EA007203B1 - Пептиды, эффективные в лечении опухолей и других заболеваний, требующих удаления или разрушения клеток - Google Patents

Abstract

Данное изобретение посвящено способам лечения заболеваний, требующих удаления или разрушения у пациентов вредных или нежелательных клеток, таких как доброкачественные и злокачественные опухоли, с использованием композиций, содержащих пептиды или основанных на пептидах, включающих часть аминокислотной последовательности белка нервной нити.

Description

Данное изобретение касается способов лечения заболеваний, требующих удаления или разрушения клеточных элементов, таких как доброкачественные и злокачественные опухоли людей, используя соединения, основанные на пептидах, содержащих аминокислотные последовательности, которые являются соответствующими, аналогичными или гомологичными определенной части аминокислотной последовательности белков нервных нитей. Способ включает, без ограничения, введение веществ внутримышечно, орально, внутривенно, спинально, внутрь опухоли, через носовую полость, локально, через кожу и т. д. отдельно или совместно с носителем.

2. Описание прототипов.

Многие способы лечения и процедуры включают удаление или разрушение вредной или нежелательной ткани. Примеры таких способов лечения включают хирургическое удаление злокачественных тканей, разрушение метастатических опухолей путем химиотерапии и уменьшения железистой гиперплазии (например, простаты). Другие примеры включают удаление с лица нежелательных волос, удаление бородавок и удаление нежелательной жировой ткани.

Необходим эффективный агент, который будет разрушать и, следовательно, способствовать удалению вредных или нежелательных клеток и тканей или будет подавлять их дальнейший рост и который, обладая минимальной системной токсичностью или не обладая ею вовсе, будет оказывать только местное влияние.

Класс таких агентов составляют белки нервных нитей и родственные им молекулы. Это показано в патентной заявке с регистрационным номером 10092934, озаглавленной “Способы лечения опухолей и родственных заболеваний, с использованием белков нервных нитей”, полностью включённой сюда в виде ссылки. В патентных заявках США № 10153334, озаглавленной “Пептиды, эффективные в лечении опухолей и других заболеваний, требующих удаления или разрушения клеток”; № 10198334, озаглавленной “Пептиды, эффективные в лечении опухолей и других заболеваний, требующих удаления или разрушения клеток” и № 10198070, озаглавленной “Пептиды, эффективные в лечении опухолей и других заболеваний, требующих удаления или разрушения клеток”; которые полностью включены сюда в виде ссылок, показано, что некоторые фрагменты белков нервных нитей и связанных белков эффективны в лечении опухолей и других заболеваний, требующих удаления или разрушения клеток.

Здесь описаны некоторые другие фрагменты белков нервных нитей, которые также оказались эффективными в лечении опухолей и других заболеваний, требующих удаления или разрушения клеток.

Рак является аномалией внутренних регуляторных механизмов клеток, которая приводит к нерегулируемому росту и размножению клетки. Нормальные клетки образуют ткани, и когда эти клетки теряют способность функционировать в виде специфических регулируемых и координированных единиц (утрата способности к дифференциации), то такой дефект ведет к беспорядку в клеточной популяции. В этом случае образуется опухоль.

Доброкачественные гипертрофии ткани являются такими аномалиями, когда из организма желательно удалить клетки. Доброкачественные опухоли являются пролиферациями, которые не образуют в организме метастазы, однако, вызывают симптомы болезни. Такие опухоли могут быть летальными, если они локализованы в недоступных областях органов, например в мозге. Существуют доброкачественные опухоли таких органов, как легкое, мозг, кожа, гипофиз, щитовидная железа, кора надпочечника и костный мозг, яичник, матка, яичко, соединительная ткань, мышца, кишки, ухо, нос, горло, миндалины, рот, печень, желчный пузырь, поджелудочная железа, предстательная железа, сердце и другие органы.

Хирургическое вмешательство часто является первым шагом при лечении рака. Задачи хирургического вмешательства различны. Иногда оно применяется для удаления по возможности большей части видимой опухоли, или, по крайней мере, уменьшения её размеров (для удаления основной части опухоли таким образом, чтобы отпала необходимость лечения другими способами). В зависимости от типа рака и его местонахождения хирургическое вмешательство также может обеспечивать некоторое симптоматическое облегчение пациенту. Например, если хирург может удалить большую часть растущей опухоли мозга и уменьшить вследствие этого давление внутри черепа, то состояния больного улучшится.

Однако не все опухоли поддаются хирургическому лечению. Некоторые из них могут быть расположены в тех частях тела, откуда полностью удалить их невозможно. В качестве таких примеров могут служить опухоли ствола мозга (часть мозга, которая регулирует дыхание), или же опухоль, которая растет вокруг главного кровеносного сосуда. В таких случаях хирургическое вмешательство ограничено изза большого риска, связанного с удалением опухоли.

В некоторых случаях хирургическое вмешательство с целью уменьшения размера опухоли не применяют, так как в этом нет необходимости. Примером является лимфома Ходжкина, рак лимфатических узлов, который очень хорошо поддаётся комбинированному лечению химиотерапией и радиационной

- 1 007203 терапией. В случае лимфомы Ходжкина хирургическое вмешательство редко применяется для лечения, но почти всегда используется с целью установления диагноза.

Химиотерапия - обычный способ лечения рака. По существу, она включает применение медикаментов (обычно их принимают через рот или путем инъекций), которые специфически атакуют быстро делящиеся клетки (типа тех, которые находятся в опухоли) повсюду в организме. Это делает химиотерапию необходимой для лечения опухолей, которые уже образовали метастазы, а также опухолей, которые способны распространяться через кровь и лимфатические системы, но не выражены вне первичной опухоли. Химиотерапия может также использоваться, чтобы усилить ответную реакцию локализованных опухолей к хирургическому вмешательству и лучевой терапии. Так обстоит дело в случае некоторых раковых образований головы и шеи.

К сожалению, другие клетки человеческого организма, которые обычно тоже быстро делятся (такие как выстилка желудка и волосы) также подвергаются воздействию химиотерапевтических средств. По этой причине многие химиотерапевтические агенты вызывают нежелательные побочные эффекты, такие как тошнота, рвота, анемия, потеря волос и другие признаки. Эти побочные эффекты являются временными, и существуют лекарства, которые ослабляют многие из них. По мере развития наших познаний, исследователи изобрели новые химиотерапевтические агенты, которые не только более успешно уничтожают раковые клетки, но и оказывают меньше побочного влияния на пациента.

Химиотерапевтические средства пациентам дают разными путями. Некоторые из них - пилюли, а некоторые вводят внутривенно или другой инъекцией. При инъекционной химиотерапии пациент посещает кабинет врача или больницу. Другие химиотерапевтические средства требуют непрерывного вливания в кровоток в течение 24 ч в сутки. В таких случаях химиотерапии требуется незначительное хирургическое вмешательство для имплантации маленького насоса, носимого пациентом. После имплантации насос медленно вводит медикамент. Во многих случаях такой постоянный порт помещен в вену пациента, чтобы устранить необходимость повторных уколов.

Лучевая терапия - другое традиционно используемое оружие в борьбе против рака. Радиация уничтожает рак путем разрушения ДНК внутри раковых клеток. Радиация осуществляется различными способами. Наиболее популярный из них предусматривает очень точное направление на пациента луча радиации и его фокусировку на опухоли. При выполнении этой процедуры пациент лежит на столе и луч перемещается вокруг него/неё. Процедура длится в течение нескольких минут, однако, она может быть проделана ежедневно в течение нескольких недель (в зависимости от типа опухоли) с целью достижения общего количества предписанной дозы.

Иногда используется другой радиационный метод, названный брахитерапией, который включает отбор радиоактивных пилюль (зерен) или проволок, и имплантацию их в теле пациента в области опухоли. Имплантанты могут быть временными или постоянными. В случае постоянного имплантанта радиация зерен угасает в течение нескольких дней или недель таким образом, чтобы пациент не был бы радиоактивен. В случае временных имплантантов полную дозу радиации обычно поставляют в течение нескольких дней, и в течение этого времени пациент должен находиться в больнице. В обоих случаях брахитерапии радиация в облучаемой области обычно поставляется очень целенаправленно, чтобы осуществить локальный контроль над раком (в отличие от химиотерапии, когда воздействию препарата подвергается организм в целом).

Некоторые специально отобранные пациенты могут подвергаться трансплантации костного мозга. Эта процедура обычно выполняется в случаях, когда пациент болен раком, который является особенно агрессивным, или вследствие того, что у пациента, подвергнутого обычной терапии, снова наблюдается рецидив рака. Трансплантация костного мозга - сложная процедура. Существуют много типов трансплантации, которые отличаются по способности вызывать побочные эффекты и достигать исцеления. Большинство трансплантаций костного мозга выполнено в специальных центрах, и во многих случаях их осуществление рассматривают как научное достижение.

Существует множество других видов терапии, хотя большинство из них все ещё исследуется в клинических условиях и пока не разрешено в качестве стандартного способа лечения. Такие примеры включают использование иммунотерапии, моноклональных антител, антиангиогенезисных факторов и генную терапию.

Иммунотерапия. Существуют различные методы, которые предназначены помочь иммунной системе пациента бороться с раком и которые весьма отличаются от радиационной терапии или химиотерапии. Часто для достижения цели исследователи вводят пациенту специально разработанную вакцину.

Моноклональные антитела. Эти антитела предназначены для того, чтобы связываться с канцерогенными (но не с нормальными) клетками, используя для этого различия в антигенных и/или других характеристиках между злокачественньми и доброкачественными клетками. Антитела могут быть введены пациенту отдельно или в виде конъюгата с различными цитостатическим соединениями, или в радиоактивной форме, таким образом, чтобы антитело было бы нацелено предпочтительно на злокачественные клетки, поставляя при этом последним токсический агент или радиоактивность.

Антиангиогенезисные факторы. Поскольку раковые клетки быстро делятся и опухоли растут, возможно скорое прекращение их кровоснабжения. Чтобы компенсировать такой процесс, некоторые опу

- 2 007203 холи выделяют вещество, которое, как считают, способствует индуцированию роста кровеносных сосудов в их близости, обеспечивая, таким образом, раковые клетки сосудистым аппаратом для подачи питательных веществ. Поэтому были разработаны методы экспериментальной терапии для прекращения роста таких, питающих опухоли, кровеносных сосудов.

Генная терапия. Рак - результат ряда мутаций, которые в конечном счете ведут к образованию раковой клетки и его чрезмерно быстрой пролиферации. Раковые образования можно лечить, подводя к раковым клеткам гены, которые будут регулировать или прекращать процесс пролиферации рака, включать запрограммированные механизмы клетки для уничтожения раковой клетки, улучшать иммунное распознавание клетки или вызывать экспрессию пролекарства, которое превращается в токсический метаболит или цитокин, подавляющий рост опухоли.

Доброкачественные опухоли и деформации также можно лечить разнообразными методами, включая хирургическое вмешательство, радиотерапию, лекарственную терапию, тепловую или электрическую абляцию, криотерапию и другие. Хотя доброкачественные опухоли не образуют метастазы, они могут стать большими и могут рецидивировать. Хирургическое удаление доброкачественных опухолей связано со всеми трудностями и побочными явлениями, которые вообще характерны для операционного вмешательства и зачастую неоднократно применяется в случае некоторых доброкачественных опухолей, таких как аденомы гипофиза, менингеомы мозга, гиперплазии простаты и других.

Существуют и другие условия, касающиеся нежелательных клеточных элементов, когда желательно селективное удаление клеток. Например, сердечная болезнь и инсульты обычно вызываются атеросклерозом, являющимся пролиферативным повреждением фиброжирных и модифицированных гладких элементов мышцы, которое искажает стенку кровеносного сосуда, сужает просвет, уменьшает поток крови, предрасполагает к образованию фокальных сгустков крови и, в конечном счете, ведёт к блокаде и инфаркту. Различные методы лечения атеросклероза включают шунтирование трансплантатов; искусственные трансплантаты; ангиопластику с реканализацией, кюретаж, радиацию, лазер или другие способы удаления; медикаментозное лечение с целью подавления атеросклероза путем уменьшения липида; различные виды антикоагулянтной терапии; общие критерии диеты, упражнений и образа жизни. Необходим метод для удаления атеросклеротических бляшек без риска и побочных эффектов, характерных для хирургических процедур.

Другие примеры нежелательных клеточных элементов, где желательно селективное удаление клеток, включают рост, индуцируемый вирусами типа бородавок. Ещё одним примером являются гипертрофические воспалительные образования, найденные в воспалённых тканях, а также гипертрофические рубцы или келоиды. Другие примеры можно найти в косметической сфере, в частности при удалении нежелательных волос, например волос на лице, или рубцовом сморщивании нежелательных областей ткани, например кожи лица, соединительных тканей или кожи и соединительной ткани конечностей.

Другие примеры нежелательных клеточных элементов, где желательно селективное удаление клеток или подавление клеточной пролиферации, включают стеноз и рестеноз любой артерии, клапана или канала в циркулирующей системе, включая, без ограничения, клапаны (например, аортальный стеноз, который включает сужение аортального отверстия клапана), коронарные артерии (например, коронарный остиальный склероз, который включает сужение устьев коронарных артерий), сонные артерии и почечные артерии. Другие примеры включают подавление или прекращение нежелательного клеточного роста или накопления нежелательных клеток, обуславливающего частичную или полную закупорку медицинских устройств типа эндопротеза сосудов, помещенного или внедренного в пределах кровеносного сосуда с целью лечения стеноза, структур или аневризм в области или в пределах мочевого тракта и в протоках желчи.

Для специалистов будут очевидны и другие примеры. Во всех или в большинстве этих примеров подчеркнута необходимость в таком лечении, при котором можно удалять или уничтожать нежелательные клеточные элементы без риска и побочных эффектов, которые характерны для обычных методов терапии, а также удалять нежелательные клеточные элементы с большой точностью.

Белки нервных нитей (ΝΤΡ) - семейство недавно описанных белков мозга. Один член этого семейства - ΆΌ7ο-ΝΤΡ - является ассоциированным с мембраной фосфопротеином с молекулярной массой ~41 кД, с функциями, связанными с основным отростком нейрона (Де Ла Монте и другие, 1. С1т. 1пус51. 100:3093-3104 (1997); Де Ла Монте и другие, Α1ζ. Вер., 2:327-332 (1999); Де Ла Монте С.М. и Уандс Дж.Р., 1оитпа1 о£ АПйетет'к ЭЕеаке. 3:345-353 (2001)). Ген, который кодирует ΑΌ7ο-ΝΤΡ и предсказанную последовательность белка для ΑΌ7ο-ΝΤΡ, был идентифицирован и описан (Де Ла Монте и другие, 1. С11п. 1пуе81, 100:3093-3104 (1997)). Кроме разновидности ~41 кД были идентифицированы другие разновидности белка нервной нити (~26 кД, ~21 кД, ~17 кД, и ~15 кД) и связаны с нейроэктодермальными опухолями, астроцитомами и глиобластомами, а также с нарушениями, обусловленными гипоксией, ишемией или мозговым инфарктом (Ксу и другие, Сапсег Векеатей, 53:3823-3829 (1993); Де Ла Монте и другие, 1. №игора1йо1. Ехр. №ито1, 55(10):1038-50 (1996), Де Ла Монте и другие, 1. №ито1. 8οΐ, 138(12):26-35 (1996); Де Ла Монте и другие, 1. №иго1. δοί, 135(2): 118-25 (1996); Де Ла Монте и другие, 1. Сйп. Тпуей., 100:3093-3104 (1997); и Де Ла Монте и другие, Α1ζ.. Вер., 2:327-332 (1999)).

- 3 007203

Разновидности белка нервной нити были описаны и зарегистрированы в патентах США №№ 5948634; 5948888 и 5830670, все под заглавием «Экспрессия гена белка нервной нити и обнаружение заболевания Альзгеймера» и в патенте США № 6071705 под заглавием «Метод обнаружения неврологической болезни или дисфункции». Содержание этих патентов специально включено сюда в полном масштабе в виде ссылок. Согласно их описанию ΝΤΡ - регламентирован и образуется в процессе смерти клетки. Таким образом показано, что мертвые и умирающие нервные клетки перепроизводят ΝΤΡ и, соответственно, присутствие последнего указывает на смерть нервных клеток и начала болезни Альзгеймера (ΑΌ).

Другие разновидности белка нервной нити были идентифицированы в виде других продуктов гена ΑΌ7ε-ΝΤΡ (например, белок, состоящий из 112 белковых аминокислот, описанный в базе данных ΝΟΒΙ Εηίτεζ-Ρτοΐείη. Доступ № ХР_032307 ΡΙΌ §15928971) или в виде продуктов, схожих с белками нервной нити (например, белок, состоящий из 106 белковых аминокислот, описанный в базе данных ΝΟΒΙ ΕηΐτεζΡτοΐθίη. Доступ № ААН14951 ΡΙΌ §15928971, и белок, состоящий из 61 белковой аминокислоты, описанный в базе данных ΝΟΒΙ Εηίτεζ-Ρτοΐείη. Доступ № ААН02534 ΡΙΌ §12803421).

Белок нервной нити связан с ΑΌ, а ΝΤΡ регламентирован гибелью клетки в процессе ΑΌ. По сравнению с контролем ΑΌ7ε-ΝΤΡ ιηΚΝΑ регламентирована в мозге с ΑΌ; уровни белка ΑΌ7ο-ΝΤΡ в мозге и в С8Е выше в ΑΌ, чем в контроле; и иммунореактивность ΑΌ7ο-ΝΤΡ найдена в старческих бляшках, нейрофибриллярных клубках (ΝΕΤ), вырождающихся нейронах, нейропильных нитях и дистрофических невротических отростках при болезни мозга ΑΌ и Синдроме Дауна (Озтурк и другие, Ргос. №111. Αοαά. 8εί. υδΑ, 86:419 423 (1989); Де Ла Монте и другие, 1. С1ш. Ιηνεκΐ., 86(3):1004-13 (1990); Де Ла Монте и другие, 1. №ита1. 8сг, 113(2):152-64 (1992); Де Ла Монте и другие, Αηη. №иго1, 32(6):733-42 (1992); Де Ла Монте и другие, 1. №игора1йо1. Ехр. №иго1., 55(10): 1038-50 (1996), Де Ла Монте и другие, 1. №иго1 8сг, 138(1-2):26-35 (1996); Де Ла Монте и другие, 1. №ито1 8сг, 135(2):118-25 (1996); Де Ла Монте и другие, 1. С1ш. Ιηνεκΐ., 100:3093-3104 (1997); и Де Ла Монте и другие, Α1ζ. Кер., 2:327-332 (1999)). ΝΤΡ локализован внутри клеток, внутри мелких образований в нейропиле или находится во внеклеточном пространстве больного мозга как при ΑΌ, так и при Синдроме Дауна (Де Ла Монте и другие, Αηη. №иго1, 32(6):733-42 (1992)).

Высокие уровни белка ΑΌ7^ΝΤΡ были найдены в С8Е и в моче больных ΑΌ (Де Ла Монте и Уандс, Ετοηΐ Βίοκα 7: 989-96 (2002); Де Ла Монте и Уандс, 1оита1 οί Α1ζ1κίηκί5 Эщеаке 3: 345-353 (2001); Мунзар и другие, Α1ζ1κίηκί5 Керο^ι5 4: 61-65 (2001); Каале и другие, ЫеигоЕду 54: 1498-1504 (2000); Мунзар и другие, Α1ζ1κίηκΓ Керο^ι5 3: 155-159 (2000); Де Ла Монте и другие, Α1ζ1κίηκί5 Керο^ι5 2: 327-332 (1999); и Де Ла Монте и другие, 1. С1т. ^ей. 100:3093-3104(1997).

Было также показано, что сверх-экспрессия ΝΤΡ связана с процессом гибели клетки при болезни Альзгеймера (Де Ла Монте и Уандс, 1. №игора11то1. Ехр. №иго1, 60:195-207 (2001); Де Ла Монте и Уандс, Се11. Μο1. ЫГе 8сг 58: 844-49 (2001). ΑΌ7^ΝΤΡ был также идентифицирован в ткани мозга при Синдроме Дауна (Уандс и другие, международная патентная публикация № АО 90/06993; Де Ла Монте и другие, 1 №иго1 8сг, 135: 118-25 (1996); Де Ла Монте и другие, Α1ζ.. Кер., 2:327-332 (1999)). Существуют данные, что сверх-экспрессия ΝΤΡ может быть также связана с глаукомой нормального напряжения (Голубничая-Лабудова и другие, Сигг Еуе Кек 21: 867-76 (2000)).

ΝΤΡ оказался эффективным агентом для уничтожения клеток в культурах клеток глиомы и нейробластомы ίη νίΐτο, в нормальной ткани мышцы грызуна, подкожной соединительной ткани, дермисе и различных исходных опухолях человека и животных, включая карциному молочной железы, карциному и папиллому кожи, карциному ободочной кишки, глиому мозга и других, в модельных экспериментах с грызунами. См. заявку на патент США № 10/092934 под заглавием “Методы лечения опухолей и родственных заболеваний с использованием белков нервных клеток”.

Оказывается, что некоторые пептидные последовательности, а также фрагменты Αϋ7ο-ΝΤΡ и другие разновидности ΝΤΡ также являются эффективными агентами для уничтожения клеток ίη νίΐτο в глиоме и клеточных культурах нейробластомы и/или ίη νίνο в нормальной ткани мышцы грызуна, подкожной соединительной ткани, коже и другой ткани. См. патентную заявку США № 10/153334 под заглавием “Пептиды, эффективные в лечении опухолей и других заболеваний, требующих удаления или разрушения клеток”; № 10/198069 под заглавием “Пептиды, эффективные в лечении опухолей и других заболеваний, требующих удаления или разрушения клеток” и № 10/198070 под заглавием “Пептиды, эффективные в лечении опухолей и других заболеваний, требующих удаления или разрушения клеток”, каждая из которых полностью включена сюда в виде ссылки.

Все описанные здесь публично доступные документы, включая предшествующее описание прототипов, в том числе и все американские патенты, специально полностью включены в виде ссылок в описание данного изобретения.

Предшествующее описание данного изобретения ни в коем случае не предназначено для признания того факта, что ни один из описанных там документов, включая рассматриваемую патентную заявку США, не является прототипом данного изобретения. Кроме того, указание здесь любых недостатков, связанных с описанными продуктами, способами и/или аппаратурой, не предназначено для ограничения данного изобретение. Действительно, аспекты данного изобретения могут включать некоторые особен

- 4 007203 ности описанных изделий, способов и/или аппаратуры, без ущерба от их недостатков.

