BRPI0213786B1

BRPI0213786B1 - peptídeos efetivos no tratamento de tumores e outras condições que requerem a remoção ou destruição de células

Info

Publication number: BRPI0213786B1
Application number: BRPI0213786-0A
Authority: BR
Inventors: Gemmell Jack; A Averback Paul
Original assignee: Nymox Corp
Priority date: 2001-11-16
Filing date: 2002-11-18
Publication date: 2019-01-02
Also published as: US20030166569A1; DE60213274D1; KR20120123573A; EP1442058B1; AU2002342463B2; JP5357196B2; IL161591A0; NO332842B1; BRPI0213786B8; PL207591B1; DK1442058T3; KR101375026B1; NO20041844L; JP2005521383A; IL161591A; CA2467053C; DE60213274T2; US8293703B2; CN100509846C; KR20050044471A

Abstract

"peptídeos efetivos no tratamento de tumores e outras condições que requerem a remoção ou destruição de células". a invenção é direcionada a métodos de tratamento de condições que requerem remoção ou destruição de células danosas ou indesejadas em um paciente, tal como tumores benignos e malignos, utilizando compostos contendo ou baseados em peptídeos compreendendo uma parte da seqüência de amino ácidos de uma proteína em cadeia neural.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para “PEPTÍDEOS EFETIVOS NO TRATAMENTO DE TUMORES E OUTRAS CONDIÇÕES QUE REQUEREM A REMOÇÃO OU DESTRUIÇÃO DE CÉLULAS”.

Este pedido reivindica prioridade ao Pedido

Provisório Número de Série 60/331.447, intitulado “Peptídeos Efetivos no Tratamento de Tumores e Outras Condições que Requerem a Remoção ou Destruição de Células”, depositado em φ 16 de Novembro de 2001, a revelação do qual sendo aqui ío incorporada por referência em sua totalidade.

REVELAÇÃO DA INVENÇÃO / 1 · Campo da Invenção v A presente invenção é dirigida a métodos de tratamento de condições que requerem remoção ou destruição de elementos celulares, tal como tumores benignos e malignos em humanos, usando-se compostos baseados em peptídeos -gty compreendendo sequências de amino ácidos correspondentes a, similares ou homólogas à parte da seqüência de amino ácido de proteínas de cadeias neurais. O método inclui, mas não é limitado a, administrar os compostos intramuscularmente, oralmente, intravenosamente, intratecalmente, intratumoralmente, intranasalmente, topicamente, transdermalmente, etc, ou sozinho ou conjugado a um veículo.

2. Descrição da Técnica Relacionada

A essência de muitos tratamentos médicos e procedimentos envolve a remoção ou destruição de tecido danoso • · ·· ··· • · · · · · • · · · · · • · · · · · ou indesejado. Exemplos de tais tratamentos importantes incluem a remoção cirúrgica de crescimentos cancerosos, a destruição de tumores metatásticos através de quimioterapia, e a redução de hiperplasia glandular (por exemplo, próstata). Outros exemplos 5 incluem a remoção de cabelo facial indesejado, a remoção de verrugas, e a remoção de tecido gorduroso indesejado.

Existe uma necessidade óbvia de um agente efetivo que possa destruir e, conseqüentemente, facilitar a remoção de ou inibir o crescimento adicional de células e tecidos to danosos ou indesejados, mas que tenham principalmente efeitos locais e mínimos, ou nenhuma toxicidade sistêmica.

As proteínas de cadeias neurais e suas moléculas relacionadas são uma classe de tais agentes, conforme revelado no Pedido de Patente dos Estados Unidos Série N°

10/092,934, intitulado “Métodos de Tratamento de Tumores e

Condições Relacionadas Utilizando Proteínas de Cadeia Neural”, a revelação do qual sendo aqui incorporada por referência em sua totalidade. Certos fragmentos de proteínas de cadeia neural e proteínas relacionadas são revelados como úteis 20 no tratamento de tumores e outras condições que requerem remoção ou destruição de células nos Pedidos de Patente dos Estados Unidos: N° 10/153,334, intitulado “Peptídeos Efetivos no Tratamento de Tumores e Outras Condições que Requerem a Remoção ou Destruição de Células”', N° 10/198.069, intitulado:

“Peptídeos Efetivos no Tratamento de Tumores e Outras Condições que Requerem a Remoção ou Destruição de Células”’,

Ν° 10/198.070, intitulado: “Peptídeos Efetivos no Tratamento de Tumores e Outras Condições que Requerem a Remoção ou Destruição de Células, as revelações dos quais sendo aqui incorporadas aqui por referência em sua totalidade.

Aqui estão revelados certos outros fragmentos de proteínas de cadeia neural que também são úteis no tratamento de tumores e outras condições que requerem a remoção ou destruição de células.

O câncer é uma anormalidade nos mecanismos to reguladores internos da célula que resulta no crescimento descontrolado e reprodução da célula. As células normais produzem os tecidos, e quando estas células perdem sua capacidade de se comportarem como uma unidade específica, controlada e coordenada (reversão para um estado geral ou mais 15 primitivo), o defeito induz a desarranjos dentre a população das células. Quando isto ocorre, um tumor é formado.

Os supercrescimentos benignos do tecidos são anormalidades em que é desejável remover células de um organismo. Os tumores benignos são proliferações celulares que 20 não criam metástases através do corpo, mas, contudo, causam sintomas de doenças. Tais tumores podem ser letais se eles estão localizados em áreas inacessíveis em órgãos, tal como o cérebro. Existem tumores benignos de órgãos incluindo pulmão, cérebro, pele, pituitária, tireóide, córtex da glândula suprarenal e medula, 25 ovário, útero, testículo, tecido conectivo, músculo, intestino,

ouvido, nariz, garganta, amídala, boca, fígado, vesícula biliar, bexiga, pâncreas, próstata, coração, e outros órgãos.

A cirurgia freqüentemente é a primeira etapa no tratamento do câncer. O objetivo da cirurgia varia. Algumas vezes _f 5 ela é utilizada para remover o máximo possível do tumor evidente, ou pelo menos para diminuir sua massa (remover a maior massa de tumor de maneira que seja menor que o necessário para ser tratado por outros meios). Dependendo do tipo • de câncer e da localização, a cirurgia também pode prover algum alívio sintomático ao paciente. Por exemplo, se um cirurgião puder remover uma grande porção de um tumor de cérebro expandido, a pressão dentro da cabeça poderá diminuir, levando a melhora nos sintomas do paciente.

Nem todos os tumores são acessíveis à cirurgia.

Alguns podem estar localizados em partes do corpo que torna impossível removê-los completamente. Exemplos destes podem φ ser tumores na base do cérebro (uma parte do cérebro que controla a respiração), ou um tumor que tenha crescido em e ao redor de um grande vaso sanguíneo. Nestes casos, o papel da cirurgia é limitado devido ao alto risco associado com a remoção do tumor.

Em alguns casos, a cirurgia não é usada para diminuir a massa do tumor, pois ela simplesmente não é necessária. Um exemplo é o linfoma de Hodgkin, um câncer dos 25 nódulos linfáticos que responde muito bem à combinações de quimioterapia e terapia de radiação. No linfoma de Hodgkin, a cirurgia é raramente necessária para alcançar a cura, mas quase sempre usada para estabelecer um diagnóstico.

A quimioterapia é outra forma comum de tratamento de câncer. Essencialmente, ela envolve o uso de

medicações (usualmente administradas pela boca ou por injeção) que especificamente atacam rapidamente as células que estão se dividindo (tais como aquelas encontradas no tumor) em toda parte do corpo. Isso torna a quimioterapia útil no tratamento de cânceres em que já tenham ocorrido metástases, bem como em tumores que tenham uma alta probabilidade de disseminação através do sangue e sistemas linfáticos, mas não são evidentes além do tumor primário. A quimioterapia também ser usada para aumentar a resposta de tumores localizados para cirurgia e terapia de radiação. Este é o caso, por exemplo, de alguns cânceres da cabeça e pescoço.

Desafortunadamente, outras células no corpo humano que normalmente também se dividem rapidamente (tais como o revestimento do estômago e cabelo) também podem ser afetadas pela quimioterapia. Por esta razão, muitos agentes quimioterápicos induzem a efeitos colaterais indesejados tais como náuseas, vômitos, anemia, perda de cabelos ou outros sintomas. Estes efeitos colaterais são temporários, e existem medicações que podem proporcionar uma ajuda para aliviarem muitos destes efeitos colaterais. Como nosso conhecimento tem continuamente crescido, os pesquisadores têm desenvolvido novos agentes quimioterápicos que não são somente melhores • ·· ··· · · · ♦ · • « 4 · · · ····· * · » » ···♦·· ··« · · · · · · · · ·· ··· ··· ·· ♦ ·· ·· para matar células cancerígenas, mas também tem poucos efeitos colaterais para o paciente.

A quimioterapia é administrada aos pacientes _t em uma variedade de modos. Algumas incluem pílulas e outras , 5 são administradas por injeção intravenosa ou outra injeção. Para quimioterapia injetável, um paciente vai ao consultório do médico ou ao hospital para tratamento. Outros agentes quimioterápicos requerem infusão continuada na corrente sanguínea, 24 horas por φ dia. Para estes tipos de quimioterapia, um procedimento cirúrgico menor é realizado para implantar uma pequena bomba a ser usada pelo paciente. A bomba então lentamente administra a medicação.

Em muitos casos, um conector permanente é colocado na veia do paciente para eliminar o requerimento de picadas repetidas de agulha.

A terapia de radiação é uma outra arma comumente usada no combate contra o câncer. A radiação mata o φ câncer pela danificação do DNA dentro das células tumorais. A radiação é liberada de diferentes modos. O mais comum compreende em apontar um feixe de radiação ao paciente em uma maneira altamente precisa, focalizando o tumor. Para isto, o paciente deita em uma mesa e o feixe move-se ao redor dele/dela.

O procedimento demora alguns minutos, mas pode ser feito diariamente por várias semanas (dependendo do tipo de tumor), para alcançar uma particular dose prescrita total.

Outro método de radiação algumas vezes empregado, denominado braquiterapia, envolve pegar pelotas ·« ··· ·· ·♦ * ·····»·· ·· ·· • · · · « · ·· · · · · · • « · β ·· · · ·· ··· ·· « » · · · ······ • · * · φ · · · · · · · ··* ·· >*· ·*« ·· · ·· ··

Μ radioativas (grãos) ou fios, e implantá-los no corpo na área do tumor. Os implantes podem ser temporários ou permanentes. Para implantes permanentes, a radiação nos grãos decai após um período de dias ou de semanas de maneira que o paciente não seja radioativo. Para implantes temporários, a dose total de radiação é usualmente liberada em alguns dias, e o paciente deve permanecer no hospital durante este tempo. Para ambos os tipos de braquiterapia, a radiação geralmente é liberada para uma área φ alvejada muito restrita para garantir controle local sobre o câncer (conforme oposto ao tratamento do corpo inteiro, como a quimioterapia faz).

Alguns pacientes altamente selecionados podem ser encaminhados para transplantes da medula óssea. Este procedimento é usualmente realizado ou pelo fato do paciente ter um câncer que é particularmente agressivo, ou pelo fato dele ter um câncer que reincidiu após ter sido tratado com terapia φ convencional. O transplante da medula óssea é um procedimento complicado. Existem muitos tipos, e eles podem variar em seu potencial causando efeitos colaterais e cura. Muitos transplantes são realizados em centros especiais, e, em muitos casos, seu emprego é considerado como uma investigação para fins de pesquisa.

Um número de outras terapias existe, embora muitas delas estão ainda sendo exploradas em tentativas clínicas e ainda não se tornaram cuidados padrões. Exemplos incluem o uso de imunoterapia, anticorpos monoclonais, fatores antiangiogenéticos e terapia genética.

Imunoterapia: Existem várias técnicas desenvolvidas para ajudar o próprio sistema imunológico do 5 paciente a lutar contra o câncer, totalmente distintas da radiação ou quimioterapia. Muitas vezes, para alcançar as finalidades os pesquisadores injetam no paciente uma vacina especialmente derivada.

• Anticorpos Monoclonais: Estes são anticorpos designados para atacarem as células cancerosas (e não células normais) levando vantagem das diferenças entre células cancerosas e não cancerosas em suas características anitogênicas/ ou outras. Os anticorpos podem ser administrados ao paciente sozinhos ou conjugados a vários compostos citotóxicos, ou em 15 forma radioativa, tal que o anticorpo preferencialmente alveja as células cancerosas, liberando, desse modo, o agente tóxico ou φ radioativo às células desejadas.

Fatores Anti-Angiogeneses: Como as células de câncer rapidamente se dividem e os tumores crescem, eles podem 20 prontamente causar supercrescimento em seu suprimento sanguíneo. Para compensar isto, alguns tumores segregam uma substância que se acredita ajuda a induzir o crescimento de vasos sanguíneos em suas vizinhanças, provendo, desse modo, as células de câncer com uma fonte vascular de nutrientes. Terapias 25 experimentais têm sido desenvolvidas para impedir o crescimento de vasos sangüíneos em tumores.

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Terapia Genética: 0 câncer é o produto de uma série de mutações que resultam na produção de uma célula cancerosa e sua excessiva proliferação. Os cânceres podem ser tratados por introdução de genes nas células cancerosas que podem agir tanto para reprimir como para paralizar a proliferação do câncer, ativando os mecanismos celulares programados pela célula para destruir a célula, aumentar o reconhecimento imune das células, ou expressar um pró-fármaco que converte a um • metabólito tóxico, ou a uma citocina que inibe o crescimento tumoral.

Os tumores benignos e mal-formações também podem ser tratados por uma variedade de métodos incluindo cirurgia, radioterapia, terapia de drogas, ablação térmica ou elétrica, crioterapia, e outros. Embora os tumores benignos não sofram metástases, eles podem crescer muito, e eles podem voltar.

A extirpação cirúrgica de tumores benignos tem todas as .0 dificuldades e efeitos colaterais das cirurgias em geral, e muitas das vezes podem ser repetidamente realizadas para alguns tumores benignos, tais como para adenomas pituitários, meningeomas do cérebro, hiperplasia prostática, e outros.

Outras condições envolvendo elementos celulares indesejados existem onde remoção celular seletiva é desejável. Por exemplo, doença do coração e derrame cerebral são tipicamente causadas por aterosclerose, que é uma lesão proliferativa de fibroadiposos e elementos do músculo liso modificado que corrompem as paredes do vaso sanguíneo, estreitam a passagem no vaso, constrigem o fluxo de sangue, predispõe a focos de coágulos de sangue, e, por fim, levam ao bloqueio e infarto. Vários tratamentos para aterosclerose incluem enxertos de derivação; enxertos artificiais; angioplastia com re5 canalização, curetagem, radiação, laser, ou outras remoções; fármaco-terapia para inibir aterosclerose através da redução de lipídios; terapias anti-coagulante; e medidas gerais de dietas, r

exercícios e estilo de vida. E necessário um método de remoção • de lesões de aterosclerose sem o risco e efeitos colaterais dos procedimentos cirúrgicos.

Outros exemplos de elementos celulares indesejados onde a remoção celular seletiva é desejável incluem crescimentos virais induzidos, tais como verrugas. Um outro exemplo são as massas inflamatórias hipertróficas encontradas nas condições inflamatórias, e escaras hipertróficas ou quelóides.

Ainda outros exemplos são encontrados no contexto cosmético φ tais como remoção de cabelos indesejados, por exemplo, cabelo facial, ou para diminuição de áreas de tecidos não desejadas para aplicações cosméticas, tal como na pele facial e tecidos conectivos, ou nas peles e tecidos conectivos das extremidades.

Outros exemplos de elementos celulares indesejados onde remoção celular seletiva ou a inibição de proliferação celular é desejável, incluem estenose e restenose de qualquer artéria, válvula ou canal no sistema circulatório incluindo, mas não limitado a, válvulas (por exemplo., estenose aórtica que envolve estreitamento do orifício da válvula aórtica), • · ····« · · · ······ í** * ; j .· • ··· ·· ··· »·· ·· · ·· ·· artérias coronárias (por exemplo., esclerose ostial coronária que envolve estreitamento das bocas das artérias coronárias), artérias carótidas, e artérias renais. Outros exemplos incluem a inibição ou remoção de crescimento ou acúmulo celular indesejado causando a oclusão parcial ou completa de dispositivos médicos tais como extensores colocados ou implentados dentro do vaso sangüíneo para tratamento de estenose, estrituras ou aneurismas neste, ou dentro do tratao urinário e nos dutos de bile.

• Ainda outros exemplos se tornarão prontamente evidentes para aqueles técnicos no assunto. Em todos ou na maior parte destes exemplos, existe a necessidade de tratamentos que podem remover ou destruir os elementos celulares não desejados sem os riscos e efeitos colaterais das terapias convencionais, ou para remover os elementos celulares não desejados com mais precisão.

As proteínas em cadeia neurais (NTP) são uma .φ família de proteínas de cérebro caracterizadas recentemente. Um membro desta família, AD7c-NTP é uma fosfoproteína associada com membrana de -41 kD com funções relacionadas ao brotamento neurítico (de la Monte e outros., J. Clin. Invest., 100: 3093-3104 (1997); de la Monte e outros., Alz. Rep., 2: 327-332 (1999); de la Monte SM e Wands JR, Journal of Alzheimer’s Disease, 3: 345-353 (2001). O gene que codifica AD7c-NTP e a seqüência de proteína diagnosticada para AD7c-NTP foram identificados e descritos (de la Monte e outros., J. Clin. Invest., 100: 3093-3104 (1997)). Em adição as espécies -41 kD, outras • · espécies de proteína em cadeia neural (-26 kD, -21 kD, -17 kD e -15 kD) foram identificadas e associadas com tumores neuroectodermal, astrocitomas e gliobastomas, e com dano devido a hipoxia, isquemia ou enfarte cerebral (Xu e outros., Câncer 5 Research, 53: 3823-3829 (1993); de la Monte e outros., R.

Neuropathol. Exp. Neurol., 55(10):1038-50 (1996), de la Monte e outros, J. Neurol. Sei., 138 (1-2):26-35 (1996); de la Monte e outros., J. Neurol. Sei., 135 (2):118-25 (1996); de la Monte e Φ outros., J. Clin. Invest., 100:3093-3104 (1997); e de la Monte e 10 outros., Alz. Rep., 2:327-332 (1999)).

Espécies de proteína em cadeia neural foram descritas e reivindicadas nas Patentes dos Estados Unidos 5.948.634; 5.948.888 e 5.830.670, todas para “Expressão de Gene de Proteína em Cadeia Neural e Detecção de Doença de 15 Alzheimer”, e Patente dos Estados Unidos 6.071.705 para “Método de Detecção de Doença ou Disfunção Neurológica”. As .φ revelações destas patentes são especificamente incorporadas por referência em sua totalidade. Conforme descrito aqui, a NTP é regulada e produzida durante a morte da célula. Desse modo, 20 células mortas e células nervosas morrendo são descritas como sobre-produzindo NTP, e conseqüentemente, sua presença indica a morte das células nervosas e a formação de doença de Alzheimer (AD).

Outras espécies de proteína de cadeia neural 25 foram identificadas como outros produtos do gene AD7c-NTP (por exemplo, uma proteína de 112 amino ácidos descrita no

Acesso de banco de dados NCB1 Entrez-Proteína #XP~032307 PID gl5928971), ou como sendo similar às proteínas em cadeia neural (por exemplo uma proteína de 106 amino ácidos no Acesso de banco de dados de NCB1 Entrez-Proteína #AAH14951 PID gl

5928971, e uma proteína de 61 amino ácidos descrita no Acesso de banco de dados de NCB1 Entrez-Proteína &AAH02534 PID gl2803421).

A proteína em cadeia neural é associada com • AD e NTP é regulada em associação com morte celular na AD. A

AD7c-NTPmRNA é regulada no cérebro AD, comparada aos controles; os níveis de proteína AD7c-NTP no cérebro e no CSF são mais altos nos AD do que nos controles; e a imunoreatividade de AD7c-NTP é encontrada nas placas senis, em entrelaçamentos neurofíbrilares (NFT), na degeneração de neurônios, cadeias de neuropil, e brotos neuróticos distróficos na AD e cérebros de síndrome de Down (Ozturk e outros., Proc. Natl. Acad. Sei.

