TW202405011A - 針對人類pd-l1及pd-l2之雙重特異性抗體及其使用方法 - Google Patents

Abstract

本發明係關於結合於PD-L1及PD-L2兩者之雙重特異性抗體，及使用此類抗體治療癌症，諸如表現或過度表現PD-L1、PD-L2或兩者之彼等癌症的方法。

Description

針對人類PD-L1及PD-L2之雙重特異性抗體及其使用方法

本發明大體上係關於醫學、腫瘤學及免疫學領域。更具體地說，其係關於對PD-L1及PD-L2具有高親和力之人類雙重抗體及其在癌症療法中之用途。

阻斷T細胞共抑制受體PD-1與其配體PD-L1之相互作用已成為現代腫瘤學之支柱，現在甚至可用於黑色素瘤及肺癌患者子集之一線治療設置(Boussiotis, 2016)。許多靶向PD-1或PD-L1之抗體目前經FDA批准或處於臨床試驗中；然而，並無處於臨床研究中的靶向第二PD-1配體PD-L2之藥劑。相較於PD-L1，PD-L2以高約3倍的親和力結合PD-1，且如同PD-L1，發送減弱T細胞功能之抑制信號(Cheng等人, 2013；Latchman等人, 2001；Lee等人, 2016；Li等人, 2017；Youngnak等人, 2003)。在過去，PD-L2被認為主要為一種表現限於腫瘤基質之誘導型共抑制分子；然而，改良之PD-L2偵測試劑已揭示PD-L2在腫瘤微環境及腫瘤細胞本身兩者中之廣泛表現(Baptista等人, 2016；Danilova等人, 2016；Derks等人, 2015；Dong等人, 2016；Howitt等人, 2016；Kim等人, 2015；Kim等人, 2015；Nomi等人, 2007；Obeid等人, 2016；Ohigashi等人, 2005；Roemer等人, 2016；Shi等人, 2014；Shin等人, 2015；Xu等人, 2016)。近年來，PD-L2被證明係對於PD-1抗體帕博利珠單抗(pembrolizumab)在多種癌症中之反應的獨立預測因子(Yearley等人, 2017)。

首次描述於絕大部分典型何傑金氏淋巴瘤(classical Hodgkin's Lymphoma，cHL)，染色體區9p24.l之擴增引起PD-L1及PD-L2 (其存在於該染色體區中)之直接上調，以及經由增強之JAK2活性引起間接誘導(Roemer等人, 2016；Shi等人, 2014；Green等人, 2010；Van Roosbroeck等人, 2016)。除cHL以外，亦在大部分原發性縱隔大B細胞淋巴瘤(PMBL)、T細胞淋巴瘤及多種組織細胞及樹突狀細胞惡性腫瘤中發現高PD-L1/PD-L2共表現之此基因驅動子。不出所料，已顯示許多此等癌症對PD-1阻斷起反應。近年來，9p24.1擴增已在實體腫瘤(諸如三陰性乳癌(TNBC))中得到證實(Howitt等人, 2016；Barrett等人, 2015)。亦在許多其他癌症中觀測到PD-L1及PDL2之相對較高共表現，該等其他癌症諸如胃癌、黑色素瘤、肺鱗狀細胞癌、頭頸癌、子宮頸癌及外陰癌、膀胱癌及肝細胞癌以及其他癌症。(Baptista等人, 2016；Danilova等人, 2016；Derks等人, 2015；Dong等人, 2016；Howitt等人, 2016；Kim等人, 2015；Nomi等人, 2007；Obeid等人, 2016；Xu等人, 2016；Yearley等人, 2017；Van Roosbroeck等人, 2016；Barrett等人, 2015；Shin等人, 2016；Inoue等人, 2016；Wang等人, 2011)。除了由此等腫瘤本身的表現之外，亦已記錄許多此等腫瘤之PD-L2的基質及內皮表現(Yearley等人, 2017)。此等發現表明PD-Ll阻斷在此等癌症中之治療潛力存在侷限性。

PD-1共抑制受體主要由活化T細胞及NK細胞表現且可由結合該共抑制受體且阻止PD配體之參與的抗體靶向。相比之下，PD-Ll由腫瘤細胞及抑制性基質細胞群表現且可用具備細胞毒性效應功能之抗體靶向。儘管此等具有抗體依賴性細胞毒性(ADCC)能力之PD-L1抗體的理論優勢可在活體外證實，但不存在患者資料來證實患者中之實際效應功能或相對於純粹阻斷變異體之改善的結果(Boyerinas等人, 2015)。

PD-L1及PD-L2僅共有大約40%一致性，因為其各自結合不同於PD-1之額外受體(Latchman等人, 2001)。PD-Ll亦在額外陰性T細胞調節相互作用中結合B7-l(Butte等人, 2007；Butte等人, 2008)。在小鼠中，PD-L2可結合於骨髓細胞或T細胞上之RGMb且調節對吸入性抗原之耐受性(Xiao等人, 2014；Nie等人, 2017)。PD-L2與腫瘤中之RGMb結合的作用仍有待描述，此相互作用在人類中之相關性亦如此。自治療立場來看，產生對PD-Ll及PD-L2具有雙特異性的抗體可被證明為極其有利的。

本發明係關於本發明人出人意料地發現一種高度特異性、雙重特異性抗體，該抗體選擇性結合於PD-L1及LD-L2兩者，同時亦展現極少甚至無脫靶結合。依下表1中所繪示，本發明人已研發出一系列以ADI-16415為起始的PD-L1/PD-L2雙重結合抗體。使ADI-16415經歷多輪親和力成熟以獲得ADI-37464，其展現對PD-L1及PD-L2之高選擇性，但亦展現與胰島素樣生長因子1 (IGF-1)受體之脫靶結合，該受體為屬於酪胺酸激酶受體大類之跨膜受體。本發明人繼續修飾Ab-37464以鑑別一種新穎抗體；該新穎抗體維持與PD-L1及LD-L2之選擇性結合，亦避免ADI-37464展現出之脫靶結合。本發明人工程改造ADI-38000系列抗體(例如Ab-38000 - Ab-38004)，其為37464之衍生物，其中輕鏈CDR突變經設計以避免脫靶胰島素受體結合。 表 1

下表2概述Ab-38000系列抗體之輕鏈CDR序列之變化以及特徵性脫靶胰島素受體結合及PD-L1及PD-L2親和力。 表 2

Ab 名稱	VL CDR1	VL CDR2	VL CDR3	胰島素受體結合	PD-L1 親和力	PD-L2 親和力
ADI-37464 (最初起始)	RASQGINSFLA (SEQ ID NO: 13)	AASSLNS (SEQ ID NO: 11)	QKAVYFPPT (SEQ ID NO: 15)	高	高	高
ADI-38000	RASQGINSFLA (SEQ ID NO: 13)	AA DS IQS (SEQ ID NO: 14)	QKAVYFPPT (SEQ ID NO: 15)	高	高	高
ADI-38001	RASQGINSFLA (SEQ ID NO: 13)	AA DS IQS (SEQ ID NO: 14)	QK SVYFPPT (SEQ ID NO: 12)	高	高	高
ADI-38002	RASQ DINSFLA (SEQ ID NO: 10)	AASSLNS (SEQ ID NO: 11)	QK SVYFPPT (SEQ ID NO: 12)	極低	高	高
ADI-38003	RAS KGISSFLA (SEQ ID NO: 16)	AASSLNS (SEQ ID NO: 11)	QKAVYFPPT (SEQ ID NO: 15)	低	高	高
ADI-38004	RASQGI SSFLA (SEQ ID NO: 17)	AASSL QS (SEQ ID NO:14)	Q SAVYFPPT (SEQ ID NO: 19)	負	中等	中等

因此，本發明係基於ADI-38002之出人意料且意外的鑑別，ADI-38002係一種對PD-L1及LD-L2兩者展現高親和力同時亦顯示極少甚至無脫靶結合的雙重特異性抗體。令本發明人尤其出人意料的是，區分ADI-37464與ADI-38002之經工程改造之修飾係基於單個非保守胺基酸點突變(例如ADI-37464中之甘胺酸取代ADI-38002中之天冬胺酸)，通常預期其會破壞結合及/或降低結合親和力。

因此，根據本發明，提供選擇性結合於PD-Ll及PD-L2兩者之抗體或抗體片段(針對PD-L1及PD-L2之雙重特異性抗體(DSPDL))及(i)具有CDR1 GSLSGYPWS (SEQ ID NO:7)、CDR2 ETDVSGWTDYNPSLKS (SEQ ID NO:8)及CDR3 ARDGRRMGTPSFDI (SEQ ID NO: 9)之重鏈CDR序列以及CDR1 RASQDINSFLA (SEQ ID NO:10)、CDR2 AASSLNS (SEQ ID NO:11)及CDR3 QKSVYFPPT (SEQ ID NO:12)之輕鏈CDR序列；(ii)具有CDR1 GSLSGYPWS (SEQ ID NO:7)、CDR2 ETDVSGWTDYNPSLKS (SEQ ID NO:8)及CDR3 ARDGRRMGTPSFDI (SEQ ID NO:9)之重鏈CDR序列以及CDR1 RASQGINSFLA (SEQ ID NO:13)、CDR2 AADSIQS (SEQ ID NO:14)及CDR3 QKAVYFPPT (SEQ ID NO:15)之輕鏈CDR序列；或(iii)具有CDR1 GSLSGYPWS (SEQ ID NO:7)、CDR2 ETDVSGWTDYNPSLKS (SEQ ID NO:8)及CDR3 ARDGRRMGTPSFDI (SEQ ID NO:9)之重鏈CDR序列以及CDR1 RASQGINSFLA (SEQ ID NO:13)、CDR2 AADSIQS (SEQ ID NO:14)及CDR3 QKSVYFPPT (SEQ ID NO:12)之輕鏈CDR序列；或(iv)具有CDR1 GSLSGYPWS (SEQ ID NO:7)、CDR2 ETDVSGWTDYNPSLKS (SEQ ID NO:8)及CDR3 ARDGRRMGTPSFDI (SEQ ID NO:9)之重鏈CDR序列以及CDR1 RASKGISSFLA (SEQ ID NO:16)、CDR2 AASSLNS (SEQ ID NO:11)及CDR3 QKAVYFPPT (SEQ ID NO:15)之輕鏈CDR序列；或(v)具有CDR1 GSLSGYPWS (SEQ ID NO:7)、CDR2 ETDVSGWTDYNPSLKS (SEQ ID NO:8)及CDR3 ARDGRRMGTPSFDI (SEQ ID NO: 9)之重鏈CDR序列以及CDR1 RASQGISSFLA (SEQ ID NO:17)、CDR2 AASSLQS (SEQ ID NO:18)及CDR3 QSAVYFPPT (SEQ ID NO:19)之輕鏈CDR序列。抗體或抗體片段可由具有以下之可變序列編碼： (a)與以下具有至少或約70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性的重鏈核苷酸序列 ，及 (b)與以下具有至少或約70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性的輕鏈核苷酸序列： 。

抗體或抗體片段可包含與以下具有至少或約70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性之胺基酸序列的重鏈：  QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSLSGYPWSWIRQPPGKGLEWIGETDVSGWTDYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARDGRRMGTPSFDIWGQGTMVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLAGPDVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPEEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO:4)及與以下具有至少或約70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性之胺基酸序列的輕鏈DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQDINSFLAWYQQKPGKAPKLLIYAASSLNSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQKSVYFPPTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO:6)。

亦提供一種治療個體之癌症的方法，其包含使個體之PD-L1-、PD-L2-或PD-L1及PDL2-陽性癌細胞與依上文所描述之抗體接觸。PD-L1-、PD-L2-或PD-L1及PDL2-陽性癌細胞可為實體腫瘤細胞，諸如肺癌細胞、腦癌細胞、頭頸癌細胞、乳癌細胞、皮膚癌細胞、肝癌細胞、胰臟癌細胞、胃癌細胞、大腸癌細胞、直腸癌細胞、子宮癌細胞、子宮頸癌細胞、卵巢癌細胞、睪丸癌細胞、皮膚癌細胞、食道癌細胞、淋巴瘤細胞、腎細胞癌細胞，或可為白血病或骨髓瘤，諸如急性骨髓性白血病、慢性骨髓性白血病或多發性骨髓瘤。

方法可進一步包含使PD-L1-、PD-L2-或PD-L1及PDL2-陽性癌細胞與第二抗癌劑或治療(諸如化學療法、放射療法、免疫療法、激素療法或毒素療法)接觸。第二抗癌劑或治療可抑制細胞內PD-L1或PD-L2功能。第二抗癌劑或治療可與第一劑同時給與或在該劑之前及/或之後給與。PD-L1或PD-L2-陽性癌細胞可為轉移性癌細胞、多重耐藥性癌細胞或復發性癌細胞。

抗體片段可為重組scFv (單鏈可變片段)抗體、單域抗體、Fab片段、F(ab')2片段或Fv片段。抗體可為嵌合抗體、人源化抗體或IgG。抗體可為人類抗體、鼠類抗體、IgG、人源化抗體或人源化IgG。抗體或抗體片段可進一步包含標記，諸如肽標籤、酶、磁性粒子、發色團、螢光分子、化學發光分子或染料。抗體或抗體片段可進一步包含與其連接之抗腫瘤藥物，諸如經由光不穩定連接子或酶裂解連接子連接至抗體或抗體片段。抗腫瘤藥物可為毒素、放射性同位素、細胞介素或酶。抗體或抗體片段可結合至奈米粒子或脂質體。

在另一實施例中，提供一種治療個體之癌症的方法，其包含向個體遞送具有以下之抗體或抗體片段：(i) CDR1 SEQ ID NO:7、CDR2 SEQ ID NO:8及CDR3 SEQ ID NO:9之重鏈CDR序列；及CDR1 SEQ ID NO:10、CDR2 SEQ ID NO:11及CDR3 SEQ ID NO:12之輕鏈CDR序列；(ii) CDR1 SEQ ID NO:7、CDR2 SEQ ID NO:8及CDR3 SEQ ID NO:9之重鏈CDR序列以及CDR1 SEQ ID NO:13、CDR2 SEQ ID NO:14及CDR3 SEQ ID NO:15之輕鏈CDR序列；或(iii)具有CDR1 SEQ ID NO:7、CDR2 SEQ ID NO:8及CDR3 SEQ ID NO:9之重鏈CDR序列以及CDR1 SEQ ID NO:13、CDR2 SEQ ID NO:14及CDR3 SEQ ID NO:12之輕鏈CDR序列；或(iv)具有CDR1 SEQ ID NO:7、CDR2 SEQ ID NO:8及CDR3 SEQ ID NO:9之重鏈CDR序列及CDR1 SEQ ID NO:16、CDR2 SEQ ID NO:11及CDR3 SEQ ID NO:15之輕鏈CDR序列；或(v)具有CDR1 SEQ ID NO:7、CDR2 SEQ ID NO:8及CDR3 SEQ ID NO:9之重鏈CDR序列以及CDR1 SEQ ID NO:17、CDR2 SEQ ID NO:18及CDR3 SEQ ID NO:19之輕鏈CDR序列。抗體片段可為重組scFv (單鏈可變片段)抗體、Fab片段、F(ab')2片段或Fv片段。抗體可為IgG。抗體可為嵌合抗體或人源化抗體。遞送可包含抗體或抗體片段投與，或編碼抗體或抗體片段之RNA或DNA序列或載體的基因遞送。

抗體或抗體片段可由依SEQ ID NO:3及SEQ ID NO:5中所示之輕鏈及重鏈可變序列編碼，或可由與來自SEQ ID NO:3及SEQ ID NO:5之序列具有至少或約70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性的輕鏈及重鏈可變序列編碼。抗體或抗體片段可包含根據來自SEQ ID NO:4及SEQ ID NO:6之序列的輕鏈及重鏈可變序列，可包含與來自SEQ ID NO:4及SEQ ID NO:6之序列具有至少或約70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性的輕鏈及重鏈可變序列，或可包含與來自SEQ ID NO:4及SEQ ID NO:6之序列具有至少或約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性的輕鏈及重鏈可變序列。

亦提供一種單株抗體，其中該抗體或抗體片段之特徵為(i)重鏈CDR序列SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8及SEQ ID NO:9及輕鏈CDR序列SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11及SEQ ID NO:12；(ii) CDR1 SEQ ID NO:7、CDR2 SEQ ID NO:8及CDR3 SEQ ID NO:9之重鏈CDR序列以及CDR1 SEQ ID NO:13、CDR2 SEQ ID NO:14及CDR3 SEQ ID NO:15之輕鏈CDR序列；或(iii)具有CDR1 SEQ ID NO:7、CDR2 SEQ ID NO:8及CDR3 SEQ ID NO:9之重鏈CDR序列以及CDR1 SEQ ID NO:13、CDR2 SEQ ID NO:14及CDR3 SEQ ID NO:12之輕鏈CDR序列；或(iv)具有CDR1 SEQ ID NO:7、CDR2 SEQ ID NO:8及CDR3 SEQ ID NO:9之重鏈CDR序列及CDR1 SEQ ID NO:16、CDR2 SEQ ID NO:11及CDR3 SEQ ID NO:15之輕鏈CDR序列；或(v)具有CDR1 SEQ ID NO:7、CDR2 SEQ ID NO:8及CDR3 SEQ ID NO:9之重鏈CDR序列以及CDR1 SEQ ID NO:17、CDR2 SEQ ID NO:18及CDR3 SEQ ID NO:19之輕鏈CDR序列。抗體片段可為重組scFv (單鏈可變片段)抗體、Fab片段、F(ab')2片段或Fv片段。抗體可為嵌合抗體、人源化抗體或IgG。

亦提供編碼具有依SEQ ID NO:3及SEQ ID NO:5所示之輕鏈及重鏈可變序列之抗體或抗體片段的核酸，或編碼與來自SEQ ID NO:3及SEQ ID NO:5之序列具有至少或約70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性之輕鏈及重鏈可變序列的核酸。亦提供編碼具有根據來自SEQ ID NO:4及SEQ ID NO:6之序列的輕鏈及重鏈可變序列之抗體或抗體片段的核酸，或編碼包含與來自SEQ ID NO:4及SEQ ID NO:6之序列具有至少或約70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性之輕鏈及重鏈可變序列之抗體或抗體片段的核酸。

