JP2002539175A - 癌細胞において表面に存在するコリジン／Ｈｓｐ４７ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、例えば、癌細胞の表面に発現するコリジン／Ｈｓｐ４７分子およびそのような発現した分子の標識としての、例えば、治療剤または造影剤のための使用に関する。本発明はさらに、そのような表面に存在するＨｓｐ４７分子の外部領域に特異的に結合するペプチドに関する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 本発明は、例えば、癌細胞の表面に発現すると予想されるコリジン／Ｈｓｐ４
７分子およびその標的としてのそのような予想される分子の使用、例えば治療剤
または造影剤、に関する。本発明はさらに、そのような表面に存在するＨｓｐ４
７分子の外部領域に特異的に結合するペプチドに関する。

【０００２】 熱ショックタンパク質コリジン／ＣＢＰ２/Ｈｓｐ４７（本明細書では時とし
てＨｓｐ４７と呼ぶ）は、コラーゲンに対する分子シャペロンとして作用し得る
。正常な細胞では、Ｈｓｐ４７は、プロコラーゲンの翻訳の初期の合成過程中の
鎖と緊密に会合し、タンパク質を伴って小胞体（ＥＲ）からゴルジへ移動し、コ
ラーゲンがそこで解離し分泌され、シャペロンはＥＲヘ戻り再利用される。本明
細書では、意外にも、癌細胞においてＨｓｐ４７が効率的にＥＲへと回収されず
、むしろ細胞の表面に存在（例えば、細胞表面上へ漏れ出る）することを開示す
る。

【０００３】 実施例１および６は、Ｈｓｐ４７が、ヒト口腔扁平上皮細胞腫瘍細胞系、ネズ
ミ上皮細胞系、乳がん細胞系および前立腺癌細胞系を含む数多くの癌細胞系の表
面に存在するが、対照の、非癌細胞では発現しないことを示している。したがっ
て細胞表面に存在するＨｓｐ４７はマーカーおよび／または癌細胞に対する“ホ
ーミング標的”としてはたらくことができる。実施例２は、少なくとも表面に存
在するＨｓｐ４７の部分が、例えば、それが細胞内の環境において通常結合する
プロコラーゲンプロペプチドに結合することが可能である。癌細胞を、細胞の表
面に発現したＨｓｐ４７の可能な部分と特異的に相互作用する物質で処理するこ
とにより、治療剤を効率的に送達することができ、治療効果を達成するのに必要
な用量を減らすことが可能であり；癌細胞またはそれらを含む癌（calcinoma）
または腫瘍（tumor）を非癌細胞のバックグラウンドの上で感度よく検出または
造影することができる。

【０００４】 本発明は、細胞表面にＨｓｐ４７を発現する細胞を調節する方法であって、Ｈ
ｓｐ４７の（少なくとも１つの）外部領域に結合する物質の有効量を細胞に投与
することを含んでなる方法に関する。本発明はさらに、Ｈｓｐ４７が少なくとも
いくつかの癌細胞の表面に発現する癌に罹患している患者を処置する方法であっ
て、Ｈｓｐ４７の外部領域に特異的に結合する物質の有効量を患者に投与するこ
とを含んでなる方法に関する。好ましい態様では、この物質は、Ｈｓｐ４７に特
異的な標的部分と、例えば、薬物または毒性物質である治療部分を含んでなる。
１つの態様では、標的部分は、Ｈｓｐ４７の領域に特異的な抗体、またはその断
片または変異体を含んでなる。別の態様では、標的部分は、Ｈｓｐ４７の外部領
域、例えば、コンセンサスモチーフXHyHyXXHyXXXXHyHy（配列番号１）またはコ
ンセンサスモチーフHyXXXHyHyXXHyXXX（配列番号２）を有するペプチドに特異的
なペプチドを含んでなる。最も好ましい態様では、ペプチドは、配列番号３〜２
５のうちの１つを有する。さらなる態様では、標的部分は、その表面上のバクテ
リオファージが上に開示されたペプチドであるバクテリオファージを含んでなる
。

【０００５】 本発明はさらに、その表面にＨｓｐ４７を発現する細胞（例えば、癌細胞また
はそのような細胞を含んでなる癌または腫瘍）を検出する診断上の造影方法であ
って、その細胞を、Ｈｓｐ４７の外部領域に特異的に結合する標的部分および検
出可能な標識（検出可能な部分）（例えば、ＭＲＩ、Ｘ線、ガンマシンチグラフ
ィ、ＣＴスキャンなどによって検出可能な標識）を含んでなる物質と接触させる
ことを含んでなる方法に関する。標的部分には、例えば、抗体、ペプチドまたは
上記のバクテリオファージが含まれる。