Однако все еще существует потребность в разработке новых, менее токсичных способов лечения нежелательных клеточных образований. Данное изобретение удовлетворяет эту потребность.

Резюме изобретения

Это изобретение частично основано на открытии, что пептиды, содержащие аминокислотные последовательности, соответствующие части аминокислотных последовательностей других разновидностей белков нервных нитей, отличных от ΑΌ7ο-ΝΤΡ, эффективны для лечения и/или уничтожения нежелательных клеточных пролифераций. Эти нежелательные клеточные пролиферации включают, среди прочего, доброкачественные и злокачественные опухоли, железистую (например, простаты) гиперплазию, нежелательную волосистость лица, бородавки и нежелательную жировую ткань.

Данное изобретение посвящено методам лечения нежелательных клеточных пролифераций (доброкачественные и злокачественные опухоли, железистая (например, простаты) гиперплазия, нежелательная волосистость лица, бородавки и нежелательная жировая ткань) и включает введение млекопитающему, которому требуется такая терапия, терапевтически эффективного количества пептида, содержащего аминокислотную последовательность (или более чем одну последовательность), соответствующую части аминокислотной последовательности разновидности белка нервной нити (ΝΤΡ), отличной от ΆΌ7ο-ΝΤΡ.

Такой пептид (пептид ΝΤΡ) может быть введен в организм отдельно или в виде конъюгата с носителем или антителом. Пептид ΝΤΡ может быть введен в организм внутримышечно, перорально, внутривенно, интраперитонеально, интрацеребрально (интрапаренхимально), интрацереброваскулярно, внутрь опухоли, через пораженный участок, интрадермально, интратекально, через нос, внутриглазно, внутриартериально, локально, трансдермально, через аэрозоль, вливанием, инъекцией болюса, посредством имплантированного устройства, посредством лекарственной формы с замедленным высвобождением медикамента, и т.д.; препараты могут вводиться отдельно или в виде конъюгата с носителем. Альтернативно, экспрессия пептида ΝΤΡ возможна ίη νΐνο путем управления геном, который обусловливает экспрессию пептида, путем введения в организм вакцины, которая индуцирует образование такого пептида, или путем введения в организм клеток, бактерий или вирусов, которые обусловливают экспрессию пептида ίη νΐνο, или путем генетической модификации или как-либо иначе.

Кроме того, пептид ΝΤΡ может быть использован совместно с другими методами лечения, для лечения доброкачественных и злокачественных опухолей и других видов нежелательного или вредного роста клеток.

Предшествующее общее описание и последующее детальное описание являются иллюстративными и разъяснительными и предназначены для обеспечения более детального объяснения данного изобретения. Другие цели, преимущества и новые особенности будут легко доступны специалистам из последующего детального описания этого изобретения.

Краткое описание фигур

Фиг. 1 показывает полную аминокислотную последовательность белка нервной нити, состоящего из 122 аминокислот (последовательность 40, из патентов США №№ 5830670, 5948634 и 5948888; NСΒI ΕιιΙιτ'/.-Ρΐ’οΐϋίιι Доступ № ААС25447 РЮ д10048540) |8ЕО ГО ΝΟ. 1].

Фиг. 2 показывает полную аминокислотную последовательность белка нервной нити, состоящего из 112 аминокислот (Νί,’ΒΙ ΕηΙΐΌζ-ΡΐΌΐοίη Доступ № ХР_032307 ΡΙΌ д15928971) |8ЕО ΙΌ ΝΟ. 2].

Фиг. 3 показывает полную аминокислотную последовательность белка, аналогичного белку нервной нити и состоящего из 106 аминокислот (Νί,’ΒΙ ΕηΙΐΌζ-ΡΐΌΐοίη Доступ № ААН14951 ΡΙΌ д15928971) |8Εί) ΙΌ ΝΟ. 3].

Фиг. 4 показывает полную аминокислотную последовательность белка нервной нити, состоящего из 98 аминокислот (последовательность 30, из патентов США №№ 5830670, 5948634 и 5948888; Νί,’ΒΙ ΕηΙΐΌζ-ΡΐΌΐοίη доступ № ААЕ25445, ΡΙΌ д10048538) |8ЕО ΙΌ ΝΟ. 4].

Фиг. 5 показывает полную аминокислотную последовательность белка нервной нити, состоящего из 75 аминокислот (последовательность 48, из патентов США №№ 5830670, 5948634 и 5948888; Νί,’ΒΙ ΕηΙΐΌζ-ΡΐΌΐοίη доступ № ААЕ25448, ΡΙΌ д10048541) |8ЕО ΙΌ ΝΟ. 5].

Фиг. 6 показывает полную аминокислотную последовательность белка нервной нити, состоящего из 68 аминокислот (последовательность 36, из патентов США №№ 5830670, 5948634 и 5948888; Νί,’ΒΙ ΕηΙΐΌζ-ΡΐΌΐοίη доступ № ААЕ25446, ΡΙΌ д10048539) |8ЕО ΙΌ ΝΟ. 6].

Фиг. 7 показывает полную аминокислотную последовательность белка, аналогичного белку нервной нити и состоящего из 61 аминокислот (Νί,’ΒΙ ΕηΙΐΌζ-ΡΐΌΐοίη доступ №ААН02534, ΡΙΌ д12803421) |8Εί) ΙΌ ΝΟ. 7].

Детальное описание предпочтительных осуществлений изобретения

Перед тем как описать указанные белки, нуклеотидные последовательности, пептиды, и т.д., а также методы, необходимо принять во внимание, что это изобретение не ограничено конкретной методологией, протоколами, линиями клеток, векторами и описанными реактивами, поскольку они могут измениться. Следует также иметь в виду, что используемая здесь терминология применяется только для описания конкретных осуществлений и не предназначена для ограничения возможностей данного изобретения, которое будет ограничено только в соответствие с прилагаемой формулой изобретения.

- 5 007203

Если не указано иначе, то все используемые здесь термины и фразы даны в соответствии со сформулированным ниже определениями.

Если контекст ясно не диктует иначе, то повсюду в этом описании сингулярные формы включают множественную ссылку. Таким образом, например, ссылка на «клетку-хозяина» включает множество таких клеток-хозяев, и ссылка на «антитело» является ссылкой на одно или более антител и их эквиваленты, известные специалистам, и т.д.

Выражение «ΑΌ7ε-ΝΤΡ» относится к белку ~41 кД, гену и последовательностям нуклеиновых кислот, кодирующих последовательности, описанные в работе Де Ла Монте и других, 1. С11п. ΙηνοδΙ. 100:3093-104 (1997), Последовательности 120 и 121 из патентов США №№ 5948634, 5948888 и 5830670.

Термин «ΝΤΡ» относится к белкам нервной нити и родственным молекулам (включая панкреатический белок нити), отличающимся от ΑΌ7ε-ΝΤΡ, как это описано в патентах США №№ 5948634, 5948888, 5830670 и 6071705, а также в Де Ла Монте и другие, I. №игора(йо1. Ехр. №ито1, 55 (10): 1038-50 (1996), Де Ла Монте и другие, I. №ито1. 8ск, 138(1-2): 26-35 (1996); Де Ла Монте и другие, I. №ито1. δει., 135(2):118-25 (1996), Де Ла Монте и другие, I. С1т. Ιηνεκΐ, 100:3093-3104 (1997), и Де Ла Монте и другие, Α1ζ. Кер., 2:327-332 (1999).

Термин ΝΤΡ без ограничения включает:

(a) ~42, ~26, ~21, ~17, ~14, и ~8 кД разновидности белка нервной нити, как описано в патентах США №№ 5948634, 5948888, 5830670 и 6071705 и в работах Де Ла Монте и другие, I. №итора1йо1. Ехр. №ито1, 55(10):1038-50 (1996), Де Ла Монте и другие, I. №ито1. δει, 138(1-2):26-35 (1996); Де Ла Монте и другие, I. №ито1. δει, 135(2): 118-25 (1996), Де Ла Монте и другие, I. С1т. ПтуеьЬ 100:3093-3104 (1997) и Де Ла Монте и другие, Α1ζ.. Кер., 2:327-332 (1999);

(b) белки, определенно узнаваемые моноклональным антителом № 2, на депозите Американской Коллекции Типов Культур, Мапаккак, Уа., под номером доступа НВ-12546 или моноклональным антителом № 5 на депозите Американской Коллекции Типов Культур, Мапаккак, Уа., под номером доступа НВ12545;

(c) белки, кодированные геном ΑΌ7ε-ΝΤΡ, включая сращённые варианты;

(ά) белок нервной нити, состоящий из 122 аминокислот и описанный последовательностью 40 из патентов США №№ 5830670, 5948634 и 5948888, каталогизированный в NСВI ЕпРта-Рго1еш доступ №ААЕ25447, ΡΙΌ §10048540, аминокислотная последовательность которого показана на фиг. 1 («ΝΤΡ[122]»);

(е) белок нервной нити, состоящий из 112 аминокислот, каталогизированный в ΝΟΒΙ Εηϋΐζ-Ρτοίείη доступ №ХР_032307, РЮ §14725132, аминокислотная последовательность которого показана на фиг. 2 («ΝΤΡ[112]»);

(ί) белок, аналогичный белку нервной нити, состоящий из 106 аминокислот, каталогизированный в NСВI ЕпЦ^-Рто1еш доступ №ААН14951 РЮ §15928971, аминокислотная последовательность которого показана на фиг. 3 («ΝΤΡ[106]»);

(§) белок нервной нити, состоящий из 98 аминокислот, описанный последовательностью 30, из патентов США №№ 5830670, 5948634 и 5948888 и каталогизированный в NСВI ЕпРта-Рго1ет доступ № ААЕ25445, ΡΙΌ §10048538, аминокислотная последовательность которого показана на фиг. 4 («ΝΤΡ[98]»);

(11) белок нервной нити, состоящий из 75 аминокислот и описанный последовательностью 48 из патентов США №№ 5830670, 5948634 и 5948888 и каталогизированный в NСВI Епйта-Рго(еш доступ №ААЕ25448, РЮ §10048541, аминокислотная последовательность которого показана на фиг. 5 («ΝΤΡ[75]»);

(ί) белок нервной нити, состоящий из 68 аминокислот и описанный последовательностью 36 из патентов США №№ 5830670, 5948634, и 5948888 и каталогизированный в ΝΟΒΙ ЕпРта-Рто1ет доступ №ААЕ25446, РЮ §10048539, аминокислотная последовательность которого показана на фиг. 6 («ΝΤΡ[68]»);

(ί) белок, аналогичный белку нервной нити, состоящий из 61 аминокислоты, каталогизированный в NСВI ЕпЦ^-Рго(еш доступ №ААН02534, РЮ §12803421, аминокислотная последовательность которого показана на фиг. 7 («ΝΤΡ[61]»);

(k) панкреатический белок нити;

(l) белок нервной нити (пРТР), описанный в патенте США № 6071705; и (т) белки, определенно узнаваемые антителами, образуемыми гибридомой из группы, состоящей из НВ 9934, НВ 9935 и НВ 9936, которые депонированы Американской Коллекцией Типов Культур.

Если в контексте не указано иначе, то выражение «пептид ΝΤΡ» относится к гомологам, фрагментам, производным, вариантам, конъюгированным белкам, и пептидным имитаторам белков ΝΤΡ.

Выражение «пептид ΝΤΡ» относится к пептидам, включающим аминокислотные последовательности, соответствующие по крайней мере части аминокислотной последовательности ΝΤΡ, разновидностей ΝΤΡ или фрагментов разновидностей ΝΤΡ и включает гомологи, фрагменты, производные, варианты, конъюгированные белки и пептидные имитаторы таких пептидов, если из контекста не следует другое.

Термин «фрагмент» относится к белку или полипептиду, который состоит из непрерывной подпос

- 6 007203 ледовательности аминокислотной последовательности ΝΤΡ белка или ΝΤΡ пептида и включает распространенные в природе фрагменты, такие как сплетенные варианты и фрагменты, образовавшиеся в результате деятельности, встречающейся в природе ίη νΐνο протеазы. Такой фрагмент может быть отрезан с аминного конца, с карбоксильного конца и/или от средней части (как, например, при природном сращивании). Такие фрагменты можно получить из метионина в качестве терминальной аминогруппы, или же без него. Термин «фрагмент» включает фрагменты, которые идентичны или отличаются от того же самого белка ΝΤΡ или пептида ΝΤΡ с обычной или необычной соприкасающейся аминокислотной последовательностью и соединены друг с другом непосредственно или через линкер.

Термин «вариант» относится к белку или полипептиду, который, в отличие от аминокислотной последовательности белка ΝΤΡ или пептида ΝΤΡ, содержит один или более аминокислотных заместителей, делеций и/или инсерций и включает встречающиеся в природе аллельные варианты или альтернативные сплетенные варианты белка ΝΤΡ или пептида ΝΤΡ. Термин «вариант» включает замещение одной или более аминокислот в последовательности пептида подобной или гомологичной аминокислотой (аминокислотами) или неподобной аминокислотой (аминокислотами). Существует много параметров, по которым аминокислоты могут оцениваться как подобные или гомологичные. (Гуннар фон Хейджен, Анализ последовательности в молекулярной биологии, стр. 123-39 (Асабетю Ρ^е88, Нью-Йорк, ΝΥ 1987).

Предпочтительные варианты включают аланиновые замещения в одной или более аминокислотных позиций. Другие предпочтительные замены включают консервативные замещения, в результате которых незначительно меняется или не меняется общий результирующий заряд, полярность или гидрофобность белка. Консервативные замещения приведены ниже в табл. 2.

Таблица 2 Консервативные Аминокислотные Замещения

Основные: аргинин лизин гистидин

Кислотные: глутаминовая кислота аспарагиновая кислота

Незаряженные полярные: глутамин аспарагин серин треонин тирозин

Неполярные: фенилаланин триптофан цистеин глицин аланин валин пролин метионин лейцин изолейцин

В табл. 3 представлена другая схема аминокислотного замещения.

- 7 007203

Таблица 3

Исходный

Остаток

А1а

Агд

Азп

Азр

Суз

С1п

О1и

О1у

ΗΪ8

Не;

Ьеи

Ьуз

Ме1 РЬе 8ег Тйг

Тгр туг

Уа1

Замещения §1у; зет

1уз §1п; Ыз д1и зег азп азр а1а; рго азп; §1п 1еи; уа1 йе; уа1 агд; д1п; д1и 1еи; Туг; йе те!; 1еи; Тут Й1Г зег

Туг 1гр; рЬе йе; 1еи

Другие варианты могут состоять из менее консервативных аминокислотных замещений типа селекции остатков, которые существенно отличаются по их эффекту сохранять: (а) структуру основной цепи полипептида в области замещения, например, в виде плоской или спиральной конформации, (Ь) заряд или гидрофобность молекулы на целевом участке или (с) большую часть боковой цепи. Предполагают, что замены, в основном оказывающие наиболее существенное влияние на функцию - это такие замещения, в которых: (а) глицин и/или пролин замещается другой аминокислотой, или удаляется, или включается; (Ь) гидрофильный остаток, например, серил или треонил, заменяется (или замещается) гидрофобным остатком, например, лейцилом, изолейцилом, фенилаланилом, валилом или аланилом; (с) остаток цистеина заменяется (или замещается) любым другим остатком; (й) остаток, имеющий электроположительную боковую цепь, например, лизил, аргинил или гистидил заменяется (или замещается) остатком, имеющим электроотрицательный заряд, например, глутамилом или аспартилом; или (е) остаток, имеющий большую боковую цепь, например, фенилаланин, заменяется (или замещается) не обладающим такой боковой цепью остатком, например, глицином. Другие варианты включают те, которые разработаны для образования нового участка (новых участков) гликозилирования и/или фосфорилирования, или те, которые разработаны для удаления существующего участка (существующих участков) гликозилирования и/или фосфорилирования. Варианты включают по крайней мере одно аминокислотное замещение на участке гликозилирования, на участке протеолитического расщепления и/или в остатке цистеина. Варианты также включают белки ΝΤΡ и пептиды ΝΤΡ, которые имеют дополнительные аминокислотные остатки в начале или в конце белка ΝΤΡ или аминокислотной последовательности пептида ΝΤΡ на пептидах линкера. Например, остаток цистеина можно добавить как к аминному концу, так и к карбоксильному концу пептида ΝΤΡ, чтобы осуществить циклизацию этого пептида путем образования дисульфидной связи. Термин «вариант» также охватывает полипептиды, которые имеют аминокислотную последовательность пептида ΝΤΡ по крайней мере с 1-25 или более дополнительными аминокислотами, фланкирующими с 3' или 5' концами пептида ΝΤΡ.

Термин «производная» относится к химически модифицированному белку или полипептиду, который был модифицирован химически или в результате естественных процессов, таких как процессинг и другие пост-трансляционные модификации, а также и химическими методами модификации, как, например, присоединением одной или более молекул полиэтиленгликоля, сахаров, фосфатов, и/или других таких молекул, где молекула или молекулы присоединены к белкам ΝΤΡ или пептидам ΝΤΡ дикого типа не естественным образом. Производные включают соли. Такие химические модификации описаны в традиционной литературе, в более детальных монографиях, а также в обширной исследовательской литературе и хорошо известны специалистам. Следует учитывать, что тот же самый тип модификации в той или иной степени может присутствовать на нескольких участках данного белка или полипептида. Данный белок или полипептид может также содержать много типов модификаций. В белке или полипептиде модификации могут произойти везде, включая основную цепь пептида, боковые аминокислотные цепи, а также аминные и карбоксильные концы. Модификации включают, например, ацетилирование, ацилиро

- 8 007203 вание, АЭР-рибозилирование, амидирование, ковалентное присоединение флавина, ковалентное присоединение группы гема, ковалентное присоединение нуклеотида или нуклеотидного производного, ковалентное присоединение липида или липидного производного, ковалентное присоединение фосфатидилинозитола, сшивание, циклизацию, образование дисульфидной связи, деметилирование, образование ковалентных сшивок, образование цистеина, образование пироглутамата, формилирование, гаммакарбоксилирование, гликозилирование, образование СР1 анкера, гидроксилирование, йодирование, метилирование, миристилирование, окисление, протеолитическое превращение, фосфорилирование, пренилирование, рацемизацию, гликозилирование, присоединение липида, сульфирование, гаммакарбоксилирование остатков глутаминовой кислоты, гидроксилирование и ΆΌΡ-рибозилирование, селенирование, сульфирование, катализируемое транспортной РНК присоединение аминокислот к белкам, например аргинилирование и непредсказуемое присоединение аминокислот. См., например, “Белки, структура и молекулярные свойства”, 2-е изд., ред. Т.Е. Крейтон, В.Г. Фримэн и компания, Нью-Йорк (1993), и Уолд, Ф., «Модификации пост-трансплантационных Белков: достижения и перспективы», стр. 1-12 в сб. Пост-трансплантационные ковалентные модификации белков» ред. Б.К. Джонсон, Асайет1с Ргезз, Нью-Йорк (1983); Сейфтер и другие., Ме1й. Епхуто1. 182:626-646 (1990), и Раттан и другие, «Синтез белка: пост-трансплантационные модификации и старение», Апп. Ν.Υ. Асаб. 8с1. 663: 48-62 (1992). Термин «производные» включает химические модификации, в результате которых образуется разветвленный, или циклический неразветвленный или разветвленный белок или полипептид. Циклические, разветвленные или разветвленно-циклические белки или полипептиды могут образоваться в результате естественных пост-трансляционных процессов и могут быть получены также исключительно синтетическими методами.

Термин «гомолог» относится к белку, который является по крайней мере на 60% идентичным по его аминокислотной последовательности белку ΝΤΡ или пептиду ΝΤΡ, в зависимости от обстоятельств, обусловленных стандартными методами, которые обычно используются для установления идентичности расположения аминокислот в двух полипептидах. Степень подобия или идентичности между двумя белками может быть легко рассчитана известными методами, включая, без ограничения, описанные в следующих трудах: Вычислительная молекулярная биология, ред. Леск А.М., ОхГогй ИшуегШу Ргезз, НьюЙорк, 1988; Биовычисление: информатика и проекты генома, ред. Смит Д.У., Асайепис Ргезз, Нью-Йорк, 1993; Компьютерный анализ данных последовательности, часть I, ред. Гриффин А.М. и Гриффин Г. Дж. Нитапа Ргезз, Нью-Джерси, 1994; Анализ последовательности в молекулярной биологии, Фон Гейндж, Г., Асайепис Ргезз, 1987; Анализ последовательности праймера, ред. Грибсков М. и Деверо Дж., М. 81оск1оп Рге55. Нью-Йорк, 1991; и Карилло Г. и Липман Д., 81АМ, 1. АррИей Ма1й., 48:1073 (1988). Разработаны предпочтительные методы для определения идентичности, с целью выявления максимального сходства между исследуемыми последовательностями. Эти методы определения идентичности и подобия запрограммированы в общественно доступных компьютерных программах.

Предпочтительные компьютерные программные методы, пригодные для определения идентичности и подобия между двумя последовательностями, включают, без ограничения, пакет программы ССС (Деверо Дж. и другие, ΝικΚίπ Ас1йз Везеагсй, 12 (1): 387 (1984)), ВЬА8ТР, ВБ-АЗТИ и ЕА8ТА, Алтшуль С.Ф. и другие, 1. Мо1ес. Вю1. 215: 403-410 (1990). Программа ВБА8Т X публично доступна из NСВI и других источников (руководство по ВЬА8Т, Алтшуль С. и другие, NСВI ЖМ ΝΙΗ ВеШезйа, Мй. 20894; Алтшуль С. и другие, 1. Мо1. Вю1. 215: 403-410 (1990). Посредством примера, используя компьютерный алгоритм типа САР (Компьютерная группа по генетике, Висконсинский университет, Мэдисон, Висконсин), два белка или полипептида, для которых должен быть определён процент идентичности последовательности, были выровнены для оптимального соответствия их соответствующих аминокислот (для выявления «согласованного промежутка», как это определяется алгоритмом).

Пенальти промежутка интервала (который рассчитывают как 3 умноженное на среднюю диагональ; «средняя диагональ» является средним значением диагонали используемой матрицы сравнения; «диагональ» - это показатель или число, заданное для каждой истинной аминокислоты специфической матрицей сравнения) и пенальти расширения промежутка (который обычно является 1/10 частью пенальти промежутка интервала), так же как и матрица сравнения типа РАМ 250 или ВБОЗИМ 62, используются вместе с алгоритмом. С алгоритмом может использоваться также и стандартная матрица сравнения (для матрицы сравнения РАМ250 см. Дейхоф и др., в сб.: Атлас последовательности и структуры белка, т. 5, 8ирр.3 [1978]; для матрицы сравнения ВБО8ИМ 62 см. Хеникофф и другие., Ргос. №11. Асай. 8ск И8А, 89:10915-10919 [1992]). В этом случае процент идентичности рассчитывают по алгоритму. По сравнению с белком ΝΊΈ или пептидом ΝΊΈ гомологи в зависимости от обстоятельств обычно будут иметь одно или более аминокислотных замещений, удалений и/или включений.