在又一實施例中，提供表現抗體或抗體片段之融合瘤或經工程改造之細胞，其中該抗體或抗體片段之特徵為重鏈CDR序列SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8及SEQ ID NO:9及輕鏈CDR序列SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11及SEQ ID NO:12；(ii) CDR1 SEQ ID NO:7、CDR2 SEQ ID NO:8及CDR3 SEQ ID NO:9之重鏈CDR序列以及CDR1 SEQ ID NO:13、CDR2 SEQ ID NO:14及CDR3 SEQ ID NO:15之輕鏈CDR序列；或(iii)具有CDR1 SEQ ID NO:7、CDR2 SEQ ID NO:8及CDR3 SEQ ID NO:9之重鏈CDR序列以及CDR1 SEQ ID NO:13、CDR2 SEQ ID NO:14及CDR3 SEQ ID NO:12之輕鏈CDR序列；或(iv)具有CDR1 SEQ ID NO:7、CDR2 SEQ ID NO:8及CDR3 SEQ ID NO:9之重鏈CDR序列及CDR1 SEQ ID NO:16、CDR2 SEQ ID NO:11及CDR3 SEQ ID NO:15之輕鏈CDR序列；或(v)具有CDR1 SEQ ID NO:7、CDR2 SEQ ID NO:8及CDR3 SEQ ID NO:9之重鏈CDR序列以及CDR1 SEQ ID NO:17、CDR2 SEQ ID NO:18及CDR3 SEQ ID NO:19之輕鏈CDR序列。抗體片段可為重組scFv (單鏈可變片段)抗體、單域抗體、Fab片段、F(ab')2片段或Fv片段。抗體可為嵌合抗體、人源化抗體或IgG。

另一實施例包含癌症疫苗，其包含一或多種特徵為依上文所描述之重鏈及輕鏈CDR序列的抗體或抗體片段。至少一個抗體片段可為重組scFv (單鏈可變片段)抗體、單域抗體、Fab片段、F(ab')2片段或Fv片段。抗體中之至少一者可為嵌合抗體或IgG。至少一種抗體或抗體片段可由依本文所示之輕鏈及重鏈可變序列編碼，可由依上文所描述之輕鏈及重鏈可變序列編碼，且可由與依上文所描述之序列具有至少或約70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致性的輕鏈及重鏈可變序列編碼。至少一種抗體或抗體片段可包含根據依上文所描述之序列的輕鏈及重鏈可變序列且可包含與依上文所描述之序列具有至少或約70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致性的輕鏈及重鏈可變序列。

在另一實施例中，提供一種偵測個體之PD-L1或PD-L2表現細胞之方法，其包含使來自該個體之樣品與以依上文所描述之重鏈及輕鏈CDR序列為特徵之抗體或抗體片段接觸，及藉由該抗體或抗體片段與該樣品中之細胞結合來偵測該樣品中之PD-L1或PD-L2表現細胞。樣品可為體液或組織樣品。細胞可為癌細胞，諸如淋巴瘤細胞、乳癌細胞或腎細胞癌細胞。細胞可為與免疫抑制相關之細胞。與免疫抑制相關之細胞可為腫瘤微環境中之非癌細胞，諸如基質細胞或內皮細胞。偵測可包含ELISA、RIA或西方墨點法(Western blot)。該方法可進一步包含再次進行該方法及測定抗原含量相較於第一次分析之變化。抗體或抗體片段可由依上文所描述之輕鏈及重鏈可變序列編碼且可由與依上文所描述之序列具有至少或約70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致性的輕鏈及重鏈可變序列編碼。抗體或抗體片段可包含根據依上文所描述之序列的輕鏈及重鏈可變序列且可包含與依上文所描述之序列具有至少或約70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致性的輕鏈及重鏈可變序列。

經考慮，本文所描述之任何方法或組合物均可根據本文所描述之任何其他方法或組合物實施。本發明之其他目標、特徵及優勢將自以下實施方式而變得顯而易見。然而，應理解，由於在本發明之精神及範疇內之各種改變及修改將自此實施方式而對熟習此項技術者變得顯而易見，故實施方式及特定實例在指示本發明之特定實施例時僅藉助於說明來給出。

依本文所使用，關於特定組分「基本上游離」在本文中用於意謂特定組分中無一者有目的地調配入組合物中及/或僅作為污染物或以痕量存在。由組合物之任何非預期污染產生之特定組分的總量較佳低於0.01%。最佳為其中任何量之特定組分均不可用標準分析方法偵測到之組合物。

依本文所使用，在說明書及申請專利範圍中，「一(a)」或「一(an)」可意謂一或多個。依本文所使用，在說明書及申請專利範圍中，當與字語「包含」結合使用時，字語「一(a)」或「一(an)」可意謂一個或超過一個。依本文所使用，在說明書及申請專利範圍中，「另一(another)」或「另一(a further)」可意謂至少第二個或更多個。

依本文所使用，在說明書及申請專利範圍中，術語「約」用於表示值包括裝置之固有誤差變化、用以確定該值之方法或存在於研究個體中之變化。

本發明之其他目標、特徵及優點將自以下實施方式變得顯而易見。然而，應理解，由於在本發明之精神及範疇內之各種改變及修改將自此實施方式而對熟習此項技術者變得顯而易見，故實施方式及特定實例在指示本發明之某些實施例時僅藉助於說明來給出。

優先權要求

本申請案主張2022年4月1日遞交的美國臨時申請案63/326,456及2022年10月3日遞交的美國臨時申請案63/378,196之優先權，該等兩個申請案中之全部內容以引用之方式併入本文中。

本發明人先前產生對人類PD-L1及PD-L2蛋白二者具有結合特異性之單株抗體。已證實此等抗體與PD-L1及PD-L2兩者結合，且因此存在諸如藉由阻斷PD-L1/PD-L2與PD-1相互作用及PD-L1與B7-1相互作用而阻斷PD-L1、PD-L2或PD-L1及PD-L2與PD-1之結合的機會。其亦可用於將治療有效負載遞送至表現PD-L1、PD-L2或PD-L1及PD-L2之癌細胞。

近年來，本發明人已工程改造雙重特異性PD-L1/PD-L2抗體以避免與人類胰島素受體之顯著結合，同時保留PD-L1/PD-L2親和力。此藉由修飾輕鏈CDR胺基酸來實現。出人意料地發現，脫靶效應之降低不影響抗體作為單一療法優於PD-1阻斷及介導治癒反應的能力。本發明人出人意料地鑑別出一種新子類的免疫檢查點抗體，其具有檢查點細胞減少之額外特性，因此允許破壞基質障壁以使T細胞浸潤腫瘤以及直接腫瘤細胞減少及抗轉移活性。此驚人且出人意料的結果與「冷」癌症具有特定相關性，該等「冷」癌症由於排斥及抑制效應T細胞反應而對現有PD-1抗體反應不佳(＜5%)。

另外，本發明人隨後使用臨床上經證實之突變誘發來工程改造抗體之Fc部分以活體外介導多種腫瘤細胞株之抗體依賴性細胞毒性(ADCC)及吞噬作用(ADCP)。注射免疫排斥(B16-PDL-2)及免疫浸潤(CT26、CT26-PD-L2、MC38)腫瘤、用抗PD-L1/PD-L2雙重特異性抗體處理之小鼠顯示出超過50%的存活率，而用鼠類抗PD1處理在冷腫瘤中顯示極少甚至無存活益處。對來自經雙重特異性抗體處理之小鼠的腫瘤及基質組分進行離體細胞分析引起T細胞活化增加及骨髓細胞隔室減少。最後，用雙重PD-L1/PD-L2抗體處理帶有人類三陰性乳癌(MDA-MB-231)之nu/nu小鼠顯著抑制腫瘤生長且減少CD11b ⁺細胞浸潤，而臨床上經證實之抗PD-L1的作用非常有限。

本發明之此等發現及其他態樣甚至更詳細地描述於下文中。 I.     PD-L1  A.   結構

計劃性死亡-配體1 (PD-L1)為由 CD274基因編碼之蛋白。PD-L1為40 kDa 1型跨膜蛋白，其可在諸如妊娠、組織同種異體移植、自體免疫疾病、癌症及其他疾病病狀之多種事件期間在免疫抑制中發揮主要作用。人類PD-L1蛋白由下文所示之胺基酸序列編碼： B.   功能

PD-L1為其受體PD-1之配體。可在活化T細胞、B細胞及骨髓細胞上發現PD-1。PD-L1與PD-1之結合調節T細胞及B細胞活化或抑制。傳遞減少抗原特異性CD8+ T細胞及CD4+輔助T細胞之增殖的抑制信號。PD-L1與PD-1之結合亦誘導細胞凋亡。此CD8+ T細胞及CD4+輔助T細胞之減少被認為有助於表現PD-L1之癌細胞逃避抗腫瘤免疫(Dong等人, 2002)。PD-L1之上調與宿主免疫系統之逃避相關且被認為是腫瘤侵襲性增加的原因(Thompson等人, 2004)。PD-L1在逃避抗腫瘤免疫性中之作用使其成為治療性干預之有吸引力的目標。 II.   PD-L2  A.   結構

計劃性死亡-配體2 (PD-L2)為由 CD273基因編碼之蛋白。PD-L2為31 kDa蛋白，其可在諸如妊娠、組織同種異體移植、自體免疫疾病、癌症及其他疾病病狀之多種事件期間在免疫抑制中發揮主要作用。人類PD-L2蛋白由下文所示之胺基酸序列編碼：

PD-L2最初用對應於SEQ ID NO:2之胺基酸1-19之信號肽產生，隨後移除該信號肽以產生成熟蛋白。成熟PD-L2蛋白對應於SEQ ID NO: 2之胺基酸20-273，由lg樣V域、lg樣C2型域、跨膜域及胞質尾組成。 B.   功能

PD-L2為其受體PD-1之配體。可在活化T細胞、B細胞及骨髓細胞上發現PD-1。PD-L2與PD-1之結合開始免疫級聯，其減少T細胞之增殖、細胞介素產生、細胞溶解功能及存活。PD-1傳遞減少抗原特異性CD8+ T細胞及CD4+輔助T細胞之增殖的抑制劑信號。PD-L2亦被證明為多種癌症對PD-1抗體帕博利珠單抗之反應的獨立預測因子(Yearley等人, 2017)。 III.單株抗體及其產生  A.   一般方法

針對PD-L1及PD-L2之抗體可藉由此項技術中所熟知之標準方法產生(參見例如Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988；美國專利4,196,265)。用於產生單株抗體(mAb)之方法一般沿著與用於製備多株抗體相同之生產線開始。該此兩種方法之第一步驟為適當宿主之免疫接種或因先前自然感染而免疫之個體的鑑別。依此項技術中所熟知，給定的免疫接種組合物之免疫原性可能不同。因此，通常需要增強宿主免疫系統，此可藉由使肽或多肽免疫原與載體偶合來實現。例示性的較佳載體為匙孔螺血氰蛋白(KLH)及牛血清白蛋白(BSA)。其他白蛋白，諸如卵白蛋白、小鼠血清白蛋白或兔血清白蛋白，亦可用作載體。將多肽結合至載體蛋白之方式為此項技術中熟知的且包括戊二醛、間順丁烯二醯亞胺基苯甲醯基-N-羥基琥珀醯亞胺酯、碳化二亞胺及雙重氮化聯苯胺。此項技術中亦熟知，可藉由使用非特異性免疫反應刺激劑(稱為佐劑)來增加特定免疫原組合物之免疫原性。例示性及較佳佐劑包括完全弗氏佐劑(complete Freund's adjuvant)(含有經殺滅之 結核分支桿菌 ( Mycobacterium tuberculosis )的非特異性免疫反應刺激劑)、不完全弗氏佐劑及氫氧化鋁佐劑。

用於產生多株抗體之免疫原組合物的量根據免疫原之性質以及用於免疫接種之動物而變化。可使用多種途徑投與免疫原(皮下、肌內、皮內、靜脈內及腹膜內)。多株抗體之產生可藉由在免疫接種之後各個時間點對經免疫接種動物進行血液取樣來監測。亦可給與第二次輔助劑注射。重複增強免疫及滴定之過程，直至達到適合滴度。當獲得所需免疫原性程度時，可對經免疫接種之動物抽血且分離血清且儲存，及/或可使用該動物產生單株抗體。

在免疫接種之後，選擇可能產生抗體之體細胞，具體言之，B淋巴球(B細胞)用於mAb產生方案中。該等細胞可自活檢之脾或淋巴結，或自循環之血液獲得。隨後使來自經免疫接種動物之抗體產生B淋巴球與永生骨髓瘤細胞之細胞，一般與經免疫接種之動物屬於同一物種的動物之永生骨髓瘤細胞，或人類或人類/小鼠嵌合細胞融合。可用於產生融合瘤之融合程序中之骨髓瘤細胞較佳不產生抗體，具有高融合效率，且酶缺陷而使其不能在僅支援所需融合細胞(融合瘤)生長之某些選擇性培養基中生長。

熟習此項技術者已知，可使用多種骨髓瘤細胞中之任一種(Goding, 第65-66頁, 1986；Campbell, 第75-83頁, 1984)。例如，在免疫接種動物為小鼠之情況下，吾人可使用P3-X63/Ag8、X63-Ag8.653、NSl/1.Ag 41、Sp210-Ag14、PO、NSO/U、MPC-11、MPC11-X45-GTG1.7及S194/5XX0 Bul；對於大鼠，吾人可使用R210.RCY3、Y3-Ag 1.2.3、IR983F及4B210；且U-266、GM1500-GRG2、LICR-LON-HMy2及UC729-6均可用於人類細胞融合。一種特定鼠類骨髓瘤細胞為NS-1骨髓瘤細胞株(亦稱為P3-NS-1-Ag4-l)，其藉由請求細胞株儲存庫編號GM3573而易於自NIGMS人類遺傳突變細胞儲存庫獲得。另一可使用之小鼠骨髓瘤細胞株為8-氮鳥嘌呤抗性小鼠鼠類骨髓瘤SP2/0非生產細胞株。最近，已描述用於人類B細胞之額外融合夥伴系，包括KR12 (ATCC CRL-8658；K6H6/B5 (ATCC CRL-1823 SHM-D33 (ATCC CRL-1668)及HMMA2.5 (Posner等人, 1987)。本發明中之抗體係使用SP2/0/mIL-6細胞株(SP2/0系之IL-6分泌衍生物)產生的。

用於產生抗體產生脾或淋巴結細胞與骨髓瘤細胞之雜交體的方法通常包含在促進細胞膜融合之一或多種藥劑(化學試劑或電)存在下，將體細胞與骨髓瘤細胞以2:1比例混合，不過該比例可各別地在約20:1至約1:1間變化。Kohler及Milstein (1975；1976)已描述使用仙台病毒(Sendai virus)之融合方法，且Gefter等人(1977)已描述使用聚乙二醇(PEG)，諸如37% (v/v) PEG之融合方法。使用電誘導融合方法亦為適合的(Goding, 第71-74頁, 1986)。

融合程序通常以約1×10 ^-6至1×10 ^-8之較低頻率產生有活力的雜交體。然而，此不會造成問題，因為有活力的融合雜交體係藉由在選擇培養基中培養而自輸注的親本細胞(特定言之，通常持續無限分裂的輸注之骨髓瘤細胞)分化。選擇培養基一般為含有阻止核苷酸在組織培養基中從頭合成之試劑的培養基。例示性的較佳試劑為胺基喋呤(aminopterin)、甲胺喋呤(methotrexate)及偶氮絲胺酸。胺基喋呤及甲胺喋呤阻止嘌呤及嘧啶之從頭合成，而偶氮絲胺酸僅阻止嘌呤合成。在使用胺基喋呤或甲胺喋呤情況下，該培養基補充有次黃嘌呤及胸苷作為核苷酸來源(HAT培養基)。在使用偶氮絲胺酸情況下，該培養基補充有次黃嘌呤。若B細胞源為埃-巴二氏病毒(Epstein Barr virus，EBV)轉型之人類B細胞株，則為了除去未與骨髓瘤融合之EBV轉型株，添加烏本苷(Ouabain)。

較佳之選擇培養基為HAT或含烏本苷之HAT。只有能夠操作核苷酸補救路徑之細胞能夠在HAT培養基中存活。骨髓瘤細胞缺乏該補救路徑之關鍵酶，例如次黃嘌呤磷酸核糖轉移酶(HPRT)，且其無法存活。B細胞可操作此路徑，但其在培養時壽命有限且一般在約兩週內死亡。因此，只有能在選擇培養基中存活的細胞為由骨髓瘤及B細胞形成之雜交體。當用於融合之B細胞源為EBV轉化之B細胞株時，依此處，亦將烏本苷用於雜交體之藥物選擇，因為EBV轉化之B細胞易經藥物殺滅，而所用骨髓瘤搭配物應選擇耐烏本苷的。

培養提供一組融合瘤，從中選擇特定融合瘤。通常，融合瘤之選擇係藉由在微量滴定盤中以單一殖株之稀釋液培養細胞，隨後測試個別殖株上清液(在約兩至三週之後)的所需反應性來進行。分析法應為靈敏、簡單且快速的，諸如放射免疫分析法、酶免疫分析法、細胞毒性分析法、蝕斑分析法、斑點免疫結合分析法及其類似方法。

隨後所選融合瘤進行連續稀釋或藉由流動式細胞分選進行單細胞分選，並選殖至個別抗體產生細胞株中，該等殖株可隨後無限繁殖以提供mAb。可採用該等細胞株以兩種基本方式產生MAb。融合瘤樣品可注射至動物(例如小鼠)體內(通常注射至腹腔中)。視情況，在注射之前，用烴，尤其是油，諸如姥鮫烷(四甲基十五烷)使動物預致敏。當以此方式使用人類融合瘤時，最佳向免疫功能不全之小鼠，諸如SCID小鼠進行注射，以防止腫瘤排斥反應。經注射動物產生腫瘤，分泌由融合之細胞雜交體產生之特異性單株抗體。隨後可抽取動物之體液，諸如血清或腹水，以提供高濃度mAb。個別細胞株亦可在活體外培養，其中mAb天然地分泌至培養基中，自該培養基可易於獲得高濃度mAb。或者，可在活體外使用人類融合瘤細胞株以在細胞上清液中產生免疫球蛋白。該等細胞株可適合於在無血清培養基中生長以使回收高純度人類單株免疫球蛋白之能力達到最佳。

必要時，藉由任一方式產生的單株抗體可使用過濾、離心及各種層析方法，諸如FPLC或親和層析法進一步純化。本發明之單株抗體的片段可自純化之單株抗體，藉由包括用酶(諸如胃蛋白酶或木瓜蛋白酶)消化之方法，及/或藉由化學還原來裂解二硫鍵而獲得。或者，本發明所涵蓋之單株抗體片段可使用自動肽合成儀合成。

預期亦可使用分子選殖方法產生單株抗體。為此，可自融合瘤株分離RNA且藉由RT-PCR獲得抗體基因並選殖至免疫球蛋白表現載體中。或者，由自該等細胞株分離之RNA製備組合免疫球蛋白噬質體庫且藉由使用病毒抗原淘選來選擇表現適當抗體之噬質體。此方法相較於習知融合瘤技術之優勢在於，可在一輪中產生並篩選出多達約104倍之抗體，且由H鏈與L鏈之組合產生新特異性，從而使發現適當抗體之幾率進一步增加。

