ES2302692T3 - Coligina/hsp47 localizada en la superficie en celulas de carcinoma. - Google Patents

Abstract

Un método para la elaboración de un medicamento para el tratamiento de un paciente que padece de un carcinoma o de un sarcoma, en donde la Hsp47 se expresa en la superficie de al menos algunas células, comprendiendo el medicamento una cantidad efectiva de un agente que comprende un resto de direccionamiento (targeting) que se une específicamente a un dominio externo de Hsp47, en donde el resto de direccionamiento es un anticuerpo o un fragmento del mismo, un péptido o un bacteriófago en cuya superficie está un péptido que se une específicamente a un dominio externo de Hsp47, y un resto terapéutico.

Description

Coligina/Hsp47 localizada en la superficie en células de carcinoma.

Descripción de la invención

Esta invención se refiere, p. ej., a moléculas de coligina/Hsp47 que se expresan en la superficie de células de carcinoma, y al uso de tales moléculas expresadas como dianas, p. ej., para agentes terapéuticos o agentes para el diagnóstico por imagen. La presente invención se refiere también a péptidos que se unen específicamente a dominios externos de tales moléculas de Hsp47 localizadas en la superficie.

La proteína de choque térmico coligina/CBP2/Hsp47 (a veces denomina en el presente texto como Hsp47) puede actuar como una chaperona molecular (o carabina molecular) para el colágeno. En las células normales, la Hsp47 llega a asociarse estrechamente con cadenas nacientes de procolágeno, tempranamente durante su traducción y acompaña a la proteína desde el retículo endoplásmico (RE) al Golgi, después de lo cual el colágeno se disocia y se segrega, y la chaperona se recicla de nuevo al RE. En el presente texto se describe que, sorprendentemente, en las células de carcinoma la Hsp47 no es reciclada eficientemente al RE sino que, en vez de ello, se localiza en la superficie de las células, es decir, se escapa a ella.

Los ejemplos 1 y 6 indican que la Hsp47 está localizada en la superficie de varias líneas de células de carcinoma, incluyendo líneas de carcinoma de células escamosas orales humanas, una línea de células epidérmicas murinas, líneas de carcinoma de cáncer de mama, y líneas de células de cáncer de próstata, pero no se expresa sobre la superficie de células testigo no carcinomatosas. Así, la Hsp47 localizada en la superficie celular puede servir de marcador y/o como "diana de anidación" ("homing target") para células de carcinoma. El ejemplo 2 muestra que al menos una porción de la Hsp47 localizada en la superficie está disponible para la unión, p. ej., a un propéptido de procolágeno al que se une normalmente en el entorno intracelular. Direccionando células de carcinoma con un agente que interacciona específicamente con porciones disponibles de Hsp47 expresada en la superficie de las células, se pueden suministrar agentes terapéuticos eficazmente, permitiendo reducir las dosis requeridas para conseguir efectos terapéuticos y reducir los efectos secundarios, y se pueden detectar de forma sensible o formar imágenes de células de carcinoma, o carcinomas o tumores que las contienen, sobre un fondo de células no carcinomatosas.

Esta invención se refiere a un agente que comprende un resto de direccionamiento que se une específicamente a un dominio externo de la Hsp47 expresada en la superficie de una célula, en una cantidad efectiva para modular la actividad de la célula, en donde el resto de direccionamiento es un péptido, en donde el péptido contiene una de las secuencias SEQ ID No: 3 a SEQ ID No: 5 de las Tablas 1 y 2, o un bacteriófago en la superficie del cual está un péptido que se une específicamente a un dominio externo de Hsp47, en donde el péptido contiene una de las secuencias SEQ ID No: 26 a SEQ ID No: 62 de la Tabla 3.

La invención se refiere también a un método para la elaboración de un medicamento para el tratamiento de un paciente que padece un carcinoma o un sarcoma en el que la Hsp47 se expresa en la superficie de al menos algunas células, comprendiendo el medicamento una cantidad efectiva de un agente que comprende un resto de direccionamiento que se une específicamente a un dominio externo de Hsp47, en donde el resto de direccionamiento es un anticuerpo o un fragmento del mismo, un péptido o un bacteriófago en la superficie del cual está un péptido que se une específicamente a un dominio externo de Hsp47, y un resto terapéutico.

La invención se refiere también a un método para la elaboración de un medicamento para alterar cualquier respuesta fisiológica de la célula que expresa la Hsp47 en su superficie, comprendiendo el medicamento una cantidad efectiva de un agente que comprende un resto de direccionamiento que se une a un dominio externo de Hsp47, en donde el resto de direccionamiento es un anticuerpo o un fragmento del mismo, un péptido o un bacteriófago en la superficie del cual está un péptido que se une específicamente a un dominio externo de Hsp47, y un resto terapéutico.

También se describe un resto de direccionamiento que comprende un péptido que es específico para un dominio externo de Hsp47, p. ej. un péptido que tiene el motivo consenso XHyHyXXHyXXXXHyHy (SEQ ID No: 1) o el motivo de consenso HyXXXHyHyXXHyXXX (SEQ ID No: 2). En una realización más preferida el péptido tiene la secuencia de una de las SEQ ID No: 3 a 25.

También se describe un método de formación de imágenes para diagnóstico para detectar una célula que expresa Hsp47 en su superficie (es decir, una célula de carcinoma, o un carcinoma o tumor que comprende tal célula), que comprende poner en contacto la célula con un agente que comprende un resto de direccionamiento que se une específicamente a un dominio externo de Hsp47, y una marca detectable (resto detectable) (p. ej. una marca que ses detectable mediante MRI, rayos X, escintilografía gamma, escaneo CT o similar). El resto de direccionamiento puede comprender, p. ej., un anticuerpo, un péptido o un bacteriófago como se describió anteriormente.

La invención se refiere también a un método de cribado in vitro en relación con un agente que se une específicamente a un carcinoma o sarcoma en el que la Hsp47 se expresa en la superficie de al menos algunas células, que comprende identificar un agente que comprende un resto de direccionamiento que se une específicamente a un dominio externo de Hsp47.

También se describen kits para detectar una célula de carcinoma, que comprenden un resto de direccionamiento que se une específicamente a un dominio externo de Hsp47.

La invención se refiere también a un kit para tratar a un paciente que padece de un carcinoma o un sarcoma en el que la Hsp47 se expresa en la superficie de al menos algunas células, o para detectar un carcinoma en el que la Hsp47 se expresa en la superficie de al menos algunas células, que comprende un agente que comprende un resto de direccionamiento que se une específicamente a un dominio externo de Hsp47 en una cantidad efectiva para generar un efecto citostático o citolítico en el carcinoma o el sarcoma, o para formar imágenes de la célula sobre un fondo de células no carcinomatosas ni sarcomatosas, en donde el resto de direccionamiento es un anticuerpo o un fragmento del mismo, un péptido, o un bacteriófago en la superficie del cual está un péptido, cada uno de los cuales restos de direccionamiento se une específicamente a un dominio externo de Hsp47, y un resto terapéutico.

La invención se refiere también a un kit para alterar cualquier respuesta fisiológica de la célula que expresa la Hsp47 en su superficie, que comprende un agente que comprende un resto de direccionamiento que se une a un dominio externo de Hsp47, en una cantidad efectiva para modular una actividad de la célula, en donde el resto de direccionamiento es un anticuerpo o un fragmento del mismo, un péptido o un bacteriófago en la superficie del cual está un péptido que se une específicamente a un dominio externo de Hsp47, y un resto terapéutico.

La invención se refiere también a un método para la preparación de un agente detectable para la detección de un carcinoma o un sarcoma en el que la Hsp47 se expresa en la superficie de al menos algunas células, comprendiendo el agente detectable para contactar el carcinoma o el sarcoma un resto de direccionamiento que se une específicamente a un dominio externo de la Hsp47, en donde el resto de direccionamiento es un péptido, en donde el péptido contiene una de las secuencias SEQ ID No: 3 a SEQ ID No: 25 de las Tablas 1 y 2 o un bacteriófago en la superficie del cual está un péptido que se une específicamente a un dominio externo de Hsp47, en donde el péptido contiene una de las secuencias SEQ ID No: 26 a SEQ ID No: 62 de la Tabla 3.

La invención se refiere también a un método para la preparación de un agente detectable para la detección de una célula que expresa Hsp47 en su superficie, comprendiendo el agente detectable para administración a la célula un resto de direccionamiento que se une específicamente a un dominio externo de la Hsp47, en donde el resto de direccionamiento es un péptido, en donde el péptido contiene una de las secuencias SEQ ID No: 3 a SEQ ID No: 25 de las Tablas 1 y 2 o un bacteriófago en la superficie del cual está un péptido que se une específicamente a un dominio externo de Hsp47, en donde el péptido contiene una de las secuencias SEQ ID No: 26 a SEQ ID No: 62 de la Tabla
3.

La invención se refiere también a un péptido que se une específicamente a un dominio externo de la Hsp47 expresada en la superficie de una célula, que comprende una de las secuencias SEQ ID No: 3 a 13 de la Tabla 1, SEQ ID No: 14 a 25 de la Tabla 2 y SEQ ID No: 26 a 62 de la Tabla 3, en donde los péptidos pueden prolongarse tanto como 20 aminoácidos adicionales en cualquiera de los extremos o en ambos extremos de los péptidos.

También se describe un péptido que contiene el motivo consenso XHyHyXXHyXXXXHyHy (SEQ ID No: 1) o el motivo consenso HyXXXHyHyXXHyXXX (SEQ ID No: 2). En una realización más preferida, el péptido es una de las secuencias SEQ ID No: 3 a 25.

Cualquier tipo de célula que exprese Hsp47 en su superficie puede ser modulada, tratada y/o detectada por los métodos de la presente invención. En una realización preferida, la célula es una célula de carcinoma. El término "carcinoma" como se usa en el presente texto significa cualquiera de los diversos tipos de neoplasias malignas derivadas de tejido epitelial en uno de cualquiera de varios sitios, p. ej., piel, células basales, intestino grueso, pulmón, colon, mama, vejiga, boca, cabeza y cuello, laringe, nasofaringe, corteza suprarrenal, glándula apocrina, cloaca, células embionarias, riñón, hígado, páncreas o próstata. La expresión "célula de carcinoma" o "célula carcinomatosa", como se usa en el presente texto, se aplica a una célula de carcinoma in vivo o in Vitro, tanto si aparece como célula individual o en el contexto de un tejido, carcinoma en cualquier estadiaje de su desarrollo, tumor, metástasis (incluyendo una micrometástasis) y similares.

Las células de sarcoma están también comprendidas por la invención. El término "sarcoma", como se usa en el presente texto, significa cualquier neoplasia del tejido conjuntivo, formada por la proliferación de células mesodérmicas. Entre los varios tipos de sarcoma comprendidos en la presente invención, están el fibrosarcoma, rabdosarcoma, neurofibrosarcoma y osteosarcoma. La expresión "célula de sarcoma" o "célula sarcomatosa", como se usa en el presente texto, se aplica a una célula de sarcoma in vivo o in vitro, tanto si aparece como célula individual o en el contexto de un tejido, un sarcoma en cualquier estado de su desarrollo, un tumor, una metástasis (incluyendo una micrometástasis) y similares. Los métodos para estudiar las células de sarcoma, en particular en relación con la expresión de Hsp47, se describen, por ejemplo, en Morino et al. (1997), In Vivo 11, 261-4; Morino et al. (1997), In Vivo 11, 17-21; Shirakami et al. (1995), In Vivo 9, 513-8; Shirakami et al. (1995), In Vivo 9, 509-12; Morino et al. (1995), In Vivo 9, 503-8; y Morino et al. (1994), In Vivo 8, 285-8.

Los métodos y reactivos como los discutidos en el presente texto en relación con las células de carcinoma son aplicables, desde luego, a cualquier tipo de células que tengan expresión en su superficie de Hsp47, y a cualquier condición fisiológica o patológica asociada con tal expresión.

La Hsp47 ha sido clonada y/o secuenciada a partir de varios organismos, incluyendo, p. ej., pollo (Hiroyashi et al. (1991), Mol. and Cell Biol. 11, 4036-4044), ratón (Takechi et al. (1992), Eur. J. of Biochem. 206, 323-329), y seres humanos (p. ej. Nakamura, nº de entrada D83174 en las bases de datos DDJB/EMBL/GenBank; Ikegawa et al. (1995), Cytogenet. Cell Genet. 71, 182-186), y Jain et al. (1994), Arch. Biochem. and Biophys. 314, 23-30).

La invención se refiere también a una composición farmacéutica que comprende un péptido como se describe en el presente texto y un vehículo aceptable farmacéuticamente.

La invención se refiere también a una composición farmacéutica que comprende un agente como se describe en el presente texto y un vehículo aceptable farmacéuticamente.

La invención se refiere también a una composición farmacéutica que comprende un agente que comprende un resto de direccionamiento que se une específicamente a un dominio externo de Hsp47 localizado en la superficie de un carcinoma o sarcoma, en una cantidad efectiva para generar un efecto citolítico o citostático en el carcinoma o el sarcoma, y un vehículo aceptable farmacéuticamente, en donde el resto de direccionamiento es un anticuerpo o un fragmento del mismo, un péptido, o un bacteriófago en la superficie del cual está un péptido, que se une específicamente a un dominio externo de Hsp47, y un resto terapéutico.

Otras realizaciones preferidas de la presente invención son métodos, kits, péptidos, agentes y composiciones farmacéuticas como se definen por las reivindicaciones anexas.

El término "Hsp47", como se usa en el presente texto, abarca, p. ej., Hsp47 de tipo silvestre procedente de cualquier mamífero, preferentemente humano, o una variante de la misma. Por "variante" de la Hsp47 se entiende, p. ej., cualquier inserción, deleción, forma mutante o sustitución, tanto conservadora como no conservadora, bien sea en un dominio interno o bien externo de la proteína, en donde tales cambios no alteran sustancialmente la unión del dominio externo a un resto de direccionamiento como se define en el presente texto. Por "sustituciones conservadoras" se entienden combinaciones tales como Gly, Ala; Val, Ile, Leu; Asp, Glu; Asn, Gln; Sr, Thr; Lys, Arg; y Phe, Tyr. Las variantes pueden incluir, p. ej., homólogos, análogos, luteínas y miméticos (mimotopos). Se incluyen muchos tipos de modificaciones de las proteínas, incluyendo modificaciones post-traduccionales. Véanse, p. ej., las modificaciones descritas en la patente de EE.UU. nº 5.935.835. Se incluyen las moléculas de Hsp47 que están modificadas de manera que tengan propiedades no asociadas normalmente con la Hsp47 de tipo silvestre, con la condición de que un dominio externo pueda unirse específicamente a un resto de direccionamiento de la presente invención.

Un agente que se une a la Hsp47 expresada (es decir, localizada, situada) en la superficie de una célula puede unirse a uno o más de cualquier porción o fragmento de la molécula de Hsp47, de cualquier longitud, que esté disponible para la unión. Tal secuencia disponible se denomina en el presente texto "dominio externo" de la proteína Hsp47.

Un agente o resto que "se une específicamente" ("es específico para"; se une "preferentemente" a) a un dominio externo de Hsp47, interacciona con él, o forma o experimenta una asociación física con él, en una cuantía y durante un tiempo suficiente para permitir la detección de la célula, o para modularla (p. ej. desencadenar una respuesta terapéutica). Por "específicamente" o "preferentemente" se entiende que el agente tiene una afinidad más alta, p. ej. un mayor grado de selectividad, para un dominio externo de Hsp47 que para otras moléculas situadas en la superficie de una célula. Del mismo modo, un agente o resto que se une específicamente a un tipo concreto de célula, p. ej. una célula de carcinoma, tiene una afinidad más alta, p. ej. un mayor grado de selectividad, para ese tipo de célula que para una célula normal (p. ej. una célula no carcinomatosa), de manera que la unión permite que la célula de carcinoma sea detectada y distinguida entre un fondo de células normales, y/o permite poner en contacto un resto terapéutico con una célula de carcinoma pero no (hasta un grado significativo) con células no carcinomatosas próximas. La afinidad o grado de especificidad puede ser determinada por uno cualquiera entre una diversidad de procedimientos de rutina, p. ej. estudios de unión competitiva. Véanse, p. ej., Czerwinski et al. (1998) Proc. Nat. Acad. Sci. 95, 11, 520-11, 525 y Moe et al. (1998) Phar. Res. 23, 31-38. La porción de un agente que se une específicamente a un dominio externo de Hsp47 puede ser denominada como "resto de direccionamiento" ("targeting moiety"), "macromolécula dirigida al sitio", "ligando" o "ligando de afinidad".

Cualquier agente o resto que se una específicamente a un dominio externo de Hsp47 está comprendido en la presente invención.

Un tipo de resto de direccionamiento comprende un anticuerpo que se une específicamente a un dominio externo de Hsp47. El término "anticuerpo", como se usa en el presente texto, puede significar un anticuerpo policlonal o, preferentemente, uno monoclonal, o un fragmento (de cualquier tamaño) de un anticuerpo policlonal o monoclonal, p. ej. Fv, Fab', Fab, F(ab')_{2}, Fab'Fc o similares. Los anticuerpos de cadena simple están también comprendidos en la invención. Se incluye cualquier forma de inmunoglobulina, p. ej. las inmunoglobulinas A, D, E, G o M. Podría desearse emplear un anticuerpo intacto (p. ej. una molécula de IgG) o bien un anticuerpo bi- o multivalente que tenga especificidad para al menos dos antígenos, o un fragmento de anticuerpo univalente. Los anticuerpos de la presente invención pueden aislarse de fuentes naturales; a partir de hibridomas, linfomas o similares; o pueden ser producidos por medios de síntesis y/o recombinantes. Pueden ser parcial o totalmente humanizados usando procedimientos convencionales conocidos en la técnica, como se describe, p. ej., en Jones et al. (1983), Nature 321, 522; Riechmann et al. (1988), Nature 332, 323; Verhoyen et al. (1988), Science 239, 1534; Carter et al. (1992), proa. Natl. Acad. Sci. USA 89, 4285; Sandhu. (1992), Crit. Rev. Biotech. 12, 437; y Singer et al. (1933), J. Immunol. 150, 2844.

Los métodos para el cribado o selección, el aislamiento, la purificación, la manipulación, etc. de anticuerpos que muestran la especificidad y/o la afinidad requeridas son convencionales y rutinarios en la técnica, y se describen, p. ej., en la patente de EE.UU. nº 4.196.265; Roitt I., (1994), Essential Immunology, Blackwell Scientific Publications, Londres; Coligan et al. Current Protocols in Immunology; Barnes et al. en Methods in Molecular Biology, Vol. 10 páginas 79-104 (Humana Press 1992); Harlow et al. Antibodies: A Laboratory Manual página 726 (Cold Srping Harbor Pub. 1988); y Current Protocols in Immunology; editado por John E. Coligan et al., John Wiley and Sons, Inc.

Otro tipo de resto de direccionamiento comprende un péptido que se une específicamente a un dominio externo de Hsp47. Tal péptido puede ser de un tamaño cualquiera o de cualquier composición de aminoácidos efectiva para unirse específicamente a un dominio externo de Hsp47, de manera que permita la formulación de una entidad detectable o la producción de una respuesta terapéutica. En una realización preferida, el péptido no es colágeno de longitud completa, y no es colágeno de origen natural o un fragmento del mismo. En una realización preferida el péptido es menor de aproximadamente 90 aminoácidos, p. ej. aproximadamente 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20 o 10 aminoácidos, lo más preferentemente aproximadamente 12 a 16 aminoácidos. La invención comprende también polipéptidos más grandes que pueden ser, p. ej., tan largos como un procolágeno de longitud completa, con la condición de que el polipéptido se pueda unir a un dominio externo de Hsp47 para permitir la formación de una entidad detectable o la producción de una respuesta terapéutica.

Los métodos para determinar si un péptido (o cualquier otro agente de interés) se une a una molécula de Hsp47 expresada en la superficie, son convencionales y rutinarios en la técnica. Véanse, p. ej., Takemoto et al. (1992), Arch. Biochem. and Biophys. 296, 323-329; Altemeyer et al. (1996), Internacional J. of Cancer 69, 340-349; Ferrarini et al. (1992), Internacional J. of Cancer 51, 613-619; Ullrich et al. (1986), Proc. Natl. Acad. Sci. 83, 3121-3125; Vanburskirk et al. (1989), J. Exp. Med. 170, 1799-1809; Freedman et al. (1992), J. of Neuroimmunology 41, 231-238; Sauk et al. (1997), Connect. Tissue Res. 37, 105-119) y la patente de EE.UU. nº 5.932.478. Tales métodos incluyen, p. ej., la detección de un agente que está etiquetado, directa o indirectamente, con un marcador fluorescente mediante microscopía de inmunofluorescencia, incluyendo microscopía confocal, o mediante citometría de flujo (FACscan); detección de un agente marcado radiactivamente mediante autorradiografía; microscopía electrónica; inmunotinción; fraccionamiento subcelular; o similares. Los ejemplos 1 y 6 ilustran algunos métodos típicos.

Se han identificado varios péptidos o secuencias de péptidos que interaccionan con Hsp47 intracelular, y/o con la proteína aislada. Estos péptidos incluyen, p. ej., la región de procolágeno definida por el anticuerpo SP1.D8 anti-propéptido (Hu et al. (1995), J. of Cellular Biochemistry 59, 350-367); la región N-propéptido del procolágeno de la cadena \alpha1(I) entre los restos 23 y 151, en particular los restos 23 y 108; las secuencias Gly-Xaa-Yaa de procolágeno, en donde X e Y son independientemente cualquier aminoácido; las secuencias modelo (Pro-Pro-Gly)_{n} de colágeno; y porciones de gelatina (Nagata et al. (1988) Biochem. Biophys. Res. Comm. 153, 428-434). Tales péptidos, o variantes, miméticos (mimotopos), muteínas, análogos o fragmentos de los mismos, pueden ser ensayados fácilmente en cuanto a su capacidad para interaccionar específicamente con un dominio externo de la Hsp47; y aquellos que se unen con avidez y/o selectivamente pueden usarse como restos de direccionamiento en la presente invención.

