CN104623639A - 白介素22二聚体在制备治疗胰腺炎药物中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及白介素22二聚体在制备治疗胰腺炎药物中的应用。相对于IL-22单体，IL-22二聚体的治疗效果显著提高。

Description

白介素22二聚体在制备治疗胰腺炎药物中的应用
技术领域
本发明涉及生物和医药技术领域。更具体地，本发明涉及白介素-22二聚体在制备治疗胰腺炎(pancreatitis)药物中的应用。
背景技术
胰腺炎(pancreatitis)通常被认为是由于胰蛋白酶原被激活转化成胰酶，胰腺泡细胞的自我消化引起。根据病程，胰腺炎可被分为急性胰腺炎(Acute pancreatitis，AP)和慢性胰腺炎(Chronic pancreatitis，CP)两种。
导致急性胰腺炎发生的常见病因包括胆石症(包括胆道微结石)、高三酰甘油血症和乙醇等；其他因素(如暴饮暴食、休克、妊娠、寄生虫感染、高脂血症、高钙血症及腮腺炎等)也可诱发AP。另外，腹部手术、内镜逆行胰胆管造影(endoscopic retrograde cholangiopancreatography，ERCP)、超声内镜检查(endoscopic ultrasonography，EUS)等医源性因素，以及药物性因素(双氢克尿噻、利尿酸、消炎痛和口服避孕药等)也与AP的发生有关。还有相当数量的患者原因不明，称为特发性胰腺炎。
急性胰腺炎是一种临床常见的疾病，急性胰腺炎的基本病变包括水肿、出血和坏死。据报道，在所有的急性胰腺炎病例中，85%为水肿性胰腺炎(Interstitial pancreatitis)，约15%为坏死性胰腺炎(necrotizing pancreatitis,文献报道范围4-47%)。在水肿性急性胰腺炎，大约10%的患者有器官衰竭，大多数可以恢复，死亡率低。在坏死性急性胰腺炎中，约33%患者(16-47%)有感染性坏死(infected necrosis)，约54%的患者(29-78%)发生器官衰竭。感染性的坏死性急性胰腺炎的器官衰竭(34-89%)，略高于无感染坏死性急性胰腺炎(45-73%)。急性胰腺炎的总体死亡率约为5%。急性水肿性胰腺炎的死亡率约为3%，坏死性急性胰腺炎的死亡率约为17%,伴有感染性坏死胰腺炎死亡率约为30%，无感染性坏死胰腺炎死亡率约为12%。无器官衰竭的急性胰腺炎死亡率为0，有一个器官衰竭的急性胰腺炎死亡率为3%(0-8%)，有多个器官衰竭的急性胰腺炎死亡率为47%(28-69%)(PeterA.Banks等,Am J Gastroenterol,101:2379-2400,2006)。目前，急性胰腺炎的治疗方法为支持性治疗、维持水和电解质平衡、疼痛处理，临床上仍没有特异有效的治疗药物。
慢性胰腺炎是由各种不同原因引起的胰腺实质弥漫性或局限性炎症。急性重症胰腺炎反复发作可导致慢性胰腺炎发生(G,Maillet B.Hepatogastroenterology,38(5):408-12,1991)。CP的发病机制至今尚未阐明，目前临床上药物治疗手段主要为补充胰酶的替代疗法和治疗疼痛等并发症。
Feng等报道了IL-22对cerulein诱导的小鼠胰腺炎具有改善作用(Int.J.Biol.Sci,8(2),249-257,2012)。
发明概述
本发明的目的是提供IL-22二聚体在制备预防和治疗胰腺炎药物中的用途。
在本发明的第一方面中，提供了一种白介素-22(IL-22)二聚体的用途，用于制备治疗和/或预防胰腺炎的药物。
在一些实施方式中，所述胰腺炎选自：急性胰腺炎、慢性胰腺炎、酒精引起的胰腺炎、复发性的胰腺炎、胆汁返流性胰腺炎、水肿性胰腺炎、坏死性胰腺炎、内镜逆行胰胆管造影术引起的胰腺炎。
在一些实施方式中，所述的白介素-22二聚体是式I所示的白介素-22二聚体，
M1-L-M2    式I
式中，
M1是白介素-22的第一单体；
M2是白介素-22的第二单体；
L是位于所述的第一单体和第二单体之间的，将所述第一单体和第二单体连接在一起的接头元件。
在一些实施方式中，所述的白介素-22二聚体保持了白介素22的生物活性，并且其血清半衰期是所述第一单体或第二单体的血清半衰期的2倍以上。
在一些实施方式中，所述的IL-22二聚体的血清半衰期是所述第一单体和/或第二单体的血清半衰期的3倍以上、5倍以上或10倍以上。
在一些实施方式中，所述的接头元件L选自下组：
(i)3-50个氨基酸的短肽；
(ii)式II所示的多肽元件：
-Z-Y-Z-    式II
式中，
Y为载体蛋白；
Z为无、或1-30个氨基酸的短肽；
“-”为化学键或共价键。
在一些实施方式中，“-”为肽键。
在一些实施方式中，Z是5-50个氨基酸。
在一些实施方式中，Z包含如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO.:10所示的序列。
在一些实施方式中，Z为如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO.:10所示的序列。
在一些实施方式中，所述的载体蛋白包含至少两个能形成分子间二硫键的半胱氨酸。
在一些实施方式中，所述的载体蛋白在IL-22单体的N端。
在一些实施方式中，所述的载体蛋白在IL-22单体的C端。
在一些实施方式中，所述的载体蛋白是白蛋白或人IgG的Fc片段。
在一些实施方式中，Fc片段包含CH2和CH3区域。
在一些实施方式中，Fc片段包含如SEQ ID NO:2或SEQ ID NO.:9所示的序列。
在一些实施方式中，Fc片段为如SEQ ID NO:2或SEQ ID NO.:9所示的序列。
在一些实施方式中，所述二聚体由两个单体亚基构成，每一个所述的单体亚基包含IL-22区域、二聚化区域以及连接所述IL-22区域和二聚化区域的连接序列。
在一些实施方式中，所述IL-22区域为IL-22单体；所述二聚化区域包括人IgG2的Fc片段；所述连接序列为连接所述IL-22单体和所述Fc片段的肽；且所述二聚体由两个所述二聚化区域(如Fc片段)的通过一个或多个二硫键配对形成。
在一些实施方式中，所述二硫键的数量为2或4。
在一些实施方式中，所述单体亚基包含一段选自如SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:6-8所示的氨基酸序列。
在一些实施方式中，所述的第一单体和第二单体是相同的。
在一些实施方式中，所述二聚体具有选自下组的一种或多种生物活性：
(a)在体内降低淀粉酶和/或脂肪酶；
(b)在体内减轻胰腺水肿；
(c)在体内抑制胰腺腺泡细胞和/或脂肪细胞的坏死；
(d)在体内减轻制胰腺中炎症细胞的浸润。
在本发明第二方面中，提供了一种可用于治疗和预防胰腺炎的药物组合物，所述药物含有药学上可接受的载体以及式I所示的白介素-22二聚体，
M1-L-M2    式I
式中，
M1是白介素-22的第一单体；
M2是白介素-22的第二单体；
L是位于所述的第一单体和第二单体之间的，将所述第一单体和第二单体连接在一起的接头元件。
在一些实施方式中，所述的白介素-22二聚体保持了白介素22的生物活性，并且其血清半衰期是所述第一单体或第二单体的血清半衰期的2倍以上。
在本发明第三方面中，提供了一种白介素-22(IL-22)二聚体的用途，用于制备提高血清中淀粉样蛋白A含量或浓度的药物；用于制备提高血清中C反应蛋白含量或浓度的药物；和/或用于制备降低血清中甘油三酯的含量的药物。
在本发明的第四方面，提供了一种治疗个体中胰腺炎的方法，包括对个体施用有效量的IL-22二聚体。
在一些实施方式中，所述IL-22二聚体包含两个单体亚基，其中，每个单体亚基包含一个IL-22区域和二聚化区域。
在一些实施方式中，每个单体亚基包含一个通过连接序列连接于一个二聚化区域的IL-22区域。
在一些实施方式中，连接序列大约是5-50个氨基酸。
在一些实施方式中，连接序列包含如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO.:10所述的序列。
在一些实施方式中，连接序列具有如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO.:10所示的序列。
在一些实施方式中，二聚化区域包含至少两个能形成分子间二硫键的半胱氨酸。
在一些实施方式中，二聚化区域包含至少一个Fc区域的部分区域。
在一些实施方式中，Fc区域包含CH2和CH3区域。
在一些实施方式中，Fc区域包含如SEQ ID NO:2或SEQ ID NO.:9所示的序列。
在一些实施方式中，Fc区域具有如SEQ ID NO:2或SEQ ID NO.:9所示的序列。
在一些实施方式中，每个单体亚基的IL-22区域具有如SEQ ID NO:3所示的序列。