φ Estados Unidos da América, 86: 419-423 (1989); de la Monte e outros., J. Clin. Invest., 86 (3): 1004-13 (1990); de la Monte e outros., J. Neurol. Sei., 113 (2):152-64 (1992); de la Monte e outros., Ann. Neurol., 32 (6):733-42 (1992); de la Monte e outros., J. Neuropathol. Exp. Neurol., 55 (10):1038-50 (1996), de la Monte e outros., J. Neurol. Sei., 138 (1-2):26-35 (1996); de la

Monte e outros., J. Neurol Sei., 135 (2):118-25 (1996); de la Monte e outros., J. Clin. Invest., 100 :3093-3104 (1997); e de la

Monte e outros., Alz. Rep., 2: 327-332 (1999)). O NTP está localizada dentro das células, no interior de processos finos no ··· ··· ·· ·· · ········ ·· ·······*· · ··· ····· · · · ······ • ‘ 14 J·· J i J .· í . í Σ í í í J • ··· ·· ··· ··· ·· · ·· ·· interior do neuropil, ou é extracelular em ambos os cérebros de AD e de Síndrome de Down. De la Monte e outros., Ann. Neurol., 32 (6):733-42 (1992).

Níveis elevados de proteína de AD7c-NTP foram encontrados em ambos CSF e urina de pacientes com AD, (de la Monte e Wands, Front Biosci 7: 989-96 (2002); de la Monte e Wands, Journal of Alzheimer’s Disease 3: 345-353 (2001); Munzar e outros, Alzheimer’s Report 4: 61-65 (2001);

Φ Kahle e outros, Neurology 54: 1498-1504 (2000); Munzar e outros, Alzheimer Reports 3: 155-159 (2000); de la Monte e outros, Alzheimer ’s Reports 2: 327-332 (1999); e de la Monte e outros., J. Clin. Invest., 100: 3093-3104 (1997).

* A sobre-expressão do NTP também foi ligada ao processo de morte celular na doença de Alzheimer (de la

Monte e Wands, J. Neuropathol and Exp. Neuro., 60: 195-207 (2001); de la Monte e Wands, Cell Mol Life Sei 58: 844-49 φ (2001). O AD7c-NTP também foi identificado no tecido de cérebro de Síndrome de Down (Wands e outros., Publicação de Patente Internacional Número WO 90/06993; de la Monte e outros, Alz., Rep., 2: 327-332 (1999)). Existe alguma evidência que a sobre-expressão do NTP também pode estar associado com glaucoma de tensão normal (Golubniitschaja-Labudova e outros, Curr Eye Res 21: 867-76 (2000)).

O NTP provou ser um agente efetivo para causar morte das células tanto in vitro em glioma e culturas de células neuroblastomas e in vivo em tecidos de músculos de • ·

roedores normais, tecidos conectivos subcutâneos, e derme, e em uma variedade de tumores de origem não-humanas e humanas diferentes, incluindo carcinoma mamário, carcinoma de pele e papiloma, carcinoma do cólon, glioma de cérebro, e outros em modelos roedores. Ver o pedido pendente de Patente dos Estados Unidos N° de Série 10/092,934, “Métodos de Tratamento de

Tumores e Condições Relacionadas Utilizando Proteínas de Cadeia Neural.

• Certas seqüências de peptídeos e fragmentos de

AD7c-NTP e outras espécies também têm também provado serem agentes efetivos para causar a morte das células tanto in vitro em glioma e culturas de células neuroblastomas e/ou in vivo em • tecidos de músculos de roedores normais, tecidos conectivos subcutâneos, derme e outros tecidos. Ver Pedidos de Patente dos

Estados Unidos Número 10/153,334, intitulada: “Peptídeos Efetivos no Tratamento de Tumores e Outras Condições que φ Requerem a Remoção ou Destruição de Células'¹'', Número

.. 10/198.069, intitulada “Peptideos Efetivos no Tratamento de

Tumores e Outras Condições que Requerem a Remoção ou 20 Destruição de Células', e Número 10/198.070, intitulada “Peptideos Efetivos no Tratamento de Tumores e Outras Condições que Requerem a Remoção ou Destruição de Células, as revelações dos quais sendo incorporadas aqui por referência em sua totalidade.

Através de toda esta descrição, incluindo a descrição precedente da técnica relatada, qualquer e todo

3Ύ • · ·· • ·· •· • ·* • · ·· · • · · · · • · ·· ··· • · · · · documento disponíveis publicamente descritos aqui, incluindo quaisquer e todas as patentes dos Estados Unidos, são especificamente incorporados aqui por referência em sua totalidade. A descrição precedente da técnica relatada não é pretendida em nenhum meio como uma admissão de quaisquer dos documentos descritos aqui, incluindo os pedidos de patentes pendentes dos Estados Unidos, são as técnicas anteriores da presente invenção. Além disso, a descrição aqui de quaisquer desvantagens associadas com os produtos descritos, métodos e/ou aparelho, não é pretendida para limitar a invenção. De fato, aspectos da invenção podem incluir certas características dos produtos descritos, métodos e/ou aparelho, sem sofrer de suas desvantagens descritas.

Permanece uma necessidade na técnica para novos tratamentos menos tóxicos, para tratamento de elementos celulares indesejados. A presente invenção satisfaz estas necessidades.

RESUMO DA INVENÇÃO

Esta invenção é direcionada em parte na descoberta que peptídeos contendo seqüências de amino ácidos correspondentes à parte das seqüências de amino ácidos de outras espécies de proteínas de cadeia neural outras do que AD7c-NTP são capazes de tratar e/ou matar proliferações celulares indesejadas. Estas proliferações celulares indesejadas incluem tumores benignos e malignos, hiperplasia glandular (por exemplo, • ·

próstata), cabelo facial não desejado, verrugas, tecido adiposo indesejado.

A presente invenção é direcionada a métodos de tratamento de proliferações celulares indesejadas (tumores 5 benignos e malignos, hiperplasia glandular (por exemplo, próstata), cabelo facial não desejado, verrugas, tecido adiposo indesejado), compreendendo administrar a um mamífero em necessidade uma quantidade terapeuticamente efetiva de um • peptídeo compreendendo uma seqüência de amino ácido (ou mais ío do que uma seqüêdncia) correspondente à parte da seqüência de amino ácido de uma espécie de proteína de cadeia neural (NTP) outra do que AD7c-NTP.

Tal peptídeo (“peptídeo NTP” ou “NTP peptídeo”) pode ser administrado sozinho ou conjugado a um 15 veículo ou a um anticorpo. O peptídeo NTP pode ser administrado intramuscularmente, oralmente, intravenosamente, φ intraperitonealmente, intracerebralmente, (intraparenquimalmente), intracerebroventricularmente, intratumoralmente, intralesionalmente, intrademalmente, intratecalmente, intranasalmente, intraocularmente, intraarterialmente, topicamente, transdermalmente, via um aerossol, infusão, injeção de bolus, dispositivo de implantação, sistema de liberação controlada, etc., tanto sozinhos ou conjugados a um veículo. Altemativamente, o peptídeo NTP pode 25 ser expresso in vivo por administração de um gene que expressa o peptídeo, administrando uma vacina que induz tal produção, ou ·· ··· ·♦ ·· · ♦······· ·♦ ·· • · · ·· · ·· · ·· · · ·«·· · · · ·<···· pela introdução de células, bactérias ou vírus que expressam o peptídeo in vivo, por causa da modificação genética, ou de outra forma.

Em adição, o peptídeo NTP pode ser usado em conjunção com outras terapias para tratamento de tumores benignos e malignos e outros crescimentos celulares não desejados e danosos.

Tanto a descrição geral anterior e a descrição φ detalhada seguinte são exemplares e explanatórias e são pretendidas para proporcionar explanações adicionais da invenção conforme reivindicada. Outros objetivos, vantagens, e novas características serão prontamente aparentes aos técnicos no assunto a partir da descrição detalhada seguinte da invenção.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

Figura 1: Mostra as seqüências de amino ácidos completas das proteínas de caeia neural (Seqüência 40 da Patente φ dos Estados Unidos N°s 5.830.670, 5.984.634 e 5.948.888, Acesso de NCB1 Entrez-Proteína #AAE25447 PID gl0048540) [SEQIDNO. 1].

Figura 2: Mostra as seqüências de amino ácido completas dos 122 amino ácidos das proteínas de cadeia neurais (Acesso de NCB1 Entrez-Proteína #XP_032307 PID gl5928971) [SEQ ID NO. 2].

Figura 3: Mostra as seqüências de amino ácido completas da proteína similar a as proteínas de cadeia neurais de

Λ

106 amino ácidos (Acesso de NCB1 Entrez-Proteína #AAH14951 PID gl5928971) [SEQ ID NO. 3].

Figura 4: Mostra as seqüências de amino ácido completas dos 98 amino ácidos das proteínas de cadeia neurais 5 (Seqüência 30 das Patentes dos Estados Unidos Números 5.830.670, 5.948.634 e 5.948.888; Acesso de NCB1 EntrezProteína &AAE25445, PIDglOO48538) [SEQ ID NO. 4],

Figura 5: Mostra as seqüências de amino ácidos • completas dos 75 amino ácidos das proteínas de cadeia neurais 10 (Seqüência 48 da Patente U.S. N° 5.830.670, 5.948.634, e 5.948.888; Acesso de NCB1 Entrez-Proteína &AAE25448, PID gl0048541) [SEQ ID NO. 5].

Figura 6: Mostra as seqüências de amino ácidos completas dos 68 amino ácidos das proteínas de cadeia neurais 15 (Seqüência 36 da Patente U.S. N° 5.830.670, 5.948.634, e 5.948.888; Acesso de NCB1 Entrez-Proteína #AAE25446, PID _· gl0048539) SEQ ID NO. 6].

Figura 7: Mostra as seqüências de amino ácidos completas dos 61 amino ácidos das proteínas de cadeia neurais 20 similares às proteínas (Acesso de NCB1 Entrez-Proteína #AAH02534, PIDgl2803421) [SEQ ID NO. 7].

DESCRIÇÃO DETALHADA DAS CONCRETIZAÇÕES PREFERIDAS

Antes das presentes proteínas, seqüências de nucleotídeos, peptídeos, etc., e métodos serem descritos, é compreendido que esta invenção não está limitada à metodologia

• ·

particular, protocolos, linhas de células, vetores, e reagentes descrtitos, conforme estes podem variar. É também para ser compreendido que a terminologia aqui usada é para a proposta de descrição de concretizações particulares somente, e não é pretendido limitar o escopo da presente invenção que será limitada somente pelas reivindicações em anexo.

Os termos e frases aqui empregados são definidos conforme abaixo a menos que de outro modo Φ especificado.

Através de toda esta descrição, as formas singulares “um”, “uma”, e “o-a” incluem referências plurais, a menos que o contexto de outro modo cite claramente. Desse modo, por exemplo, uma referência a “uma célula hospedeira” inclui uma pluralidade de tais células hospedeiras, e uma referência a um “anticorpo” é uma referência a um ou mais anticorpos e equivalentes destes conhecidos àqueles técnicos no φ assunto, e assim por diante.

A expressão “AD7c-NTP” se refere a proteína -41kD e o gene e as seqüências de ácido nucléico codificadas para elas é descrita no de la Monte e outros., J. Clin. Invest., 100:30933104 (1997), em Seqüências 120 e 121 da Patente dos Estados Unidos N°s 5.948.634, 5.948.888, e 5.830.670.

O termo “NTP” se refere a proteínas de cadeia neural e moléculas relacionadas (incluindo proteína de cadeia pancreática) outras do que AD7c-NTP, conforme descrito nas Patentes dos Estados Unidos Números 5.948.634, 5.948.888,

·· ·«· ·· ··· ··· ·· · ·· ··

5.830.670 e 6.071.705, e em de la Monte e outros., J. Neuropathol. Exp. Neurol., 55 (10):1038-50 (1996), de la Monte e outros., J. Neurol. Sei., 138 (1-2):26-35 (1996); de la Monte e outros., J. Neurol Sei., 135 (2):118-25 (1996); de la Monte e 5 outros., J. Clin. Invest., 100 :3093-3104 (1997); e de la Monte e outros., Alz. Rep., 2: 327-332 (1999)). O termo “NTP” inclui, mas não está limitado a:

(a) as espécies -42, -26, -21,-17,-14 e -8 kD da proteína em cadeia neural como descritos nas Patentes dos

Estados Unidos N°s 5.948.634, 5.948.888, 5.830.670 e 6.071.705, e no de la Monte e outros., J. Neuropathol. Exp. Neurol 55(10):1038-1050 (1996), de la Monte e outros, J. Neurol. Sei., 138(1-2): 26-35 (1996), de la Monte e outros, J. Neurol. Sei., 135(2): 118-125 (1996), de la Monde e outros, J. Clin. Invest., 15 100:3093-3104 (1997) e de la Monte e outros, Alz. Rep., 2:327332 (1999);

(b) proteínas especificamente reconhecidas pelo anticorpo monoclonal #2 depositado na American Type Culture Collection, Manassas, Va., sob o número de acesso HB-12546 ou anticorpo monoclonal #5 depositado na American Type Culture Collection, Manassas, Va., sob o número de acesso HB-12545;

(c) proteínas codificadas pelo gene AD7c-NTP, incluindo variantes ;

(d) os 122 amino ácidos da proteína de cadeia 25 neural descrita na Seqüência 40 da Patente dos Estados Unidos

N°s 5.830.670, 5.948.634, e 5.948.888 e listadas no Acesso NCB1 * ’ * 22 • ·«······ ····· · ·· · ·

Entrez-Proteína #AAE25447, PID gl 0048540, as seqüências de amino ácidos pelas quais é ilustrada na Figura 1 (“NTP[122]”);

(e) os 112 amino ácidos da proteína de cadeia neural listados no Acesso NCB1 Entrez-Proteína #XP~032307,

PIDg 14725132, as seqüências de amino ácidos pelas quais é ilustrada na Figura 2 (“NTP[112]”);

(f) os 106 amino ácidos da proteína de cadeia neural - similar à proteína listada no Acesso NCB1 Entrez- ® Proteína #AAH14951 PIDgl5928971, as seqüências de amino ácidos pelas quais é ilustrada na Figura 3 (“NTP[106J”);

(g) os 98 amino ácidos da proteína de cadeia neural descrita na Seqüência 30 da Patente dos Estados Unidos N°s 5.830.670, 5.948.634, e 5.948.888 e listadas no Acesso NCB1 Entrez-Proteína #AAE25445, PID gl0048538, as seqüências de amino ácidos pelas quais é ilustrada na Figura 4 (“NTP[98]);

(h) os 75 amino ácidos da proteína de cadeia φ neural descrita na Seqüência 48 da Patente dos Estados Unidos

N°s 5.830.670, 5.948.634, e 5.948.888 e listadas no Acesso NCB1 Entrez-Proteína #AAE25448, PID gl0048541, as seqüências de amino ácidos pelas quais é ilustrada na Figura 5 (“NTP[75]”);

(i) os 68 amino ácidos da proteína de cadeia neural descrita na Seqüência 36 da Patente dos Estados Unidos N°s 5.830.670, 5.948.634, e 5.948.888 e listadas no Acesso NCB1 Entrez-Proteína &AAE25446, PID gl0048539, as seqüências de amino ácidos pelas quais é ilustrada na Figura 6 (“NTP[68]”);

(j) os 61 amino ácidos da proteína de cadeia neural - similar à proteína listada no Acesso NCB1 EntrezProteína #AAH02534, PID gl2803421, as sequências de amino ácidos pelas quais é ilustrada na Figura 7 (“NTP[61J”);

(k) proteína de cadeia pancreática;

(l) a proteína de cadeia pancreática neural (nPTP) descrita na Patente dos Estados Unidos N° 6.071.706; e (m) proteínas especificamente reconhecidas ® pelos anticorpos produzidos por um hibridoma do grupo consistindo de HB 9934, HB 9935, e HB 9936 depositado na American Type Culture Collection.

O termo “NTP” inclui homólogos, fragmentos, derivados, variantes, proteínas de fusão, e miméticos de peptídeos de proteínas NTP a menos que o contexto indique o contrário.

A expressão “NTP peptídeo” se refere a peptídeos compreendendo seqüências de amino ácidos -φ correspondentes a pelo menos parte da seqüência de amino ácidos de NTP, de uma espécie de NTP, ou a fragmentos de uma espécie de NTP, e inclui homólogos, fragmentos, derivados, variantes, proteínas de fusão, e miméticos de peptídeos de tais peptídeos, a menos que o contexto indique o contrário.

O termo “fragmento” se refere a uma proteína ou polipeptídeo que consiste de uma subseqüência contínua da seqüência de amino ácidos de uma NTP proteína ou NTP peptídeo, e inclui fragmentos que ocorrem naturalmente tais como variantes e fragmentos resultantes da atividade de protease que • · · · ·· · «··· • · · · · · · ····· ··· ·· ··· ··· ·· · ··

Mó ocorre in vivo. Tal fragmento pode ser truncado no terminal amino, no terminal carbóxi, e/ou internamente (tal como por união natural). Tais fragmentos podem ser preparados com ou sem uma metionina terminal amino. O termo “fragmento” inclui fragmentos, se idênticos ou diferentes, a partir da mesma proteína NTP ou peptídeo NTP, com uma seqüência de amino ácido contígua em comum ou não, unidos juntos, ou diretamente, ou através de um articulador.

® O termo “variante” se refere a uma proteína ou polipeptídeo na qual uma ou mais substituições de amino ácidos, deleções, e/ou inserções estão presentes quando comparadas à seqüência amino ácido de uma proteína NTP ou peptídeo NTP, e inclui variantes alélicas ocorrendo naturalmente, ou variantes de união alternativas de uma proteína NTP ou NTP-peptídeo. O termo “variante” inclui a substituição de um ou mais amino ácidos na seqüência peptídeo com um amino ácido similar ou φ homólogo ou um amino ácido dissimilar. Existem muitas escalas nas quais os amino ácidos podem ser classificados como similares ou homólogos. (Gunnar von Eleijne, Sequence Analysis in

Molecular Biology, p. 123-139. (Academic Press, New York, NY 1987). Variantes preferidas incluem substituições de alanina em uma ou mais posições de amino ácidos. Outras substituições preferidas incluem substituições conservativas que tem pouco ou nenhum efeito na carga da rede total, polaridade, ou hidrofobicidade da proteína. Substituições conservativas são demonstradas na Tabela 2 abaixo.

TABELA 2

Substituições Consevativas de Amino Ácido

Básica	arginina lisina histidina
Acida	ácido glutâmico ácido aspártico
Polar Não-carregado	glutamina serina tirosina
Não-Polar	fenilalanina triptofan cisteína glicina alanina valina prolina metionina leucina isoleucina

Tabela 3 demonstra um outro esquema de substituição de amino ácido:

TABELA 3

Resíduo

Substituições

·· ··· ·· ·· · ········ ·· ·· • · · · · · ·· · ·· ·· ···· · · · · ·· ···

Original
Ala	gly; ser
Arg	lys
Asn	gin; his
Asp	glu
Cys	ser
Gin	asn
Glu	asp
Gly	ala; pro
His	asn; gin
Ile	leu; vai
Leu	ile; vai
Lys	arg; gin; glu
Met	leu; tyr; ile
Phe	met; leu; tyr
Ser	thr
Thr	ser
Trp	tyr
Tyr	trp; phe
Vai	ile; leu

Outras variantes podem consistir de substituições de amino ácido menos conservativas, tais como resíduos de seleção que diferem mais significantemente em seus 5 efeitos na manutenção (a) da estrutura da espinha dorsal do polipeptídeo na área de substituição, por exemplo, como uma ··· ·· ·· • · · ♦ · · • * · · · • · · » • · · ·· · · · ········ ·· ·· • · · · · • · «· · · · • · · · · · • · · · · · · • · · · · · · lâmina ou conformação em forma de hélice, (b) a hidrofobicidade da molécula no local alvo, ou (c) a cadeia lateral.