Por "variantes" se entiende, p. ej., cualquier inserción, deleción, forma mutante o sustitución, tanto conservadora como no conservadora, en donde tales cambios no alteran sustancialmente la unión del péptido a un dominio externo de Hsp47. Los tipos de variantes incluyen los discutidos en el presente texto con referencia a las moléculas de Hsp47. Entre los péptidos modificados que están comprendidos en la presente invención se encuentran peptidomiméticos que pueden ser generados y ensayados por medios rutinarios convencionales. Véanse, p. ej., al-Obeidi et al. (1998), Mol. Biotechnol. 9, 205-23; Kieber-Emmons et al. (1997), Curr. Opin. Biotechnol. 8, 435-41; Bowditch et al. (1996), Blood 88, 4579-4584; y Partidos et al. (1997), Immunology Letters 57, 113-116.

Los métodos para medir tales constantes de unión o determinar la avidez son convencionales en la técnica. Véase, p. ej., Blond-Elguindi et al. (1993) Cell 75, 717-728. En una realización preferida, la constante de unión (avidez) del péptido o región del péptido con Hsp47 es 15-45 \mum; lo más preferentemente, la constante de unión es 20-30 \mum.

Una técnica para identificar péptidos que se pueden unir específicamente y/o ávidamente a la Hsp47 expresada en la superficie (dominios externos), es la exposición en bacteriófago (exposición en fago; phage display) combinada con la adsorción por afinidad (panning o inmunopurificación por afinidad). Véanse, p. ej., Smith et al. (1993),Methods Enzymol. 217, 228-57; Smith et al. (1995), J. Biol. Chem. 270, 18, 323-328; Kitamura et al. (1992), Cell 69, 823-831; Burkhardt et al. (1991), Proc. Natl. Acad. Sci. 88, 7410-7414; Pasqualini et al. (1996), Brazilian J. of Med. and Biol. Res. 29, 1151-1158; Pasqualini et al., (1996) Molecular Psychiatry 1, 423; Ruoslahti (1996), Ann. Rev. of Cell and Development Biology 12, 697-715; Ruoslahti (1997), Kidney Internacional 51, 1413-1417; Hutchcroft et al. (1992), J. Biol. Chem. 267, 8613-8619; y Borst et al. (1993), Immunological reviews 132, 49-84. Entre los tipos de fago que pueden usarse están los fagos filamentosos de hebra simple, p. ej. fd, F2, F5. M13 y variantes de los mismos. De forma resumida, un conjunto de péptidos aleatorios de longitud elegida (p. ej. 7-meros o 12-meros, es decir heptámeros o dodecámeros) son clonados y expuestos en la superficie de bacteriófagos, y se eligen los fagos que se unen preferentemente a células que llevan Hsp47 expresada en superficie, después de uno o más ciclos de selección.

Una demostración de esta inmunopurificación o panning se muestra en el Ejemplo 5. Los péptidos 12-meros expuestos en fago identificados en este ejemplo contienen, en general, o el motivo consenso, XHyHyXXHyXXXXHyHy (SEQ ID No: 1) o bien el motivo consenso HyXXXHyHyXXHyXXX (SEQ ID No: 2), en donde X es independientemente cualquier aminoácido y Hy es independientemente cualquier aminoácido hidrófobo. En una realización preferida, el aminoácido hidrófobo es uno grande, p. ej. W (Trp), L (Leu) o F (Phe). Entre los péptidos que tienen el motivo consenso SEQ ID No: 1 están aquellos que tienen la secuencia de SEQ ID No: 3 a SEQ ID No: 13, como se muestra en la Tabla 1. Estos péptidos pueden caracterizarse como péptidos predominantemente hidrófobos.

TABLA 1 Péptidos predominantemente hidrófobos

1

Entre los péptidos que tienen el motivo consenso SEQ ID No: 2 están aquellos que tienen la secuencia de SEQ ID No: 14 a SEQ ID No: 25, como se muestra en la Tabla2. Estos péptidos pueden caracterizarse como péptidos predominantemente hidrófobos.

TABLA 2 Péptidos predominantemente hidrófilos

2

Los péptidos predominantemente hidrófobos identificados en el Ejemplo 5 no muestran sorprendentemente identidad de secuencias específica respecto a regiones del procolágeno, que se sabe que se une a Hsp47 pero que, teniendo en cuenta el perfil hidrópático de los aminoácidos (véase la discusión en el Ejemplo 5), mapean sin embargo con regiones dentro la región N-propéptido del colágeno (restos 59-71) o la región C-propéptido (restos 1344-1445). Los péptidos predominantemente hidrófilos tampoco muestran una identidad de secuencias específica con regiones de procolágeno, pero generalmente mapean a regiones dentro de la región helicoidal del procolágeno.

Entre los péptidos 7-meros expuestos en fago identificados en el Ejemplo 5, están aquellos que tienen la SEQ ID No: 26 a SEQ ID No: 62, como se muestra en la Tabla 3.

TABLA 3 Péptidos 7-meros

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3

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Los péptidos de acuerdo con la presente invención incluyen las SEQ IDs (identificaciones de secuencias) descritas en el presente texto, así como péptidos que se prolongan hasta, p. ej., 20 aminoácidos más (p. ej. aproximadamente 1, 3, 6, 9, 12, 15 ó 18) en cualquiera de los extremos o en ambos extremos del péptido, con la condición de que el péptido prolongado muestre la especificidad/avidez requeridas para un dominio externo de Hsp47.

Preferentemente, un péptido de la invención está "aislado", p. ej. está en otra forma distinta de aquella con la que se presenta en la naturaleza, p. ej., en un tampón, en una forma seca en espera de reconstitución, como parte de un kit, etc. En algunas realizaciones el péptido está sustancialmente purificado. La expresión "sustancialmente purificado", como se usa en el presente texto, se refiere a una molécula, tal como un péptido, que está sustancialmente libre de otras proteínas, lípidos, carbohidratos, ácidos nucleicos y otros materiales biológicos con los que está asociada de manera natural. Por ejemplo, una molécula sustancialmente pura, tal como un péptido, puede ser al menos aproximadamente 60% en peso seco, preferentemente aproximadamente 70%, 80%, 90%, 95% o 99% la molécula de interés. Un experto en la técnica puede purificar péptidos usando métodos de purificación de proteínas estándar, y la pureza de los péptidos puede determinarse usando métodos estándar, incluyendo, p. ej., electroforesis en gel de poliacrilamida (p. ej. SDS-PAGE), cromatografía en columna (p. ej. cromatografía de líquidos de alto rendimiento (HPLC) y análisis de secuencia de aminoácidos amino-terminal.

Una vez que los péptidos que manifiestan una especificidad para la Hsp47 expresada en la superficie han sido identificados, pueden determinarse cálculos de energía libre u otras propiedades para cada uno, y esta información puede ser usada para diseñar otros agentes o fármacos, p. ej. compuestos orgánicos que se unen preferentemente a Hsp47 expresada en la superficie. Tales métodos son convencionales. Véanse, p. ej., Rejyo et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. 93, 8945-8950; Gabius et al. (1998) Phar. Res. 15, 23-30; y Selz et al. (1998) Biophysical Jol. 75, 2332-2343.

Las técnicas de presentación en fago (phage display)/separación por inmunopurificación (panning) pueden servir no sólo para identificar péptidos que pueden ser usados en la presente invención sino también pueden proporcionar los bacteriófagos que llevan tales péptidos en su superficie, que pueden ser usados en la presente invención. Esto es, un resto de direccionamiento de la presente invención puede ser el propio bacteriófago que lleva el péptido. Tales bacteriófagos muestran la ventaja de que son fácilmente internalizados en el RE de las células a las que se adhieren. Véase, p. ej., el Ejemplo 6.

En un aspecto de la invención, un resto de direccionamiento como anteriormente, se usa para suministrar un resto terapéutico (p. ej. un fármaco o una sustancia tóxica) a una célula que expresa Hsp47 en su superficie (p. ej. una célula de carcinoma, por ejemplo una célula que constituye parte de un tejido o tumor). Un agente terapéutico de la presente invención comprende preferentemente un resto de direccionamiento y, asociado con él, un resto terapéutico. Un agente terapéutico puede modular una célula, bien sea positivamente o bien negativamente, con la condición de que tenga un efecto terapéutico neto sobre el entorno en el que reside la célula (p. ej. un tejido, tumor, metástasis, paciente o similar). Por "modular" se entiende que se altera cualquier respuesta fisiológica de la célula, p. ej. una actividad metabólica, una respuesta a un factor ambiental externo o interno, un proceso de síntesis o catabólico, activación, represión, etc. El agente terapéutico puede conseguir la inhibición o la supresión del crecimiento, muerte, destrucción, eliminación, control, modificación, etc. de la célula o el tejido. Se incluyen los efectos citostático, citolítico, citotóxico y carcinostático. Un agente terapéutico puede suprimir un fenotipo neoplásico, o puede interferir con la función normal, o incapacitarla de alguna otra forma, de una célula a la que es suministrado. En una realización, el agente terapéutico puede prevenir el establecimiento, el crecimiento o la metástasis de un carcinoma, p. ej. puede prevenir la recidiva de un carcinoma. Ejemplos representativos de agentes antitumorales tales como, p. ej., activadores inmunitarios e inhibidores de la proliferación de tumores, se describen, p. ej., en la patente de EE.UU. nº 5.662.896. "Tratamiento" o producción de una "respuesta terapéutica" en una célula, un tejido, un tumor, una metástasis, un paciente o similar, por un agente terapéutico (p. ej. que comprende un fármaco o un agente tóxico) se define en el presente texto como una acción que puede provocar una respuesta tal como las que se discuten anteriormente. Por una "cantidad efectiva" de un agente terapéutico se entiende una cantidad que es suficiente para provocar tal respuesta.

Los métodos para ensayar si un agente desencadena un efecto terapéutico son rutinarios y convencionales, y pueden llevarse a cabo in vivo o in vitro. Un método típico para realizar la farmacocinética en un modelo animal se muestra en el Ejemplo 7. Un modelo animal típico para probar el efecto de un agente sobre tumores es el modelo de xenoinjerto de carcinoma de células escamosas orales humanas, que se muestra en el Ejemplo 7. Entre los factores que pueden ser ensayados están la tasa de supervivencia del animal, la reducción de tamaño del tumor tratado, y la presencia o ausencia de metástasis, tales como metástasis en los ganglios linfáticos o en el pulmón.

Cualquiera entre una amplia variedad de restos terapéuticos está comprendido en la presente invención, incluyendo compuestos terapéuticos que se usan corrientemente pero que son suministrados a las células por otros métodos. Los restos terapéuticos pueden ser aislados de fuentes naturales o pueden ser producidos por medios de síntesis y/o recombinantes, todos los cuales son bien conocidos por los profesionales con una experiencia normal en la técnica. Entre los fármacos o restos terapéuticos que pueden usarse en la presente invención están los agentes quimioterapéuticos y/o citotóxicos tales como, p. ej., esteroides, antimetabolitos, antraciclina, vinca alcaloides, neocarcinostatina (NCS), adriamicina, didesoxicitidina, cisplatino, doxorrubicina, pirarrubicina, melfalán y daunomicina, o similares. Los métodos para unir tales restos a restos de direccionamiento son rutinarios y convencionales. Por ejemplo, el Ejemplo 7 ilustra métodos para unir doxorrubicina a un agente de direccionamiento de anticuerpo o péptido.

En una realización, el resto terapéutico comprende una toxina tal como, p. ej., ricina (p. ej. la cadena A y/o B de la misma, o la forma desglicosilada), lectinas venenosas, toxina de la difteria, exotoxina de Pseudomonas aeruginosa, abrina, modeccina, toxina botulina, alfa-amanitan, proteína antiviral de la hierba carmín o pokeweed (PAP, incluyendo PAPI, PAPII y PAP-S), proteínas inhibidoras del ribosoma, especialmente las proteínas inhibidoras del ribosoma de cebada, trigo, maíz, centeno, o gelonina, o glicoproteína inactivadora del ribosoma (GPIR). Los fragmentos, subunidades, muteínas, miméticos, variantes y/o análogos de tales toxinas son, desde luego, conocidas por los expertos en la técnica y están incluidas en la presente invención. Se contempla que todas estas variantes o mutantes que conservan sus propiedades tóxicas serán utilizables de acuerdo con la presente invención.

Los métodos para seleccionar toxinas y unirlas (p. ej. por asociación, unión o conjugación) con un resto de direccionamiento (p. ej. un péptido o un anticuerpo) son rutinarios y convencionales en la técnica. Véanse, p. ej., las patentes de EE.UU. nº 5.840.522, 5.079.163, 4.520.011, 5.667.786, 5.686.072, 4.340.535, 6.020.145, 5.254.342, 4.911.912, 4.450.154 y 5.928.873. Los métodos para unir una toxina de péptido o polipéptido, p. ej., a un resto de direccionamiento de péptido o de anticuerpo incluyen, p. ej., unión covalente, unión por afinidad, intercalación, unión coordinada y complejación. La unión covalente puede lograrse bien sea por condensación directa de cadenas laterales existentes o por la incorporación de moléculas de unión externas. Muchos agentes bivalentes o polivalentes son útiles en el acoplamiento de moléculas de proteínas a otras funciones proteína, péptido o amino, etc. Por ejemplo, la bibliografía está repleta de agentes de acoplamiento tales como carbodiimidas, diisocianatos, glutaraldehído, diazobencenos y hexametilen diaminas. En algunas realizaciones, puede ser que se desee primero derivatizar el resto de direccionamiento y después unir el componente de toxina al producto derivatizado. Los agentes de entrecruzamiento adecuados para ser usados de esta manera incluyen, p. ej., SPDP (N-succinimidil-3-(2-piridiltio)propionato) y SMPT (4-succinimidil-oxicarbonil-\alpha-metil \alpha(2-piridiltio)tolueno). En una realización, una toxina y un resto de direccionamiento pueden unirse covalentemente formando un puente disulfuro entre grupos libres tiol de origen natural (p. ej. en la cadena A de una ricina) y/o un grupo tiol o disulfuro activado que ha sido introducido en un análogo de una cadena de péptido (p. ej. un análogo de gelonina que tiene una cisteína disponible para formar un puente disulfuro).

En otra realización, el resto terapéutico puede comprender cualquiera de una diversidad de radioisótopos o radionucleidos reconocidos en la técnica. Los métodos de radioterapia (medicina nuclear), en la que se suministran a las células dosis citotóxicas de radioactividad, son convencionales en la técnica y se describen, p. ej., en el documento EP 481.526; patente de EE.UU. nº 5.962.424; Roeske et al. (1990) Int. J. Radiation Oncology Biol. Phys. 19, 1539-48; y Leichner et al.. (1993), Med. Phys. 20 (2 Pt. 2), 569-77. Tales compuestos radioactivos pueden afectar a la célula señalada como diana así como a las células de tumores adyacentes que, por una u otra razón, no muestran Hsp47 en su superficie. Una descripción más detallada de los tipos de agentes radioactivos que pueden ser usados y de cómo unirlos a restos de direccionamiento, se discute más adelante en referencia con agentes para formación de imágenes. Entre las fuentes de radiación más preferidas están el Tc-99 y el In-111.

En otra realización, el resto terapéutico puede comprender un anticuerpo, y puede usarse como base para tipos convencionales de inmunoterapia, p. ej., como se discute más adelante en relación con anticuerpos que no están asociados con un resto terapéutico adicional.

Desde luego, pueden acoplarse combinaciones de los varios restos terapéuticos a un resto de direccionamiento, confiriendo así citotoxicidad variable. En otra realización, se administran juntos dos o mas agentes terapéuticos distintos.

Muchas variaciones del tratamiento están comprendidas en la invención. Por ejemplo, puede ser deseable tratar a un paciente previamente con una cantidad de una toxina (u otro agente terapéutico) efectiva para generar una respuesta inmunitaria, proporcionando así al paciente una protección sistémica frente a la toxina. Subsiguientemente, se puede administrar la toxina al paciente en una cantidad efectiva para matar células tumorales. Véase, p. ej., la patente de EE.UU. nº 5.667.786.

En otra realización, puede usarse un anticuerpo anti-Hsp47 que no está asociado con un resto terapéutico adicional, p. ej. para tratar un carcinoma, en un método de inmunoterapia. Cualquiera de los tipos de anticuerpos descritos en el presente texto como restos de direccionamiento puede ser usado para inmunoterapia. Los métodos de inmunoterapia son convencionales y se describen, p. ej., en las patentes de EE.UU. nº 6.015.567, nº 5.478.556 y 6.017.540.

En una de estas realizaciones, el anticuerpo produce un efecto en virtud de su asociación con Hsp47 de la superficie de la célula. El Ejemplo 3 demuestra que la Hsp47 localizada en la superficie de la célula está asociada con la proteína tetraspanina, CD9, y así puede estar implicada en la interacción de células con la matriz celular. Por consiguiente, un anticuerpo dirigido contra Hsp47 puede modular la interacción de una célula, p. ej. una célula de carcinoma, con la matriz intracelular. Además, la expresión de Hsp47 en la superficie de la célula puede correlacionarse con la invasividad de la célula y la fagocinesis (movilidad), que, a su vez, pueden correlacionarse con el potencial metastático de una célula carcinogénica. El Ejemplo 4 demuestra una correlación negativa en varias líneas celulares entre la expresión de Hsp47 en la superficie de la célula y la invasividad/fagocinesis. Sin desear vincularse a ningún mecanismo en particular, la invención comprende métodos de tratamiento con un anticuerpo anti-Hsp47 para modular una célula (aumentar o disminuir una actividad fisiológica o una propiedad de la misma) (p. ej., célula de carcinoma, un tumor, etc.) por ejemplo para modular la invasión, la migración/movilidad de las células del tumor (p. ej. carcinoma), y/o metástasis de una célula tumoral (p. ej. célula de carcinoma).

En casos en los que la expresión de Hsp47 en la superficie de la célula se correlaciona negativamente con la invasividad y/o la metástasis del tumor, la detección de Hsp47 expresada en superficie puede servir como base para un método de diagnóstico para identificar tumores (p. ej. carcinomas) que son sustancialmente no metastáticos y/o que están asociados con un mejor pronóstico que los tumores en cuya superficie es sustancialmente menor la expresión de Hsp47.

En otra de estas realizaciones, el anticuerpo puede producir un efecto inmunológico. Sin ánimo de vincularse a ningún mecanismo en particular, la invención abarca situaciones en las que un anticuerpo recluta células NK para la citotoxicidad mediada por anticuerpo mediada por la célula. Los anticuerpos bifuncionales pueden llevar efectores tales como NK y T_{c} próximos a la diana del tumor. Muchas variaciones de inmunoterapia serán evidentes para los expertos en la técnica. Por ejemplo, pueden ser administrados conjuntamente dos conjugados heteroanticuerpo biespecíficos, p. ej. anti-tumor/anti-CD3 y anti-tumor/anti-CD28. Sin ánimo de vincularse a ninguna teoría de mecanismo en particular, se propone que dos de tales heteroconjugados pueden actuar sinérgicamente induciendo el contacto entre una célula T y un tumor para activar la citotoxicidad directa incluso aunque la propia célula T no tenga especificidad convencional para la diana tumor.

La inmunoterapia puede llevarse a cabo introduciendo un anticuerpo directamente en un paciente, usando métodos de suministro y dosis convencionales, tales como se describen en el presente texto para otros agentes terapéuticos. Alternativamente, pueden introducirse en un paciente como una vacuna uno o más dominios externos de Hsp47, o fragmentos del mismo, que contienen un epítopo inmunitario, con el fin de desencadenar una respuesta inmunitaria mediada por células. En una realización preferida, el dominio externo es "aislado", p. ej. es esencialmente libre de dominios transmembrana y citoplásmico. El dominio externo o fragmento del mismo puede ser de cualquier tamaño, con la condición de que comprenda al menos un inmunoepítopo. Si se desea, el dominio externo puede ser administrado conjuntamente, o conjugarse con uno o más reactivos que pueden potenciar la respuesta inmunitaria, p. ej. una molécula coestimuladora tal como B7 o citocinas IFN\gamma, GMCSF, L2/4 y 7; una molécula antigénica tal como un péptido; o un coadyuvante adecuado.

En otra realización, un bacteriófago cuya superficie comprende un péptido que es específico para Hsp47 puede servir como vector para la puesta en práctica de una terapia génica. Los métodos típicos de display o presentación en fago y inmunopurificación de afinidad o panning diseñados para obtener fagos que pueden ser usados en tal método se describen en el presente texto. Un gen del que se desea la expresión en un hospedador mamífero, puede ser insertado en una casete de expresión de mamífero y después puede ser clonado en el genoma del fago. Las casetes para la expresión de genes de mamíferos son convencionales en la técnica, como los son los métodos para clonar tales casetes en un ácido nucleico de interés, p. ej. el DNA de un fago filamentoso. Los métodos para clonar y expresar genes son rutinarios para un profesional con experiencia normal en la técnica. Véanse, p. ej., Sambrook, J. et al (1989). Molecular Cloning, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Ausubel, F. M. et al (1995), Current Protocols in Molecular Biology, N. Y., John Wiley and Sons; y Davis et al. (1986), Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier Sciences Publishing, Inc., Nueva York. En particular, los métodos para usar fagos como vehículos de suministro de genes para células de mamíferos son convencionales y se describen, p. ej., en Larocca et al. (1999), FASEB Journal 13, 727-734; Barry et al. (1996), Nat. Biotechnology 1282, 7711; Larocca et al (1998), Hum. Gene Ther. 9, 2393-2399; Poul et al. (l999). J. Mol. Biol. 288, 203-11; y Kassner et al (l999), Biochem. Biophys. Res. Comm., 264, 921-8.

Para muchas de las técnicas de biología molecular citadas en esta solicitud, incluyendo aislamiento, clonación, modificación, marcado, manipulación, secuenciación y alguna otra forma de tratamiento o análisis de ácidos nucleicos y/o proteínas, véanse, p. ej. Hames et al. (1985), Nucleic Acid Hybridization, IL Press, Dracopoli, N. C. et al., Current Protocols in Human Genetics, John Wiley and Sons, Inc.; y Coligan, J. E. et al., Current Protocols in Protein Science, John Wiley and Sons, Inc.