在一些实施方式中，每个单体亚基具有选自SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:6-8所示的序列。
在一些实施方式中，IL-22二聚体通过静脉方式给予。
在一些实施方式中，IL-22二聚体的给药剂量大约为2μg/kg至200μg/kg。
在一些实施方式中，IL-22二聚体的给药剂量大约为5μg/kg至80μg/kg。
在一些实施方式中，IL-22二聚体的给药剂量大约为10μg/kg至45μg/kg。
在一些实施方式中，所述胰腺炎为急性胰腺炎。
在一些实施方式中，所述胰腺炎为慢性胰腺炎。
在一些实施方式中，所述胰腺炎为水肿性胰腺炎。
在一些实施方式中，所述胰腺炎为坏死性胰腺炎。
在一些实施方式中，所述胰腺炎为酒精引起的胰腺炎。
在一些实施方式中，所述胰腺炎为复发性的胰腺炎。
在一些实施方式中，所述胰腺炎为胆汁返流性胰腺炎。
在一些实施方式中，所述胰腺炎为内镜逆行胰胆管造影术引起的胰腺炎。
在一些实施方式中，所述个体具有升高的血清淀粉酶、血清脂肪酶、尿液淀粉酶或升高的C反应蛋白。
在一些实施方式中，IL-22二聚体的给药不多于大约每周一次。
在一些实施方式中，IL-22二聚体的给药不多于大约每月一次。
在一些实施方式中，IL-22二聚体的给药不多于大约每三个月一次。
在一些实施方式中，IL-22二聚体的有效量可升高个体血清淀粉样蛋白A、C反应蛋白的水平。
在一些实施方式中，IL-22二聚体的有效量可抑制个体甘油三酯的水平。
在一些实施方式中，IL-22二聚体的有效量未引起炎性细胞因子水平的升高。
在一些实施方式中，炎性细胞因子选自TNFα、IL-6、IL-1β和IL-8。
在一些实施方式中，IL-22二聚体的有效量在体内可降低淀粉酶和/或脂肪酶。
在一些实施方式中，IL-22二聚体的有效量在体内减轻胰腺水肿。
在一些实施方式中，IL-22二聚体的有效量在体内抑制胰腺腺泡细胞和/或脂肪细胞的坏死。
在一些实施方式中，IL-22二聚体的有效量在体内减轻制胰腺中炎症细胞的浸润。
在一些实施方式中，二聚化区域在IL-22二聚体亚基的N端。
在一些实施方式中，二聚化区域在IL-22二聚体亚基的C端。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1显示了本发明一种IL-22二聚体的示意图。其中，“-”表示连接肽，标记为“IL-22”的椭圆形表示IL-22单体。该IL-22二聚体的一种序列如SEQ ID NO：5所示，其中第1-146位为IL-22，第147-162位为连接肽，第163-308位为另一IL-22。
图2A和图2B显示了本发明IL-22二聚体的示意图。其中，“-”表示氨基酸连接肽，标记为“IL-22”的椭圆形表示IL-22单体，图2A中标记为“C”的椭圆形表示载体蛋白，并且IL-22区域位于载体蛋白的N-末端，图2B中标记为“Fc”的半椭圆形表示Fc片段(一种二聚化区域)，显示二个Fc片段通过二硫键配对形成二聚体。
一种用于构成该IL-22二聚体的、带有Fc片段的IL-22单体的序列如SEQ ID NO：4所示，其中第1-146位为IL-22，第147-162位为连接肽，第163-385位为人IgG2的Fc片段。二个带有Fc片段的IL-22单体，通过Fc的配对作用构成二聚体。
一种用于构成该IL-22二聚体的、带有Fc片段的IL-22单体的序列如SEQ ID NO：6所示，其中第1-146位为IL-22，第147-152位为连接肽，第153-375位为人IgG2的Fc片段。二个带有Fc片段的IL-22单体，通过Fc的配对作用构成二聚体。
图3A和3B显示了本发明IL-22二聚体的示意图。其中，“-”表示氨基酸连接肽，标记为“IL-22”的椭圆形表示IL-22区域，图3A中，标记为“C”的椭圆形表示载体蛋白，并且IL-22区域位于载体蛋白的C-末端，图3B中标记为“Fc”的半椭圆形表示Fc片段(一种二聚化区域)，显示二个Fc片段通过二硫键配对形成二聚体。
一种用于构成该IL-22二聚体的、带有Fc片段的IL-22单体的序列如SEQ ID NO:7所示，其中第1-223位为人IgG2的Fc片段，第224-239位为连接肽，第240-385位为IL-22。二个带有Fc片段的IL-22单体，通过Fc的配对作用构成二聚体。
一种用于构成该IL-22二聚体的、带有Fc片段的IL-22单体的序列如SEQ ID NO:8所示，其中第1-223位为人IgG2的Fc片段，第224-229位为连接肽，第230-375位为IL-22。二个带有Fc片段的IL-22单体，通过Fc的配对作用构成二聚体。
图4显示了IL-22、IL-22二聚体在体外活性试验中对Colo205细胞的增殖作用。
图5显示了IL-22、IL-22二聚体在体外活性试验中对Colo205细胞STAT3的激活作用。
图6显示了IL-22二聚体给药后在大鼠胰腺组织中的分布情况。SD大鼠尾静脉给予125I标记的IL-22二聚体30μg/kg，单次给药，分别检测给药后2hr、24hr和48hr器官组织的放射性计数。
图7显示了IL-22二聚体给药后在食蟹猴胰腺组织中的分布情况。食蟹猴静脉注射100μg/kg剂量的IL-22二聚体，单次给药，分别检测给药后2hr器官组织的药物浓度。
图8A显示了IL-22二聚体给药后人体血清中淀粉样蛋白浓度随时间的变化。
图8B显示了IL-22二聚体给药后人体血清中C反应蛋白浓度随时间的变化。
图8C显示了IL-22二聚体给药后人体血清中甘油三酯浓度随时间的变化。
图8D显示了IL-22二聚体给药后对人体血清中不同细胞因子浓度的影响。
图9A显示了在大鼠胰腺炎模型中IL-22、IL-22二聚体对血清淀粉酶的影响。
图9B显示了在大鼠胰腺炎模型中IL-22、IL-22二聚体对血清脂肪酶的影响。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究，意外地发现IL-22二聚体对于胰腺炎(尤其是胆汁返流性胰腺炎)具有特别有效的治疗作用。在此基础上，发明人完成了本发明。
本发明提供了一种使用有效量的IL-22二聚体用于预防和/或治疗胰腺炎的方法。
在一些实施方式中，提供一种预防和/或治疗胰腺炎的方法，包括对个体施用一种有效量的IL-22二聚体。
在一些实施方式中，提供了一种抑制患有胰腺炎个体炎症的方法，包括施用一种有效量的IL-22二聚体。
在一些实施方式中，提供了一种在个体中减少一种或多种胰腺炎的症状的方法，包括施用一种有效量的IL-22二聚体。
在一些实施方式中，提供了提高患有胰腺炎个体生活质量的方法，包括施用一种有效量的IL-22二聚体。
在一些实施方式中，有效量的IL-22二聚体可降低胰腺炎个体的血清淀粉酶水平。在一些实施方式中，血清淀粉酶的水平相较于治疗前的水平，大约至少降低了2、3、4、5、6、7、8、9或10倍。
在一些实施方式中，有效量的IL-22二聚体可降低在胰腺炎个体的血清脂肪酶水平。在一些实施方式中，血清淀粉酶水平相较于治疗前的水平，大约至少降低了2、3、4、5、6、7、8、9或10倍。
在一些实施方式中，有效量的IL-22二聚体可抑制胰腺炎个体的胰腺腺泡细胞和/或脂肪细胞的坏死，减轻胰腺水肿，减轻胰腺炎症细胞的浸润。
在一些实施方式中，提供了一种预防和/或治疗胰腺炎的方法，包括对个体施用一种有效量的IL-22二聚体，其中有效量的IL-22二聚体可导致个体中血清淀粉样蛋白A水平增加。在一些实施方式中，血清淀粉样蛋白A的水平相较于治疗前的水平，大约至少增加了5、10、15、20、25、30、50、100、150、200、500、1000、2000或2500倍。
在一些实施方式中，提供了一种预防和/或治疗胰腺炎的方法，包括对个体施用一种有效量的IL-22二聚体，其中，有效量的IL-22二聚体可导致个体中C反应蛋白水平增加。在一些实施方式中，C反应蛋白的水平相较于治疗前的水平，至少增加了2、3、4、5、10、15、20、25、30、50或100倍。
在一些实施方式中，提供了一种预防和/或治疗胰腺炎的方法，包括对个体施用一种有效量的IL-22二聚体，其中，有效量的IL-22二聚体导致个体中甘油三酯水平下降。在一些实施方式中，甘油三酯的水平相较于治疗前的水平，大约至少下降了2、3、4、5、10、15、20、25或30倍。
在一些实施方式中，提供了一种预防和/或治疗胰腺炎的方法，包括对个体施用一种有效量的IL-22二聚体，其中，有效量的IL-22二聚体未导致炎性细胞因子(例如选自TNFα、IL-6、IL-1β和IL-8中的任意一种炎症细胞因子)的增加。
在一些实施方式中，提供了一种预防和/或治疗胰腺炎的方法，包括对个体施用一种有效量的IL-22二聚体，其中，有效量的IL-22二聚体导致包括两项或两项以上上述的治疗终点。