Термин слившийся белок относится к белку, где один или более пептидов ΝΊΈ рекомбинантно соединены или химически конъюгированы (ковалентно и нековалентно) с белком типа (но без ограничения) антитела, или фрагмента антитела типа Р_аЬ фрагмента, или короткой цепи Εν. Термин слившийся белок относится также к мультимерам (т.е. димерам, тримерам, тетрамерам и высшим мультимерам) пептидов ΝΊΓ. Такие мультимеры включают гомомерные мультимеры, содержащие один пептид ΝΊΓ, гетеромерные мультимеры, содержащие больше чем один пептид №ТР, и гетеромерные мультимеры,

- 9 007203 содержащие по крайней мере один пептид ΝΤΡ и по крайней мере один другой белок. Такие мультимеры могут образоваться в результате формирования гидрофобных, гидрофильных, ионных и/или ковалентных ассоциаций, звеньев или связей, они также могут образовываться межмолекулярными связями, с использованием молекулы линкера, или могут быть связаны косвенно, например, через формирование липосомы.

Термин «имитатор пептида» или «имитатор» относится к биологически активным соединениям, которые подражают биологической деятельности пептида или белка, но по химический природе они больше не являются пептидами, то есть они больше не содержат никакие пептидные связи (т.е. амидные связи между аминокислотами). Здесь термин «имитатор пептида» используется в более широком смысле и включает молекулы, которые по своей химической природе больше не являются типичными пептидами, такие как псевдопептиды, полупептиды и пептоиды. Примеры имитаторов пептидов в таком более широком смысле (где часть пептида замещена структурой, не содержащей пептидные связи) описаны ниже. Молекулы, полностью или частично лишённые химической природы пептида, имитаторы пептида согласно этому изобретению обеспечивают пространственную расстановку реагирующих химических компонентов, которая очень походит на пространственную расстановку активных групп в пептиде ΝΤΡ, которые являются основой для имитатора пептида. В результате этой геометрии с подобным активным участком имитатор пептида проявляет относительно биологических систем такие эффекты, которые являются подобными биологической деятельности пептида ΝΤΡ.

Имитаторы пептида, описанные в данном изобретении, существенно подобны как по своей пространственной форме, так и по биологической активности описанным здесь пептидам ΝΤΡ. Примеры методов структурной модификации известного в науке пептида с целью создания имитатора пептида включают инверсию хиральных центров основной цепи, ведущих к структурам Ό-аминокислотных остатков, которые могут, в особенности на Ν-конце, привести к увеличению стабильности относительно протеолитической деградации, не оказывая при этом отрицательного влияния на активность. Пример этого дается в статье «Т-связывание тритилированного Ό-ала¹ - пептида», Смита К.С, и др., Эгид Осус1оршсп1 Кек., 15, стр. 371-379 (1988). Вторым методом является изменение циклической структуры для увеличения стабильности, например, образование межмолекулярной Ν-С связи в имидах и лактамах (Эде и др. в сб. «Пептиды: химия и биология», ред. Смит и Ривиер. Ексот, Лейден (1991), стр 268-270). Пример этого дается в конформационно-ограниченных соединениях, подобных тимопентину, таких, которые описаны в патенте США № 4457489 (1985), выданном на имя Гольдшейна Дж. и др. и включённом сюда в виде ссылки. Третий метод заключается в замещении пептидных связей псевдопептидными связями в пептиде ΝΤΡ, что ведет к повышению протеолитической стабильности. Было описано множество псевдопептидных связей, которые вообще не влияют на структуру пептида и его биологическую активность. Одним из таких примеров является замещение ретроинверсо-псевдопептидных связей («Биологически активные ретроинверсо-аналоги тимопентина», Систо А. и др. в сб. «Пептиды, химия, структура и биология», ред. Ривиер Дж.Е. и Маршалл Г.Р. Ексот, Лейден (1990), стр. 722-773), и Дальпоззо и др. (1993), Ιηΐ. 1. Рерййе РгоЮю Кек., 41:561-566, которые включены сюда в виде ссылок). Согласно этой модификации, аминокислотные последовательности пептидов могут быть идентичны последовательности описанного выше пептида ΝΤΡ, за исключением того, что один или более пептидных связей замещены ретроинверсо-псевдопептидной связью. Предпочтительно большинство Ν-терминальных пептидных связей замещены, так как в результате такого замещения увеличивается устойчивость к протеолизу, который катализируется экзопептидазами, влияющими на Ν-терминал. Дальнейшие модификации также могут быть получены путем замещения химических групп аминокислот другими химическими группами аналогичной структуры.

Другая подходящая псевдопептидная связь, которая увеличивает стабильность к ферментному расщеплению, не влияя на биологическую активность или незначительно уменьшая ее, это - восстановленная изостерическая псевдопептидная связь (Коудер и др. (1993), Ιηΐ. ΐ. Рерййе Рго1ет Кек., 41:181-184, полностью включенный здесь в виде ссылки).

Таким образом, аминокислотные последовательности этих пептидов могут быть идентичны последовательности пептида ΝΤΡ, за исключением того, что одна или более пептидных связей замещены изостерической псевдопептидной связью. Предпочтительно большинство Ν-концевых пептидных связей замещено, так как в результате такого замещения увеличивается устойчивость к протеолизу, который катализируется экзопептидазами, влияющими на Ν-терминал. Синтез пептидов с одной или более восстановленной изостерической псевдопептидной связью известен в науке (Коудер и др. (1993), процитированный выше). Другие примеры включают использование кетометиленовой или метилсульфидной связей для замещения пептидных связей.

Пептоидные производные пептидов ΝΤΡ представляют другой класс имитаторов пептидов, которые сохраняют важные структурные детерминанты для биологической активности, хотя и не содержат пептидных связей, что придает им устойчивость к протеолизу (Саймон и др., 1992, Ргос. Ναΐΐ. Асай. 8с1. И8А, 89:9367-9371, полностью включенный здесь в виде ссылки). Пептоиды - это олигомеры Νзамещенных глицинов. Описано множество Ν-алкильных групп, каждая из которых соответствует боковой цепи природной аминокислоты (Саймон и др. (1992), процитировано выше). Некоторые или все ами

- 10 007203 нокислоты пептидов ΝΤΡ могут быть замещены Ν-замещенным глицином, соответствующим замещенной аминокислоте.

Термин «имитатор пептида» или «имитатор» включает также реверсные-Ό пептиды и энантиомеры, как это определено ниже.

Термин «реверсный-Ό пептид» относится к биологически активному белку или пептиду, состоящему из Ό-аминокислот, расположенных в обратном порядке по сравнению с последовательностью Баминокислотного пептида ΝΤΡ. Таким образом, карбокси-терминальный остаток Б-аминокислоты пептида ΝΤΡ для Ό-аминокислотного пептида становится амино-терминалом и т.д. Например, пептид ΝΤΡ, ΕΤΕ8Η, становится Η_ά8^ΕφΓ_άΕ_ά, где Е_а, Н_а, 8_а и Τ_ά являются Ό-аминокислотами, соответствующими Баминокислотам, Ε, Н, 8 и Τ соответственно.

Термин «энантиомер» относится к биологически активному белку или пептиду, в котором один или больше Б-аминокислотных остатков в аминокислотной последовательности пептида ΝΤΡ заменены соответствующим^) О-аминокислотным(и) остатком (остатками).

Используемый здесь термин «композиция» определенно относится к любой композиции, содержащей указанный пептид или аминокислотную последовательность. Композиция может состоять из сухой смеси, водного раствора, или стерильной смеси. Композиции, включающие пептиды ΝΤΡ могут использоваться в качестве зондов для гибридизации. Зонды могут храниться в высушенной замораживанием форме и могут быть связаны со стабилизирующим агентом типа углевода. При гибридизации зонды можно использовать в виде водного раствора, содержащего соли, например №С1, детергенты, например додецилсульфат натрия (8Ό8), и другие компоненты, например раствор Денхардта, сухое молоко, ДНК спермы лосося и т.д.

Аминокислоты и аминокислотные остатки, описанные здесь, могут быть перечислены согласно принятому коду одной или тремя буквами, приведенными в таблице ниже. Если не определено иначе, эти аминокислоты или остатки имеют естественно распространенную Б стереоизомерную форму.

Таблица 1

Аминокислота	Однобуквенный код	Трёхбуквенный код
Аланин	А	А1а
Аргинин	К	Аг§
Аспарагин	N	Азп
Аспарагиновая кислота	ϋ	Азр
Цистеин	С	Суз
Глутамин	6	Спп
Г лутаминовая кислота	Е	С1и
Глицин	С	С1у
Гистидин	Н	ΗΪ8
Изолейцин	I	Не
Лейцин	Б	Беи
Лизин	К	Туз
Метионин	м	Ме!
Фенилаланин	г	Рйе
Пролин	Р	Рго
Серин	8	8ег
Треонин	т	Тйг
Триптофан		Тгр
Тирозин	Υ	Туг
Валин	V	Уа1

Как определено в этом описании выше, объектом данного изобретения является композиция, включающая пептиды ΝΤΡ.

Предпочтительный пептид ΝΤΡ получен из аминокислотной последовательности, состоящей из последовательности 122 аминокислот ΝΤΡ, показанной на фиг. 1 (ΝΤΡ [122]), или состоящей из последовательности 112 аминокислот ΝΤΡ, показанной на фиг. 2 (ΝΤΡ [112]). Однако использование других пептидов ΝΤΡ, основанных на частях или фрагментах других молекул того же самого семейства, как ΝΤΡ [122] или ΝΤΡ [112] типа других белков нервных нитей или типа любого из показанных на фиг. 3-7 и типа белков панкреатических нитей, также затронуто в данном изобретении. Кроме того, изобретение включает другие белки, которые содержат пептид ΝΤΡ целиком или только его часть, посредством чего

- 11 007203 белки предпочтительно обладают той же самой, аналогичной или более высокой биологической активностью, что и пептид ΝΤΡ.

В широком разнообразии человеческих и нечеловеческих белков («родственные белки») тоже найдены пептидные последовательности и фрагменты ΆΌ7ο-ΝΤΡ и других видов ΝΤΡ, а также подобные варианты и гомологи. В частности, ген ΆΌ7ο-ΝΤΡ содержит последовательности А1и-типа, которые являются весьма подобными последовательностям, найденным в других генах человека и других геномах приматов.

Поэтому разумно ожидать, что некоторые, если не все, из пептидов ΝΤΡ, также окажутся эффективными агентами для уничтожения клеток, так как они содержат последовательности пептида, которые являются гомологами или подобными пептидным последовательностям ΑΌ7ο-ΝΤΡ и других видов ΝΤΡ. Следовательно, квалифицированный специалист может синтезировать специфические белки, основываясь на аминокислотной последовательности для любого пептида ΝΤΡ, способного быть эффективным агентом для уничтожения клеток и соответствующим образом проверить их эффективность.

Из пептида ΝΤΡ, являющегося эффективным агентом для уничтожения клеток, можно получить другие пептидные последовательности, обладающие аналогичной физиологической активностью. Специалист в данной области без излишнего экспериментирования сможет синтезировать фрагменты эффективного пептида ΝΤΡ, охватывающие полную аминокислотную последовательность этого белка для идентификации других эффективных пептидных последовательностей.

Пептиды ΝΤΡ этого изобретения, содержащие аминокислотные последовательности, соответствующие части аминокислотной последовательности для ΝΤΡ [122], без ограничения, включают следующее:

Пептид ΝΤΡ[122] №1 [8Е(} ГО N0 8], ΝΤΡ[122] ρΐ06-122

1ОР<2УЬ8К.1КЕЕ1ККСЕ

Пе-А8р-С1п-О1п-Уа1-Ееи-8ег-Аг§-11е-Еу8-Ееи-Сг1и-11е-Еу5-Аг§-Су8-Ееи

Пептид ΝΤΡ[122] №2 [8Е<2 ГО ΝΟ 9], ΝΤΡ[122] ρΐ-15

ΜΜνοψΝΚΓσκχννΥΕί

Ме1-Ме1-Уа1-Суз-Тгр-Азп-Аг§-РЬе-Сг1у-Еу8-Тгр-Уа1-Туг-Р11е-11е

Пептид ΝΤΡ[122] №3 [8Е(} ГО N0 10], ΝΤΡ[122] ρΐ 6-30 δΑΙΡΝΡΘΡΚΥΕΥΗΟν

8ег-А1а-11е-РЬе-А8п-Рйе-Сг1у-Рго-Аг§-Туг-Ееи-Туг-Н18-О1у-Уа1

Пептид ΝΤΡ[122] №4 [8Е(} ГО N0 11],ΝΤΡ[122] р31-45

РРУРЬ1ЬУК118РЫ

Рго-РЬе-Туг-Р11е-Ееи-11е-Ееи-Уа1-Аг§-11е-11е-8ег-Р11е-Ееи-11е

Пептид ΝΤΡ[122] №5 [8Е(^ ГО N0 12], ΝΤΡ[122] р46-60 σϋΜΕϋνΕΕΝεΤΕΕΚΚ

С1у-А8р-Ме1-О1и-А8р-Уа1-Ееи-Ееи-А8п-Су8-ТЪг-Ееи-Ееи-Еу8-Аг§

Пептид ΝΤΡ[122] №6 [8Е<3 ГО N0 13], ΝΤΡ[122] р60-75

88КРКРХУСАЬУС8МО

8ег-8ег-Аг§-РЬе-Аг§-Р11е-Тгр-Сг1у-А1а-Ееи-Уа1-Су8-8ег-Ме1-А8р

Пептид ΝΤΡ[122] №7 [8Е</ ГО N0 14], ΝΤΡ[122] р76-90

8СКР8КУАУТУК.Р1Т

8ег-Суз-Аг§-Р11е-8ег-Аг§-Уа1-А1а-Уа1-Тйг-Туг-Аг§-РЪе-11е-Т11г

Пептид ΝΤΡ[122] №8 [8Ер ГО N0 15], ΝΤΡ[122] р91-105

ЕЬМРЗРАУХУМАКЫТ

Ееи-Ееи-А8п-11е-Рго-8ег-Рго-А1а-Уа1-Тгр-Ме1-А1а-Аг§-А8п-Т11г

- 12 007203

Пептиды ΝΤΡ этого изобретения, содержащие аминокислотные последовательности, соответствующие части аминокислотной последовательности для ΝΤΡ [112], без ограничения, включают следующее:

Пептид ΝΤΡ[112] №1 [8ЕС2 ГО N0 16], ΝΤΡ[112] р1-15

МА(}8КЕТАТ8А81<Ур

Ме1-А1а-Сг1п-8ег-Аг§-Ьеи-Т11г-А1а-Т11е-8ег-А1а-8ег-Аг§-Уа1-С1п

Пептид ΝΤΡ[ 112] №2 [8Е(^ ГО N0 17], ΝΤΡ[112] р16-30

АШ^РРКрЬСГОКА

А1а-Пе-Ьеи-Ееи-8ег-С1п-Рго-Рго-Ьу5-Сг1п-Ееи-Сг1у-Ьеи-Аг§-А1а

Пептид ΝΤΡ[112] №3 [8Е<2 ГО N0 18],ΝΤΡ[112] р31-45

ΡΑΝΤΡΕΙΓνΓδΕΕΑσ

Рго-А1а-Азп-Т11г-Рго-Ееи-11е-Р11е-Уа1-Р11е-8ег-Ееи-О1и-А1а-С1у

Пептид ΝΤΡ[112] №4 [8Е(^ ГО N0 19],ΝΤΡ[112] р46-60

ЕННГОрАСЕКЬЕТЗО

Рйе-Н1з-Н18-11е-Су5-С1п-А1а-(31у-Ееи-Еу8-Ееи-Ееи-Т11г-8ег-С}1у

Пептид ΝΤΡ[112] №5 [8Е0 ГО N0 20], ΝΤΡ[112] рб 1 -75 ϋΡΡΑ8ΑΕζ>8ΑΟΙΤθν

Азр-Рго-Рго-А1а-8ег-А1а-РЬе-(л1п-8ег-А1а-(л1у-11е-Т11г-01у-Уа1

Пептид ΝΤΡ[112] №6 [8Е<2 ГО ΝΟ 21], ΝΤΡ[112] р76-90 δΗΕΤζΙΡΑΝΕϋΚΚίεδ

8ег-Н18-Ееи-Т11г-Сг1п-Рго-А1а-А8п-Ееи-А8р-Еу8-Еу8-11е-Су8-8ег

Пептид ΝΤΡ[112] №7 [8Е(^ ГО N0 22], ΝΤΡ[112] р91 -112

ΝσΠδΟΥνΑρΑΟΕΚΕΕΑδΟΝΡδΚ Азп-О1у-Сг1у-8ег-Су8-Туг-Уа1-А1а-Сг1п-А1а-Сг1у-Ееи-Еу8-Ееи-Ееи-А1а-8егСу8-Азп-Рго-8ег-Еу₈

Пептиды ΝΤΡ этого изобретения, содержащие аминокислотные последовательности, соответствующие части аминокислотной последовательности, состоящей из 106 аминокислот ΝΤΡ, описанной на фиг. 3 (ΝΤΡ[106]), без ограничения, включают следующее:

- 13 007203

Пептид ΝΤΡ[106] №1 [8Ер ГО N0 23], ΝΤΡ[106] ρΐ-ΐ5

МА¥ТЕК88ЬУЕЕЕСЕТ

Ме1-Тгр-Т11г-Ееи-Еу8-8ег-8ег-Ееи-Уа1-Ееи-Ееи-Ееи-Су8-Ееи-ТЪт

Пептид ΝΤΡ[106] №2 [8Еф ГО N0 24], ΝΤΡ[106] р 16-30

С8УАРМР88ЬКрКТ8

Суз-8ег-Туг-А1а-Р11е-Ме1-Р11е-8ег-8ег-Ееи-Аг§-С1п-Еу8-ТЬг-8ег

Пептид ΝΤΡ[106] №3 [8Е<2 ГО N0 25], ΝΤΡ[106] р31-45

ΕΡφΘΚνΡΟΘΕΗΡΚΙΚ

С1и-Рго-01п-С1у-Еу8-Уа1-Рго-Суз-С1у-Сг1и-Н18-РЬе-Аг§-Пе-Аг§

Пептид ΝΤΡ[106] №4 [8Еф ГО N0 26], ΝΤΡ[106] р46-60 рХЕРЕНТрСАЪОЗКЗУ

С1п-А5п-Ееи-Рго-С1и-Н15-ТЬг-С1п-С1у-Тгр-Ееи-С1у-8ег-Еу5-Тгр

Пептид ΝΤΡ[106] №5 [8Е(} ГО N0 27], ΝΤΡ[106] р61-75

ЬШАРАЖРЕУЕЕКС

Ееи-Тгр-Ееи-Ьеи-РЬе-А1а-Уа1-Уа1-Рто-Р11е-Уа1-11е-Ееи-Еу8-Су8

Пептид ΝΤΡ[106] №6 [8Еф ГО N0 28], ΝΤΡ[106] р76-90 φΚΟδΕΚΝΚνΚΜΑΡΡΡ

О1п-Аг§-А8р-8ег-О1и-Ьу8-А8п-Еу8-Уа1-Аг§-Ме(-А1а-Рго-Рке-РЬе

Пептид ΝΤΡ[106] №7 [8Еф ГО N0 29], ΝΤΡ[106] р90-106

ШНЮ818ОУ8ОККМР

Ееи-Н18-Н18-Бе-А8р-8ег-Пе-8ег-О1у-Уа1-8ег-О1у-Еу8-Аг§-Ме1-РЪе

Пептиды ΝΤΡ этого изобретения, содержащие аминокислотные последовательности, соответствующие части аминокислотной последовательности, состоящей из 98 аминокислот ΝΤΡ, описанной в фиг. 4 (ΝΤΡ[98]), без ограничения, включают следующее:

- 14 007203

Пептид ΝΤΡ[98] №1 [8ЕО ГО N0 30], ΝΤΡ[98] ρ1-15

ΕΑΥΥΓΜΕΗΕΡΤΤΝΡΡ

61и-А1а-Туг-Туг-ТЬг-Ме1-Ееи-Н18-Ееи-Рго-ТЬг-Т11г-А5П-Аг§-Рго

Пептид ΝΤΡ[98] №2 [8Εφ ГО N0 31], ΝΤΡ[98] ρ16-30

КТАНСШЕЛРРНЗРК.

Еуз-11е-А1а-Н18-Су8-11е-Ееи-Рйе-А8П-01п-Рго-Н15-8ег-Рго-Аг§

Пептид ΝΤΡ[98] №3 [8Ε0 ГО N0 32],ΝΤΡ[98] ρ31-45

8Ν8Η8ΗΡΝΡΕΚΕΗΚΚ

8ег-Азп-8ег-Н18-8ег-Н18-Рго-А8п-Рго-Ееи-Еу8-Ееи-Н18-Аг§-Аг§

Пептид ΝΤΡ[98] №4 [8Εφ ГО N0 33], ΝΤΡ[98] ρ46-60

8Η8ΗΝΚΡΚΑΥ1ΕΤΠ

8ег-Н1з-8ег-Н1з-Азп-Аг§-Рго-Аг£-А1а-Туг-11е-Ееи-11е-Т11г-11е

Пептид ΝΤΡ[98] №5 [8ΕΡ ГО N0 34], ΝΤΡ[98] ρ61 -75

ЬРЗКЕКЕРТНЗрЗНН

Ееи-Рго-8ег-Еуз-Ееи-Еуз-Ееи-Аг§-'П1г-Н18-8ег-С1п-8ег-Н18-Н18

Пептид ΝΤΡ[98] №6 [8Ε(2 ГО N0 35], ΝΤΡ[98] ρ76-98

ΝΡΕδΚΤδΝδΤΡΊΝδΡΕΜΤδδΚΡΚ

Азп-РгоАеи-Зег-АцуЗЪг-Зег-АБп-Зег-ЗЪг-Рго-ТЪг-Азп-Зег-РЬе-Ееи-МеЕТЬг-Зег8ег-Ьуз-Рго-Аг§

Пептиды ΝΤΡ этого изобретения, содержащие аминокислотные последовательности, соответствующие части аминокислотной последовательности, состоящей из 75 аминокислот ΝΤΡ, описанной на фиг. 5 (ΝΤΡ[75]), без ограничения, включают следующее:

Пептид ΝΤΡ[75] №1 [8Е(2 ГО N0 36], ΝΤΡ[75] ρΐ-15 зззесьрксугоукне

8ег-8ег-8ег-Ееи-61у-Ьеи-Рго-Ьу8-Су8-Тгр-А5р-Туг-Аг§-Н15-С1и

Пептид ΝΤΡ[75] №2 [8Е<2 ГО N0 37], ΝΤΡ[75] р16-30

ЬЬЗЬАЕМЮТКУМАС

Ееи-Ьеи-8ег-Ьеи-А1а-Ееи-МеГ11е-А8П-Рйе-Агд-Уа1-МеЕА1а-Су8

Пептид ΝΤΡ[75] №3 [8Е0 ГО N0 38], ΝΤΡ[75] р31-45

ΤΡΚΟΗΕΙΛΟΚΙδίν

ТЪг-РЬе-Еу8-С1п-Н18-11е-О1и-Ееи-Агд-О1п-Еу8-11е-8ег-11е-Уа1

Пептид ΝΤΡ[75] №4 [8Е0 ГО N0 39], ΝΤΡ[75] р46-60

РККЬССМСРУСРУК!