Puede introducirse en una célula uno cualquiera entre una variedad de genes terapéuticos, en un método de terapia génica, con tal un vector. Tales genes pueden ser traducidos a proteínas, expresados como secuencias de ácido nucleico antisentido o ribozimas, o similares. Los genes pueden ser integrados en el genoma hospedador o pueden ser mantenidos establemente o expresados transitoriamente en una forma no integrada.

Los tipos de genes que pueden ser administrados son bien conocidos en la técnica y se describen, junto con métodos que los usan para terapia génica, p. ej. en Culver et al. (1994), TIG 10, 1744-178 y las patentes de EE.UU. nº 6.017.896; 5.916.803; 5.871.726; 5.688.773; 5.496.731; 5.631.236; 5.962.424; 5.922.685; 5.789.244; 5.662.896; 5.532.220; 5.888.502; 5.888.814; 5.932.210; y 5.916.803. Los genes pueden ser introducidos en células ex vivo y reintroducidos en un paciente, o pueden ser introducidos in vivo. Entre las clases generales de genes que pueden administrarse están: genes que potencian la inmunogenicidad de un tumor, p. ej. genes que codifican antígenos extraños; genes que inician la apoptosis; genes que potencian las células inmunitarias para aumentar la actividad antitumoral, p. ej. genes que codifican citocinas, tales como IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, IL-12, TNF-\alpha o \beta; GM-CSF, G-CSF, M-CSF IFN- \alpha, \beta o \gamma, TGF-\alpha o \beta, TNF-\alpha o \beta, NGF o similares; genes sensibles o suicidas (p. ej. genes que codifican HSV- o VZV-Tk, que confieren sensibilidad al ganciclovir; o que codifican citosina desaminasa, que confiere sensibilidad para 5-fluorocitosina; o que codifica una enzima de clivaje de purina no humana, tal como la purina nucleósido fosforilasa, que confiere sensibilidad a un sustrato de purina que, cuando es clivada por la enzima, se hace tóxica para la célula); genes que bloquean la expresión de oncogenes, p. ej. genes que codifican el mensaje de K-RAS antisentido); genes supresores de tumores de tipo silvestre (p. ej. p53; p16; gel del retinoblastoma (RB), bien sea p110^{RB} de longitud completa o proteínas mutantes tales como p94^{RB} o p56^{RB}; mitosina; o H-NUC); genes que bloquean los mecanismos por los que los tumores se evaden de la destrucción inmunológica, p. ej. el gen que codifica el mensaje de IGF-1 (factor de crecimiento de tipo insulínico) antisentido; genes que codifican una variante citoplásmica construida por ingeniería genética de una nucleasa (p. ej. RNasa A) o proteasa (p. ej. tripsina, papaína, proteinasa K, carboxipeptidasa, etc.); y genes que codifican cualquiera de las toxinas proteínicas descritas anteriormente.

Muchos otros tipos de terapia génica están comprendidos por la presente invención y serán evidentes para un profesional con una experiencia normal en la técnica. Por ejemplo, cualquier resto de direccionamiento como se ha expuesto antes puede ser asociado (p. ej. unido covalentemente o no covalentemente) con un gen de interés y puede servir para suministrarlo a una célula. En una realización, el resto de direccionamiento comprende parte de un vector que también comprende uno o más de: a) un vehículo no viral para el gen que se ha de insertar; b) una proteína de fusión para potenciar la penetración del vector en el citoplasma y, opcionalmente el núcleo, de la célula; y c) un gen terapéutico tal como los descritos anteriormente con referencia a la terapia génica mediada por un bacteriófago. Muchas variedades de los componentes a) y b) serán conocidas por los expertos en la técnica. Para una discusión más profunda de estos componentes, véase, p. ej. la patente de EE.UU. nº 5.916.803 y la sección que sigue, relativa a la introducción de péptidos y agentes similares en una célula.

Los métodos para suministrar (administrar, introducir) agentes terapéuticos en una célula, tejido o tumor, o en un paciente, in vitro o in vivo, y para monitorizar u observar los efectos inducidos de esta forma, serán evidentes para un profesional con experiencia normal en la técnica. Véanse, p. ej., las referencias citadas en el presente texto, y Vitetta et al. (1991), Cancer Res. 51, 4052. Los agentes que se han de administrar in vivo pueden ser formulados con portadores, excipientes o vehículos aceptables farmacéuticamente y, además, pueden ser suplementados con otros agentes medicinales tales como, p. ej., coadyuvantes, estabilizantes, potenciadores o similares.

La especificidad del direccionamiento que se engendra mediante la invención permite la administración sistémica. Alternativamente, pueden administrarse agentes en el sitio, o cerca del mismo, de un tejido o tumor a tratar. (Desde luego, las vías de administración descritas en el presente texto pueden emplearse para métodos de detectar una diana (formación de imágenes) así como para métodos de tratamiento). Los métodos de administración son convencionales e incluyen vías de administración parenterales y no parenterales. Las vías parenterales incluyen, p. ej. la intravenosa, intraarterial, intraportal, intramuscular, subcutánea, intraperitoneal, intraespinal, intratecal, intracerebroventricular, intracraneal, intrapleural u otras vías de inyección. Las vías no parenterales incluyen, p. ej., la oral, nasal, transdérmica, pulmonar, rectal, bucal, vaginal, ocular. Para suministro no parenteral, podría ser deseable usar agentes que potencian la transcitosis de un complejo receptor/ligando de la superficie de la célula, p. ej. por administración de brefeldina A o monensina. Véase, p. ej., la patente de EE.UU. nº 5.254.342.

Las dosificaciones a administrar pueden determinarse por procedimientos convencionales y, en general, serán conocidos por los expertos en la técnica. Los factores a considerar incluyen la actividad del agente específico implicado, la estabilidad metabólica y longitud de acción del agente, el modo y el tiempo de administración, combinación de fármacos, velocidad de excreción, especie que se está tratando, y la edad, peso corporal, estado general, sexo, dieta y gravedad de los estados patológicos concretos del hospedador que está siendo sometido a la terapia. Por ejemplo, los regímenes terapéuticos para una inmunotoxina apropiados (es decir, un conjugado que comprende un anticuerpo, o variante o fragmento del mismo, conjugado con una o más moléculas de toxina) implican la administración a un paciente de una dosis entre aproximadamente 0,5 y 2 mg/kg.

Un agente terapéutico puede ser internalizado en cualquiera de una diversidad de localizaciones en una célula o un tejido. En algunos casos, es deseable que un agente terapéutico sea internalizado en una célula acompañando la Hsp47 a medida que se recicla al RE. En otros casos, es deseable que un agente terapéutico sea endocitosado en un endosoma o lisosoma de una célula, p. ej. una toxina proteinácea que ha de ser procesada proteolíticamente con el fin de que se haga activa. Hay también otros casos en los que es deseable que el agente evada la degradación enzimática y sea transportado al citoplasma y/o al núcleo. Pueden usarse diversos procedimientos convencionales para potenciar el transporte de una entidad unida a la superficie a una célula y, en algunos casos, evitar tal proteolisis, Puede ser deseable, por ejemplo, asociar el agente terapéutico, directa o indirectamente, con un vehículo y/o con una proteína de fusión, para generar un vector para el suministro del agente terapéutico.

Hay una variedad de vehículos apropiados (p. ej. vehículos no virales) que son bien conocidos en la técnica y se describen, p. ej., en la patente de EE.UU. nº 5.916.803; Cotten et al. (1993), Curr. Biol. 4, 705; Behr (1993), Acc. Chem. Res. 26, 274; Felgner (1990), Adv. Deliv. Rev. 5, 163; Behr (1994), Bioconjugate Chem. 5, 382; y Ledley (1995), Hum. Gene Ther. 6, 1129. En una realización preferida, el vehículo muestra una vida mitad larga en el organismo, permitiendo el máximo posible de unión de un vector a una célula diana. Entre los vehículos preferidos están los liposomas o lípidos catiónicos, polipéptidos o proteínas, o similares. Un vehículo puede asociarse directamente (p. ej. acoplarse) o indirectamente a un agente terapéutico, por cualquiera de una variedad de medios convencionales.

Hay diversas proteínas de fusión que pueden potenciar la penetración de un vector en una célula y/o fuera de un endosoma o lisosoma y en el citoplasma de una célula. Muchas proteínas, o fragmentos o variantes de las mismas, poseen propiedades fusiogénicas, incluyendo cierto número de proteínas virales. Tales proteínas serán conocidas por un experto en la técnica y se discuten, p. ej., en la patente de EE.UU. nº 5.916.803; Hughson (1995), Current Biol. 5, 265; Iloekstra (1990), J. Bioenergetics Biomembranes 22, 675; y White (1990), Ann. Rev. Physiol. 52, 675.

En algunos casos, un resto de direccionamiento puede ser modificado de manera que se una más eficientemente a un dominio externo de Hsp47 y/o sea internalizado más eficientemente en una célula. Por ejemplo, péptidos cortos producidos por síntesis, tales como algunos de los péptidos 7-meros indicados en la Tabla 3, se unen a veces a células diana, pero no son absorbidos por ellas; mientras que los mismos péptidos son internalizados cuando son expuestos en el término pIII de un bacteriófago. Para potenciar la internalización, p. ej., de un péptido sintético corto, se puede añadir al péptido un enlazador de péptido sintético que tenga las propiedades deseables, p. ej. un enlazador que exponga el péptido corto de tal manera que pueda unirse y ser internalizado por una célula con Hsp47 en su superficie, pero que, él mismo, no se una a otras células distintas de aquellas que exponen Hsp47 en su superficie, sea estable en la circulación, pueda ser procesado después de la internalización, o similares. Otras de estas modificaciones mejoradoras de restos diana serán evidentes para los expertos en la técnica.

En otro aspecto de la invención, un resto de direccionamiento como el anterior se asocia con un resto detectable que permite la detección (formación de imagen, identificación) de una célula que expresa Hsp47 en su superficie, p. ej. una célula de carcinoma, un carcinoma en cualquier estadio de desarrollo, un tumor, una metástasis (incluyendo una micrometástasis), o similares. Un agente que comprende un resto de direccionamiento y un resto detectable se llama en el presente texto un agente detectable o un agente de formación de imagen. Tal detección puede realizarse in vitro o in vivo. Los métodos de detección pueden ser cuantitativos. Por ejemplo, la cantidad de Hsp47 expresada en la superficie de una célula, o el número de células que expresan Hsp47 en su superficie, pueden cuantificarse exponiendo la célula, el tumor, el animal, el paciente, o similares, a un dispositivo de detección que puede identificar y cuantificar el marcador detectable.

Los restos detectables comprendidos en la presente invención incluyen, p. ej., generadores de señal [entidades que son capaces de emitir una cantidad detectable de energía en forma de radiación electromagnética (tal como rayos X, radiación UV, radiación IR, radiación visible y similares), e incluyen entidades fosforescentes y fluorescentes, marcadores bioluminiscentes, emisores de rayos gamma y X, o similares]; reflectores de señales (p. ej. entidades paramagnéticas); o absorbentes de señales (p. ej. colorantes opacificadores de haces de electrones).

Un resto detectable puede unirse (o asociarse) con un resto de direccionamiento por uno cualquiera entre una variedad de métodos bien establecidos, incluyendo los descritos anteriormente para unir restos terapéuticos a restos de direccionamiento. Por ejemplo, en métodos particularmente adecuados para la detección in vitro, puede incorporarse directamente un elemento radioactivo (p. ej. un aminoácido) a un resto de direccionamiento (p. ej. una cadena de péptido) y detectarse por autorradiografía; o un marcador fluorescente puede asociarse con tal resto de direccionamiento por medio de una interacción biotina/avidina, asociación con un anticuerpo conjugado con fluoresceína, o similares, y detectarse por microscopía de inmunofluorescencia, citometría de flujo (FACscan) o similares.

Los metales potenciadores de la diana están comprendidos en la presente invención y son particularmente adecuados para la formación de imágenes in vivo. Los metales de acuerdo con la presente invención incluyen, p. ej., metales paramagnéticos para MRI, iones de metales pesados, p. ej. con números atómicos de al menos 37, preferentemente al menos 50, para formación de imágenes de rayos X o ultrasonidos; y iones de isótopos radioactivos para escintigrafía. La elección del metal vendrá determinada por la aplicación de diagnóstico (o terapéutica) que se desea. Los ejemplos de iones radioactivos incluyen, p. ej., iones de lantánidos u otros iones metálicos, incluyendo isótopos y radioisótopos de los mismos, tales como, p. ej., los iones yodo^{123}, yodo^{125}, yodo^{131}, tecnecio^{99m}, indio^{111}, renio^{188}, renio^{186}, cobre^{67}, ytrio^{90}, astato^{211}, galio^{67}, iridio^{192}, cobalto^{60}, radio^{226}, oro^{198}, cesio^{137}, fósforo^{32}, carbono^{14}, y tritio. Los ejemplos de agentes fluorogénicos incluyen gadolinio y renografina.

Un metal puede ser asociado con un resto de direccionamiento por cualquiera de una diversidad de medios, que son bien conocidos por un profesional con experiencia normal en la técnica. Para métodos de preparación restos potenciadores de imágenes, unirlos a restos de direccionamiento y usarlos para la detección, véanse, p. ej., los documentos EP 481.526, GB-A-2169598 y EP 136.812. Por ejemplo, los metales pueden unirse a (asociarse con, fijarse a) restos de direccionamiento mediante agentes quelantes, incluyendo poliquelantes, poliquelantes bifuncionales, y sales o intermedios macrocíclicos de los mismos. Existe una diversidad de métodos para multiplicar la potenciación, p. ej. usando un compuesto formado por una molécula esqueleto, tal como una poliamina, a la cual se une una diversidad de agentes quelantes.

Las rutas por las que pueden administrarse agentes de formación de imágenes se describen anteriormente con referencia al suministro de agentes terapéuticos. Los agentes de formación de imágenes de la presente invención pueden ser administrados a pacientes para formar imágenes en cuantía suficiente para dar el deseado contraste con las técnicas de formación de imágenes particulares. Generalmente, dosificaciones de aproximadamente 0,001 a 5,0 mmoles de ion metálico de formación de imágenes quelado, por kilogramo de peso corporal del paciente, son efectivas para conseguir mejoras de contraste adecuadas. Para la mayor parte de la aplicaciones de MRI, las dosificaciones preferidas de iones metálicos de formación de imágenes estarán en el intervalo de aproximadamente 0,02 a 1,2 mmoles/kg de peso corporal, mientras que para aplicaciones de rayos X las dosificaciones de aproximadamente 0,5 a 1,5 mmoles/kg son generalmente efectivas para conseguir la atenuación de los rayos X. Las dosis preferidas para la mayor parte de las aplicaciones de rayos X son de 0,8 a 1,2 mmoles del lantánico o del metal pesado por kg de peso
corporal.

Otro aspecto de la presente invención es un método de cribado de un agente que se una específicamente a un carcinoma en el que se expresa Hsp47 en la superficie de al menos algunas de sus células, preferentemente en el que el agente es útil para tratar un carcinoma en un paciente o para el diagnóstico de un carcinoma en un paciente, que comprende identificar un agente que se une específicamente a un dominio externo de Hsp47. En otra parte en esta solicitud se describen ensayos para determinar si un agente se une a un dominio externo de Hsp47, y para determinar la especificidad y/o la avidez de la unión. Se dispone de procedimientos de rutina para el cribado de agentes de interés, usando tales métodos.

Otro aspecto de la presente invención es un kit para tratar a un paciente que padece un carcinoma en el que la Hsp47 se expresa en la superficie de al menos alguna de las células del carcinoma, o para detectar un carcinoma en el que la Hsp47 se expresa en la superficie de al menos alguna de las células del carcinoma, que comprende un agente que se une específicamente a un dominio externo de la Hsp47 en una cantidad suficiente para generar un efecto citostático o citolítico en el carcinoma, o para formar imágenes de la célula sobre un fondo de células no carcinomatosas. En una realización preferida, el agente comprende, como resto de direccionamiento, un anticuerpo o un fragmento del mismo, un péptido o un bacteriófago en cuya superficie está un péptido, cada uno de los cuales restos se une específicamente a un dominio externo de la Hsp47. En la realización más preferida el resto de direccionamiento es

un anticuerpo monoclonal,

un péptido que comprende el motivo consenso XHyHyXXHyXXXXHyHy (SEQ ID No: 1) o el motivo consenso HyXXXHyHyXXHyXXX (SEQ ID No: 2), en donde X, independientemente, puede ser un aminoácido, y Hy, independientemente, puede ser cualquier aminoácido hidrófobo,

un péptido que tiene la secuencia de cualquiera de las SEQ ID No: 3 a SEQ ID No: 25 de las Tablas 1 y 2, o

un bacteriófago en cuya superficie hay un péptido que se une específicamente a un dominio externo de la Hsp47.

En una realización, el agente comprende, como resto terapéutico, una toxina, un radioisótopo o radionucleido, un anticuerpo o un ácido nucleico que codifica un gen terapéutico. La invención comprende también un kit para modular una célula que expresa Hsp47 en su superficie, que comprende un agente que se une específicamente a un dominio externo de la Hsp47, en una cantidad efectiva para modular la célula. Desde luego, un kit de la presente invención comprenderá uno o más recipientes para los agentes terapéuticos y/o formadores de imágenes.

Ejemplos

Los datos que se describen en los Ejemplos 1 a 6 que siguen se presentan en los manuscritos: 1) Hebert et al. (1999), J. Cellular Biochemistry 73, 248-258, que se incorpora como referencia en su totalidad; y 2) Sauk et al. (2000) J. Cellular Biochemistry, aceptado en enero de 2000, que se incluye en el presente texto como Apéndice 1 y se incorpora como referencia en su totalidad.

Ejemplo 1 Expresión de coligina/Hsp47 en la superficie de células de carcinoma epidermoide oral

Se ha realizado estudios usando líneas celulares establecidas de carcinomas de células escamosas orales humanas (SCC-4, SCC-9, SCC-15 y SCC-25) y una línea de células epidermoides murinas, carcinoma de pulmón de Lewis (LL/2), obtenida de la ATCC. Además, se usa una línea celular primaria de fibroblastos gingivales como testigo.

A. Análisis por citometría de flujo

Para estos estudios, se usan el anticuerpo monoclonal SPA-470 contra coligina/Hsp47 (StressGen, Victoria, BC) y un anticuerpo policlonal de conejo coligina/Hsp47, preparado contra un péptido 22-mero correspondiente a la secuencia N-terminal de coligina/Hsp47 de ratón. Los anticuerpos monoclonales para análisis de citometría se conjugan directamente con fluoresceína usando el kit de éster 5(6) carboxifluorescein-N-hidroxi succinimida (Boehringer Mannheim, Indianápolis, IN) o se marcan con SA-Red670^{TM} después de la biotinilación del anticuerpo usando el kit EZ-Link^{TM} Sulfo-NHS-LC-Biotinylation (Pierce, Roxkville, Ill).

Las células desarrolladas in vitro se lavan y se incuban en una solución al 0,5% de Poliglobina N para bloquear los receptores Fc insaturados y reducir la unión no específica de anticuerpos monoclonales. A continuación, 50 ml de la suspensión de células (1 x 10^{6} células/ml) se incuban con 2,5 ml (1 mg) de anticuerpos, conjugados con fluoresceína, o SA-Red670^{TM} (GibcoBRL, Gaithersburg, MD). Después de lavar, el sedimento de células se resuspende en PBS que contiene BSA para ensayos de citometría de flujo. Para evaluar la coligina/Hsp47 intracelular, las células se impermeabilizan primero con 0,1% de saponina. Después se analizan las muestras en un citómetro de flujo FACScan (Beton Dickinson, San José, CA). El láser de argón a 488 nm se hace funcionar a 15 nW de potencia. Los datos de los conjugados de fluoresceína se recogen después de un filtro 530/30 BP. Para los análisis citométricos de flujo de dos colores se emplean o bien fluoresceína o Red670^{TM} con yoduro de propidio. Los filtros usados son SP dicroico a 600 nm; 525 \pm 15 nm BP (fluoresceína) y 645 LP (Red670^{TM}).

El yoduro de propidio se usa para evaluar el ciclo celular y teñir para ver células muertas. Para estos estudios se añade una solución hipotónica de citrato que contiene PI a \sim 1 x 10^{6} células lavadas, hasta una concentración de 1 mM. Las células se marcan durante 20 minutos y después se analizan en el FACScan en su solución de teñido. La fluorescencia naranja del PI se recoge después de un filtro 585/42 nm BP.

Se usa compensación electrónica entre los canales de fluorescencia que recogen emisiones para eliminar el recubrimiento espectral residual. Los datos de fluorescencia se muestran en una escala de cuatro décadas. En cada muestra se recoge un mínimo de 10.000 eventos. El análisis de los datos se realiza con software LYSYS II (Becton Dickinson, Mansfield, MA). Se usan representaciones de contorno de parámetro dual de fluorescencia para la exclusión de residuos y agregados. Este método de cierre permite la fácil discriminación de los residuos de células muertas (dispersión frontal de la luz baja y fluorescencia de PI alta). El porcentaje de células con un G_{1/0}, S, de complemento de DNA G_{2}/M se determina a partir de un histograma de DNA mediante integración por regiones usando rutinas incorporadas de análisis de datos Multicycle® (Phoenix Flor Systems, San Diego, CA).

El análisis por citometría de flujo de líneas de células SCC, la línea de células murinas LL/2 y fibroblastos gingivales humanos, revela que todas las líneas de células poseen coligina/Hsp47 intracelular. El análisis del ciclo de las células revela además que la expresión de coligina/Hsp47 no está limitada a ninguna fase del ciclo celular en los fibroblastos gingivales ni en las células de carcinoma epidermoide. Sin embargo, cuando el análisis del ciclo celular se realiza solamente para la expresión en la superficie de la célula, la coligina/Hsp47 está limitada solamente a las líneas de células de carcinoma epidermoide.