如本发明所用，术语“治疗”是指基于治愈、缓解、改善、减轻、延迟、和/或影响治疗对象疾病、症状、疾病体质(predisposition)的目的而给予需要治疗的对象本发明的白介素-22二聚体。
如本发明所用，术语“有效量”是指能够在治疗对象体内达到预防或治疗目的的白介素-22二聚体的量。本领域的普通技术人员应理解，所述“治疗有效量”可随白介素-22二聚体的给药途径、所用药物辅料以及与其他药物联合用药情况的不同而有所不同。
如本发明所用，术语“治疗对象”或“个体”是指鼠、人及其他哺乳动物。
在一些实施方式中，治疗对象是16岁或以下、18岁或以下、25岁或以下、35岁或以下、45岁或以下、55岁或以下、65岁或以下或75岁或以下。在一些实施方式中，治疗对象是16岁或以上、18岁或以上、25岁或以上、35岁或以上、45岁或以上、55岁或以上、65岁或以上或75岁或以上。
在一些实施方式中，个体(治疗对象)的Ranson评分分数为1或以上、2或以上、3或以上、4或以上、5或以上、6或以上、7或以上、8或以上、9或以上、10或以上、11或以上。在一些实施方式中，治疗对象的CT严重指数为1或以上、2或以上、3或以上、4。在一些实施方式中，治疗对象的修正CT严重指数为1或以上、2或以上、3或以上、4或以上、5或以上、6或以上、7或以上、8或以上、9或以上、10或以上、11或以上。在一些实施方式中，治疗对象的APACHE II评分为1或以上、2或以上、3或以上、4或以上、5或以上、6或以上、7或以上、8或以上、9或以上、10或以上、11或以上、15或以上、20或以上、25或以上、30或以上、35或以上、40或以上。在一些实施方式中，治疗对象的APACHE III评分为1或以上、2或以上、3或以上、4或以上、5或以上、10或以上、15或以上、20或以上、25或以上、30或以上、35或以上、40或以上、45或以上、50或以上。在一些实施方式中，治疗对象的修正Glasgow评分为1或以上、2或以上、3或以上、4或以上、5或以上、6或以上、7或以上、8或以上。在一些实施方式中，患者具有两个或更多上述特征。在一些实施方式中，治疗对象呈急性胰腺炎的特征性影像学改变。
在一些实施方式中，治疗对象表现出一种或多种胰腺炎的症状，包括但不限于，恶心、腹痛或敏感，呕吐、消化不良、体重下降、脂肪痢、发生组织病变、急性炎症、空泡形成(例如，腺泡细胞空泡形成)、中性白细胞浸润、水肿、胰腺结石、胆结石、胆系结石、胰腺囊肿、体温上升或下降、心率上升、呼吸率上升、内出血、黄疸、糖尿病、坏死(例如，腺泡细胞坏死)、胰腺癌或器官衰竭。
在一些实施方式中，治疗对象的血清淀粉酶水平升高(例如大约高于120U/L、150U/L、200U/L、300U/L或400U/L)，尿淀粉酶水平升(例如大约高于40U/h、80U/h、120U/h或160U/h)。在一些实施方式中，治疗对象的血清脂肪酶水平升高(例如大约高于150U/L、200U/L、300U/L、或高于400U/L、或高于500U/L)。在一些实施方式中，治疗对象的血清淀粉酶和/或脂肪酶活性至少＞3倍正常上限值。在一些实施方式中，治疗对象的血清C反应蛋白水平升高(例如大约高于25mg/L、50mg/L、100mg/L、150mg/L、200U/L、250mg/L、300mg/L或400mg/L)。
在一些实施方式中，治疗对象的血清丙氨酸转氨酶水平升高(例如大约高于40U/L、50U/L、60U/L、75U/L或150U/L)。在一些实施方式中，治疗对象血清中IL-6或IL-8水平升高或血液磷脂酶(phospholipase A2)水平升高(例如大约高于3U/L、7U/L、15U/L、30U/L、60U/L或100U/L)。在一些实施方式中，治疗对象的血清降钙素原水平升高(例如大约高于3ng/mL、4ng/mL、5ng/mL、7.5ng/mL)。在一些实施方式中，治疗对象的尿胰蛋白酶原激活肽水平升高(例如大约高于3ng/mL、6ng/mL、10ng/mL、20ng/mL或30ng/mL)。在一些实施方式中，治疗对象的血清胰蛋白酶原激活肽水平升高。在一些实施方式中，治疗对象粪弹性蛋白酶水平下降(例如大约低于200μg/g、150μg/g、100μg/g或50μg/g)。在一些实施方式中，治疗对象的白细胞数提高(例如大约高于12000细胞/mm3、14000细胞/mm3、16000细胞/mm3、18000细胞/mm3或20000细胞/mm3)。在一些实施方式中，治疗对象的血清钙水平下降(例如大约低于10mg/mL、8mg/mL、6mg/mL、4mg/mL或2mg/mL)。在一些实施方式中，治疗对象血清中天冬氨酸转氨酶水平升高(例如大约高于30U/L、40U/L、50U/L、60U/L或75U/L)。在一些实施方式中，治疗对象血清中乳酸脱氢酶水平升高(例如大约高于250IU/L、300IU/L、350IU/L、400IU/L或450IU/L)。在一些实施方式中，治疗对象的血糖水平提高(例如大约高于180mg/dL、200mg/dL、220mg/dL、260mg/dL、300mg/dL)。在一些实施方式中，治疗对象患有碱缺失(例如高于3mEq/L、4mEq/L、5mEq/L、6mEq/L)。
如本文所用，可被预防或治疗的胰腺炎包括多种胰腺炎。
在一些实施方式中，胰腺炎可指慢性胰腺炎，包括但不限于，酒精性胰腺炎(长期饮酒)、遗传性胰腺炎、囊性纤维化胰腺炎、创伤引起的胰腺炎、热带胰腺炎、营养不良诱发胰腺炎、高血钙胰腺炎、钙化胰腺炎(由钙结石如胰腺结石、胆结石或胆道结石引起的)、自身免疫胰腺炎或先天性胰腺炎。
在一些实施方式中，胰腺炎可指急性胰腺炎。在一些实施方式中，急性胰腺炎是孤立的突发事件；在一些实施方式中，急性胰腺炎是复发的。急性胰腺炎，包括但不限于，酒精诱发胰腺炎(急性饮酒)、胆石性胰腺炎、胆源性胰腺炎、逆行胰胆管造影术后胰腺炎或先天性胰腺炎。在一些实施方式中，急性胰腺炎是由病毒性感染所引起的，如柯萨奇病毒(coxackie virus)、巨细胞病毒(cytomegalovirus)、乙型肝炎病毒(hepatitis B)、单纯性疱疹病毒(herpes simplex virus)、流行性腮腺炎病毒(mumps viruses)和水痘带状疱疹病毒(varicella-zoster viruses)。在一些实施方式中，急性胰腺炎是由细菌性感染所引起的，如军团杆菌(Legionella)、细螺旋体(Leptospira)、支原体(Mycoplasma)或沙门氏菌(Salmonella)所引起的感染。在一些实施方式中，急性胰腺炎是曲霉属(Aspergillus)真菌感染所引起的。在一些实施方式中，急性胰腺炎是由寄生虫感染所引起的，如蛔虫(Ascaris)、隐孢子虫(Cryptosporidium)和弓形虫(Toxoplasma)。
在一些实施方式中，胰腺炎可指由药物使用所导致的胰腺炎，例如被用于治疗各种医疗情况或不当使用的药物。例如，在一些实施方式中，可治疗由于施用以下药物引起的胰腺炎，例如地达诺新(didanosine)、天冬酰胺酶(asparaginase)、氨水杨酸(mesalamine)、激素(hormones)、麻醉剂(opiates)、四环素(tetracycline)、阿糖胞苷(cytarabine)、血管紧张素转换酶抑制剂(ACE inhibitors)、组织蛋白去乙酰化抑制剂(valporic acid)、咪唑硫嘌呤(azathioprine)、柳氮磺胺吡啶(sulfasalazine)、呋喃苯胺酸(furosemide)、苏灵大(sulindac)、类固醇(steroids)或3-羟基-3甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶抑制剂(HMG-CoA reductaseinhibitors)。
在一些实施方式中，胰腺炎可指遗传性胰腺炎或家族性胰腺炎。例如，在一些实施方式中，患有胰腺炎的个体携带变种胰蛋白酶-1(又称为阳离子胰蛋白酶原或人丝氨酸蛋白酶1)、丝氨酸蛋白酶抑制剂Kazal-type1(SPINK1)，或囊胞性纤维化跨膜传导调节蛋白(CFTR)，可被治疗。在一些实施方式中，一个负责基因或编码蛋白被截断后，引起变种。
在一些实施方式中，胰腺炎与其他因素有关联，包括高血钙、高血脂、高血淀粉酶、腹部创伤、胃溃疡、蝎螫伤、低体温症、胰腺分裂、怀孕、糖尿病、手术、胰腺癌、和血管炎。在一些实施方式中，胰腺炎可指由自身免疫疾病所导致的胰腺炎。在一些实施方式中，胰腺炎可指先天性胰腺炎。
在一些实施方式中，胰腺炎是由胆结石或其他因素造成胆管阻塞导致的。因为胆囊和胰腺共用一个通道连接至胃肠道，当在导管中固定的胆结石阻塞消化酶从胰腺流出，从而引起急性胆石性胰腺炎。其他形式的胆源性胰腺炎可能由于胆汁淤渣阻塞通道或胆管结构畸形致胆胰回流引起。