可合理地設計基於酵母之抗體庫，且可自此類基於酵母之抗體呈現庫選擇及/或分離抗體，依例如WO2012/009568；WO2009/036379；WO2010/105256；WO2003/074679；美國專利8,691,730；及美國專利9,354,228中所揭示。抗體可表現為來自依上文所揭示且經純化之任何所需細胞類型的全長IgG。

教示可用於本發明中之抗體之產生的其他美國專利(各自以引用之方式併入本文中)包括美國專利5,565,332，其描述使用組合方法產生嵌合抗體；美國專利4,816,567，其描述重組免疫球蛋白之製備；及美國專利4,867,973，其描述抗體-治療劑結合物。 B.   本發明之抗體

根據本發明之抗體可首先藉由其結合特異性，亦即，結合於PD-L1及PD-L2來定義。熟習此項技術者藉由使用熟習此項技術者熟知之技術評估給定抗體之結合特異性/親和力，可確定此類抗體是否處於本發明的申請專利範圍之範疇內。在一個態樣中，提供具有來自依上文所描述之重鏈及輕鏈之CDR的單株抗體。此類抗體可使用本文所描述之方法，由以下實例部分中論述之殖株產生。

在第二態樣中，該等抗體可藉由其可變序列定義，該可變序列包括另外的「構架」區。此等提供於例如編碼或表示完整可變區之SEQ ID NO:3/SEQ ID NO:4及SEQ ID NO:5/SEQ ID NO:6中。另外，視情況使用以下更詳細地論述之方法，抗體序列可因此等序列而不同。例如，核酸序列可不同於上文所陳述之彼等核酸序列，因為(a)可變區可與輕鏈及重鏈之恆定域分隔，(b)核酸可不同於上文所陳述之彼等核酸而不影響由此編碼之殘基，(c)核酸可與上文所陳述之彼等核酸相差給定百分比，例如至少或約70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同源性，(d)核酸可憑藉在高度嚴格條件下雜交的能力而不同於上文所闡述之彼等核酸，依藉由低鹽及/或高溫條件所例示，諸如藉由約0.02 M至約0.15 M NaCl在約50℃至約70℃之溫度下提供。(e)胺基酸可與上文所陳述之彼等胺基酸相差給定百分比，例如至少或約80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同源性，或(f)胺基酸可藉由允許保守取代(下文論述)而不同於上文所陳述之彼等胺基酸。前述內容中之各者可用於上述核酸序列及上述胺基酸序列。 C.   抗體序列之工程改造

在各種實施例中，出於各種原因，諸如改善表現、改善交叉反應性或降低脫靶結合，可選擇對所鑑別之抗體的序列進行工程改造。以下為用於抗體工程改造之相關技術的大致論述。

可培養融合瘤，隨後裂解細胞且提取總RNA。可在RT下使用隨機六聚體以產生RNA之cDNA複本，且隨後使用預期可擴增所有人類可變基因序列之PCR引子之多元混合物進行PCR。PCR產物可選殖至pGEM-T Easy載體中，隨後藉由自動DNA定序使用標準載體引子進行定序。結合及中和之分析可使用自融合瘤上清液收集且藉由使用蛋白質G管柱之FPLC純化的抗體進行。

重組全長IgG抗體可藉由將重鏈及輕鏈Fv DNA自選殖載體次選殖至IgG質體載體中、轉染至293 Freestyle細胞或CHO細胞中，且自293或CHO細胞上清液收集純化抗體產生。

在與最終cGMP製造方法相同之宿主細胞及細胞培養方法中產生的抗體之快速可用性有可能縮短方法進展程式之持續時間。Lonza開發出使用彙集的在CD ACF培養基中生長之轉染物的一種通用方法，用於在CHO細胞中快速產生少量(最多50 g)抗體。儘管比實際瞬時系統略慢，但優勢包括較高產物濃度及與產生細胞株相同之宿主及方法的使用。在拋棄式生物反應器中表現模型抗體之GS-CHO池之生長及生產率的實例：在以分批進料模式操作之拋棄式袋式生物反應器培養(5 L工作體積)時，在轉染9週內達到2 g/L之採集抗體濃度。

可諸如藉由Adimab®技術合理地設計及合成抗體及可自其中選擇及/或分離此類抗體之抗體庫，依例如WO2012/009568；WO2009/036379；WO2010/105256；WO2003/074679；美國專利8,691,730；及美國專利9,354,228中所揭示。此合成抗體之方法需要將編碼所需或經設計抗體之核苷酸序列插入至異位表現之載體中。隨後，所需抗體可表現為完整鏈IgG分子且經純化。

抗體分子將包含由例如mAb蛋白水解裂解產生之片段(諸如F(ab')、F(ab')2)，或可例如經由重組方式產生的單鏈免疫球蛋白。此類抗體衍生物為單價的。在一個實施例中，此類片段可彼此組合，或與其他抗體片段或受體配體組合以形成「嵌合」結合分子。很明顯，此類嵌合分子可含有能夠結合至同一分子之不同抗原決定基的取代基。

在相關實施例中，抗體為所揭示之抗體之衍生物，例如包含與所揭示之抗體(例如，嵌合抗體或CDR移植抗體)中之CDR序列相同之CDR序列的抗體。或者，可希望進行修飾，諸如將保守變化引入抗體分子中。在進行此類變化時，可考慮胺基酸之親水指數。在此項技術中一般理解胺基酸之親水指數在賦予蛋白質相互作用生物功能方面之重要性(Kyte及Doolittle，1982)。公認胺基酸之相對親水性促成所得蛋白質之二級結構，該二級結構又界定蛋白質與其他分子(例如酶、受質、受體、DNA、抗體、抗原及其類似物)之相互作用。

在此項技術中亦理解，可基於親水性有效進行類似胺基酸之取代。以引用之方式併入本文中之美國專利4,554,101揭示藉由鄰近胺基酸之親水性調節的蛋白質之最大局部平均親水性與蛋白質之生物特性相關。依美國專利4,554,101中所詳述，以下親水性值已分配於胺基酸殘基：鹼性胺基酸：精胺酸(+3.0)、離胺酸(+3.0)及組胺酸(-0.5)；酸性胺基酸：天冬胺酸(+3.0±1)、麩胺酸(+3.0±1)、天冬醯胺(+0.2)及麩醯胺酸(+0.2)；親水性非離子型胺基酸：絲胺酸(+0.3)、天冬醯胺(+0.2)、麩醯胺酸(+0.2)及蘇胺酸(-0.4)，含硫胺基酸：半胱胺酸(-1.0)及甲硫胺酸(-1.3)；疏水性非芳族胺基酸：纈胺酸(-1.5)、白胺酸(-1.8)、異白胺酸(-1.8)、脯胺酸(-0.5±1)、丙胺酸(-0.5)及甘胺酸(0)；疏水性芳族胺基酸：色胺酸(-3.4)、苯丙胺酸(-2.5)及酪胺酸(-2.3)。

應理解，一種胺基酸可經具有類似親水性之另一胺基酸取代且產生在生物學或免疫學上改變之蛋白質。在此類變化中，用親水值在±2內之胺基酸取代較佳，用親水值在±1內之彼等胺基酸取代尤佳，且用親水值在±0.5內之彼等胺基酸取代甚至更佳。

依上文所概述，胺基酸取代一般基於胺基酸側鏈取代基之相對類似性，例如其疏水性、親水性、電荷、尺寸及其類似特性。考慮各種前述特徵之例示性取代為熟習此項技術者所熟知的，且包括：精胺酸及離胺酸；麩胺酸及天冬胺酸；絲胺酸及蘇胺酸；麩醯胺酸及天冬醯胺；以及纈胺酸、白胺酸及異白胺酸。

本發明亦涵蓋同型修飾。藉由修飾Fe區以具有不同同型，可實現不同功能。例如，改變成IgG1可增加抗體依賴性細胞毒性，轉變成A類可改善組織分佈，且轉變成M類可改善價態。

經修飾之抗體可藉由熟習此項技術者已知之任何技術製備，包括經由標準分子生物技術表現，或多肽之化學合成。重組表現之方法闡述於本文件中其他地方。 D.   單鏈抗體

單鏈可變片段(scFv)係免疫球蛋白重鏈及輕鏈之可變區與短(通常為絲胺酸、甘胺酸)連接子連接在一起的融合物。儘管移除恆定區且引入連接肽，但此嵌合分子保留原始免疫球蛋白之特異性。此修飾通常未改變特異性。歷史上產生該等分子係為了幫助噬菌體呈現，其中其特別適宜以單一肽形式表現抗原結合域。或者，scFv可直接由來源於融合瘤的次選殖之重鏈及輕鏈產生。單鏈可變片段缺乏在完整抗體分子中所發現之恆定Fc區，且因此無法使用常用結合位點(例如，蛋白質A/G)來純化抗體。該等片段通常可使用蛋白質L純化/固定，因為蛋白質L與κ輕鏈之可變區相互作用。

可撓性連接子通常包含促進螺旋及轉角之胺基酸殘基，諸如丙胺酸、絲胺酸及甘胺酸。然而，其他殘基亦可起作用。Tang等人(1996)使用噬菌體呈現作為自蛋白連接子庫快速選擇單鏈抗體(scFv)之定製連接子的方法。構築隨機連接子庫，其中重鏈及輕鏈可變域之基因係藉由編碼具有不同組成之18個胺基酸之多肽的片段連接。將scFv組庫(大約5×10 ⁶個不同成員)呈現於絲狀噬菌體上且用半抗原進行親和力選擇。所選變異體群展現結合活性之顯著增加，同時保持相當大的序列多樣性。隨後篩選1054種個別變異體得到催化活性scFv，其係以可溶形式高效產生的。序列分析揭露在V H C末端後兩個殘基之連接子中的保守脯胺酸及在其他位置處之大量精胺酸及脯胺酸作為所選繫鏈之唯一常見特徵。

本發明之重組抗體亦可涉及允許受體二聚合或多聚合之序列或部分。此類序列包括衍生自IgA之該等序列，其允許與J鏈一起形成多聚體。另一多聚合域為Gal4二聚合域。在其他實施例中，該等鏈可用允許兩個抗體組合的諸如生物素/抗生素蛋白之試劑修飾。

在獨立實施例中，單鏈抗體可藉由使用非肽連接子或化學單元連接受體輕鏈及重鏈來產生。一般而言，輕鏈及重鏈將在不同細胞中產生，純化，且隨後以適當方式(亦即，重鏈之N端經由適當化學橋接連接至輕鏈之C端)連接在一起。

使用交聯試劑形成分子橋接，將兩個不同分子，例如穩定劑及凝聚劑之官能基系在一起。然而，經考慮會產生相同類似物之二聚體或多聚體或包含不同類似物之雜聚物複合體。為了以逐步方式連接兩種不同化合物，可使用異雙官能交聯劑消除非所需均聚物形成。

例示性異雙官能交聯劑含有兩個反應性基團：一個與一級胺基團(例如，N-羥基丁二醯亞胺)反應，且另一個與硫醇基(例如吡啶基二硫化物、順丁烯二醯亞胺、鹵素等)反應。經由一級胺反應性基團，交聯劑可與一種蛋白質(例如，選定抗體或片段)之離胺酸殘基反應，且經由硫醇反應性基團，已經繫栓至第一蛋白質上的交聯劑與另一蛋白質(例如，選擇性試劑)之半胱胺酸殘基(游離硫氫基)反應。

較佳採用在血液中具有合理穩定性之交聯劑。已知眾多類型的含有二硫鍵之連接子，其可成功地用於結合靶向劑及治療劑/預防劑。含有位阻性二硫鍵之連接子可證明在活體內得到較大穩定性，從而防止靶向肽在到達作用部位之前釋放。因此該等連接子為一組連接試劑。

另一交聯試劑為SMPT，其為含有藉由鄰近苯環及甲基「空間位阻」之二硫鍵的雙官能交聯劑。咸信二硫鍵之位阻起到保護該鍵免受可存在於組織及血液中之硫醇根陰離子(諸如麩胱甘肽)侵襲的功能，且藉此有助於防止結合物在將附接試劑遞送至目標位點之前解偶合。

與許多其他已知之交聯試劑相同，SMPT交聯試劑能夠交聯諸如半胱胺酸之SH或一級胺(例如離胺酸之ε胺基)之官能基。另一可能的交聯劑類型包括含有可裂解二硫鍵之異雙官能光反應性疊氮苯，諸如磺基丁二醯亞胺基-2-(對疊氮基水楊醯胺基)乙基-1,3'二硫代丙酸酯。N-羥基-琥珀醯亞胺基與一級胺基反應且疊氮苯(在光解後)與任何胺基酸殘基發生非選擇性反應。

除受阻交聯劑外，亦可根據本發明採用非受阻連接子。除含有或產生保護性二硫化物外，其他有用交聯劑包括SATA、SPDP及2-亞胺基硫雜環戊烷(Wawrzynczak及Thorpe, 1987)。在此項技術中充分理解此類交聯劑之使用。另一實施例涉及使用可撓性連接子。

美國專利4,680,338描述可用於產生配體與含胺聚合物及/或蛋白質之結合物，尤其用於形成抗體與螯合劑、藥物、酶、可偵測標記及類似者之結合物的雙官能連接子。美國專利5,141,648及5,563,250揭示含有在多種溫和條件下可裂解之不穩定鍵的可裂解結合物。此連接子特別可用於所關注之試劑可直接鍵接至該連接子且裂解導致活性劑之釋放的情形。特定應用包括將游離胺基或游離硫氫基添加至蛋白質，諸如抗體或藥物。

美國專利5,856,456提供用於將多肽組分連接至融合蛋白(例如單鏈抗體)之肽連接子。連接子之長度為至多約50個胺基酸，含有至少一次出現之帶電荷胺基酸(較佳為精胺酸或離胺酸)，隨後為脯胺酸，且以更高穩定性及減少之聚集為特徵。美國專利5,880,270揭示可用於多種免疫診斷及分離技術中的含胺氧基之連接子。 E.   純化

在某些實施例中，本發明之抗體可經純化。依本文所使用，術語「純化」意欲指可與其他組分分離之組合物，其中相對於天然可獲得之狀態，蛋白質純化至任何程度。因此，純化之蛋白質亦指脫離其可天然出現之環境的蛋白質。當使用術語「實質上純化」時，此名稱將指其中蛋白質或肽形成組合物之主要組分的組合物，諸如蛋白質在組合物中佔約50%、約60%、約70%、約80%、約90%、約95%或更多。

蛋白質純化技術係熟習此項技術者熟知的。該等技術一方面涉及細胞環境粗品部分分離成多肽及非多肽部分。多肽已與其他蛋白質分離，所關注之多肽可進一步使用層析技術及電泳技術純化以實現部分或完全純化(或純化至均質)。特別適合於製備純肽之分析方法為離子交換層析法、排阻層析法；聚丙烯醯胺凝膠電泳；等電聚焦。用於蛋白質純化之其他方法包括用硫酸銨、PEG、抗體及其類似物沈澱，或藉由熱變性，隨後離心；凝膠過濾、逆相層析、羥磷灰石層析及親和層析；及此類及其他技術之組合。

在純化本發明之抗體時，可能需要在原核或真核表現系統中表現該多肽且使用變性條件提取蛋白質。可使用結合至多肽之標記部分的親和管柱自其他細胞組分純化多肽。依此項技術中一般所知，咸信執行多個純化步驟之次序可改變，或可省略某些步驟，且仍為可用於製備實質上純化之蛋白質或肽的方法。

通常，利用結合抗體Fe部分之試劑(亦即蛋白A)分級分離完整抗體。替代地，可使用抗原同時純化及選擇適當抗體。此類方法通常利用結合至支撐物，諸如管柱、過濾器或珠粒之選擇劑。抗體結合至支撐物，移除污染物(例如，洗掉)且藉由施加條件(鹽、熱等)釋放抗體。

熟習此項技術者根據本揭示案將獲知用於定量蛋白質或肽之純化程度的多種方法。該等方法包括例如，測定活性部分之比活性，或藉由SDS/PAGE分析評估一個部分內的多肽量。用於評估一個部分之純度的另一方法係計算該部分之比活性，將其與初始提取物之比活性相比較，且由此計算純度。用於表示活性之量的實際單位當然取決於選擇用於跟蹤純化之特定分析技術及表現之蛋白質或肽是否展現可偵測之活性。

已知多肽之遷移有時會隨SDS/PAGE之不同條件而明顯變化(Capaldi等人, 1977)。因此，應理解，在不同電泳條件下，純化或部分純化之表現產物的表觀分子量可變化。 IV. 癌症之醫藥調配物及治療  A.   癌症

癌症由來自組織之細胞殖株群體過度生長產生。癌症之發展，稱為癌發生(carcinogenesis)，可經建模且多種方式表徵。早已理解癌症之發展與炎症之間的相關性。炎症反應與宿主對微生物感染之防禦有關，且亦驅動組織修復及再生。大量證據指向炎症與罹患癌症之風險之間的聯繫，亦即慢性炎症可導致發育不良。

可應用本發明之方法的癌細胞通常包括表現PD-L1、PD-L2或PD-L1及PD-L2，且更特定言之，過度表現PD-L1、PD-L2或PD-L1及PD-L2的任何細胞。適合的癌細胞可為乳癌、肺癌、大腸癌、胰臟癌、腎癌、胃癌、肝癌、骨癌、血液癌症(例如白血病或淋巴瘤)、神經組織癌、黑色素瘤、卵巢癌、睪丸癌、前列腺癌、子宮頸癌、陰道癌或膀胱癌細胞。另外，本發明之方法可應用於各種物種，例如人類、非人類靈長類動物(例如猴、狒狒或黑猩猩)、馬、牛、豬、綿羊、山羊、犬、貓、兔、天竺鼠、沙鼠、倉鼠、大鼠及小鼠。癌症亦可為復發性、轉移性及/或多重耐藥性的，且本發明之方法尤其可用於此類癌症以使得其可切除、延長或重新誘發緩解、抑制血管生成、阻止或限制癌轉移及/或治療多重耐藥性癌症。在細胞水平下，此可轉變為殺死癌細胞、抑制癌細胞生長或以其他方式逆轉或減少腫瘤細胞之惡性表型。 B.   調配及投與

本發明提供包含關於PD-L1及PD-L2 (DSPDL)之雙重特異性抗體的醫藥組合物。在一特定實施例中，術語「醫藥學上可接受」意謂經聯邦政府或州政府之管制機構批准或在美國藥典或其他公認之藥典中列出可用於動物且更特定而言可用於人類。術語「載劑」係指與治療劑一起投與之稀釋劑、賦形劑或媒劑。此類醫藥學載體可為無菌液體，諸如水及油，包括石油、動物、植物或合成來源之彼等，諸如花生油、大豆油、礦物油、芝麻油及其類似者。其他適合之醫藥賦形劑包括澱粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、生理鹽水、右旋糖、明膠、麥芽、稻穀、麵粉、白堊、矽膠、硬脂酸鈉、甘油單硬脂酸酯、滑石、氯化鈉、脫脂奶粉、甘油、丙二醇、水、乙醇及其類似物。