B. Estudios de inmunofluorescencia: Se realiza microscopía de inmunofluorescencia según el método de Tang et al. (Tang et al. (1994), Eur. J. Cell Biology 65, 298-304; Tang et al. (1993), Eur. J. Cell Biology 120, 325-328). Para visualizar la coligina/Hsp47 de la superficie de la célula, las células no se permeabilizan sino que se tratan y se fijan con paraformaldehído al 1% como se describe para los análisis citométricos. Las células se tiñen después con anticuerpos anti-coligina/Hsp47 como anticuerpo primario seguido por anticuerpo de cabra anti-IgG de conejo o de ratón conjugado con FITC (isotiocianato de fluoresceína).

La microscopía de fluorescencia de las células no permeabilizadas, preparadas para análisis de citometría de flujo, confirma la tinción de anti-coligina/Hsp47 en la superficie.

C. Fraccionamiento de la membrana subcelular: El método para fraccionar membranas del plasma se modifica según los métodos descritos por Weber et al. (1988), "Subcelular distribution of Insulin Receptors" en Insulin Receptors, Kahn CR y Harison LS, editores (Nueva Cork; Alan R. Liss, Inc.), p. 171-187. En esencia, después de incubar 5 ml de células [(2-5) x 10^{6} células por ml] con o sin amilorida 1 mM, la suspensión de células se centrifuga a 100 g durante 60 segundos a temperatura ambiente. Los sedimentos celulares se suspenden en 10 ml de tampón tris/EDAT/sacarosa (Tris/HCl 20 mM, EDTA 1 mM y sacarosa 255 mM, pH 7,4) a 18-20ºC. El sedimento se resuspende en 500 \mul de tampón tris/EDAT/sacarosa usando un homogeneizador de vidrio-Teflon, se extiende en una almohadilla de 600 \mul de sacarosa 1,2 M en tampón de Tris 20 mM/EDTA 1 mM (pH 7,4) y se centrifuga en un rotor Beckman TLS55 a 8.150 g a 4ºC durante 30 minutos. Las membranas del plasma recogidas en la interfase de la almohadilla se suspenden en 2,5 ml de tampón Tris/EDTA/sacarosa y se centrifugan en un rotor Beckman TLA100.3 a 410.000 g a 4ºC durante 20 min. El sedimento de membrana de plasma final se resuspende en 60 \mul de tampón. Las muestras se tratan después con colagenasa bacteriana para eliminar la posibilidad de unión de procolágeno derivada citoplásmico -coligina/Hsp47 a los receptores de integrina de la superficie de la célula como consecuencia del fraccionamiento de la célula. El sobrenadante inicial se centrifuga en un rotor Sorvall SS34 a 48.000 g a 4ºC durante 15 min, y el sedimento de microsomas de alta densidad se resuspende en 40 \mul de tampón. El sobrenadante se sigue centrifugando en un rotor Beckman 70.1 a 300.000 g a 4ºC durante 75 min, y el sedimento de microsomas de baja densidad se resuspende en 60 \mul de tampón.

Las fracciones de la membrana se caracterizan por la distribución de actividad de 5'-nucleosidasa, un marcador de la membrana del plasma. La proteína se mide con el kit de ensayo de proteínas BCA (Pierce, Rockford, IL). Las membranas de plasma se someten directamente a análisis PAGE y Western. Para las transferencias Western o Western blots, las proteínas analizadas en SDS-PAGE se electrotransfieren inmediatamente a papel de nitrocelulosa y se bloquean con 10% de NFDM en Tris-HCl 10 mM pH 7,4, NaCl 0,9 mM (TBS) durante 2 h, y después en TBS/NFDM con 2% de NGS (GIBCO, Grand Island, NY). El antisuero o suero perinmune se diluye 1:2000 en el mismo tampón y se incuba con una agitación suave durante la noche. Después se enjuaga la nitrocelulosa tres veces durante 5 minutos en TBS/Tween. La Hsp47 se detecta con proteína A marcada con [^{125}I] (New England Nuclear, Boston, MA).

El fraccionamiento de la membrana subcelular de células con amilorida y células testigo para obtener una fracción de membrana del plasma, seguido por el análisis de transferencia Western, confirma la presencia de coligina/Hsp47 en la fracción 5'-nucleosidasa de la membrana del plasma.

Ejemplo 2 Unión de coligina/Hso47 de la superficie de la célula a \alpha-1 (I)-N-propéptido

Las secuencias de cDNA que codifican el dominio globular pro \alpha1(I) propéptido-N (NP1) [restos 23 a 108] y el dominio globular + dominio del propéptido GlyXaaYaa (NP2) [restos 23 a 151] se preparan como proteínas de fusión con GST como se describió con anterioridad (Hu et al. (1995), Cellular Biochemistry 59, 350-367). La expresión de la proteína de fusión se induce mediante IPTG 0,1 mM después de que las bacterias alcanzan la fase logarítmica media. Las proteínas de fusión se purifican mediante esferas de glutatión-Sepharose B (Pharmacia, Piscataway, NJ) siguiendo las instrucciones del fabricante. Las proteínas se caracterizan mediante SDS-PAGE y análisis de transferencia Western como se describió con anterioridad (Hu et al., ibid).

Las esferas de afinidad NP1 y NP2 se preparan siguiendo el método de Hu et al. (1995) ibid. En esencia, las proteínas de fusión con GST se tratan con trombina, se dializan y la proteína GST es eliminada de cada mezcla de reacción pasándola sobre una columna de glutatión-Sepharose. Los eluidos se recogen y se liofilizan, y se acoplan con Sepharose activada con CNBr. Las esferas finales contienen 1-2 mg de péptido por 250 \mul. Se llevan a cabo experimentos de unión a la superficie de Hsp47 mezclando 250 \mul de una suspensión al 50% (v/v) de péptido-Sepharose (Pharmacia, Piscataway, NJ) con una suspensión de membranas del plasma procedentes de células SCC biotiniladas en la superficie. Después de una incubación a 4ºC durante 1 h, las esferas se recogen por centrifugación y se lavan 3 veces con un volumen igual de tampón de Laemmli. Las esferas se extraen con 250 \mul de tampón de Laemmli para muestras para electroforesis hirviendo la muestra durante 5 min. Después de la separación mediante SDS-PAGE, las proteínas se transfieren a membranas de nitrocelulosa y se visualizan con ExtrAvidina conjugada con HRPO (peroxidasa de rábano picante) (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) usando reactivos Renaissance Chemiluminiscent Reagents (NEN, Cambridge).

Para demostrar la disponibilidad de la coligina/Hsp47 de la superficie de la célula para unir propéptidos de procolágeno en células vivas, se añaden proteínas de fusión con GST (1 \mug/ml) al medio de cultivo de \sim 1 x 10^{6} células SCC, puestas en placa en portaobjetos con cámaras (Nalgene NUNC, Milwaukee, WI) durante 10 minutos a 37ºC. Las células se lavan después en PBS fijado en paraformaldehído como antes, y se identifican las proteínas de fusión asociadas a las células (NP1, NP2) con anticuerpos anti-GST conjugados con HRPO, siguiendo los procedimientos de Sauk et al. (1994), I. Biol. Chem. 269, 3941-3946.

Los experimentos de unión realizados con membranas del plasma marcadas con biotina y Sepharosa unida al dominio globular pro \alpha1(1) (restos 23 a 108) o al dominio globular pro \alpha1(1) + dominio del propéptido GlyXaaYaa (restos 23 a 151) dan resultados similares. En ambos casos se identifican las bandas que migran a 46K y 47K. El análisis de transferencia Western confirma que tanto la banda de coligina/Hsp47 no glicosilada de 46K (Hirayoshi et al. 1991) como la de 47K reaccionan con anticuerpos anti-Hsp47. Estos hallazgos son consistentes para todas las líneas de células.

La tinción citoquímica con inmunoperóxido de proteínas de fusión con GST unidas a células en cultivo revela que las líneas de células con un porcentaje más alto de células que expresan coligina/Hsp47 de superficie muestran un porcentaje más elevado de proteínas de fusión unidas GST-NP1 y GST-NP2.

Ejemplo 3 Marcado de la superficie de la célula e inmunoprecipitación

Los métodos usados fueron descritos previamente para la caracterización de complejos TM4SF con integrinas (Berditchevski et al. (1996) Molec. Biol. of the Cell 7, 193-207). En esencia, las células se marcan con NHS-LC-biotina (Pierce, Rockford, IL) de acuerdo con el protocolo del kit, y se lisan en tampón de inmunoprecipitación [1% de Brij 96, Hepes 25 mM, pH 7,4, NaCl 150 mM, MgCl_{2} 5 mM, PMSF 2 mM, 20 \mug/ml de apotinina, y 10 \mug/ml de leupeptina]. Los complejos inmunitarios se recogen sobre esferas de proteína A previamente unidas con anticuerpos, seguido por cuatro lavados con tampón para inmunoprecipitación. Para condiciones más "rigurosas", el tampón de inmunoprecipitación es suplementado con 0,2% de SDS. Los complejos inmunitarios son eluidos de las esferas de proteína A con tampón para elusión de Laemmli, y las proteínas se separan mediante SDS-PAGE. Las proteínas se transfieren a membranas de nitrocelulosa y se visualizan con ExtrAvidin conjugada con HRPO (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) usando reactivos Renaissance Chemiluminiscent Reagents (NEN, Cambridge). Se realizan reprecipitaciones en lisados Brij 96 preparados a partir de células SCC biotiniladas en la superficie. Después de cinco lavados con el tampón para inmunoprecipitación, los complejos de proteína se disocian con 0,5% de SDS añadido al tampón de inmunoprecipitación. A continuación los eluidos se diluyen 1:1 con tampón de inmunoprecipitación y se re-precipitan con los anticuerpos apropiados acoplados directamente a esferas de Sepharose. Después se procesan las muestras como se describió anteriormente.

Para el entrecruzamiento, las células se tratan con DTSSP, un agente de entrecruzamiento impermeable de la membrana o DSP. Después de la solubilización en tampón de inmunoprecipitación suplementado con 0,2% de SDS, los complejos de proteína se inmunoprecipitan como anteriormente y se analizan bajo condiciones reductoras.

Las proteínas de la superficie de la membrana son co-precipitadas consistentemente con anticuerpos anti-coligina/Hsp47. En estudios de entrecruzamiento, las células SCC y LL/2 son pretratadas primero con un agente de entrecruzamiento clivable, DSP, después se marcan en la superficie con biotina o ^{125}I y se lleva a cabo la subsiguiente inmunoprecipitación bajo condiciones rigurosas para romper la asociación no covalente entre Hsp y la proteína tetraspanina. Un complejo de coligina/Hsp47-CD9 es inmunoprecipitado usando mAbs (anticuerpos monoclonales) anti-CD9 o bien anticuerpos anti-coligina/Hsp47. Una banda característica de 47K se detecta fácilmente en todos los inmunoprecipitados de anti-CD9 y una banda de proteína de \sim 22K, de tamaño similar a CD9 o CD81 es co-precipitada con anti-coligina/Hsp47. Sin embargo, cuando se realizaron experimentos similares con mABs anti-CD81, no se identificó la coligina/Hsp47 en los inmunoprecipitados. No obstante, la re-inmunoprecipitación de los inmunoprecipitados de CD9 con anti-coligina/Hsp47 tiene por resultado una banda de 47K en todas las células SCC y líneas celulares LL/2. Para verificar si las regiones extracelulares de Hsp47 y CD9 interaccionan directamente, se realizan experimentos de entrecruzamiento similares usando DTSSP, un agente de entrecruzamiento impermeable a la membrana. El tratamiento de células intactas SCC y LL/2 con DSP o bien con DTSSP tiene por resultado la co-inmunoprecipitación de CD9 y coligina/Hsp47. El tratamiento con amilorida 1 mM potencia en gran medida la cantidad de coligina/Hsp47 recuperada después de la inmunoprecipitación sin alterar el perfil de las proteínas precipitadas.

Ejemplo 4 Invasión de células tumorales y fagocinesis A: Ensayo de migración con oro coloidal

Se cultivan en placa células tumorales sobre portaobjetos con cámaras pre-recubiertos con una mezcla de 80 \mug/ml de colágeno de tipo I, 100 \mug/ml de Matrigel®, o 100 \mug/ml de laminina-5 y partículas coloidales de oro, y se incuban en medio con o sin varios anticuerpos. Los portaobjetos con cámaras recubiertos con oro coloidal se preparan como se describe en Albrecht-Buehler ((1977), Cell 12, 333-339) con modificación para queratinocitos y la inclusión de proteínas matriz (Woodley et al., (1988) J. of Cellular Phys. 136, 140-146; Kim et al., (1994) Laboratory Investigation 71, 401-408; Kim et al., (1994) J. of Biol. Chem. 269, 26.926-26.932). Se añaden células SCC o LL/2 a cada cámara y 20 minutos más tarde se eliminan las células no adherentes y se reemplaza el medio. Los cultivos se mantienen durante 24 horas y después se fijan en 1X Histochoice (Amresco, Solon, OH) durante 1 min, se lavan en PBS y se deshidratan mediante etanoles graduados. Las áreas carentes de partículas de oro identifican las pistas fagocinéticas. El índice de migración se determina usando software de análisis de imágenes midiendo el área de las pistas fagocinéticas asociadas con las células en campos aleatorios bajo iluminación de campo oscuro a 100 X (Pilcher et al., 1997) J. Cell Biol. 137, 1445-1457. Se cuentan todas las células de un campo y para cada experimento se cuentan 25 células. Para cada experimento, todas las condiciones se hacen por triplicado.

B: Ensayo de invasión de células tumorales

Se modifica un ensayo in vitro según el descrito con anterioridad por Chu et al. (1993) Proc. Nat'l. Acad. Sci. 90, 4261-4265, utilizando Matrigel®, una membrana basal reconstituida. En esencia, una cámara de Borden modificada que contiene un filtro de policarbonato libre de polivinilpirrolidona de 8 \mum de porosidad, se pre-recubre con Matrigel® (Collaborative Biomedical Products, Becton Dickinson, Bedford, MA). El pocillo inferior de la cámara se llena después con medio libre de suero que contiene 500 \mul de medio acondicionado con células 3T6 como quimioatrayente. El pocillo superior se siembra entonces con 200 \mul de suspensión de células a razón de 1,0 x 10^{4} células por cámara más aditivos, según se indica. Las cámaras se incuban después a 37ºC durante 24 horas. Las células no invasivas se retiran de la superficie superior de la membrana con una torunda de algodón, y la cámara se incuba en 3 ml de Dispase (Collaborative Biomedical Products, Becton Dickinson, Bedford, MA) durante 2 horas, y la reacción se paraliza con EDTA 10 mM. Las células resultantes contenidas en Matrigel®, así como las células de la cámara inferior, se cuentan en un contador Coulter. Los datos se expresan como porcentaje de invasión a través de la matriz y membrana relativo a la migración a través de la membrana testigo. El "índice de invasión" se expresa como la relación del porcentaje de invasión de una célula de ensayo sobre el porcentaje de invasión de una célula testigo.

El tratamiento global y los efectos de grupo se evalúan usando un análisis de varianza (ANOVA), con comparaciones post-hoc basadas en el test de Newman-Keuls (p \leq 0,05). La asociación del marcaje de fluorescencia de Hsp47 medio con el índice de invasión se evalúa usando el coeficiente de correlación no paramétrico de orden de rango de Spearman (coeficiente \rho).

El uso de cámaras de Borden modificadas para valorar la invasión de células tumorales revela que las células SCC y las células LL/2 muestran una varianza significativa en los índices de invasión entre las líneas celulares. Esta varianza se asocia con el nivel de coligina/Hsp47 expresada en la superficie de la célula. Después se realizan ensayos en cámara en los que las células se incuban en presencia de anticuerpos dirigidos contra CD9, CD81 y coligina/Hsp47. Las células incubadas en cámaras de Matrigel® con anti-coligina/Hsp47 tienen por resultado un incremento en el índice de invasión, mientras que la incubación con anticuerpos anti-CD9 o anti-CD81 no tiene efecto y es similar a los testigos. El tratamiento con amilorida en cada instante reduce drásticamente el índice de invasión en todas las líneas de células tumorales. Sin embargo, las células tratadas con amilorida no son afectadas por el tratamiento con anticuerpos anti-coligina/Hsp47.

Los resultados de migración de células SCC en ensayos con oro coloidal son paralelos a los resultados obtenidos a partir de los ensayos en cámaras de Borden, pero dependen de si el oro coloidal contiene Matrigel®, colágeno o laminina-5. El índice de migración fagocinética de las células SCC es el más alto en laminina-5, seguida por colágeno y Matrigel®. En particular, las pistas de migración son más anchas y largas en oro coloidal recubierto con laminina-5 que las observadas en colágeno o Matrigel®. Se observa que los índices de migración fagocinética en ambas matrices, colágeno y Matrigel®, aumentan después del tratamiento con anticuerpos anti-coligina/Hsp47, pero no son afectados después del tratamiento con anticuerpos anti-CD9. Los índices fagocinéticos no son afectados después del tratamiento con superficies recubiertas con anti-coligina/Hsp47 o laminina-5.

Ejemplo 5 Identificación y análisis de péptidos de unión de Hsp47

A. Inmunopurificación por afinidad de una biblioteca de péptidos: Se usan dos bibliotecas de bacteriófagos con insertos de heptapéptido aleatorio (Ph. D.-7, New England Biolabs; Beverly, MA) o dodecapéptido aleatorio (Ph. D.-12, New England Biolabs; Beverly, MA) en el término N de la proteína pIII. La biblioteca Ph. D.-7 consiste en 2,8 x 10^{9} secuencias electroporadas amplificadas una vez para dar \sim70 copias de cada secuencia en 10 \mul de fago suministrado. La biblioteca Ph. D.-12 consiste en \sim2.7 x 10^{9} secuencias electroporadas amplificadas una vez para dar \sim55 copias/10 \mul de fago suministrado.

B. Selección de bacteriófagos de unión de Hsp47 por inmunopurificación de afinidad

Los bacteriófagos que exponen péptidos reconocidos por Hsp47 se identifican usando los kits Ph. D.-7 o Ph. D.-12 y protocolos modificados para una diana biotinilada. En esencia, 96 pocillos de una placa de mitrotítulo se recubren con 15 \mul de estreptavidina (1 mg/ml) en 135 \mul de NaHCO_{3} 0,1 M pH 8,6, con agitación suave en una cámara humidificada, durante la noche, a 4ºC. Después de eliminar la solución de estreptavidina, los pocillos se lavan tres veces con TBS que contiene 0,05% de Tween 20 (TBS-Tween) y después se bloquean por incubación durante 1 h a 37ºC con 1% de BSP en PBS que contiene 0,1 \mug/ml de estreptavidina.

A continuación, los fagos se complejan con Hsp47 biotinilada añadiendo 0,1 \mug de Hsp47 biotinilada y 2 x 10^{11} pfu (unidades formadoras de placas) del fago input en 400 \mul de TBS-Tween, y se incuban durante 60 minutos. Las soluciones de complejo fago-diana se añaden después a las placas bloqueadas y lavadas, y se incuban a temperatura ambiente durante 5 minutos, para desplazar el fago de unión de estreptavidina. Los fagos que no se unen se desechan y las placas se lavan 10 x con TBS-Tween (0,1%). Después se tratan los pocillos con 15 \mul de Tris-HCl 1 M pH 2,2 que contiene 1 mg/ml de BSA, durante 5 minutos, para eluir el Hsp47-fago. Las muestras se neutralizan con Tris-HCl 1 M pH 9,1 y se amplifican por adición a 20 ml de cultivo ER 2537 incubado a 37ºC, agitando vigorosamente durante 4,5 horas. Después se transfieren los cultivos a tubos nuevos y el fago se precipita con 1/6 de volumen de PEG/NaCl a 4ºC durante la noche. A 4 ml de medio LB se inocula una colonia individual de ER2537 y después se incuba a 37ºC con agitación vigorosa hasta que el cultivo alcanza la fase log media (D.O._{600} \sim 0,5). Se obtiene un sedimento por centrifugación durante 15 minutos a 10.000 rpm y 4ºC. El sedimento se suspende en 1 ml de TBS y se centrifuga durante 5 minutos a 10.000 rpm y 4ºC. El sobrenadante se transfiere a un tubo nuevo y se precipita con 1/6 de volumen de PEG/NaCl en hielo durante 1 hora. Después de la centrifugación el sedimento se resuspende en 200 \mul de TBS. El eluido se titula y se cultiva en placas LB/IPTG/XGal y se incuba durante la noche. Dado que el fago de la biblioteca se deriva del vector de clonación común M13mp19, que lleva en gen lacZ\alpha, las placas de fago aparecen azules cuando se cultivan en placa en medios que contienen Xgal y IPTG. Las colonias azules se seleccionan para secuenciación o se usan para una segunda tanda de inmunopurificación. Como testigo se usa estreptavidina como diana y después de tres tandas de inmunopurificación para verificar una secuencia consenso para péptidos de unión de
estreptavidina.

C. Cribado para bacteriófagos de unión de Hsp47

Clones de colonias azules procedentes de placas que contienen 50-200 colonias se transfieren a filtros de nitrocelulosa. Las bacterias se lavan de los filtros con PBS que contiene 0,05% de Tween 20 y 1% de albúmina de suero bovino, y los filtros se incuban después durante 30 minutos en el mismo tampón, antes de lavar tres veces con PBS-Tween. Después de una incubación durante 1 hora en 5 ml de Hsp47 biotinilado (0,1-2 \mug/ml en PBS-Tween), los filtros se lavan de nuevo tres veces con PBS-Tween. Las posiciones de los clones que han segregado bacteriófagos que unen Hsp47 se localizan después por uno de dos métodos: los filtros se incuban con 5 ml de estreptavidasa conjugada con fosfatasa alcalina (dilución 1/10.000 en PBS-Tween; Pierce, Rockford, IL) durante 1 hora a temperatura ambiente, antes de un lavado extensivo con PBS-Tween, o los filtros se incuban durante 1 hora en 5 ml de un anticuerpo anti-biotina (dilución 1/50.000 en PBS-Tween, Pierce, Rockford, IL), se lavan y se incuban con un anticuerpo de conejo anti-inmunoglobulina de cabra conjugado con fosfatasa alcalina (dilución 1/5.000 en PBS-Tween, Pierce, Rockford, IL). En cada caso, la actividad de la fosfatasa alcalina se revela usando una mezcla de nitroblue tetrazolio y 5-bromo-4-cloro-3-indolilfosfato tolidio (Bethesda Research Labs., Rockville, MD) como sustrato.