As substituições que em geral são carga ou massa da esperadas como para ter um efeito mais significante na função são aquelas em que (a) glicina e/ou prolina é substituída por um outro amino ácido ou é deletado ou inserido; (b) um resíduo hidrofílico, por exemplo, seril ou treonil, é substituído por (ou por) um resíduo hidrofóbico, por exemplo, leucil, isoleucil, fenilalanina, valil, ou alanil; (c) um resíduo de cisteína é substituído por (ou por) qualquer outro resíduo; (d) um resíduo tendo uma cadeia lateral eletropositiva, por exemplo, lisil, arginil, ou histidil, é substituído por (ou por) um resíduo tendo uma carga eletronegativa, por exemplo, glutamil ou aspartil; ou (e) um resíduo tendo uma cadeia lateral volumosa, por exemplo, fenilalanina, é substituído por (ou por) um não tendo tal cadeia lateral, por exemplo, glicina. Outras variantes incluem aquelas designadas para ou gerar um novo local de glicosilação e/ou fosforilação, ou aquelas designadas para deletar um local de glicosilação e/ou fosforilação.

As variantes incluem pelo menos uma substituição de amino ácido em um local de glicosilação, um local de clivagem proteolítica e/ou resíduo de cisteína. As variantes também incluem NTP proteínas ou NTP peptídeos com resíduos de amino ácidos adicionais seqüência de amino ácido articuladores. Por exemplo, antes ou após a NTP proteína ou de NTP peptídeo nos peptídeos um resíduo de cisteína pode ser ·· ·♦· ·· ·· · ···«···· ·· ·· • · · · · · ♦· · ·· · · • · · · · · · · ····· • · ··· · · · · ···· • · * · ···»···· ··· ·· ··· ··· ·· · ·· ·· adicionado tanto nas terminações amino e carbóxi de um NTP peptídeo de maneira a permitir a ciclização do segmento de NTP Peptídeo pela formação de uma ligação dissulfíto. O termo “variante” também envolve polipeptídeos que tem a seqüência de 5 amino ácido de um NTP-peptídeo com pelo menos um e até 25 ou mais amino ácidos adicionais que flanqueiam qualquer da terminação 3’ ou 5’ do NTP peptídeo.

O termo “derivado” se refere a uma proteína

Φ quimicamente modificada ou polipeptídeo que tenha sido ío modificado quimicamente tanto por processos naturais, tais como processamento e outras modificações pós-translacionais, mas ▼

também por técnicas de modificações químicas como, por exemplo, por adição de uma ou mais moléculas de polietileno glicol, açúcares, fosfatos e/ou outras tais moléculas, onde a molécula ou moléculas não são naturalmente fixados às proteínas NTP do tipo selvagem ou NTP peptídeos. Derivados incluem sais, φ Tais modificações químicas são bem descritas em textos básicos e em monografias mais detalhadas, bem como na literatura de pesquisa volumosa, e elas são bem conhecidas dos técnicos no 20 assunto.

Deve ser apreciado que o mesmo tipo de modificação pode estar presente no mesmo ou em variados graus nos vários locais em uma dada proteína ou polipeptídeo. Também, uma dada proteína ou polipeptídeo pode conter muitos tipos de 25 modificações.

•· ··· ·· ·· · ········ ·· ·· • · · ·· · · · · ·· ·· • · · · · · · · ····· • · ···· · ······ • · · · ·······♦ ··· ·· ··· ··· ·· · ·· ·· ôú

Modificações podem ocorrer em qualquer lugar na proteína ou polipeptídeo, incluindo a espinha dorsal do peptídeo, as cadeias laterais dos amino ácidos, e as terminações amino ou carboxil.

Modificações incluem, por exemplo, acetilação, acilação, ADP-ribosilação, amidação, ligação covalente da flavina, ligação covalente da metade heme, ligação covalente de um nucleotídeo ou derivado nucleotídeo, ligação covalente de um Φ lipídeo ou derivado lipídeo, ligação covalente de fosfotidilinositol, ligação cruzada, ciclização, formação de ligação de dissulfíto, demetilação, formação de ligações cruzadas covalentes, formação de cisteína, formação de piroglutamato, formilação, gama-carboxilação, glicosilação, formação de âncora GPI, hidroxilação, iodinação, metilação, myristolação, oxidação, processamento proteolítico, fosforilação, prenilação, racemização, glicosilação, ligação lipídica, sulfação, gamma-carbonilação de φ resíduos de ácido glutâmico, hidroxilação e ADP-ribosilação, selenoização, sulfatação, adição mediada de transferência RNA de amino ácidos em proteínas, tais como arginilação, e ubiquitinação. Ver, por exemplo, Proteins - Structure And Molecular Properties, 2^a edição, T. E. Creighton, W. H. Freeman and Company, New York (1993) and Wold, F., “Posttranslational Protein Modifícations: Perspectives and Prospects,” páginas 1-12 em Posttranslational Covalent Modification Of Proteins, B. C.

Johnson, Ed., Academic Press, New York (1983); Seifter e outros, Meth. Enzymol. 182:626-646 (1990) and Rattan e outros, “Protein

Systhesis: Posttranslational Modifícations and Aging,” Ann. N. Y. Acad. Sei. 663: 48-62 (1992).

O termo “derivados” inclui modificações químicas resultantes na proteína ou polipeptídeo tornando 5 ramificado ou cíclico, com ou sem ramificação. Proteínas circulares cíclicas, ramificadas ou circulares ramificadas ou polipeptídeos podem resultar dos processos naturais de póstranslação, e podem ser feitos por métodos inteiramente sintéticos, também.

ίο O termo “homólogo” se refere a uma proteína que é pelo menos 60% idêntica em sua seqüência amino acido de uma NTP proteína ou NTP peptídeo, conforme o caso pode ser, conforme determinado por métodos padrões que são comumente usados para comparar a similaridade na posição dos amino ácidos de dois polipeptídeos. O grau de similaridade ou identidade entre as duas proteínas pode ser prontamente calculado por métodos conhecidos, incluindo mas não limitado àqueles descritos em Computational Molecular Biology, Lesk, A. M., edição, Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D. W., edição, Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part I., Griffin, A. M., and Griffin, H. G., edições Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, Von Heinje, G., Academic Press, 1987; Sequence Analysis Primer,

Gribskov, M. and Devereux, J., edições, M. Stockton Press, New • · ··· ·· ·· · ·«····· ·· ·· * ♦ · ·♦ · · · · ·· ·· ♦ · · · · · · ······ ·· ··*· · ······ ···· · · · · « · » · ··· ·· ··· ··· ·· 4 ·· «·

York, 1991; and Carillo H. and Lipman, D., SIAM, J. Applied

Math.,4%\ 1073 (1988).

Métodos preferidos para determinar identidade são designados para dar a maior equiparação entre as seqüências testadas. Métodos para determinar identidade e similaridade são codificados em programas de computador publicamente disponíveis.

Métodos de programa de computador preferidos • úteis na determinação da identidade e similaridade entre as duas ío seqüências incluem, mas não estão limitados a, embalagens de programa GCG (Devereux, J., e outros, Nucleic Acids Research,

12(1):387 (1984)), BLASTP, BLASTN, and FASTA, Atschul, S.

F. e outros, J. Molec. Biol., 215: 403-410 (1990). O programa

BLAST X está publicamente disponível a partir de NCB1 e outras fontes (BLAST Manula, Altschul, S., e outros, NCB1

NLM NIH Bethesda, Md. 20894; Altschul, S., e outros, J. Mol.

φ Biol., 215:403-410 (1990). Por meio de exemplo, usando-se um algoritmo de computador tal como GAP (Genetic computer

Group, University of Wisconsin, Madison, Wis.), as duas proteínas ou polipeptídeos para os quais a percentagem da identidade da seqüência é para ser determinada são alinhadas para igualdade ótima de seus respectivos amino ácidos (a “amplitude da igualdade, como determinada pelo algoritmo).

Uma abertura na folga penaliza (que é calculada como 3 vezes a média diagonal, a “média diagonal” é a média da diagonal da matriz de comparação sendo usada; a “diagonal” é o ·· ··· ·· ·· · ······· ·· ·· * « » · · · ·· · · · · · • · · · · * · ··· ··· ·· * · * · · ······ ···· »······« ··· ·· ··· ··· ·· · ·· ·· escore ou número designado para cada amino ácido perfeito pela matriz de comparação particular) e uma penalidade de extensão de folga (que é usualmente 1/10 vezes a penalidade de abertura de folga), bem como uma matriz de comparação tal como PAM 250 ou BLOSUM 62 são usadas em conjunção com o algoritmo. Uma matriz de comparação padrão (ver Dayhoff e outros, em: Atlas of

Protein Sequence and Structure, vol. 5, suplemento 3 [1978] para a matriz de comparação PAM250; ver Henikoff e outros, Proc.

• Natl. Acad. Sei USA,89:10915-10919 [1992] para a matriz de comparação BLOSUM 62) também pode ser usada pelo algoritmo. O percentual da identidade é então calculado pelo algoritmo. Homólogos podem tipicamente ter uma ou mais substituições de amino ácidos, deleções, e/ou inserções quando comparados com a comparação proteína NTP proteína ou NTP 15 peptídeos, conforme o caso.

O termo “proteína de fusão” se refere a uma φ proteína onde um ou mais NTP peptídeos são recombinantemente fundidos ou quimicamente conjugados (incluindo covalentemente ou não-covalentemente) a uma proteína tal como (mas não limitado a) um anticorpo ou fragmento de anticorpo similar a um fragmento F_ab ou F_v de cadeia curta. O termo “proteína de fusão” também se refere a multímeros (isto é., dímeros, trímeros, tetrâmeros e multímeros mais altos) de NTP peptídeos. Tais multímeros compreendem multímeros homoméricos compreendendo um NTP peptídeo, multímeros heteroméricos compreendendo mais do que um NTP peptídeo, e multímeros heteroméricos compreendendo pelo menos um NTP peptídeo e pelo menos uma outra proteína. Tais multímeros podem ser o *

resultado de associações hidrofóbica, hidrofílica, iônica e/ou covalente, ligações e articulações, podendo ser formados por 5 reticulação usando-se moléculas articuladoras, ou podem estar ligados indiretamente por, por exemplo, formação de lipossoma.

O termo “peptídeo mimético” ou mimético” se refere a compostos biologicamente ativos que imitam a atividade • biológica de um peptídeo ou uma proteína mas não são peptídicos 10 maiores na natureza química, quer dizer, que eles não contêm quaisquer ligações peptídicas maiores (quer dizer, ligações amida entre amino ácidos). Aqui, o termo peptídeo mimético é usado em um sentido mais amplo para incluir moléculas que não são peptídeos completamente maiores na natureza, tais como 15 pseudopeptídeos, semi-peptídeos e peptóides. Exemplos de peptídeos miméticos neste sentido mais amplo (onde parte de um φ peptídeo é substituída por uma estrutura faltando ligações peptídeas) são descritos abaixo.

Se completamente ou parcialmente não20 peptídeo, os peptídeos miméticos, de acordo com esta invenção, proporcionam uma arranjo espacial de metades químicas reativas que proximamente assemelham-se a arranjos tridimensionais dos grupos ativos nos NTP peptídeos, nos quais o peptídeo mimético é baseado. Como resultado desta geometria do local ativo similar, o peptídeo mimético possui efeitos nos sistemas biológicos que são similares à atividade biológica do NTP peptídeo.

•· · •· •· •· ·· · • · · • · · • · · • · · • ··

Os peptídeos miméticos desta invenção são preferivelmente substancialmente similares tanto na forma tridimensional e atividade biológica dos NTP peptídeo descritos aqui. Exemplos dos métodos de estruturalmente modificar um peptídeo conhecido na técnica para criar um peptídeo mimético inclui a inversão dos centros quirais da espinha dorsal levando a estruturas de resíduos de D-amino ácidos que podem, particularmente, na terminação N, levar à estabilidade aumentada para degradação proteolítica sem adversamente afetar a atividade. Um exemplo é dado no trabalho “Tritriated D-ala^Peptide T Binding”, Smith C. S. e outros, Drug Development Res., 15, pp. 371-379 (1988). Um segundo método é alteração da estrutura cíclica para estabilidade, tais como imidas inter-cadeias de N para C e lactamas (Ede e outros em Smith and Rivier (Eds.) “Peptides: Chemistry and Biology”, Escom, Leiden (1991), pp 268-270). Um exemplo disto é dado em compostos similares a thimopentina conformacionalmente restrito, tais como aqueles descritos na Patente dos Estados Unidos N° 4.457.489 (1985), Goldstein, G. e outros, a descrição a qual é incorporada aqui por referência em sua totalidade. Um terceiro método é substituir ligações peptídeas no NTP peptídeo por ligações pseudopeptídeos que conferem resistência as proteólises.

Um número de ligações de pseudopeptídeos tem sido descrito pelo fato de em geral não afetar a estrutura do peptídeo e a atividade biológica. Um exemplo desta tentativa é substituir as ligações retro-inversa do pseudopeptídeo (“Análogos • · • ·

retro-inversos biologicamente ativos da thimopentina”. Sisto A. e outros em River, J. E. and Marshall, G. R. (edições) “Peptides, Chemistry, Structure and Biology”, Escom, Leiden (1990), páginas 722-773) and Dalpozzo, e outros (1993), Int. J. Peptide 5 Protein Res., 41:561-566, incorporado aqui por referência). De acordo com esta modificação, as seqüências de amino ácido dos peptídeos podem ser idênticas às seqüências de um NTP peptídeo descrito acima, exceto pelo fato de uma ou mais das ligações de peptídeos serem substituídas por uma ligação pseudopeptídeo 10 retro-inversa. Preferivelmente a maior ligação peptídeo Nterminal é substituída, uma vez que tal substituição pode conferir resistência à proteólise por exopeptídases atuando nas terminações N. Modificações adicionais também podem ser feitas por substituições de grupos químicos dos amino ácidos com 15 outros grupos químicos de estrutura similar. Uma outra ligação de pseudopeptídeo adequada é aquela conhecida para aumentar a estabilidade à divagem enzimática com nenhuma ou pouca perda de atividade biológica é a ligação pseudopeptídica isostere reduzida (Couder, e outros (1993), Int. J. Peptide Protein Res., 20 41:181-184, aqui incorporada por referência em sua totalidade).

Assim, as seqüências de amino ácido destes peptídeos podem ser idênticas às seqüências de um NTP peptídeo, exceto pelo fato que uma ou mais das ligações peptídeos serem substituídas por uma ligação pseudopeptídeo isostere. 25 Preferivelmente a maior ligação peptídeo da terminação N é substituída, uma vez que a substituição pode conferir resistência à • · • · · •· •· •· •· • · · ········ · · ·· • · · · · • · ·· · · · · · · · proteólise por exopeptidases atuando na terminação N. A síntese dos peptídeos com uma ou mais ligações pseudopeptídeos isosteres é conhecida na técnica (Couder e outros (1993), citada acima). Outros exemplos incluem a introdução de ligações ketometileno ou metilsulfeto para substituir ligações peptídeos.

Derivados peptóides de NTP peptídeos representam uma outra classe de peptídeos miméticos que retém determinantes estruturais importantes para atividade biológica, ainda eliminando as ligações de peptídeos, portanto conferindo resistência à proteólise (Simon, e outros, 1992, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89: 9367-9371, incorporada aqui por referência em sua totalidade). Peptóides são oligômeros de glicinas N-substituídas. Um número de grupos N-alquil têm sido descrito, cada um correspondendo à cadeia lateral de um amino ácido natural (Simon, e outros (1992), citado acima). Alguns ou todos os amino ácidos do NTP peptídeo podem ser substituídos com a glicina Nsubstituída correspondente ao amino ácido substituído.

A expressão “peptídeo mimético” ou “mimético” também inclui peptídeos reversos-D e enantiômeros como definido abaixo.

Ο termo “peptídeo reverso-D” se refere à proteína biologicamente ativa ou peptídeo consistindo de Damino ácidos arranjados em uma maneira reversa quando comparado à seqüência L-amino ácido ou NTP peptídeo. Assim, o resíduo terminal carbóxi de um peptídeo de L-amino ácido NTP torna-se a terminação amino para o peptídeo D-amino ácido e • · «

<5$ • · · · • · · · • · • · • · • · · · · · ········ ·· • · · · · • · ♦ · · • · · · · • · · · · · assim por diante. Por exemplo, o NTP peptídeo, SSWDY, tomase Y_dD_dW_dS_dS_d, onde D_d, S_d, W_d, e Y_d são os D-amino ácidos correspondentes aos L-amino ácidos, D, S, W, e Y respectivamente.

O termo “enantiômero” se refere a proteína biologicamente ativa ou peptídeo onde um ou mais resíduos Lamino ácido na seqüência amino ácido de um NTP peptídeo é substituído com o(s) resíduo(s) D-amino ácido(s) correspondente(s).

Uma “composição” conforme aqui usado, se refere amplamente a qualquer composição contendo um peptídeo recitado ou seqüência de amino ácido. A composição pode compreender uma formulação seca, uma solução aquosa, ou uma composição estéril. Composições compreendendo NTP peptídeos podem ser empregadas como sondas de hibridização. As sondas podem ser armazenadas na forma congelada-seca, e podem estar associadas com um agente de estabilização tal como um carbohidrato. Nas hibridizações, a sonda pode ser desdobrada em uma solução aquosa contendo sais, por exemplo., NaCl, detergentes, por exemplo., sulfato de dodecil sódio (SDS), e outros componentes, por exemplo., solução de Denhardt, leite seco, DNA de esperma de salmon, etc.

Os amino ácidos e resíduos de amino ácidos descritos aqui podem ser referidos de acordo em concordância para aceitar um ou três letras para codificação na tabela abaixo: A menos que de outro modo especificado, estes amino ácidos ou resíduos são da forma L estereoisômero que ocorrem naturalmenre.

r Amino Acido	Símbolo de Uma Letra	Símbolo de Três Letras
Alanina	A	Ala
Arginina	R	Arg
Aspargina	N	Asn
Acido Aspártico	D	Asp
Cisteína	C	Cys
Glutamina	Q	Gin
Acido glutâmico	E	Glu
Glicina	G	Gly
Histidina	H	His
Isoleucina	I	Ile
Leucina	L	Leu
Lisina	K	Lys
Metionina	M	Met
Fenilalanina	F	Phe
Prolina	P	Pro
Serina	s	Ser
Treonina	T	Thr
Triptofan	w	Trp
Tirosina	Y	Tyr
Valina	V	Vai

A presente invenção é dirigida a uma composição que comprende NTP peptídeos como definido acima ·» nesta invenção.

Um NTP peptídeo preferido é derivado a partir da seqüência de amino ácido para seqüência de 122 amino ácidos de NTP descrita na Fig. 1 (NTP[122J), ou para a seqüência de amino ácido para seqüência de 122 amino ácidos de NTP descrita na Fig. 2 (NTP[112]). Contudo, o uso de outros NTP peptídeos A baseados nas porções ou fragmentos de outras moléculas da ío mesma família como NTP[122] ou NTP[112), tais como outras proteínas de cadeia neural, ou tais como quaisquer daquelas mostradas nas Figuras 3-7, e proteínas de cadeia pancreática, também é envolvida pelo escopo da invenção. Além disso, a invenção inclui outras proteínas que contêm no todo ou em parte um NTP peptídeo, pelo que as proteínas preferivelmente possuem bioatividade similar aumentada como o NTP peptídeo.

φ As sequências de peptídeo e fragmentos de

AD7c-NTP e outras espécies de NTP e variantes similares e homólogos também são encontrados em uma ampla variedade de proteínas humanas e não-humanas (“Proteínas Relacionadas”). Em particular, o gene AD7c-NTP contém seqüências de tipos Alu que são muito similares a aquelas também encontradas em outros genes no genoma humano e de outros primatas.