組合物可調配為中性或鹽形式。醫藥學上可接受之鹽包括與陰離子形成之鹽，諸如衍生自氫氯酸、磷酸、乙酸、草酸、酒石酸等之鹽；及與陽離子形成之鹽，諸如衍生自氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧化銨、氫氧化鈣、氫氧化鐵、異丙胺、三乙胺、2-乙胺基乙醇、組胺酸、普魯卡因等之鹽。

本發明之抗體可包括典型醫藥製劑。投與根據本發明之此等組合物將經由任何常用途徑，只要經由彼途徑可接近目標組織。此包括經口、經鼻、頰內、直腸、陰道或局部。或者，可藉由皮內、皮下、肌內、腹膜內或靜脈內注射投與。此類組合物將通常作為前述醫藥學上可接受之組合物投與。備受關注的係直接腫瘤內投與、腫瘤灌注或局部或區域投與至腫瘤，例如局部或區域脈管或淋巴系統中或在切除之腫瘤床中。

活性化合物亦可非經腸或腹膜內投與。可在水中適當地與界面活性劑(諸如羥丙基纖維素)混合製備呈游離鹼或藥理學上可接受之鹽形式之活性化合物的溶液。亦可在甘油、液態聚乙二醇及其混合物中及在油中製備分散液。在一般儲存及使用條件下，此等製劑含有防腐劑以防止微生物生長。 C.   組合療法

在本發明之上下文中，亦預期本文所描述之PD-L1及PD-L2 (雙重PDL)之雙重特異性抗體可類似地與化療或放射性治療性干預或其他治療組合使用。尤其亦證明將雙特異性PD-L1及PD-L2抗體與靶向PD-L1或PD-L2功能之不同態樣的其他療法(諸如靶向PD-L1或PD-L2細胞質域之肽及小分子)組合有效。

為使用本發明之方法及組合物殺滅細胞、抑制細胞生長、抑制癌轉移、抑制血管生成或以其他方式逆轉或減少腫瘤細胞之惡性表型，通常將使「目標」細胞與根據本發明之雙特異性抗PD-L1及抗PD-L2抗體及至少一種其他藥劑接觸。此等組合物將以有效殺死或抑制細胞增殖之組合量提供。此過程可涉及使細胞與根據本發明之雙特異性抗PD-L1及抗PD-L2抗體及其他藥劑或因子同時接觸。此可藉由使細胞與單一組合物或包括兩種藥劑之藥理學調配物接觸，或藉由使細胞與兩種不同組合物或調配物同時接觸來達成，其中一種組合物包括根據本發明之雙特異性抗PD-L1及抗PD-L2抗體且另一種包括其他藥劑。

或者，雙特異性抗PD-L1及抗PD-L2抗體療法可以數分鐘至數週範圍內之時間間隔先於或遵循另一藥劑治療。在其他藥劑及雙特異性抗PD-L1及抗PD-L2抗體分別施加至細胞之實施例中，通常將確保顯著時段在各次遞送之間沒有到期，使得藥劑及表現構築體仍能夠對細胞發揮有利的組合作用。在此類情況下，經考慮，吾人將使細胞與兩種模式在彼此之約12至24小時內接觸，且更佳在彼此之約6至12小時內接觸，最佳僅約12小時之延遲時間。在某些情況下，可能需要延長時段以進行顯著治療，無論如何，在各別投與之間會流逝若干天(2、3、4、5、6或7)至若干週(1、2、3、4、5、6、7或8)。

亦設想到，雙特異性抗PD-L1抗體及抗PD-L2抗體或另一藥劑之超過一次投與將為所期望的。可採用各種組合，其中根據本發明療法之雙特異性抗PD-L1及抗PD-L2抗體為「A」且另一療法為「B」，依下文所例示：

考慮到抗體治療之毒性(若存在)，向患者投與本發明之治療劑將遵循用於投與該特定二級療法之一般方案。預期治療週期將視需要重複進行。亦預期，各種標準療法以及手術干預可與所描述之癌症療法組合施加。

熟習此項技術者係根據「Remington's Pharmaceutical Sciences」第15版，第33章，尤其第624-652頁。視所治療個體之病狀而定，將必然出現一些劑量變化。在任何事件中，負責投與之人員將判定個別個體之適當劑量。此外，對於人投與而言，製劑應符合視FDA生物製品標準辦公室(FDA Office of Biologics standards)需要之無菌性、發熱性、大體安全及純度標準。 1.              化學療法

癌症療法亦包括具有基於化學及放射治療之多種組合療法。組合化學療法包括例如順鉑(CDDP)、卡鉑、丙卡巴肼、氮芥、環磷醯胺、喜樹鹼、異環磷醯胺、美法侖、苯丁酸氮芥、白消安、亞硝基脲、更生黴素、道諾黴素、阿黴素、博萊黴素、光輝黴素(plicomycin)、絲裂黴素、依託泊苷(VP16)、他莫昔芬、雷洛昔芬(raloxifene)、雌激素受體結合劑、紫杉醇、吉西他濱、溫諾平(navelbine)、法呢基蛋白轉移酶抑制劑、反鉑、5-氟尿嘧啶、長春新鹼、長春鹼及甲胺喋呤、替莫唑胺(Temazolomide)(一種水性形式DTIC)或前述之任何類似物或衍生變異體。化學療法與生物療法之組合已知為生化療法。本發明涵蓋可採用或此項技術中已知用於治療或預防癌症之任何化學治療劑。 2.              放射線療法

造成DNA損傷且已廣泛使用之其他因素包括通常稱為y-射線、X射線及/或放射性同位素直接遞送至腫瘤細胞之因素。亦涵蓋其他形式之DNA損傷因素，諸如微波及UV輻照。最可能之情形為，所有此等因素對DNA、DNA之前驅物、DNA之複製及修復，及染色體之組裝及維持造成大範圍損害。X射線之劑量範圍在延長之時間段(3至4週)期間50至200倫琴日劑量至2000至6000倫琴之單次劑量範圍內。放射性同位素之劑量範圍變化極大，且視同位素之半衰期、所發出之輻射之強度及類型，及贅生性細胞之吸收情況而定。

當應用於細胞時，術語「接觸」及「暴露」在本文中用於描述治療劑及化學治療劑或放射性治療劑藉以遞送至目標細胞或與目標細胞直接併接地置放的過程。為達成細胞殺死或鬱滯，兩種藥劑均以有效殺死細胞或防止其分裂之組合量遞送至細胞。 3.              免疫療法

免疫治療劑通常依賴於使用免疫效應細胞及分子來靶向及破壞癌細胞。免疫效應子可為例如對腫瘤細胞表面上之一些標記物具有特異性的抗體。單獨的抗體可充當療法之效應子或其可募集其他細胞以實際上實現細胞殺死。抗體亦可與藥物或毒素(化學治療劑、放射性核種、蓖麻毒素A鏈、霍亂毒素、百日咳毒素等)結合且僅充當靶向劑。或者，效應子可為攜帶直接或間接與腫瘤細胞目標相互作用之表面分子的淋巴球。各種效應細胞包括細胞毒性T細胞及NK細胞。治療模式之組合，亦即直接細胞毒活性及Fortilin蛋白之抑制或減少將在癌症治療中提供治療益處。

免疫療法亦可用作組合療法之一部分。下文論述用於組合療法之通用方法。在免疫療法之一個態樣中，腫瘤細胞必須帶有一些適合於靶向，亦即不存在於大部分其他細胞上之標記。存在許多腫瘤標記，且任何此等標記可用於在本發明之情形下靶向。常見腫瘤標記包括癌胚抗原、前列腺特異性抗原、尿液腫瘤相關抗原、胚胎抗原、酪胺酸酶(p97)、gp68、TAG-72、HMFG、唾液酸化路易斯抗原(Sialyl Lewis Antigen)、MucA、MucB、PLAP、雌激素受體、層黏連蛋白受體、 erbB及p155。免疫療法之替代態樣為組合抗癌作用與免疫刺激作用。亦存在免疫刺激分子，包括細胞介素，諸如IL-2、IL-4、IL-12、GM-CSP、γ-IFN、趨化因子，諸如MIP-1、MCP-1、IL-8及生長因子，諸如FL T3配體。組合免疫刺激分子作為蛋白質或使用基因遞送與腫瘤抑制因子(諸如MDA-7)的組合已展示增強抗腫瘤作用(Ju等人, 2000)。

以先前所論述，當前在研究中或在使用中之免疫療法之實例係免疫佐劑(例如 牛分枝桿菌 (Mycobacterium bovis)、 鐮狀瘧原蟲 (Plasmodium falciparum)、二硝基氯苯及芳族化合物)(美國專利5,801,005；美國專利5,739,169；Hui及Hashimoto，1998；Christodoulides等人, 1998)、細胞介素療法(例如干擾素及IL-1、GM-CSP及TNF) (Bukowski等人, 1998；Davidson等人, 1998；Hellstrand等人, 1998)基因療法(例如TNF、IL-1、IL-2、p53) (Qin等人, 1998；Austin-Ward及Villaseca，1998；美國專利5,830,880及美國專利5,846,945)及單株抗體(例如抗神經節苷脂GM2、抗HER-2、抗p185) (Pietras等人, 1998；Hanibuchi等人, 1998；美國專利5,824,311)。赫賽汀(Herceptin)(曲妥珠單抗(trastuzumab))係阻斷HER2-neu受體之嵌合(小鼠-人類)單株抗體。其具有抗腫瘤活性且已批准用於治療惡性腫瘤(Dillman，1999)。赫賽汀與化療之癌症組合療法已展示比單獨療法更有效。因此，經考慮，一或多種抗癌療法可與本文所描述之腫瘤相關HLA限制性肽療法一起使用。

在授受性免疫療法中，患者之循環淋巴球或腫瘤浸潤淋巴球經活體外分離，藉由諸如IL-2之淋巴介質活化或經腫瘤壞死之基因轉導，且再投與(Rosenberg等人, 1988；1989)。為達成此目的，將向動物或人類患者投與免疫學上有效量之活化淋巴球與依本文所描述之併入佐劑之抗原肽組合物的組合。活化淋巴球將最佳為患者自身細胞，其先前自血液或腫瘤樣本分離且活體外經活化(或「擴增」)。此形式之免疫療法已產生若干黑色素瘤及腎癌消退情況，但反應者百分比相比於無反應者較少。

存在用於癌症之被動免疫療法之多種不同方法。其可廣泛地分成以下：單獨注射抗體；注射與毒素或化學治療劑偶合之抗體；注射與放射性同位素偶合之抗體；注射抗個體基因型抗體；及最後，清除骨髓中之腫瘤細胞。

人類單株抗體用於被動免疫療法中，因為其在患者中產生很少或沒有副作用。然而，其應用略微受限於其稀缺性且迄今為止僅在病灶內投與過。神經節苷脂抗原之人類單株抗體已病灶內投與罹患皮膚復發性黑色素瘤的患者(Irie及Morton，1986)。在十個患者中之六名患者中觀測到消退，隨後每日或每週進行病灶內注射。在另一項研究中，病灶內注射兩種人類單株抗體取得一定成功(Irie等人, 1989)。可能的治療性抗體包括抗TNF、抗CD25、抗CD3、抗CD20、CTLA-4-IG及抗CD28。

投與超過一種針對兩種不同抗原之單株抗體或甚至具有多種抗原特異性之抗體係可能有利的。治療方案亦可包括投與淋巴介質或其他免疫增強劑，依Bajorin等人(1988)所描述。人類單株抗體之研發進一步詳細描述於本說明書中其他處。 4.              基因療法

在又一實施例中，二級治療為其中治療性聚核苷酸在投與腫瘤相關HLA限制性肽之前、之後或同時投與的基因療法。編碼腫瘤相關HLA限制肽之載體與編碼以下基因產物中之一者的第二載體一起遞送將對目標組織具有組合之抗過度增殖作用。或者，可使用編碼兩種基因之單個載體。本發明涵蓋多種蛋白質，其中一些描述於下文中。可與本發明組合靶向某種形式之基因療法的各種基因為一般熟習此項技術者所熟知且可包含涉及癌症之任何基因。

細胞增殖之誘導劑。誘導細胞增殖之蛋白質視功能而定進一步屬於各種類別。所有此等蛋白質之共同性為其調節細胞增殖之能力。例如，PDGF(sis致癌基因)之一種形式為分泌生長因子。致癌基因很少由編碼生長因子之基因產生，且在本發明中，sis係唯一已知的天然存在之致癌生長因子。在本發明之一個實施例中，經考慮，針對細胞增殖之特定誘導劑的反義mRNA用於防止細胞增殖之誘導劑表現。

蛋白質PMS、ErbA、ErbB及neu為生長因子受體。此等受體之突變致使可調節功能喪失。例如，影響Neu受體蛋白質之跨膜域之點突變產生neu致癌基因。erbA致癌基因來源於甲狀腺激素之細胞內受體。被修飾之致癌ErbA受體被認為與內源性甲狀腺激素受體競爭，引起不受控生長。

最大類別之致癌基因包括信號轉導蛋白質(例如，Src、Abl及Ras)。蛋白質Src為細胞質蛋白質酪胺酸激酶，且其自原致癌基因至致癌基因之轉型在一些情況下經由酪胺酸殘基527處之突變產生。相比之下，在一個實例中，GTP酶蛋白ras自原致癌基因轉型為致癌基因係由序列中胺基酸12處之纈胺酸至甘胺酸突變產生，從而降低ras GTP酶活性。蛋白質Jun、Fos及Myc為直接發揮其對核充當轉錄因子之作用的蛋白質。

細胞增殖抑制劑。腫瘤抑制致癌基因用於抑制過度細胞增殖。此等基因失活破壞其抑制活性，導致不受調控之增殖。最常見腫瘤抑制劑為Rb、p53、p21及p16。可根據本發明採用之其他基因包括APC、DCC、NF-1、NF-2、WT-1、MEN-I、MEN-II、zac1、p73、VHL、C-CAM、MMAC1/PTEN、DBCCR-1、FCC、rsk-3、p27、p27/p16融合及p21/p27融合。

計劃性細胞死亡之調節子。細胞凋亡或計劃性細胞死亡為正常胚胎發育、維持成人組織內穩定及抑制癌發生之基本過程(Kerr等人, 1972)。在其他系統中，Bcl-2家族蛋白質及ICE樣蛋白酶已經證實為細胞凋亡之重要調節因子及效應子。與濾泡性淋巴瘤相關的Bcl-2蛋白質在控制細胞凋亡及增強細胞存活以對不同細胞凋亡刺激起反應中發揮重要作用(Bakhshi等人, 1985；Cleary及Sklar，1985；Cleary等人, 1986；Tsujimoto等人, 1985；Tsujimoto及Croce，1986)。現將進化保守的Bcl-2蛋白質視為相關蛋白質家族之成員，其可歸類為死亡促效劑或死亡拮抗劑。

在發現其之後，Bcl-2展示用以遏制由多種刺激觸發之細胞死亡。此外，顯而易見地，存在共有共同結構及序列同源性之Bcl-2細胞死亡調節蛋白家族。此等不同家族成員已展示具有與Bcl-2 (例如BclxL、Bclw、Bcls、Mcl-1、Al、Bfl-1)類似的功能，或抵消Bcl-2功能且促進細胞死亡(例如Bax、Bak、Bik、Bim、Bid、Bad、Harakiri)。 5.              手術

大約60%患有癌症的人將經歷一些類型之手術，其包括預防性、診斷或分期、治癒性及姑息性手術。治癒性手術為可與其他療法結合使用之癌症治療，諸如本發明之治療、化學療法、放射線療法、荷爾蒙療法、基因療法、免疫療法及/或替代療法。

治癒性手術包括切除，其中物理上移除、切除及/或破壞癌組織之全部或部分。腫瘤切除係指物理移除腫瘤之至少部分。除腫瘤切除以外，手術治療亦包括雷射手術、冷凍手術、電手術及顯微鏡控制手術(莫氏手術(Mohs' surgery))。進一步預期，本發明可與移除表面皮癌、初癌或附帶量之正常組織結合使用。

在切除一部分或所有癌細胞、組織或腫瘤後，可在體內形成空腔。治療可藉由用額外抗癌療法對該區域灌注、直接注射或局部施用而實現。可例如每1天、2天、3天、4天、5天、6天或7天、或每1週、2週、3週、4週及5週或每1個月、2個月、3個月、4個月、5個月、6個月、7個月、8個月、9個月、10個月、11個月或12個月重複此類治療。此等治療亦可具有不同劑量。 V.   抗體結合物

抗體可與至少一種藥劑連接以形成抗體結合物。為了增加抗體分子作為診斷劑或治療劑之功效，通常連接或共價結合至少一個所需分子或部分，或與之形成複合體。此類分子或部分可為但不限於至少一個效應子或報導子分子。效應子分子包含具有所需活性，例如免疫抑制/消炎之分子。此類分子之非限制性實例陳述於上文。此類分子之非此類分子視情況經由可裂解連接子連接，該等可裂解連接子經設計以允許分子在目標位點處或附近釋放。

相比之下，報導子分子定義為可使用分析法偵測的任何部分。已經結合至抗體之報導子分子的非限制性實例包括酶、放射性標記、半抗原、螢光標記、磷光分子、化學發光分子、發色團、光親和性分子、著色粒子或配體，諸如生物素。

抗體結合物一般較佳用作診斷劑。抗體診斷劑一般分為兩類：用於活體外診斷，諸如用於多種免疫分析法中之診斷劑；及用於活體內診斷方案之診斷劑，一般稱為「抗體引導之成像」。此項技術中已知許多適當成像劑，以及其連接至抗體之方法(參見例如，美國專利5,021,236、4,938,948及4,472,509)。所用成像部分可為順磁性離子、放射性同位素、螢光染料、NMR可偵測之物質及X射線成像劑。

在順磁性離子之情況下，可例如提及諸如鉻(III)、錳(II)、鐵(III)、鐵(II)、鈷(II)、鎳(II)、銅(II)、釹(III)、鈣(III)、鐿(III)、釓(III)、釩(II)、鋱(III)、鏑(III)、鈥(III)及/或鉺(III)之離子，其中釓尤佳。可用於其他情形，諸如X射線成像之離子包括但不限於鑭(III)、金(III)、鉛(II)且尤其是鉍(III)。