在一些实施方式中，胰腺炎是由内镜下逆行胰胆管造影术(ERCP)造成的。ERCP经常用于诊断或治疗在胆道系统或胰腺导管系统中的畸形或问题，如胆结石、黄疸或肿瘤，但是这个过程有时会导致胰腺炎的发生。
胰腺炎可以被诊断，且可以通过多种方法对治疗进行评估，包括但不限于超声波(例如超声内镜)、计算机断层扫描(CT)、核磁共振成像(MRI)或者其他内部可视化技术。内镜下逆行胰胆管造影术(ERCP)或核磁共振胰胆管造影术(MRCP)也可用于胰腺、胆囊以及胆管的显像，以此对胰腺炎的治疗终点进行诊断、评估。
超声内镜检查术用于诊断和治疗评估，评价标准可包括在胰腺软细胞组织、胰腺囊肿、不规则的胰管轮廓或者扩张的胰管上，一个或更多的高回声点、高回声线或高回声小叶。CT的严重性指数也可用于诊断，具体操作可参见Balthazar等人的放射学156:767-772(1985)、Balthazar的放射学174:331-336(1990)，Mortele等人的Am.J.放射学183:1261-1265(2004)，Balthazar等，Radiology156:767-772(1985),Balthazar,Radiology174:331-336(1990)，或者Mortele等,Am.J.Roentgenology,183:1261-1265(2004))。在一些实施方式中，腹壁水肿的检验结果，或者核磁共振严重性指数(MRSI)评分的提高可作为一个评价标准，具体操作可参见Yang等人Eur.J.放射学81:3041-3047(2012)(Yang等,Eur.J.Radiology,81:3041-3047(2012))。在一些实施方式中，胆道或胆囊结石的可视化结果可作为一个评价标准。
IL-22
如本文所用，“白介素-22”或“IL-22”是指一种蛋白质，包括(a)具有与Dumoutier等人在US 6,359,117中描述的人/鼠白介素-22基本相同的氨基酸序列的蛋白质和(b)具有与天然白介素-22相同的生物学活性的蛋白质。本发明的白介素-22包括，但不限于：人白介素-22、重组人白介素、鼠白介素-22和/或重组鼠白介素-22。
具体地，白介素-22(IL-22)是一种由被激活的T细胞和自然杀伤细胞(NK细胞)表达并分泌的糖蛋白，又称为与白介素-10相关的由T细胞衍生的可诱导因子(IL-10 related T cell-derived inducible factor，IL-TIF)。被激活的T细胞主要是CD4+细胞，特别是CD28途径中激活的Th1细胞、Th17细胞和Th22细胞。最初在经IL-9刺激后的鼠科动物T细胞和肥大细胞中发现IL-22mRNA的表达。在伴刀豆球蛋白A(Con A)的刺激下，脾细胞也可产生IL-22(Dumoutier等,J.Immunology,164:1814-1819,2000)。人IL-22的mRNA主要由被抗CD3抗体或Con A刺激的外周T细胞表达。
天然的IL-22前体肽由179个氨基酸残基组成，而成熟肽为146个氨基酸残基。Dumoutier等人最先报道了小鼠和人IL-22基因的克隆(Dumoutier等,2000;US 6,359,117and6,274,710)。IL-22主要由被激活的T细胞(特别是Thl7细胞)、外源凝集素(lectin)刺激后的脾细胞(Dumoutier等,2000)、IL-2/IL-12刺激后的NK细胞(Wolk,K等,J.Immunology,168:5397-5402,2002)和LPS刺激后的多个器官和组织中表达，包括肠道、肝、胃、肾、肺、心脏、胸腺、脾都可以检测到IL-22的表达升高。IL-22通过结合IL-22R1受体和IL-10R2受体，发挥生物学功能。IL-22R1是IL-22特异的受体，主要在皮肤、肾、消化系统(胰腺，小肠，肝，大肠，结肠)以及呼吸系统(肺，支气管)中表达。已公开的研究表明，IL-22是一个免疫调节剂。
IL-22二聚体
本发明的IL-22二聚体的结构如式I所示。代表性的结构如图1-3中所示。其中，载体蛋白，包括(但并不限于)人IgG(1,2,3,4)的Fc片段，或人白蛋白(albumin)。
或者，本发明的IL-22二聚体包含两个单体亚基，其中，每个单体亚基包含一个IL-22区域和二聚化区域，每个单体亚基包含一个通过连接序列连接于一个二聚化区域的IL-22区域。所述IL-22区域位于二聚化区域的C-末端，也可位于二聚化区域的N-末端。所述二聚体的载体蛋白由两个二聚体化区域通过二聚化形成。
如本文所用，术语“连接肽”或“连接序列”(linker)指位于IL-22单体和载体蛋白之间的或IL-22单体(或IL-22区域)和二聚化区域之间的、起连接作用的短肽。连接肽的长度没有特别限制。连接肽的长度通常为5-50个氨基酸。在一些实施方式中，连接肽不影响或不显著影响IL-22单体和IL-22单体形成正确的折叠和空间构象。一些连接肽的例子包括(但并不限于)：
较佳地，所述的连接肽具有选自下组的氨基酸序列：
(a)疏水性氨基酸Gly和Pro构成的3-16个氨基酸序列，例如Gly-Pro-Gly-Pro-Gly-Pro;
(b)多克隆位点所编码的氨基酸序列。该序列通常为5-20个，较佳地10-20个氨基酸；
(c)来自于IL-22单体之外的蛋白的氨基酸序列，例如来自于IgG或白蛋白的氨基酸序列；
(d)由(a)、(b)和(c)组合形成的氨基酸序列。
优选的连接肽包括：GSGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:1)或ASTKGP(SEQ IDNO.:10)。
此外，在融合蛋白的N端或C末端还可添加其他不影响IL-22单体活性的氨基酸序列。较佳地，这些添加的氨基酸序列有利于表达(如信号肽)，有利于纯化(如6×His序列)、酿酒酵母α-因子信号肽切割位点(Glu-Lys-Arg)，或可促进融合蛋白的活性。
在一些实施方式中，IL-22二聚体包含两个单体亚基，其中每个单体亚基包含一个IL-22区域和一个二聚化区域。在一些实施方式中，IL-22区域融合于二聚化区域的N末端。在一些实施方式中，IL-22区域融合于二聚化区域的C末端。在一些实施方式中，IL-22区域和二聚化区域通过连接肽连接(例如，大约5-50个氨基酸长度的连接肽，又如具有如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO.:10所示序列的连接肽)。在一些实施方式中，IL-22二聚体的二聚化区域包括亮氨酸拉链结构。
在一些实施方式中，IL-22二聚体包含两个IL-22单体亚基，其中每个IL-22单体亚基包含一个IL-22单体和至少免疫球蛋白Fc区域(Fc区域，或称为Fc片段)的一部分。在一些实施方式中，IL-22区域融合于Fc区域的N端。在一些实施方式中，IL-22区域融合于Fc区域的C端。在一些实施方式中，IL-22区域和Fc区域通过连接肽连接(例如，大约5-50个氨基酸长度的连接肽，又如具有如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO.:10所示序列的连接肽)。在一些实施方式中，IL-22区域具有如SEQ ID NO:3所示的序列。在一些实施方式中，Fc区域包含至少2个能形成分子间二硫键的半胱氨酸。在一些实施方式中，Fc区域的N末端被截断，例如缺失完整的免疫球蛋白Fc区域起始的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸。在一些实施方式中，Fc区域来自IgG2。在一些实施方式中，Fc区域具有如SEQ ID NO:2或SEQ ID NO.:9所示的序列。
在一些实施方式中，IL-22二聚体包含两个IL-22单体亚基，其中每个IL-22单体亚基包含或为如SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:6-8所示的序列。
本发明包含对提及的多肽的修饰，包括不显著影响特性的功能上等价的蛋白和活性提高或降低的变体。在领域中多肽的修饰是常规的实践并且不需要在本发明中详述。修饰的多肽的例子包括多肽的氨基酸残基的保守替代，一个或更多缺失或增加那些不显著危害性地改变功能活性的氨基酸，不显著危害性地改变功能活性的非保守的突变，或化学类似物的使用。
氨基酸序列插入包含在N端或C末端融合长度为一个残基到含有数百甚至更多残基的多肽，包含内部序列中插入单个或多个氨基酸残基。末端插入的例子包括一个N末端甲硫氨酸残基或一个表位标签，IL-22二聚体的单体亚基的其它插入变体包含在N端或C端融合多肽或能提高IL-22二聚体血清半衰期的多肽。