D. Determinación de la secuencia de péptidos expuestos por bacteriófago

Los DNAs monocatenarios de bacteriófago una cadena se purifican y se secuencian como un oligonucleótido -96 primer (5'-CCCTCATAGTTAGCGTAACG-3') (SEQ ID NO: 63). Las reacciones de secuenciación se llevan a cabo usando un ABI Prism Modelo 373 Version 3.0.

E. Programa para puntuar péptidos de unión de Hsp47

Las bibliotecas de partida y las seleccionadas se comparan de una manera dependiente de la posición. Se realiza un análisis estadístico por máxima probabilidad y remuestreo bootstrap. Este revela la distribución de restos por la posición en péptidos de unión de Hsp47 en comparación con péptidos de la biblioteca original. Para codificar las preferencias obtenidas anteriormente, se usa un sistema de puntuación previamente descrito para BiP (Cwirla et al. (1990) Proc. Nat'l. Acad. Sci 87, 6378-82) para predecir los sitios de unión de Hsp47 en polipéptidos sintéticos y de origen natural. Al hacer esto se da una puntuación a cada uno de los 20 aminoácidos posibles en cada posición de la secuencia núcleo de 7 restos. Estas puntuaciones se derivan de las veces de diferencia en la abundancia global de cada resto en los péptidos expuestos por las poblaciones de bacteriófagos seleccionadas y no seleccionadas. La puntuación para cada una de las secuencias de siete restos en cada heptapéptido se determina como se describió previamente (Cwirla et al., ibid).

Para validar el conjunto de puntuaciones de las secuencias de unión de Hsp47 es necesario un segundo conjunto de secuencias de unión de Hsp47 que no sea parte de la base de datos usada para generar la matriz de puntuación. Para realizar esto se usa una segunda biblioteca consistente en bacteriófagos recombinantes independientes que exponen dodecapéptidos aleatorios (Ph. D-12, New England Biolabs, Beverly, MA). Las secuencias se comparan entonces mediante BLAST iterado específico de la posición, Pattern-Hit Initiated BLAST (PHI BLAST) (BLAST iniciado por acierto de un patrón) y secuencias BLAST 2 unas frente a otras (NCBI). Además, se comparan los perfiles hidropáticos de dos péptidos usando la base de datos del Weizmann Institute of Sciences Genome and Bioinformatics.

F. Análisis de los péptidos de unión de Hsp47

Se usan dos bibliotecas de bacteriófagos con insertos de heptapéptido o dodecapéptido aleatorios en el término N de la proteína pIII; la primera en ser estudiada es la biblioteca de heptapéptidos. Se escogen al azar 70 clones de bacteriófagos individuales entre la biblioteca no seleccionada, y las secuencias de aminoácidos de los insertos de heptapéptido variables se deducen de las secuencias de nucleótidos de la correspondiente región de codificación. Todos los aminoácidos están representados, aunque sus frecuencias no siempre corresponden a las esperadas de los números relativos de codones que codifican cada resto.

Las secuencias de heptapéptidos expuestas por 54 bacteriófagos de unión de Hsp47 obtenidos por inmunopurificación se determinan por análisis de la secuencia de DNA de la correspondiente región del genoma del bacteriófago. Las secuencias peptídicas de los 54 clones que unen Hsp47 se consideran primeramente como una sola población y se comparan con las procedentes de los 70 clones escogidos al azar de la biblioteca de partida. La tabulación de los valores de hidrofilicidad de los bacteriófagos que unen Hsp47 revela dos poblaciones generales de péptidos que son elegidos por inmunopurificación. Un grupo de péptidos está representado por péptidos hidrófilos y el otro por un grupo hidrófobo de péptidos más pequeño.

La comparación de la composición global en aminoácidos de las dos poblaciones de heptapéptidos, seleccionada y no seleccionada, revela que la asparagina (N), treonina (T), tirosina (Y) y prolina (P) están particularmente enriquecida, mientras que la fenilalanina (F), ácido aspártico (D) y arginina (R) están reducidas significativamente. Sin embargo, cuando se consideran individualmente, el grupo hidrófobo de péptidos está claramente enriquecido en triptófano y leucina, así como en valina y alanina.

El espaciador de cinco restos que une los heptapéptidos variables a la proteína pIII madura no contiene restos enriquecidos. La inspección de los péptidos hidrófobos seleccionados revela un motivo de restos mejor descrito como XHyHyXXXHyHy, en donde Hy es un aminoácido hidrófobo grande (normalmente W, L o F) y X es cualquier aminoácido. Este motivo núcleo se identifica también en los restos seleccionados a partir de una biblioteca Ph. D-12 representada por un motivo XHyHyXXHyXXXXHyHy. Motivo péptido descrito como XXHyHyXXX describe mejor los péptidos hidrófilos seleccionados entre la biblioteca. Curiosamente, también puede identificarse un motivo núcleo similar (HyXXXHyHyXXHyXXX) en restos seleccionados entre la biblioteca de dodecapéptidos. Sin embargo, un pequeño número de péptidos carecen totalmente de restos hidrófobos aunque son seleccionados durante la inmunopurificación de Hsp47.

Se realizan análisis con el programa BLAST para valorar la homología de secuencias entre los péptidos expuestos por bacteriófago y procolágeno I y los dodecapéptidos seleccionados. Se observa poca homología específica basándose solo en la secuencia. Sin embargo, cuando el perfil hidropático del procolágeno I (1) se compara con los dodecapéptidos obtenidos a partir de tres tandas de inmunopurificación usando el método de Kyte-Doolittle de cálculo de la hidrofilicidad sobre una longitud de ventana de 7, todos los péptidos expuestos por el fago están representados por regiones específicas dentro de la molécula de procolágeno. La mayor parte de los péptidos hidrófobos (véase la Tabla 1)se localizan en regiones dentro de la región N-propéptido (restos 59-71) o la región C-propéptido (restos 1344-1445). En cambio, la mayoría de los péptidos hidrófilos (véase la Tabla 2) se localizan en regiones con la región helicoidal del procolágeno (restos: 283-295, 470-482, 666-678, 727-739, 1040-1052 y 1087-1099) con solamente un péptido localizado en una secuencia dentro de la región N-propéptido (restos 100-112).

Ejemplo 6 Localización subcelular del fago de unión de Hsp47 (HBP) en células tumorales

Se han realizado estudios usando las líneas de células SCC4, SCC9, SCC15 y SCC25 como se describió anteriormente, y una línea de células de queratinocito transformada normal oral GMSM-K que es cortesía del Dr. V. Murrah (UNC, Chapel Hill, NC). Se obtienen células de carcinomas de mama [HTB126, HTB127] y normales HTB125 de la ATCC. Además, las líneas de células de próstata PC-3, LNCaP y PZ-HPV son cortesía del Dr. R. Franklin (UM, Baltimore, MD).

A. Análisis de citometría de flujo: Los anticuerpos contra Hsp47 se describieron anteriormente, al igual que los métodos para conjugarlos con fluoresceína o Rojo Texas. El anticuerpo monoclonal anti-M13 se obtiene de Amersham Pharmacia Biotech (Piscataway, NJ). El análisis citométrico se realiza como se describió antes.

Se incuban 25 \mul de HBP con 10^{6} células (SCC4, SCC9, SCC15, SCC25, HTB126, HTB127, PC-3 y LNCaP) en medios durante 1 hora a 37ºC. Después se lavan las células 3 veces con TBS-Tween y el HBP se tiñe con anticuerpos FITC-anti-M13 y se analizan por citometría de flujo. Estos estudios revelan que las líneas de células tumorales no permeabilizadas (SCC4, SCC9, SCC15, SCC25, HTB126, y PC-3) poseen niveles variables de tinción de fago M13 sobre sus superficies celulares. Además, si las células son permeabilizadas antes de la adición del anticuerpo, entonces el teñido de la superficie de la célula acoplado con el fago internalizado revela una tinción aumentada. Sin embargo, la GMSM-K, una línea de células epiteliales establecida, tratada de igual manera, revela una escasa o nula tinción. Resultados similares a los obtenidos para las células GMSM-K se obtienen también para las líneas de células normales HTB125 y PZ-HPV de mama y próstata, respectivamente.

B. Análisis de inmunoprecipitación: Para verificar la asociación del fago de unión de M13 con líneas de células específicas, las células SCC4 y GMSM-K se tratan con un HBP durante 1 hora, después se lavan 3 veces con TBS-Tween y las membranas del plasma se aíslan y se inmunoprecipitan con anticuerpos anti-M13. Esto produce dos bandas de proteína, una con un Mr = 47k y otra con un Mr = 27k. La banda de 47k se identifica como Hsp47 por análisis de transferencia Western.

C. Inmunofluorescencia y microscopía confocal 1. Inmunofluorescencia y microscopía confocal

La microscopía de inmunofluorescencia se lleva a cabo como se describió anteriormente. Para visualizar la Hsp47 de la superficie de la célula o el bacteriófago M13, las células no se permeabilizan sino que se tratan y se fijan con 1% de paraformaldehído como se describe para los análisis citométricos. Sin embargo, para prevenir la unión no específica, las células se bloquean con 10% de suero de cerdo en PBS durante 1 hora. Después se incuban las células con anticuerpos anti-Hsp47 o anti-bacteriófago M13 (Amersham Pharmacia-Biotech, Piscataway, NJ), se lavan con PBS y se incuban durante 1 hora con IgG anti-conejo de cabra conjugada con fluoresceína o bien con rojo Texas. Se montan cubreobjetos en medio de montaje que contiene un agente antiblanqueo (Kirkegaard and Perry Laboratories, Inc.; Gaithersburg, MD). Las células se examinan bajo un fotomicroscopio Zeiss II equipado con epifluorescencia. Las células no tratadas con anticuerpos primarios se usan como controles negativos.

Las imágenes confocales se recogen usando un microscopio confocal Zeiss LSM410. Se usa un FT de 488/568 con un filtro de barrera de 590 para detectar la tinción con rojo Texas, y un FT de 560 con una barrera a 515-540 para generar imágenes marcadas con fluoresceína. Las imágenes digitales se recogen en un Zip drive y se generan figuras usando software Adobe Photoshop 3.0 (Adobe Systems Inc. Mountain View, CA). No se asocia fluorescencia con las células después de la incubación con solamente anticuerpos secundarios.

La microscopía confocal muestra el destino y la co-localización del HBP. Estos estudios revelan que cuando se tratan líneas de células tumorales con HBO, hay una distribución de tinción en la superficie de las células, en microvesículas, y una intensa tinción en una región perinuclear que es coincidente con el RE. Las células se tratan después con bacteriófago M13 seguido por doble tinción con anticuerpos rojo Texas-anti-Hsp47 y anticuerpos FITC-M13. La localización de Hsp47 es similar a la de la tinción del fago M13 y la co-localización de anticuerpos revela superposición, matices amarillos, de los patrones tanto de tinción de M13 como de tinción de Hsp47.

2. Lisosomas y el RE

Para marcar el compartimiento lisosomal, las células se incuban con 1 mg/ml dextrano-FITC fijable con lisina (Molecular Probes; Eugene, OR) en medio de crecimiento durante 4 horas a 37ºC en 5% de CO_{2}. Después de lavar, las células se incuban otros 30 minutos para cazar el dextrano desde los compartimientos endosomal temprano al lisosomal. Para la identificación de los compartimientos endosomales temprano y de reciclaje, las células se incuban en medio libre de suero que contiene 50 \mug/ml de FITC-transferrina (Molecular Probes; Eugene, OR) durante 30 minutos a 37ºC en 5% de CO_{2}. Después de tratamientos para identificar los compartimientos subcelulares específicos, las células se fijan y se procesan para inmunofluorescencia y/o microscopía confocal.

Las células se cultivan en presencia de dextrano conjugado con FITC, seguido de un periodo de caza de 30 minutos para eliminar el dextrano de los compartimientos endosomales tempranos antes de la fijación y la inmunotinción con los anticuerpos anti-M13 conjugados con rojo Texas. Las células SSC4, que son representativas de las otras líneas celulares, demuestran una clara identificación de FITC-dextrano a estructuras vesiculares, si bien la tinción de HBP está limitada principalmente a vesículas puntiformes en el citoplasma y una zona perinuclear. Para verificar que el HBP no está direccionado significativamente a los lisosomas, se alimentan células SCC4 con esferas de látex y HBP y después se fijan y se procesan para inmunofluorescencia usando anticuerpos anti-M13. En las células SCC4, la señal de M13 no puede ser localizada en el periferia de la esfera, lo que sugiere que hay una asociación mínima con los fagosomas.

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Para marcar los endosomas, se cultivan células SCC4 y GMSM-K en presencia de transferrina conjugada con FITC o conjugada con rojo Texas antes de la fijación y la tinción con anticuerpos anti-M13. El análisis por microscopía confocal indica que la transferrina tiñe tanto la membrana del plasma (tinción en anillo en el borde de las células) como los endosomas de reciclaje (tinción puntiforme subcelular). Un patrón muy similar y coincidente se observa para la tinción con anticuerpo M13, por consiguiente la superposición de las dos imágenes indica la colocalización (matices amarillos) de las dos señales en la región subcelular puntiforme y membrana del plasma. Es digno de mención que las células GMSM-K proporcionan patrones iguales de tinción con dextrano conjugado y transferrina pero no son teñidas por anticuerpos anti-M13.

D. Fraccionamiento subcelular

Las membranas del plasma se fraccionan como se describió anteriormente.

Las fracciones de la membrana se caracterizan por la distribución de la actividad de 5'-nucleosidasa, un marcador de la membrana del plasma. Las membranas del plasma se someten directamente a PAGE y análisis de transferencia Western blot. Para los análisis de Western blot las proteínas que han corrido en la SDS-PAGE son inmediatamente electrotransferidas a papel de nitrocelulosa y bloqueadas con 10% de leche seca no grasa (NFDM). El antisuero o suero perinmune se diluye 1:2000 en el mismo tampón y se incuba con agitación suave durante la noche. La nitrocelulosa se aclara después tres veces durante 5 minutos en TBS/Tween. Los anticuerpos contra Hsp47 y bacteriófago M13 se detectan con proteína A marcada con [^{125}I] (New England Nuclear, Boston, Mass) o por análisis de Western blot.

F. Síntesis de péptidos

Se preparan heptapéptidos y dodecapéptidos mediante síntesis en fase sólida de flujo continuo y se analizan mediante cromatografía de líquidos de alta presión y espectrometría de masas, como se describió anteriormente (Cwirla et al., ibid).

Ejemplo 7 Determinación de la eficacia de los péptidos de unión de Hsp47 y anticuerpos monoclonales Hsp47 en la anidación de fármacos quimioterapéuticos a sitios tumorales en xenoinjertos de carcinoma escamoso oral

A. Efecto de péptidos de anidación en tumores de Hsp47 conjugada con doxorrubicina y anticuerpos monoclonales Hsp47 sobre el progreso del tumor: Se usa la doxorrubicina como compuesto modelo para mostrar que la anidación de fármaco a Hsp47 de la superficie de la célula en tumores bien diferenciados reduce de forma efectiva la dosis de fármaco requerida para una respuesta del tumor, o aumenta la eficacia de un fármaco en el índice quimioterapéutico en un modelo de xenoinjerto de carcinoma de células escamosas orales humanas.

B. Conjugados de anticuerpo monoclonal Hsp47 y doxorrubicina: Los inmunoconjugados de doxorrubicina se formulan usando un enlazador de malonato. En esencia, el anticuerpo monoclonal se conjuga con enlazador BAMME-CH DMB en tampón de borato 0,5 M en presencia de dimetilformamida. Después de una purificación cromatográfica, el anticuerpo funcional es desbloqueado mediante la adición de carbohidrazida 100 mM y se purifica cromatográficamente. Finalmente, el anticuerpo funcional desbloqueado se hace reaccionar con doxorrubicina 10 mM y se purifica cromatográficamente. Se ha demostrado que conjugados similares mantienen la inmunorreactividad del anticuerpo y tienen una potencia equivalente a la doxorrubicina libre no conjugada sin manifestar toxicidad, como se determina por la pérdida de peso y muertes en un modelo de xenoinjerto en ratones atímicos.

C. Conjugados de doxorrubicina con proteína de unión de Hsp47: Los péptidos Hsp47 son sintetizados por el UM Biopolymer Laboratory Core Laboratory y se purifican mediante cromatografía de líquidos de alto rendimiento. Los péptidos se conjugan con doxorrubicina (Aldrich) con 10-etil-3-(3-dimetil-aminopropil) carbodiimide hidrocloruro (EDC, Sigma) y N-hidroxisuccinimida (NHS, Sigma). Los conjugados se liberan después de las sustancias reaccionantes mediante filtración en gel en Sephadex G25. La presencia de fármaco libre se monitoriza mediante HPLC y resonancia magnética nuclear y se observa que es menos del 5% del preparado.

D. Farmacocinética de la distribución de doxorrubicina como fármaco libre, conjugado de péptido y conjugado de anticuerpo monoclonal

1. Animales y administración del fármaco: Ratones adultos libres de patógenos específicos (de 5 a 6 semanas de edad) se mantienen bajo condiciones de albergue convencionales. Dosis intravenosas en bolo de fármaco, doxorrubicina libre, doxorrubicina conjugada con péptido y doxorrubicina conjugada con anticuerpo monoclonal, son administradas por una vena lateral de la cola.

2. Muestreo: Se toman muestras de sangre a los 5, 10, 15, 30, 45, 60, 90, 120, 180, 240, 360, 480, 960 y 1440 minutos después de la dosificación. Además, se recogen corazones, pulmones, hígados, riñones, bazos, músculos esqueléticos (estriados) y tumores a los mismos tiempos que las muestras de sangre. En cada estudio, la sangre y los tejidos de ratones sacrificados 5 minutos después de suministrar el vehículo sirven como testigos. La sangre se recoge por punción cardíaca en jeringuillas heparinizadas, se transfiere a tubos de centrífuga Eppendorf y se guardan en hielo hasta que son centrifugados a 13.000 x g durante 5 min, para obtener el plasma. Los tejidos son rápidamente disecados, se mantienen en hielo hasta que son pesados y después se congelan frescos en nitrógeno líquido. El plasma, los tejidos y las soluciones de dosificación se guardan congelados a -70ºC hasta el análisis.

3. Análisis de doxorrubicina: Las concentraciones de doxorrubicina en plasma y tejido se determinan mediante cromatografía de líquidos de alto rendimiento (HPLC). Las muestras de plasma se extraen por procedimientos convencionales. Muestras de plasma de 200 \mul se mezclan con patrón interno (4'-epidoxorrubicina) y después se mezclan vigorosamente con 0,6 ml de cloroformo/2-propanol (1:1, v/v) durante 15 segundos. Se añade sulfato amónico (aproximadamente 0,5 g) al gel resultante y se mezcla intensamente. La mezcla trifásica se centrifuga durante 15 minutos a 13.000 x g. La fase superior resultante se transfiere a un tubo de ensayo cónico y se seca bajo un chorro de N_{2}. El residuo seco se redisuelve en 100 \mul de fase móvil, se pasa a viales de muestreador automático, y se inyectan 75 \mul en el sistema de HPLC descrito más adelante.

Las muestras de tejido se descongelan, se pasan inmediatamente a tubos de polipropileno de 17 x 100 mm que se conservan en un baño de hielo, y se homogeneizan usando un Polytron (Brinkman Instruments, Westbury, NY), en partes (peso a volumen) de solución salina tamponada con fosfato (KH_{2}PO_{4} 1,2 mM, Na_{2}HPO_{4} 2,9 mM, NaCl 154 mM, pH 7,4, Biofluids, Inc., Rockville, MD). Una parte de cada homogeneizado se mezcla después con patrón interno, se extrae con cloroformo/2-propanol, y se prepara para la inyección en el sistema de HPLC.

El sistema de HPLC usado incluye un muestreador automático Hewlett-Packard (Palo Alto, CA) modelo 1100 y una bomba Waters (Milford, MA) M45. La columna empleada es una columna ALLTECH (Deerfield, IL) 10 \mum Cl8 Econosil (250 mm de longitud, 4,6 mm de diámetro interior). La fase móvil consiste en acetonitrilo: ácido ortofosfórico 0,32 M (27: 43, v/v) y se bombea a razón de 1 ml/min. El eluyente de la columna se monitoriza con un juego de fluoromonitor Amicon a una longitud de onda de excitación de 470 nm y una longitud de onda de emisión superior a 500 nm. Con este método se consigue una buena separación de doxorrubicina, doxorrubicinol y patrón interno, con un tiempo de retención de 12,5, 7 y 15 minutos, respectivamente. El límite inferior de cuantificación es 0,1 nm. La señal del detector es procesada con un integrador Hewlett-Packard 3392 para integrar el área bajo cada pico. La concentración de doxorrubicina de cada muestra se calcula determinando la relación del área del pico de doxorrubicina a la del correspondiente pico del patrón interno, y comparando esta relación con una curva de calibración realizada de forma concomitante, preparada en la matriz apropiada.

4. Análisis farmacocinético: La variación de las concentraciones de plasma frente al tiempo se analizan por ambos métodos, no compartimental y compartimental. El área bajo la curva (AUC) desde cero hasta infinito y la vida mitad terminal (T_{1/2} ) se estiman por análisis no compartimental con la función de LaGrange, como se ha puesto en práctica con el programa de ordenador LAGRAN. CL_{tb} se calcula a partir de la definición:

CL_{tb} = Dosis/AUC

y el volumen de distribución en estado estacionario (V_{DSS}) se calcula a partir de la fórmula:

(V_{DSS}) = CL_{tb}/kel

Además, las concentraciones individuales de doxorrubicina en plasma frente al tiempo se ajustan a modelos compartimentales con el programa ADAPT II que usa un simplex Nelder Mead como algoritmo. Se ajustan a los datos modelos lineales, abiertos, de dos y tres compartimientos. La discriminación del modelo se basa en los Criterios de Información de Akaike (AIC) definidos como:

AIC - 2p + n(ln \ WSSR)

en donde p representa el número de parámetros del modelo, n es el número de observaciones y WSSR representa la suma ponderada de los cuadrados de los residuos.