Рго-Аг§-Еу8-Ьеи-Су8-Су8-МеРС1у-Рго-V а1-Суз-Рго-V а1-Ьуз-Не

Пептид ΝΤΡ[75] №5 [8Е0 ГО N0 40], ΝΤΡ[75] р61 -75

АЕЬТЖЗНСТУ/ЪРАЗ

А1а-Ееи-Ееи-ТП-11е-А8п-О1у-Н18-Су8-ТЬг-Тф-Ееи-Рго-А1а-8ег

- 15 007203

Пептиды ΝΤΡ этого изобретения, содержащие аминокислотные последовательности, соответствующие части аминокислотной последовательности, состоящей из 68 аминокислот ΝΤΡ, описанной в фиг. 6 (ΝΤΡ[68]), без ограничения, включают следующее:

Пептид ΝΤΡ[68] №1 [8Εζ> ГО N0 41], ΝΤΡ[68] ρΐ-15

МРУЕСЫЕШЕККО

Ме1-Рйе-Уа1-Рйе-Су8-Ееи-11е-Ееи-А8П-Аг§-61и-Еу8-Ее-Еу8-С1у

Пептид ΝΤΡ[68] №2 [8ЕЦ ГО N0 42], ΝΤΡ[68] р16-30

ОИЗЗРЕЕЕЗЕЕРЗЕЦ

С1у-Азп- 8ег- 8 ег-РНе-РЬе-Ьеи-Ьеи-8 ег-РЬе-РЬе-РНе-8 ег-РЬе-Спп

Пептид ΝΤΡ[68] №3 [8ЕЦ ГО N0 43], ΝΤΡ[68] р31-45

НССЦСЕЦСКТТЕбУА

А5п-Су8-Су8-С1п-Су8-РИе-С1п-Су8-Аг§-ТЬг-Тйг-С1и-С1у-Туг-А1а

Пептид ΝΤΡ[68] №4 [8ЕЦ ГО N0 44], ΝΤΡ[68] р46-68

УЕСЕУСЕУОКААРЕС^УТУЗРЛТ

Уа1-С1и-Су8-Рйе-Туг-Су8-Ееи-Уа1-А8р-Еу5-А1а-А1а-Рйе-С}1и-Су8-Тгр-Тгр-РЬеТ уг- Зег-Рйе- Азр-ТИг

Пептиды ΝΤΡ этого изобретения, содержащие аминокислотные последовательности, соответствующие части аминокислотной последовательности, состоящей из 61 аминокислоты ΝΤΡ, описанной в фиг. 7 (ΝΤΡ[61]), без ограничения, включают следующее:

Пептид ΝΤΡ[61] №1 [8Е(} ГО ΝΟ 45], ΝΤΡ[61] ρΐ-15

МЕРНТУАЦАСУРОНО

Ме1-С1и-Рго-Н15-Ткг-Уа1-А1а-О1п-А1а-С1у-Уа1-Рго-О1п-Н13-А5р

Пептид ΝΤΡ[61] №2 [8Е(^ ГО ΝΟ 46],ΝΤΡ[61] р16-30

ЕСЗЕфЗЕЕРРЕККЕЗ

Ееи-С1у-8ег-Ееи-О1п-8ег-Ееи-Ееи-Рго-Аг§-Р11е-Еу8-Аг§-Р11е-8ег

Пептид ΝΤΡ[61] №3 [8ЕЦ ГО N0 47], ΝΤΡ[61] р31-45

ΟΕΙΕΡΚΙλνΟΥΚΝΜΝΤ

Суз-Ееи-Ие-Ееи-Рго-Еуз-Пе-Тгр-Азр-Туг-Аг^-Азп-МеЕАзп-Тйг

Пептид ΝΤΡ[61] №4 [8ЕЦ ГО N0 48], ΝΤΡ[61] р46-61

ΑΕΚΚΝΚΥΤΡΕΤ6ΚΚ8

А1а-Ееи-11е-Еу8-Аг§-А8п-Аг§-Туг-ТН-Рго-С1и-1Ъг-С1у-Аг§-Еу8-8ег

Специалисту будет очевидно, что могут быть отобраны также и другие меньшие фрагменты вышеупомянутых пептидов ΝΤΡ, которые будут обладать той же самой или подобной биологической активностью. Специалистом могут быть отобраны и другие фрагменты ΝΤΡ, обладающие той же самой или подобной биологической активностью. Описанные в данном изобретении пептиды ΝΤΡ охватывают эти другие фрагменты. Вообще, описанные в данном изобретении пептиды содержат по крайней мере 6 аминокислот, предпочтительно по крайней мере 5 аминокислот и более предпочтительно по крайней мере 4 аминокислоты.

Изобретение также охватывает пептиды, включающие два или больше пептида ΝΤΡ, которые со

- 16 007203 единены друг с другом даже в том случае, если последовательности двух пептидов ΝΤΡ не являются смежными в последовательности (или последовательностях) разновидностей ΝΤΡ, из которых пептиды ΝΤΡ были получены. Что касается того, что пептид ΝΤΡ имеет желательную биологическую активность, из этого следует, что два таких пептида ΝΤΡ также обладали бы желательной биологической активностью, даже если эти сегменты не были бы смежными в пределах аминокислотной последовательности (или последовательностях) этих видов ΝΤΡ, из которых пептиды ΝΤΡ были получены.

Пептиды ΝΤΡ, их фрагменты, варианты, производные, гомологи, слившиеся белки и имитаторы, которые охватывает данное изобретение, могут быть получены, используя известные специалистам методы, такие как рекомбинантная технология ДНК, синтез белка и выделение встречающихся в природе пептидов ΝΤΡ, белков ΝΤΡ, белков ΆΌ7ε-ΝΤΡ и их фрагментов, вариантов, производных и гомологов.

Пептиды ΝΤΡ и фрагменты, варианты, производные, гомологи, слившиеся белки и их имитаторы могут быть получены из других пептидов ΝΤΡ, белков ΝΤΡ, белков ΆΌ7ε-ΝΤΡ и их фрагментов, вариантов, производных и гомологов, используя методы, известные специалистам. Такие методы включают (без ограничения) использование протеаз, для расщепления пептида ΝΤΡ, белка ΝΤΡ или белка ΆΌ7ε-ΝΤΡ, с образованием желаемого пептида ΝΤΡ.

Пептид ΝΤΡ, или белок ΝΤΡ также могут быть получены, используя известные рекомбинантные методы технологии ДНК, типа сформулированных у Самбрука и др, (Молекулярное Клонирование: Лабораторное Руководство, Со1б 8ргшд НагЬог ЬаЬога1огу ΡΓεδδ, Со1б 8ргшд НагЬог, Нью-Йорк [1989]), и/или у Аусубеля и др., ред., Текущие протоколы по молекулярной биологии, Сгссп ΡιιΝίδΙκπ, 1пс. и \УПеу апб 8оп§, Нью-Йорк [1994].

Ген или кДНК, кодирующие пептид ΝΤΡ или белок ΝΤΡ, могут быть получены, например, путем скрининга геномной или кДНК библиотеки или путем ΡΟΡ амплификации. Зонды и праймеры, необходимые для скрининга библиотеки, могут быть произведены на основе информации о последовательности для других известных генов или фрагментов гена от того же самого или связанного семейства генов типа, например, сохраненных мотивов, обнаруженных в других пептидах ΝΤΡ или белках ΝΤΡ. Кроме того, если ген, кодирующий пептид ΝΤΡ или белок ΝΤΡ, был идентифицирован от одной разновидности, то весь ген или часть его могут использоваться в качестве зонда, чтобы идентифицировать соответственные гены у других разновидностей. Зонды и праймеры могут быть использованы для скрининга библиотек сЭНА из различных источников ткани, намереваясь осуществить экспрессию гена пептида ΝΤΡ или белка ΝΤΡ. Как правило, необходимо использовать особенно строгие условия для скрининга, чтобы довести до минимума число полученных при этом ложных положительных данных.

Другой способ получить ген, кодирующий пептид ΝΤΡ или белок ΝΤΡ, состоит в том, чтобы использовать химический синтез, применяя известные специалисту методы, типа описанных Энгельсом и соавторами Апдете. Сйет. 1пЙ. Еб., 28:716-734 [1989]. Эти способы включают, среди прочего, фосфотриэфирный, фосфорамидитный и Н-фосфонатный методы синтеза нуклеиновых кислот. Предпочтительным методом для такого химического синтеза является синтез на полимерной основе с использованием стандартных методов химии фосфорамидитов. Обычно ДНК, кодирующая пептид ΝΤΡ или белок ΝΤΡ, будет состоять из нескольких сотен нуклеотидов в длине. Используя эти методы, нуклеиновые кислоты, более крупные, чем приблизительно из 100 нуклеотидов, могут синтезироваться в виде нескольких фрагментов. После этого фрагменты могут быть лигированы вместе, чтобы формировать полную длину пептида ΝΤΡ или белка ΝΤΡ. Обычно фрагмент ДНК, кодирующий терминальную аминогруппу белка, будет иметь ΑΤΟ, который кодирует остаток метионина. Этот метионин может или не может присутствовать в развитой форме белка ΝΤΡ или пептида ΝΤΡ, в зависимости от того, предназначен ли синтезированный в клетке-хозяине белок для секреции из этой клетки.

Путем использования стандартных методов лигации, ген, кДНК, или их фрагмент, кодирующий белок ΝΤΡ или пептид ΝΤΡ, может быть включен в соответствующую экспрессию или вектор амплификации. Обычно вектор выбирается, чтобы быть функциональным в конкретно используемой клетке хозяина (т.е. вектор совместим с механизмом клетки хозяина, таким образом, что может произойти амплификация гена и/или экспрессия гена. Амплификацию/экспрессию гена, кДНК, или их фрагмента, кодирующего белок ΝΤΡ или пептид ΝΤΡ, можно осуществить в клетках прокариотов, дрожжей, насекомых (системы бакуловируса) и/или эукариотов. Выбор клетки-хозяина будет зависеть частично от того, должен ли белок ΝΤΡ или пептид ΝΤΡ быть гликозилирован и/или фосфорилирован. Если это так, то в качестве клетки-хозяина предпочтительны клетки дрожжей, насекомых или млекопитающих.

Как правило, векторы, используемые в любой из клеток хозяина, будут содержать по крайней мере 5' фланкирующую последовательность (называемую также промотором), а также другие регулирующие элементы, такие, как усиливающий агент (усиливающие агенты), начало репликационного элемента, транскрипционный элемент завершения, полную последовательность интрона, содержащую сайты соединения донора и акцептора, последовательность сигнального пептида, элемент сайта связывания рибосомы, полиаденилирующую последовательность, область полилинкера для включения нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, который будет выражен, и выбираемый элемент маркера. Каждый из этих элементов обсужден ниже. Произвольно вектор может содержать последовательность метки, т. е. олигонуклеотидную молекулу, расположенную в 5' или 3' концах белка ΝΤΡ или пептида ΝΤΡ, коди

- 17 007203 рующего последовательность; олигонуклеотидная молекула кодирует ро1уН18 (типа йехаНщ), или другую метку типа ΕΤ-ΑΠ ΗΑ (гемагглютинин вируса Гриппа), или тус, для которого существуют коммерчески доступные антитела. Эта метка типично соединяется к полипептиду путем экспрессии полипептида, и может служить средством для аффинной очистки белка ΝΤΡ или пептида ΝΤΡ от клетки-хозяина. Аффинная очистка может быть достигнута, например, колоночной хроматографией, путем использования в качестве аффинной матрицы антител против метки. Произвольно метка может впоследствии быть удалена от очищенного белка ΝΤΡ или пептида ΝΤΡ различными путями, типа использования определенных пептидаз.

Основную цепь и Ес регион иммуноглобулина человека специалист может соединить у Ν-конца или у С-конца белка ΝΤΡ или пептида ΝΤΡ. Полученный слившийся Ес-белок может быть очищен при помощи аффинной колонки Белка А. Как известно, Ес проявляет большой фармакокинетический период полураспада ш у1уо, и оказалось, что фармакокинетический период полураспада ш у1уо у слившихся с Ес белков значительно больше, чем у их неслившихся копий. Кроме того, слияние в регион Ес позволяет димеризировать/мультимеризировать молекулу, что может быть полезна с точки зрения биологической активности некоторых молекул.

5' Фланкирующая последовательность может быть гомологичной (т.е. от тех же самых видов и/или штамма, что и клетка-хозяин), гетерологичной (т. е. от другой (отличной от клетки-хозяина) разновидности видов или штамма), гибридной (т.е. комбинацией 5' фланкирующих последовательностей из больше чем одного источника), синтетической или она может быть 5' фланкирующей последовательностью нативного белка ΝΤΡ или гена пептида ΝΤΡ. По существу, источником 5' фланкирующей последовательности может быть любой одноклеточный прокариотический или эукариотический организм, любой позвоночный или беспозвоночный организм или любое растение при условии, что 5' фланкирующая последовательность функциональна и может быть активизирована в процессе обмена клетки-хозяина.

5' Фланкирующие последовательности, которые пригодны в векторах, описанных в данном изобретении, могут быть получены любым из нескольких методов, известных в науке. Как правило, пригодные здесь 5' фланкирующие последовательности, отличающиеся от фланкирующей последовательности белка ΝΤΡ или гена пептида ΝΤΡ, должны быть предварительно идентифицированы путем составления генетической карты и/или путем расщепления рестрикционной эндонуклеазой, и, таким образом, могут быть изолированы из надлежащего источника ткани с использованием соответствующих рестрикционных эндонуклеаз. В некоторых случаях полная нуклеотидная последовательность 5' фланкирующей последовательности может быть известна. Здесь 5' фланкирующая последовательность может быть синтезирована, используя вышеописанные методы для синтеза нуклеиновых кислот или клонирования.

Если известна вся 5' фланкирующая последовательность или только ее часть, то она может быть получена, используя ΡСВ и/или скрининг геномной библиотеки с подходящим олигонуклеотидом и/или фрагментом 5' фланкирующей последовательности от тех же самых или других разновидностей.

Если 5' фланкирующая последовательность не известна, то фрагмент ДНК, содержащий 5' фланкирующую последовательность, можно выделить из более крупной части ДНК, которая может содержать, например, последовательность кодирования или даже другой ген или гены. Выделение может быть достигнуто путем расщепления рестрикционной эндонуклеазой, используя один или более тщательно отобранные ферменты, чтобы выделить надлежащий фрагмент ДНК. После расщепления желательный фрагмент может быть выделен путем очистки на геле агарозы, на колонке Р1адеп®, или другими известными специалисту методами. Принцип выбора подходящих ферментов для достижения этой цели должен быть очевиден специалисту.

Возникновение репликационного элемента является характерной частью для коммерчески приобретенных векторов экспрессии прокариотов и оно способствует амплификации вектора в клетке хозяина. Амплификация вектора в определенном числе копий, в некоторых случаях, может быть важна для оптимальной экспрессии белка ΝΤΡ или пептида ΝΤΡ. Если вектор выбора не содержит возникновение репликационного сайта, то его можно химически синтезировать на основе известной последовательности и лигировать в вектор. Элемент завершения транскрипции обычно расположен у 3' конца белка ΝΤΡ или пептида ΝΤΡ, кодирующего последовательность и предназначен для того, чтобы закончить транскрипцию белка ΝΤΡ или пептида ΝΤΡ. Обычно, элемент завершения транскрипции в прокариотических клетках представляет фрагмент, богатый С-С. сопровождаемый ро1у Τ последовательностью. Хотя элемент может быть клонирован от библиотеки или куплен коммерчески, как часть вектора, он может быть также легко синтезирован, используя описанные выше методы синтеза нуклеиновых кислот.

Выбираемый элемент гена маркера кодирует белок, необходимый для выживания и роста клетки хозяина, выращенной в отборной культуральной среде. Типичные гены маркера выбора кодируют белки, которые (а) придают прокариотическим клеткам хозяина резистентность к антибиотикам или другим токсинам, например к ампициллину, тетрациклину или канамицину, (б) дополняют ауксотрофные дефициты клетки или (в) снабжают важнейшие питательные вещества, не доступные от комплексных питательных сред. Предпочтительными выбираемыми маркерами являются ген сопротивления к канамицину, ген сопротивления к ампициллину и ген сопротивления к тетрациклину.

Связывающий рибосому элемент, обычно называемый последовательностью Шайна-Дельгарно (у

- 18 007203 прокариотов) или последовательностью Козака (у эукариотов), является обычно необходимым для инициирования трансляции мРНК. Элемент типично расположен у 3' промотора и у 5' последовательности кодирования синтезируемого белка ΝΤΡ или пептида ΝΤΡ. Последовательность Шайна-Дельгарно различна, но она является типичным полипурином (т.е. имеет высокое содержание А-С). Множество последовательностей Шайна-Дельгарно были идентифицированы, и каждую из них можно легко синтезировать, применяя описанные выше методы, и использовать в прокариотическом векторе.

В тех случаях, когда желательно, чтобы белок ΝΤΡ или пептид ΝΤΡ были выделены из клетки хозяина, можно воспользоваться сигнальной последовательностью, чтобы направить белок ΝΤΡ или пептид ΝΤΡ из клетки хозяина, где он синтезируется, и удалить карбоксильную концевую часть белка, чтобы предотвратить мембранную анкеровку. Как правило, последовательность сигнала расположена в регионе кодирования белка ΝΤΡ/гена пептида ΝΤΡ или кДНК, или непосредственно у 5' конца кодирующего региона белка ΝΤΡ/гена пептида ΝΤΡ. Множество последовательностей сигнала были идентифицированы, и любой из них, который является функциональным в отобранной клетке хозяина, может использоваться в сочетании с белком ΝΤΡ/геном пептида ΝΤΡ или кДНК. Поэтому, последовательность сигнала может быть гомологичной или гетерологичной белку ΝΤΡ/гену пептида ΝΤΡ или кДНК, и может быть гомологичной или гетерологичной белку ΝΤΡ/гену пептида ΝΤΡ или кДНК. Кроме того, последовательность сигнала можно химически синтезировать, используя сформулированные выше методы. В большинстве случаев секреция полипептида из клетки хозяина через присутствие сигнального пептида приводит к удалению из полипептида терминальной аминогруппы метионина.

Во многих случаях транскрипция белка ЫТР/гена пептида ΝΤΡ или кДНК усилена присутствием одного или более интронов в векторе; это тем более справедливо, если белок ΝΤΡ или пептид ΝΤΡ произведены в клетках хозяев эукариотов, особенно в клетках хозяев млекопитающих. Используемые интроны могут естественно встречаться в белке ΝΤΡ/гене пептида ΝΤΡ, особенно где используемый ген содержит полную длину геномной последовательности или ее фрагмента. Если интрон естественно не встречается в пределах гена (что наблюдается у большинства представителей кДНК), то интрон(ы) может быть получен из другого источника. Вообще, позиция интрона относительно фланкирующей последовательности и белка ΝΤΡ/гена пептида ΝΤΡ, является важным фактором, поскольку интрон должен быть транскрибирован таким образом, чтобы он был эффективным. По существу, если белок ΝΤΡ/ген пептида ΝΤΡ, включенный в вектор экспрессии, является молекулой кДНК, то предпочтительная позиция для интрона - 3' у сайта начала транскрипции, и 5' у поли-А-последовательности завершения транскрипции. Предпочтительно в случае белка ΝΤΡ/кДНК пептида ΝΤΡ, интрон или интроны будут расположены на одной или другой стороне (т.е. 5' или 3') молекулы кДНК, таким образом, что это не прерывает данную кодирующую последовательность. Для практической реализации данного изобретения можно использовать любой интрон из любого источника, включая любой вирусный, прокариотический и эукариотический организм (растение или животное), при условии, что он совместим с клеткой (клетками) хозяина, в которую он вводится. Здесь включены также и синтетические интроны. В векторе можно произвольно использовать больше чем один интрон.

Когда один или больше сформулированных выше элементов отсутствуют в используемом векторе, они могут быть индивидуально получены и лигированы в вектор. Методы, используемые для получения каждого из элементов, известны специалистам и сопоставимы с методами, сформулированными выше (т.е. синтез ДНК, скрининг библиотеки и т.п.).

Заключительные векторы, используемые для практической реализации данного изобретения, обычно сконструированы из исходных векторов типа коммерчески доступного вектора. Такие векторы могут содержать или не содержать некоторые из элементов, которые будут включены в законченный вектор. Если ни один из желательных элементов не присутствует в стартовом векторе, то каждый элемент может быть индивидуально лигирован в вектор путем сокращения вектора соответствующей эндонуклеазой (эндонуклеазами), ограничивая его таким образом, чтобы концы элемента были лигированы и концы вектора были совместимы для лигирования. В некоторых случаях необходимо притуплять предназначенные для совместного лигирования концы, чтобы получить удовлетворительную лигатуру. Притупление достигается первым наполнителем, заполняющим липкие концы, используя ДНК полимеразу Кленова или Т4 ДНК полимеразу в присутствии всех четырех нуклеотидов. Эта процедура хорошо известна в науке и описана выше, например в работе Самбрука и других. Альтернативно, два или больше из элементов, которые будут введены в вектор, сперва могут быть лигированы вместе (если они должны быть расположены смежными друг с другом), а затем лигированы в вектор.

Дополнительный метод для конструирования вектора состоит в том, чтобы провести все лигации различных элементов одновременно в одну реакционную смесь. В таких условиях из-за неправильной лигации или вставки элементов будет произведено много бессмысленных или нефункциональных векторов. Функциональный вектор может быть идентифицирован и отобран только путем расщепления рестрикционной эндонуклеазой.