在用於治療及/或診斷應用之放射性同位素的情況下，可提及砹 ²¹¹、 ¹⁴碳、 ⁵¹鉻、 ³⁶氯、 ⁵⁷鈷、 ⁵⁸鈷、銅 ⁶⁷、 ¹⁵²Eu、鎵 ⁶⁷、 ³氫、碘 ¹²³、碘 ¹²⁵、碘 ¹³¹、銦 ¹¹¹、 ⁵⁹鐵、 ³²磷、錸 ¹⁸⁶、錸 ¹⁸⁸、 ⁷⁵硒、 ³⁵硫、鎝 ^99m及/或釔 ⁹⁰通常較佳用於某些實施例，鎝 ^99m及/或銦 ¹¹¹通常亦為較佳的，由於其能量低且適合遠端偵測。放射性標記之單株抗體可根據此項技術中熟知之方法產生。例如，單株抗體可藉由與碘化鈉及/或碘化鉀及化學氧化劑(諸如次氯酸鈉)或酶氧化劑(諸如乳過氧化酶)接觸而碘化。單株抗體可用鎝 ^99m藉由配體交換法，例如藉由用亞錫溶液還原高鎝酸鹽，將經還原之鎝螯合至葡聚糖凝膠管柱上且將抗體施加至此管柱上來進行標記。或者，可使用直接標記技術，例如藉由溫育高鎝酸鹽、還原劑(諸如SNCl ₂)、緩衝溶液(諸如鄰苯二甲酸鈉-鉀溶液)及抗體。中間官能基通常用於將放射性同位素結合至抗體且以金屬離子為二伸乙三胺五乙酸(DTPA)或伸乙基二胺四乙酸(EDTA)之形式存在。

在涵蓋用作結合物之螢光標記中包括Alexa 350、Alexa 430、AMCA、BODIPY 630/650、BODIPY 650/665、BODIPYFL、BODIPY-R6G、BODIPY-TMR、BODIPY-TRX、Cascade Blue、Cy3、Cy5、6-FAM、異硫氰酸螢光素、HEX、6-JOE、俄勒岡綠(Oregon Green)488、俄勒岡綠500、俄勒岡綠514、太平洋藍(Pacific Blue)、REG、若丹明綠(Rhodamine Green)、若丹明紅、腎造影劑(Renographin)、ROX、TAMRA、TET、四甲基若丹明及/或德克薩斯紅(Texas Red)。

所涵蓋之另一類抗體結合物為預期主要在活體外使用的該等結合物，其中抗體連接至在與發色基質接觸時產生著色產物的二級結合配體及/或酶(酶標籤)。適合酶之實例包括尿素酶、鹼性磷酸酶、(辣根)氫過氧化酶或葡萄糖氧化酶。較佳之二級結合配體為生物素及鏈黴抗生物素蛋白及卵白素化合物。此類標記之使用為熟習此項技術者熟知的且描述於例如美國專利3,817,837、3,850,752、3,939,350、3,996,345、4,277,437、4,275,149及4,366,241中。

將分子位點特異性附接至抗體之又一已知方法包含使抗體與基於半抗原之親和標記反應。本質上，基於半抗原之親和標記與抗原結合位點中之胺基酸反應，由此破壞此位點且阻斷特異性抗原反應。然而，由於其因抗體結合物引起抗原結合之損失，此可能為不利的。

亦可使用含有疊氮基之分子，經由低強度紫外光產生之反應性亞氨體中間物而與蛋白質形成共價鍵(Potter及Haley, 1983)。特定言之，已使用嘌呤核苷酸之2-疊氮基類似物及8-疊氮基類似物作為定點光探針以鑑別粗細胞提取物中之核苷酸結合蛋白(Owens及Haley，1987；Atherton等人, 1985)。2-疊氮基核苷酸及8-疊氮基核苷酸亦用於定位純化蛋白質之核苷酸結合域(Khatoon等人, 1989；King等人, 1989；Dholakia等人, 1989)且可用作抗體結合劑。

此項技術中已知用於將抗體附接或結合至其結合物部分之若干方法。一些連接方法涉及使用金屬螯合劑複合物，採用例如有機螯合劑，諸如二伸乙三胺五乙酸之酸酐(DTPA)；伸乙基三胺四乙酸；N-氯-對甲苯磺醯胺；及/或四氯-3a-6a-二苯基甘脲-3連接至抗體(美國專利4,472,509及4,938,948)。單株抗體亦可與酶在諸如戊二醛或高碘酸鹽之偶合劑存在下反應。帶有螢光素標記之結合物係在該等偶合劑存在下或藉由與異硫氰酸鹽反應來製備。在美國專利4,938,948中，乳房腫瘤之成像係使用單株抗體實現且可偵測成像部分使用諸如甲基-對羥基苯甲亞胺酸酯或N-琥珀醯亞胺基1-3-(4-羥苯基)丙酸酯之連接子結合至抗體。

在其他實施例中，涵蓋藉由使用不改變抗體組合位點之反應條件，在免疫球蛋白Fe區中選擇性引入硫氫基進行免疫球蛋白之衍生作用。揭示的根據此方法產生之抗體結合物展現改善之耐久性、特異性及敏感性(美國專利5,196,066，以引用的方式併入本文中)。文獻中亦已揭示效應子或報導子分子之位點特異性附接，其中該報導子或效應子分子係結合至Fe區中之碳水化合物殘基(O'Shannessy等人, 1987)。據報告，此方法製造出在診斷上及治療上頗具前景之抗體，該等抗體當前處於臨床評價中。 VI. 免疫偵測方法

在另外其他實施例中，存在用於結合、純化、移除、定量及以其他方式通常偵測PD-L1或PD-L2及其相關抗原的免疫偵測方法。一些免疫偵測方法包括例如酶聯免疫吸附分析法(ELISA)、放射免疫分析法(RIA)、免疫放射分析法、螢光免疫分析法、化學發光分析法、生物發光分析法及西方墨點法。特定言之，亦提供用於偵測及定量PD-L1及PD-L2抗體之競爭性分析。各種有用免疫偵測方法之步驟已描述於科學文獻中，諸如Doolittle及BenZeev(1999)、Gulbis及Galand(1993)、De Jager等人(1993)及Nakamura等人(1987)。一般而言，免疫結合方法包括獲得懷疑樣品，且視具體情況在有效允許免疫複合體形成之條件下，使該樣品與根據本文所論述之實施例的第一抗體接觸。

使所選生物樣品與抗體在有效條件下接觸一段足以允許免疫複合體(主要免疫複合體)形成之時間一般約為僅僅將抗體組合物添加至樣品中且培育該混合物一段長至足以使該等抗體與存在之PD-L1及PD-L2形成免疫複合體(亦即，結合至存在之PD-L1及PD-L2)之時間的問題。此後，一般洗滌樣品-抗體組合物，諸如組織切片、ELISA盤、點漬墨或西方墨點，以移除任何非特異性結合之抗體物種，使得僅在主要免疫複合體內特異性結合之該等抗體得到偵測。

一般而言，免疫複合體形成之偵測為此項技術中熟知的且可藉由應用眾多方法實現。此等方法一般係基於標記或標記物，諸如該等放射性標籤、螢光標籤、生物標籤及酶標籤中之任一者的偵測。關於使用此類標記之專利包括美國專利3,817,837、3,850,752、3,939,350、3,996,345、4,277,437、4,275,149及4,366,241。當然，可藉由使用依此項技術中已知的二級結合配體，諸如二次抗體及/或生物素/抗生素蛋白配體結合佈置發現另外的優勢。

用於偵測之抗體本身可連接至可偵測標記，其中隨後僅僅偵測此標記，由此測定組合物中主要免疫複合體之量。或者，可藉助於對抗體具有結合親和力之第二結合配體偵測主要免疫複合體內結合之第一抗體。在此等情況下，該第二結合配體可連接至可偵測標記。該第二結合配體本身通常為一種抗體，其因此可被稱為「二級」抗體。主要免疫複合體與經標記之二級結合配體或抗體在有效條件下接觸一段足以允許二級免疫複合體形成之時間。隨後一般洗滌該等二級免疫複合體以移除任何非特異性結合之經標記二級抗體或配體，且隨後偵測二級免疫複合體中之殘留標記。

其他方法包括藉由兩步法偵測主要免疫複合體。使用第二結合配體，諸如對抗體具有結合親和力之抗體，形成依上文所描述之二級免疫複合體。洗滌之後，使二級免疫複合體與對第二抗體具有結合親和力之第三結合配體或抗體再次在有效條件下接觸一段足以允許形成免疫複合體(三級免疫複合體)之時間。第三配體或抗體連接至可偵測標記，從而允許偵測由此形成之三級免疫複合體。若需要，此系統可提供信號放大。

一種免疫偵測方法使用兩種不同抗體。第一生物素化抗體用於偵測目標抗原，且隨後第二抗體用於偵測附接至經複合生物素的生物素。在該方法中，首先在含有第一步驟抗體之溶液中培育待測試之樣品。若存在目標抗原，則一些抗體結合至抗原而形成生物素化抗體/抗原複合體。抗體/抗原複合體隨後藉由在具有鏈黴抗生物素蛋白(或抗生素蛋白)、生物素化DNA及/或互補生物素化DNA之連續溶液中培育以進行擴增，其中各步驟添加另外的生物素位點至抗體/抗原複合體中。重複擴增步驟，直至達到適合擴增程度，此時，在含有針對生物素之第二步驟抗體的溶液中培育樣品。此第二步驟抗體例如用酶標記，該酶可藉由使用色原體受質之組織酶學偵測抗體/抗原複合體之存在。在適當擴增情況下，可產生肉眼可見之結合物。

另一已知的免疫偵測方法利用了免疫-PCR (聚合酶鏈反應)方法。該PCR方法在與生物素化DNA一起培育之前類似於Cantor方法，不過改用多輪鏈黴抗生物素蛋白及生物素化DNA培育，用低pH或高鹽緩衝液洗滌DNA/生物素/鏈黴抗生物素蛋白/抗體複合體以釋放出抗體。隨後使用所得洗滌溶液在適合引子及適當對照物存在下進行PCR反應。至少在理論上，可利用PCR之巨大擴增能力及特異性偵測單抗原分子。 A.   ELISA

免疫分析在其最簡單意義上為結合分析。某些較佳的免疫分析法為此項技術中已知的各種類型之酶聯免疫吸附分析法(ELISA)及放射免疫分析法(RIA)。使用組織切片進行之免疫組織化學偵測亦為尤其適用的。然而，易於理解的是，偵測不限於此類技術，且亦可使用西方墨點法、點狀墨點法、FACS分析及其類似方法。

在一種例示性ELISA中，將本發明之抗體固定至展現蛋白質親和力之選定表面上，諸如聚苯乙烯微量滴定盤之孔中。隨後，將懷疑含有PD-L1及/或PD-L2之測試組合物添加至孔中。在結合及洗滌移除非特異性結合之免疫複合體之後，可偵測經結合之抗原。偵測可藉由添加另一針對連接至可偵測標記之PD-L1及PD-L2的雙特異性抗體，或藉由連接至可偵測標記之抗PD-L1或抗PD-L2抗體實現。此類ELISA為簡單的「夾心ELISA」。偵測亦可藉由添加PD-L1及PD-2之第二雙特異性抗體，或抗PD-L1或抗PD-L2抗體，隨後添加對第二抗體具有結合親和力之第三抗體實現，其中第三抗體與可偵測標記連接。

在另一例示性ELISA中，將懷疑含有PD-L1及/或PD-L2抗原之樣品固定至孔表面上，且隨後與雙特異性抗PD-L1及抗PD-L2抗體接觸。在結合及洗滌移除非特異性結合之免疫複合體後，偵測經結合之雙特異性抗PD-L1及抗PD-L2抗體。在初始雙特異性抗PD-L1及抗PD-L2抗體連接至可偵測標記的情況下，可直接偵測免疫複合體。同樣，可使用對第一雙特異性抗PD-L1及抗PD-L2抗體具有結合親和力之第二抗體偵測免疫複合體，其中第二抗體與可偵測標記連接。

無論採用何種形式，ELISA均具有某些共同特徵，諸如塗佈、培育及結合、洗滌移除非特異性結合之物質，及偵測經結合之免疫複合體。下文中描述此等修飾。

在用抗原或抗體塗佈盤時，一般將該盤之孔與抗原或抗體溶液培育隔夜或指定的數小時時間。隨後洗滌該盤之孔以移除不完全吸附之材料。隨後，該等孔之任何殘留可用表面利用對測試抗血清呈抗原中性之非特異性蛋白質「塗佈」。該等蛋白質包括牛血清白蛋白(BSA)、酪蛋白或奶粉溶液。該塗佈允許阻斷固定表面上之非特異性吸附位點且因此減小由該表面上抗血清之非特異性結合引起的背景。

在ELISA中，可能更常用的是，使用二級或三級偵測方式而非直接程序。因此，在蛋白質或抗體結合至孔，用非反應性材料塗佈以減小背景且洗滌以移除未結合之材料之後，使固定表面與待測試之生物樣品在有效允許免疫複合體(抗原/抗體)形成的條件下接觸。免疫複合體之偵測則需要經標記之二級結合配體或抗體，及二級結合配體或抗體與經標記之三級抗體或第三結合配體之組合。

「在有效允許免疫複合體(抗原/抗體)形成之條件下」意謂條件較佳包括用諸如BSA、牛γ球蛋白(BGG)或磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)/Tween之溶液稀釋抗原及/或抗體。該等添加之試劑亦往往有助於減小非特異性背景。

「適合」條件亦意謂培育係在足以允許有效結合之溫度或時間段下進行。培育步驟通常為較佳在約25℃至27℃之溫度下約1至2至約4小時，或可在約4℃下隔夜。

在ELISA中之所有培育步驟之後，洗滌接觸之表面，以便移除未形成複合體之材料。較佳洗滌程序包括用諸如PBS/Tween或硼酸鹽緩衝液之溶液洗滌。在測試樣品與最初結合之材料之間形成特定免疫複合體且隨後洗滌之後，可測定甚至微量免疫複合體之存在。

為提供偵測方式，第二或第三抗體將具有相關標記以允許偵測。較佳此標記將為在與適當發色受質一起培育時顯色的酶。因此，例如，需要使第一及第二免疫複合體與尿素酶、葡萄糖氧化酶、鹼性磷酸酶或氫過氧化酶共軛抗體在促進其他免疫複合體形成之發生的時間及條件下接觸或培育(例如，在室溫下於含PBS之溶液，諸如PBS-Tween中培育2小時)。

在與經標記抗體一起培育且隨後洗滌以移除未結合之材料之後，例如藉由與發色受質，諸如脲，或溴甲酚紫，或2,2'-次偶氮基-二-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸) (ABTS)或H ₂O ₂(在過氧化酶作為酶標記之情況下)一起培育，來對標記之量進行定量。隨後，藉由例如使用可見光譜分光光度計量測所產生之顏色的色度來實現定量。 B.   西方墨點法

西方墨點法(或者，蛋白質免疫墨點法)為用於偵測給定組織勻漿或提取物樣品中之特定蛋白質的分析技術。其使用凝膠電泳，藉由多肽之長度(變性條件)或藉由蛋白質之3-D結構(天然/非變性條件)來分離天然或變性之蛋白質。隨後將蛋白質轉印至膜(通常為硝化纖維素或PVDF)上，在其中使用目標蛋白質特異性抗體探測(偵測)該等蛋白質。

樣品可獲自完整組織或細胞培養物。在大多數情況下，首先使用摻混機(對於較大樣品體積)、使用均質機(較小體積)或藉由音波處理，以機械方式分解固體組織。亦可藉由以上機械方法之一打開細胞。然而，應注意，細菌、病毒或環境樣品可為蛋白質之來源且因此西方墨點法並不僅僅侷限於細胞研究。可採用選定之清潔劑、鹽及緩衝劑促進細胞溶解及溶解蛋白質。通常添加蛋白酶及磷酸酶抑制劑以防止樣品被其自身酶消化。組織準備通常係在較冷溫度下進行以避免蛋白質變性。

使用凝膠電泳分離樣品中之蛋白質。蛋白質之分離可藉由等電點(pI)、分子量、電荷或該等因素之組合進行。分離之性質取決於樣品之處理及凝膠之性質。此為測定蛋白質之極有用方式。亦可使用二維(2-D)凝膠，其在兩個維度上擴散來自單一樣品之蛋白質。蛋白質在第一維度上係根據等電點(使其具有中性淨電荷之pH)分離，且在第二維度上根據其分子量分離。

為了使蛋白質可用於抗體偵測，將其自凝膠內移至由硝化纖維素或聚偏二氟乙烯(PVDF)製成之膜上。將該膜置放於凝膠頂部上，且在其頂部上置放一疊濾紙。將該整個疊層置放於緩衝溶液中，該緩衝溶液在毛細作用下使蛋白質與其一起在濾紙上向前移動。用於轉印蛋白質之另一方法稱為電墨點法(electroblotting)且使用電流將蛋白質自凝膠拉至PVDF或硝化纖維素膜中。蛋白質自凝膠內移至膜上，同時維持其在凝膠內所具有之組織。此墨點法之結果是，蛋白質暴露於薄表面層上以進行偵測(參見下文)。膜之兩個種類係針對其非特異性蛋白質結合特性(亦即，同等地結合所有蛋白質)選擇。蛋白質結合係基於疏水相互作用，以及膜與蛋白質之間之帶電相互作用。相較於PVDF，硝化纖維素膜更便宜，但要脆弱得多且無法經受住重複探測。蛋白質自凝膠轉印至膜之均一性及總體效用可藉由用考馬斯亮藍(Coomassie Brilliant Blue)或麗春紅染料(Ponceau S dye)對膜染色來檢查。一旦轉印，即使用經標記初級抗體偵測蛋白質，或使用未標記初級抗體，隨後使用經標記蛋白質A或結合至初級抗體Fe區之二級經標記抗體間接偵測蛋白質。 C.   免疫組織化學

抗體亦可與製備用於免疫組織化學(IHC)研究之新鮮冷凍及/或福馬林固定、石蠟包埋之組織塊一起使用。由此等顆粒試樣製備組織塊之方法已成功地用於先前針對各種預後因子之IHC研究中且為熟習此項技術者熟知的(Brown等人, 1990；Abbondanzo等人, 1990；Allred等人, 1990)。

簡言之，可藉由以下方式製備冷凍切片：在小塑膠膠囊中，在室溫下使50 ng冷凍「粉碎」組織在磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)中復水；藉由離心使粒子粒化；將其再懸浮於黏性包埋介質(OCT)中；倒轉膠囊及/或再藉由離心使其粒化；在-70℃異戊烷中急速冷凍；切割塑膠膠囊及/或移除冷凍之組織圓柱；將組織圓柱固定於低溫薄片切片機夾盤上；及/或自膠囊切割25-50個連續切片。或者，可使用完整的冷凍組織樣品進行連續切片切割。