Por essa razão é razoável esperar que alguns, se não todas, dos NTP peptídeos também possam dar prova de serem agentes efetivos que causem a morte da célula por que eles

contêm seqüências de peptídeos idênticas, homólogas ou proximamente similares às seqüências de peptídeo encontradas em AD7c-NTP e outras espécies de NTP. Usando-se as guias aqui providas, uma pessoa ordinariamente técnica no assunto poderá sintetizar proteínas específicas baseadas na seqüência de amino ácidos para qualquer NTP Proteína encontrada como sendo um agente efetivo que provoque a morte da célula e teste a eficácia dela como agentes causadores da morte da célula.

φ Outras seqüências de peptídeos derivadas de um

NTP peptídeo encontradas para serem agente efetivo que causa a morte da célula também podem ser agentes efetivos que causam a morte de células. Uma pessoa ordinariamente técnica no assunto pode, usando a guia aqui provida, sintetizar sem excessiva experimentação fragmentos de um NTP peptídeo efetivo percorrendo a seqüência de amino ácidos total daquela proteína de modo a identificar outras seqüência de peptídeos efetivas.

φ Os preferidos NTP peptídeos desta invenção contendo seqüências de amino ácidos correspondentes à parte da seqüência de amino ácido para NTP [122] incluem, mas não estão limitados a, os seguintes:

NTP[1221peptídeo #1 [SEQ ID NO. 8],

NTP[I22] pl06-122

IDQQVLSRIKLEIKRCL

Ile-Asp-Gln-Gln-Val-Leu-Ser-Arg-Ile-Lys-Leu25 Glu-Ile-Lys-Arg-Cys-Leu

NTP[1221peptídeo #2 [SEQ ID NO. 9], NTP pl-15

MMVCWNRFGKWVYFI

Met-Met-Val-Cys-Trp-Asn-Arg-Phe-Gly-Lys5 Trp-Val-Tyr-Phe-Ile

NTP[122]peptídeo #3 [SEQ ID NO. 10],

NTP[122] pl6-30

SAIFNFGPRYLYHGV • Ser-Ala-Ile-Phe-Asn-Phe-Gly-Pro-Arg-Tyr10 Leu-Tyr-His-Gly-Val

NTP[122]peptídeo #4 [SEQ ID NO. 11], NTP[122] p31-45

PFYFLILVRIISFLI

Pro-Phe-Tyr-Phe-Leu-Ile-Leu-Val-Arg-Ile-Ile15 Ser-Phe-Leu-Ile

NTP[122]peptídeo #5 [SEQ ID NO. 12], φ NTP[122] p46-60

GDMEDVLLNCTLLKR

Gly-Asp-Met-Glu-Asp-Val-Leu-Leu-Asn-Cys20 Thr-Leu-Leu-Lys-Arg

NTP[122]peptídeo #6 [SEQ ID NO. 13],

NTP[122] p60-75

SSRFRFWGALVCSMD

Ser-Ser-Arg-Phe-Arg-Phe-Trp-Gly-Ala-Leu25 Val-Cys-Ser-Met-Asp

NTP[122]peptídeo #7 [SEQ ID NO. 14], NTP[122] p76-90

SCRFSRVAVTYRFIT

Ser-Cys-Arg-Phe-Ser-Arg-Val-Ala-Val-Thr5 Tyr-Arg-Phe-Ile-Thr

NTP[122]peptídeo #8 [SEQ ID NO. 15], NTP[122] p91-105

LLNIPSPAVWMARNT (B Leu-Leu-Asn-Ile-Pro-Ser-Pro-Ala-Val-Trpío Met-Ala-Arg-Asn-Thr

Os NTP peptídeos desta invenção contendo seqüências de amino ácido correspondentes à parte da sequência de amino ácido para NTP[112] incluem, mas não estão limitados a, os seguintes:

NTP[112]peptídeo #1 [SEQ ID NO. 16],

NTP[112] pl-15 φ MAQSRLTATSASRVQ

Met-Ala-Gln-Ser-Arg-Leu-Thr-Ala-The-SerAla-Ser-Arg-Val-Gln

NTP[112]peptídeo #2 [SEQ ID NO. 17],

NTP[112] pl6-30

AILLSQPPKQLGLRA

Ala-Ile-Leu-Leu-Ser-Gln-Pro-Pro-Lys-Gln-LeuGly-Leu-Arg-Ala

NTP[112]peptídeo #3 [SEQ ID NO. 18],

NTP[112] p31-45 ·· ··· ·* ·« · ········ ·· ·· • « · ·· · ·· · ♦ · · · • ··· · · · · · · · ·» ·· ···· · ··»··· • · · · ···· · · · · • * · ·· ··· ··· ·· · ·· ··

PANTPLIFVFSLEAG

Pro-Ala-Asn-Thr-Pro-Leu-Ile-Phe-Val-Phe-SerLeu-Glu-Ala-Gly

NTP[I12]peptídeo #4 [SEQ ID NO. 19], 5 NTP[112] p46-40

FHHICQAGKLLTSG

Phe-His-His-Ile-Cys-Gln-Ala-Gly-Leu-LysLeu-Leu-Thr-Ser-Gly • NTP[112]peptídeo #5 [SEQ ID NO. 20],

NTP[112] p61-75

DPPASAFQSAGITGV

Asp-Pro-Pro-Ala-Ser-Ala-Phe-Gln-Ser-AlaGly-Ile-Thr-Gly-Val

NTP[112]peptídeo #6 [SEQ ID NO. 21], 15 NTP[112] p76-90

SHLTQPANLDKKICS

Ser-His-Leu-Thr-Gln-Pro-Ala-Asn-Leu-AspLys-Lys-Ile-Cys-Ser

NTP[112]peptídeo #7 [SEQ ID NO. 22],

NTP[112] p91-l 12

NGGSCYVAQAGLKLLASCNPSK

Asn-Gly-Gly-Ser-Cys-Tyr-Val-Ala-Gln-AlaGly-Leu-Lys-Leu-Leu-Ala-Ser-Cys-Asn-Pro-Serr-Lys)

Os NTP peptídeos desta invenção contendo seqüências de amino ácido correspondentes à parte da seqüência de amino ácido para o NTP de 106 amino ácidos descrito na

444 44 44 · 44444444 ··44 • 4 4 44 4 4 4 4 ··♦· • » · 4 4 4 · ······ • 9 4*44 · «4·»··

4444 44444444

444 44 444 444 44 4 4444 éó

Figura 3 (NTP[106] incluem, mas não estão limitados a, os seguintes:

NTP[106]peptídeo #1 [SEQ ID NO. 23],

NTP[106] pl-15

MWTLKSSLVLLLCLT

Met-Trp-Thr-Leu-Lys-Ser-Ser-Leu-Val-LeuLeu-Leu-Cys-Leu-Thr

NTP[106]peptídeo #2 [SEQ ID NO. 24], • NTP[106]pl6-30

CSYAFMFSSLRQKTS

Cys-Ser-Tyr-Ala-Phe-Met-Phe-Ser-Ser-LeuArg-Gln-Lys-Thr-Ser

NTP[106]peptídeo #3 [SEQ ID NO. 25],

NTP[106] p3I-45

EPQGKVPCGEHFRIR

Glu-Pro-Gln-Gly-Lys-Val-Pro-Cys-Gly-Gluφ His-Phe-Arg-Ile-Arg

NTP[106]peptídeo #4 [SEQ ID NO. 26],

NTP[106] p46-40

QNLPEHTQGWLGSKW

Gln-Asn-Leu-Pro-Glu-His-Thr-Gln-Gly-TrpLeu-Gly-Ser-Lys-Trp

NTP[1061peptídeo #5 [SEQ ID NO. 27],

NTP[106] p61-75

LWLLFAVVPFVILKC

Leu-Trp-Leu-Leu-Phe-Ala-Val-Val-Pro-PheV al-Ile-Leu-Ly s-Cys

NTP[106]peptídeo #6 [SEQ ID NO. 28], NTP[106] p76-90

QRDSEKNKVRMAPFF

Gln-Arg-Asp-Ser-Glu-Lys-Asn-Lys-Val-ArgMet-Ala-Pro-Phe-Phe)

NTP[106]peptídeo #1 [SEQ ID NO. 29], • NTP[106] p90-106

LHHIDSISGVSGKRMF

Leu-His-His-Ile-Asp-Ser-Ile-Ser-Gly-Val-SerGly-Lys-Arg-Met-Phe

Os NTP peptídeos desta invenção contendo seqüências de amino ácido correspondentes à parte da seqüência 15 de amino ácido para o NTP de 98 amino ácidos descrito na Figura (NTP[98] incluem, mas não estão limitados a, os seguintes: <· NTP[98]peptídeo #1 [SEQ ID NO. 30],

NTP[98]pl-15

EAYYTMLHLPTTNRP

Glu-Ala-Tyr-Tyr-Thr-Met-Leu-His-Leu-ProThr-Thr-Asn-Arg-Pro

NTP[98]peptídeo #2 [SEQ ID NO. 31], NTP[98] pl6-30

KIAHCILFNQPHSPR

Lys-Ile-Ala-His-Cys-Ile-Leu-Phe-Asn-Gln-ProHis-Ser-Pro-Arg >

ίο

6ύ

NTP[98]peptídeo #3 [SEQ ID NO. 32],

NTP[98] p31-45

SNSHSHPNPLKLHRR

Ser-Asn-Ser-His-Ser-His-Pro-Asn-Pro-LeuLys-Leu-His-Arg-Arg

NTP[98]peptídeo #4 [SEQ ID NO. 33],

ΝΤΡ[98] ρ46-40

SHSHNRPRAYILITI

Ser-His-Ser-His-Asn-Arg-Pro-Arg-Ala-Tyr-IleLeu-Ile-Thr-Ile

NTP[981peptídeo #5 [SEQ ID NO. 34],

NTP[98] p61-75

LPSKLKLRTHSQSHH

Leu-Pro-Ser-Lys-Leu-Lys-Leu-Arg-Thr-HisSer-Gln-Ser-His-His

NTP[98]peptídeo #6 [SEQ ID NO. 35],

NTP[98] p76-98

NPLSRTSNSTPTNSFLMTSSKPR

Asn-Pro-Leu-Ser-Arg-Thr-Ser-Asn-Ser-ThrPro-Thr-Asn-Ser-Phe-Leu-Met-Thr-Ser-Ser-Lys-Pro-Arg

Os NTP peptídeos desta invenção contendo seqüências de amino ácido correspondentes à parte da seqüência de amino ácido para o NTP de 75 amino ácidos descrito na Figura 5 (NTP[75] incluem, mas não estão limitados a, os seguintes:

NTP[75]peptídeo #1 [SEQ ID NO. 36],

NTP[75]pl-15

SSSLGLPKCWDYRHE

Ser-Ser-Ser-Leu-Gly-Leu-Pro-Lys-Cys-TrpAsp-Tyr-Arg-His-Glu

NTP[75]peptídeo #2 [SEQ ID NO. 37],

NTP[75] pl6-30

LLSLALMINFRVMAC

Leu-Leu-Ser-Leu-Ala-Leu-Met-Ue-Asn-PheArg-Val-Met-Ala-Cys • NTP[75]peptídeo #3 [SEQ ID NO. 38],

NTP[75] p31-45

TKKQHIELRQKISIV

Thr-Phe-Lys-Gln-His-Ile-Glu-Leu-Arg-GlnLys-Ile-Ser-Ile-Val

NTP[75]peptídeo #4 [SEQ ID NO. 39],

NTP[75] p46-40

PRKLCCMGVCPVKI φ Pro-Arg-Lys-Leu-Cys-Cys-Met-Gly-Pro-ValCy s-Pro-Val-Ly s-Ile

NTP[75]peptídeo #5 [SEQ ID NO. 40],

NTP[75]p61-75

ALLTINGHCTWLPAS

Ala-Leu-Leu-Thr-Ile-Asn-Gly-His-Cys-ThrTrp-Leu-Pro-Ala-Ser

Os NTP peptídeos desta invenção contendo seqüências de amino ácido correspondentes à parte da seqüência ·· ··« ·· ·· · ········ ·· ·· • · · ·· ··« · · · · · • ··· · · · · · · · · · • · ···· « ······ ···· ········ ··« ·· ··· ··· ·· · ·· ·· de amino ácido para o NTP de 68 amino ácidos descrito na Figura (NTP[68] incluem, mas não estão limitados a, os seguintes:

NTP[68]peptídeo #1 [SEQ ID NO. 41],

NTP[68]pl-15

MFVFCLILNREKIKG

Met-Phe-Val-Phe-Cys-Leu-Ile-Leu-Asn-ArgGlu-Lys-Ile-Lys-Gly

NTP[68]peptídeo #2 [SEQ ID NO. 42], • NTP[68] pl6-30

GNSSFFLLSFFFSFQ

Gly-Asn-Ser-Ser-Phe-Phe-Leu-Leu-Ser-PhePhe-Phe-Ser-Phe-Gln

NTP[68]peptídeo #3 [SEQ ID NO. 43],

NTP[68] p31-45

NCCQCFQCRTTEG YA

Asn-Cys-Cys-Gln-Cys-Phe-Gln-Cys-Arg-Thrφ Thr-Glu-Gly-Tyr-Ala

NTP[68]peptídeo #4 [SEQ ID NO. 44],

NTP[68] p46-48

VECFYCLVDKAAFECWFYSFDT

V al-Glu-Cy s-Phe-Tyr-Cy s-Leu- V al-Asp-Ly sAla-Ala-Phe-Glu-Cys-Trp-Trp-Phe-Tyr-Ser-Phe-Asp-Thr

Os NTP peptídeos desta invenção contendo seqüências de amino ácido correspondentes à parte da seqüência de amino ácido para o NTP de 61 amino ácidos descrito na Figura (NTP[61] incluem, mas não estão limitados a, os seguintes:

··· ··· ·· ·· · ·♦······ ·· ·· • · · · · · ··· · · · · · ····· ·· · ······ ··· ··· · · · · · · · · • · · · · #······· • ··· ·· ··· ··· ·· · ·· ·· yo

NTP[611peptídeo #1 [SEQ ID NO. 45],

NTP[61]pl-15

MEPHTVAQAGVPQHD

Met-Glu-Pro-His-Thr-Val-Ala-Gln-Ala-Gly5 Val-Pro-Gln-His-Asp

NTP[61]peptídeo #2 [SEQ ID NO. 46],

NTP[61] p 16-30

LGLQSLLPRFKRFS ® Leu-Gly-Ser-Leu-Gln-Ser-Leu-Leu-Pro-Arg10 Phe-Lys-Arg-Phe-Ser

NTP[61]peptídeo #3 [SEQ ID NO. 47],

NTP[61] p31-45

CLILPKIWDYRNMNT

Cys-Leu-Ile-Leu-Pro-Lys-Ile-Trp-Asp-Tyr-Arg15 Asn-Met-Asn-Thr

NTP[61]peptídeo #4 [SEQ ID NO. 48], > NTP[61]p46-61

ALIKRNRYTPETGRKS w

Ala-Leu-Ile-Lys-Arg-Asn-Arg-Tyr-Thr-Pro20 Glu-Thr-Gly-Arg-Lys-Ser

Será aparente àqueles técnicos no assunto que outros fragmentos menores dos NTP peptídeos acima podem ser selecionados tal que estes peptpideos possuirão a mesma atividade biológica. Outros fragmentos de NTP podem ser selecionados por um técnico no assunto tal que estes peptídeos possuirão a mesma ou atividade biológica similar. Os NTP

Al peptídeos da invenção envolvem estes outros fragmentos. Em geral, os peptídeos desta invenção têm pelo menos 6 amino ácidos, preferivelmente pelo menos 5 amino ácidos, e mais preferivelmente pelo menos 4 amino ácidos.

A invenção também envolve peptídeos compreendendo dois ou mais NTP peptídeos unidos juntos, ainda se as seqüências dos dois NTP peptídeos não são contíguos na seqüência da(s) espécie(s) de NTP que os NTP peptídeos foram ® derivados. Para a extensão que um NTP peptídeo tem a atividade 10 biológica desejada, segue-se que dois tais NTP peptídeos também possuiríam a atividade desejada, ainda se estes segmentos não fossem contíguos dentro da seqüência de amino ácidos da(s) espécie(s) de NTP da qual os NTP peptídeos foram derivados.

Os NTP peptídeos e fragmentos, variantes, 15 derivados, homólogos, proteínas de fusão e miméticos destas envolvidos por esta invenção podem ser preparados usando φ métodos conhecidos aos técnicos no assunto, tais como tecnologia de DNA recombinante, sínteses de proteína e isolamento de NTP peptídeos que ocorrem naturalmente, NTP proteínas, proteína 20 AD7c-NTP e fragmentos, variantes, derivados e homólogos deles.

Os NTP peptídeos e fragmentos, variantes, derivados, homólogos, proteínas de fusão, e miméticos destas, podem ser preparados de outros NTP peptídeos, NTP proteínas, proteínas AD7c-NTP e fragmentos, variantes, derivados e 25 homólogos deles usando métodos conhecidos aos técnicos no assunto. Tais métodos incluem (mas não estão limitados a) o uso

de protease para clivar o NTP peptídeo, NTP proteína ou AD7cNTP proteína no desejado NTP peptídeo.

Um NTP-peptídeo ou uma NTP proteína pode ser preparado usando bem conhecidos métodos de tecnologia de 5 DNA recombinantes tais como aqueles demonstrados em Sambrook e outros, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. [1989]) e/ou Ausebel e outros, edições, Current Protocols in í Molecular Biology, Green Publishers Inc. and Wiley and sons, N. ίο Y. [1994].

Um gene ou cDNA codificando um NTP * peptídeo ou uma NTP proteína pode ser obtido por exemplo por . escaneamento de um genômico ou biblioteca cDNA, ou por amplificação PCR. Sondas ou iniciadores úteis para escaneamento 15 da biblioteca podem ser gerados baseado na informação de seqüência para outros genes conhecidos ou fragmentos de genes a ) partir dos mesmos, ou uma família relacionada de genes, tais como, por exemplo, motivos conservados encontrados em outros NTP peptídeos ou NTP proteína. Em adição, onde um gene 20 codificando uma NTP proteína ou NTP peptídeo tem sido identificado a partir de uma espécie, todas ou uma porção daquele gene pode ser usada como uma sonda para identificar genes homólogos a partir de outras espécies. As sondas ou iniciadores podem ser usados para escanear bibliotecas de cDNA a partir de 25 várias fontes de tecidos acreditadas para expressar um gene NTP peptídeo ou NTP proteína. Tipicamente, condições de alta ^: 73 • · ·· ·· • · · · · ·· · ·· · adstringência podem ser empregadas para escanear e minimizar o número de positivos falsos obtidos a partir do escaneamento.

Um outro meio para preparar um gene codificando uma NTP proteína ou NTP peptídeo é empregar sínteses químicas utilizando métodos bem conhecidos para os no assunto, tais como aqueles descritos por Engels e Angew. Chem. Intl. Ed., 28:716-734 [1989]. Estes técnicos outros., métodos incluem, aliás, o fosfotriéster, fosforamidita, e métodos H-fosfonato para sínteses de ácido nuclêico.

Um método preferido para tal síntese química é a síntese de polímero suportado usando química fosforamidita padrão. Tipicamente, o DNA codificando uma NTP proteína ou um NTP peptídeo pode ser de várias centenas de nucleotídeos em r comprimento. Ácidos nucléicos maiores que 100 nucleotídeos podem ser sintetizados como vários fragmentos usando estes métodos. Os fragmentos podem então ser ligados juntos para formar uma NTP proteína ou NTP peptídeo de comprimento total. Usualmente, o fragmento DNA codificando a terminação amino da proteína deverá ter um ATG, o qual codifica um resíduo de metionina. Esta metionina pode ou não estar presente na forma madura da NTP proteína ou NTP peptídeo, dependendo se a proteína produzida na célula hospedeira é desenvolvida para ser secretada a partir daquela célula.