Предпочтительные векторы для реализации данного изобретения - это те, которые совместимы с клетками-хозяевами организмов бактерий, насекомых и млекопитающих. Такие векторы включают, среди прочего, рСКН, рСВ3, и ροΩΝΑ3.1 (ΙηνίΙΐΌ§οη ί’οιηραην. 8аи Ωίο§ο. Са11Т), ρΒδΙΙ (§1га1адеие ί’οιηραην.

- 19 007203

Ьа ίο11;·ι. Са11Г.). рЕТ15Ь (Νονηβοη. Μηάίδοη. АЛ.). Р6ЕХ (РЕагтас1а Вю1ес11. РЛеа1а\\'ау. Ν.Ε). ρΕ6ΕΡ-Ν2 (С1оп1сс11. Ρ;·ι1ο Α11ο. СаБГ). рЕТЬ (В1иеВас11; Ιηνίΐτο^η). и рВа51ВасЭиа1 (Ο^ο/ΒΡΕ Сгап4 Л1ап4. Ν.Υ.).

После того как вектор был построен и молекула нуклеиновой кислоты. кодирующая полную длину или усеченную структуру белка ΝΤΡ или пептида ΝΤΡ. была вставлена в надлежащий сайт вектора. законченный вектор может быть вставлен в подходящую клетку хозяина для амплификации и/или экспрессии полипептида. Клетки хозяина могут быть прокариотическими клетками-хозяевами (типа Е. Сой). или эукариотическими клетками-хозяевами (типа клеток дрожжей. клеток насекомых или клеток позвоночных). Клетка хозяина. культивируемая в соответствующих условиях. может синтезировать белок ΝΤΡ или пептид ΝΤΡ. которые впоследствии могут быть выделены из среды культивирования (если клетка хозяина выделяет их в среду) или непосредственно из производящей их клетки хозяина (если клетка хозяина не выделяет их в среду).

После выделения белок ΝΤΡ или пептид ΝΤΡ может быть очищен. используя такие методы. как хроматография на молекулярных ситах. аффинная хроматография и т.п. Выбор клетки хозяина для получения белка ΝΤΡ или пептида ΝΤΡ будет частично зависеть от того. должны ли гликозилироваться или фосфорилироваться белок ΝΤΡ или пептид ΝΤΡ (в таком случае. в качестве клетки-хозяина предпочтительны эукариотические клетки). а также от способности клетки хозяина свернуть белок в виде его нативной третичной структуры (например. надлежащая ориентация дисульфидных мостиков. и т.д.). таким образом. чтобы из белка ΝΤΡ или пептида ΝΤΡ получить биологически активный белок или из пептида ΝΤΡ получить пептид. обладающий биологической активностью. Белок ΝΤΡ или пептид ΝΤΡ могут быть свернуты после синтеза. используя соответствующие химические условия. как это обсуждено ниже. Подходящие клетки или линии клеток включают клетки млекопитающих. такие как клетки яичника Китайского хомяка (СНО). клетки 293 или 293Т почки человеческого эмбриона (НЕК) или клетки 3Т3. Принципы выбора подходящих клеток-хозяев млекопитающих и методов для трансформации. культивирования. амплификации. скрининга. а также выделения и очистки продукта. известны в технике. Другие подходящие линии клеток млекопитающих включают линии клеток СО8-1 и СО8-7 обезьяны и линию клеток СУ-1. Следующие образцовые клетки-хозяева млекопитающих включают линии клеток приматов и линии клеток грызунов. включая трансформированные линии клеток. Пригодны также нормальные диплоидные клетки. штаммы клеток. полученные из первичной ткани в виде культур ίη νίΐτο. а также первичные животные ткани. культивируемые в искусственной среде. В гене выбора клетки-кандидаты могут быть генотипично несовершенные. или могут содержать доминантно действующий ген выбора. Другие подходящие линии клеток млекопитающих включают. без ограничения. клетки нейробластомы мыши Ν2Α. НеЬа. клетки Ь-929 мыши. линии 3Т3. полученные от Швейцарца. Ва1Ь-с или ΝΙΗ мышей. линии клеток ВНК или НаК хомяка.

Для данного изобретения в качестве клетки-хозяина аналогично пригодны также и бактериальные клетки. Например. в области биотехнологии хорошо известны как клетки-хозяева различные штаммы Е. той (например. НВ101. ЭН5.а1р11а.. ΌΗ10. и МС1061). Различные штаммы В. киЬШЛ. Ρ8еиάοтοηа8 крр.. другие ВасШик крр.. ЗперЮтусек крр. и т.п. можно также использовать в этом методе. Для экспрессии полипептидов. описанных в данном изобретении. в качестве клетки-хозяина можно использовать также клетки многих дрожжевых штаммов. известных специалистам.

Кроме того. где желательно. в методах данного изобретения могут использоваться также системы клеток насекомых. Такие системы описаны. например. у Киттса и др. (Вю1ес11пк.|ие5. 14:810-817 [1993]). у Луклоу (Сигг. Орш. Β^οΐесйηο1. 4:564-572 [1993]) и Луклоу и др. (I. У1го1. 67:4566-4579 [1993]). Предпочтительными клетками насекомых являются 8Г-9 и Н15 (Ιηνίΐτο^η. СаткЬаб. СайГ.).

Инсерция (также обозначаемая как трансформация или трансфекция) вектора в отобранную клетку хозяина может быть достигнута методами хлорида кальция. электропорации. микроинъекции. липофекции или ЭЕАЕ-декстрана. Отобранный метод частично будет зависеть от типа используемой клетки хозяина. Эти и другие подходящие методы хорошо известны специалистам и сформулированы. например. у Самбрука и других (см. выше).

Клетки хозяина. содержащие вектор (т.е. трансформированные или трансфектированные клетки). могут быть культивированы. применяя хорошо известные специалисту стандартные среды. Эти среды обычно должны содержать все питательные вещества. необходимые для роста и выживания клеток. Подходящими средами для культивирования клеток Е. той являются. например. Бульон Лурия (ЬВ) и/или Отменный Бульон (ЛетНс Вго111). Подходящими средами для культивирования эукариотических клеток являются ΡΡΜΙ 1640. МЕМ. ЭМЕМ. которые могут быть дополнены сывороткой и/или факторами роста. как этого требует специфика культивируемой клетки. Подходящая среда для клеток насекомых - эта среда Грейса. к которой. по мере необходимости. добавлен дрожжевой гидролизат. гидролизат лактальбумина и/или сыворотка эмбриона теленка. Как правило. к среде культивирования добавляется только антибиотик или другой компонент. способствующий селективному росту трансформированных клеток. Применяемый компонент будет определяться выбираемым маркерным элементом. присутствующим на плазмиде. при помощи которой клетка хозяина была преобразована. Например. если выбираемый маркерный элемент устойчив к канамицину. то в таком случае компонентом. который добавляют к среде культивирования. будет канамицин.

- 20 007203

Количество белка ΝΤΡ или пептида ΝΤΡ, вырабатываемого в клетке хозяина, можно определить используя стандартные методы, известные в науке. Такие методы включают, без ограничения, анализ \Ус51сгп Ь1о1. электрофорез в δΌδ-полиакриламидном геле, неденатурирующий гель-электрофорез, НГЬС разделение, масс-спектроскопию, иммунное осаждение и/или определение активности, как например, определение сдвига гели связывающей ДНК.

Если было предусмотрено, что белок ΝΤΡ или пептид ΝΤΡ должны выделяться из клеток хозяина, то большая часть белка ΝΤΡ или пептида ΝΤΡ может быть найдена в среде культивирования клетки. Белки, полученные этим способом, как правило, не содержат амино-терминальный метионин, поскольку в процессе секреции он удаляется из клетки. Если белок ΝΤΡ или пептид ΝΤΡ не выделяются клетками хозяина, но содержатся в цитоплазме и/или ядре (для клеток-хозяев эукариотов), или в цитозоли, (для клеток-хозяев грам-отрицательных бактерий), то они могут содержать амино-терминальный метионон.

Для выделения белка ΝΤΡ или пептида ΝΤΡ, содержащихся в цитоплазме и/или ядре клетки хозяина, обычно клетки хозяина сначала разрушают механически или при помощи детергента, чтобы содержание клетки перешло в буферный раствор. После этого белок ΝΤΡ или пептид ΝΤΡ могут быть выделены из этого раствора.

Выделение белка ΝΤΡ или пептида ΝΤΡ из раствора может быть достигнута различными методами. Если синтезируется такой белок, который в обоих его концах, карбоксильном и аминном, содержит метку типа гексаГистидина (например, ΝΤΡ пептид/гексаГис), или другой маленький пептид типа ЕЬЛС (81дта-Л1йпсй, 8ΐ. БоиН, ΜΙ), или кальмодулин-связывающий пептид (81га1адеие, Ьа 1о11а, СА), то его можно существенно очистить одностадийным процессом, путем пропускания раствора через аффинную колонку, где матрица колонки имеет высокий аффинитет к метке или непосредственно к белку (т. е. моноклональное антитело, специфически опознающий пептид ΝΤΡ). Например, полигистидин обладает высоким аффинитетом и специфичностью к никелю, цинку и кобальту; таким образом, используя метод иммобилизированной ионами металлов аффинной хроматографии, в частности, аффинные полимеры, содержащие никель (например, их используют в системах О1адеи'8 О1Аехрге55 5у51ет или 1пуйгодеи'8 Хргекк), или аффинные полимеры, содержащие кобальт (например, их используют в системе ΒΌ Вю8С1еисе8-СЕОЭТЕСН'8 Τа1оη), можно добиться очистки пептида ΝΤΡ/полиГис. (см., например, Текущие протоколы в молекулярной биологии. Ред. Аусубель и другие, раздел 10.11.8, 1ойи \УПеу & 8ои§, Нью-Йорк [1993]).

Если белок ΝΤΡ или пептид ΝΤΡ получены без присоединенной метки, и не доступны никакие антитела, то используют другие известные методы очистки. Такие методы включают, без ограничения, ионообменную хроматографию, хроматографию на гидроксиапатите, хроматографию гидрофобного взаимодействия, хроматографию на молекулярных ситах, НГЬС, электрофорез нативной гели в комбинации с элюцией геля, и препаративное изоэлектрическое фокусирование (Порите тасЫиеЛесйшдие, НоеГег 8с1епБПс). В некоторых случаях для достижения высокой степени очистки два или более из этих методов могут быть объединены.

Если ожидается, что белок ΝΤΡ или пептид ΝΤΡ прежде всего содержатся внутри клетки, то внутриклеточный материал (включая тела включения для грамотрицательных бактерий) может быть извлечен из клетки хозяина, используя любую стандартную технику, известную специалисту. Например, с целью извлечения периплазмы/цитоплазмы, клетки хозяина могут подвергаться лизису Французским прессом, гомогенизацией и/или ультразвуком с последующим центрифугированием. Если белок ΝΤΡ или пептид ΝΤΡ образуют тела включения в цитозоли, то такие тела включения часто связываются с внутренними и/или внешними клеточными мембранами и, таким образом, после центрифугирования они прежде всего концентрируются в осадочном материале. В таком случае тела включения расщепляют, извлекают их содержимое и растворяют, обрабатывая осадочный материал при экстремальных значениях рН или же агентом, вызывающим диссоциацию комплексов, таким как детергент, гуанидин, производные гуанидина, мочевина или производные мочевины в присутствии восстанавливающего агента, такого как дитиотрейтол при щелочных значениях рН, или как трис-карбоксиэтилфосфин при кислых значениях рН. В такой растворимой форме белок ΝΤΡ или пептид ΝΤΡ могут быть проанализированы, используя гельэлектрофорез, иммунное осаждение и т.д.. Если нужно выделить белок ΝΤΡ или пептид ΝΤΡ, то выделение может быть достигнуто, используя стандартные методы типа сформулированных ниже и описанных Марстоном и другими, Ме111. Еп/., 182:264-275 [1990].

В некоторых случаях после выделения белок ΝΤΡ или пептид ΝΤΡ могут быть биологически неактивны. Существуют различные методы для повторного свертывания или превращения полипептида в его третичную структуру и образования дисульфидных связей, которые могут использоваться для восстановления биологической активности. Такие методы включают обработку растворенного полипептида при рН обычно более чем 7 и присутствие специфической концентрации агента, вызывающего диссоциацию комплексов. Методика выбора агента, вызывающего диссоциацию комплексов, очень подобна методике, которую используют при выборе метода растворения тела включения, но обычно при более низкой концентрации. При этом не обязательно, чтобы тот же самый агент, вызывающий диссоциацию комплексов и используемый для растворения, использовался и для диссоциации. В большинстве случаев, свертывающий/окисляющий раствор содержит также и восстанавливающий агент или же восстанавли

- 21 007203 вающий агент совместно с его окисленной формой в определенном соотношении для создания специфического окислительно-восстановительного потенциала, позволяющего осуществить перестановку дисульфидных связей и образование цистеинового мостика (цистеиновых мостиков) белка. Некоторые из обычно используемых окислительно-восстановительных пар включают цистеин/цистамин, глутатион (С8Н)/дитиобис С8Н. хлорид двухвалентной меди, дитиотреитол (ОТТ)/дитиан-ОТТ, 2-меркаптоэтанол (ЬМЕ)/дитио-Ь(МЕ). Во многих случаях для увеличения эффективности свертывания необходим сорастворитель и другие обычные реактивы, в том числе глицерин, полиэтиленгликоль различных молекулярных весов и аргинин.

Если белок ΝΤΡ или тела включения пептида ΝΤΡ в значительной степени не сформированы в клетке хозяина, то после центрифугирования гомогената, белок ΝΤΡ или пептид ΝΤΡ следует искать прежде всего в надосадочной жидкости, и белок ΝΤΡ или пептид ΝΤΡ могут быть выделены из надосадочной жидкости методами, типа сформулированных ниже.

В тех ситуациях, где это предпочтительно для частичного или полного выделения белка ΝΤΡ или пептида ΝΤΡ, очистка может быть достигнута использованием известных специалисту стандартных методов. Такие методы включают, без ограничения, электрофоретическое разделение, сопровождаемое электроэлюцией, различные типы хроматографии (иммуноаффинные, молекулярных сит и/или ионного обмена), и/или жидкостную хроматографию высокого разрешения. В некоторых случаях для полной очистки целесообразно использование нескольких методов.

В дополнение к подготовке и очистке белков ΝΤΡ или пептидов ΝΤΡ и используемых рекомбинантных методов ДНК белки ΝΤΡ или пептиды ΝΤΡ и их фрагменты, варианты, гомологи и производные получают химическими методами синтеза (типа твердофазного синтеза пептидов) с использованием методов, известных в технике, таких как сформулированные Меррифильдом и др., 1. СНеш. 8ос., 85:2149 [1963], Хаутеном и др., Ρι^ Ναΐΐ Асай. δα. И8А , 82:5132 [1985], а также Стюартом и Янгом, Твердофазный синтез пептидов, Ρ^е^се СНеш1са1 Со., КоскГогй, 111 [1984]. Такие полипептиды могут синтезироваться с метионином или без метионина в виде аминного терминала. Химически синтезируемые белки ΝΤΡ или пептиды ΝΤΡ могут быть окислены, используя методы образования дисульфидных мостиков, сформулированные в этих трудах. Предполагают, что белки ΝΤΡ или пептиды ΝΤΡ будут обладать биологической активностью, сопоставимой с активностью белков ΝΤΡ или пептидов ΝΤΡ, полученных путем рекомбинации или путем выделения из природных источников, и, таким образом, могут использоваться попеременно с рекомбинантным или природным белком ΝΤΡ или пептидом ΝΤΡ.

Химически измененные композиции пептида ΝΤΡ, в которых пептид ΝΤΡ связан с полимером, рассмотрены в данном изобретении. Отобранный полимер обычно является водорастворимым, так чтобы связанный с ним белок в водной среде, типа физиологической среды, не выпадал в осадок. Отобранный полимер обычно модифицируют, чтобы он имел единственную реакционную группу, такую как активная сложноэфирная группа для ацилирования, или альдегидная группа для алкилирования, чтобы можно было регулировать степень полимеризации, как это предусмотрено в указанных методах. Полимер может иметь любой молекулярный вес и может быть разветвленным или линейным. В указанные полимеры пептидов ΝΤΡ включены также и смеси полимеров.

В некоторых случаях желательно получить нуклеиновую кислоту и/или аминокислотные варианты встречающихся в природе белков ΝΤΡ или пептидов ΝΤΡ. Варианты нуклеиновых кислот могут быть получены, используя сайт, направляющий мутагенез, Ρ0Κ амплификацию или другие соответствующие методы, где праймер(ы) имеют желательные точечные мутации (описание методов мутагенеза см. Самбрук и др. (выше) и Аусубель и др. (выше)). Для получения вариантов таких кислот может использоваться также и химический синтез с применением методов, описанных Энгельсом и др. (см. выше). Можно использовать также и другие известные специалисту методы.

Предпочтительными вариантами нуклеиновых кислот являются те, которые содержат нуклеотидные замещения, ответственные за предпочтительный кодон в клетке хозяина, используемой для получения белка ΝΤΡ или пептида ΝΤΡ. Такая оптимизация кодона может быть определена через компьютерные алгоритмы, которые включают таблицы частот кодона, типа ЕсоЫдй. Сой, показывающие предпочтение кодона высоко выраженных бактериальных генов, как это предусмотрено версией 9.0 пакета компьютерной группы генетики Висконсинского университета, Май1коп, \νίκ. Другие полезные таблицы частот кодона включают Се1едапк_Ыдй.сой, Се1едапк_1о^.сой, ПгокорЫ1а_Ыдй.сой, Нитап_Ыдй.сой, Ма17е_Ыдй.сой, и Уеак1_1ид11.сой. Другие предпочтительные варианты по сравнению с диким типом - это те, которые кодируют консервативные замещения аминокислот, как описано выше (например, когда заряд или полярность боковой цепи природной аминокислоты существенно не изменяется при его замещении различными аминокислотами), и/или те, которые предназначены для создания нового(ых) сайта(ов) гликозилирования и/или фосфорилирования или те, которые предназначены для удаления существующего(их) сайта(ов) гликозилирования и/или фосфорилирования.

Белки ΝΤΡ, пептиды ΝΤΡ, их фрагменты, гомологи, варианты, производные и соли могут быть получены, используя обычные методы синтеза пептида, известные специалистам. Эти методы включают химические методы сочетания (ср. Вунш Е. «Методы органической химии», т. 15, ч. 1+2, Синтез пептидов, Лиете Уег1ад, 81и11даг1 (1974), и Баррани Г., Маррифилд Ρ.Β.: «Пептиды», ред. Е. Гросс, Дж. Майен

- 22 007203 хофер, т. 2, глава 1, стр. 1-284, Лсайетю Ргекк (1980)), ферментативные методы сочетания (ср. Уидмер Ф., Иохансен Дж. Т., Саг1кЬег§ Кек. Соттип., т. 44, стр. 37-46 (1979), Куллманн У.: «Ферментативный синтез пептида», СКС Ргекк Ιηε Воса Ка1оп, Р1а. (1987), и Уидмер Ф., Иохансен Дж.Т., в «Синтетические пептиды в биологии и медицине»:, ред. Алитало К., Партанен П., Ватиери А., стр. 79-86, Е1ке\зег Амстердам (1985)), или комбинацию химических и ферментативных методов, если это экономично и выгодно для проекта. Используя приведенные здесь руководящие принципы, специалисты могут изменить пептидные последовательности пептида ΝΤΡ с целью получения гомолога, имеющего ту же самую или подобную биологическую активность (биоактивность), как исходный или нативный белок ΝΤΡ или пептид ΝΤΡ.

Использование непосредственно не самого пептида, а миметических структур данного пептида ΝΤΡ, предоставляет определенные преимущества. Вообще, имитаторы пептидов биологически более аккумулируемы, имеют более длинную продолжительность действия и являются более дешёвыми, чем белки и пептиды.

Таким образом, описанные выше пептиды ΝΤΡ пригодны для получения таких малых химических соединений с подобной биологической активностью и, следовательно, с подобным терапевтическим применением. Пептидные имитаторы пептидов ΝΤΡ могут быть получены путем применения методов комбинаторной химии и других методов, известных в науке (см., например, труды 20-го Европейского Симпозиума по пептидам, ред. Г. Юнг, Е. Байер, стр. 289-336 и приведенные там ссылки).

В науке известны примеры методов структурной модификации пептидов с целью создания имитаторов пептидов; эти методы включают инверсию хиральных центров основной цепи, которая ведет к структурам остатков Ό-аминокислот, способных, особенно в Ν-терминали, увеличить стабильность к протеолитической деградации, не влияя при этом на активность. Пример этого описан в статье Смита К.С. и др. «Т-связывание тритилированного Ό-ала¹ - пептида», Эгид ^еνе1οртеηΐ Кек., 15, стр. 371379(1988).

Другой метод заключается в изменении циклической структуры с целью увеличения стабильности и приводит к структурам типа Ν-С связанных имидов и лактамов (Эде и др. в сб. «Пептиды: химия и биология», ред. Смит и Ривиер, Ексот, Лейден (1991), стр 268-270). Примером этого служат конформационно ограниченные тимопентин-подобные соединения, например, описанные Гольдшейном Г. и др. в патенте США № 4457489 (1985), который включен сюда в виде ссылки.

Третий метод состоит в замещении пептидных связей в пептиде ΝΤΡ псевдопептидными связями, что придаёт устойчивость к протеолизу. Было описано множество псевдопептидных связей, которые вообще не затрагивают структуру пептида и его биологическую активность. Одним из примеров этого подхода является замещение ретроинверсо-псевдопептидных связей («Биологически активные ретроинверсо-аналоги тимопентина», Систо А. и др. в сб. «Пептиды, химия, структура и биология», ред. Ривиер Дж.Е. и Маршалл Г.Р. Ексот, ЬеИеп (1990), стр 722-773) и Дальпоззо и другие (1993), Ιηΐ. 1. РерБйе Рто1еш Кек., 41:561-566, включенные здесь в виде ссылок). Согласно этой модификации, аминокислотные последовательности пептидов могут быть идентичны последовательностям пептидов ΝΤΡ, описанным выше, за исключением того, что один или больше пептидных связей замещены ретроинверсопсевдопептидными связями. Предпочтительно большинство Ν-терминальных пептидных связей замещены, так как такое замещение придает устойчивость к протеолизу экзопептидазами, действующими на Νтерминал.