E. Tratamiento de ratones que tienen tumores con fármacos de anidación de Hsp47: Ratones con tumores de tamaño coincidente (aprox. 1 cm^{3}) se aleatorizan en seis grupos de tratamiento de no menos de seis animales por grupo: vehículo solo, doxorrubicina libre, péptido de unión doxorrubicina-Hsp47, péptido no de unión doxorrubicina-testigo, conjugado doxorrubicina-monoclonal, anticuerpo monoclonal Hsp47. Los análisis de poder estadístico indican que se requieren al menos 6 animales por grupo para ver una diferencia de supervivencia del 30%. Generalmente, la dosificación de doxorrubicina en ratones atímicos con xenoinjertos humanos es de 50 a 200 \mug/semana). Como la anidación del fármaco al tumor es más efectiva que el fármaco libre, se realizan estudios iniciales con dosificaciones de 5, 10 y 15 \mug/semana. La concentración de doxorrubicina como equivalentes se ajusta midiendo la absorbancia de fármaco y conjugados a 490 nm y una curva de calibración establecida para determinar equivalentes de péptido y conjugados monoclonales. La fracción de animales supervivientes se determina en el curso de 40 días y se representa en forma de curva de supervivencia de Kaplan-Meier. La supervivencia se determina examinando a los animales diariamente para determinar la mortalidad. A continuación, se realiza un experimento de escalado de dosis en el que los ratones son tratados con doxorrubicina-péptido de unión de Hsp47 y anticuerpos monoclonales Hsp47 conjugados con doxorrubicina a una dosis de 30 \mug de equivalente de doxorrubicina cada 21 días durante 84 días. Se construye una curva de supervivencia de Kaplan-Meier. Además, después de la necropsia, se determinan el peso y el tamaño del tumor primario, y se establece la presencia de ganglios linfáticos y metástasis pulmonares. El peso de los ganglios linfáticos y de los pulmones se mide también como medida global de metástasis apoyada por evaluación histológica.

Para determinar la toxicidad, la dosificación del fármaco se escala a 200 \mug de equivalente de doxorrubicina por ratón. Los ratones que reciben dosis elevadas de fármaco reciben una dosis individual de doxorrubicina libre, doxorrubicina-péptido de unión de Hsp47 o doxorrubicina-anticuerpo monoclonal Hsp47. Los animales son después seguidos durante 14 días y la fracción media de animales se representa en una curva de supervivencia de Kaplan-Meier.

Los animales tratados con conjugados de doxorrubicina de anidación en el tumor sobreviven más tiempo para dosis equivalentes de fármaco más bajas que los animales que reciben fármaco libre. Además, junto con una mayor supervivencia está una reducción en el tamaño del tumor en cuanto a peso, ganglios linfáticos y metástasis. Si el anticuerpo monoclonal Hsp47 no conjugado tiene él mismo un efecto inmunoterapéutico en la mediación de una respuesta contra el tumor, esto es evidente solamente en el modelo C57BL, ya que los ratones atímicos inmunodeficientes no responden de tal manera y el uso de testigos no conjugados.

De la descripción que antecede, un experto en la técnica puede determinar fácilmente las características esenciales de la presente invención y, sin apartarse del espíritu ni del alcance de la misma, puede introducir cambios y modificaciones de la invención para adaptarla a varios usos y condiciones.

Sin más elaboración, se cree que, usando la descripción precedente, un experto en la técnica puede utilizar la presente invención en su más amplia extensión. Por consiguiente, las realizaciones preferidas específicas que anteceden han de considerarse como meramente ilustrativas y de ningún modo limitantes del resto de la descripción.

La descripción completa de todas las solicitudes, patentes y publicaciones citadas anteriormente y en las figuras, se incorporan al presente texto como referencia.

Apéndice I

Motivos de unión de CPB2 una diana potencial de la superficie celular para células de carcinoma

Abreviaturas: CPB2: proteína 2 de unión a colágeno; RE: retículo endoplasmático; ATCC: American Type Culture Collection; TBS: solución salina tamponada con Tris; PBS: solución salina tamponada con fosfato; PEG: polietilenglicol; FITC: isotiocianato de fluoresceína.

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Previamente se ha señalado (J. Cellular Biochem., 1999) que entre muchas líneas de células el producto génico de CPB2, Hsp47, esquiva a su receptor de retención, erd2P, con el resultado de la aparición de Hsp47 en la superficie de la célula asociada con la proteína tetraspanina CD9. En tanto que Hsp47 posee una hendidura de unión altamente restringida, se usaron bibliotecas de exposición de péptidos aleatorios para caracterizar péptidos que se unen a Hsp47 y después para direccionar esta proteína en líneas de células de carcinoma in vitro. La comparación de los clones obtenidos de la inmunopurificación (panning) reveló poca homología específica basándose solamente en la secuencia. Para determinar si las células de carcinoma que expresan Hsp47 podrían captar selectivamente los bacteriófagos seleccionados, se emplearon las tradicionales inmunofluorescencia y microscopía confocal. Estos estudios revelaron que los péptidos de unión de Hsp47 de exposición en fago se unen a líneas de células que expresan Hsp47 y que los péptidos eran rápidamente captados a una posición coincidente con la tinción de Hsp47. Estas observaciones fueron confirmadas por análisis citométrico. Estos datos indican que el producto CBP2 puede proporcionar una diana molecular para la quimioterapia y/o formación de imágenes de enfermedades malignas.

Se sigue buscando identificar dianas de superficie celular específicas por las cuales dirigir el tratamiento o formar imágenes de células neoplásicas. Por ejemplo, un grupo de proteínas que han sido usadas como diana para el suministro de fármacos son moléculas quiméricas creadas por anomalías cromosómicas asociadas con el cáncer. Sin embargo, tales moléculas suelen ser únicas para un tumor en particular (Baron et al., 1997; Diez de Medina SG et al., 1997). Además de las proteínas antes mencionadas, fuentes potenciales de tales dianas son los productos de genes que han sido amplificados (multiplicados) en un locus cromosómico particular en el tumor maligno. Por ejemplo el locus cromosómico 11q13-14 se amplifica normalmente en cánceres humanos que incluyen cánceres de cabeza y cuello, pulmón, esófago, vejiga y mama (Schuuring et al., 1992). Este amplicón es grande, abarcando 2,5-5 Mb, y alberga varios genes con un potencial oncogénico conocido (Bekri, 1997). En el cáncer de mama este locus es amplificado en aprox. 13% de los tumores primarios mientras que en los cánceres de cabeza y cuello la amplificación puede representar del 40% al 76% de los tumores. Se ha desarrollado un mapa más detallado de esta región que indica que en 11q13 existen tantas como cinco unidades de amplificación distintas. Entre estas unidades hay un área genómica que incluye el gen GARP en 11q13.5-q14.1. La valoración de esta región, situada telomérica a CCDN1 y EMS1, ha revelado cierto número de genes en el mapa regional, concretamente CBP2 (Hsp47) y "spot 14" en el locus cromosómico 11q13.5 con CLNS1A, UVRAG y PAK1 localizados teloméricos a esta última región. Entonces, estrechando el núcleo del amplicón 11q13-q14 a un área de 350 kb que incluye D11S533 en su lado telomérico (Bekri, 1997;
Moncur, 1998).

Al evaluar el amplicón se hizo evidente que el producto génico de CBP2 estaba asociado con un grupo de tumores malignos, y puede distinguir tal grupo (Morino et al., 1997; Morino et al., 1995; Morino et al., 1994; Shirakami et al., 1995a; Shirakami et al., 1995b; Shirakami et al., 1995), así como, estando localizado en citotrofoblastos extravellosos y células caducas en la interfase materna fetal (Pak et al., 1997; Shirakami et al., 1995b; Morino et al., 1995; Morino et al., 1994; Morino et al., 1997; Shirakami et al., 1995). Curiosamente, CBP2, mapeado al cromosoma 11q13.5, comparte un locus con Spot 14, un gen clave expresado en neoplasias lipogénicas (Moncur, 1998).

Normalmente, el producto génico CBP2, Hsp47, se limita al RE-Golgi en donde primero se asocia con cadenas de procolágeno en un punto muy temprano durante la traducción de cadenas nacientes (Sauk et al., 1994). La Hsp47 es retenida dentro de estos compartimientos celulares por el reciclamiento del producto génico erd2, receptor KDEL, que se asocia con la secuencia COOH-terminus RDEL de Hsp47 (Sauk et al., 1997). Sin embargo, en algunos tumores Hsp47 se expresa independientemente de sus propiedades de chaperona ("proteína carabina") y elude o carece de este mecanismo de vigilancia y se manifiesta en la superficie de la célula, pero no se segrega al medio. Aunque estudios previos han demostrado que Hsps tales como gp96 son proteínas de membrana periféricas fuertemente unidas a la superficie, el mecanismo de anclaje preciso no estaba claro, si bien no podían excluirse interacciones iónicas con otras proteínas (Tamura Y, 1997). La Hsp47, al igual que gp96, carece de características de secuencia para farnesilación, palmitación, isoprenilación o miristilación; en consecuencia, la unión covalente también parece ser un mecanismo de anclaje improbable (Tamura Y, 1997; Altmeyer et al., 1996; Tamura Y, 1997). Curiosamente, se demostrado que la Hsp47 se asocia con la proteína tetraspanina CD9 en algunas líneas de células de carcinoma epidermoide (Hebert et al., 1999). Además, en estos casos se ha demostrado que Hsp47 es fácilmente recuperada, incluso sin usar entrecruzamiento, a partir de inmunoprecipitados de la membrana utilizando anticuerpos anti-CD9, lo que sugiere la presencia de interacciones hidrófobas entre estas proteínas (Hebert et al., 1999).

A diferencia de otras muchas chaperonas, se ha demostrado que la Hsp47 posee un número limitado de ligandos intracelulares (Nakai et al., 1989). Aunque estudios previos han definido la unión de Hsp47 a una región definida por el anticuerpo anti-propéptido SP1.D8 (Hu et al., 1995), a una región procolágeno a N-propéptidos de las cadenas \alpha1>(I) entre los restos 23-151, y a gelatina (Nagata et al., 1988), aún se han de determinar los motivos peptídicos específicos para esta unión (Hu et al., 1995).

Aquí, los autores de la presente invención exponen un repertorio de péptidos de bacteriófago obtenidos de experimentos de inmunopurificación con Hsp47. La co-localización de algunos de estos péptidos con Hsp47 en cierto número de líneas de células tumorales demuestra que los péptidos pueden ser dirigidos a una localización intracelular coincidente espacialmente con Hsp47. Estos resultados indican que la Hsp47 de la superficie de la célula no está anclada permanentemente a la superficie de la célula y que esta proteína experimenta reciclaje con un pool intracelular. Además, estos estudios sugieren que la expresión de la CBP2 en tumores puede proporcionar una diana para terapia génica dirigida a un fago, un mecanismo por el cual se suministran fármacos, o un medio para formar imágenes de enfermedades y metástasis ocultas.

Materiales y métodos

Líneas de células: Se realizaron estudios usando cierto número de líneas celulares establecidas de carcinomas de células escamosas orales humanas [SCC4, SCC9, SCC15 y SCC25] obtenidas de la ATCC, y una línea celular de queratinocitos orales normales transformada GMSM-K fue cortesía del Dr. V. Murrah (UNC, Chapel Hill, NC). Igualmente, se obtuvieron de la ATCC células de carcinomas de mama [HTB126, HTB127], y células de mama normales HTB125. Además, las líneas de células de próstata PC-3, LNCaP, y PZ-HPV fueron cortesía del Dr. R. Franklin (UM, Baltimore, MD). En los estudios presentados en el presente texto, las células se cultivaron en una mezcla 1:1 de F12 de Ham y medio de Eagle modificado por Dulbecco que contiene 10% de suero de ternera fetal, hidrocortisona (0,4 \mug/ml, Sigma) a 37ºC, en una atmósfera de aire con 5% de CO_{2}. Para las líneas de células de carcinoma de mama, se añadieron al medio 10 \mug/ml de insulina, como prescribe la ATCC y se desarrollaron células PZ-HPV en medio KSF. Las células fueron subcultivadas por desagregación con tripsina (0,1%)-EDTA (0,01%) en solución salina tamponada con fosfato [PBS] a pH 7,5.

Anticuerpos: Se usó el anticuerpo monoclonal SPA-470 contra Hsp47 (StressGen, Victoria, BC), así como un anticuerpo policlonal de conejo Hsp47 preparado contra un péptido 22-mero correspondiente a la secuencia N-terminal de Hsp47 de ratón que estaba conjugada con hemocianina de lapa californiana (Sauk et al., 1994). El anticuerpo monoclonal anti-M13 se obtuvo de Amersham Pharmacia Biotech (Piscataway, NJ). Los anticuerpos monoclonales para los análisis citométricos fueron conjugados directamente con fluoresceína usando el kit de éster 5(6) carboxifluorescein-N-hidroxi succinimida (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) o se marcaron con SA-Red670^{TM} después de la biotinilación del anticuerpo usando el kit de biotinilación EZ-Link^{TM} Sulfo-NHS-LC (Pierce, Rockville, Ill).

Inmunopurificación por afinidad de una biblioteca de péptidos: Para estudiar la especificidad de unión de Hsp47, los autores de la presente invención utilizaron dos bibliotecas de bacteriófagos con insertos de heptapéptido Ph. D.- 7, New England Biolabs; Beverly, MA) o dodecapéptido (Ph. D.-12, New England Biolabs; Beverly, MA) aleatorios en el término N de la proteína pIII. La biblioteca Ph. D.-7 consiste en aprox. 2,8 x 10^{9} secuencias electroporadas amplificadas una vez para dar copias de cada secuencia en 10 \mul de fago suministrado. La biblioteca Ph. D.-12 consistía en aprox. 2,7 x 10^{9} secuencias electroporadas amplificadas una vez para dar aprox. 55 copias/10 \mul de fago sumi-
nistrado.

Selección de bacteriófagos de unión de Hsp47 por inmunopurificación por afinidad: Los bacteriófagos que exponen péptidos reconocidos por Hsp47 fueron identificados usando los kits Ph.D.-7 o Ph.D.-12 (New England Biolabs; Beverly, MA) y los protocolos modificados para una diana biotinilada. En esencia, 96 pocillos de una placa de microtítulo fueron recubiertos con 15 \mul de estreptavidina (1 mg/ml) en 135 \mul de NaHCO_{3} 0,1 M pH 8,6, con agitación suave en una cámara humidificada, durante la noche y a 4ºC. Después de eliminar la solución de estreptavidina los pocillos se lavaron tres veces con TBS que contiene 0,05% de Tween 20 (TBS-Tween) y después se bloquearon por incubación durante 1 hora a 37ºC con 1% de BSP en PBS que contiene 0,1 \mug/ml de estreptavidina.

A continuación, el fago fue precomplejado con Hps47 biotinilada mediante la adición de 0,1 \mug de Hsp47 biotinilada y 2 x 10^{11} pfu (unidades formadoras de placas) del fago de entrada en 400 \mul de TBS-Tween y se incubaron durante 60 minutos. La solución de complejo fago-diana se añadió después a las placas bloqueadas lavadas y se incubaron a temperatura ambiente durante 10 minutos. Se añadió biotina hasta una concentración final de 0,1 mM y se incubo durante 5 minutos para desplazar el fago de unión de estreptavidina. El fago no de unión fue desechado y las placas se lavaron 10 x con TBD-Tween (0,1%). Después los pocillos se trataron con 15 \mul de Tris-HCl 1 M, pH 2,2, que contiene 1 mg/ml de BSA, durante 5 minutos, para eluir el Hsp47-fago. Las muestras se neutralizaron con Tris-HCl 1 M, pH 9,1 y se amplificaron añadiendo 20 ml de cultivo de ER 2537 incubado a 37ºC con agitación vigorosa durante 4,5 horas. Los cultivos se transfirieron después a tubos nuevos y se centrifugaron a 10.000 rpm a 4ºC durante 10 minutos. Los sobrenadantes se transfirieron a tubos nuevos y el fago se precipitó con 1/6 de volumen de PEG/NaCl a 4ºC durante la noche. A 4 ml de medio LB se inoculó una colonia individual de ER2537 y después se incubó a 37ºC con agitación vigorosa hasta que el cultivo alcanzó la fase logarítmica media (D.O._{600} aprox. 0,5). Se obtuvo un sedimento por centrifugación durante 15 minutos a 10.000 rpm, 4ºC. El sedimento se suspendió en 1 ml de TBS y se centrifugó durante 5 minutos a 10.000 rpm, 4ºC. El sobrenadante se transfirió a un tubo nuevo y se precipitó con 1/6 de volumen de PEG/NaCl en hielo, durante 1 hora. Después de la centrifugación el sedimento se resuspendió en 200 \mul de TBS. El eluído se tituló y se puso en placas LB/IPTG/XGaI, y se incubó durante la noche. Dado que el fago de la biblioteca se deriva del vector de clonación común M13mp19, que lleva el gen lacZ\alpha, las placas de fago aparecen azules cuando se ponen en placa en medios que contienen XgaI e IPTG. Las colonias azules fueron seleccionadas para secuenciación o usadas para una segunda tanda de inmunopurificación. Como testigo se usó estreptavidina como diana y después de tres tandas de inmunopurificación para verificar una secuencia de consenso para los péptidos que unen estraptavidina.

Cribado para bacteriófagos que unen Hsp47

Clones de colonias azules de placas que contienen 50-200 colonias fueron transferidos a filtros de nitrocelulosa. Las bacterias se lavaron de los filtros con PBS que contiene 0,05% de Tween 20 y 1% de albúmina de suero bovino, y los filtros se incubaron después durante 30 minutos en el mismo tampón antes de lavar tres veces con PBS-Tween. Después de una incubación durante 1 hora en 5 ml de Hsp47 biotinilada (0,1 - 2 \mug/ml en PBS-Tween), los filtros se lavaron de nuevo tres veces en PBS-Tween. Las posiciones de los clones que habían segregado bacteriófagos de unión de Hsp47 fueron después localizadas por uno de dos métodos: los filtros se incubaron con 5 ml de estreptavidina conjugada con fosfatasa alcalina (dilución 1/10.000 en PBS-Tween, Pierce, Rockford, IL) durante 1 hora a temperatura ambiente antes de un lavado a fondo con PBS-Tween, o los filtros fueron incubados durante 1 hora en 5 ml de un anticuerpo anti-biotina (dilución 1/50.000 en PBS-Tween, Pierce, Rockford, IL), lavados e incubados con un anticuerpo de inmunoglobulina anti-cabra de conejo, conjugado con fosfatasa alcalina (dilución 1/5.000 en PBS-Tween, Pierce, Rockford, IL). En cada caso, la actividad de la fosfatasa alcalina se reveló usando una mezcla de nitroblue tetrazolio y 5 bromo-4-cloro-3-indolifosfato tolidio (Bethesda Research Labs, Rockville, MD) como sustrato.

Determinación de la secuencia de los péptidos expuestos por bacteriófago

Los DNAs de bacteriófagos de cadena simple fueron purificados y secuenciados como oligonucleótido -96 primer (5'-CCCTCATAGTTAGCGTAACG-3'). Las reacciones de secuenciación se llevaron a cabo usando un ABI Prism Model 373 Version 3.0.

Programa para puntuar péptidos de unión de Hsp47

Para caracterizar los péptidos que se unen a Hsp47, los autores de la presente invención compararon las bibliotecas de partida y las seleccionadas de una manera independiente de la posición. Se realizó un análisis estadístico por máxima probabilidad y remuestreo bootstrap. Este reveló la distribución de restos por posición en péptidos de unión de Hsp47 en comparación con péptidos en la biblioteca original. Para codificar las preferencias obtenidas anteriormente, los autores de la presente invención usaron un sistema de puntuación previamente descrito para BiP (Cwirla et al., 1990) que se usaría para predecir sitios de unión de Hsp47 en polipéptidos de origen natural y sintéticos. Haciendo esto, se da una puntuación a cada uno de los 20 aminoácidos posibles en cada posición de la secuencia núcleo de siete restos. Estas puntuaciones se derivaron de las veces de diferencia de abundancia global de cada resto en los péptidos expuestos por las poblaciones de bacteriófagos seleccionadas y no seleccionadas. La puntuación para cada uno de las secuencias
de siete restos presentes en cada heptapéptido se determinó como se describió previamente (Cwirla et al., 1990).

Para validar el conjunto de puntuación de secuencias de unión de Hsp47, es necesario un segundo conjunto de secuencias de unión de Hsp47 que no son parte de la base de datos usada para generar la matriz de puntuación. Para realizar esto se usó una segunda biblioteca consistente en bacteriófagos recombinantes independientes que exponen dodecapéptidos aleatorios (Ph. D-12, New England Biolabs, Beverly, MA). Las secuencias se compararon después mediante un BLAST iterado específico de la población, BLAST iniciado por acierto de patrón, y secuencias BLAST 2 unas frente a otras (NCBI). Además, los perfiles hidropáticos de dos péptidos se compararon usando la base de datos del Weizmann Institute of Sciences Genome and Bioinformatics.

Síntesis de péptidos

Se prepararon heptapéptidos y dodecapéptidos mediante síntesis en fase sólida de flujo continuo y se analizaron mediante cromatografía de líquidos de alta presión y espectrometría de masas como se describió previamente (Cwirla et al., 1990).

Análisis citrométricos

Células desarrolladas in vitro, como se describió antes, fueron lavadas e incubadas en una solución al 0,5% de Polyglobin N para bloquear los receptores Fc no saturados y reducir la unión no específica de anticuerpos monoclonales (Takeshita et al., 1995). A continuación, se incubaron 50 ml de la suspensión de células (1 x 10^{6} células/ml) con 2,5 ml (1 mg) de anticuerpos, conjugados con fluoresceína, o SA-Red670 (GibcoBRL, Gaithersburg, MD). Después de lavar, el sedimento de células se resuspendió en PBS que contiene BSA para el ensayo de citometría de flujo. Para evaluar la Hsp47 intracelular y bacteriófago M13, las células fueron primero impermeabilizadas con 0,1% de saponina, como se describió previamente (Tang et al., 1994; Tang et al., 1993). Las muestras fueron después analizadas en un citómetro de flujo FACScan (Becton Dickinson, San Jose, CA). El láser de argón de 488 nm se hizo funcionar a una potencia de 15 nW. Los datos procedentes de conjugados de fluoresceína se recogieron después de un filtro de 530/30 BP. Se emplearon cuatro análisis citométricos de dos colores, bien sea de fluoresceína o bien de Red670^{TM}, con yoduro de propidio. Los filtros usados fueron dicroico SP de 600 nm; 525 \pm 15 nm BP (fluoresceína) y 645 LP (Red670^{TM}).