O gene, cDNA, ou fragmento dele codificando a

NTP proteína ou NTP peptídeo pode ser inserido em uma expressão apropriada ou vetor de amplificação usando técnicas de ligação padrão. O vetor tipicamente é selecionado para ser funcional em particular com as células hospedeiras empregadas (isto é, o vetor é compatível com a maquinaria das células hospedeiras, tal que a amplificação do gene e/ou expressão do 5 gene possa ocorrer). O gene, cDNA ou fragmento dele codificando a NTP proteína ou NTP peptídeo pode ser amplificado/expressado em células hospedeiras procarióticas, levedura, insetos (sistemas baculovírus) e/ou em células hospedeiras eucarióticas. A seleção das células hospedeiras 10 dependerá em parte se a NTP proteína ou NTP peptídeo é para ser glicosilado e/ou fosforilatado. Desta forma, levedura, insetos, ou células hospedeiras de mamíferos são preferidas.

Tipicamente, os vetores utilizados em qualquer das células hospedeiras conterão pelo menos uma seqüência de 15 divisão 5’ (também referida como um “promotor”) e outros elementos regulatórios, tal como um espessante, uma origem de elemento de replicação, um elemento de terminação transcricional, uma seqüência de intrão completa contendo um local de união doador e aceitador, uma seqüência de peptídeo de 20 sinal, um elemento local de ligação do ribossoma, uma seqüência de poliadenilação, uma região poli-ligante para inserção do ácido nucléico codificando o polipeptídeo a ser expressado, e um elemento marcador selecionável. Cada um destes elementos é discutido abaixo.

Opcionalmente, o vetor pode conter uma seqüência de identificação, isto é, uma molécula de • · · • ♦ · • · · ·· · ·· · • · · · · • ·· ··· • · · · · · • · · · · ·

..... 7ó oligonucleotídeo localizada na extremidade 5’ ou 3’ da seqüência codificando a NTP proteína ou NTP peptídeo; a molécula de oligonucleotídeo que codifica poliHis (tal como hexaHis), ou outro identicador tais como FLAG, HA (vírus da Influenza hemaglutinin) ou myc para as quais existem anticorpos comercialmente disponíveis. Este identificador é tipicamente fundido para polipeptídeo após expressão do polipeptídeo, e pode servir como um meio para purificação de afinidade da NTP proteína ou NTP peptídeo a partir da célula hospedeira. A purificação de afinidade pode ser acompanhada, por exemplo, por cromatografia de coluna usando anticorpos contra o identificador como uma matriz por afinidade. Opcionalmente, o identificador pode subseqüentemente ser removido da NTP proteína purificada ou NTP peptídeo por vários meios tais como usando certas peptidases.

O ponto principal da imunoglobulina humana e a região Fe podem ser fundidos tanto na terminação N ou terminação C da NTP proteína ou NTP peptídeo por um técnico no assunto. A proteína de fusão Fe subseqüente poderá ser purificada pelo uso de uma coluna de afinidade da Proteína A.

O Fc é conhecido por exibir uma meia-vida farmacocinética longa in vivo e as proteínas fundidas para Fc deverão ser encontradas exibindo uma meia-vida substancialmente maior in vivo

Também, fusão para a que a contra parte região Fe não fundida.

permite a dimerização/multimerização da molécula que pode ser usada para a bioatividade de algumas moléculas.

A seqüência de divisão 5’ pode ser homóloga (isto é, a partir da mesma espécie e/ou descendência como as células hospedeiras), heteróloga (isto é, a partir de espécies outras que as espécies das células hospedeiras ou descendência), híbridos (isto é, uma combinação das seqüências de divisão 5’ de mais que uma fonte), sintético, ou pode ser a proteína NTP nativa ou seqüência de divisão 5’ do gene NTP peptídeo. Tais como, a to fonte da seqüência de divisão 5’ pode ser qualquer organismo eucariótico ou procariótico unicelular, qualquer organismo vertebrado ou invertebrado, ou qualquer planta, proporcionando que a seqüência de divisão 5’ seja funcional em, e possa ser ativada pela maquinaria da célula hospedeira.

As seqüências de divisão 5’ úteis nos vetores desta invenção podem ser obtidas por quaisquer dos vários métodos bem conhecidos na técnica. Tipicamente, as seqüências de divisão 5’ úteis aqui outras que a seqüência de divisão do gene NTP proteína ou NTP peptídeo poderão ser previamente 20 identificadas pelo mapeamento e/ou por digestão endonuclease de restrição, e podem assim serem isoladas a partir da fonte de tecido própria usando a endonuclease de restrição apropriada. Em alguns casos, a seqüência de nucleotídeo completa da seqüência de divisão 5’ pode ser conhecida. Aqui, a seqüência de divisão 5’ pode ser sintetizada utilizando os métodos descritos acima para síntese de ácido nucléico ou clonagem.

« ·

Onde todas ou somente uma porção da seqüência de divisão 5’ são conhecidas, elas podem ser obtidas usando PCR e/ou por escaneamento da biblioteca genômica com oligonucleotídeos adequados e/ou fragmentos da seqüência de 5 divisão 5’ a partir da mesma ou de outras espécies.

Onde a seqüência de divisão 5 ’ não é conhecida, um fragmento de DNA contendo seqüência de divisão 5’ pode ser isolado a partir de uma peça maior do DNA que pode conter, por exemplo, uma seqüência de codificação ou mesmo um outro gene 10 ou genes.

O isolamento pode ser acompanhado pela digestão da endonuclease de restrição usando uma ou mais enzimas cuidadosamente selecionadas para isolar fragmento de DNA apropriado. Após a digestão, o fragmento desejado pode ser 15 isolado por purificação de gel de agarose, coluna Qiagen® ou outros métodos conhecidos pelos técnicos no assunto. A seleção de enzimas adequadas para acompanhar esta proposta poderá estar prontamente aparente a qualquer um técnico no assunto.

A origem do elemento de replicação é 20 tipicamente uma parte dos vetores de expressão procarióticos comercialmente adquiridos, e auxilia na amplificação do vetor em uma célula hospedeira. A amplificação do vetor para um certo número de cópias pode, em alguns casos, ser importante para a expressão ótima da NTP proteína ou NTP peptídeo. Se o vetor de 25 escolha não contém uma origem do local de replicação, ele pode ser quimicamente sintetizado baseado em uma seqüência • · conhecida, e ligada no vetor. O elemento de terminação de transcrição é tipicamente localizado 3’ na extremidade da seqüência codificando proteína NTP proteína ou NTP peptídeo, e serve para terminar a transcrição da NTP proteína ou NTP 5 peptídeo. Usualmente, o elemento de terminação de transcrição nas células procarióticas é um fragmento rico G-C seguido por uma seqüência poli T. Enquanto o elemento pode ser facilmente clonado a partir de uma biblioteca ou comercialmente adquirido como uma parte de um vetor, ele pode ser também prontamente 10 sintetizado utilizando métodos para síntese de ácido nucléico tal como aqueles descritos acima.

Um elemento de gene marcador selecionado codifica uma proteína necessária para a sobrevivência e crescimento da célula hospedeira crescida em um meio de cultura 15 seletivo. Genes marcadores típicos de seleção codificam proteínas que (a) conferem resistência à antibióticos ou outras toxinas, por exemplo, ampicilina, tetraciclina, ou kanamicina para células hospedeiras procarióticas, (b) deficiências auxotróficas complementares da célula; ou (c) suprimento de nutrientes 20 críticos não disponíveis a partir do meio complexo. Marcadores adequados preferidos são o gene de resistência a kanamicina, o gene de resistência à ampicilina, e o gene de resistência à tetraciclina.

O elemento de ligação de ribossoma, 25 comumente denominado seqüência Shine-Dalgamo (procariótes), ou seqüência Kozak (eucariotes), é usualmente necessário para a ······· ·· ·· • · · · · · · • · · · · · elemento é tipicamente

5’ para a seqüência de inibição da translação do mRNA. O localizado em 3’ para o promotor e codificação da NTP proteína ou NTP peptídeo a ser sintetizada. A seqüência Shine-Dalgarno é variada, mas é tipicamente uma polipurina (isto é, tendo um alto conteúdo A-G). Muitas seqüências Shine-Dalgarno têm sido identificadas, cada uma das quais podendo ser prontamente sintetizadas por uma pessoa técnica no assunto utilizando métodos demonstrados acima e em um vetor procariótico.

Nestes casos onde é desejável que NTP proteína ou NTP peptídeo seja secretado a partir da célula hospedeira, uma seqüência de sinal pode ser usada para dirigir a NTP proteína ou NTP peptídeo para fora da célula hospedeira onde ela é sintetizada, e a parte terminal carbóxi da proteína pode ser deletada de maneira a impedir ancoragem de membrana. Tipicamente, a seqüência de sinal é posicionada na região de codificação no gene de NTP proteína / NTP peptídeo ou cDNA, ou diretamente na terminação 5’ da região codificando o gene NTP proteína / NTPpeptídeo. Muitas seqüências de sinal têm sido identificadas, e quaisquer delas que são funcionais na célula hospedeira selecionada podem ser usadas em conjunção com o gene de NTP proteína / NTP peptídeo ou cDNA. Portanto, a seqüência de sinal pode ser homóloga ou heteróloga para o gene de NTP proteína / NTP peptídeo, ou cDNA, e pode ser homóloga ou heteróloga para o gene de NTP proteína / NTP peptídeo, ou cDNA. Adicionalmente, a seqüência de sinal pode ser

quimicamente sintetizada usando métodos demonstrados acima. Em muitos casos, a secreção do polipeptídeo a partir da célula hospedeira via a presença de um peptídeo de sinal resultarão na remoção da metionina de terminação amino a partir do 5 polipeptídeo.

Em muitos casos, a transcrição do gene NTP proteína / NTP peptídeo, ou cDNA é aumentada pela presença de um ou mais intrãos no vetor; isto é particularmente verdadeiro onde a NTP proteína ou NTP peptídeo é produzido em células 10 hospedeiras eucarióticas, especialmente células hospedeiras de mamíferos. Os intrãos usados podem estar naturalmente ocorrendo dentro do gene de NTP proteína / NTP peptídeo, especialmente onde o gene usado é uma seqüência genômica de comprimento total ou fragmento dela. Onde o intrão não está 15 ocorrendo naturalmente dentro do gene (como para a maior parte dos cDNAs), o(s) intrão(s) pode(m) ser obtido(s) de uma outra fonte. A posição do intrão com relação à seqüência de divisão e o gene de NTP proteína / NTP peptídeo é geralmente importante, como o intrão deve ser transcrito para ser efetivo. Tal como, onde 20 o gene de NTP proteína / NTP peptídeo inserido no vetor de expressão é uma molécula cDNA, a posição preferida para o intrão é 3’ para o local de começo da transcrição, e 5’ para a seqüência de transcrição poli A. Preferivelmente para NTP proteína / NTP peptídeo cDNA, o intrão ou intrões estarão 25 localizados em um ou outro lado (isto é, 5’ ou 3’) do cDNA, tal que ele não interrompa esta seqüência de codificação. Qualquer • ·

intrão de qualquer fonte, incluindo quaisquer organismos, virais, procarióticos e eucarióticos (planta ou animal), poderá ser utilizado para praticar esta invenção, provido que ele é compatível com as célula(s) hospedeira(s) nas quais ele é inserido. Também 5 incluídos aqui estão intrãos sintéticos. Opcionalmente, mais que um intrão poderá ser utilizado no vetor.

Onde um ou mais dos elementos demonstrados acima não estão ainda presentes no vetor a ser utilizado, eles podem ser individualmente obtidos e ligados no vetor. Métodos 10 utilizados para a obtenção de cada um dos elementos são bem conhecidos dos técnicos no assunto, e são comparáveis com os métodos demonstrados acima (isto é, síntese de DNA, escaneamento de biblioteca, e similares).

Os vetores finais utilizados para a prática desta 15 invenção são construídos de vetores de partida tais como um vetor comercialmente disponível. Tais vetores podem ou não conter alguns dos elementos a serem incluídos no vetor completo. Se nenhum dos elementos desejados está presente no vetor de partida, cada elemento poderá ser individualmente ligado ao vetor 20 por corte do vetor com endonuclease(s) de restrição apropriada(s) tal que as extremidades do elemento a ser ligado e as extremidades do vetor são compatíveis para ligação. Em alguns casos, pode ser necessário abrandar as extremidades a serem ligadas juntas de maneira a obter uma ligação satisfatória. 25 Abrandamento é realizado por um primeiro enchimento em “extremidades adesivas” usando polimerase Klenow DNA ou » · • · · · · • · · · · · · • · · · · • · · · · · polimerase T4 DNA na presença de todos os quatro nucleotídeos. Este procedimento é bem conhecido na técnica, e é descrito, por exemplo, em Sambrook e outros, acima. Alternativamente, dois ou mais dos elementos a serem inseridos no vetor podem ser primeiro ligados juntos (se eles estão para serem posicionados adjacentes um ao outro), e, então, ligados no vetor.

Um método adicional para construção do vetor é conduzir todos as ligações dos vários elementos simultaneamente em uma mistura de reação. Aqui, muitos vetores não senso ou não funcionais serão gerados devido à ligação imprópria ou inserção dos elementos; contudo, o vetor funcional pode ser identificado e selecionado pela restrição da digestão de endonuclease.

Vetores preferidos para a prática desta invenção são aqueles que são compatíveis com as células hospedeiras bacteriais, de insetos e de mamíferos. Tais vetores incluem, aliás, pCRII, pCR3, e pcDNA3.1 (Invitrogen Company, San Diego, Calif.), pBSII (Stratagene Company, La Jolla, Calif.), pET15b (Novagen, Madison, Wis.), PGEX (Pharmacia Biotech, Piscataway, N.J.), pEGFP-N2 (Clontech, Paio alto, Calif.), pETL (BlueBacII; Invitrogen), e pFastBacDual (Gibco/BRL, Grand Islan, N. Y.).

Após ο vetor ter sido construído e a molécula de ácido nucléico codificando uma NTP proteína ou NTP peptídeo de comprimento total ou truncado tiver sido inserida no local próprio do vetor, o vetor completo pode ser inserido em uma célula hospedeira adequada para amplificação e/ou expressão de • · • ♦ ······ • · • · · • · · • · · • · polipeptídeo. Células hospedeiras podem ser células hospedeiras procarióticas (tais como E. colí) ou células hospedeiras eucarióticas (tal como uma célula de levedura, célula de inseto, ou uuma célula vertebrada). A célula hospedeira, quando cultivada sob condições apropriadas, podem sintetizar a NTP proteína ou NTP peptídeo a qual pode subseqüentemente ser coletado a partir do meio de cultura (se a célula hospedeira a secreta no meio) ou diretamente a partir da célula hospedeira que a produz (se ela não é secretada).

Após coleta, a NTP proteína ou NTP peptídeo podem ser purificados utilizando métodos tais como cromatografia de peneira molecular, cromatografía de afinidade, e similares. A seleção da célula hospedeira para produção de NTP proteína ou NTP peptídeo dependerá em parte se a NTP proteína ou NTP peptídeo é para ser glicosilatado ou fosforilatado (no caso em que as células hospedeiras eucarióticas são preferidas), e a maneira pela qual a célula hospedeira é capaz de dobrar a proteína em sua estrutura terciária nativa (por exemplo, orientação própria das pontes de disulfeto, etc.) tal que a proteína biologicamente ativa é preparada pela NTP proteína ou NTP peptídeo que tenha atividade biológica, a NTP proteína ou NTP peptídeo podendo ser dobrados após síntese usando condições químicas apropriadas conforme discutidas abaixo. Células adequadas ou linhas de células podem ser células de mamíferos, tais como células de ovário de hamister Chinês (CHO), rim embrionário humano (HEK) 293 ou células 293T, ou células 3T3. A seleção das células

hospedeiras de mamíferos adequadas e métodos para transformação, cultura, amplificação, peneiramento e produção de produto e purificação são conhecidos na técnica.

Outras linhas de células de mamíferos adequadas são as linhas de células de macacos COS-1 e COS-7, e a linha de célula CV-1. Exemplos adicionais de células hospedeiras de mamíferos incluem linhas de células de primatas e linhas de células de roedores, incluindo as linhas de células transformadas. Células diplóides normais, linhagens de células 10 derivadas de cultura in vitro de tecidos primários, bem como transplantes primários, também são adequados. Células candidatas podem ser genotipicamente deficientes na seleção do gene, ou podem conter um gene de seleção dominantemente atuante. Outras linhas de células de mamíferos adequadas 15 incluem, mas não são limitadas a, células N2A neuroblastomas de camundongos, HeLa, células L-929 de camundongos, linhas 3T3 derivadas a partir do camundongo Swiss, Balb-cor NIH, linhas de células de hamister BHK ou HaK.

Similarmente úteis como células hospedeiras 20 adequadas para a presente invenção são células bacteriais. Por exemplo, as várias linhagens de E. coli (por exemplo, HB101, DH5.alfa., DH10, e MC 1061) são bem conhecidos como células hospedeiras no campo da biotecnologia. Varias linhagens de B. subtilis, Pseudomonas spp., outros Bacillus spp., Streptomyces 25 spp., e similares também podem ser empregados neste método.

Muitas linhagens de células de leveduras conhecidas pelos • · «

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Só técnicos no hospedeiras invenção.

assunto estão também disponíveis como células para a expressão dos polipeptídeos da presente

Adicionalmente, onde desejado, sistemas de células de insetos podem ser utilizados nos métodos da presente invenção. Tais sistemas são descritos, por exemplo, em Kitts e outros (Biotechniques, 14:810-817[1993]), Lucklow (Curr. Opin. Biotechnol., 4:564-572 [1993]) e Lucklow e outros (J. Virol., 67:4566-4579 [1993]). Células de insetos preferidas são Sf-9 e Hi5 (Invitron, Carlsbad, Calif.).

Inserção (também referida a transformação ou transfecção) do vetor na célula hospedeira selecionada pode ser acompanhada usando tais métodos como cloreto de cálcio, eletroporação, micro injeção, lipofecção, ou método DEAEdextran. O método selecionado será em parte uma função do tipo de célula hospedeira a ser utilizada. Estes métodos e outros métodos adequados são bem conhecidos dos técnicos no assunto, e são demonstrados, por exemplo, em Sambrook e outros, acima mencionado.

As células hospedeiras contendo o vetor (isto é, transformadas ou transfectadas) podem ser cultivadas utilizando meio padrão bem conhecido dos técnicos no assunto. O meio usualmente contém todos os nutrientes necessários para o crescimento e sobrevivência das células.

Os meios adequados para cultura de células E. coli são, por exemplo, Luria Broth (LB) e/ou Terrific Broth (TB).

Meios adequados para cultivo de células eucarióticas são RPM1

1640, MEM, DMEM, todas as quais podendo ser suplementadas com soro e/ou fatores de crescimento como requerido pela linha de célula particular que está sendo cultivada. Um meio adequado 5 para culturas de insetos é o meio Grace suplementado com yeastolate, lactalbumin hidrolisada, e/ou soro de novilho fetal quando necessário. Tipicamente, um antibiótico ou outro composto útil para crescimento seletivo das células transformadas somente é adicionado como um suplemento ao meio. O composto ío a ser usado será ditado pelo elemento marcador selecionável presente no plasmídeo com o qual a célula hospedeira foi transformada. Por exemplo, onde o elemento marcador selecionável é resistência a kanamicina, o composto adicionado ao meio de cultura será kanamicina.

A quantidade de NTP proteína ou NTP peptídeo produzida na célula hospedeira pode ser avaliada usando métodos padrões conhecidos na técnica. Tais métodos incluem, sem limitação, análise de mancha Western, eletroforese de gel SDSpoliacrilamida, eletroforese de gel não denaturante, separação

HPLC, espectroscopia de massa, imunoprecipitação, e/ou ensaios de atividade tais como ensaios de substituição de ligação gel de DNA.