Синтез пептидов с одной или более восстановленными ретроинверсо-псевдопептидными связями известен в науке (Систо (1990) и Дальпоззо и др. (1993), процитированные выше). Таким образом, пептидные связи могут быть замещены непептидными связями, которые позволяют имитатору пептида принимать подобную исходному пептиду структуру и, соответственно, биологическую активность. Можно сделать также и дальнейшие модификации, заменяя химические группы аминокислот на другие химические группы подобной структуры. Другая подходящая псевдопептидная связь, которая, как известно, увеличивает стабильность к ферментативному расщеплению без или с небольшой потерей биологической активности - эта восстановленная изостерическая псевдопептидная связь (Коудер и другие, (1993), Ιηΐ. 1. РерБйе Рто1еш Кек., 41:181-184, включенный здесь в виде ссылки). Таким образом, аминокислотные последовательности этих пептидов могут быть идентичны последовательности пептида ΝΤΡ за исключением того, что одна или больше пептидных связей замещены изостерическими псевдопептидными связями. Предпочтительно, большинство Ν-терминальных пептидных связей замещены, так как такое замещение придает сопротивляемость к протеолизу экзопептидазами, действующими на Ν-терминал. Синтез пептидов с одной или более восстановленными изостерическими псевдопептидными связями известен в технике (Коудер и другие (1993), процитирован выше). Другие примеры включают введение кетометиленовых или метилсульфидных групп для замещения пептидных групп.

Пептоидные производные пептидов ΝΤΡ представляют собой другой класс пептидных имитаторов, которые сохраняют важные структурные детерминанты для биологической деятельности и при этом не содержат пептидную связь, придавая таким образом сопротивляемость к протеолизу (Саймон и др., 1992, Ргос. №ΐί. Αсаά. 8ск υδΑ, 89:9367-9371 и включенный здесь в виде ссылки). Пептоиды - это олигомеры Ν-замещенных глицинов. Было описано множество Ν-алкильных групп, каждая из которых соответству

- 23 007203 ет боковой цепи природной аминокислоты (Саймон и др. (1992), процитированный выше и включенный сюда в виде ссылки). Некоторые или все аминокислоты пептида ΝΤΡ заменены Ν-замещенным глицином, соответствующим замещенной аминокислоте.

Усовершенствованию пептидных имитаторов можно способствовать путем определения третичной структуры исходного пептида ΝΤΡ спектроскопией ЯМР, кристаллографией и/или автоматизированным молекулярным моделированием. Эти методы помогают в развитии новых композиций более высокой потенции и/или большей биоаккумуляции и/или большей стабильности, чем исходный пептид (Деан (1994), ΒίοΕδδαγδ. 16: 683-687; Коэн и Шатцмиллер (1993), 1. Мо1. Сгарй., 11: 166-173; Уилей и Рич (1993), Меб. Век. Веу., 13: 327-384; Мур (1994), Τκηάκ ГЬагтасо! 8с1., 15: 124-129; Хруби (1993), Вюро1утегк, 33: 1073-1082; Багг и другие (1993), 8с1. Ат., 269:92-98, все включены сюда в виде ссылок).

После идентификации потенциального пептидного имитатора его можно синтезировать и анализировать, используя методы оценки его активности, описанные в нижеследующих примерах. Данное изобретение включает соединения - пептидные имитаторы, полученные вышеупомянутыми методами, имеющие биологическую активность Пептидов ΝΤΡ и подобную трехмерную структуру. Для специалиста очевидно, что имитатор пептида, имеющий одну или более описанных выше модификаций, может быть получен из любого из пептидов ΝΤΡ. Кроме того, будет очевидно, что имитаторы пептидов, описанные в данном изобретении, в дополнение к их применению в терапевтических композициях, могут далее использоваться для получения еще более активных непептидных соединений.

Сегодня существует множество организаций, которые способны синтезировать описанные здесь пептиды ΝΤΡ. Например, учитывая последовательность пептида ΝΤΡ, организация может синтезировать пептид и переслать синтезируемый пептид с сопровождающей документацией и доказательством идентичности пептида.

Это изобретение охватывает также использование пептидов ΝΤΡ и соответствующих им молекул нуклеиновых кислот для испытательных тестов, для качественного или количественного определения пептидов ΝΤΡ, белков ΝΤΡ, ΑΌ7^ΝΤΡ, ДНК пептида ΝΤΡ, ДНК белка ΝΤΡ, ДНК ΑΩ7^ΝΤΡ-;·ι или соответствующих РНК, присутствующих в тканях млекопитающих или жидких образцах тела. Пептиды ΝΤΡ и соответствующие им молекулы нуклеиновых кислот можно использовать в качестве препаратов в испытаниях биологической активности пептида ΝΤΡ или ДНК кодированного пептида ΝΤΡ. Последовательности нуклеиновой кислоты пептида ΝΤΡ могут быть полезным источником для гибридных зондов, предназначенных для качественного или количественного определения содержания ДНК пептида ΝΤΡ, ДНК белка ΝΤΡ, ДНК ΑΟ7^ΝΤΡ-;·ι или соответствующей РНК, в тканях млекопитающих или жидких образцах тела. Пептид ΝΤΡ, который сам по себе биологически неактивен, может быть применен для получения антител, которые распознают и/или связываются с пептидами ΝΤΡ, белками ΝΤΡ или белками ΑΌ7^ΝΤΡ. Такие антитела можно получить, используя стандартные методы. Таким образом, в пределах данного изобретения рассмотрены также антитела, которые реагируют или связываются с пептидами ΝΤΡ так же как и с короткоцепными фрагментами антител и с другими реагирующими фрагментами таких антител. Антитела могут быть поликлональными, моноклональными, рекомбинантными, химерными, однонитевыми и/или биспецифическими. Как правило, антитело или его фрагмент имеет человеческое происхождение или гуманизирован, т.е. при введении в организм пациента, предотвращает или минимизирует иммунную реакцию на антитело. Предпочтительные антитела - это антитела человека, как поликлональные так и моноклональные. Фрагментом антитела может быть любой фрагмент, который реагирует с пептидами ΝΤΡ данного изобретения, такие как Р_аь, Р_аЬ', и т.д. Данное изобретение включает также гибридомы, вырабатываемые в присутствии любого пептида ΝΤΡ, как антигена к отобранному млекопитающему, например, к клеткам млекопитающего (например, к клеткам селезенки), слившимся с некоторыми раковыми клетками, для создания известными методами линий увековеченных клеток. Данное изобретение охватывает также методы, используемые для создания линий таких клеток и антител, направленных против целыой молекулы или отдельных частей пептида ΝΤΡ.

Антитела могут далее использоваться ίη νίνο и ίη νίίτο для диагностических и исследовательских целей в меченном виде, для обнаружения присутствия пептида ΝΤΡ, белка ΝΤΡ или ΑΌ7^ΝΤΡ в образцах жидкостей или клеток тела.

Это изобретение охватывает также использование одного или более пептидов ΝΤΡ, как калибровочных стандартов в анализах, которых проводят для качественного или количественного определения пептидов ΝΤΡ, белков ΝΤΡ, ΑΌ7^ΝΤΡ, ДНК пептида ΝΤΡ, ДНК белка ΝΤΡ, ДНК ΑΟ7^ΝΤΡ-;·ι или соответствующих РНК, присутствующих в тканях млекопитающих или жидких образцах тела.

Данное изобретение описывает новые методы лечения тех заболеваний, которые требуют удаления клеток, таких, как клетки доброкачественных и злокачественных опухолей, железистой гиперплазии (например простаты), нежелательных волос на лице, бородавок и нежелательных жировых тканей или ингибирования или предотвращения нежелательной клеточной пролиферации, напр. стеноза стента. Такой метод включает введение больному организму млекопитающего терапевтически эффективных количеств пептида ΝΤΡ, или покрытие устройства, напр. стента, терапевтически эффективным количестом пептида ΝΤΡ.

Болезнь может быть, например, опухолью легкого, груди, живота, поджелудочной железы, проста

- 24 007203 ты, пузыря, кости, яичника, кожи, почки, пазухи, толстой кишки, кишечника, живота, прямой кишки, пищевода, крови, мозга и его покрытий, спинного мозга и его покрытий, мышцы, соединительной ткани, надпочечника, паращитовидной железы, щитовидной железы, матки, яичка, гипофиза, репродуктивных органов, печени, желчного пузыря, глаза, уха, носа, горла, миндалин, рта, лимфатического узла и лимфатической системы и других органов.

Используемый здесь термин «злокачественная опухоль» охватывает все формы карцином, сарком и меланом человека, которые встречаются в плохо дифференцированной, умеренно дифференцированной и хорошо дифференцированной формах.

Это изобретение удовлетворяет потребность в способе лечения, при помощи которого можно удалить доброкачественные опухоли с меньшим риском и меньшими нежелательными побочными эффектами, характерными для хирургии. Особенно необходим метод удаления хирургическим путем доброкачественных опухолей из опасных областей, таких как места, расположенные глубоко в теле (например, мозг, сердце, легкие и другие).

Способ лечения заболеваний, требующих удаления клеток, может использоваться в сочетании с обычными методами лечения заболеваний, типа хирургического вмешательства, химиотерапии и радиации. Пептиды ΝΤΡ могут быть введены пациенту до, во время или после таких обычных лечебных процедур.

Заболеваниями, которые можно лечить подобным образом, являются также гиперплазия, гипертрофия или чрезмерно быстрый рост ткани, отобранной из группы, состоящей из легкого, груди, живота, поджелудочной железы, простаты, пузыря, кости, яичника, кожи, почки, пазухи, толстой кишки, кишечника, живота, прямой кишки, пищевода, крови, мозга и его покрытий, спинного мозга и его покрытий, мышцы, соединительной ткани, надпочечника, паращитовидной железы, щитовидной железы, матки, яичка, гипофиза, репродуктивных органов, печени, желчного пузыря, глаза, уха, носа, горла, миндалин, рта, а также лимфатических узлов и лимфатической системы.

Другие заболевания, которые можно лечить, используя метод данного изобретения - это вирусные, бактериальные или паразитические изменения ткани, отобранной из группы, состоящей из легкого, груди, живота, поджелудочной железы, простаты, пузыря, кости, яичников, кожи, почки, пазухи, толстой кишки, кишечника, живота, прямой кишки, пищевода, крови, мозга и его покрытий, спинного мозга и его покрытий, мышцы, соединительной ткани, надпочечника, паращитовидной железы, щитовидной железы, матки, яичка, гипофиза, репродуктивных органов, печени, желчного пузыря, глаза, уха, носа, горла, миндалин, рта, а также узлов лимфы и лимфатической системы.

Заболевание, которое можно лечить, может также быть уродством или нарушением ткани, отобранной из группы, состоящей из легкого, груди, живота, поджелудочной железы, простаты, пузыря, кости, ονηΓν, кожи, почки, пазухи, толстой кишки, кишечника, живота, прямой кишки, пищевода, крови, мозга и его покрытий, спинного мозга и его покрытий, мышцы, соединительной ткани, надпочечника, паращитовидной железы, щитовидной железы, матки, яичка, гипофиза, репродуктивных органов, печени, желчного пузыря, глаза, уха, носа, горла, миндалин, рта, а также узлов лимфы и лимфатической системы.

В частности, заболевание, которое можно лечить, может быть гипертрофией миндалевидной железы, гиперплазией простаты, псориазом, экземой, дерматозами или геморроем. Заболевание, которое можно лечить, может быть сосудистой болезнью, типа атеросклероза или артериосклероза, или сосудистой болезни, типа варикозных вен, стеноза или рестеноза артерии или стента. Заболевание, которое можно лечить, также может быть косметической модификацией ткани, типа кожи, глаза, уха, носа, горла, рта, мышцы, соединительной ткани, волос или грудной ткани.

В сферу данного изобретения включены терапевтические композиции пептидов ΝΤΡ. Такие композиции могут содержать терапевтически эффективное количество пептида ΝΤΡ с добавленным к нему фармацевтически приемлемым носителем. Материалом носителя может быть вода для инъекции, предпочтительно содержащая добавленные к ней другие материалы, обычно используемые для введения в организм млекопитающих. Как правило, для терапевтического применения пептид ΝΤΡ вводятся в виде композиции, включающей очищенный пептид ΝΤΡ в сочетании с одним или большим количеством физиологически приемлемых носителей, наполнителей или разбавителей. Исключительно подходящими носителями являются нейтральный буферированный солевой раствор или солевой раствор, смешанный с сывороточным альбумином. Предпочтительно продукт сформулирован в виде лиофилизированной массы с использованием соответствующих наполнителей (например, сахарозы). При желании могут быть включены также и другие стандартные носители, разбавители и наполнители. Композиции, содержащие известные специалистам буферные системы с соответствующим диапазоном значения рН, в том числе буфер Триса, имеющий рН приблизительно 7.0-8.5 или ацетатный буфер, имеющий рН приблизительно 4.0-5.5, могут дополнительно содержать сорбитол или подходящую замену.

Использование пептидов ΝΤΡ, конъюгированных, взаимосвязанных, сцепленных с антителом, фрагментом антитела, подобной антителу молекулой или молекулой с высоким аффинитетом к определенному маркеру опухоли, такой как клеточный рецептор, сигнальный пептид или сверх-выраженный фермент для прицеливания на нежелательные клеточные элементы, также затронуто данным изобретением. Антитело, фрагмент антитела, подобная антителу молекула или молекула с высоким аффинитетом

- 25 007203 к определенному маркеру опухоли используются для прицеливания на пептид №ГР, сопряженного с определенной целевой клеткой или тканью. Например, опухоль с отличительным поверхностным антигеном или выраженным антигеном может преследоваться антителом, фрагментом антитела или подобной антителу связывающей молекулой, в результате чего клетки опухоли могут быть убиты пептидом ΝΙΓ. Такой подход с прицеливанием антитела имеет ожидаемые преимущества, выражающиеся в уменьшении дозировки, увеличении вероятности их связывания или поглощения целевыми клетками и увеличении их полезности для прицеливания и обработки метастатических опухолей и опухолей микроскопических величин.

Это изобретение также охватывает использование пептидов №ГР, конъюгированных или взаимосвязанных или сцепленных к белку или другой молекуле, для образования композиции, которая расщепляет участок(и) опухоли, или смежный участок(и), или опухолевые и другие нежелательные клетки ферментом, специфическим для данной опухоли, или протеазой, или конъюгированным антителом, которые нацелены на опухоль или другие нежелательные клетки; при этом композиция выделяет пептид №ГР около участка(ков) опухоли или других нежелательных клеток.

Это изобретение охватывает также использование пептидов №ГР, конъюгированных, или взаимосвязанных, или сцепленных с белком или другой молекулой для образования композиции, которая выделяет пептид №ГР, или некоторые биологически активные фрагменты пептида №ГР при освещении обрабатываемой ткани видимым светом (как в случае лазерной терапии или другой фотодинамической или фотоиндуцированной терапии) и другими формами электромагнитной радиации, такими как инфракрасная и ультрафиолетовая радиация, рентгеновские или гамма лучи, локальная термообработка, α- или βрадиация, ультразвуковая эмиссия или другие источники ограниченной энергии.

В соответствие с лечебными показаниями, пептиды №ГР могут использоваться отдельно, вместе или в комбинации с другими фармацевтическими композициями, такими как цитокины, факторы роста, антибиотики, агенты индуцирующие апоптоз, противовоспалительные и/или химиотерапевтические агенты.

Это изобретение охватывает также терапевтические композиции пептидов №ТР, использующие дендримеры, фуллерены и другие синтетические молекулы, полимеры и макромолекулы, где пептид №ГР и/или соответствующая ему ДНК конъюгированы или соединены с молекулой, полимером или макромолекулой, или включены в них самостоятельно или совместно с другими разновидностями молекул, такими, как специфические маркера опухоли. Например, в патенте США № 5714166 «Биологически активные и/или целеуказанные дендримерные конъюгаты», среди прочего описаны способы получения и применения конъюгатов дендритового полимера, состоящего по крайней мере из одного дендримера с целевой директорией(ами) и конъюгированного с ним по крайней мере одного биологически активного агента. Содержание патента США № 5714166 включено сюда полностью в виде ссылки.

Это изобретение также охватывает терапевтические композиции пептидов ΝΙΓ и/или генов и носителей для лекарств, таких как липидные эмульсии, мицеллярные полимеры, полимерные микросферы, электрически активные полимеры, гидрогели и липосомы.

Использование пептидов ΝΙΓ или родственных генов или эквивалентов гена, переданных нежелательным клеткам, также затронуто в данном изобретении. Сверхэкспрессия пептида №ГР в пределах опухоли может использоваться, чтобы индуцировать смерть клеток опухоли и тем самым уменьшать в ней популяцию клеток. Полагают, что передача гена или эквивалента гена пептида №ГР с целью обработки нежелательных клеточных элементов, имеет преимущества, так как требует малых доз и проникает в потомственные образования целевых клеточных элементов, обусловливая тем самым потребность менее частой терапии и меньшей общей терапии. Это изобретение также охватывает передачу генов, которые кодируют слившийся белок, содержащий пептид ΝΙΓ и нежелательные клетки или соседние им клетки, где после экспрессии гена и образования и/или выделения слившегося белка, последний расщепляется при воздействии на них нативных ферментов или протеаз, а также под влиянием предшественников лекарств, которые выделяют пептид №ГР в нежелательные клетки или около них.

Использование клонированных рекомбинантных конъюгатов типа ΝΙΓ пептид-антитело; клонированных рекомбинантных конъюгатов типа ΝΙΓ пептид-фрагмент антитела; и клонированных рекомбинантных конъюгатов типа ΝΙΓ пептид-белок подобный антителу также затронуто в данном изобретении. Преимущества клонированного пептида №ГР, объединенного с нацеленным конъюгатом (типа антитела, фрагмента антитела, подобной антителу молекулы или молекулы с высоким аффинитетом к рецептору, специфическому к раку или другому маркеру опухоли), состоят в том, что такая молекула объединяет описанные выше преимущества нацеливания в дополнение к преимуществам производства и стандартизации клонированной конъюгированной молекулы.

Это изобретение охватывает также использование терапевтических композиций пептидов №ГР или генов №ГР или эквивалентов гена, как компонентов покрытия медицинского устройства типа стент, чтобы устранить, ингибировать, или предотвратить нежелательную клеточную пролиферацию или аккумуляцию.

Твердые формы дозировки для орального приема включают, без ограничения, капсулы, таблетки, пилюли, порошки и гранулы. В таких твердых формах дозировки, активное соединение предпочтительно

- 26 007203 смешивают по крайней мере с одним из следующих: (а) с одним или более инертным наполнителем (или носителем), таким как цитрат натрия или двузамещенный фосфат кальция; (б) с наполнителями или расширителями, такими как крахмалы, лактоза, сахароза, глюкоза, маннитол и кремневая кислота; (в) со связующими веществами, такими как карбоксиметилцеллюлоза, альгинаты, желатин, поливинилпирролидон, сахароза и гуммиарабик; (г) с гигроскопическими веществами типа глицерина; (д) с распадающимися агентами типа агар-агара, карбоната кальция, крахмала картофеля или тапиоки, альгиновой кислоты, некоторых комплексных силикатов и карбоната натрия; (е) с замедлителями растворения типа парафина; (ж) с ускорителями абсорбции типа четвертичных аммонийных соединений; (з) со смачивающими агентами типа ацетилового спирта и моностеарата глицерина; (и) с адсорбентами типа каолина и бентонита; и (к) со смазками типа талька, стеарата кальция, стеарата магния, твердых полиэтиленгликолей, лаурилсульфата натрия или их смесей. Для капсул, таблеток и пилюль формы дозировки могут также включать вещества буферного действия.

Жидкие формы дозировки для орального приема включают фармацевтически приемлемые эмульсии, растворы, суспензии, сиропы и эликсиры. В дополнение к активным соединениям, жидкие формы дозировки могут включать инертные разбавители типа воды или других растворителей, обычно используемых в технике, солюбилизирующие агенты и эмульгаторы. К образцовым эмульгаторам можно отнести этиловый спирт, изопропиловый спирт, этилкарбонат, этилацетат, бензиловый спирт, бензил-бензоат, пропиленгликоль, 1,3-бутиленгликоль, диметилформамид, масла, такие как хлопковое масло, арахисовое масло, кукурузное масло, оливковое масло, касторовое масло и кунжутное масло, глицерин, тетрагидрофурфуриловый спирт, полиэтиленгликоли, жирнокислые сложные эфиры сорбитана или смеси этих веществ и т.п.

Помимо таких инертных разбавителей, композиция также может включать вспомогательные вещества, такие как смачивающие агенты, эмульгирующие и суспендирующие агенты, а также подслащивающие, ароматизирующие и благовонные агенты.

Фактические уровни дозировки активных компонентов и методы их введения в композициях данного изобретения с целью получения таких количеств пептида ΝΤΡ, которые являются эффективными для достижения желательной терапевтической ответной реакции на конкретную композицию, могут быть различны. Поэтому отобранный уровень дозировки зависит от желательного терапевтического эффекта, пути введения, желательной продолжительности лечения и других факторов.

Млекопитающим, включая людей, эффективные количества могут быть введены, основываясь на площади поверхности тела. Взаимосвязь дозировок для животных различных видов и размеров, а также для людей (основанная на тд/М² поверхности тела) описана у Е.Дж. Фрайрайх и др. Сапсег СйетоШег. Вер., 50 (4):219 (1966). Область поверхности тела может быть приблизительно определена по высоте и весу индивидуума (см., например, Научные таблицы, 6е1§у Ρйа^тасеиΐ^са18, ΑΓά№ν. Ν.Υ., стр. 5 537-538 (1970)).

Полная ежедневная доза пептида ΝΤΡ может вводиться в организм хозяина одной или несколькими порциями. Дозировки могут содержать такие количества его дольных единиц, которые в сумме составляют ежедневную дозу. Следует, однако, учитывать, что определенный уровень дозы для любого специфического пациента будет зависеть от разнообразия факторов, включая вес тела, общее состояние здоровья, пол, диету, время и путь введения, потенциал введенного препарата, степень поглощения и выделения, комбинацию с другими лекарствами и серьезность конкретной болезни.

Метод введения композиции пептида ΝΤΡ согласно данному изобретению включает, без ограничения, введение соединений внутримышечно, орально, внутривенно, интраперитонеально, интрацеребрально (интрапаренхимально), интрацеребровентрикулярно, внутрь опухоли, через пораженный участок, через кожу, интратекально, через нос, интраокулярно, внутриартериально, локально, трансдермально, через аэрозоль, путем инфузии, инъекцией шарика, через имплантированное устройство, системой медленного выделения и т. д.