Se usó yoduro de propidio para la evaluación del ciclo celular y la tinción en busca de las células muertas. Para estos estudios se añadió un solución hipotónica de citrato que contiene PI a 1 x 10^{6} células lavadas, a una concentración de 1 mM. Las células se marcaron durante 20 minutos, después se analizaron en el FACScan en su solución de tinción. La fluorescencia naranja del PI se recogió después de un filtro de 585/42 nm BP.

Se usó compensación electrónica entre canales de fluorescencia que recogen emisiones para eliminar la superposición espectral residual. Los datos de fluorescencia se mostraron en una escala de cuatro décadas de longitud. Se recogió en cada muestra un mínimo de 10.000 eventos. El análisis de los datos se realizó con software LYSIS II (Becton Dickinson, Mansfield, MA). Se usaron representaciones de contorno del parámetro dual de fluorescencia para la exclusión de residuos y agregados. Este método de bloqueo permitió la fácil discriminación de residuos de las células muertas (baja dispersión de luz directa y alta fluorescencia de PI).

Microscopía de inmunofluorescencia y confocal: La microscopía de inmunofluorescencia se llevó a cabo según el método de Tang et al. (Tang et al., 1994; Tang et al., 1993). Para visualizar la Hsp47 de la superficie de la célula o el bacteriófago M13, las células no se permeabilizaron sino que se trataron y se fijaron con para formaldehído al 1% como se describe para los análisis citométricos. Sin embargo, para prevenir la unión no específica, las células se bloquearon con 10% de suero de cerdo en PBS durante 1 hr. Las células se incubaron después con anticuerpos anti-Hsp47 o anti-bacteriófago M13 (Amersham Pharmacia-Biotech, Piscataway, NJ), se lavaron con PBS, y se incubaron durante 1 hora con IgG anti-conejo de cabra, conjugada con fluoresceína o bien con rojo Texas. Se montaron cubreobjetos en medio de montaje que contiene un agente antiblanqueo (Kirkegaard and Perry Laboratories, Inc.; Gaithersburg, MD). Las células fueron examinadas bajo un fotomicroscopio Zeiss II equipado con epifluorescencia. Células no tratadas con anticuerpos primarios se usaron como controles negativos.

Las imágenes confocales se recogieron usando un microscopio confocal Zeiss LSM410. Se usó un FT de 488/568 con un filtro de barrera de 590 para detectar la tinción con rojo Texas y un FT de 560 con una barrera a 515-540 se usaron para generar imágenes marcadas con fluoresceína. Las imágenes digitales se recogieron en un drive ZIP y se generaron figuras usando software Adobe Photoshop 3.0 (Adobe Systems Inc. Mountain View, CA). No se asoció fluorescencia con células después de la incubación con solamente anticuerpos secundarios.

Para marcar el compartimiento lisosomal, las células se incubaron con 1 mg/ml de FITC lisina fijable -dextrano (Molecular Probes; Eugene, OR) en medio de crecimiento durante 4 horas a 37ºC en 5% de CO_{2}. Después de lavar, las células se incubaron durante 30 minutos más para cazar el dextrano desde los compartimientos endosomal temprano al lisosomal. Para la identificación de los compartimientos endosomal temprano y de reciclaje, las células se incubaron en medio libre de suero que contiene 50 \mug/ml de FITC-transferrina (Molecular Probes; Eugene, OR) durante 30 minutos a 37ºC en 5% de CO_{2}. Después de tratamientos para identificar los compartimientos subcelulares específicos, las células se fijaron y se procesaron para inmunofluorescencia y/o microscopía confocal.

Fraccionamiento subcelular de las membranas del plasma: el método para fraccionar membranas del plasma se modifica según los métodos descritos por Weber et al. (Weber TM et al., 1988). Las muestras se trataron con colagenasa bacteriana para eliminar la posibilidad de unión de procolágeno-Hsp47 derivado citoplásmico a los receptores de integrina de la superficie de la célula como consecuencia del fraccionamiento de la célula. El sobrenadante inicial se centrifuga en un rotor Sorvall SS34 a 48.000 g a 4ºC durante 15 min, y el sedimento de microsomas de alta densidad se resuspende en 40 \mul de tampón. El sobrenadante se siguió centrifugando en un rotor Beckman 70.1 a 300.000 g a 4ºC durante 75 min, y el sedimento de microsomas de baja densidad se resuspende en 60 \mul de tampón.

Las fracciones de la membrana se caracterizaron por la distribución de actividad de 5'-nucleosidasa, un marcador de la membrana del plasma (Avruch and Wallach, 1971). Las membranas de plasma se sometieron directamente a análisis PAGE y Western. Para las transferencias Western, las proteínas analizadas en SDS-PAGE se electrotransfirieron inmediatamente a papel de nitrocelulosa y se bloquearon con 10% de leche seca no grasa (NFDM). El antisuero o suero perinmune se diluyó 1:2000 en el mismo tampón con una agitación suave durante la noche. Después se aclara la nitrocelulosa tres veces durante 5 minutos en TBS/Tween. Los anticuerpos contra Hsp47 y bacteriófago M13 se detectaron con proteína A marcada con [^{125}I] (New England Nuclear, Boston, MA) o análisis de transferencia Western como se describió previamente (Sauk et al., 1997).

Resultados

Para aclarar los motivos de unión de Hsp47, los autores de la presente invención utilizaron dos bibliotecas de bacteriófagos con insertos de heptapéptido o dodecapéptido aleatorios en el término N de la proteína pIII. Como generalmente se requieren péptidos que contienen al menos siete u ocho restos para una unión eficiente, los autores de la presente invención escogieron primero una biblioteca de bacteriófagos que exponían péptidos heptámeros (Ph. D.-7, New England Biolabs; Beverly, MA). Para comenzar a caracterizar estos péptidos, se escogieron al azar 70 clones de bacteriófagos individuales entre la biblioteca no seleccionada, y las secuencias de aminoácidos de los insertos de heptapéptido variables se dedujeron de las secuencias de nucleótidos de la correspondiente región de codificación. Todos los aminoácidos estaban representados, aunque sus frecuencias no siempre corresponden a las esperadas de los números relativos de codones que codifican cada resto.

Las secuencias de heptapéptidos expuestas por 54 bacteriófagos de unión de Hsp47 obtenidos por inmunopurificación se determinan por análisis de la secuencia de DNA de la correspondiente región del genoma del bacteriófago. Las secuencias peptídicas de los 54 clones que unen Hsp47 se consideran primeramente como una sola población y se comparan con las procedentes de los 70 clones escogidos al azar de la biblioteca de partida. La tabulación de los valores de hidrofilicidad de los bacteriófagos que unen Hsp47 revela dos poblaciones generales de péptidos que son elegidos por inmunopurificación. Un grupo de péptidos estaba representado por péptidos hidrófilos y el otro por un grupo hidrófobo de péptidos más pequeño (Figura 1).

La comparación de la composición global en aminoácidos de las dos poblaciones de heptapéptidos, seleccionada y no seleccionada, reveló que la asparagina (N), la treonina (T), la tirosina (Y) y la prolina (P) están particularmente enriquecidas, mientras que la fenilalanina (F), el ácido aspártico (D) y la arginina (R) están reducidas significativamente (Figura 2a, 2b). Sin embargo, cuando se consideran individualmente, el grupo hidrófobo de péptidos está acusadamente enriquecido en triptófano y leucina, así como valina y alanina.

El espaciador de cinco restos que une los heptapéptidos variables a la proteína pIII madura no contiene restos enriquecidos. Así, indicando que es improbable que los restos del espaciador contribuyan a la actividad de unión de bacteriófagos seleccionados, permitiendo a los autores de la presente invención buscar solamente en las secuencias de heptapéptido variables, para ver la presencia de un motivo de unión. La inspección de los péptidos hidrófobos seleccionados revela un motivo de restos mejor descrito como XHyHyXXXHyHy, en donde Hy es un aminoácido hidrófobo grande (normalmente W, L o F) y X es cualquier aminoácido. Este motivo núcleo se identifica también en los restos seleccionados a partir de una biblioteca Ph. D-12 representada por un motivo XHyHyXXHyXXXXHyHy. Tomados en conjunto, estos datos sugieren que el sitio de unión de péptido contiene un bolsillo hidrófobo profundo separado por restos hidrófilos cargados (Figura 3). El motivo péptido descrito como XXHyHyXXX describe mejor los péptidos hidrófilos seleccionados entre la biblioteca. Curiosamente, también puede identificarse un motivo núcleo similar (HyXXXHyHyXXHyXXX) en restos seleccionados entre la biblioteca de dodecapéptidos. Sin embargo, un pequeño número de péptidos carecía totalmente de restos hidrófobos aunque son seleccionados durante la inmunopurificación de Hsp47.

Reconociendo que el procolágeno I era un ligando natural para Hsp47, se realizaron análisis con el programa BLAST para valorar la homología de secuencias entre los péptidos expuestos por bacteriófago y procolágeno I y los dodecapéptidos seleccionados. Curiosamente, se observa poca homología específica basándose solo en la secuencia. Sin embargo, cuando el perfil hidropático del procolágeno I (1) se comparó con los dodecapéptidos obtenidos a partir de tres tandas de inmunopurificación usando el método de Kyte-Doolittle de cálculo de la hidrofilicidad sobre una longitud de ventana de 7, todos los péptidos expuestos por el fago están representados por regiones específicas dentro de la molécula de procolágeno. Curiosamente, la mayor parte de los péptidos hidrófobos se localizan en regiones dentro de la región N-propéptido (restos 59-71) o la región C-propéptido (restos 1344-1445). En cambio, la mayoría de los péptidos hidrófilos se localizaron en regiones con la región helicoidal del procolágeno (restos: 283-295, 470-482, 666-678, 727-739, 1040-1052 y 1087-1099) con solamente un péptido localizado en una secuencia dentro de la región N-propéptido (restos 100-112) (Figura 4).

Para adquirir un entendimiento en la localización subcelular del fago de unión de Hsp47 (HBP) en células tumorales, los autores de la presente invención incubaron 25 \mul de HBP con 10^{6} células (SCC4, SCC9, SCC15, SCC25, HTB126, HTB127, PC-3 y LNCaP) en medios durante 1 hora a 37ºC. Después se lavaron las células 3 veces con TBS-Tween y el HBP se tiñó con anticuerpos FITC-anti-M13 y se analizaron por citometría de flujo. Estos estudios revelaron que las líneas de células tumorales no permeabilizadas (SCC4, SCC9, SCC15, SCC25, HTB126, y PC-3) poseían niveles variables de tinción con fago M13 sobre sus superficies celulares. Además, si las células eran permeabilizadas antes de la adición del anticuerpo, entonces el teñido de la superficie de la célula acoplado con el fago internalizado revelaba una tinción aumentada. Sin embargo, la GMSM-K, una línea de células epiteliales establecida, tratada de igual manera, reveló una escasa o nula tinción. La Figura 5 representa una línea de células tumorales representativa, células SCC4, comparada con células GMSM-K. Resultados similares a los obtenidos para las células GMSM-K se obtuvieron también para las líneas de células normales HTB125 y PZ-HPV de mama y próstata, respectivamente.

Para verificar la asociación del fago de unión de M13 con líneas de células específicas, las células SCC4 y GMSM-K se trataron con un HBP durante 1 hora, después se lavaron 3 veces con TBS-Tween y las membranas del plasma se aislaron y se inmunoprecipitaron con anticuerpos anti-M13. Esto produjo dos bandas de proteína, una con un
Mr = 47k y otra con un Mr = 27k (Figura 6). La banda de 47k se identificó como Hsp47 por análisis de transferencia Western.

La microscopía confocal se empleó también para determinar el destino y la co-localización del HBP. Estos estudios revelaron que cuando se tratan líneas de células tumorales con HBP hay una distribución de tinción en la superficie de las células, en microvesículas, y una intensa tinción en una región perinuclear que es coincidente con el RE (Hebert et al., 1999). Las células se trataron después con bacteriófago M13 seguido por doble tinción con rojo Texas-anticuerpos anti-Hsp47 y FITC-anticuerpos M13. La localización de Hsp47 es similar a la de la tinción del fago M13 y la co-localización de anticuerpos revela superposición, matices amarillos, de los patrones tanto de tinción de M13 como tinción de Hsp47 (Figura 7).

A continuación, los autores de la presente invención determinaron si el HBP se localizaba en el compartimiento endosomal/lisosomal tardío. Para marcar el compartimiento lisosomal, las células se cultivaron en presencia de dextrano conjugado con FITC, seguido de un periodo de caza de 30 minutos para eliminar el dextrano de los compartimientos endosomales tempranos antes de la fijación y la inmunotinción con los anticuerpos anti-M13 conjugados con rojo Texas. Las células SSC4, que son representativas de las otras líneas celulares, demuestraron una clara identificación de FITC-dextrano a estructuras vesiculares, si bien la tinción de HBP estaba limitada principalmente a vesículas puntiformes en el citoplasma y la zona perinuclear (Figura 8). Para verificar que el HBP no está dirigido significativamente a los lisosomas, se añadieron células SCC4 a esferas de látex y HBP y después se fijaron y se procesaron para inmunofluorescencia usando anticuerpos anti-M13. En las células SCC4, la señal de M13 no pudo ser localizada en el periferia de la esfera, lo que sugiere que había una asociación mínima con los fagosomas.

Como los autores de la presente invención ya habían demostrado que la Hsp47 se expresaba en la superficie de la célula, consideraron si el HBP unido a Hsp47 de la superficie de la célula podría estar presente en endosomas de reciclaje. Para marcar estos compartimientos, se cultivaron células SCC4 y GMSM-K en presencia de transferrina conjugada con FITC o conjugada con rojo Texas antes de la fijación y la tinción con anticuerpos anti-M13. El análisis por microscopía confocal indica que la transferrina teñía tanto la membrana del plasma (tinción en anillo en el borde de las células) como los endosomas de reciclaje (tinción puntiforme subcelular). Un patrón muy similar y coincidente se observa para la tinción con anticuerpo M13, por consiguiente la superposición de las dos imágenes indica la co-localización (matices amarillos) de las dos señales en la región subcelular puntiforme y la membrana del plasma (Figura 9). Es digno de mención que las células GMSM-K proporcionaban patrones iguales de tinción con dextrano conjugado y transferrina pero no son teñidas por anticuerpos anti-M13 (no mostrado).

Basándose en la secuencia de péptidos aislados por inmunopurificación, se sintetizaron heptapéptidos y dodecapéptidos consistentes con los modelos predichos obtenidos de la puntuación, se marcaron con FITC y se incubaron con células SCC que se había demostrado que se unían y captaban el HBP. Aunque ninguna de las líneas celulares captó los heptapéptidos, todos los dodecapéptidos sintetizados pudieron ser observados en el citoplasma de células tumorales al cabo de 15 minutos de incubación (Figura 10).

Discusión

Se ha demostrado que el uso de bibliotecas de péptidos aleatorios es una valiosa herramienta para identificar nuevas moléculas terapéuticas. Las bibliotecas representan un enorme número de secuencias de péptidos expuestas en la superficie de virión de clones de fago filamentoso o bien en un soporte sintético en fase sólida. Es primordial para esta estrategia la observación de que péptidos aislados por selección por afinidad de tales bibliotecas típicamente interaccionan con dominios biológicamente relevantes de las proteínas diana (Smith and Scott, 1993; Kitamura et al., 1992; Burkhardt et al., 1991; Smith et al., 1995; Pasqualini et al., 1996; Pasqualini and Ruoslahti, 1996; Ruoslahti, 1997; Ruoslahti, 1996; Hutchcroft et al., 1992; Borst et al., 1993). Esta estrategia tiene por resultado frecuentemente cierto número de péptidos que aparentemente se unen a un dominio individual de una proteína o receptor. Curiosamente, los péptidos carecen frecuentemente de similitud de secuencias y son reminiscentes del descubrimiento de mimotopos (Bowditch et al., 1996; Partidos et al., 1997; Bowditch et al., 1996), en los que péptidos cortos se unen al sitio de unión del antígeno de anticuerpos, incluso aunque difieren en secuencia del antígeno. Claramente, esto parece ser el caso aquí, en donde miles de péptidos fueron localizados a partir de ambas bibliotecas. Sin embargo, estos péptidos podrían dividirse en dos grupos. Un grupo caracterizado por una prevalencia de restos hidrófobos y un segundo grupo caracterizado por una preponderancia de restos hidrófilos cargados. El enriquecimiento en valina y alanina, así como en triptófano y leucina, en péptidos expuestos por este grupo seleccionado de bacteriófagos es consistente con la afinidad de Hsp47 a una región que está determinada por su carácter hidrófobo. Además, la demostración de la unión de HBP por dodecapéptidos con un motivo de XXXXXHyXXHyXHyHy indica que los dominios hidrófobos del ligando no necesitan estar localizados en el término pIII. Así, los datos sugieren que estos péptidos seleccionados describen un sitio de unión de péptido para Hsp47 que contiene un bolsillo largo que puede acomodar las cadenas laterales de aminoácidos grandes hidrófobos y aromáticos, y que contiene regiones adyacentes que pueden interaccionar con restos cargados. Estas conclusiones vienen apoyadas por estudios de modelización estructural tridimensional que revelan que la Hsp47 madura posee una región de unión en forma de un surco largo y profundo que, al pH fisiológico, la base está formada por una lámina \beta con lados formados por hélices. Las hélices proyectan cadenas laterales de restos de aminoácidos hidrófobos hacia el surco mientras que la lámina \beta proyecta cadenas laterales de restos de aminoácidos hidrófobos hacia arriba desde el fondo (Davids et al., 1995). Además, este modelo explica la capacidad de Hsp47 para unirse a regiones hidrófobas dentro del N-propéptido como se describió con anterioridad (Hu et al., 1995) y de la misma forma al esqueleto de colágeno desnaturalizado (gelatina) (Nagata et al., 1988). Fue interesante el descubrimiento de que regiones dentro de la región C-propéptido del procolágeno podrían también proporcionar un sitio de unión para Hsp47, ya que la asociación carboxiterminal de cadenas de procolágeno está implicada en el ensamblado de la cadena (Chessler, 1993b; Lees, 1997; Oliver, 1996; Lees, 1994; Chessler, 1993a).

Para mejorar el conocimiento de la naturaleza y el destino de la Hsp47 expuesta en la superficie celular de células cancerosas, los autores de la presente invención localizaron fagos M13 seleccionados entre las bibliotecas de bacteriófagos en la superficie celular de cierto número de líneas de células de cáncer oral, mama y próstata utilizando análisis de citometría de flujo. Haciéndolo, los autores de la presente invención demostraron que la permeabilización de las células antes de la tinción con anticuerpo potenciaba la señalización de FACS, sugiriendo que M13 estaba internalizado en las células. La inmunoprecipitación de las membranas del plasma de las células tumorales expuestas a fagos seleccionados que exponen péptidos de unión de Hsp47, reveló que la Hsp47 era inmunoprecipitada con el bacteriófago M13 así como otra proteína de 27 kD que puede representar CD9 (Hebert et al., 1999), así, probando que las HBP seleccionadas estaban asociadas con complejos de Hsp47 de la superficie de la célula. Se empleó entonces formación de imagen confocal para comenzar a localizar el destino del bacteriófago que expone el péptido seleccionado internalizado. Estos estudios revelaron que la incubación a corto plazo tenía por resultado que se localizaban péptidos seleccionados en la superficie de la célula y endosomas de reciclaje. Esto no era algo inesperado ya que la reposición en la membrana de proteínas de la superficie de la célula y receptores sigue normalmente un curso así. Sin embargo, sorprendentemente solo una pequeña cantidad de los péptidos internalizados pudieron ser identificados en lisosomas distinguidos por la tinción con FITC-dextrano. De forma antitética, cuando las células fueron teñidas tanto para HBP como para Hsp47 expuestas por M13, hubo una localización concurrente, matices amarillos, de ambos anticuerpos para localizaciones intracelulares coincidentes representadas por endosomas en reciclaje y el RE.

Colectivamente, estos datos indican que a diferencia del péptido de la superficie de la célula los receptores de hormonas experimentan internalización por endocitosis al unirse a ligandos, que después son clasificados en endosomas a lisosomas, donde son presumiblemente degradados (Gruenheid, 1999). Proteínas del RE de la superficie de la célula son enviadas con sus ligandos de nuevo al RE con solamente una pequeña cantidad del ligando destinada para el procesamiento lisosomal. Concebiblemente, el uso de una proteína RE con capacidad de unión a un número de ligandos restringido permitirá el direccionamiento de conjugados de fármaco o compuestos para formación de imágenes directamente a células tumorales que expresen estas proteínas. Tal direccionamiento ofrece la posibilidad de minimizar efectos tóxicos no selectivos. Además, sería de esperar que la resistencia a multifármacos sería menos importante en el caso del transporte a la superficie celular mediado por el RE del fármaco a través de la membrana celular (Czerwinski et al., 1998). Aunque estos datos in vitro indican que una Hsp47 expresada en la superficie celular contiene elementos que podrían ser capaces de suministrar un agente tumoral muy selectivo, aún se han de probar en este modelo elementos que pueden tener importancia en la determinación de esta actividad. Estos elementos incluyen el tipo de resto tóxico que podría suministrar su efecto en el RE y el nivel necesario de Hsp47 expresada en la superficie de la célula para suministrar fármaco y la capacidad para reciclar para una unión de ligando y transporte adicionales (Czerwinski et al., 1998). El que los heptapéptidos expuestos en el término pIII de bacteriófagos fueran captados por células tumorales mientras que sus homólogos sintéticos no fueron internalizados, indica que el uso de tales péptidos necesitaría enlazadores de péptido, que sean estables en la circulación, capaces de exponer los péptidos para la unión, y aún puedan ser procesados después de la internalización. La investigación en curso en el laboratorio de los autores de la presente invención se dirige a resolver estas cuestiones y a la aplicación de los hallazgos a tumores clínicamente relevantes.