蛋白中存在20种常见氨基酸，根据侧链的化学特性，这些氨基酸可以分为9类或组，本发明的“保守的”替代指的是在同类/组中的一种氨基酸替代另一种氨基酸。对蛋白的保守的氨基酸替代通常不显著改变蛋白的构-象和功能。相反，非保守的氨基酸替代趋于破坏蛋白的构象和功能。具有相似的侧链的氨基酸残基的家族已在领域中被定义，这些家族包括的氨基酸侧链如下：碱性侧链(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)，酸性侧链(天冬氨酸、谷氨酸)，不带电荷的极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)，非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)，β-支侧链(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香族侧链(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。(参见下表)
氨基酸分类示例
小/脂肪族残基: Gly,Ala,Val,Leu,Ile
环状亚氨基酸 Pro
含羟基残基: Ser,Thr
酸性残基: Asp,Glu
氨基残基: Asn,Gln
碱性残基: Lys,Arg
咪唑残基: His
芳香族残基: Phe,Tyr,Trp
含硫残基: Met,Cys
在一些实施方式中，保守的氨基酸替换包含用甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、异亮氨酸(I)、缬氨酸(V)和亮氨酸(L)替代任何其它的这类脂肪族氨基酸；丝氨酸(S)替代苏氨酸(T)，反之亦然；天冬氨酸(D)替代谷氨酸(E)，反之亦然；谷氨酰胺(Q)替代天冬酰胺(N)，反之亦然；赖氨酸(K)替代精氨酸(R)，反之亦然；苯丙氨酸(F),酪氨酸(Y)和色氨酸(W)替代任何其它的这类芳香族氨基酸;甲硫氨酸(M)替代半胱氨酸，反之亦然。其它的替代也可视为保守替代，取决于特定氨基酸所处的环境和在蛋白三维构象结构中的作用，例如，甘氨酸(G)和丙氨酸(A)通常可以互换，丙氨酸氨(A)与缬氨酸(V)之间也可以，甲硫氨酸(M)相对较疏水，通常可用亮氨酸或异亮氨酸互换，有时缬氨酸也可以。当氨基酸所处位置的显著特征在于氨基酸残基的电荷，并且两种氨基酸残基的PKs差异不显著时，赖氨酸(K)和精氨酸(R)通常可以互换。在特定的环境中其它方式的替代仍然可以被认为“保守的”(参见Biochemistry at pp.13-15,2nd ed. Lubert Stryer编辑.(StanfordUniversity);Henikoff等,Proc.Nat’l Acad. Sci.USA(1992)89:10915-10919;Lei等,J.Biol.Chem.(1995)270(20):11882-11886)。
我们出乎意料的发现，相对于IL-22单体，虽然IL-22二聚体在体外活性试验中具有较低的活性，然而在体内环境中对治疗胰腺炎方面具有显著地效果，例如，在一些实施方式中，本发明的IL-22二聚体在体外细胞增殖试验中EC50不低于20ng/mL(包括例如不低于100ng/mL、200ng/mL、300ng/mL、400ng/mL或更高)。在一些实施方式中，在体外细胞增殖试验中，IL-22二聚体的EC50大约至少为单体IL-22(例如如SEQ ID NO:3所示的单体IL-22)的5倍(包括例如大约至少是10倍、30倍、50倍、100倍、150倍、300倍、400倍、500倍、600倍、1000倍或更高)。在一些实施方式中，在体外STAT3刺激试验中，IL-22二聚体的EC50大约不低于10ng/mL(包括不低于50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL、300ng/L、400ng/mL或更高)。在一些实施方式中，在体外STAT3刺激试验中，IL-22二聚体的EC50大约至少是IL-22单体(例如SEQ ID NO:3所示的单体IL-22)的10倍(包括例如大约至少是50倍、100倍、200倍、300倍、400倍、500倍、600倍、700倍、800倍、900倍、1000倍、1500倍或更高)。
在一些实施方式中，IL-22二聚体血清半衰期显著地高于IL-22单体。在一些实施方式中，IL-22二聚体血清半衰期大约至少是15、30、50、100、150、200、250、300或350小时。在一些实施方式中，IL-22二聚体给药剂量为2μg/kg时，药物血清半衰期至少是15、30、50、100、150、200小时。在一些实施方式中，IL-22二聚体给药剂量为10μg/kg时，药物血清半衰期至少是50、100、150、200小时。在一些实施方式中，IL-22二聚体给药剂量为30μg/kg时，药物血清半衰期大约至少是100、150、200、250小时。在一些实施方式中，IL-22二聚体给药剂量为45μg/kg时，药物血清半衰期大约至少是100、150、200、250、300、350小时。
IL-22二聚体的制备
IL-22二聚体的IL-22单体亚基可采用重组DNA技术表达。采用已知的技术，编码IL-22单体亚基的核苷酸序列可以被插入可复制的克隆载体或蛋白表达载体的限制性酶切位点。在一些实施方式中，一个单一编码IL-22单体亚基的核苷酸序列被插入克隆载体或表达载体。在一些实施方式中，一个编码IL-22区域的核苷酸序列和一个编码延伸肽区域的核苷酸序列可以分别被插入克隆载体或表达载体，在这种方式下，当核苷酸序列被表达成蛋白时，形成一段连续的多肽。在一些实施方式中，一个编码接头(连接肽)的核苷酸序列，一个编码二聚化区域的核苷酸序列，和一个编码IL-22区域可以分别被插入克隆载体或表达载体，在这种方式下，当核苷酸序列被表达蛋白时，形成一段连续的多肽。在一些实施方式中，编码IL-22单体亚基的核苷酸序列可以与编码亲和或者鉴别标签(tag)的核苷酸序列融合，例如，但不限于His-tag,FLAG-tag,SUMO-tag,GST-tag,抗体-tag,或MBP-tag。在一些实施方式中，采用已知的技术，克隆载体或表达载可以接着被转染或转化真核或原核细胞。在一些实施方式中，IL-22或IL-22单体亚基可以在体外表达。
表达宿主细胞可以是能表达IL-22二聚体的任何细胞。合适的原核表达宿主细胞包括，但不限于，Escherichia coli,Erwinia,Klesbsiella,Proteus,Salmonella,Serratia,Shigella,Bacillus subtilis,Bacillus licheniformis,Pseudomonas,和Streptomyces。真核细胞，例如真菌或酵母，也适合于表达IL-22二聚体的单体亚基，例如，但不限于Saccharomyces,Schizosaccharomyces pombe,Kluyveromyces lactis,Kluyveromyces fragilis,Kluyveromyceswaltii,Kluyveromyces drosophilarum,Kluyveromyces thermotolerans,Kluyveromyces marxianus,Pichia pastoris,Neurospora crassa,Schwanniomyces,Penicillium,Tolypocladium,Synechococcus和Aspergillus。植物或海藻细胞也适合于表达IL-22二聚体的单体亚基，例如Chlamydomonas。多细胞生物衍生真核细胞也适合于表达IL-22单体亚基，例如，但不限于，无脊椎细胞如Drosophila S2和Spodoptera Sf9，或者哺乳动物细胞，如中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)、COS细胞、人胚肾细胞(例如HEK293细胞)、鼠睾丸滋养层细胞、人肺细胞和鼠乳腺癌细胞。在IL-22单体亚基克隆质粒被转化或转染宿主细胞后，细胞可在传统的营养培养基生长，必要时诱导蛋白表达。在一些实施方式中，IL-22单体亚基的表达不需要诱导。
在一些实施方式中，表达的IL-22单体亚基形成IL-22二聚体。在一些实施方式中，IL-22单体亚基需要进一步诱导形成IL-22二聚体，如补充氧化化合物(如过氧化氢，金属催化剂)、紫外线或者化学交联剂(例如甲醛，1,6二(马来酰亚氨基)己烷(1,6-bismaleimidohexane)、1,3-二溴-2-异丙醇(1,3-dibromo-2-propanol)、二氯二乙硫醚(bis(2-chloroethyl)sulfide)或戊二醛)。