Другой метод введения пептида ΝΤΡ, описанного в данном изобретении, - это трансдермальный или кожный путь. Пример такого осуществления - использование заплаты. В частности, заплата может быть приготовлена из тонкой суспензии пептида ΝΤΡ, например, в диметилсульфоксиде (ДМСО) или в смеси ДМСО с хлопковым маслом и наложена на поверхность опухоли млекопитающего путем помещения заплаты в углубление кожи. Другие среды или их смеси с другими растворителями и твердыми носителями также функционируют одинаково хорошо. Заплата может содержать соединение пептида ΝΤΡ в виде раствора или суспензии. Такая заплата может быть наложена на кожу пациента, например, посредством ее помещения в углубление кожи пациента, сформированное путем сгибания кожи и ее закрепления посредством стежков, клипс или других зажимных приспособлений. Этот мешочек должен использоваться таким образом, чтобы был обеспечен непрерывный контакт с кожей без вмешательства млекопитающего. Помимо использования такого мешочка из кожи может использоваться любое приспособление, которое гарантирует устойчивый контакт заплаты с кожей. Например, для закрепления заплаты на кожу можно использовать клейкий бандаж.

Пептид ΝΤΡ может быть введен в виде лекарственной формы или препарата с замедленным высвобождением медикамента. Подходящие примеры лекарственных форм с замедленным высвобождением

- 27 007203 медикамента включают полупроницаемые полимерные матриксы в виде форменных изделий, например, пленки или микрокапсулы. Матриксы с замедленным высвобождением медикамента включают полиэстеры, гидрогели, полилактиды (США 3773919, ΕΡ 58481), сополимеры Ь-глутаминовой-кислоты и гаммаэтил-Ь-глутамата (Сидмэн и др., Вюро1утегз, 22: 547-556 [1983]), поли-(2-гидроксиэтил-метакрилат) (Лэнгер и др., Σ. Вютеб. Ма1ег. Вее., 15: 167-277 [1981] и Лэнгер, СНет. Τесй., 12: 98-105 [1982]), этиленвинилацетат (Лэнгер и др., см. выше), или поли-Э(-)-3-гидроксимасляную кислоту (ΕΡ 133988). Лекарственные составы с замедленным высвобождением медикамента также могут включать липосомы, которые можно приготовить любым из методов, известных в технике (например, Эппштейн и др., Ггос. №111. Асаб. 8с1. И8А, 82: 3688-3692 [1985]; ΕΡ 36,676; ΕΡ 88,046; и ΕΡ 143,949).

Другой метод введения пептида ΝΤΡ, описанного в данном изобретении, основан на прямой или косвенной инфузии пептида ΝΤΡ в опухоль или другую ткань, подвергаемую лечению. Пример такого осуществления - прямая инъекция пептида ΝΤΡ в опухоль или другую ткань. Лечение может состоять из одной инъекции, многократных инъекций в один приём или ряда инъекций в течение часов, дней или месяцев, что приводит к регрессии или разрушению опухоли или другой ткани. Лечение контролируется посредством биопсии, визуализации или других методов контроля тканевого роста. Инъекцию в опухоль или другую ткань, подвергаемую лечению можно осуществить устройством, вставленным в полость, типа носа, рта, уха, влагалища, прямой кишки или уретры или через разрез, чтобы проникнуть в опухоль или ткань 1п у1уо, и можно выполнить с применением метода визуализации или оптической системы, типа ультразвукового индикатора или волоконной оптики для идентификации соответствующего участка для инъекции(й). Другой пример такого осуществления - использование устройства, которое может обеспечить постоянную инфузию пептида ΝΤΡ в ткань в течение некоторого времени.

Другой метод введения пептида ΝΤΡ, описанного в данном изобретении, заключается в комбинации с хирургической или подобной процедурой, используемой для физического удаления, ампутации или разрушения опухолевых или других тканей или клеточных элементов, удаления или разрушения которых желают достичь путем введения пептида ΝΤΡ, описанного в данном изобретении, непосредственно в область (областях) удаляемой опухоли или другой ткани или в соседнюю область (областях), чтобы уничтожить клетки опухоли или воспрепятствовать росту любых клеток, не удаленных или разрушенных в соответствии с вышеописанной процедурой.

Другим методом введения пептида ΝΤΡ, описанного в данном изобретении, является имплантация устройства в пределах опухоли или другой ткани, подлежащей лечению. Примером такого осуществления является внедрение пластины, содержащей пептид ΝΤΡ, в опухоль или другую ткань подвергаемую лечению. Через какое-то время, пластина выделяет в ткань терапевтическую дозу пептида ΝΤΡ. Альтернативно или дополнительно композиция может быть введена локально, путем имплантации в обрабатываемую область мембраны, губки или другого соответствующего материала, на котором был абсорбирован пептид ΝΤΡ. Если используется имплантационное устройство, то оно может быть внедрено в любую подходящую ткань или орган, и поставку пептида ΝΤΡ можно осуществить устройством непосредственно через таблетку, или путем непрерывного введения, или через катетер, используя непрерывную инфузию.

Альтернативный метод введения состоит в том, чтобы ввести одну или более копий гена, кодирующего пептид ΝΤΡ, в целевую клетку и, если необходимо, индуцировать копией(ями) гена внутриклеточное образование пептида ΝΤΡ. Один из способов, при котором генная терапия может быть применена, состоит в том, чтобы использовать ген, кодирующий пептид ΝΤΡ, (или геномную ДНК, кДНК и/или синтетическую ДНК, кодирующую пептид ΝΤΡ (или их фрагмент, вариант, гомолог или производное), которые могут быть действенно связанными с конститутивным или индуцируемым промотором для образования ДНК-конструкта генной терапии. Промотор может быть гомологичным или гетерологичным эндогенному гену, кодирующему пептид ΝΤΡ, при условии, что он активен в клетке или ткани такого типа, в которую будет помещен конструкт. Другие компоненты ДНК-конструкта генной терапии произвольно включают, по мере необходимости, молекулы ДНК, предназначенные для сайт-специфической интеграции (например, эндогенные фланкирующие последовательности, необходимые для гомологичной рекомбинации), тканеспецифичный промотор, ускоритель(и) или замедлитель(и), молекулы ДНК, способные к обеспечению отборного преимущества перед родительской клеткой, молекулы ДНК, необходимые в качестве меток для идентификации трансформированных клеток, отрицательные системы выбора, агенты для специфического связывания клетки (например, агенты для нацеливания на клетки), специфические факторы интернализации клетки и факторы транскрипции для усиления экспрессии вектора, а также факторы, позволяющие изготовлять вектор.

Средства поставки гена к клетке или ткани ш у1уо или ех у1уо включают (без ограничения) прямую инъекция простой ДНК, баллистические методы, опосредованную липосомой передачу, опосредованную рецептором передачу (комплекса ДНК-лиганд), электропорацию и осаждение фосфатом кальция, как описано, например, в пат. США № 4970154, АО 96/40958, пат. США № 5679559, пат. США № 5676954, и пат. США № 5593875, описания которых включены сюда в виде ссылок. Они также включают использование вирусного вектора типа ретровируса, аденовируса, адено-связанного вируса, вируса сифилиса, лентивируса, вируса папилломы или вируса герпеса простого, использование конъюгата ДНК-белок и

- 28 007203 использование липосомы. Использование векторов генной терапии описано, например, пат. США № 5672344, пат. США № 5399346, пат. США № 5631236 и пат. США № 5635399, содержания которых включены сюда в виде ссылок.

Ген, кодирующий пептид ΝΤΡ, можно вводит пациентам, путем внедрения некоторых клеток, которые проектировались генетически ех νΐνο для экспрессии и секреции пептида ΝΤΡ или их фрагментов, вариантов, гомологов или производных, используя для этого методы типа описанных здесь. Такие клетки могут быть животными или человеческими клетками и могут быть получены из собственной ткани пациента или из другого источника, человеческого или нечеловеческого. При желании, клетки могут быть иммобилизованы или они могут быть стволовыми клетками. Однако чтобы уменьшить шанс на иммунологическую ответную реакцию, предпочитают инкапсулировать клетки, уменьшая инфильтрацию в окружающие ткани. В качестве материала для инкапсуляции обычно используют биологически совместимые, полупроницаемые полимерные оболочки или мембраны, которые позволяют выделить белковый продукт(ы), но предотвращают разрушение клеток посредством иммунной системы пациента или другими вредными факторами окружающих тканей. Методы, используемые для мембранной инкапсуляции клеток, знакомы специалистам, а подготовка инкапсулированных клеток и их имплантация в организм пациентов может быть достигнута без неуместного экспериментирования. См., например, патенты США №№ 4892538; 5011472 и 5106627, содержания которых включены сюда в виде ссылок. Система инкапсуляции живых клеток описана в заявке ГСТ, νΟ 91/10425, описание которой включено сюда в виде ссылки. Методы формулирования разнообразных других форм с замедленным или регулируемым высвобождением медикамента, типа носителей липосом, биоэродируемых частиц или бусинок также известны специалистам и описаны, например, в патенте США № 5653975, который включен сюда в виде ссылки. Клетки, инкапсулированные или без герметизации, могут быть внедрены в подходящие ткани тела или органы пациента.

Следующие примеры приведены для иллюстрации данного изобретения. Следует, однако, отметить, что изобретение не должно быть ограничено определенными условиями или деталями, описанными в этих примерах. На протяжении всего описания данного изобретения, все ссылки на публично доступные документы, включая патенты США, специально включены в описание посредством ссылок.

В частности, это изобретение определенно включает в виде ссылки примеры, содержавшиеся в патентной заявке США № 10/092934, Методы лечения опухолей и родственных заболеваний, предусматривающие использование белков нервных нитей, которые показывают, что целевой белок ΑΌ7ο-ΝΤΡ - эффективный агент для уничтожения клеток, как ίη νίΐτο в глиоме и клеточных культурах нейробластомы, так и ΐη νΐνο в нормальной ткани мышцы грызуна, подкожной соединительной ткани и дермисе, а также в разнообразии различных опухолей человеческого и нечеловеческого происхождения, включая грудную карциному, карциному кожи и папиллому, карциному толстой кишки, глиому мозга и другие опухоли в модельных экспериментах с грызунами. Это изобретение также определенно включает в виде ссылок примеры, содержащиеся в патентных заявках США: № 10/153334, озаглавленной «Пептиды, эффективные в лечении опухолей и других заболеваний, требующих удаления или разрушения клеток»; № 10/198069, озаглавленной «Пептиды, эффективные в лечении опухолей и других заболеваний, требующих удаления или разрушения клеток»; и № 10/198070, озаглавленной «Пептиды, эффективные в лечении опухолей и других заболеваний, требующих удаления или разрушения клеток», которые показывают, что фрагменты ΑΌ7ο-ΝΤΡ, гомологичные ΑΩ7ο-ΝΤΡ белки, пептиды ΝΤΡ и белки ΝΤΡ - эффективные агенты для уничтожения клеток ίη νΐνο в нормальной ткани мышцы грызуна, подкожной соединительной ткани, дермисе и другой ткани.

Пример 1. Цель этого примера состояла в том, чтобы определить влияние пептида ΝΤΡ [122] № 1 на ткани, на участках инъекции.

Крысы самцы Спрагу-Долея (весом в пределах 300 г), были анестезированы эфиром и им был введен пептид ΝΤΡ[122] № 1 путем инъекции в простату после открытой хирургической визуализации простаты. Инъекции состояли из 300 мкл пептида ΝΤΡ[122] № 1, 1 мг/мл в ΡΒ8 рН 7.4. (1,0 мг/кг) (и = 8), контрольные инъекции только ΡΒ8 (и = 6) и контроля без инъекции (и = 2). После 72 ч крыс безболезненно умерщвляли. Предстательные железы были нарезаны, фиксированы в 10% буферированном формалине в течение 24 ч, залиты в парафин, приготовлены срезы и окрашены реагентом Η & Е. Для каждого животного целая железа простаты была залита и нарезана. Все окрашенные срезы были исследованы гистологически и измерены. Для каждой простаты были исследованы по крайней мере 4 гистологических среза, и для каждого гистологического среза были измерены два диаметра (Ό) поперечного сечения, в 90° друг от друга (общее количество > 8 измерений на каждую простату). Средний диаметр этих измерений для каждой простаты использовался для оценки объема, согласно формуле

Результаты: сокращение объема простаты у крыс, инъецированных пептидом ΝΤΡ[122] № 1, согласно проведенным измерениям, составляло в среднем 45% по сравнению с контролем (там не было никаких заметных различий между контролем, инъецированными только ΡΒ8 и контролем без инъекций). В простате подвергшихся лечению крыс наблюдались обширная потеря железистого эпителия,

- 29 007203 сглаживания и атрофии. Открытые инфузии в простату крысы пептида ΝΤΡ[122] № 1 в РВ8 рН 7.4, 1,0 мг/кг вызвали сокращение объема простаты > 40% по сравнению с простатой не подвергшихся лечению животных или и инъецированных только РВ8 в течение 72 ч.

Пример 2. Цель этого примера состояла в том, чтобы определить влияние пептида ΝΤΡ[112] № 1 на ткани в участках инъекции.

Крысы самцы Спрагу-Долея (весом в пределах 300 г) были анестезированы эфиром и им был введен пептид ΝΤΡ[112] № 1 путем инъекции в простату после открытой хирургической визуализации простаты. Инъекции состояли из 300 мкл пептида ΝΤΡ[112] № 1, 1 мг/мл в РВ8 рН 7.4 (1,0 мг/кг) (и = 4), контрольные инъекции только РВ8 (и = 3) и контроля без инъекции (η = 1). После 72 ч крыс безболезненно умерщвляли. Предстательные железы были нарезаны, фиксированы в 10% буферированном формалине в течение 24 ч, залиты в парафин, приготовлены срезы и окрашены реагентом Η & Е. Для каждого животного целая железа простаты была залита и нарезана. Все окрашенные срезы были исследованы гистологически и измерены. Для каждой простаты были исследованы по крайней мере 4 гистологических среза и для каждого гистологического среза были измерены два диаметра (Ό) поперечного сечения, в 90° друг от друга (общее количество > 8 измерений на каждую простату). Средний диаметр этих измерений для каждой простаты использовался для оценки объема, согласно формуле

РР

Контролем служили те же, что и в примере 1.

Результаты: как в вышеупомянутом примере 1, инъекция ΝΤΡ [112] пептида №1 вызвала существенное уменьшение клетки и атрофию в простате за 72 ч. Контрольные образцы показали отсутствие изменений или минимальные изменения, состоящие из слабых фокальных микро-воспалений, вызванных иглами.

Пример 3. Цель этого примера состояла в том, чтобы определить влияние описанных выше пептидов ΝΤΡ на ткани на участках инъекции.

Восьми нормальным крысам были введены через кожу и подкожно описанные выше ΝΤΡ [122] пептиды 1-8, ΝΤΡ [112] пептиды 1-7, ΝΤΡ [106] пептиды 1-7, ΝΤΡ [98] пептиды 1-6, ΝΤΡ [75] пептиды 15, ΝΤΡ [68] пептиды 1-4 и ΝΤΡ [61] пептиды 1-4, каждый в четырех различных центрах и в оконечности скелетной мышцы, каждый в двух различных центрах, в виде солевого раствора в количествах 100-400 мл при концентрациях 0,1-1 мг/мл путем инъекции из пластмассовых шприцов, снабженных иглами калибра 26 из нержавеющей стали.

Животных наблюдали в течение 24 ч и затем безболезненно умерщвляли. Индивидуальные центры инфильтрации были нарезаны, фиксированы в 10%-м формалине, залиты в парафин, окрашены и исследованы стандартными гистопатологическими методами.

Аналогичным группам контрольных крыс были введены: (1) 0,1% солевой раствор бычего сывороточного альбумина, (2) нормальная сыворотка человека, (3) физиологический раствор, (4) неинфекционные бактериальные белки и (5) очищенные контрольные пептиды. Затем крыс исследовали и умерщвляли, центры инфильтрации были нарезаны и обработаны, как это указано выше.

Результаты: инъекция ΝΤΡ [122] пептидов 1-8, ΝΤΡ [112] пептидов 1-7, ΝΤΡ [106] пептидов 1-7, ΝΤΡ [98] пептидов 1-6, ΝΤΡ [75] пептидов 1-5, ΝΤΡ [68] пептидов 1-4 и ΝΤΡ [61] пептидов 1-4 во всех примерах вызывала обширный острый некроз ткани на участках инъекции. Некроз очевиден в ткани мышцы, подкожной соединительной ткани и дермисе на участках, где был введен пептид ΝΤΡ. За 24 ч клетки кажутся бледными, сморщенными и некротическими и наблюдается инфильтрация в воспаленных клетках.

Некроз коррелирует с областями инъекции, и кажется, не распространяется далеко вне участка инъекции.

Кроме областей умеренного воспаления, контроль не показал никаких свидетельств некроза или потери клетки. В отличие от инъекций пептида ΝΤΡ, где целые области слоев ткани мышцы были некротические, контроль показал отсутствие изменений или минимальные изменения мышцы. У контрольных инъекций в местах инъекции наблюдались минимальные или умеренные острые воспаления и изменения, состоящие из фокальных микро-кровоизлияний, вызванных иглами.

Специалисту будет очевидно, что могут быть предложены различные модификации и изменения по методам и составам данного изобретения, не отступая от сущности и границ изобретения.

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

Claims (34)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Пептид ΝΤΡ, выбранный из группы, включающей:

   a) пептид, представленный аминокислотной последовательностью 8Εζ) Ю ΝΟ.8 (Пе-Акр-СИи-СИпУа1-Ееи-8ег-Аг§-11е-Еу8-Ееи-61и-11е-Еу8-Аг§-Су8-Ееи);

   b) пептид, представленный аминокислотной последовательностью 8ЕО Ю ΝΟ.9 (Мс1-Мс1-Уа1-Су5Тгр-А5п-Аг§-Р11с-СИу-Еу5-Тгр-Уа1-Туг-Р11с-Пс):

   c) пептид, представленный аминокислотной последовательностью 8Εζ) Ю N0.10 (8ег-А1а-11е-Р11е

   -30007203

   Αки-Ρ1е-С1у-Ρ^ο-Α^д-Τу^-^еи-Τу^-Η^к-С1у-Vа1);

   б) пептид, представленный аминокислотной последовательностью 8Εφ ΙΌ ΝΟ.11 (Ρ^ο-Ρ1е-Τу^-Ρ1еΕΌΐι-ΙΒ-ΕΌΐι-ναΙ-ΑΓβ-ΙΒ-ΙΒ^Γ-ΡΙκ-ΕΌΐι-ΙΒ);

   е) пептид, представленный аминокислотной последовательностью 8Εφ ΙΌ ΝΟ.12 (С1у-Акр-Ме1-С1иΑδρ-ναΙ-ΕΌΐι-ΕΌΐι-Αδη-ίΑδ-ΤΙΐΓ-ΕΌΐι-ΕΌΐι-ΕΛ-δ-ΑΓβ);

   ί) пептид, представленный аминокислотной последовательностью 8Εφ ΙΌ ΝΟ.13 (8е^-8е^-Α^д-Ρ1еΑ^д-Ρ1е-Τ^р-С1у-Α1а-^еи-Vа1-Сук-8е^-Меΐ-Αкр);

   д) пептид, представленный аминокислотной последовательностью 8Εφ ΙΌ ΝΟ.14 (8е^-Сук-Α^д-Ρ1е8е^-Α^д-Vа1-Α1а-Vа1-Τ1^-Τу^-Α^д-Ρ1е-I1е-Τ1^);

   к) пептид, представленный аминокислотной последовательностью 8Εφ ΙΌ ΝΟ.15 (^еи-^еи-Αки-I1еΡ^ο-8е^-Ρ^ο-Α1а-Vа1-Τ^р-Меΐ-Α1а-Α^д-Αки-Τ1^);

   ί) пептид, представленный аминокислотной последовательностью 8Εφ ΙΌ ΝΟ.16 (Ме1-А1а-С1н-8егΑΓ§-ΕΌΐ.ι-Τ1ΐΓ-Α1;·ι-Τ1κ^Γ-Α1;·ι^Γ-ΑΓ§-ν;·ι1-61η);

   _)) пептид, представленный аминокислотной последовательностью 8Εφ ΙΌ ΝΟ.17 (А1а-Пе-Ьеи-Ьеи8е^-С1и-Ρ^ο-Ρ^ο-^ук-С1и-^еи-С1у-^еи-Α^д-Α1а);

   k) пептид, представленный аминокислотной последовательностью 8Εφ ΙΌ ΝΟ.18 (ΡΐΌ-Α1α-Α8η-Τ1ΐΓΡΐΌ-ΕΌΐι-ΙΕ-Ρ1κ-να1-Ρ1κ^Γ-ΕΌΐι-61ιι-Α1α-61\·);

   l) пептид, представленный аминокислотной последовательностью 8Εφ ΙΌ ΝΟ.19 (Ρ^-Ηίκ-Ηίκ-ΙΚСук-С1и-Α1а-С1у-^еи-^ук-^еи-^еи-Τ1^-8е^-С1у);

   т) пептид, представленный аминокислотной последовательностью 8Εφ ΙΌ ΝΟ.20 (Α8ρ-ΡΐΌ-ΡΐΌ-Α1α8е^-Α1а-Ρ1е-С1и-8е^-Α1а-С1у-I1е-Τ1^-С1у-Vа1);

   η) пептид, представленный аминокислотной последовательностью 8Εφ ΙΌ ΝΟ.21 (8е^-Η^к-^еи-Τ1^С1и-Ρ^ο-Α1а-Αки-^еи-Αкр-^ук-^ук-I1е-Сук-8е^);

   o) пептид, представленный аминокислотной последовательностью 8Εφ ΙΌ ΝΟ.22 (А5и-С1у-С1у-8егСук-Τу^-Vа1-Α1а-С1и-Α1а-С1у-^еи-^ук-^еи-^еи-Α1а-8е^-Сук-Αки-Ρ^ο-8е^-^ук);

   p) пептид, представленный аминокислотной последовательностью 8Εφ ΙΌ ΝΟ.23 (Меΐ-Τ^р-Τ1^-^еи^ук-8е^-8е^-^еи-Vа1-^еи-^еи-^еи-Сук-^еи-Τ1^);

   с.|) пептид, представленный аминокислотной последовательностью 8Εφ ΙΌ ΝΟ.24 (Сук-8ег-Руг-А1аΡ1е-Меΐ-Ρ1е-8е^-8е^-^еи-Α^д-С1и-^ук-Τ1^-8е^);

   г) пептид, представленный аминокислотной последовательностью 8Εφ ΙΌ ΝΟ.25 (Ό1ι.ι-ΡΐΌ-61η-61ν^ук-Vа1-Ρ^ο-Сук-С1у-С1и-Η^к-Ρ1е-Α^д-I1е-Α^д);