Se a NTP proteína ou NTP peptídeo tiverem sido designados para serem secretados a partir das células hospedeiras, a maioria das NTP proteína ou NTP peptídeo poderá ser encontrada no meio de cultura de célula. As proteínas • · • · · · · • · · ·· •· · •· · • ·· ········ ·· • · · · · • · · · · · · • · · · · • · · « · · • · · · · · · ίΎ preparadas deste modo tipicamente não possuem uma metionina de terminação amino, a medida que ela é removida durante a secreção da célula. Se, contudo, a NTP proteína ou NTP peptídeo não é secretado das células hospedeiras, ele estará presente no citoplasma e/ou núcleo (para as células hospedeiras eucarióticas), ou no citisol (para células hospedeiras de bactéria gram negativa), e podem ter uma metionina de terminação amino.

Para a NTP proteína ou NTP peptídeo situado no citoplasma da célula hospedeira e/ou no núcleo, as células hospedeiras tipicamente são primeiro rompidas mecanicamente, ou com detergente para liberar os conteúdos intracelulares em uma solução tamponada. A NTP proteína ou NTP peptídeo então podem ser isolados desta solução.

A purificação da NTP proteína ou NTP peptídeo da solução pode ser acompanhada utilizando uma variedade de técnicas. Se a proteína tiver sido sintetizada tal que ela contenha um identificador tal como hexaHistidina (por exemplo., NTP peptídeo/hexaHis), ou outro peptídeo pequeno tal como FLAG (Sigma-Aldritch, St. Louis, MI), ou peptídeo de ligação calmodulin (Stratagene, La Jolla, CA) em ou sua terminação carboxil ou amino, ele pode essencialmente ser purificado em um processo de uma etapa pela passagem da solução através de uma coluna de afinidade onde a matriz da coluna possui uma alta afinidade para o identificador ou para a proteína diretamente (isto é, um anticorpo monoclonal especificamente reconhecendo o NTP peptídeo). Por exemplo, polihistidina se liga com grande

afinidade e especificidade ao níquel, zinco, e cobalto; assim, cromatografia de afinidade de íon metal imobilizado que emprega uma resina de afinidade baseada em níquel (conforme usado no sistema expresso QIA Quiagen ou Sistema Xpress Invitrogen), ou 5 uma resina de afinidade baseada em cobalto (conforme usado em sistema BD Biosciences-CLONTECH Talon), pode ser usada para purificação da NTP peptídeo/poliHis. (Ver, por exemplo, Ausubel e outros., edição, Current Protocols in Molecular Biology, Seção 10.11.8, John Wiley & Sons, New York [1993]).

Onde a NTP proteína ou NTP peptídeo é preparado sem um identificador afixado, e anticorpos não estão disponíveis, outros procedimentos bem conhecidos para purificação podem ser utilizados. Tais procedimentos incluem, sem limitação, cromatografia de troca de íon, cromatografia de hidroxiapatita, cromatografia de interação hidrofóbica, cromatografia de peneira molecular, HPLC, eletroforese de gel nativa em combinação com eluição gel, e focalização isoelétrica preparativa (técnica/máquina “Isoprime”, Hoefer Scientific). Em alguns casos, duas ou mais destas técnicas podem ser combinadas 20 para alcançar pureza aumentada.

Se é antecipado que a NTP proteína ou NTP peptídeo serão encontrados primariamente intracelularmente, o material intracelular (incluindo corpos de inclusão para bactéria gram-negativa) pode ser extraído a partir da célula hospedeira 25 usando quaisquer técnicas padrões conhecidas pelos técnicos no assunto. Por exemplo, as células hospedeiras podem ser lisadas

para liberar os conteúdos do periplasma/citoplasma por prensa Francesa, homogeneização, e/ou sonicação seguida por centrifugação. Se a NTP proteína ou NTP peptídeo tiver formado corpos de inclusão no citisol, os corpos de inclusão podem 5 freqüentemente se ligar às membranas celulares internas e/ou externas e, assim, podem ser encontrados primariamente no material em pelota após centrifugação. O material em pelota então pode ser tratado em pH extremos, ou com agentes chaotrópico tal como um detergente, guanidina, derivados de guanidina, uréia, ou 10 derivados de uréia, na presença de um agente de redução tal como ditiotreitol em pH alcalino ou fosfina tris carboxietil em pH ácido para liberar, fora quebra, e solubilizar os corpos de inclusão. A NTP proteína ou NTP peptídeo em sua nova forma solúvel pode, então, ser analisada usando eletroforese gel, 15 imunoprecipitação ou similares Se é desejado isolar a NTP proteína ou NTP peptídeo, o isolamento pode ser executado usando métodos padrões tais como aqueles demonstradas abaixo, e em Marston e outros (Meth. Enz. 182:264-275 [1990]).

Em alguns casos, a NTP proteína ou NTP 20 peptídeo podem não ser biologicamente ativos após isolamento.

Vários métodos para redobradura ou conversão do polipeptídeo em sua estrutura terciária e geração de ligações de dissulfeto, podem ser utilizados para restaurar a atividade biológica. Tais métodos incluem exposição do polipeptídeo solubilizado em um 25 pH usualmente acima de 7, e na presença de uma concentração particular do chaotropo.

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A seleção do chaotropo é muito similar às escolhas utilizadas para a solubilização do corpo de inclusão, mas usualmente em uma concentração inferior, e não é necessariamente o mesmo chaotropo conforme usado para a solubilização. Em muitos casos, a solução de redobradura/oxidação também pode conter uma agente de redução ou mais um agente de redução, a forma oxidada na taxa específica para gerar um potencial redox particular permitindo que dissulfeto falso ocorra na formação da ponte de cisteína proteína.

Alguns dos pares redox comumente usados incluem cisteína/cistamina, glutationa (GSH)/ditiobis (GSH, cloreto cúprico, ditiotreitol (DTT)/ditiane DTT, 2-mercaptoetanol (bME)/ditio-b(ME). Em muitos exemplos, um co-solvente pode ser necessário para aumentar a eficiência da redobradura, e os reagentes mais comuns usados para esta propósito incluem glicerol, polietileno glicol de vários pesos moleculares, e arginina.

Se os corpos de inclusão da NTP proteína ou NTP peptídeo não são formados em um grau significante na célula hospedeira, a NTP proteína ou NTP peptídeo podem ser encontrados primariamente no sobrenadante após centrifugação do homogenato de célula, e a NTP proteína ou NTP peptídeo podem ser isolados do sobrenadante utilizando métodos tais como aqueles demonstrados abaixo.

Nestas situações onde é preferível isolar parcialmente ou completamente a NTP proteína ou NTP peptídeo, a purificação pode ser executada usando métodos padrões bem

conhecidos dos técnicos no assunto. Tais métodos incluem, sem limitação, separação por eletroforese seguida por eletroeluição, vários tipos de cromatografias (imunoafinidade, peneira molecular, e/ou troca de íon), e/ou cromatografia líquida de alta 5 pressão. Em alguns casos, pode ser preferível utilizar mais do que um destes métodos para purificação completa.

Em adição à preparação e purificação da NTP proteína ou NTP peptídeo utilizando técnicas de DNA recombinantes, as NTP proteína ou NTP peptídeo e seus 10 fragmentos, variantes, homólogos, proteínas de fusão, miméticos de peptídeo, e derivados, podem ser preparados por métodos de síntese química (tais como sínteses de peptídeo de fase sólida) usando técnicas conhecidas na arte tais como aquelas demonstradas por Merrifield e outros, (J. Am. Chem. Soe., 15 85:2149 [1963])., Houghten e outros (Proc. Natl. Acad. Sei. USA,

82:5132 [1985]), and Stewart and Young, Solid Phase Peptide Synthesis, Pierce Chemical Co., Rockford, III. [1984]). Tais polipeptídeos podem ser sintetizados com ou sem uma metionina em uma terminação amino. NTP proteína ou NTP peptídeo 20 quimicamente sintetizados podem ser oxidados utilizando métodos demonstrados nestas referências para formar pontes de dissulfetos.

As NTP proteína ou NTP peptídeo são esperadas como tendo atividade biológica comparável às NTP 25 proteína ou NTP peptídeo produzidas recombinantemente ou purificados a partir de fontes naturais, e assim podem ser usadas

intervariavelmente com NTP proteína ou NTP peptídeo recombinantes ou neurais.

As composições de NTP proteína ou NTP peptídeo quimicamente modificadas nas quais o NTP peptídeo é 5 ligado a um polímero são incluídas dentro do escopo da presente invenção. O polímero selecionado é tipicamente solúvel em água de maneira que a proteína na qual ele é fixado não precipita em meio aquoso, tal como um meio fisiológico. O polímero selecionado pode é usualmente modificado para ter um grupo 10 reativo único, tal como um éster ativo para acilação, ou um aldeído para alquilação, de maneira que o grau de polimerização pode ser controlado conforme provido nos presentes métodos. O polímero pode ser de qualquer peso molecular, e pode ser ramificado ou não ramificado. Incluídos dentro do escopo dos 15 polímeros de NTP peptídeo está uma mistura de polímeros.

Em alguns casos, pode ser desejável preparar ácido nucléico e/ou variantes de amino ácidos das NTP proteína ou NTP peptídeo que ocorrem naturalmnte. As variantes de ácido nucléico podem ser produzidos usando mutagenese dirigida local, 20 amplificação PCR, ou outros métodos apropriados, onde os iniciador(s) tenha(m) os pontos de mutações desejados (ver Sambrook e outros, acima, e Ausubel e outros, acima, para descrição de técnicas de mutagenese). Sínteses químicas utilizando os métodos descritos por Engels e outros, acima, 25 podem também ser utilizadas para preparar tais variantes. Outros métodos conhecidos pelos técnicos no assunto podem também ser utilizados.

Variantes de ácidos nucléicos preferidas são aquelas contendo contagem de substituições nucleotídeas para 5 preferência de códon na célula hospedeira que é para ser utilizada para produzir a NTP proteína ou NTP peptídeo. Tal otimização de códon pode ser determinada via algoritmos de computador os quais incorporam tabelas de freqüência de códon tais como Ecohigh.Cod para preferência de códon de genes bacteriais 10 altamente expressos conforme provido pela University of Wisconsin Package Versão 9.0, Genetics Computer Group, Madison, Wis. Outras tabelas de freqüência de códon úteis incluem “Celegans_high.cod”, “Celegans_low.cod”, “Drosophila_high.cod”, “Human_high.cod”, “Maize_high.cod, e 15 Yeast high.cod”. Outras variantes preferidas são aquelas que codificam mudanças de amino ácidos conservativas conforme descrito acima (por exemplo, em que a carga ou polaridade da cadeia lateral de amino ácido ocorrendo naturalmente não é alterada substancialmente pela substituição com um amino ácido 20 diferente) quando comparado ao tipo selvagem, e/ou aqueles designados para gerar um novo local de glicosilação e/ou fosforilação, ou aqueles designados para deletar um local de glicosilação e/ou fosforilação existente.

Os NTP proteínas, NTP peptídeos, e 25 fragmentos, homólogos, variantes, proteínas de fusão, miméticos de peptídeo, derivados e sais deles podem também ser feitos

utilizando técnicas de síntese de peptídeo convencionais conhecidas por um técnico na arte. Estas técnicas incluem métodos de acoplamento químico (conforme Wunsch, E. “Methoden der organischen Chemie”, Volume 15, Banda 1+2, 5 Synthese Von Peptiden, thime Verlag, Stuttgart (1974), e

Barrancy, G.; Marrifield, R. B.: “The Peptides”, edições E. Gross, J. Meienhofer, Volume 2, Capítulo 1, pp 1-284, Academic Press (1980)), métodos de acoplamento enzimático (conforme, Widmer, F. Johansenm J. T., Carlsberg Res. Commun., Vol. 44, pp. 37-46 10 (1979), e Kullmann, W.: “Enzymatic Peptide Synthesis”, CRC

Press Inc. Boca Raton, Fia. (1987), e Widmer, F., Johansen, J. T. em “Synthetic Peptides in Biology and Medicines:, edições Alitalo, K., Partanen, P., Vatiere, A, A., página 79-86, Elsevier, Amsterdam (1985)), ou uma combinação de métodos químicos e 15 enzimáticos se isto é vantajoso para o processo, desenvolvimento e economia. Usando as guias providas aqui, aqueles técnicos na arte são capazes de variando a seqüência peptídeo NTP peptídeo produzir um homólogo tendo a mesma atividade biológica ou atividade biológica similar (bioatividade) como a NTP proteína 20 ou NTP peptídeo original ou nativo.

Pode ser uma vantagem utilizar um mimético de uma dada NTP proteína ou NTP peptídeo melhor que o próprio peptídeo. Em geral, os mimétivos de peptídeo são mais biodispopníveis, possuem uma longa duração de ação, e podem 25 ser mais baratos para produzir do que proteínas e peptídeos.

Assim os NTP peptídeos descritos acima têm utilidade no desenvolvimento de tais compostos químicos pequenos com atividades biológicas similares e, portanto, com utilidades terapêuticas similares. Os miméticos de peptídeo 5 podem ser desenvolvidos utilizando técnicas químicas combinatórias e outras técnicas conhecidas na arte (ver, por exemplo, Proceeding of the 20th European Peptide Symposium, edição G. Jung, E. Bayer, página 289-336, e referências).

Exemplos de métodos conhecidos na técnica 10 para modificar estruturalmente um peptídeo para criar um peptídeo mimético incluem a inversão dos centros quirais da espinha dorsal conduzindo para estruturas de resíduos de D-amino ácido que podem, particularmente na terminação N, conduzir a aumentar a estabilidade para degradação proteolítica sem afetar 15 adversamente a atividade. Um exemplo é provido em “Tritriated D-ala¹-Peptide T Binding”, Smith C. S. e outros, Drug Development Res. 15, pp. 371-379 (1988).

Um segundo método é a alteração da estrutura cíclica para estabilidade, tal como imidas de intercadeia N para C 20 e lactamas (Ede e outros em Smith and Rivier (Eds.) “Peptides: Chemistry and Biology”, Escom, Leiden (1991), pp. 268-270). Um exemplo deste é dado em compostos similares a thymopentin conformacionalmente restritos, tais como aqueles descritos na Patente dos Estados Unidos N° 4.457.489 (1985), Goldstein, G. e 25 outros, a descrição do qual sendo incorporada aqui por referência em sua totalidade.

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Um terceiro método é substituir ligações de peptídeo no NTP peptídeo por ligações pseudopeptídeos que conferem resistência as proteólises. Um número de ligações de pseudopeptídeos tem sido descrito pelo fato de em geral não 5 afetar a estrutura do peptídeo e a atividade biológica. Um exemplo desta abordagem é substituir as ligações retro-inversa do pseudopeptídeo (“Biologically active retroinverso analogues of thymopentin”, Sisto A. e outros em River, J. E. and Marshall, G. R. (edições) “Peptides, Chemistry, Structure and Biology”, 10 Escom, Leiden (1990), páginas 722-773) e Dalpozzo, e outros (1993), Int. J. Peptide Protein Res., 41:561-566, incorporados aqui por referência). De acordo com esta modificação, as seqüências de amino ácido dos peptídeos podem ser idênticas às seqüências do NTP peptídeo descrito acima, exceto pelo fato de 15 que uma ou mais das ligações de peptídeos são substituídas por uma ligação pseudopeptídeo retro-inversa. Preferivelmente a maior ligação do peptídeo N- terminal é substituída, uma vez que tal substituição virá a conferir resistência à proteólise por exopeptídases atuando nas terminações N.

A síntese de peptídeos com um ou mais ligações pseudopeptídeos retro-inversas reduzidas é conhecida na técnica (Sisto (1990) e Dalpozzo, e outros (1993), citada acima). Assim, ligações de peptídeo podem ser substituídas por ligações não peptideas que permitem ao peptídeo mimético adotar uma 25 estrutura similar, e, portanto, a atividade biológica ao peptídeo original. Modificações adicionais também podem ser feitas por substituição dos grupos químicos dos amino ácidos com outros grupos químicos de estrutura similar. Uma outra adequada ligação pseudopeptideo que é conhecida por aumentar a estabilidade à divisão enzimática com nenhuma ou pouca perda da atividade 5 biológica é a ligação pseudopeptidea isostere reduzida (Couder, e outros (1993), Int. J. Peptide Protein Res., 41:181-184, aqui incorporada por referência em sua totalidade). Assim, as seqüências de amino ácido destes peptídeos podem ser idênticas às seqüências de um NTP peptídeo, exceto pelo fato que uma ou ío mais das ligações de peptídeos são substituídas por uma ligação pseudopeptideo isostere. Preferivelmente a maior ligação de peptídeo da terminação N é substituída, uma vez que a substituição poderá conferir resistência à proteólise por exopeptidases atuando na terminação N. A síntese de peptídeos 15 com uma ou mais ligações pseudopeptídeos isosteres é conhecida na técnica (Couder e outros (1993), citada acima). Outros exemplos incluem a introdução de ligações de cetometileno ou de metilsulfeto para substituir as ligações de peptídeos.

Derivados peptóides de NTP peptídeo 20 representam outra classe de peptídeos miméticos que retém determinantes estruturais importantes para atividade biológica, ainda eliminando as ligações de peptídeos, conferindo, portanto, resistência à proteólise (Simon, e outros, 1992, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89: 9367-9371, e incorporada aqui por referência em sua 25 totalidade). Peptóides são oligômeros de glicinas N-substituídas.

Um número de grupos N-alquil têm sido descrito, cada um • ·

correspondendo à cadeia lateral de um amino ácido natural (Simon, e outros (1992), citado acima e incorporado aqui por referência em sua totalidade). Alguns ou todos os amino ácidos do NTP-peptídeo são substituídos com a glicina N-substituída 5 correspondente ao amino ácido substituído.

O desenvolvimento de peptídeos miméticos pode ser auxiliado pela determinação da estrutura terciária do NTP peptídeo original por espectroscopia NMR, cristalografia e/ou modelação molecular com o auxílio do computador. Estas 10 técnicas ajudam no desenvolvimento de composições novas de alta potência e/ou maior biodisponibilidade e/ou maior estabilidade do que o peptídeo original (Dean (1994), BioEssays, 16:683-687; Cohen and Shatzmiller (1993), J. Mol. Graph., 11:166-173; Wiley and Rich (1993), Med. Res. Rev., 13:327-384;

Moore (1994), Trends Pharmacol. Sei., 15:124-129; Hruby (1993), Biopolymers, 33:1073-1082; Bugg e outros (1993), Sei. Am. 269:92-98, todas incorporadas aqui por referência em sua totalidade).

Uma vez que um composto mimético peptídeo 20 potencial é identificado, ele pode ser sintetizado e ensaiado utilizando os métodos resumidos nos exemplos abaixo para acessar sua atividade. Os compostos miméticos peptídeos obtidos pelos métodos acima, tendo a atividade biológica dos NTP peptídeos e estrutura tridimensional similar, são abrangidos por 25 esta invenção. Deve ser prontamente aparente aos técnicos no assunto que um mimético de peptídeo pode ser gerado a partir de

Dô quaisquer NTP peptídeos suportando uma ou mais das modificações descritas acima. Será, além disso, aparente que os miméticos de peptídeos desta invenção podem ser adicionalmente utilizados para o desenvolvimento de compostos não peptídicos igualmente mais potentes, em adição à sua utilidade como compostos terapêuticos.

Atualmente existe um número de organizações que estão capacitadas a sintetização os NTP peptídeos aqui descritos. Por exemplo, dada uma seqüência de um NTP peptídeo, 10 a organização pode sintetizar o peptídeo e enviar o peptídeo sintetizado acompanhado de documentação e prova de identidade do peptídeo.

Esta invenção também engloba o uso de NTP peptídeos e suas moléculas de ácido nucléico correspondentes 15 para ensaios para testar, ou qualitativamente ou quantitativamente, a presença de NTP peptídeos, NTP proteínas, AD7c-NTP, NTP peptídeo DNA, NTP proteína DNA, AD7c-NTP DNA ou RNA correspondentes em tecido de mamífero ou amostras de fluidos corpóreos. Os NTP peptídeos e suas 20 moléculas de ácido nucléico correspondentes podem ser utilizados na preparação de tais ensaios, se ou não o NTP peptídeo ou o NTP peptídeo DNA codificado mostra atividade biológica. As seqüências de ácido nucléico de NTP peptídeo podem ser uma fonte útil de sondas de hibridização para testar, ou 25 qualitativamente ou quantitativamente, a presença do NTP peptídeo DNA, NTP proteína DNA, AD7c-NTP DNA ou • ·

Too correspondente RNA no tecido de mamífero ou amostras de fluidos corpóreos.