在一些实施方式中，IL-22二聚体的形成不需要诱导。在一些实施方式中，IL-22二聚体的表达宿主是中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)。在一些实施方式中，IL-22二聚体可以采用一系列的蛋白纯化技术纯化，例如IL-22二聚体可通过一下方式纯化：亲和层析、离子交换层析，反向HPLC，分子筛层析，沉淀或超滤。在一些实施方式中，融合于IL-22单体亚基多肽的亲和标签可以被去除。
对于IL-22二聚体的制备方法，可参见专利申请PCT/CN2011/079124(2011年8月30日申请，申请人：健能隆医药技术(上海)有限公司)。
IL-22二聚体的施用
本发明所述的IL-22二聚体可通过不同的途径对施用于个体。在一些实施方式中，IL-22二聚体可通过肠道外给药、静脉注射给药、口服给药、肌肉注射给药或皮下注射给药。
在一些实施方式中，个体是哺乳动物；优选为人类、啮齿动物或灵长类中的人一种或多种。
被施用给个体(如人)的IL-22二聚体的剂量将随具体的组合物、使用方法、和被治疗的具体胰腺炎种类而不同。所述剂量应该足以实现所期望的反应，如针对具体状况的治疗性的或预防性的反应。在一些实施方式中，有效量是足以延缓疾病发展的剂量。在一些实施方式中，有效量是足以预防疾病发生和/或再发生的剂量。有效量可以在一次或多次给药中被施用。合适的IL-22二聚体给药剂量包括，例如，大约0.5-500μg/kg，2-200μg/kg、5-80μg/kg、10-45μg/kg或30-40μg/kg。
在一些实施方式中，IL-22二聚体施用频率为每周1次。在一些实施方式中，IL-22二聚体施用频率为每2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或24周1次。在一些实施方式中，IL-22二聚体施用频率为每1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或12月1次。在一些实施方式中，IL-22二聚体仅施用一次。
在一些实施方式中，IL-22二聚体静脉注射剂量大约至少为10μg/kg、20μg/kg、30μg/kg、40μg/kg或50μg/kg。在一些实施方式中，IL-22二聚体的施用频率不超过每周1次、每月1次、每2月1次或每6月1次。
药盒和药物
本发明还提供了适于任一方法中的药盒或药物、单位剂量和制品。例如，提供了一种药盒，包含了一种IL-22二聚体和采用IL-22二聚体治疗胰腺炎的用法说明。
本发明所述的IL-22二聚体与药学上可接受的赋形剂或载体可制成制剂，用于治疗胰腺炎。
本发明的化合物及其药理上可接受的盐可制成各种制剂，其中包含安全、有效量范围内的本发明IL-22二聚体或其药理上可接受的盐及药理上可以接受的赋形剂或载体。其中“安全、有效量”指的是：化合物的量足以明显改善病情，而不至于产生严重的副作用。化合物的安全、有效量根据治疗对象的年龄、病情、疗程等具体情况来确定。
“药学上可以接受的赋形剂或载体”指的是：一种或多种相容性固体或液体填料或凝胶物质，它们适合于人使用，而且必须有足够的纯度和足够低的毒性。“相容性”在此指的是组合物中各组份能与本发明的化合物以及它们之间相互掺和，而不明显降低化合物的药效。药理上可以接受的赋形剂或载体部分例子有纤维素及其衍生物(如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素钠、纤维素乙酸酯等)、明胶、滑石、固体润滑剂(如硬脂酸、硬脂酸镁)、硫酸钙、植物油(如豆油、芝麻油、花生油、橄榄油等)、多元醇(如丙二醇、甘油、甘露醇、山梨醇等)、乳化剂(如吐温)、润湿剂(如十二烷基硫酸钠)、着色剂、调味剂、稳定剂、抗氧化剂、防腐剂、无热原水等。
施用本发明IL-22二聚体时，可以口服、直肠、肠胃外(静脉内、肌肉内或皮下)、局部给药。
用于口服给药的固体剂型包括胶囊剂、片剂、丸剂、散剂和颗粒剂。在这些固体剂型中，活性化合物与至少一种常规惰性赋形剂(或载体)混合，如柠檬酸钠或磷酸二钙，或与下述成分混合：(a)填料或增容剂，例如，淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和硅酸；(b)粘合剂，例如，羟甲基纤维素、藻酸盐、明胶、聚乙烯基吡咯烷酮、蔗糖和阿拉伯胶；(c)保湿剂，例如，甘油；(d)崩解剂，例如，琼脂、碳酸钙、马铃薯淀粉或木薯淀粉、藻酸、某些复合硅酸盐、和碳酸钠；(e)缓溶剂，例如石蜡；(f)吸收加速剂，例如，季胺化合物；(g)润湿剂，例如鲸蜡醇和单硬脂酸甘油酯；(h)吸附剂，例如，高岭土；和(i)润滑剂，例如，滑石、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、十二烷基硫酸钠，或其混合物。胶囊剂、片剂和丸剂中，剂型也可包含缓冲剂。
固体剂型如片剂、糖丸、胶囊剂、丸剂和颗粒剂可采用包衣和壳材制备，如肠衣和其它本领域公知的材料。它们可包含不透明剂，并且，这种组合物中活性化合物或化合物的释放可以延迟的方式在消化道内的某一部分中释放。可采用的包埋组分的实例是聚合物质和蜡类物质。必要时，活性化合物也可与上述赋形剂中的一种或多种形成微胶囊形式。
用于口服给药的液体剂型包括药学上可接受的乳液、溶液、悬浮液、糖浆或酊剂。除了活性化合物外，液体剂型可包含本领域中常规采用的惰性稀释剂，如水或其它溶剂，增溶剂和乳化剂，例知，乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、丙二醇、1,3-丁二醇、二甲基甲酰胺以及油，特别是棉籽油、花生油、玉米胚油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油或这些物质的混合物等。
除了这些惰性稀释剂外，组合物也可包含助剂，如润湿剂、乳化剂和悬浮剂、甜味剂、矫味剂和香料。
除了活性化合物外，悬浮液可包含悬浮剂，例如，乙氧基化异十八烷醇、聚氧乙烯山梨醇和脱水山梨醇酯、微晶纤维素、甲醇铝和琼脂或这些物质的混合物等。
用于肠胃外注射的组合物可包含生理上可接受的无菌含水或无水溶液、分散液、悬浮液或乳液等液体组合物。适宜的含水和非水载体、稀释剂、溶剂或赋形剂包括水、乙醇、多元醇(如丙二醇、聚乙二醇、甘油等)及其适宜的混合物收载于中国药典及其他各国药典。优选地，所述液体组合物中还含有药学上常用的各种添加剂，只要该添加剂不阻碍IL-22二聚体的功能。代表性的添加剂包括(但不限于)：缓冲剂、PH调节剂等。
用于肠胃外注射的组合物还可包含用于重新溶解成无菌的可注射溶液或分散液的无菌粉末(如冻干粉)。优选地，所述冻干粉针剂还含有药学上常用的各种添加剂，只要该添加剂不阻碍IL-22二聚体的功能。代表性的添加剂包括(但不限于)：缓冲剂、PH调节剂等。优选地，用于溶解冻干粉的溶剂包括(但不限于)葡萄糖水溶液、氯化钠水溶液。
本发明的IL-22二聚体更优选用于静脉内给药，如静脉推注、静脉滴注等。
用于局部给药的本发明IL-22二聚体的剂型包括软膏剂、散剂、贴剂、喷射剂和吸入剂。活性成分在无菌条件下与生理上可接受的载体及任何防腐剂、缓冲剂，或必要时可能需要的推进剂一起混合。
本发明IL-22二聚体可以单独给药，或者与其他药学上可接受的化合物联合给药。
含有本发明的白介素-22二聚体的微胶囊可用于本发明的白介素-22的缓释给药。重组蛋白的微囊缓释给药技术已成功应用于重组人生长激素(rhGH)、重组人干扰素(rhIFN)、白介素-2和MNrgp 120(Johnson等,Nat.Med.,2:795-799(1996);Yasuda,Biomed.Ther27:1221-1223(1993);WO 97/03692,WO 96/40072,WO 96/07399;US 5,654,010)。
本发明的白介素-22二聚体的缓释制剂可用具有良好生物兼容性和宽泛生物可降解性的乳酸羟基乙酸高聚物(PLGA)制备。PLGA的降解产物，乳酸和羟基乙酸可被人体很快清除。而且，该高聚物的降解能力可随其分子量和组成的不同，从几个月延长到几年(Lewis,“Controlled release of bioactive agents form lactide/glycolide polymer,”in:M.Chasin and R.Langer(Eds.),Biodegradable Polymers as Drug Delivery Systems(Marcel Dekker:New York,1990),pp.1-41))。
本发明的药物组合物的剂量和浓度范围可因实际使用情况的不同而变化。本领域的普通技术人员应知如何根据实际需求去选择合适的剂量和给药途径。对于不同种系，例如人和鼠之间药物剂量范围的调整原则，可参见Mordenti,J.和Chappell,W.“The use ofinterspecies scaling in toxicokinetics”In Toxicokinetics and New Drug Development,Yacobi等;Pergamon Press,New York1989,pp.42-96。
