polipéptido da fórmula (II): (II) -Z-Y-Z em que Y é uma proteína de suporte; Z é zero, ou um ou mais péptidos curtos compreendendo 1 a 30 aminoácidos; é uma ligação química ou uma ligação covalente; em que, o dímero de IL-22 retém a actividade biológica de IL-22 e possui uma semivida no soro de pelo menos duas vezes a semivida do referido primeiro ou do segundo monómero IL-22; em que a proteína de suporte é formada pela ligação de dois fragmentos Fc de IgG2 humana via ligações dissulfeto; e em que cada um dos fragmentos Fc consiste nos resíduos de aminoácidos 163-385 de SEQ ID N0:2.
6. 10. O dímero de IL-22 da reivindicação 9, em que o primeiro monómero de IL-22 humana e o segundo monómero de IL-22 humana compreendem os resíduos de aminoácidos 1-146 de SEQ ID NO:2.
7. 11. O dímero de IL-22 da reivindicação 9, em que o referido dímero de IL-22 compreende uma sequência de aminoácidos seleccionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 2-5.
8. 12. Uma composição farmacêutica para usar no tratamento de hepatite, compreendendo um dímero de IL-22 humana e um veículo aceitável em termos farmacêuticos, em que o referido dímero de IL-22 é mostrado como a fórmula (I) : (I) M1-L-M2 em que Ml é um primeiro monómero de IL-22 humana; M2 é um segundo monómero de IL-22 humana; e L é um elemento de ligação que liga o referido primeiro monómero IL-22 ao referido segundo monómero IL-22 e localizado entre os dois, em que, o dímero de IL-22 retém a actividade biológica de IL-22 e possui uma semivida no soro de pelo menos duas vezes a semivida do primeiro ou do segundo monómero.
9. 13. A composição farmacêutica para usar de acordo com a reivindicação 12 em que o dimero de IL-22 humana é como definido em qualquer uma das reivindicações 9-11.
10. 14. A composição farmacêutica para usar de acordo com a reivindicação 12 ou reivindicação 13, em que o dimero de IL-22 compreende uma sequência de aminoácidos seleccinonada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 2-5.
11. 15. A composição farmacêutica para usar de acordo com qualquer uma das reivindicaçãoes 12-14, em que a hepatite é hepatite virai. Lisboa, 06 de março de 2018