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Leyendas de las figuras Figura 1 Distribución de puntuaciones de hidrofobicidad calculadas para péptidos expuestos por bacteriófagos seleccionados entre la biblioteca PhD-7 después de inmunopurificación frente a Hsp47

Se muestra la distribución de puntuaciones de hidrofobicidad global calculadas para cada péptido usando la escala de hidropatía de Kyte y Doolittle (1982), para 54 péptidos expuestos por bacteriófagos obtenidos a partir de la unión de Hsp47 después de tres tandas de inmunopurificación (panning).

Figura 2 Abundancia relativa de los 20 aminoácidos en heptapéptidos expuestos por la biblioteca de bacteriófagos PhD-7

Se purificó el DNA monocatenario de 70 clones de bacteriófagos de la biblioteca PhD, y las secuencias de los heptapéptidos expuestos por estos bacteriófagos fueron deducidas de la secuencia de DNA de la correspondiente región del genoma del bacteriófago. La figura muestra la frecuencia de la incidencia de cada aminoácido calculada como el número observado dividido por el número total de restos en los 70 heptapéptidos. Los aminoácidos están agrupados de acuerdo con el número de codones que los especifican, y la frecuencia esperada para cada grupo si todos los codones fueran utilizados con igual eficiencia se indica mediante las barras abiertas (Cwirla et al., 1990). (B) La composición global en aminoácidos de 54 heptapéptidos a partir de los bacteriófagos PhD-7 de unión de Hsp47 fue comparada con la de 70 heptapéptidos de clones escogidos aleatoriamente entre la biblioteca de partida PhD-7. Se muestran las veces que aumenta o las veces que disminuye la abundancia.

Figura 3 Modelo esquemático del sitio de unión de péptido de Hsp47

Se muestra el esqueleto del péptido en forma de cadena extendida. Las cadenas laterales de dos restos adyacentes se prolongan en bolsillos profundos en el sitio de unión de péptido que tienen preferencias globales para grandes cadenas laterales hidrófobas o aromáticas. Los datos en la figura 3 indican que los aminoácidos en la posición 2 y 3 en heptapéptidos y 2 y 3 y/o 11 y 12 hacen contactos favorables con cadenas laterales de Hsp47. Los bolsillos hidrófobos están flanqueados por regiones que contiene restos cargados en posición 4, 5, 6 en heptapéptidos y posiciones 4 y 5, y 7, 8, 9 y 10 en dodecapéptidos.

Figura 4 El perfil hidropático de procolágeno I comparado con péptidos seleccionados de la biblioteca PhD-12

Usando el método de Kyte Doolittle para calcular la hidrofilicidad (1982) sobre una longitud de ventana de 7, fagos seleccionados de la biblioteca PhD-12 fueron comparados con cadenas alfa de procolágeno I. Los restos indicados en los recuadros sobre el perfil del procolágeno I indican los restos similares a péptidos de unión de Hsp47 seleccionados entre la biblioteca PhD-12 después de tres tandas de inmunopurificación. Las flechas en las regiones de C-propéptido indican aminoácidos críticos para la asociación y ensamble del procolágeno (Chessler, 1993b; Lees, 1997; Oliver, 1996; Lees, 1994; Chessler, 1993a).

Figura 5 Tinción con FITC-antifago M13 de células GMSM-K (testigo) y SCC-4

Los paneles (a) y (b) representan células GMSM-K testigo y células SCC-4, respectivamente, mostrando la tinción de la membrana. Los paneles (c) y (d) representan células GMSM-K testigo y células SCC-4, respectivamente, en las que las células han sido permeabilizadas para demostrar la tinción intracelular. Las áreas dentro de los recuadros representan tinción con FITC para fago-péptido.

Figura 6 Inmunoprecipitación de proteínas de la membrana por anticuerpos anti-fago M13

Las bandas representan proteínas de unión con anti-fago M13 inmunoprecipitadas como se describe en Métodos. Las calles (a-f) representan clones de M13 seleccionados de bibliotecas PhD-7 y PhD-12. Las calles (a-c) representan clones de PhD-7 3, 5 y 7, respectivamente, y las calles (d-f) representan clones de PhD-12 2, 5 y 9, repectivamente.

Figura 7 Imágenes microscópicas confocales de células SCC-4 teñidas con anticuerpos anti-Hsp47 y Anti-M13

El panel (a) representa células tumorales teñidas con anticuerpos anti-M13 conjugados con FITC, el panel (b) representa anticuerpos anti-Hsp47 conjugados con rojo Texas, y el panel (c) representa co-localización espacial, matices amarillos, de la tinción con FITC y con rojo Texas.

Figura 8 Imágenes microscópicas confocales de células SCC-4 teñidas con FITC-dextrano y rojo Texas-anticuerpos Anti-M13

El panel (a) representa células tumorales teñidas con dextrano conjugado con FITC, el panel (b) representa anticuerpos anti-M13 conjugados con rojo Texas, y el panel (c) representa co-localización espacial de la tinción con FITC y con rojo Texas. Solamente una parte minoritaria de anticuerpos anti-M13 se co-localiza con FITC-dextrano, matices amarillos.

Figura 9 Imágenes microscópicas confocales de células SCC-4 teñidas con FITC-transferrina y rojo Texas-anticuerpos anti-M13

El panel (a) representa células tumorales teñidas con transferrina conjugada con FITC, el panel (b) representa anticuerpos anti-M13 conjugados con rojo Texas, y el panel (c) representa co-localización espacial, matices amarillos, de la tinción con FITC y con rojo Texas.

Figura 10 Absorción de dodecapéptido conjugado con isotiocianato de fluoresceína en células SCC

El dodecapéptico correspondiente a un péptido clonado fue sintetizado y conjugado con isotiocianato de fluoresceína como se describe en Métodos. El péptido se incubó después con células SCC-4 durante 30 minutos., se lavó y se procesó para microscopía de fluorescencia. La fluorescencia verde representada alrededor del área nuclear y en la tinción puntiforme representan la distribución celular de la absorción del péptido.

<110> UNIVERSIDAD DE MARYLAND, BALTIMORE

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<120> COLIGINA/Hsp47 LOCALIZADA EN SUPERFICIE EN CÉLULAS DE CARCINOMA

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<130> UNIMD-4 WO

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<140> PCT/US00/06588

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<141> 2000-03-15

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<150> 60/124,481

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<151> 1999-03-15

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<160> 68

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<170> PatentIn Ver. 2.1

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<210> 1

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<211> 12

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: motivo consenso

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<220>

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<221> MOD_RES

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<222> (1)

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<223> Cualquier aminoácido

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<220>

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<221> MOD_RES

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<222> (2)..(3)

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<223> Aminoácido hidrófobo

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<220>

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<221> MOD_RES

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<222> (4)..(5)

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<223> Cualquier aminoácido

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<220>

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<221> MOD_RES

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<222> (6)

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<223> Aminoácido hidrófobo

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<220>

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<221> MOD_RES

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<222> (7)..(10)

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<223> Cualquier aminoácido

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (11)..(12)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Aminoácido hidrófobo

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 2

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Motivo consenso

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Aminoácido hidrófobo

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (2)..(4)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (5)..(6)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Aminoácido hidrófobo

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (7)..(8)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (9)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Aminoácido hidrófobo

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (10)..(12)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 2

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 3

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Péptido sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 3

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Trp His Trp Gln Trp Thr Pro Trp Ser Ile Gln Pro}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Péptido sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 4

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Trp His Tyr Pro Trp Phe Gln Asn Trp Ala Met Ala}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Péptido sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 5

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Trp His Trp Asn Gly Trp Lys Tyr Pro Val Val Asp}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Péptido sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 6

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Phe His Trp Pro Thr Leu Tyr Asn Met Tyr Ile Pro}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Péptido sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 7

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Phe His Trp Ser Trp Tyr Thr Pro Ser Arg Pro Ser}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Péptido sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 8

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Trp His Trp Ser Tyr Pro Leu Trp Gly Pro Leu Glu}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Péptido sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 9

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Asn Trp Thr Leu Pro Thr Ala Gln Phe Ala Tyr Leu}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Péptido sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 10

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Val Leu Ile Pro Val Lys Ala Leu Arg Ala Val Trp}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Péptido sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 11

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Thr Pro Gln Pro Asn Met Met Leu Arg Ile Ser Pro}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Péptido sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 12

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ala Asn Phe Thr Phe Phe Lys Leu Met Pro Val Ser}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Péptido sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 13

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Lys Val Pro Pro Ala Leu Pro Ser Pro Trp Thr Ser}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Péptido sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 14

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gly Leu Tyr Met His Pro Pro Thr His Thr Met Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Péptido sintético

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 15

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Glu Gly Arg Ser Thr Leu Thr Ser Leu Thr Ile Ile}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Péptido sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 16

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ser Gly Ala Ala Asn Gln Pro Ser Ala Thr Ser Gly}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Péptido sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 17

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Lys His Asn Glu Gln Thr Phe His Pro Lys Val Pro}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Péptido sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 18

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Thr Val Leu His Ser Leu Ala His Gln Thr Phe Ile}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Péptido sintético

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 19

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ala Gln Ser Met Asp Val Tyr Ser Arg Gln Pro Phe}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Péptido sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 20

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Asn Thr Pro Thr Ala Pro Trp His Pro Gly Glu Ser}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Péptido sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 21

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Arg Tyr Met Asn Asp His Lys Ser Pro Thr Asp Ser}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Péptido sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 22

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ser Asn Ala Gln Glu Asp Val His Asp Leu Ser Ser}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Péptido sintético

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 23

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Thr Pro Ser Pro Asn Lys Ser Thr Val Ser Pro Gly}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Péptido sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 24

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Lys Phe Met Gln Ala Gln Ala Gly Met Thr His Asn}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Péptido sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 25

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Leu Asp Ser Arg Tyr Ser Leu Gln Ala Ala Met Tyr}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Péptido sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 26

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gly Ile Thr Ser Leu Leu Ser}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Péptido sintético

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 27

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Phe His Ser Gly Trp Pro Gln}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Péptido sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 28

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Thr Thr Asn Tyr Tyr Thr Asn}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Péptido sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 29

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Glu Pro Ala His Arg Ser Tyr}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Péptido sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 30

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ser Asn Ala Ala Thr Glu Tyr}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Péptido sintético

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 31

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Lys Leu Ser Met Thr Ile Pro}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Péptido sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 32

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Leu Val Asn Met Pro Thr Pro}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Péptido sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 33

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ser Pro Asn Pro Trp Tyr Gly}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Péptido sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 34

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ser Leu Ser Thr Thr Gln Lys}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Péptido sintético

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 35

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Thr Asp Thr Pro Arg Arg Gln}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Péptido sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 36

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Lys Leu Thr Asn Thr Val Leu}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 37

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Péptido sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 37

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Lys Leu Thr Asn Thr Val Leu}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 38

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Péptido sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 38

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Thr Ala Thr Ser Leu Gln Trp}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 39

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Péptido sintético

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 39

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Lys Leu Pro Asn Val Asn Ser}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 40

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Péptido sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 40

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Asn Val Pro Tyr Val Val His}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 41

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Péptido sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 41

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Asp Arg Phe Ser Pro Met Pro}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 42

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Péptido sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 42

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{His Phe Gln Pro Arg His His}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Péptido sintético

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 43

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{His Ser Thr Ser Thr Pro His}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 44

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Péptido sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 44

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Tyr Val Ala Ser Pro Trp Gln}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 45

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Péptido sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 45

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Phe Arg Tyr Asp Thr Phe Pro}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 46

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Péptido sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 46

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{His Asn Tyr Leu Asn Leu Thr}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 47

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Péptido sintético

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 47

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ile Ser Gln Gly Thr Thr Pro}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 48

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Péptido sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 48

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Glu Phe Leu Pro Val Gln Leu}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 49

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Péptido sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 49

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{His Asn Tyr Leu Asn Leu Thr}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 50

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Péptido sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 50

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{His Pro Ser Leu Asn Lys Pro}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 51

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Péptido sintético

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 51

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{His Ser Thr Ser Val Thr Gln}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 52

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Péptido sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 52

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Tyr Val Ala Ser Trp Pro Gln}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 53

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Péptido sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 53

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ile Thr Val Gln Lys Asn Thr}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 54

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Péptido sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 54

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Val Ala Gly Asn Pro Leu Gln}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 55

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Péptido sintético

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 55

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Phe Thr Ile Pro Ser Asn Leu}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 56

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Péptido sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 56

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Asn Val Met Ile Lys Gly Gln}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 57

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Péptido sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 57

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gln Lys Pro Pro Pro Tyr Asp}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 58

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Péptido sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 58

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Asn Val Pro Tyr Gly Val His}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 59

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Péptido sintético

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 59

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ala Phe Leu Pro Ser Lys Leu}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 60

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Péptido sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 60

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{His Phe Gln Pro Arg His His}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 61

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Péptido sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 61

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Asn Thr Ser Pro Leu Glu Leu}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 62

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Péptido sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 62

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Asp Phe Asn Tyr Asn Pro Leu}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 63

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 63

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ccctcatagt tagcgtaacg

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 64

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Motivo consenso

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

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<221> MOD_RES

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<222> (1)

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<223> Cualquier aminoácido

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<220>

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<221> MOD_RES

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<222> (2)..(3)

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<223> Aminoácido hidrófobo

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

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<221> MOD_RES

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<222> (4)..(6)

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<223> Cualquier aminoácido

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

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<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (7)..(8)

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<223> Aminoácido hidrófobo

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 64

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 65

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: Motivo consenso

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<220>

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<221> MOD_RES

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<222> (1)..(2)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

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<222> (3)..(4)

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<223> Aminoácido hidrófobo

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

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<221> MOD_RES

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<222> (5)..(7)

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<223> Cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 65

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 66

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 4

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<212> PRT

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<213> Secuencia desconocida

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de secuencia desconocida: receptor KDEL

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 66

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\sa{Lys Asp Glu Leu}

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 67

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia desconocida

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

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<223> Descripción de secuencia desconocida: secuencia término COOH de Hsp47

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 67

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\sa{Arg Asp Glu Leu}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 68

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Motivo consenso

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(5)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

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<222> (6)

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<223> Aminoácido hidrófobo

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

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<221> MOD_RES

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<222> (7)..(8)

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<223> Cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

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<220>

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<221> MOD_RES

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<222> (9)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Aminoácido hidrófobo

\vskip1.000000\baselineskip

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<220>

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<221> MOD_RES

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<222> (10)

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<223> Cualquier aminoácido

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<220>

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<221> MOD_RES

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<222> (11)..(12)

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<223> Aminoácido hidrófobo

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 68

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\sa{Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa}

Claims (23)

1. Un método para la elaboración de un medicamento para el tratamiento de un paciente que padece de un carcinoma o de un sarcoma, en donde la Hsp47 se expresa en la superficie de al menos algunas células, comprendiendo el medicamento una cantidad efectiva de un agente que comprende un resto de direccionamiento (targeting) que se une específicamente a un dominio externo de Hsp47, en donde el resto de direccionamiento es un anticuerpo o un fragmento del mismo, un péptido o un bacteriófago en cuya superficie está un péptido que se une específicamente a un dominio externo de Hsp47, y un resto terapéutico.

2. El método según la reivindicación 1ª, en el que el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.

3. El método según la reivindicación 1ª, en el que el péptido es una de las SEQ ID No: 3 a SEQ ID No: 25 de las Tablas 1 y 2.

4. El método según la reivindicación 1ª, en el que el resto terapéutico es una toxina, un radioisótopo o radionucleido, un anticuerpo o un ácido nucleico que codifica un gen terapéutico.

5. El método según la reivindicación 1ª, en el que el medicamento es para modular la interacción de una célula tumoral con una matriz intracelular y para modular la invasión de células tumorales, la emigración o la movilidad de células malignas o la metástasis de células tumorales.

6. Un método in vitro para la alteración de cualquier respuesta fisiológica de la célula que expresa Hsp47 en su superficie, que comprende suministrar a dicha célula un resto de direccionamiento que se une a un dominio externo de Hsp47, en donde el resto de direccionamiento es un anticuerpo o un fragmento del mismo, un péptido o un bacteriófago en cuya superficie está un péptido que se une específicamente a un dominio externo de Hsp47, y un resto terapéutico.

7. El método según la reivindicación 1ª, en el que la Hsp47 es humana.

8. Un método para la elaboración de un agente detectable para detectar un carcinoma o un sarcoma en el que la Hsp47 se expresa en la superficie de al menos algunas células, comprendiendo el agente detectable para contactar el carcinoma o el sarcoma un resto de direccionamiento que se une específicamente a un dominio externo de Hsp47, en donde el resto de direccionamiento es un péptido, en donde el péptido contiene una de las secuencias SEQ ID No: 3 a SEQ ID No: 25 de las Tablas 1 y 2, o un bacteriófago en la superficie del cual está un péptido que se une específicamente a un dominio externo de la Hsp47, en donde el péptido es una de las secuencias SEQ ID No: 26 a SEQ ID No: 62 de la Tabla 3.

9. El método según la reivindicación 8ª, en el que el agente detectable es detectable mediante MRI, rayos X, escintigrafía gamma o escaneo CT.

10. Un método para la elaboración de un agente detectable para detectar una célula que expresa Hsp47 en su superficie, comprendiendo el agente detectable para administrar a la célula un resto de direccionamiento que se une específicamente a un dominio externo de Hsp47, en donde el resto de direccionamiento es un péptido, en donde el péptido contiene una de las secuencias SEQ ID No: 3 a SEQ ID No: 25 de las Tablas 1 y 2, o un bacteriófago en la superficie del cual está un péptido que se une específicamente a un dominio externo de la Hsp47, en donde el péptido contiene una de las secuencias SEQ ID No: 26 a SEQ ID No: 62 de la Tabla 3.

11. El método según la reivindicación 8ª, en el que la Hsp47 es humana.

12. Un método in vitro para el cribado de un agente que se une específicamente a un carcinoma o un sarcoma, en el que la Hsp47 se expresa en la superficie de al menos algunas células, que comprende identificar un agente que comprende un resto de direccionamiento que se une específicamente a un dominio externo de Hsp47.

13. Un kit para el tratamiento de un paciente que padece de un carcinoma o de un sarcoma, en el que la Hsp47 se expresa en la superficie de al menos algunas células, o para detectar un carcinoma en el que la Hsp47 se expresa en la superficie de al menos algunas células, que comprende un agente que comprende un resto de direccionamiento que se une específicamente a un dominio externo de Hsp47 en una cantidad efectiva para generar un efecto citostático o citolítico en el carcinoma o el sarcoma, o para formar imágenes de la célula sobre un fondo de células no carcinomatosas o no sarcomatosas, en donde el resto de direccionamiento es un anticuerpo o un fragmento del mismo, un péptido, o un bacteriófago en la superficie del cual está un péptido, cada uno de los cuales restos de direccionamiento se une específicamente a un dominio externo de Hsp47, y un resto terapéutico.

14. El kit según la reivindicación 13ª, en el que el resto terapéutico es una toxina, un radioisótopo o radionucleido, un anticuerpo o un ácido nucleico que codifica un gen terapéutico.

15. El uso de un kit que comprende un agente que comprende un resto de direccionamiento que se une específicamente a un dominio externo de Hsp47, en una cantidad efectiva para modular una actividad de la célula, en donde el resto de direccionamiento es un anticuerpo o un fragmento del mismo, un péptido, o un bacteriófago en la superficie del cual está un péptido que se une específicamente a un dominio externo de Hsp47, y un resto terapéutico para la alteración de cualquier respuesta fisiológica de la célula in vitro, que exprese Hsp47 en su superficie.

16. Un péptido que se une específicamente a un dominio externo de Hsp47 expresada en la superficie de una célula, que comprende una de las secuencias SEQ ID No: 3-13 de la Tabla 1, SEQ ID No: 14-25 de la Tabla 2 y SEQ ID No: 26-62 de la Tabla 3, en donde los péptidos pueden prolongarse tanto como hasta 20 aminoácidos adicionales en cualquiera de los extremos de los péptidos, o en ambos.

17. Un péptido según la reivindicación 16ª, en donde dicho péptido es un peptidomimético de procolágeno.

18. El péptido según la reivindicación 16ª, en donde el péptido es una de las secuencias SEQ ID Nos: 3 a 13 de la Tabla 1.

19. El péptido según la reivindicación 16ª, en donde el péptido es una de las secuencias SEQ ID Nos: 14 a 25 de la Tabla 2.

20. Un agente que comprende un resto de direccionamiento que se une específicamente a un dominio externo de Hsp47 expresada en la superficie de una célula, en una cantidad efectiva para modular la actividad de la célula, en donde el resto de direccionamiento es un péptido, en donde el péptido contiene una de las secuencias SEQ ID No: 3 a SEQ ID No: 5 de las Tablas 1 y 2, o un bacteriófago en la superficie del cual está un péptido que se une específicamente a un dominio externo de Hsp47, en donde el péptido contiene una de las secuencias SEQ ID No: 26 a SEQ ID No: 62 de la Tabla 3.

21. Una composición farmacéutica que comprende un péptido según la reivindicación 16ª y un vehículo aceptable farmacéuticamente.

22. Una composición farmacéutica que comprende un agente según la reivindicación 20ª y un vehículo aceptable farmacéuticamente.

23. Una composición farmacéutica que comprende un agente que comprende un resto de direccionamiento que se une específicamente a un dominio externo de Hsp47 localizada en la superficie de un carcinoma o un sarcoma, en una cantidad efectiva para generar un efecto citolítico o citostático en el carcinoma o el sarcoma, y un vehículo aceptable farmacéuticamente, en donde el resto de direccionamiento es un anticuerpo o un fragmento del mismo, un péptido, o un bacteriófago en la superficie del cual está un péptido, que se une específicamente a un dominio externo de Hsp47, y un resto terapéutico.