   к) пептид, представленный аминокислотной последовательностью 8Εφ ΙΌ ΝΟ.26 (Ό1η-Α8η-Ενι.ι-ΡΐΌ61ιι-Ηί8-Τ1ΐΓ-61ι·ι-ό1ν-ΤΓρ-ΕΌΐ.ι-61ν^Γ-Εν8-ΤΓρ);

   ΐ) пептид, представленный аминокислотной последовательностью 8Εφ ΙΌ ΝΟ.27 (^еи-Τ^р-^еи-^еиΡ1е-Α1а-Vа1-Vа1-Ρ^ο-Ρ1е-Vа1-I1е-^еи-^ук-Сук);

   и) пептид, представленный аминокислотной последовательностью 8Εφ ΙΌ ΝΟ.28 (С11-Агд-Акр-8егС1и-^ук-Αки-^ук-Vа1-Α^д-Меΐ-Α1а-Ρ^ο-Ρ1е-Ρ1е);

   ν) пептид, представленный аминокислотной последовательностью 8Εφ ΙΌ ΝΟ.29 (Ьеи-Шк-Шк-ПеΑкр-8е^-I1е-8е^-С1у-Vа1-8е^-С1у-^ук-Α^д-Меΐ-Ρ1е);

   \у) пептид, представленный аминокислотной последовательностью 8Εφ ΙΌ ΝΟ.30 (С1и-Α1а-Τу^-Τу^Τ1^-Меΐ-^еи-Η^к-^еи-Ρ^ο-Τ1^-Τ1^-Αки-Α^д-Ρ^ο);

   х) пептид, представленный аминокислотной последовательностью 8Εφ ΙΌ ΝΟ.31 (Ьук-Пе-АБ-ШкСук-I1е-^еи-Ρ1е-Αки-С1и-Ρ^ο-Η^к-8е^-Ρ^ο-Α^д);

   у) пептид, представленный аминокислотной последовательностью 8Εφ ΙΌ ΝΟ.32 (8е^-Αки-8е^-Η^к8е^-Η^к-Ρ^ο-Αки-Ρ^ο-^еи-^ук-^еи-Η^к-Α^д-Α^д);

   ζ) пептид, представленный аминокислотной последовательностью 8Εφ ΙΌ ΝΟ.33 ^ег-Шк^ег-ШкΑки-Α^д-Ρ^ο-Α^д-Α1а-Τу^-I1е-^еи-I1е-Τ1^-I1е);

   аа) пептид, представленный аминокислотной последовательностью 8Εφ ΙΌ ΝΟ.34 (^еи-Ρ^ο-8е^-^ук^еи-^ук-^еи-Α^д-Τ1^-Η^к-8е^-С1и-8е^-Η^к-Η^к);

   ЬЬ) пептид, представленный аминокислотной последовательностью 8Εφ ΙΌ ΝΟ.35 (Αки-Ρ^ο-^еи8е^-Α^д-Τ1^-8е^-Αки-8е^-Τ1^-Ρ^ο-Τ1^-Αки-8е^-Ρ1е-^еи-Меΐ-Τ1^-8е^-8е^-^ук-Ρ^ο-Α^д);

   сс) пептид, представленный аминокислотной последовательностью 8Εφ ΙΌ ΝΟ.36 (8ег-8ег-8ег-ЬеиС1у-^еи-Ρ^ο-^ук-Сук-Τ^р-Αкр-Τу^-Α^д-Η^к-С1и);

   бб) пептид, представленный аминокислотной последовательностью 8Εφ ΙΌ ΝΟ.37 (Ьеи-Ьеи-8ег^еи-Α1а-^еи-Меΐ-I1е-Αки-Ρ1е-Α^д-Vа1-Меΐ-Α1а-Сук);

   ее) пептид, представленный аминокислотной последовательностью 8Εφ ΙΌ ΝΟ.38 (Τ1^-Ρ1е-^укбЫ-Шк-Пе-бШ-Ьеи-Агд-бШ-Ьук-Пе^ег-Пе^ай;

   ίί) пептид, представленный аминокислотной последовательностью 8Εφ ΙΌ ΝΟ.39 (ΡΓΟ-Агд-Ьук-ЬеиСук-Сук-Меΐ-С1у-Ρ^ο-Vа1-Сук-Ρ^ο-Vа1-^ук-I1е);

   дд) пептид, представленный аминокислотной последовательностью 8Εφ ΙΌ ΝΟ.40 (А1а-Ьеи-ЬеиΤ1^-I1е-Αки-С1у-Η^к-Сук-Τ1^-Τ^р-^еи-Ρ^ο-Α1а-8е^);

   11) пептид, представленный аминокислотной последовательностью 8Εφ ΙΌ ΝΟ.41 (Меΐ-Ρ1е-Vа1

   - 31 007203

   Ρйе-Сук-^еи-I1е-^еи-Αкη-Α^§-61и-^ук-I1е-^ук-61у);

   ίί) пептид, представленный аминокислотной последовательностью 8ЕО ΙΌ ΝΟ.42 (61у-Лкη-8е^-8е^Рйе-Рйе-Ьеи-Ьеи-8ег-Рйе-Рйе-Рйе-8ег-Рйе-61п);

   [ί) пептид, представленный аминокислотной последовательностью 8ЕО ΙΌ ΝΟ.43 ^кп-Сук-Суккк) пептид, представленный аминокислотной последовательностью 8Е0 ΙΌ ΝΟ.44 (Уа1-61и-СукΡйе-Τу^-Сук-^еи-Уа1-Αкр-^ук-Α1а-Α1а-Ρйе-61и-Сук-Τ^р-Τ^р-Ρйе-Τу^-8е^-Ρйе-Αкр-Τй^);

   11) пептид, представленный аминокислотной последовательностью 8Е0 ΙΌ ΝΟ.45 (Ме1-61и-Рго-Н1кΤЬ^-Vа1-Α1а-61η-Α1а-61у-Vа1-Ρ^ο-61η-Н^к-Αкр);

   тт) пептид, представленный аминокислотной последовательностью 8Е0 ΙΌ ΝΟ.46 (Ьеи-61у-8ег^еи-61η-8е^-^еи-^еи-Ρ^ο-Α^§-Ρйе-^ук-Α^§-Ρйе-8е^);

   пп) пептид, представленный аминокислотной последовательностью 8Е0 ΙΌ ΝΟ.47 (Сук-Ьеи-Пе-ЬеиΡ^ο-^ук-I1е-Τ^р-Αкр-Τу^-Α^§-Αкη-Меΐ-Αкη-ΤЬ^); и оо) пептид, представленный аминокислотной последовательностью 8Е0 ΙΌ ΝΟ.48 (Α1а-^еи-I1е-^укΑ^§-Αкη-Α^§-Τу^-ΤЬ^-Ρ^ο-61и-ΤЬ^-61у-Α^§-^ук-8е^), где пептид эффективен для удаления или разрушения клеточных элементов.
2. 2. Пептид, содержащий гомолог, производное, фрагмент или вариант пептида по п.1.
3. 3. Пептид, содержащий аминокислоту в Ό-конфигурации в аминокислотной последовательности пептида по п.1.
4. 4. Пептид, содержащий пептид по п.1 по крайней мере с 1-25 дополнительными аминокислотами, фланкирующими либо 3' , либо 5' конец пептида.
5. 5. Пептид, содержащий по крайней мере два пептида по п.1.
6. 6. Пептид, содержащий по крайней мере два повторения пептида по п.1.
7. 7. Миметик пептида по п.1.
8. 8. Пептид, содержащий пептид по п.1, слитый с антителом, фрагментом антитела или антителоподобной молекулой.
9. 9. Нуклеиновая кислота, кодирующая аминокислотную последовательность, соответствующую пептиду по п.1, а также его гомологам, фрагментам и вариантам.
10. 10. Композиция, содержащая одну или несколько нуклеиновых кислот по п.9 и фармацевтически приемлемый носитель.
11. 11. Способ лечения состояния млекопитающего, при котором требуется удаление или разрушение клеток, предусматривающий введение млекопитающему терапевтически эффективного количества пептида по п.1
12. 12. Способ по п.11, отличающийся тем, что пептид вводят путем, выбранным из группы, включающей пероральный, подкожный, внутрикожный, интраназальный, внутривенный, внутримышечный, интратекальный, внутриопухолевый, местный и трансдермальный путь введения.
13. 13. Способ по п.11, отличающийся тем, что способ осуществляют до, во время или после лечения млекопитающего, где лечение выбрано из группы, включающей хирургическое вмешательство, трансплантацию, имплантацию, химиотерапию, иммунотерапию, вакцинацию, термическую или электрическую абляцию, криотерапию, лазерную терапию, фототерапию, генную терапию и радиацию.
14. 14. Способ по п.11, где состояние представляет собой доброкачественную или злокачественную опухоль ткани, выбранной из группы, включающей легкие, молочные железы, желудок, поджелудочную железу, простату, мочевой пузырь, костную ткань, яичники, кожу, почки, синус, толстую кишку, кишечник, прямую кишку, пищевод, сердце, селезенку, слюнные железы, кровь, головной мозг и его оболочки, спинной мозг и его оболочки, мышцы, соединительную ткань, надпочечник, паращитовидную железу, щитовидную железу, матку, яички, гипофиз, репродуктивные органы, печень, желчный пузырь, глаза, уши, нос, горло, миндалины, рот, лимфатические узлы и лимфатическую систему.
15. 15. Способ по п.11, где состояние представляет собой гиперплазию, гипертрофию или чрезмерный рост ткани, выбранной из группы, включающей легкие, молочные железы, желудок, поджелудочную железу, простату, мочевой пузырь, костную ткань, яичники, кожу, почки, синус, толстую кишку, кишечник, прямую кишку, пищевод, сердце, селезенку, слюнные железы, кровь, головной мозг и его оболочки, спинной мозг и его оболочки, мышцы, соединительную ткань, надпочечник, паращитовидную железу, щитовидную железу, матку, яички, гипофиз, репродуктивные органы, печень, желчный пузырь, глаза, уши, нос, горло, миндалины, рот, лимфатические узлы и лимфатическую систему.
16. 16. Способ по п.11, где состояние представляет собой вирусное, бактериальное или паразитическое изменение ткани, выбранной из группы, включающей легкие, молочные железы, желудок, поджелудочную железу, простату, мочевой пузырь, костную ткань, яичники, кожу, почки, синус, толстую кишку, кишечник, прямую кишку, пищевод, сердце, селезенку, слюнные железы, кровь, головной мозг и его оболочки, спинной мозг и его оболочки, мышцы, соединительную ткань, надпочечник, паращитовидную железу, щитовидную железу, матку, яички, гипофиз, репродуктивные органы, печень, желчный пузырь, глаза, уши, нос, горло, миндалины, рот, лимфатические узлы и лимфатическую систему.
17. 17. Способ по п.11, где заболевание представляет собой порок развития ткани, выбранной из груп

    - 32 007203 пы, включающей легкие, молочные железы, желудок, поджелудочную железу, простату, мочевой пузырь, костную ткань, яичники, кожу, почки, синус, толстую кишку, кишечник, прямую кишку, пищевод, сердце, селезенку, слюнные железы, кровь, головной мозг и его оболочки, спинной мозг и его оболочки, мышцы, соединительную ткань, надпочечник, паращитовидную железу, щитовидную железу, матку, яички, гипофиз, репродуктивные органы, печень, желчный пузырь, глаза, уши, нос, горло, миндалины, рот, лимфатические узлы и лимфатическую систему.
18. 18. Способ по п.11, отличающийся тем, что тканью является лимфоидная ткань.
19. 19. Способ по п.11, отличающийся тем, что состоянием является тонзилярная гипертрофия.
20. 20. Способ по п.11, отличающийся тем, что состоянием является гиперплазия простаты.
21. 21. Способ по п.11, отличающийся тем, что состоянием является псориаз.
22. 22. Способ по п.11, отличающийся тем, что состоянием является экзема.
23. 23. Способ по п.11, отличающийся тем, что состоянием является дерматоз.
24. 24. Способ по п.11, отличающийся тем, что состоянием является косметическое изменение ткани.
25. 25. Способ по п.14, отличающийся тем, что тканью является ткань кожи, глаз, ушей, носа, горла, рта, мышц, соединительной ткани, волос или молочных желез.
26. 26. Способ по п.11, отличающийся тем, что состоянием является заболевание сосудов.
27. 27. Способ по п.11, отличающийся тем, что состоянием является геморрой.
28. 28. Способ по п.11, отличающийся тем, что состоянием является варикозное расширение вен.
29. 29. Способ по п.28, отличающийся тем, что состоянием является атеросклероз или артериосклероз.
30. 30. Способ по п.11, отличающийся тем, что состояние выбрано из группы, включающей воспаление, аутоиммунное заболевание, нарушение обмена веществ, наследственное/генетическое заболевание, травму или физическое повреждение, недостаток питания, инфекционное заболевание, амилоидоз, фиброз, болезнь накопления, врожденный порок развития, ферментопатию, отравление, интоксикацию, экологическую болезнь, лучевую болезнь, эндокринное заболевание, дегенеративное заболевание или механическую болезнь.
31. 31. Способ по п.11, отличающийся тем, что пептид конъюгирован, присоединен или связан с молекулой, выбранной из группы, включающей антитело, фрагмент антитела и антителоподобную связывающую молекулу, где указанная молекула обладает повышенной аффинностью связывания с опухолью или другой мишенью по сравнению с другими клетками.
32. 32. Способ по п.11, отличающийся тем, что пептид представляет собой часть единичной новой клонированной рекомбинантной молекулы, состоящей из пептида и молекулы, выбранной из группы, включающей антитело, фрагмент антитела и антителоподобную связывающую молекулу, где молекула обладает повышенной аффинностью связывания с опухолью или другой мишенью по сравнению с другими клетками.
33. 33. Способ по п.11, отличающийся тем, что состоянием является стеноз, рестеноз, окклюзия или блокирование артерии или стента, помещенного или имплантированного в артерию.
34. 34. Способ профилактики или ингибирования стеноза, окклюзии или блокирования стента, предусматривающий покрытие стента, по меньшей мере, терапевтически эффективным количеством пептида по п.1.

    - 33 007203

    ΝΤΡ[122] [8Εζ) Π)ΝΟ. 1]

    I Мее-МеЬ-Уа1-Суз-Тгр-А5п-Агд-Р1-1е-(31у-Ьуз-

    ММУСМЦКРСК

    II Тгр-Уа1-Туг-Р}1е-11е-Зег-А1а-11е-Р11е-Азп-

    ΜνΥΡΙΒΑΙΡΝ

    21 РЪе-(31у-Рго-Агд-Туг-Ьеи-Туг-Н18-С1у-Уа1ΡΘΡΚΥΣΥΗΘν

    31 Рго-РЪе-Туг-РЕе-Ьеи-Ые-Ьеи-'УаХ-Агд-Иеρργρι,ιι,νκι

    41 11е-Зег-РЪе-1>еи-11е-С1у-Азр-МеЕ-(31и-Азр13РЬ1СРМЕО

    51 Уа1-Ьеи-Ьеи-Азп-Суз-Т11г-Ьеи-Ьеи-Ьуз-АгдУЬЬИСТЬЬКК

    61 5ег-5ег-Агд-РЬе-Агд-Р11е-Тгр-(31у-А1а-Ьеи3 ЗНРКРМСАЬ

    71 Уа1-Суз-Зег-МеЕ-Азр-5ег-Суз-Агд-Рке-Зег УСЗМРЗСКР 8

    81 Агд-Уа1-А1а-Уа1-ТЬг-Туг-Агд-РЬе-11е-ТЬгκνΑνΤΥΚΡΙ Т

    91 Ееи-Ьеи-Азп-11е-Рго-Зег-Рго-А1а-57а1-ТхрЬЬМ1РЗРАУИ

    101 МеЕ-А1а-Агд-Азп-Т11г-11е-Азр-С1п-С1п-Уа1ΜΑΚΝΤΙΌΩΟν

    III 11еи-Зег-Агд-11е-Ьуз-Ьеи-С1и-11е-Ьуз-Агд'

    ЬЗК1КЬЕ1КК

    121 Суз-Ьеи

    С Ь

    Фиг. 1

    ΝΤΡ[112] [ΞΕφΙϋΝΟ. 2]

    I МеЕ-А1а-С1п-Зег-Агд-Ьеи-ТИг-А1а-ТЕе-Зег·

    МАСЗКЬТАТЗ

    II А1а-Зег-Агд-Уа1-С1п-А1а-11е-Ьеи-Ьеи-5ег-

    АЗКУ0А1ЬЬЗ

    21 . 61п-Рго-Рго-Ьуз-С1п-Ьеи-С1у-Ьеи-Агд-А1аОРРКОЬСЬКА

    31 Рго-А1а-Азп-ТПг-Рго-Ьеи-11е-РПе-Уа1-РПеΡΑΝΤΡ1>ΙΡνΡ

    41 Зег-Ьеи-<31и-А1а-С1у-РИе-Н1з-Н1з-11е-СузЗБЕАСРНН1С

    51 С1п-А1а-(31у-Ьеи-Ьуз-Ьеи-Ьеи-Т11г-Зег-С1уОАСЬКЬЬТЗС

    61 Азр-Рго-Рго-А1а-Зег-А1а-Р11е-С1п-Зег-А1аΌΡΡΑ3ΑΡ03Α

    71 01у-11е-ТЬг-61у-Уа1-8ег-Н18-Ьеи-Т11Г-С1пС1Т6У5НЬТ0

    81 Рго-А1а-Азп-Ьеи-Азр-Ьуз-Ьуз-11е-Суз-ЗегΡΑΝΕυΚΚΙΟΒ

    91 Азп-С1у-С1у-Зег-Суз-Туг-Уа1-А1а-С1п-А1аИССЗСУУАОА

    101 С1у-Ьеи-Ьуз-Ьеи-Ьеи-А1а-5ег-Суз-Азп-РгоСЬКЬЬАЗСЫР

    III Зег-Ьуз

    3 К

    Фиг. 2

    - 34 007203

    ΝΤΡ[106] [8Ε<3 Π) ΝΟ. 3]

    I Мек-Тгр-ТЬг-Ьеи-Ьуз-Зег-Зег-Ьеи-Уа1-Ьеи·

    ММТЬКЗЗЬУЬ

    II Ьеи-Ьеи-Суз-Ьеи-Т11г-Суз-5ег-Туг-А1а-РЬе·

    ЬЬСЬТСЗУАР

    21 МеЬ-РЬе-Зег-Зег-Ьеи-Агд-<31п-Ьуз-Т11г-Зег· МРБЗЬКОКТЗ

    31 61и-Рго-С1п-С1у-Ьуз-\Га1-Рго-Суз-С1у-С1и· ΕΡβΟΚνΡΌΟΕ

    41 Нхз-Р11е-Агд-11е-Агд-31п-Азп-Ьеи-Рго-61и· НРВ1КСЫЬРЕ

    51 Нхз-Ткг-С1п-С1у-Тгр-Ьеи-С1у-Зег-Ьуз-Тгр· нтрсзиьззкте

    61 Ьеи-Тгр~Ъеи-11еи-Р1ге~А1а-’7а1-7а1--Рго-Р11е· ЬЮЬЬРАУУРР

    71 Уа1-11е-Ьеи-Ьуз-Суз-е1п-Агд-Азр-Зег-е1и· У1ЬКС0’ЕОЗЕ

    81 Ьуз-Азп -Ьу з - Уа 1 - Аг д -Ме Ь- А1 а-Рго- РЬе- РЬе

    ΚΝΚνΚΜΑΡΡΓ

    91 Ьеи-Н18-Нх8-11е-Азр-5ег-11е-Зег~С1у-Уа1·

    Ι,ΗΗΙϋ5Ι5αν

    101 Зег-С1у-Ьуз-Агд-Мее-Рке

    5 С К К Μ Р

    Фиг. 3

    ΝΤΡ[98] [8Ε0ΙΟΝΟ. 4]

    I С1и-А1а-Туг-туг-ТЬг-МеЬ-Ьеи-Нхз-Ьеи-Рго-

    ЕАУУТМЬНЬР

    II ТЬг-Т11г-А8П-Агд-Рго-Ьуз-11е-А1а-Нхз-Суз

    ТТЫКРК1АНС

    21 11е-Ьеи-Рйе-Азп-01п-Рго-Нхз-Зег-Рго-Агд· ΙΒΡΝ0ΡΗ3ΡΚ

    31 Зег-Азп-Зег-Нхз-Зег-Нхз-Рго-Азп-Рго-ЬеиΞΝ5Η3ΗΡΝΡΙ,

    41 Ъуз-Ьеи-Нхз-Агд-Агд-Зег-Нхз-Зег-Нхз-АзпКЬНККЗНЗНЫ

    51 Агд-Рго-Агд-А1а-Туг-11е-Ьеи-11е-Т11г-11е·

    К Р К А У I Ь I Т I

    61 Ьеи-Рго-Зег-Ьуз-Ьеи-Ьуз-Ьеи-Агд-ТЬг-НхзЬРЗКЬКЬКТН

    71 5ег-С1п-5ег-Нхз-Нхз-Азп-Рго-Ьеи-Зег-Агд303ΗΗΝΡΣ5Κ

    81 Т11г-Зег-Азп-Зег-Т11г-Рго-ТЬг-Азп-5ег-РйеΤ3Ν5ΤΡΤΝ3Ρ

    91 Ьеи-Мей-ТИг-Зег-Зег-Ьуз-Рго-Агд ЬМТЗЗКРК

    Фиг. 4

    - 35 007203

    ΝΊΤ[75] [3Ε4ΙΌΝΟ. 5]

    I Зег-Зег-Зег-Ьеи-СХу-Ьеи-Рго-Ьуз-Суз-Тгр·

    ЗЗЗЬСЬРКСУ»

    II Азр-Туг-Агд-Нгз-СХи-Ьеи-Ьеи-Зег-Ьеи-АХа·

    ΏΥΚΗΕ1ιΙι5ΙιΑ

    21 Ьеи-Ме6.-11е-Азп-РЪе-Агд-Уа1-Ме£.-А1а-Су5 ЬМ1ИРКУМАС

    31 ТЬг-РЬе-Ьуз-С1п-Н1з-11е-С1и-1₁еи-Агд-С1п· ΤΡΚΟΗΙΕΕΠΰ

    41 Ьуз-11е-5ег-11е-Уа1-Рго-Агд-Ъуз-Ьеи-Суз· К131УРККЬС

    51 Суз-МеЕ-СХу-Рго-УаХ-Суз-Рго-УаХ-Ъуз-1Хе· ΟΜΘΡνσρνκι