O NTP peptídeo que não é por si próprio biologicamente ativo pode ser útil para a preparação de anticorpos 5 que reconhecem e/ou ligam NTP peptídeos, NTP proteínas ou AD7c-NTP proteína. Tais anticorpos podem ser preparados utilizando métodos padronizados. Então, anticorpos que reagem com ou se ligam aos NTP-peptídeos, bem como com fragmentos de anticorpo de cadeia curta e outros fragmentos reativos de tais 10 anticorpos, são também contemplados como dentro do escopo da presente invenção.

Os anticorpos podem ser policlonais, monoclonais, recombinantes, quiméricos, de cadeira simples e/ou biespecíficos. Tipicamente, o anticorpo ou fragmento dele pode 15 ser tanto de origem humano, ou podem ser “humanizados”, isto é, preparado de maneira a impedir ou minimizar uma reação imune ao anticorpo quando administrado a um paciente.

Anticorpos preferidos são anticorpos humanos, tanto policlonal ou monoclonal, O fragmento de anticorpo pode 20 ser qualquer fragmento que é reativo com NTP peptídeos da presente invenção, tal como F_ab, F_ab’> etc. Também providos por esta invenção são hibridomas geradas pela apresentação de qualquer NTP peptídeo como um antígeno para um mamífero selecionado, seguido por células fundidas (por exemplo, células 25 do baço) do mamífero com certas células de câncer para criar linhas de células imortalizadas por técnicas conhecidas. Os • · • · • · · • · · • · · • · · · · · • · · • · • · • ·

101 métodos empregados para gerar tais linhas de células e anticorpos dirigidos contra todo ou porções de um NTP peptídeo são também envolvidos por esta invenção.

Os anticorpos podem adicionalmente serem utilizados para diagnósticos in vivo e in vitro ou para propósitos de pesquisas, tais como na forma indicada para detectar a presença de NTP peptídeo, NTP proteína ou AD7c-NTP em um fluido do corpo ou amostra de células.

Esta invenção também engloba o uso de um os mais NTP peptídeos como padrões de calibração em ensaios que testam, tanto qualitativamente ou quantitivamente, a presença de NTP peptídeos, NTP proteínas, AD7c NTP, NTP peptídeo DNA, NTP proteína DNA, AD7c-NTP DNA ou RNA correspondente no tecido de mamífero ou amostras de fluidos corpóreos.

A presente invenção é dirigida a métodos de tratamento das condições que requerem a remoção das células, tais como tumores benignos e malignos, hiperplasia glandular (por exemplo, próstata), cabelo facial não desejado, verrugas e tecidos gordurosos não desejados, ou a inibição ou prevenção de proliferação celular indesejada, tais como estenose de um extensor. Tal método compreende em administrar a um mamífero em necessidade, ou revestimento, um dispositivo tal como um extensor com uma quantidade terapeuticamente efetiva do NTP peptídeo.

A condição pode ser, por exemplo, tumores de pulmão, mama, estômago, pâncreas, próstata, bexiga, osso, • · ovário, pele, rim, sinus, cólon, intestino, estomago, reto, esôfago, sangue, cérebro e seus revestimentos, medula espinhal e seus revestimentos, músculos, tecido conectivo, glândula supra-renal, paratiróide, tiróide, útero, testículo, pituitária, órgãos 5 reprodutivos, fígado, vesícula biliar, olho, ouvido, nariz, garganta, amídala, boca, nodos linfáticos e sistema linfóide, e outros órgãos.

Como usado aqui, o termo “tumor maligno” é pretendido englobar todas as formas de carcinomas humanos, sarcomas e melanomas os quais ocorrem em formas pobremente 10 diferenciadas, moderadamente diferenciadas, e formas bem diferenciadas.

Esta invenção satisfaz uma necessidade da técnica para tratamentos que podem remover tumores benignos com menos risco e poucos efeitos colaterais indesejados da 15 cirurgia. Um método de remoção de tumores benignos em áreas cirurgicamente perigosas tais como em localizações profundas no corpo (por exemplo, cérebro, coração, pulmões, e outros) é particularmente necessário.

O método de tratamento das condições onde 20 células devem ser removidas pode ser utilizado em conjunção com métodos tradicionais de tratamento de tais condições, tais como excissão cirúrgica, quimioterapia, e radiação. Os NTP peptídeos podem ser administrados antes, durante, ou após tais tratamentos convencionais.

A condição a ser tratada pode também ser a hiperplasia, hipertrofia, ou supercrescimento de um tecido • · • ··· ·· ··♦ ··· ·· · ·· ·· selecionado a partir do grupo consistindo de pulmão, mama, estômago, pâncreas, próstata, bexiga, osso, ovário, pele, rim, sinus, cólon, intestino, estômago, reto, esôfago, sangue, cérebro e seus revestimentos, medula espinhal e seus revestimentos, músculos, tecidos conectivos, glândula supra-renal, paratiróide, tiróide, útero, testículo, pituitária, órgãos reprodutivos, fígado, vesícula biliar, olho, ouvido, nariz, garganta, amídala, boca e nodos linfáticos e sistema linfóide.

φ Outras condições que podem ser tratadas utilizando o método da invenção são tecido alterado viralmente, bacterialmente ou parasiticamente, selecionado a partir do grupo consistindo de pulmão, mama, estômago, pâncreas, próstata, bexiga, osso, ovário, pele, rim, sinus, cólon, intestino, estômago, reto, esôfago, sangue, cérebro e seus revestimentos, medula espinhal e seus revestimentos, músculos, tecidos conectivos, glândula supra-renal, paratiróide, tiróide, útero, testículo, φ pituitária, órgãos reprodutivos, fígado, vesícula biliar, olho, ouvido, nariz, garganta, amídala, boca, nodos linfáticos e sistema linfóide.

A condição a ser tratada pode também ser uma má-formação ou uma doença de um tecido selecionado a partir do grupo consistindo de pulmão, mama, estômago, pâncreas, próstata, bexiga, osso, ovário, pele, rim, sinus, cólon, intestino, estômago, reto, esôfago, sangue, cérebro e seus revestimentos, medula espinhal e seus revestimentos, músculos, tecidos conectivos, glândula supra-renal, paratiróide, tiróide, útero,

testículo, pituitária, órgãos reprodutivos, fígado, vesícula biliar, olho, ouvido, nariz, garganta, amídala, boca, nodos linfáticos e sistema linfóide.

Em particular, a condição a ser tratada pode ser hipertrofia tonsilar, hiperplasia prostática, psoríase, eczema, dermatoses ou hemorróidas. A condição a ser tratada pode ser uma doença vascular, tal como aterosclerose ou arteriosclerose, ou uma doença vascular, tal como veias varicosas, estenose ou φ restenose de uma artéria ou um extensor. A condição a ser tratada pode também ser uma modificação cosmética em um tecido, tal como pele, olho, ouvido, nariz, garganta, boca, músculo, tecido conectivo, cabelo, ou tecido da mama.

Composições terapêuticas dos NTP peptídeos também são contempladas na presente invenção. Tais 15 composições podem compreender uma quantidade terapeuticamente efetiva de um NTP peptídeo em mistura com um φ veículo farmaceuticamente aceitável.

O material veículo pode ser água para injeção, preferivelmente suplementada com outros materiais comuns em 20 soluções para administração em mamíferos. Tipicamente, um

NTP peptídeo para uso terapêutico pode ser administrado na forma de uma composição compreendendo NTP peptídeo purificado em conjunção com um ou mais veículos fisiologicamente aceitáveis, excipientes, ou diluentes. Salina 25 tamponada neutra ou salina misturada com soro albumina são veículos exemplares apropriados. Preferivelmente, o produto é

W6 formulado como um liofilizante utilizando excipientes apropriados (por exemplo, sucrose). Outros veículos padrões, diluentes, e excipientes podem ser incluídos conforme desejado.

As composições da invenção podem compreender também tampões conhecidos daqueles tendo conhecimento comum na técnica com uma faixa apropriada de valores de pH, incluindo tampão Tris de pH de cerca de 7.0-8.5, ou tampão acetato de pH de cerca de 4.0-5.5, que podem φ adicionalmente incluir sorbitol ou um substituto adequado deles.

O uso de NTP peptídeos conjugados ou ligados ou unidos a um anticorpo, fragmento de anticorpo, molécula similar a anticorpo, ou uma molécula com uma afinidade alta a um marcador de tumor específico, tal como um receptor celular, peptídeo de sinal ou enzima superexpressa, para atingir os elementos celulares não desejados também estão englobados pelo escopo da invenção.

φ O anticorpo, fragmento de anticorpo, molécula similar a anticorpo, ou molécula com uma alta afinidade a um marcador de tumor específico, são usados para atingir o NTP 20 peptídeo conjugado a um alvo de tecido ou celular específico. Por exemplo, um tumor com um antígeno de superfície distintivo, ou antígeno expresso, pode ser alvejado por um anticorpo, fragmento de anticorpo, molécula de ligação similar ao anticorpo, e as células do tumor podem ser mortas pelo NTP peptídeo. Tal 25 abordagem usando anticorpos alvejados possuem uma vantagem antecipada de dosagem diminuída, aumento da probabilidade de

hOG ligação à e compreensão pela células alvo, e benefício aumentado para alvejamento e tratamento dos tumores metásticos e tumores de tamanhos microscópicos.

Esta invenção também engloba a utilização de •

NTP peptídeos conjugados ou ligados ou unidos a uma proteína ou outra molécula para formar uma composição que, após divisão no ou próximo do(s) local(is) do tumor ou outras células indesejadas por uma enzima específica de tumor ou local ou • protease, ou por um anticorpo conjugado que alveja tumores ou outras células não desejadas, liberam o NTP peptídeo no ou próximo do(s) local(is) do tumor ou outras células não desejadas.

A invenção também engloba a utilização de

NTP peptídeos conjugados ou ligados ou unidos a uma proteína ou outra molécula, para formar uma composição que libera o NTP peptídeo ou algum fragmento biologicamente ativo do NTP peptídeo após exposição do tecido a ser tratado para iluminar φ (como em terapias a laser ou outras terapias foto-dinâmicas ou foto-ativadas), outras formas de radiação eletro-magnética tais como radiação infravermelha, radiação ultravioleta, radiação de raio-X ou raio gama, calor localizado, radiação alfa ou beta, emissões ultrassônicas, ou outras fontes de energia localizada.

Os NTP peptídeos podem ser empregados sozinhos, juntos, ou em combinação com outras composições farmacêuticas, tais como citocinas, fatores de crescimento, antibióticos, agentes de indução de apoptoses, anti-inflamatórios, ··· »· ·· · ·«······ ·· ·· • · · ·* · · · · · · · ·

A · · · · · · · · · · · · β · · » · · · ······ • · · · ········ ··· »· ·«· ·♦· ·· · ·· ·· e/ou agentes quimioterápicos conforme é apropriado para a indicação sendo tratada.

Esta invenção também envolve composições terapêuticas de NTP peptídeos empregando dendrimeros, fulerenes, e outras moléculas sintéticas, polímeros e macromoléculas onde o NTP peptídeo e/ou sua molécula de DNA corresponde é conjugada com, fixada à, ou encerrada na molécula, polímero ou macromolécula, tanto por si própria ou em conjunção com outras espécies de moléculas tais como um marcador de tumor específico. Por exemplo, a Patente dos

Estados Unidos N° 5.714.166, Bioactive and/ou Targeted

Dendimer Conjugates, prevê um método de preparação e uso, de conjugados de polímeros dendriticos compostos de pelo menos um dendrímero com um diretor alvo, e pelo menos um agente 15 bioativo conjugado a ele. A revelação da Patente dos Estados

Unidos N° 5.714.166 é incorporada aqui por referência em sua totalidade.

Esta invenção também engloba composições terapêuticas de NTP peptídeos e/ou genes e veículos de distribuição de drogas tais como emulsões lipídicas, polímeros de micelle, microesferas de polímeros, polímeros eletroativos, hidrogéis e lipossomas.

O uso de NTP peptídeos ou genes relacionados ou genes equivalentes transferidos para as células não desejadas é 25 envolvido pela invenção. A superexpressão do NTP peptídeo dentro do tumor pode ser usada para induzir as células no tumor • ·

para matar e, desse modo, reduzir a população de células do tumor.

O gene ou equivalente do gene transferido do NTP peptídeo para tratar os elementos celulares não desejados é antecipado para ter a vantagem de requerer menos dosagem, e de ser passado na progênia celular dos elementos celulares alvos, necessitando, desse modo, menos terapia freqüente, e menos terapia total. Esta invenção também engloba a transferência de genes que codificam para uma proteína de fusão contendo um 10 NTP peptídeo para as células não desejadas ou células vizinhas onde, seguindo a expressão do gene e a produção e/ou a secreção da proteína de fusão, a proteína de fusão é dividida tanto por enzimas nativas ou proteases ou por um pró-fármaco para liberar o NTP peptídeo, na ou próximo das células não desejadas.

O uso de conjugados de anticorpos-NTPpeptídeo recombinante clonado; conjugados de fragmento de anticorpo-NTP-peptídeo recombinante; e conjugados da proteína similar ao anticorpo-NTP-peptídeo recombinante é também englobado pelo escopo da invenção. As vantagens de um NTP 20 peptídeo clonado combinado com conjugado alvejado (tal como um anticorpo, fragmento de anticorpo, molécula similar a anticorpo, ou uma molécula com uma alta afinidade a um receptor específico a câncer, ou outros marcadores de tumor), são aquelas tal como uma molécula combinando as vantagens alvejadas 25 descritas acima em adição às vantagens para fabricação e produção padronizada da molécula conjugada clonada.

Esta invenção também envolve o uso de composições terapêuticas de NTP peptídeos, ou genes de NTP, ou genes equivalentes, como um componente do revestimento de um dispositivo médico tal como um extensor de modo a remover, 5 inibir ou impedir proliferação ou acúmulo celulares indesejados.

Formas de dosagem sólidas para administração oral incluem, mas não estão limitadas a, cápsulas, tabletes, pílulas, pós e grânulos. Em tais formas de dosagem sólida, o composto ativo é misturado com pelo menos um dos seguintes:

(a) um ou mais excipientes inertes (ou veículos), tais como citrato de sódio ou fosfato de dicálcio;

(b) enchedores ou extensores, tais como amido, lactose, sucrose, glucose, manitol, e ácido silícico;

(c) ligantes, tais como carboximetilcelulose, 15 alginatos, gelatina, polivinilpirrolidona, sucrose e acácia;

(d) umectantes, tais como glicerol;

(e) agentes de desintegração, tais como agaragar, carbonato de cálcio, amido de batata ou tapioca, ácido algínico, certos silicatos complexos, e carbonato de sódio;

(f) retardadores de solução, tais como parafina;

(g) aceleradores de absorção, tais como compostos de amônia quaternária;

(h) agentes umectantes, tais como álcool acetil e monoesterato glicerol;

(i) adsorventes, tais como caulim e bentonita; e

110

(j) lubrificantes, tais como talco, estearato de cálcio, estereato de magnésio, glicóis polietileno sólidos, sulfato de lauril sódio, ou misturas deles. Para cápsulas, tabletes, e pílulas, as formas de dosagem podem também compreender 5 agentes de tamponamento.

Formas de dosagem líquida para administração oral incluem emulsões farmaceuticamente aceitáveis, soluções, suspensões, xaropes, e elixires. Em adição aos compostos ativos, as formas de dosagem líquida podem compreender diluentes 10 inertes comumente usados na técnica, tais como água ou outros solventes, agentes solubilizantes, e emulsificantes. Emulsificantes exemplares são álcool etil, álcool isopropil, carbonato de etil, acetato de etil, álcool benzil, benzoato de benzil, propilenoglicol, 1,3-butilenoglicol, dimetilformamida, óleos, tais como óleo de 15 semente de algodão, óleo de amendoim, óleo de germem de milho, óleo de oliva, óleo castóreo, óleo de gergelim, glicerol, álcool tetrahidrofurfuril, polietilenoglicol, ésteres de ácidos graxos de sorbitan, ou misturas destas substâncias, e similares.

Além destes diluentes inertes, a composição 20 pode também incluir adjuvantes tais como agentes de umedecimento, emulsificantes e agentes de suspensão, adoçantes, temperos, agentes de perfumaria.

Os níveis de dosagem presentes dos ingredientes ativos nas composições da invenção podem ser 25 variados para obter uma quantidade de NTP peptídeo que seja efetiva na obtenção de uma resposta terapêutica desejada para * · · · • · • · • · • · · · ·

9 ·

• · · • · · • · · • 9

111 uma composição particular e método de administração. O nível de dosagem selecionado depende, portanto, do efeito terapêutico desejado, da rota de administração, da duração desejada do tratamento, e outros fatores.

Com mamíferos, incluindo humanos, as quantidades efetivas podem ser administradas com base na área superficial do corpo. A inter-relação das dosagens para animais de vários tamanhos, espécies, e humanos (baseado em mg/M² da superfície do corpo) é descrita por E. J. Freireich e outros, Câncer Chemother. Res., 50(4):219 (1996). A área da superfície do corpo pode ser aproximadamente determinada a partir do peso e altura de um indivíduo (ver, por exemplo, Scientific Tables, Geigy Pharmaceuticals, Ardsley, N. Y. páginas 537-538 (1970)).

A dose diária total do NTP peptídeo administrada a um hospedeiro pode ser em doses únicas ou divididas. Composições de unidade de dosagem podem conter tais quantidades de tais submúltiplos delas como pode ser usado para fazer a dose diária. Deve ser entendido, entretanto, que o nível de dose específica para qualquer paciente particular depende de uma variedade de fatores incluindo o peso do corpo, saúde geral, sexo, dieta, tempo e rota de administração, potência da droga administrada, taxas de absorção e excreção, combinação com outras drogas, e a severidade da doença particular a ser tratada.

Um método de administração de uma composição de NTP peptídeo de acordo com a invenção inclui, mas não é limitado a, administração dos compostos

oralmente, intravenosamente, intracerebralmente, intracerebroventricularmente, intramuscularmente, intraperitonealmente, (intraparenquimalmente), intratumoralmente, intralesionalmente, intrademalmente, intratecalmente, intranasalmente, intraocularmente, intraarterialmente, topicamente, transdermalmente, via um aerossol, infusão, injeção de bolus, dispositivo de implantação, sistema de liberação controlada, etc.

Outro método de administração do NTP peptídeo da invenção é por uma rota transdermal ou transcutânea. Um exemplo de tal concretização é o uso de um emplastro. Em particular, um emplastro pode ser preparado com uma suspensão fma do NTP peptídeo, por exemplo, dimetilsulfóxido (DMSO), ou uma mistura de DMSO com óleo de semente de algodão, e levado para contato com a pele do mamífero portador do tumor do local de localização do tumor dentro de uma bolsa de pele. Outros meios ou misturas deles com outros solventes e suportes sólidos poderiam trabalhar igualmente bem. O emplastro pode conter o composto de NTP peptídeo na forma de uma solução ou uma suspensão. O emplastro pode então ser aplicado à pele do paciente, por exemplo, por meio de inserção dele em uma bolsa de pele do paciente formado por dobradura e manutenção junto da pele por meios de pontos, clipes ou outros dispositivos de retenção. Esta bolsa pode ser empregada em uma maneira tal que um contato contínuo com a pele é assegurado sem a interferência do mamífero. Além de usar uma bolsa de pele, qualquer dispositivo pode ser usado, o que assegura a colocação firme do emplastro em contato com a pele. Por exemplo, uma bandagem adesiva pode ser utilizada para manter o emplasto no lugar na pele.

preparação ou formulação de liberação sustentada. Exemplos adequados de preparações de liberação sustentada incluem matrizes polímeras semipermeáveis na forma de artigos formados, por exemplo, por filmes, ou microcápsulas.