本发明也提供在合适的包装中包含本文描述的组合物的制品。用于本文描述的组合物的合适的包装在本领域内是已知的，包括例如：小瓶(如密封小瓶)、容器(如密封容器)、安瓿、瓶、罐、软包装(如，密封的迈拉(Mylar)或塑料袋)、和类似物。可以进一步消毒和/或密封这些制品。也提供包含本文描述的组合物的单位剂型。这些单位剂型可以以单个或多个单位剂量被保存在合适的包装中并且也可以被进一步灭菌和密封。
本发明也提供包含本文描述的组合物(或单位剂型和/或制品)的药盒，并且可以进一步包括使用组合物的方法的说明书，如本文进一步描述的使用。在一些实施方式中，本发明的药盒包括上面描述的包装。在另外的实施方式中，本发明的药盒包括上面描述的包装。它可以进一步包括从商业和使用者的观点而言需要的其他材料，包括另外的缓冲液、稀释剂、过滤器、针、注射器以及带有用于实施本文描述的任何方法的说明书的包装插入物(package inserts)。
本发明的主要优点在于：
1.与IL-22单体相比，在体内IL-22二聚体具有明显优于IL-22单体的生物活性。
2.IL-22二聚体在动物模型中已证实可有效防治胰腺炎；能够显著地降低胰腺炎个体中血清淀粉酶和脂肪酶的含量；在体内能够减轻胰腺水肿，抑制胰腺腺泡细胞和/或脂肪细胞的坏死，减轻制胰腺中炎症细胞的浸润。在等摩尔IL-22分子剂量下，与IL-22单体相比，IL-22二聚体在胰腺炎动物模型中具有更有效的治疗作用。
3.首次意外的发现，静脉注射IL-22二聚体，具有良好的耐受性和安全性；而皮下注射IL-22二聚体，给药部位出现迟发的不良事件。
4.IL-22二聚体在人体内具有显著的生物学活性，能显著提高血清中CRP、SAA水平，降低血清中的TG水平。
5.注射IL-22二聚体后在人体内未引起血清中炎性细胞因子浓度的明显上升。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1 IL-22或IL-22二聚体对Colo205细胞的增殖作用
Colo205细胞培养于RPMI1640 10%FBS培养基中，细胞生长至对数期时，弃上清，加入PBS洗去残留培养基，加入2～5mL0.25%Trypsin-EDTA消化，加入培养基吹打均匀，1500rpm离心5min，收集细胞，然后用基础培养基配制成5.0×105Cell/mL的细胞悬液，于96孔板各孔分别添加100μL/孔，于37℃、5%CO2培养箱中过夜。次日，取出CO2培养箱中的96孔板，于4℃条件下，800rpm离心5分钟，从各孔抽出细胞上清液90μL，并补入90μL0.1%BSA/RPMI1640，加入IL-22二聚体(由二个SEQ ID NO.:4所示单体亚基构成)至终浓度1.4、4.1、12.3、37.0、111.1、333.3、1000、3000ng/mL，加入IL-22(rhIL-22，重组人IL-22)至终浓度0.01、0.04、0.12、0.37、1.1、3.3、10、30ng/mL，于37℃，5%CO2培养箱中培养20hr，收集细胞上清液，采用IL-10ELISA试剂盒(R&D Systems，Cat#S1000B)检测OD值。
结果如图4所示，IL-22二聚体的半数有效浓度(EC50)值为229ng/mL(2675pM)，IL-22的EC50为0.54ng/mL(32.4pM)。在体外活性实验中，IL-22二聚体的生物活性远低于IL-22单体。
实施例2 IL-22或IL-22二聚体对Colo205细胞STAT3的激活作用
Colo205细胞培养于RPMI164010%FBS培养基中，细胞生长至对数期时，弃上清，加入PBS洗去残留培养基，加入2～5mL0.25%Trypsin-EDTA消化，加入培养基吹打均匀，1500rpm离心5min，收集细胞，然后用基础培养基RPMI1640配制成2.0×105Cell/mL的细胞悬液，于96孔板各孔分别添加100μL/孔，于37℃、5%CO2培养6hr，加入不同浓度的rhIL-22或IL-22二聚体(由二个SEQ ID NO.:4所示单体亚基构成)，继续培养1hr，弃上清，在培养板各孔中加入40μL细胞裂解液(Cat No.9803S,Cell Signalling)，离心收集上清，Bradford法测定蛋白质浓度，ELISA法(STAT3[pY705]phosphor ELISA Kit，CatNo.KH00481，Invitrogen)检测pSTAT3水平，检测的pSTAT3浓度除以蛋白浓度即为pSTAT3的含量。
结果如图5所示，IL-22二聚体激活STAT3的半数有效浓度(EC50)值为119.5ng/mL(1394pM,IL-22二聚体按的理论分子量85.7KD计算)，IL-22的EC50为0.14ng/mL(6.9pM，IL-22的分子量按16.7KD计算)。
实施例3 IL-22二聚体在SD大鼠器官组织中的分布
18只SD大鼠，随机分成三组，每组6只(雌雄各半)，尾静脉给予125I-IL-22二聚体(由二个SEQ ID NO.:4所示单体亚基构成)(Iodogen法标记)，剂量为30μg/kg，动物分别于给药后2hr、24hr和48hr处死，取器官组织称重，直接测量放射性计数，计算每克组织中的放射性计数。
结果表明：给药后48小时内，IL-22二聚体可稳定存在于胰腺内。如图6所示，IL-22二聚体给药后24hr、48hr在胰腺中的药物浓度分别下降至2hr的56%、21%。IL-22二聚体给药后24hr、48hr在肝脏中的药物浓度分别下降至2hr的28%、9%。给药后2hr，IL-22二聚体在胰腺中的药物浓度约为肝脏的1/5。
实施例4 IL-22二聚体在食蟹猴器官组织中的分布
食蟹猴3只，雄性，体重4.3-4.6公斤，静脉注射100μg/kg剂量的IL-22二聚体(由二个SEQ ID NO.:4所示单体亚基构成)，给药后2小时处死动物，取器官组织于液氮保存，然后称取组织，加入细胞裂解液裂解，制备组织匀浆液，离心，取上清测定蛋白质含量，并用ELISA法(Human IL-22ELISA Kit，Biolegend，Cat.No434506)检测IL-22二聚体在组织中的药物浓度。
结果表明：IL-22二聚体在动物胰腺中的药物浓度很低(约为0.76ng/mg蛋白)，如图7所示，该浓度远低于IL-22二聚体在肝脏中的浓度(约为在肝脏中浓度的1/5)。
实施例5 IL-22二聚体在健康受试者中安全性试验
方法：
入组健康男性受试者，随机分成6个剂量组，分别为：
安慰剂组(n=8)，单次静脉滴注给予等体积的5%葡萄糖/生理盐水；
IL-22二聚体2.0μg/kg皮下注射组(n=6)(SC组)：单次皮下注射IL-22二聚体2.0μg/kg。
IL-22二聚体2.0μg/kg静脉注射组(n=6)(IV组)：IL-22二聚体溶于100mL5%葡萄糖/生理盐水，剂量为2.0μg/kg，单次静脉滴注。
IL-22二聚体10μg/kg静脉注射组(n=6)(IV组)：IL-22二聚体溶于100mL5%葡萄糖/生理盐水，剂量为10μg/kg，单次静脉滴注。
IL-22二聚体30μg/kg静脉注射组(n=6)(IV组)：IL-22二聚体溶于100mL5%葡萄糖/生理盐水，剂量为30μg/kg，单次静脉滴注。
IL-22二聚体45μg/kg静脉注射组(n=6)(IV组)：IL-22二聚体溶于100mL5%葡萄糖/生理盐水，剂量为45μg/kg，单次静脉滴注。
其中，IL-22二聚体(由二个序列如SEQ ID NO:4所示的单体亚基构成)。
通过体格检查、实验室检查、体重、生命体征、心电图和腹部超声等评价安全性，另外，对血清中的药物浓度和SAA-1、CRP、TG以及血清中的细胞因子等进行检测分析。
结果：
A.不良事件
IL-22二聚体2.0μg/kg皮下注射组共有6例不良事件判定与研究药物相关，分别为注射部位的皮肤干燥(3例)、红斑(2例)和钱币样湿疹；
IL-22二聚体2.0μg/kg静脉注射组未观察到任何不良事件；
IL-22二聚体10μg/kg静脉注射组观察到2例不良事件，畏寒(输液反应)和头痛各1例；
IL-22二聚体30μg/kg静脉注射组观察到6例不良事件，分别是局部皮肤干燥(4例)、过敏性皮炎(1例)和输液反应(1例)；
IL-22二聚体45μg/kg静脉注射组观察到12例不良事件，分别为局部皮肤干燥(6例)、眼痒(3例)、红斑疹(2例)和嗜睡(1例)；
安慰剂组观察到上呼吸道感染、乏力和多汗各1例。
不良事件、体格检查、实验室检查、体重、生命体征、心电图和腹部超声等数据显示最高剂量达到45μg/kg IL-22二聚体单次静脉给药后的安全性良好，未观察到严重不良事件或者危及生命的不良事件。