永久性切片可藉由類似方法製備，該方法涉及在塑膠微量離心管中使50 mg樣品復水；集結成團；再懸浮於10%福馬林中固定4小時；洗滌/集結成團；再懸浮於溫熱的2.5%瓊脂中；集結成團；在冰水中冷卻以使瓊脂變硬；自管中移出組織/瓊脂塊；使該塊滲入及/或包埋於石蠟中；及/或切割多達50個永久性連續切片。又，可代之以完整組織樣品。 D.   免疫偵測套組

在另外其他實施例中，存在可用於上文所描述之免疫偵測方法的免疫偵測套組。免疫偵測套組將在適合容器構件中包含結合至PD-L1及/或PD-L2抗原之第一雙特異性抗體及視情況選用之免疫偵測試劑。

在某些實施例中，PD-L1及PD-L2之雙特異性抗體可預先結合至固體載體，諸如管柱基質及/或微量滴定盤之孔。該套組中之免疫偵測試劑可呈多種形式，包括與給定抗體關聯或連接至給定抗體之該等可偵測標記。亦涵蓋與二級結合配體關聯或附接至二級結合配體之可偵測標記。例示性二級配體為對第一抗體具有結合親和力之二級抗體。

用於本發明套組中之其他適合的免疫偵測試劑包括兩組分試劑，其包含對第一抗體具有結合親和力之二級抗體，以及對第二抗體具有結合親和力之第三抗體，該第三抗體連接至可偵測標記。依上文所指出，此項技術中已知多種例示性標記且所有此類標記均可結合本文所論述之實施例。

套組可進一步包含適合的PD-L1及PD-L2抗原之等分組合物，無論標記或未標記，其可用於製備偵測分析之標準曲線。該等套組可含有呈完全結合形式、呈中間物形式或呈有待該套組之使用者結合之獨立部分形式的抗體-標記結合物。該等套組之組分可包裝封裝於水性介質中或以凍乾形式包裝封裝。

該等套組之容器構件一般包括至少一個小瓶、試管、燒瓶、瓶、注射器，或可放入抗體或較佳適宜等分之其他容器構件。套組亦包括含有抗體、抗原及任何其他試劑容器(嚴密限制以商業出售)之構件。此類容器可包括注射模製或吹塑模製塑膠容器，其中保留所需小瓶。 VII. 實例

包括以下實例以展示本發明之較佳實施例。本領域中熟習此項技術者應理解，以下實例中所揭示之技術代表本發明人所發現之在本發明之實踐中發揮良好作用的技術，且因此可視為構成其實踐的較佳實施方式。然而，熟習此項技術者根據本發明應理解，在不背離本發明之精神及範疇的情況下可對所揭示之特定實施例作出許多變更且仍獲得相同或類似結果。 實例1 -材料及方法

抗體表徵。測試自酵母表面展示篩選產生之候選抗體與PD-L1或PD-L2結合的能力。為產生對人類PD-L1及PD-L2之親和力KD，將候選單株Ab以100 nM (15 µg/mL)裝載於抗人類Fc捕獲(AHC)生物感測器上，且以30-0.37 nM之稀釋系列測試人類PD-L1或PD-L2蛋白締合及解離。分析物(PD-L1或PD-L2)之結合及釋放藉由Octet儀器即時記錄，且隨後用於計算KD、Kon及Kdis；結果源於2:1全域擬合建模，其中減去參考孔。為產生對鼠類PD-L1及PD-L2之親和力KD，將候選抗體以100 nM (15 µg/mL)共價固定於活化的胺反應性第2代(AR2G)生物感測器上(在蛋白裝載後用1M乙醇胺pH 8.5淬滅)，且以300-1 nM之稀釋系列測試小鼠PD-L1或PD-L2蛋白締合及解離。分析物之結合及釋放藉由Octet儀器即時記錄，且隨後用於計算KD、Kon及Kdis；結果源於2:1全域擬合建模，其中減去參考孔。

在混合淋巴球反應中之雙重 PD-L1/PD-L2 特異性抗體活性。使用CD14微珠自周邊血液單核細胞分離CD14+單核球。將細胞以1百萬/ml接種在10% FCS/RPMI/P/S細胞培養基中且用IL-4及GM-CSF刺激。將細胞培養7天以分化為未成熟樹突狀細胞(IDC)且添加不同濃度之PD-L1、PD-L1及PD-L2二者、DiPDL或商業抗體。IDC隨後用於以10:1 CD4:IDC之比率刺激CD4+ T細胞。根據R&D systems提供之方案，藉由ELISA分析IFN-γ。

針對同基因型小鼠大腸直腸癌之抗體活性。將1×10 ⁵個CT26或CT26-PDL2大腸直腸癌細胞皮下植入雌性BALB/c小鼠的右側腹。在第3、6、9、12及15天，小鼠腹膜內接受PD-L1/PD-L2抗體(250 μg)、對照抗體(例如抗PD-1)或媒劑。用測徑規量測跟蹤腫瘤生長，且當小鼠死亡或腫瘤體積超過1000 mm ³時將其評分為不再存活。

針對人源化小鼠中 BFTC909 腎細胞癌之抗體活性。將5×10 ⁶個BFTC909腎細胞癌細胞皮下植入移植人類CD34+幹細胞之huNOG-ExL小鼠的右側腹。當腫瘤達到＞50 mm ³時，小鼠腹膜內接受PD-L1/PD-L2抗體(250 µg)、對照抗體(例如抗PD-1)或媒劑，一週兩次，持續三週。用測徑規量測跟蹤腫瘤生長，且當小鼠死亡或腫瘤體積超過1000 mm ³時將其評分為不再存活。

量測人類胰島素受體結合。將2×10 ⁶個CHO-K細胞或CHO-K人類胰島素受體(CHO-INSR)細胞置放於96孔圓底組織培養盤之孔中，且藉由以2000 RPM離心2分鐘沈澱。將沈澱物再懸浮於含有一系列濃度之PD-L1/PD-L2雙特異性抗體(通常，0.1、1、10 µg/mL)之100 µl流式細胞測量術染色緩衝液中且在4攝氏度下培育30分鐘至1小時。隨後使細胞沈澱且用1:300稀釋度之抗人類IgG PE二級抗體再懸浮。再培育30分鐘後，在最後時刻使細胞沈澱且再懸浮於100 µl流式細胞測量術緩衝液中。使再懸浮細胞在BD LSR II流式細胞儀上運行以評估CHO-INSR與CHO-K細胞中PE螢光之強度，從而評估與人類胰島素受體之結合量。 實例2 -結果

產生不具有胰島素受體交叉反應之 PD-L1/PD-L2 雙重特異性抗體。來自若干輪Adimab®選擇之PD-L1及PD-L2重鏈及輕鏈已產生高親和力PD-L1/PD-L2雙重特異性抗體ADI-37464。儘管此抗體具有強效抗腫瘤活性，但發現其對人類胰島素受體(INSR)具有高親和力，亦使其不適於臨床使用。圖1顯示經由輕鏈互補決定區(CDR)之靶向點突變產生五個新殖株(38000-38004)，該靶向點突變的目的為移除胰島素受體結合但保留高PD-L1/PD-L2雙重親和力。出人意料地，此類修飾使得親本殖株與經修飾之抗體之間的結合親和力幾乎沒有顯著差異。此等衍生物中之三者(38002、38003、38004)顯示顯著降低的INSR結合及保留的PD-L1/PD-L2雙重親和力，且經推進用於進一步研究。

38000 系列 PD-L1/PD-L2 抗體之親和力量測。使用Octet及Biocore，量測PD-L1及PD-L2對38000系列抗體相對於其親本抗體ADI-37464之親和力(圖2)。藉由所有量測，38002顯示出PD-L1及PD-L2結合親和力與37464無顯著差異。

用 38000 系列 PD-L1/PD-L2 雙重特異性抗體處理 CT26 親本及 CT26-PD-L2 腫瘤。在大腸直腸癌之親本CT26同基因型模型中，38002顯示與親本抗體37464等效的治療活性(圖3A)。在高PD-L2過度表現的CT26-PD-L2模型中，38002顯示與親本37464殖株等效的腫瘤生長抑制(圖3B)。38002與37464均能夠治癒CT26-PD-L2之動物，且儘管37464治癒了較大部分，但38002與37464之間的差異在此實驗中並非統計學上顯著的。在第二個CT26親本實驗中，38002顯示PD-1阻斷之極大腫瘤生長抑制且再次在統計學上等效於親本PD-L1/PD-L2雙重特異性抗體37464 (圖4)。

處理人源化小鼠中之 BFTC-909 腎細胞癌。在治療骨髓幹細胞人源化huNOG-ExL小鼠中之人類BFTC909腎細胞癌腫瘤中，與可瑞達(Keytruda)或另一PD-L1/PD-L2雙重特異性殖株27907相比，38002在10天之治療中表現出最高的腫瘤生長減少(圖5)。

人類混合淋巴球反應 (MLR) 。在兩個獨立供體混合淋巴球反應對中，與PD-L1/PD-L2雙重特異性抗體27907相比，添加PD-L1/PD-L2雙重特異性抗體38002使干擾素γ釋放顯著增強至相等或更高的水平(圖5)。

量測脫靶胰島素受體結合。儘管37464及所有38000抗體藉由流式細胞測量術顯示與PD-L1、PD-L2以及雙重PD-L1及PD-L2 CHO細胞之高度結合，37464亦顯示在1 μg/mL下與過度表現INSR之CHO細胞的顯著結合。相比之下，兩個衍生殖株38002及38004顯示在1 μg/mL下無法偵測到與INSR的結合，依圖6中所示。此種在活體內可達到之濃度下缺乏INSR結合為38000系列PD-L1/PD-L2抗體之關鍵特徵，此使該等抗體與先前37464抗體區分開且使該等抗體適用於患者之治療用途。 實例 3 - 38002 與 37464 對 CHO 細胞上胰島素受體之結合、 ADCC 及 ADCP 活性之分析。

CHO-INSR 細胞上 INSR 、 PD-L1 及 PD-L2 表現。此實例中所用之細胞，即表現人類胰島素受體(CHO-INSR)之中國倉鼠卵巢(CHO)細胞係自ATCC (CHO INSR 1284 - CRL-3307 | ATCC)獲得。將細胞首先藉由流式細胞測量術針對INSR、PD-L1及PD-L2之表現進行表徵。正如所預期，經工程改造之CHO細胞顯示INSR之高表現(＞96%)，且無PD-L1或PD-L2之表現(圖10)。將INSR+ CHO細胞與針對INSR、PD-L1、PD-L2及對照的經PE標記之抗體一起培育。藉由流式細胞測量術量測螢光。

評估與 CHO 細胞上之 INSR 的結合。經由使用流式細胞測量術評估38002及37464抗體與表現人類INSR之活細胞結合的能力。將INSR-CHO細胞與38002、37464或同型對照抗體之連續稀釋液一起培育，隨後洗滌4次，且與山羊抗人類IgG (H+L)二級抗體Alexa Fluor 555一起培育。藉由流式細胞測量術量測螢光。資料顯示，相比於同型對照時，37464在高濃度下與INSR+細胞結合，但38002不與INSR+細胞結合(圖11)。

ADCC 活性。為測試38002及37464針對表現INSR之目標細胞的ADCC潛力，使用了利用經工程改造以表現具有驅動螢光素酶表現之NFAT反應元件之FcɣRIIIa受體的Jurkat細胞進行的報導子細胞分析(圖12A)。將38002及37464抗體與表現INSR但不表現PD-L1或PD-L2之INSR-CHO目標細胞一起培育。抗體38002未顯示針對表現INSR之目標細胞的活性，而抗體37464顯示出活性(圖12B)。

ADCP 活性。為了測試38002之ADCP活性，使用了利用經工程改造以表現具有驅動螢光素酶表現之NFAT反應元件之FcɣRIIa受體的Jurkat細胞進行的報導子細胞分析(圖13A)。針對穩定表現INSR之目標CHO細胞測試抗體38002、37464及對照同型。資料顯示在37464而非38002之濃度下對INSR+細胞的活性(圖13B)。

此實例進一步說明38002在活體內可達到之濃度下出人意料地缺乏INSR結合，其為38000系列PD-L1/PD-L2抗體之關鍵特徵且將該等抗體與先前產生之37464抗體區分開且使該等抗體適用於患者之治療用途。 實例 4 - 使用人類質膜蛋白細胞陣列評估 38002 、 38003 及 38004 之結合概況

使用細胞微陣列篩選3種人類IgG1抗體之特異性脫靶結合相互作用：38002、38003及38004 (統稱為「測試抗體」)。測試抗體靶向人類CD274 (PD-L1)及PDCD1LG2 (PD-L2)。

對各測試抗體與固定未轉染之HEK293細胞及過度表現CD274 (PD-L1)及PDCD1LG2 (PD-L2)之細胞之結合水平的研究顯示20 μg/mL之各測試抗體為合適的篩選濃度。因此，篩選20 μg/mL測試抗體38002以結合固定人類HEK293細胞，分別表現5861種全長人類質膜蛋白及細胞表面系留人類分泌蛋白加另一371人類異二聚體。此總共揭示37個庫命中。

各庫命中與2個對照受體一起再表現，且用20 μg/mL之各測試抗體或對照處理再測試。此在固定細胞及活細胞兩者上進行。

測試抗體38002在固定及活細胞微陣列上顯示與其主要目標CD274 (PD-L1)及PDCD1LG2 (PD-L2)之特異性相互作用。在固定細胞微陣列上觀測到與CST1、CST4及FBLN1之額外相互作用，且在活細胞微陣列上觀測到與CST1、CST4、長INSR同功異型物、短INSR同功異型物及INSR + IGF1R異二聚體之額外相互作用。在流式細胞測量術劑量反應研究中進一步研究與主要目標及長及短INSR同功異型物的相互作用。發現與主要目標CD274 (PD-L1)及PDCD1LG2 (PD-L2)之相互作用的EC ₅₀值分別為0.03及0.1 μg/mL，而發現與長及短INSR同功異型物之相互作用的EC ₅₀值分別為144.9及87.5 μg/mL。因此，長同功異型物之EC ₅₀值分別比主要目標CD274 (PD-L1)及PDCD1LG2 (PD-L2)大4830倍及1449倍。短同功異型物之EC ₅₀值分別比主要目標CD274 (PD-L1)及PDCD1LG2 (PD-L2)大2930倍及875倍。此等資料表明38002與INSR的二次相互作用在生物學上不相關。

雖然未針對整個蛋白質庫篩選，但當針對測試抗體38002產生之命中篩選測試抗體38003時，其在固定及活細胞微陣列上顯示與其主要目標CD274 (PD-L1)及PDCD1LG2 (PD-L2)的特異性相互作用。在固定細胞微陣列上觀測到與CST4及FBLN1之額外相互作用，且在活細胞微陣列上觀測到與CST1、CST4及INSR同功異型物之額外相互作用。類似地，當針對由測試抗體38002產生之命中篩選測試抗體38004時，其在固定及活細胞微陣列上顯示與其主要目標CD274 (PD-L1)及PDCD1LG2 (PD-L2)的特異性相互作用。僅在活細胞微陣列上觀測到與CST1及CST4之額外相互作用。

後續流式細胞測量術驗證研究。人類HEK293細胞僅用編碼ZsGreen1或ZsGreen1及CD274 (PD-L1)、PDCD1LG2 (PD-L2)、長INSR同功異型物、短INSR同功異型物或CD20 (分析對照)之表現載體轉染。如所指示，將活細胞轉染物與38002之劑量範圍(0-300 μg/mL)、1 μg/mL利妥昔單抗生物類似物(分析對照)或僅分析緩衝液一起培育。洗滌細胞，且與依細胞微陣列篩選中所用之相同AF647抗人類IgG Fc偵測抗體一起培育。再次洗滌細胞，且使用Accuri流式細胞儀(BD)藉由流式細胞測量術進行分析。在分析中使用7AAD活/死染料排除死細胞，且選擇ZsGreen+ (經轉染)細胞用於分析。

確認 / 特異性篩選 ( 固定細胞 ) 。在隨後確認/特異性篩選中，所有37個庫命中、INSR + IGFR及2個對照受體(CD20及EGFR)在HEK293細胞中過度表現。正如預期，利妥昔單抗生物類似物顯示與過度表現之CD20之中等/強烈強度的相互作用，從而驗證培育條件及偵測系統。

測試抗體38002顯示與其主要目標CD274 (PD-L1)及PDCD1LG2 (PD-L2) (強烈強度)之特異性相互作用。測試抗體38002展示與CST1 (非常弱及弱強度)、CST4 (弱/中等強度)及FBLN1 (弱/中等強度)之額外相互作用。

當針對由測試抗體38002產生之庫命中篩選時，測試抗體38003顯示與其主要目標CD274 (PD-L1) (強烈強度)及PDCD1LG2 (PD-L2) (強烈強度)的特異性相互作用。測試抗體38003亦顯示與CST4 (強烈及中等/強烈強度)及FBLN1 (中等/強烈強度)的額外相互作用。

當針對由測試抗體38002產生之庫命中篩選時，測試抗體38004顯示與其主要目標CD274 (PD-L1) (強烈強度)及PDCD1LG2 (PD-L2) (強烈強度)的特異性相互作用。

確認/特異性篩選(活細胞)。在無細胞固定之情況下對活細胞進行的確認/特異性篩選中，測試抗體38002顯示與其主要目標CD274 (PD-L1)及PDCD1LG2 (PD-L2)的特異性相互作用以及與INSR (長及短同功異型物)、CST1、CST4以及INSR_IGF1R的額外相互作用。38002與FBLN1之間的相互作用在固定細胞微陣列中為弱/中等強度，在活細胞微陣列中為極弱強度(不顯著)。

測試抗體38003顯示與其主要目標CD274 (PD-L1)及PDCD1LG2 (PD-L2)的特異性相互作用以及與INSR (短同功異型物)、CST1及CST4的額外相互作用。

測試抗體38004顯示與其主要目標CD274 (PD-L1)及PDCD1LG2 (PD-L2)的特異性相互作用以及與CST1及CST4的額外相互作用。

流式細胞測量術追蹤結果 ( 活細胞 ) 。為進一步研究測試抗體38002之一些經鑑別特異性相互作用，CD274 (PD-L1)、PDCD1LG2 (PD-L2)、長INSR同功異型物，短INSR同功異型物或CD20在HEK293細胞中過度表現。包括僅ZsGreen1g轉染細胞之活細胞轉染物與38002之劑量範圍(0-300 μg/mL)、1 μg/mL利妥昔單抗生物類似物(分析對照)或分析緩衝液一起培育。隨後藉由流式細胞測量術研究相互作用。