Matrizes de liberação sustentada incluem poliésteres, hidrogéis, polilactídeos, (U.S. 3.773.919, EP 58.481), copolímeros de ácido L-glutâmico e etil-L-glutamato gama (Sidman e outros, Biopolymers, 22:547-556 [1983]), poli (2hidroxietil-metacrilato) (Langer e outros, J. Biomed. Mater. Res., 15 15:167-277 [1981] e Langer, Chem. Tech., 12:98-105 [1982]), acetato de etileno (Langer e outros, acima) ou ácido poli-D(-)-3hidroxibutírico (EP 133.988). Composições de liberação sustentada também podem incluir lipossomas, que podem ser preparados por quaisquer dos vários métodos conhecidos na técnica (por exemplo, Eppstein e outros, proc. Natl. Acad. Sei.

USA, 82:3688-3692 [1985]; EP 36.676; EP 88.046; e EP

143.949).

Um outro método de administração do NTP peptídeo da invenção é por infusão direta ou indireta do NTP peptídeo no tumor ou outro tecido a ser tratado. Um exemplo de tal concretização é a injeção direta do NTP peptídeo no tumor ou

outro tecido a ser tratado. O tratamento pode consistir de uma injeção simples, injeções múltiplas em uma ocasião, ou uma série de injeções por um período de horas, dias ou meses com a regressão ou destruição do tumor ou outro tecido a ser tratado sendo monitorado por meio de biópsia, imagem ou outros métodos de monitoração do crescimento do tecido. A injeção no tumor ou outro tecido a ser tratado pode ser por um dispositivo inserido em um orifício tal como nariz, boca, ouvido, vagina, reto ou uretra, ou através de uma incisão de maneira a alcançar o 10 tumor ou tecido in viv,o e pode ser realizado em conjunção com um sistema de imagem ou ótico tal como ultra-som ou escopo de fibra ótica de maneira a identificar o local apropriado para a(s) injeção(ões). Outro exemplo de tal concretização é o uso de um dispositivo que pode prover uma infusão constante do NTP 15 peptídeo ao tecido por todo o tempo.

Outro método de administração de um NTP peptídeo da invenção é em conjunção com um procedimento cirúrgico ou similar empregado para extirpar fisicamente, ablatar, ou, de outro modo, matar ou destruir tumor ou outro tecido ou 20 elementos celulares requeridos ou desejados para serem removidos ou destruídos em que um NTP peptídeo da invenção é administrado à(s) área(s) imediata(s) circundando a(s) área(s) onde o tumor ou outro tecido foram removidos de maneira a destruir ou impedir o crescimento de quaisquer células de tumor 25 ou outros elementos não removidos ou destruídos pelo procedimento.

···»···· · ·

Outro método de administração de um NTP peptídeo da invenção é pela implantação de um dispositivo dentro do tumor, ou outro tecido a ser tratado. Um exemplo de tal concretização é a implantação de uma pastilha contendo NTP 5 peptídeo no tumor ou outro tecido a ser tratado. A pastilha libera uma dose terapêutica do NTP peptídeo no tecido por todo o tempo. Alternativamente ou adicionalmente, a composição pode ser administrada localmente via implantação na área afetada de uma membrana, esponja, ou outro material apropriado no qual o 10 NTP peptídeo tenha sido absorvido. Onde um dispositivo de implantação é usado, o dispositivo pode ser implantado em qualquer tecido adequado ou órgão, e a distribuição do NTP peptídeo pode ser diretamente através do dispositivo via bolus, ou via administração contínua, ou via catéter usando infusão 15 contínua.

Um método alternativo de administração é introduzir um ou mais cópias de um gene codificando o NTP peptídeo na célula sendo alvejada e, se necessário, induzindo a(s) cópia(s) do gene a começarem a produzir o NTP peptídeo 20 intracelularmente. Uma maneira pela qual a terapia genética pode ser aplicada é usar o gene que codifica o NTP peptídeo (ou DNA genômico, cDNA, e/ou DNA sintético codificando o NTP peptídeo (ou um fragmento, variante, homólogo ou derivado dele) que pode ser operavelmente ligado a um promotor constitutivo ou 25 inductível para formar um construtor de DNA de terapia genética. O promotor pode ser homólogo ou heterólogo para um gene • · · · · •· · •· •· · •* · • ····♦ ········ · · · · • · · · · • · ·· ··· • · · · · · • · · · · · · lió codificando o NTP peptídeo endógeno, provido pelo fato que ele é ativo na célula ou tipo de tecido no qual o construtor será inserido.

Outros componentes do construtor de DNA de terapia genética podem opcionalmente incluir, quando requerido, moléculas de DNA designadas para integração de local específico (por exemplo seqüências de divisão endógenas úteis para recombinação homóloga), promotores específicos de tecidos, espessante(s) ou silenciador(es), moléculas de DNA capazes de proporcionar uma vantagem seletiva sobre a célula parente, moléculas de DNA úteis como modelos para identificar células transformadas, sistemas de seleção negativa, agentes de ligação específicos de células (como, por exemplo, para alvejamento de células), fatores de internalização específico de células, e fatores de transcrição para aumentar a expressão por um vetor, bem como fatores que possibilitem a fabricação de vetores.

Meios de distribuição de genes a uma célula ou tecido in vivo ou ex vivo incluem (mas não são limitados a) injeção direta de DNA simples, métodos balísticos, transferência mediada de lipossomas, transferência mediada de receptor (complexo DNA-ligante), eletroporação, e precipitação de fosfato de cálcio. Ver Patente dos Estados Unidos N°s 4.970.154, WO 96/40958, Patente dos Estados Unidos N° 5.679.559, Patente dos Estados Unidos N° 5.676.954, e Patente dos Estados Unidos N° 5.593.875, a revelação de cada uma sendo incorporada por referência aqui em sua totalidade. Eles também incluem o uso de • · · ·· •· · •· · • ·· • ·· ··♦ · • · ·· ··· um vetor viral tal como um retrovírus, adenovirus, vírus adenoassociado, vírus pox, lentivirus, vírus papiloma ou vírus da herpes simples, uso de um conjugado proteína-DNA, e uso de um lipossoma. O uso de vetores de terapia de gene é descrito, por exemplo, na Patente dos Estados Unidos N° 5.672.344, Patente dos Estados Unidos N° 5.399.346, Patente dos Estados Unidos N° 5.631.236, e Patente dos Estados Unidos N° 5.635.399, revelações de cada uma sendo incorporada por referência aqui sua totalidade.

as em ser

O gene que codifica o NTP peptídeo pode distribuído através da implantação nos pacientes de certas células que tenham sido geneticamente engenheiradas ex vivo, usando métodos tais como aqueles descritos aqui, para expressar e secretar NTP peptídeo ou fragmentos, variantes, homólogos, ou derivados deles. Tais células podem ser células de animais ou humanas, e podem ser derivadas do tecido do prórpio paciente, ou de uma outra fonte, tanto humana ou não-humana.

Opcionalmente, as células podem ser imortalizadas ou serem células tronco. Entretanto, de maneira a diminuir a chance de uma resposta imunológica, é preferido que as células sejam encapsuladas para evitar infiltração dos tecidos circundantes. Os materiais de encapsulamento são tipicamente encerramentos biocompatíveis semi-poliméricos ou membranas que permitam a liberação do(s) produto(s) da proteína, mas impeçam a destruição das células pelo sistema imunológico do paciente, ou por outros fatores detrimentais a partir dos tecidos circundantes.

Métodos usados para encapsulamento de membrana de células são familiares aos técnicos no assunto, e a 5 preparação de células encapsuladas e sua implementação em pacientes podem ser executadas sem experimentação inadequada. Ver, por exemplo, Patente dos Estados Unidos N°s 4.892.538; 5.011.472; e 5.106.627, a revelação delas sendo incorporadas por referência aqui em sua totalidade.

Um sistema para encapsulamento de células vivas é descrito no PCT WO 91/10425. Técnicas de formulações de uma variedade de outros meios de distribuição controlada ou sustentada, tais como veículos de lipossomas, partículas biocorroíveis ou contas, são também conhecidos daqueles técnicos no assunto, e são descritos, por exemplo, na Patente dos Estados Unidos N° 5.653.975, a revelação da qual é incorporada por referência aqui em sua totalidade. As células, com ou sem encapsulamento, podem ser implantadas em tecidos do corpo adequados, ou órgãos do paciente.

Os exemplos seguintes são providos para ilustrar a presente invenção. Deve ser entendido, entretanto, que a invenção não é limitada às condições específicas ou detalhes descritos nestes exemplos. Do começo ao fim do pedido, quaisquer e todas as referências aos documentos disponíveis publicamente, incluindo a Patente dos Estados Unidos, são especificamente incorporados por referência.

• · · · · • · · ·· •· · •· · • ·· • · · · · ♦ · ··· ···· ·· ·· • · · · · • · · · · · · • · · · · * · · · · • · · ·· · ·

113

Em particular, esta invenção expressamente incorpora por referência os exemplos contidos na Patente Pendente dos Estados Unidos No. 10/092,934, “Methods of Treating Tumors and Related Conditions Using Neural Thread 5 Proteinsfa. qual mostra que a proteína inteira AD7c-NTP é um agente efetivo que causa a morte de células tanto in vitro em culturas de células de glioma e neuroblastoma, e in vivo em tecidos musculares de roedores normais, tecido conectivo subcutâneo e derme, e em uma variedade de diferentes tumores 10 originados em humanos e não-humanos, incluindo carcinoma mamário, carcinoma de pele, e papiloma, carcinoma de cólon, glioma de cérebro, e outros em modelos de roedores.

Esta invenção também expressamente incorpora por referencia os exemplos contidos na Patente dos Estados 15 Unidos No. 10/153334, intitulada: Peptides Effective In The Treatment Of Tumors And Other Conditions Requiring The Removal Or Destruction Of Cells', N° 10/198.069, intitulada: Peptides Effective In The Treatment Of Tumors And Other Conditions Requiring The Removal Or Destruction Of Cells’, e N° 20 1 0/198.070, intitulada: Peptides Ejfective In The Treatment Of

Tumors And Other Conditions Requiring The Removal Or Destruction Of Cells, cada uma da qual revelando que fragmentos de AD7c-NTP, de proteínas homólogas para AD7c-NTP e NTP proteínas, e de NTP proteínas são agentes efetivos para causarem 25 a morte de células in vivo em tecidos muscular de roedores normais, tecidos conectivos subcutâneos, derme e outros tecidos.

Exemplo 1

A proposta deste exemplo foi determinar o efeito do NTP-peptídeo #1 nos tecidos nos locais de injeção.

Ratos machos Sprague-Dawley (faixa de peso de 300 gramas) foram anestesiados com éter e dado NTP [122] peptídeo #1 por infusão intraprostática após visualização cirúrgica aberta da próstata. As injeções consistiam de 300 μΐ de NTP[122] peptídeo #1, 1 mg/mL em PBS pH 7,4 (1,0 mg/kg) (n = 8), injeções de controle de PBS apenas (n = 6), e controles com ío nenhuma injeção (n = 2). Os ratos foram sacrificados sem dor após 72 horas. As glândulas da próstata foram dissecadas, fixadas em formalina tamponada 10% por 24 horas, embebidas em parafina, seccionadas, e manchadas com Η & E. Para cada animal a glândula de próstata total foi embebida e seccionada. Todas as 15 seções manchadas foram histologicamente examinadas e medidas.

Para cada próstata, pelo menos 4 seções histológicas foram examinadas, e para cada seção histológica dois diâmetros de corte transversal (D) a 90° de cada outra foram medidos (total de > 8 medições por próstata). O diâmetro médio destas medições para 20 cada próstata foi usado para estimar o volume de acordo com V = 4/3 (D/2)³.

Resultados: A redução no volume da próstata em ratos injetados com NTP[122] peptídeo #1 foi estimada para ser na média 45% comparada aos controles (não existe diferença 25 discemível entre as injeções de PBS de controle sozinha, e controles sem injeções). A próstata de rato tratada mostrou perda

100

extensiva de epitélio glandular, achatamento e atrofia. NTP [122] peptídeo #1 em infusões abertas de PBS pH 7,4 de 1,0 mg/kg na próstata do rato, produziu uma redução de volume da próstata estimado de >40% comparado aos controles de PBS não-tratado 5 ou tratado em 72 horas.

Exemplo 2

Ratos machos Sprague-Dawley (faixa de peso 10 de 300 gramas) foram anestesiados com éter e dado NTP[112] peptídeo #1 por infusão intraprostática após visualização cirúrgica aberta da próstata. As injeções consistiam de 300 pl de NTP[112] peptídeo #1, 1 mg/mL em PBS pH 7,4 (1,0 mg/kg) (n = 4), injeções de controle de PBS apenas (n = 3), e controles com 15 nenhuma injeção (n = 1). Os ratos foram sacrificados sem dor após 72 horas. As glândulas da próstata foram dissecadas, fixadas em formalina tamponada 10% por 24 horas, embebidas em parafina, seccionadas, e manchadas com Η & E. Para cada animal a glândula de próstata total foi embebida e seccionada. Todas as 20 seções manchadas foram histologicamente examinadas e medidas.

Para cada próstata, pelo menos 4 seções histológicas foram examinadas, e para cada seção histológica dois diâmetros de corte transversal (D) a 90° de cada outra foram medidos (total de > 8 medições por próstata). O diâmetro médio destas medições para 25 cada próstata foi usado para estimar o volume de acordo com V = 4/3 (D/2)³.

101 • λ ·

iXb

Os controles foram os msmos como o Exemplo

1.

Resultados: Como no Exemplo 1 acima, a injeção de NTP[112] peptídeo #1 produziu perda de célula significante e atrofia na próstata em 72 horas. Os controles mostraram mudanças mínimas ou ausentes, consistindo de inflamação focal a partir das agulhas.

Exemplo 3

A proposta deste exemplo foi determinar o efeito dos NTP-peptídeos descritos acima no tecido nos locais de injeção.

Oito ratos normais foram injetados na pele e subcutaneamente, cada um em quatro locais diferentes, e no músculo de esqueleto de extremidade, cada um em dois locais diferentes, com os NTP[122] peptídeos 1-8, NTP[112] peptídeos

1-7, NTP [106] peptídeos 1-7, NTP[98] peptídeos 1-6, NTP[75] peptídeos 1-5, NTP[68] peptídeos 1-4 e NTP[61] peptídeos 1-4 descritos acima em quantidades de 100 a 400 mL em concentrações de 0,1-1 mg/mL distribuídas de seringas plásticas através de agulhas de calibre 26 de aço inoxidável.

Os animais foram observados por 24 horas e sacrificados sem dor em 24 horas. O local individual de infiltração foi excisado, fixado em formalina 10%, embebidos em parafina, e manchados e examinados por métodos histopatológicos padrões.

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113

Grupos similares de ratos de controle foram injetados com (1) albumina de soro bovino 0,1% em salina, (2) soro humano normal, (3) salina fisiológica, (4) proteínas bacteriais não-infeciosas, e (5) peptídeos de controle, e 5 purificados e, em seguida, examinados e sacrificados conforme acima, com o local excisado de injeção tratado conforme acima.

Resultados

A injeção do NTP[122] peptídeos 1-8,

NTP[112] peptídeos 1-7, NTP [106] peptídeos 1-7, NTP[98] ío peptídeos 1-6, NTP[75] peptídeos 1-5, NTP[68] peptídeos 1-4 e

NTP [61] peptídeos 1-4 em todos os exemplos produziu necrose aguda abundante de tecido nos locais de injeção. A necrose é evidente no tecido do músculo, tecido conectivo subcutâneo, e derme, nos locais onde o NTP peptídeo foi injetado. Em 24 horas, 15 as células parecem pálidas, encolhidas e necróticas, e existe infiltração com células inflamatórias. A necrose se correlaciona com as áreas de injeção, e não parece difundir-se para além do local de injeção.

Não considerando as áreas medianas de 20 inflamação, os controles não mostraram evidência de necrose ou perda de células. Em contraste às injeções de NTP peptídeo onde os campos totais de camadas de fibra de músculo, os controles mostraram mudanças nos músculos ausente ou mínima. As injeções de controle tiveram inflamação aguda de mínima a suave 25 nos locais de injeção, e micro hemorragias focais a partir das agulhas.

····

103

US

Será aparente àqueles técnicos no assunto que várias modificações e variações podem ser feitas nos métodos e composições da presente invenção, sem fugir do espírito ou escopo da invenção.

Claims

1. Peptídeo, caracterizado pelo fato de consistir de uma sequência de aminoácido selecionada do grupo consistindo de:

a) SEQ ID NO. 8 (Ile-Asp-Gln-Gln-Val-LeuSer-Arg-Ile-Lys-Leu-Glu-Ile-Lys-Arg-Cys-Leu);

b) SEQ ID NO. 9 (Met-Met-Val-Cys-Trp-AsnArg-Phe-Gly-Lys-Trp-Val-Tyr-Phe-Ile);

c) SEQ ID NO. 10 (Ser-Ala-Ile-Phe-Asn-PheGly-Pro-Arg-Tyr-Leu-Tyr-Elis-Gly-Val);

d) SEQ ID NO. 11 (Pro-Phe-Tyr-Phe-Leu-IleLeu-Val-Arg-Ile-Ile-Ser-Phe-Leu-Ile);

e) SEQ ID NO. 12 (Gly-Asp-Met-Glu-Asp-Val-

Leu-Leu-Asn-Cys-Thr-Leu-Leu-Lys-Arg);

f) SEQ ID NO. 13 (Ser-Ser-Arg-Phe-Arg-PheTrp-Gly-Ala-Leu-Val-Cys-Ser-Met-Asp);

g) SEQ ID NO. 14 (Ser-Cys-Arg-Phe-Ser-Arg-

Val-Ala-Val-Thr-Tyr-Arg-Phe-Ile-Thr); e

h) SEQ ID NO. 15 (Leu-Leu-Asn-Ile-Pro-SerPro-AIa-Val-Trp-Met-Ala-Arg-Asn-Thr);

2. - Peptídeo NTP de acordo com a reivindicação

1, caracterizado pelo fato de que é para uso como um medicamento.

3. - Composição caracterizada pelo fato de que compreende um peptídeo NTP de acordo com a reivindicação 1 e um portador para o mesmo.

.......................... Γ /:/..-.:1 : ·..··..* 1/7 1ΛΎ Figura 1 ΝΤΡ[122] [SEQIDNO. 1] 1 Met-Met-Val-Cys-Trp-Asn-Arg-Phe-Gly-Lys- - MMVCWNR'FGK 11 Trp-Val-Tyr-Phe-Ile-Ser-Ala-Ile-Phe-Asn- WVYFISAIFN 21 Phe-Gly-Pro-Arg-Tyr-Leu-Tyr-His-Gly-Val- FGPRYLYHGV 31 Pro-Phe-Tyr-Phe-Leu-Ile-Leu-Val-Arg-Ile- • P FYFLILVRI 41 Ile-Ser-Phe-Leu-Ile-Gly-Asp-Met-Glu-Asp- - ISFLIGDMED 51 νάΙ-Βθ'ΐι-υθΏ.-ΑΞη-ΟγΞ-Ί'ΙΐΓ-ΒΘυ-Ιιβ'α-υγε-Αχρ- VLLNCTLLKR 61 Ser-Ser-Arg-Phe-Arg-Phe-Trp-Gly-Ala-Leu- * SSRFRFWGAL· 71 Val-Cys-Ser-Met-Asp-Ser-Cys-Arg-Phe-Ser VCSMDSCRF S 81 Arg-Val-Ala-Val7Thr-Tyr-Arg-Phe-Ile-T.hr- RVAVTYRFI T • 91 Leu-Leu-Asn-Ile-Pro-Ser-Pro-Ala-Val-Trp- LLNIPSPAVW 101 Met-Ala-Arg-Asn-Thr-Ile-Asp-Gln-Gln-Val- MARNTIDQQV 111 Leu-Ser-Arg-Ile-Lys-Leu-Glu-Ile-Lys-Arglsrikleikr 121 Cys-Leu C L