结果表明，IL-22二聚体通过静脉给药比皮下给药具有更好的安全性和耐受性。
表1 皮下注射IL-22二聚体后给药部位和皮肤的不良事件
B.IL-22二聚体在人体内的药代动力学
分别于给药前、给药后不同的时间点，静脉采血，离心分离血清，低于-70度冻存。采用ELISA法检测血药浓度(Human IL-22ELISA Kit，Biolegend，Cat.No434506)。检测结果采用非房室模型分析药代动力学参数(分析软件：PhoenixTM WinNonlin(PharsightCorporation,Version 6.2.1)))
结果表明，IL-22二聚体在人体内具有非常优异的半衰期，其中45μg/kg剂量组单次给药的半衰期长达206hr，显著优于IL-22单体的半衰期。
表2 药代动力学参数(均值，n=6)
C.IL-22二聚体能够显著提高血清中的SAA、CRP浓度，降低血清中的TG浓度
a．血清淀粉样蛋白(SAA)
采用ELISA法检测血清中SAA-1的浓度(human SAA ELISA kit,Cat No.KHA0011C，Invitrogen)。
结果显示，静脉给予IL-22二聚体能够显著提高人血清中SAA的浓度，具有非常显著的生物活性。如图8A所示，与安慰剂组相比，给予IL-22二聚体12小时后SAA-1浓度显著提高，在给药后15天时45μg/kg剂量组血清中仍然有相当高的SAA浓度。
表3 SAA-1的最大浓度(Cmax)和升高倍数
*数值为安慰剂组的均值
b．C反应蛋白
采用免疫透射比浊法检测C反应蛋白(C reaction protein,CRP)。
结果显示，如图8B所示，与安慰剂组相比，静脉给予IL-22二聚体能够显著提高血清中的C反应蛋白的浓度。
c．甘油三酯
采用自动血生化仪检测给药前后血清中甘油三酯的变化。
结果显示，如图8C所示，与安慰剂组相比，静脉给予IL-22二聚体能够显著降低血清中的甘油三酯浓度，具有明显的剂量效应关系。
d．细胞因子检测
对安慰剂组和IL-22二聚体45μg/kg静脉注射组给药前和给药后24、48hr的血清，采用Proteome Profiler Arrays-Human Cytokine Array Panel A(Cat.No.ARY005，R&D systems)检测多种细胞因子的含量。以50ng/mL PMA(佛波醇酯)处理PBMCs(人外周血单核细胞)24hr后的培养上清作为阳性对照。血清样品的上样量为200μL，检测方法按试剂盒说明书操作。
结果显示，如图8D所示，阳性对照(PBMCs+PMA)的炎性细胞因子如TNFα、IL-6、IL-1β、IL-8等明显提高。与安慰剂组类似，IL-22二聚体45μg/kg静脉注射组给药后24、48hr的血清中，CD54、MIF、Serpin E1、CCL5具有相对较高的浓度，炎性细胞因子如TNFα、IL-6、IL-1β、IL-8的浓度与给药前相比未发生明显变化。结果说明，IL-22二聚体注射后在人体中未引起血清炎性细胞因子浓度的上升。
实施例6 IL-22或IL-22二聚体对胰胆管逆行注射牛磺胆酸钠诱导大鼠急性胰腺炎模型的防治作用
胰胆管内逆行注射牛黄胆酸钠诱导的急性胰腺炎模型，已被广泛应用于临床胆汁返流性胰腺炎的病因及药物治疗疗效的判断。本试验采用0.1mL/100g3.5%牛黄胆酸钠逆行注射胰胆管建立大鼠急性胰腺炎模型。
SD大鼠随机分成3组：
模型对照组(n=6)，于手术前2小时单次静脉注射等体积的溶剂。
IL-22单体组40μg/kg组(n=7)，于手术前2小时单次静脉注射重组人IL-22(rhIL-22)40μg/kg。
IL-22二聚体100μg/kg剂量组(n=7)，于手术前2小时单次静脉注射IL-22二聚体100μg/kg(与IL-22单体40μg/kg组具有等摩尔的IL-22分子剂量)。
IL-22二聚体由二个SEQ ID NO.:4所示单体亚基构成。
实验前动物禁食12h，自由饮水。
手术方法：
用乙醚麻醉后，模型组经腹壁正中切口入腹，寻及十二指肠和胆总管，于肝门下肝管汇合处用显微动脉夹暂时夹闭胆总管，在十二指肠外侧壁选择一无血管区，用规格为0.4的输液针在无血管区穿刺斜行进入胰胆管，而后拔出针头，用PE10管刺入孔内沿十二指肠乳头进入胰胆管，推入8-10mm，固定以防止脱出，缓慢逆行注入3.5%牛黄胆酸钠(0.1mL/100g)，注射完毕后针芯停留8min，移去PE管及显微动脉夹，关闭腹腔。术后自由饮食饮水。在手术结束后12小时，从大鼠眼眶静脉丛取血，分离血清，检测淀粉酶和脂肪酶。
动物于手术后48hr处死，取大鼠胰腺组织，10%的福尔马林溶液固定后，分别于胰头、胰体、胰尾处切片，常规制成3μm的石蜡组织切片，HE染色，在光镜下观察胰腺组织学改变，按Schmidt评分标准从水肿、坏死、出血、炎症细胞浸润等方面进行双盲评分(Schmidt et al.Ann Surg,1992,215(1):44-56)，每只动物分别取胰腺头、体、尾共3张切片进行评分。
结果：
模型组的淀粉酶和脂肪酶水平显著上升，表明成功建立了胰腺炎动物模型。如图9A和图9B所示：与模型组相比，IL-22单体具有降低血清中淀粉酶的趋势，但无显著性差异；IL-22二聚体组能显著降低血清中的淀粉酶水平(P=0.03)。与模型组相比，IL-22单体能显著降低血清中的脂肪酶水平(P=0.03)，IL-22二聚体组能显著降低血清中的脂肪酶水平(P=0.008)。值得注意的是，在等摩尔IL-22分子剂量下，IL-22二聚体对大鼠胰腺炎模型动物具有治疗作用且药效优于IL-22。镜下观察，模型组的胰腺组织可见明显水肿、大量炎性细胞的浸润、局部腺泡细胞和脂肪细胞坏死、少量出血，IL-22二聚体可以明显改善胰腺炎动物的病理组织评分，显示出对胰腺的保护作用，而相同摩尔IL-22分子剂量下，IL-22单体未见对胰腺明显的保护作用。
表4.各组大鼠胰腺组织评分结果
a.与模型组相比，P<0.05;
b.与IL-22单体组相比，P<0.05。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种白介素-22(IL-22)二聚体的用途，其特征在于，用于制备治疗和/或预防胰腺炎的药物。
2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述胰腺炎选自：急性胰腺炎、慢性胰腺炎、酒精引起的胰腺炎、复发性的胰腺炎、胆汁返流性胰腺炎、水肿性胰腺炎、坏死性胰腺炎、内镜逆行胰胆管造影术引起的胰腺炎。
3.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的白介素-22二聚体是式I所示的白介素-22二聚体，
M1-L-M2    式I
式中，
M1是白介素-22的第一单体；
M2是白介素-22的第二单体；
L是位于所述的第一单体和第二单体之间的，将所述第一单体和第二单体连接在一起的接头元件。
4.如权利要求3所述的用途，其特征在于，所述的接头元件L选自下组：
(i)3-50个氨基酸的短肽；
(ii)式II所示的多肽元件：
-Z-Y-Z-    式II
式中，
Y为载体蛋白；
Z为无、或1-30个氨基酸的短肽；
“-”为化学键或共价键。
5.如权利要求4所述的用途，其特征在于，所述的载体蛋白是白蛋白或人IgG的Fc片段。
6.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述二聚体由两个单体亚基构成，每一个所述的单体亚基包含IL-22区域、二聚化区域以及连接所述IL-22区域和二聚化区域的连接序列。
7.如权利要求6所述的用途，其特征在于，所述单体亚基包含一段选自如SEQ IDNO:4和SEQ ID NO:6-8所示的氨基酸序列。
8.如权利要求1-7任一项所述的用途，其特征在于，所述二聚体具有选自下组的一种或多种生物活性：
(a)在体内降低淀粉酶和/或脂肪酶；
(b)在体内减轻胰腺水肿；
(c)在体内抑制胰腺腺泡细胞和/或脂肪细胞的坏死；
(d)在体内减轻制胰腺中炎症细胞的浸润。
9.一种可用于治疗和预防胰腺炎的药物组合物，其特征在于，所述药物含有药学上可接受的载体以及式I所示的白介素-22二聚体，
M1-L-M2    式I
式中，
M1是白介素-22的第一单体；
M2是白介素-22的第二单体；
L是位于所述的第一单体和第二单体之间的，将所述第一单体和第二单体连接在一起的接头元件。
10.一种白介素-22(IL-22)二聚体的用途，其特征在于，
用于制备提高血清中淀粉样蛋白A含量或浓度的药物；
用于制备提高血清中C反应蛋白含量或浓度的药物；和/或
用于制备降低血清中甘油三酯的含量的药物。
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