測試抗體38002顯示與其主要目標CD274 (PD-L1)及PDCD1LG2 (PD-L2)之結合，EC ₅₀值分別為0.03及0.1 μg/mL。亦觀測到在長INSR同功異型物及短同功異型物之結合，EC ₅₀值分別為144.9及87.5 μg/mL。因此，長同功異型物之EC ₅₀值分別比主要目標CD274 (PD-L1)及PDCD1LG2 (PD-L2)大4830倍及1449倍。短同功異型物之EC ₅₀值分別比主要目標CD274 (PD-L1)及PDCD1LG2 (PD-L2)大2930倍及875倍。

結論。測試抗體38002在固定及活細胞微陣列上顯示與其主要目標CD274 (PD-L1)及PDCD1LG2 (PD-L2)之特異性相互作用。在固定細胞微陣列上觀測到與CST1、CST4及FBLN1之額外相互作用，且在活細胞微陣列中觀測到與CST1、CST4、長INSR同功異型物、短INSR同功異型物及INSR + IGF1R異二聚體之額外相互作用。當在流式細胞測量術劑量反應研究中進一步研究與主要目標及長及短INSR同功異型物之相互作用時，發現與主要目標CD274 (PD-L1)及PDCD1LG2 (PD-L2)之相互作用的EC ₅₀值分別為0.03及0.1 μg/mL，而發現與長及短INSR同功異型物之相互作用的EC ₅₀值分別為144.9及87.5 μg/mL。因此，長同功異型物之EC ₅₀值分別比主要目標CD274 (PD-L1)及PDCD1LG2 (PD-L2)大4830倍及1449倍。短同功異型物之EC ₅₀值分別比主要目標CD274 (PD-L1)及PDCD1LG2 (PD-L2)大2930倍及875倍。此等資料表明38002與INSR的二次相互作用在生物學上不相關。 實例 5

具有效應功能之 BiPDL 抗體介導針對表現 PD-L1 及 PD-L2 之腫瘤細胞的有效 ADCC 。本發明人藉由使用主要鼠類NK細胞及鈣黃綠素AM標記之U9240 PMBL目標細胞評估BiPDL抗體的效應功能。比溶胞率百分比顯示小鼠IgG2a 21680及21661能夠有效介導針對U2940之ADCC (圖14A)。為了檢查ADCC及ADCP之BiPDL抗體效應功能，本發明人採用ADCC (Jurkat/FcyRIIa)及ADCP (Jurkat/FcyRIIIa)之Promega報導子生物分析。資料顯示，與阿維魯單抗(Avelumab)或與對照同型相比時，27869、27907及37464能夠誘發更強的ADCC及ADCP信號傳導。

BiPDL 藉由增加 T 細胞活化及減少骨髓抑制來抑制腫瘤生長且增加「冷」腫瘤小鼠模型 B16-PD-L2 黑色素瘤之存活率。為了評估BiPDL抗體在「冷」腫瘤之情況下的功效，本發明人採用過度表現鼠類PD-L2之B16F10黑色素瘤細胞。小鼠用對照抗小鼠PD-1殖株RMP1-14、小鼠IgG2a抗PD-L1及抗PD-L2抗體或BiPDL抗體27869及37464之組合處理。依先前觀測，B16腫瘤生長不受抗PD1處理的影響。然而，用BiPDL抗體處理能夠減少腫瘤生長(圖15A)及增加小鼠存活率(圖15B)，表明BiPDL抗體在腫瘤微環境中具有免疫調節功能。注意到27869之功效略高。

為了確定此治療反應背後之機制，本發明人分析腫瘤及淋巴結中之免疫細胞群體及其活化狀態。經BiPDL抗體處理之小鼠的淋巴結顯示比用抗PD1、抗PD-L1或抗PD-L2抗體處理之小鼠更高的經CD4 (圖15C)及CD8 (圖15D) T細胞發出的Ki67螢光。經BiPDL處理之小鼠在其淋巴結中亦呈現比其他處理條件顯著更高比例之CD8 ⁺樹突狀細胞(圖15E)。在腫瘤中，與用抗PD1處理之小鼠相比，在用37464處理之小鼠中，較低百分比之巨噬細胞(圖15F)、顆粒球性骨髓來源之抑制細胞(MDSC，圖15G)及單核球MDSC (圖15H)表現精胺酸酶(一種免疫抑制標記物)。

27869及37464在活體外表現類似，且27869在B16模型中顯示最小的治療優勢。然而，在植入大腸癌細胞株CT26之小鼠(視為熱腫瘤小鼠模型)中，用37464處理使得腫瘤生長比27869顯著更強地減少(圖16A)。為進一步研究此等差異，本發明人假設27869及37464可能對PD-L1-B7.1相互作用具有不同影響，從而導致對T細胞之協同刺激功能。因此，本發明人藉由使用經PE標記之人類重組B7.1對藉由流式細胞測量術分析之活CHO/PD-L1細胞設計組合生物分析。此等資料顯示當用37464預處理CHO/PD-L1細胞時，經PE標記之人類重組B7.1結合被阻斷，但當用27869或對照抗體一起預培育時不被阻斷。此重要的極重要的功能及結構結果使得BIPDL成為具有三重阻斷(PD-L1、PD-L2及B7.1阻斷)之極其罕見的抗體，其具有增強的效應功能ADCC及ADCP。綜合所有此等結果表明37464譜系比27869譜系更佳。

BiPDL 抗體脫靶分析及另一可變區工程改造 / 選擇輪次消除脫靶結合且保留三重阻斷及效應功能。脫靶結合可顯著影響治療抗體之藥物動力學(PK)、組織分佈、功效及毒性。本發明人在此處已進行第一篩選且未展現任何顯著的BiPDL抗體之脫靶結合，另一人類質膜蛋白細胞陣列展現37464顯示與胰島素受體INSR結合(圖17A)。為了消除與INSR之脫靶結合且保留對PD-L1及PD-L2之治療親和力，在中，在37464之輕鏈中進行可變區CDRL1及CDRL3之2個靶向點突變。本發明人獲得命名為38002的經工程改造之新抗體，其保留對PD-L1及PD-L2之親和力，量測結果為PD-L1之K _d=7.62×10 ^-9，且PD-L2之K _d=1.9×10 ^-9(單體人類配體，圖18A)，同時消除與INSR之脫靶結合。

為確認38002與INSR結合之消除，將BiPDL抗體以不同濃度與表現INSR之細胞一起培育。37464在低至1 nM之濃度顯示與INSR之結合，而38002與INSR之結合在33 nM時未顯示顯著結合且在100 nM時保持最小(圖17C)，對於蛋白質之短及長同功異型物兩者均為如此(圖18B)。此外，流式細胞測量術染色確認38002在Promega生物分析中保留與PD-L1及PD-L2之高結合活性且保留其PD-1阻斷活性，其中其配體與抗PD-1可瑞達保持等效(圖17D-E)。此外，38002僅在細胞表現PD配體但不表現INSR或對照(圖＞174F)時保留其效應功能ADCC及ADCP (圖17F-G)。

新穎抗體在 B16-PD-L2 黑色素瘤中增加細胞毒性且減少抑制細胞浸潤。為確認新穎抗體38002保持先前觀測到之活體內功效，向小鼠植入B16黑色素瘤且用小鼠IgG2a抗PD-1、抗PD-L1及/或抗PD-L2或38002處理。雖然在此模型中PD-1阻斷並不提高存活率，但38002比觀察到具有50%存活率之任何其他治療更有效地提高存活率。當藉由流式細胞測量術離體分析腫瘤時，注意到腫瘤免疫浸潤中NK細胞之比例的非顯著增加(圖19B)。有趣地，在用38002處理後，CD8 T細胞之百分比(圖19C)以及其藉由顆粒酶B (圖19D)及穿孔蛋白(圖19E)表現說明之細胞毒性功能顯著增加。與此細胞毒性反應結合，本發明人亦觀測到免疫抑制細胞之比例降低，包括顆粒球(圖19F)及單核球(圖19G) MDSC以及巨噬細胞(圖19H)。

新穎抗體抑制與骨髓細胞減少相關之人類 MDA-MB-231 乳癌中之腫瘤生長。為了評估IMGS001在活體內無T細胞微環境中對MDA-MB-231生長之影響，裸鼠在左邊第四乳腺原位接受1×10 ⁶個MDA-MB-231細胞的攻擊。在攻擊後三天開始，小鼠每三天用IMGS-001、阿維魯單抗或PBS作為對照腹膜內處理，持續總共7次投與。每週量測腫瘤兩次。接受IMGS-001或阿維魯單抗之小鼠與經PBS處理之對照組相比具有較慢腫瘤生長(圖21A)。在第14、17及19天，用IMGS-001處理之小鼠與對照組相比具有顯著較低的腫瘤體積，而用阿維魯單抗處理之小鼠與僅第17天之對照相比具有顯著較低的腫瘤體積。在第19天，處死小鼠且收集腫瘤用於顯微鏡檢查。免疫組織化學分析顯示，在未經處理之腫瘤中，大量CD11b陽性細胞均勻分佈浸潤，而在IMGS-001處理之小鼠的腫瘤中，浸潤明顯且持續減少至約三分之一。 * * * * * * * * * * * * *

吾人不難理解，依本文圖式中大體描述及繪示，本發明之各種實施例的組件可以多種不同組態配置及設計。因此，依附圖中所示，本發明之實施例的詳細描述並不意欲限制所主張之本發明的範疇，而僅表示本發明之所選實施例。

貫穿本說明書所描述之本發明的特徵、結構或特性可在一或多個實施例中以任何合適的方式組合。例如，貫穿本說明書對「某些實施例」、「一些實施例」或類似語言的引用意謂結合該實施例描述之特定特徵、結構或特性包括於本發明之至少一個實施例中。因此，貫穿本說明書之片語「在某些實施例中」、「在一些實施例中」、「在其他實施例」或類似語言的出現未必皆指同一組實施例，且所描述之特徵、結構或特性可在一或多個實施例中以任何合適的方式組合。

應注意，貫穿本說明書對特徵、優點或類似語言的參考並不暗示可由本發明實現的所有特徵及優點應處於或處於本發明的任何單個實施例中。確切而言，參考特徵及優點之語言被理解為意謂結合實施例所描述之特定特徵、優點或特性包括於本發明之至少一個實施例中。因此，貫穿本說明書對特徵及優點之論述以及類似語言可能但未必參考同一實施例。

此外，本發明之所描述特徵、優點及特性可在一或多個實施例中以任何合適的方式組合。熟習相關技術者將認識到，可在無特定實施例之特定特徵或優點中之一或多者的情況下來實踐本發明。在其他情況下，可在可能未存在於本發明之所有實施例中的某些實施例中認識到額外特徵及優點。

一般熟習此項技術者將容易地理解，依上文所論述之本發明可用不同次序之步驟及/或組態不同於所揭示之彼等組態的硬體元件加以實踐。因此，儘管本發明已基於此等較佳實施例進行描述，但熟習此項技術者將顯而易見，某些修改、變化及替代構造將為顯而易見的，同時保持在本發明之精神及範疇內。因此，為判定本發明之邊界及界限，應參考隨附申請專利範圍。 VIII. 參考文獻

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U.S. Patent 3,817,837 U.S. Patent 3,850,752 U.S. Patent 3,939,350 U.S. Patent 3,996,345 U.S. Patent 4,196,265 U.S. Patent 4,275,149 U.S. Patent 4,277,437 U.S. Patent 4,366,241 U.S. Patent 4,472,509 U.S. Patent 4,554,101 U.S. Patent 4,680,338 U.S. Patent 4,816,567 U.S. Patent 4,867,973 U.S. Patent 4,938,948 U.S. Patent 5,021,236 U.S. Patent 5,141,648 U.S. Patent 5,196,066 U.S. Patent 5,563,250 U.S. Patent 5,565,332 U.S. Patent 5,856,456 U.S. Patent 5,880,270 Vander Veen et al., Anim Health Res Rev,13:1-9, 2012. Van Deventer and Wittrup, Methods Mol. Biol.,1131: 151-181, 2014. Van Roosbroeck et al., Genes Chromosomes Cancer,55: 428-441, 2016. Voss et al., Nature,468:709-712, 2010. Wang et al., World J. Gastroenterol.,17: 3322-3329, 2011. Warter et al., J. Immunol.,186:3258-3264, 2011. Wawrzynczak & Thorpe, In: Immunoconjugates, Antibody Conjugates In Radioimaging And Therapy Of Cancer,Vogel (Ed.), NY, Oxford University Press, 28, 1987. Xiao et al., J. Exp. Med.,211: 943-959, 2014. Xu et al., PEDS26.10: 663-70, 2013. Yearley etal., Clin. Cancer. Res.,23: 3158-3167, 2017. Yu et al., Nature455:532-536, 2008.

以下圖式形成本說明書之一部分且包括在此以進一步證實本發明之某些態樣。參照該等圖式中之一或多個，結合本文中呈現之特定實施例之詳細描述，可更好地理解本發明。

圖 1繪示藉由Octet量測之38000系列的親和力。針對物種指示(species indication)之PD-L1及PD-L2，藉由Octet量測對低/無胰島素受體結合的38000系列成員中之各者的親和力。亦藉由Biacore量測人類單價PD-L1及PD-L2親和力。

圖 2A-B繪示用38000系列PD-L1/PD-L2雙重特異性抗體處理CT26親本及CT26-PD-L2腫瘤。圖2A繪示將親本CT26腫瘤植入BALB/C小鼠且在第3、6及9天用10 mg/kg指定抗體處理。圖2B繪示將CT26-PDL2腫瘤植入BALB/C小鼠且在第3、6及9天用10 mg/kg指定抗體處理。用測徑規量測腫瘤尺寸，以1000 mm ³作為終點。

圖 3繪示用38000系列PD-L1/PD-L2雙重特異性抗體處理CT26親本-第二實驗。將親本CT26腫瘤植入BALB/C小鼠且在第3、6及9天用10 mg/kg指定抗體處理。用測徑規量測腫瘤尺寸，以1000 mm ³作為終點。

圖 4繪示處理人源化小鼠中之BFTC-909腎細胞癌。將BFTC-909異種移植腫瘤植入huNOG-ExL CD34+幹細胞人源化小鼠中，且一旦腫瘤達到50 mm ³，以10 mg/kg每兩週使用所示抗體進行處理。

圖 5繪示38002 PD-L1/PD-L2抗體增強人類周邊血液混合淋巴球反應中之IFN-γ分泌。將來自一個供體(供體1)之活體外產生的樹突狀細胞與來自兩個其他供體(供體2或3)的T細胞共培養，且在共培養72小時後藉由ELISA量測IFN-γ分泌。

圖 6繪示38002及38004在生理濃度下不與人類胰島素受體結合。將表現高濃度胰島素受體之CHO細胞用指定PD-L1/PD-L2抗體及二級抗人類PE結合物染色。藉由流式細胞測量術在BD LSRII上量測結合量。

圖 7繪示ADI-38002完整重鏈可變區序列。(SEQ ID NO: 20及21)。

圖 8繪示ADI-38002完整輕鏈可變區序列。(SEQ ID NO: 22及23)。

圖 9繪示ADI-38002人類IgG1 (GASDIE)恆定區序列。(SEQ ID NO :24及25)。

圖 10繪示顯示研究中所用之CHO-INSR細胞上經PE標記之同型、抗人類INSR、抗人類PD-L1及抗人類PD-L2之染色的直方圖。閘設定於同型對照樣品上。PE表現顯示於x軸上。

圖 11繪示用38002 (圓形)、37464 (方形)或對照(空心圓)抗體之連續稀釋液培育之INSR+ CHO細胞的結果。藉由流式細胞測量術量測螢光。顯示對於各抗體之各濃度的平均值± SDM (n=2)。針對INSR+ CHO細胞測試33.333 - 0.00511 nM之劑量範圍。

圖 12A繪示抗體依賴性細胞毒性報導子生物分析(ADCC，Promega，2020)之圖示。 圖 12B繪示38002及37464針對CHO-INSR細胞之ADCC (抗體依賴性細胞毒性報導子生物分析(Promega，2020))活性。38002、37464或IgG同型之濃度顯示於x軸上，且發光活性顯示於y軸上。顯示各抗體之各濃度的平均值±SDM (n=2)。針對INSR+ CHO細胞測試22.22-0.0302 nM之劑量範圍。

圖 13A繪示抗體依賴性細胞吞噬報導子生物分析(ADCP，Promega，2016)之圖示。 圖 13B繪示38002及37464針對CHO-INSR細胞的ADCP活性。38002、37464或IgG同型之濃度顯示於x軸上，且發光活性顯示於y軸上。顯示針對各抗體之各濃度的平均值± SD (n=2)。針對INSR+ CHO細胞測試22.22 - 0.0302 nM之劑量範圍。

圖 14A-E顯示選定之雙重特異性抗體能夠接合Fcy受體且誘導NK細胞抗體依賴性細胞毒性。(圖14A)將用鈣黃綠素標記之U2940目標細胞與指定小鼠IgG2a雙重特異性抗體一起培育且與自小鼠脾臟分離之NK細胞共培養。使用樣品及對照之鈣黃綠素釋放來量測細胞裂解百分比。顯示針對各抗體之各濃度的平均值± SEM (n=2)。(圖14B-C)將中國倉鼠卵巢(CHO) PD-L1 ⁺CHO細胞及PD-L2 ⁺CHO細胞(兩種細胞株之1:1混合物)與雙重特異性抗體以顯示於x軸上之濃度一起培育且與NFAT-RE螢光素酶報導子Jurkat T細胞(FcgRIIIa，用於ADCC，或FcgRIIa-H，用於ADCP)共培養。較高信號指示有效ADCC (圖14B)或ADCP (圖14C)活化路徑。顯示針對各抗體之各濃度的平均值± SEM (n=3)。(圖14D-E)將異位表現PD-L2之鼠類黑色素瘤癌細胞B16F10與雙重特異性抗體以顯示於x軸上之濃度一起培育且與NFAT-RE螢光素酶報導子Jurkat T細胞(FcgRIIIa，用於ADCC，或FcgRIIa-H，用於ADCP)共培養。較高信號指示有效ADCC (圖14D)或ADCP (圖14E)活化路徑。顯示針對各抗體之各濃度的平均值± SEM (n=3)。在GraphPad Prism中使用非線性回歸生成最佳擬合曲線。

圖 15A-H顯示選定之雙重特異性抗體藉由增加T細胞活化及減少骨髓抑制來延遲腫瘤生長且增加B16黑色素瘤之存活率。在第3、6、9及12天注射小鼠IgG1抗PD-1 (殖株RMP1-14)及小鼠IgG2a雙重特異性抗體來處理。(圖15A-B)向C57Bl/6小鼠皮下注射50,000個過度表現PD-L2之B16細胞。監測小鼠以確定腫瘤生長(圖15A)及存活率(圖15B)。顯示平均值± SEM (n=20)。(圖15C-H)向C57Bl/6小鼠皮下注射100,000個過度表現PD-L2之B16細胞且依(圖15A)所指示進行處理。在D14收集淋巴結(圖15C-E)及腫瘤(圖15F-H)且藉由流式細胞測量術進行分析。顯示個別值及平均值。

圖 16A-B顯示抗體37464呈現優於27869及27907之治療優勢。(圖16A) Balb/c小鼠皮下注射100,000個CT26細胞且在第3、6、9及12天用小鼠IgG1抗PD-1 (殖株RMP1-14)或小鼠IgG2a雙重特異性抗體處理。監測小鼠以確定腫瘤生長。顯示平均值±SEM (n=10)。(圖16B)將BiPDL與同型對照抗體之連續稀釋液與CHO/PDL-1細胞以及人類重組B7.1一起預培育，接著用經PE標記之抗人類B7.1抗體二次染色。標記之經PE標記之抗人類B7.1抗體的結合指示細胞表面上可自由獲得之PD-L1用於B7.1結合。非線性回歸用於在GraphPad Prism中生成最佳擬合曲線。

圖 17A-I顯示選擇無靶向結合之最佳化雙重特異性抗體。(圖17A-B)將編碼來自庫篩選之所有命中的載體及編碼EGFR (轉染及陰性對照)及CD20 (陽性對照)之對照載體一式兩份地重新排列/重新表現。在用(圖17A) 5 µg/mL之37464或(圖17B) 20 µg/mL之38002固定細胞後探測細胞。用1 µg/mL利妥昔單抗(Rituximab)生物類似物(陽性對照)或無測試分子(僅二級AF647抗hIgG Fc)探測平行載玻片。測試抗體之特定相互作用以藍色(弱強度)及綠色(弱/中等強度及以上)顯示；非特異性相互作用，但其中測試與對照處理之間存在較大強度差異的相互作用以紫色顯示；更強的非特異性相互作用以黑色顯示；陽性對照相互作用以橙色顯示。INSR (長及短同功異型物)及INSR+IGF1R細胞點以紅色突出顯示。(圖17C)將INSR ⁺CHO細胞與38002 (紅色)、37464 (藍色)或對照(黑色)抗體之連續稀釋液一起培育。藉由流式細胞測量術量測螢光。顯示各抗體之各濃度的平均值±SDM (n=2)。針對INSR ⁺CHO細胞測試33.333-0.00511 nM之劑量範圍。(圖17D-E)表現PD-L1 (D)或PD-L2 (圖17E)之中國倉鼠卵巢(CHO)細胞與雙重特異性抗體以顯示於x軸上之濃度一起培育且與NFAT螢光素酶報導子Jurkat T細胞共培養。較高信號指示更有效地阻斷PD-1路徑。(圖17F-G)中國倉鼠卵巢(CHO) PD-L1+ CHO細胞及PD-L2+ CHO細胞(兩種細胞株之1:1混合物)與雙重特異性抗體以顯示於x軸上之濃度一起培育且與NFAT-RE螢光素酶報導子Jurkat T細胞(ADCC之FcgRIIIa或ADCP之FcgRIIa-H)共培養。較高信號指示有效ADCC (圖17F)或ADCP (圖17G)活化路徑。顯示各抗體之各濃度的平均值±SEM (n=3)。(圖17H-I)異位表現PD-L2之鼠類黑色素瘤癌細胞B16F10與雙重特異性抗體以顯示於x軸上之濃度一起培育且與NFAT-RE螢光素酶報導子Jurkat T細胞(ADCC之FcgRIIIa或ADCP之FcgRIIa-H)共培養。較高信號指示有效ADCC (圖17H)或ADCP (圖17I)活化路徑。非線性回歸用於在GraphPad Prism中生成最佳擬合曲線。

圖 18A-B顯示具有類似親和力但不與INSR結合之雙重特異性抗體38002的特徵。(圖18A)圖表顯示雙重特異性抗體38002對單體PD-L1及PD-L2之親和力。在Octet®平台上量測KD且以Molar表示。(圖18B) 38002與在活HEK293細胞上表現之CD274 (PD-L1)、PDCD1LG2 (PD-L2)、INSR長同功異型物及INSR短同功異型物結合的滴定曲線。

圖 19A-H顯示雙重特異性抗體38002藉由增加T細胞活化及減少骨髓抑制來增加B16黑色素瘤之存活率。(圖19A)向C57BL/6小鼠植入表現PD-L2之B16F10細胞。小鼠在第3、6、9及12天接受抗小鼠PD-1 (殖株RMP1-14)、小鼠IgG2a抗PD-L1抗體、小鼠IgG2a抗PD-L2抗體、小鼠IgG2a抗PD-L1及抗PD-L2抗體或人類IgG1-GASDIE 38002雙重特異性抗體之1:1混合物的腹膜內處理。平均值±SEM腫瘤體積(mm ³)相對於腫瘤接種後之天數繪製。(圖19B-H)向C57Bl/6小鼠皮下注射100,000個過度表現PD-L2之B16細胞。在第3、6、9及12天注射小鼠IgG1抗PD-1 (殖株RMP1-14)及小鼠IgG2a 38002處理，且收集腫瘤且在D14藉由流式細胞測量術進行分析。顯示個別值及平均值。

圖 20A-D顯示向C57BL/6小鼠注射500,000個B16-PD-L2細胞。人類IgG1-GASDIE 38002雙重特異性抗體在第3、6、9及12天以20 mg/kg經由IP給與。在第18天將小鼠安樂死且收集淋巴結，用經PE標記之抗CD11b、Gr-1、精胺酸酶-1及FOXP3抗體或同位素對照染色，且藉由流式細胞測量術進行分析。

圖 21A-B顯示用雙重IMGS-001處理攜帶MDA-MB-231腫瘤之nu/nu小鼠抑制腫瘤生長且減少CD11b+細胞之浸潤。(圖21A)平均值±SEM腫瘤體積(mm ³)繪製於y軸上，腫瘤攻擊後之天數繪製於x軸上。未配對t檢驗用於比較組。*p ＜ 0.05；**p ＜ 0.01；***p ＜ 0.001。(圖21B)在未經處理及雙重IMGS-001處理之腫瘤中抗CD11b之免疫組織化學(放大率×200)。直方圖顯示在整個載玻片腫瘤組織中偵測到之CD11b+細胞之平均百分比±SD。未配對t檢驗用於比較組。p = 0.0001。

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Claims (67)

1. 一種抗體或其抗原結合片段，其包含SEQ ID NO:7中所示之重鏈CDR1胺基酸序列、SEQ ID NO:8中所示之重鏈CDR2胺基酸序列及SEQ ID NO:9中所示之重鏈CDR3胺基酸序列以及SEQ ID NO:10中所示之輕鏈CDR1胺基酸序列、SEQ ID NO:11中所示之輕鏈CDR2序列及SEQ ID NO: 12中所示之輕鏈CDR3胺基酸序列。
2. 如請求項1之抗體或抗體片段，其中該抗體或抗體片段由依SEQ ID NO:5中所示之輕鏈可變序列及依SEQ ID NO:3中所示之重鏈可變序列編碼。
3. 如請求項1之抗體或抗體片段，其中該抗體或抗體片段係由與SEQ ID NO:5具有至少90%一致性之輕鏈可變序列及與SEQ ID NO:3具有至少90%一致性之重鏈可變序列編碼。
4. 如請求項1之抗體或抗體片段，其中該抗體或抗體片段係由與SEQ ID NO:5具有至少95%一致性之輕鏈可變序列及與SEQ ID NO:3具有至少95%一致性之重鏈可變序列編碼。
5. 如請求項1之抗體或抗體片段，其中該抗體或抗體片段包含SEQ ID NO:6之輕鏈可變序列及SEQ ID NO:4之重鏈可變序列。
6. 如請求項1之抗體或抗體片段，其中該抗體或抗體片段包含與SEQ ID NO:6具有至少90%一致性之輕鏈可變序列及與SEQ ID NO:4具有至少90%一致性之重鏈可變序列。
7. 如請求項1之抗體或抗體片段，其中該抗體或抗體片段包含與SEQ ID NO:6具有至少95%一致性之輕鏈可變序列及與SEQ ID NO:4具有至少95%一致性之重鏈可變序列。
8. 如請求項1至7中任一項之抗體或抗體片段，其中該抗體片段為重組scFv (單鏈可變片段)抗體、Fab片段、F(ab')2片段或Fv片段。
9. 如請求項1至7中任一項之抗體或抗體片段，其中該抗體為嵌合抗體。
10. 如請求項1至9中任一項之抗體或抗體片段，其中該抗體為IgG。
11. 如請求項1至10中任一項之抗體或抗體片段，其中該抗體或抗體片段進一步包含細胞穿透肽及/或為胞內抗體。
12. 如請求項1至11中任一項之抗體或片段，其中該抗體或抗體片段為人類抗體或人源化抗體。
13. 如請求項1至12中任一項之抗體或片段，其中該抗體或抗體片段與包含ADI-37464之CDR區之抗體相比，表現出與人類胰島素樣生長因子1受體(IGF1R)之結合減少。
14. 如請求項1至13中任一項之抗體，其中該抗體或其抗原結合片段結合於PD-L1。
15. 如請求項1至13中任一項之抗體，其中該抗體或其抗原結合片段結合於PD-L2。
16. 如請求項1至13中任一項之抗體，其中該抗體或其抗原結合片段具有1×10 ^-8或更小之對於PD-L1的K _D。
17. 如請求項1至13中任一項之抗體，其中該抗體或其抗原結合片段具有1×10 ^-8K _D或更小之對於PD-L2的K _D。
18. 一種治療患有癌症之個體的方法，其包含向該個體遞送具有重鏈CDR序列SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8及SEQ ID NO:9以及輕鏈CDR序列SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11及SEQ ID NO:12之抗體或抗體片段。
19. 如請求項18之方法，該抗體或抗體片段係由SEQ ID NO:5之輕鏈可變序列及SEQ ID NO:3之重鏈可變序列編碼。
20. 如請求項18或19之方法，其中該抗體或抗體片段係由與SEQ ID NO:5具有至少或90%一致性之輕鏈可變序列及與SEQ ID NO:3具有至少90%一致性之重鏈可變序列編碼。
21. 如請求項18或19之方法，該抗體或抗體片段係由與SEQ ID NO:5具有至少95%一致性之輕鏈可變序列及與SEQ ID NO:3具有至少95%一致性之重鏈可變序列編碼。
22. 如請求項18之方法，其中該抗體或抗體片段包含輕鏈可變序列SEQ ID NO:6及重鏈可變序列SEQ ID NO:4。
23. 如請求項18之方法，其中該抗體或抗體片段包含與SEQ ID NO:6具有至少90%一致性之輕鏈可變序列及與SEQ ID NO:4具有至少90%一致性之重鏈可變序列。
24. 如請求項18之方法，其由與SEQ ID NO:6具有至少95%一致性之輕鏈可變序列及與SEQ ID NO:4具有至少95%一致性之重鏈可變序列編碼。
25. 如請求項18至24中任一項之方法，其中該抗體片段為重組scFv (單鏈可變片段)抗體、Fab片段、F(ab')2片段或Fv片段。
26. 如請求項18至25中任一項之方法，其中該抗體為IgG或嵌合抗體。
27. 如請求項18至26中任一項之方法，其中該抗體或抗體片段與包含ADI-37464之CDR區之抗體相比，表現出與人類胰島素樣生長因子1受體(IGF1R)之結合減少。
28. 如請求項18至27中任一項之方法，其中遞送包含抗體或抗體片段投與，或藉由編碼該抗體或抗體片段之RNA或DNA序列或載體進行基因遞送。
29. 一種表現抗體或抗體片段之融合瘤或經工程改造之細胞，其中該抗體或抗體片段具有重鏈CDR序列SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8及SEQ ID NO:9以及輕鏈CDR序列SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11及SEQ ID NO:12。
30. 如請求項29之融合瘤或經工程改造之細胞，其中該抗體或抗體片段包含SEQ ID NO:5之輕鏈可變序列及SEQ ID NO:3之重鏈可變序列。
31. 如請求項29之融合瘤或經工程改造之細胞，其中該抗體或抗體片段包含與SEQ ID NO:5具有至少90%一致性之輕鏈可變序列及與SEQ ID NO:3具有至少90%一致性之重鏈可變序列。
32. 如請求項29之融合瘤或經工程改造之細胞，其中該抗體或抗體片段包含與SEQ ID NO:5具有至少95%一致性之輕鏈可變序列及與SEQ ID NO:3具有至少95%一致性之重鏈可變序列。
33. 如請求項29之融合瘤或經工程改造之細胞，其中該抗體或抗體片段包含SEQ ID NO:6之輕鏈可變序列及SEQ ID NO:4之重鏈可變序列。
34. 如請求項29之融合瘤或經工程改造之細胞，其中該抗體或抗體片段包含與SEQ ID NO:6具有至少90%一致性之輕鏈可變序列及與SEQ ID NO:4具有至少90%一致性之重鏈可變序列。
35. 如請求項29之融合瘤或經工程改造之細胞，其中該抗體或抗體片段包含與SEQ ID NO:6具有至少95%一致性之輕鏈可變序列及與SEQ ID NO:4具有至少95%一致性之重鏈可變序列。
36. 如請求項29至35中任一項之融合瘤或經工程改造之細胞，其中該抗體片段為重組scFv (單鏈可變片段)抗體、Fab片段、F(ab')2片段或Fv片段。
37. 如請求項29至36中任一項之融合瘤或經工程改造之細胞，其中該抗體為嵌合抗體。
38. 如請求項29至36中任一項之融合瘤或經工程改造之細胞，其中該抗體為IgG。
39. 如請求項29至38中任一項之融合瘤或經工程改造之細胞，其中該抗體或抗體片段進一步包含細胞穿透肽及/或為胞內抗體。
40. 一種疫苗調配物，其包含一或多種由重鏈CDR序列SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8及SEQ ID NO:9以及輕鏈CDR序列SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11及SEQ ID NO:12表徵的抗體或抗體片段。
41. 如請求項40之疫苗調配物，其中至少一種抗體或抗體片段由SEQ ID NO:5之輕鏈可變序列及SEQ ID NO:3之重鏈可變序列編碼。
42. 如請求項40之疫苗調配物，其中至少一種抗體或抗體片段係由與SEQ ID NO:5具有至少90%一致性之輕鏈可變序列及與SEQ ID NO:3具有至少90%一致性之重鏈可變序列編碼。
43. 如請求項42之疫苗調配物，其中至少一種抗體或抗體片段係由與SEQ ID NO:5具有至少95%一致性之輕鏈可變序列及與SEQ ID NO:3具有至少95%一致性之重鏈可變序列編碼。
44. 如請求項40之疫苗調配物，其中至少一種抗體或抗體片段包含SEQ ID NO:6之輕鏈可變序列及SEQ ID NO:4之重鏈可變序列。
45. 如請求項40之疫苗調配物，其中至少一種抗體或抗體片段包含與SEQ ID NO:6具有至少95%一致性之輕鏈可變序列及與SEQ ID NO:4具有至少95%一致性之重鏈可變序列。
46. 如請求項40至45中任一項之疫苗調配物，其中至少一種抗體片段為重組scFv (單鏈可變片段)抗體、單域片段、Fab片段、F(ab')2片段或Fv片段。
47. 如請求項40至45中任一項之疫苗調配物，其中至少一種抗體為嵌合抗體。
48. 如請求項40至47中任一項之疫苗調配物，其中至少一種抗體為IgG。
49. 如請求項40至49中任一項之疫苗調配物，其中至少一種抗體或抗體片段進一步包含細胞穿透肽及/或為胞內抗體。
50. 一種偵測個體之表現PD-Ll或PD-L2之細胞的方法，其包含： (a)使來自該個體之樣品與具有SEQ ID NO:4之重鏈CDR序列及SEQ ID NO:6之輕鏈CDR序列的抗體或抗體片段接觸；及 (b)藉由該抗體或抗體片段與該樣品中之細胞結合來偵測該樣品中之表現PD-Ll或PD-L2之細胞。
51. 如請求項50之方法，其中該樣品為體液。
52. 如請求項50或51之方法，其中該樣品為組織樣品。
53. 如請求項50或51之方法，其中偵測包含ELISA、RIA或西方墨點法(Western blot)。
54. 如請求項50至53中任一項之方法，其中該抗體或抗體片段由依SEQ ID NO:3及SEQ ID NO:5中所示之可變序列編碼。
55. 如請求項50至53中任一項之方法，其中該抗體或抗體片段係由與SEQ ID NO:5具有至少90%一致性之輕鏈可變序列及與SEQ ID NO:3具有至少90%一致性之重鏈可變序列編碼。
56. 如請求項50至53中任一項之方法，其中該抗體或抗體片段係由與SEQ ID NO:5具有至少95%一致性之輕鏈可變序列及與SEQ ID NO:3具有至少95%一致性之重鏈可變序列編碼。
57. 如請求項50至53中任一項之方法，其中該抗體或抗體片段包含SEQ ID NO:6之輕鏈可變序列及SEQ ID NO:4之重鏈可變序列。
58. 如請求項50至53中任一項之方法，其中該抗體或抗體片段包含與SEQ ID NO:6具有至少90%一致性之輕鏈可變序列及與SEQ ID NO:4具有至少90%一致性之重鏈可變序列。
59. 如請求項50至53中任一項之方法，其中該抗體或抗體片段包含與SEQ ID NO:6具有至少95%一致性之輕鏈可變序列及與SEQ ID NO:4具有至少95%一致性之重鏈可變序列。
60. 如請求項50至59中任一項之方法，其中該抗體片段為重組scFv (單鏈可變片段)抗體、Fab片段、F(ab')2片段或Fv片段。
61. 如請求項50至60中任一項之方法，其中該細胞為癌細胞。
62. 如請求項61之方法，其中該癌細胞為淋巴瘤細胞、乳癌細胞或腎細胞癌細胞。
63. 如請求項50至60中任一項之方法，其中該細胞為與免疫抑制相關之細胞。
64. 如請求項63之方法，其中該與免疫抑制相關之細胞為腫瘤微環境中之非癌細胞。
65. 如請求項64之方法，其中該腫瘤微環境中之該非癌細胞為基質細胞或內皮細胞。
66. 一種治療腫瘤微環境中之免疫抑制的方法，其包含向該個體遞送具有重鏈CDR序列SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8及SEQ ID NO:9以及輕鏈CDR序列SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11及SEQ ID NO:12之抗體或抗體片段。
67. 一種增加對腫瘤或癌症之免疫反應的方法，其包含向該個體遞送具有重鏈CDR序列SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8及SEQ ID NO:9以及輕鏈CDR序列SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11及SEQ ID NO:12之抗體或抗體片段。