【０００６】 本発明はさらに、Ｈｓｐ４７が少なくともいくつかの癌細胞の表面に発現する
癌に対して特異的に結合する物質をスクリーニングする方法であって、Ｈｓｐ４
７の外部領域に特異的に結合する物質を同定することを含んでなる方法に関する
。好ましい態様では、その物質は、患者における癌の処置または患者における癌
を診断するのに有用である。

【０００７】 本発明はさらに、Ｈｓｐ４７の外部領域に特異的に結合する標的部分を含んで
なる、癌細胞を検出するためのまたは癌細胞を処置するためのキットに関する。

【０００８】 本発明はさらに、Ｈｓｐ４７の外部領域に特異的に結合するペプチドに関する
。好ましい態様では、このペプチドは、コンセンサスモチーフXHyHyXXHyXXXXHyH
y（配列番号１）またはコンセンサスモチーフHyXXXHyHyXXHyXXX（配列番号２）
を含む。好ましい態様では、ペプチドは配列番号３〜２５のうちの１つである。

【０００９】 Ｈｓｐ４７を表面に発現するいずれかの種類の細胞は、本発明の方法により調
節、処置および／または検出することができる。好ましい態様では、細胞は癌細
胞である。本明細書において使用される用語「癌」は、いくつかの部位、例えば
皮膚、基底細胞、大腸、肺、結腸、胸部、膀胱、口腔、頭部および頚部、喉頭、
鼻咽頭、副腎皮質、アポクリン腺、排泄腔、胎細胞、腎臓、肝臓、膵臓または前
立腺のいずれか上皮組織に由来する様々なタイプの悪性新生物のいずれかを意味
する。本明細書において使用される用語「癌細胞」は、個々の細胞としてかまた
は組織の状態で、いずれかの進行段階の癌、腫瘍、転移（微小癌組織の転移を含
む）などとして存在するが、インビボまたはインビトロの癌細胞に適用する。

【００１０】 肉腫細胞もまた本発明に包含される。本発明において使用される用語「肉腫」
は、中胚葉細胞の増殖によって形成したいずれかの結合組織新生物を意味する。
多くのタイプの肉腫のうち、本発明に包含されるものは線維肉腫、横紋筋肉腫、
神経線維肉腫および骨肉腫である。本明細書において使用される用語「肉腫細胞
」は、個々の細胞としてかまたは組織の状態で、いずれかの進行段階の肉腫、腫
瘍、転移（微小癌組織の転移を含む）などとして存在するが、インビボまたはイ
ンビトロの肉腫細胞に適用される。特にＨｓｐ４７の発現に関連して、肉腫細胞
を試験するための方法は、例えば、Morino et al,（1997）, In Vivo 11, 261−
4；Morino et al,（1997）, In Vivo 11,17−21；Shirakami et al（1995）, In
Vivo 9, 513−8；Shirakami et al（1995）, In Vivo 9, 509−12；Morino et
al,（1995）, In Vivo 9, 503−8；およびMorino et al, （1994）, In Vivo 8,
285−8に開示されている。

【００１１】 癌細胞に関連して本明細書において開示されている方法および物質は、もちろ
ん、Ｈｓｐ４７の表面発現を有するいかなる細胞およびそのような発現に伴うな
んらかの生理学的または病理学的状態に対しても適用可能である。

【００１２】 Ｈｓｐ４７は、クローニングされているおよび／または、例えば、ニワトリ（
Hiroyashi et al.（1991）. Mol.およびCell Biol. 11、4036−4044）；マウス
（Takechi et al.（1992）. Eur. J. of Biochem. 206、323−329）；およびヒ
ト（例えば、Nakamura、accession number ＃D83174 in the DDJB/EMBL/GenBank
databases；Ikegawa et al.（1995）. Cytogenet. 細胞 Genet. 71、182−186
）；およびJain et al.（1994）. Arch. Biochem. & Biophys. 314、23−30）を
含む、数多くの生物から配列が決定されている。

【００１３】 本明細書において使用される用語「Ｈｓｐ４７」は、例えばいずれかの哺乳類
、好ましくはヒト、の供給源に由来する、野生型のＨｓｐ４７またはその変異体
を包含する。Ｈｓｐ４７の「変異体」は、例えば、そのタンパク質の内部または
外部領域における、保存的または非保存的な、いずれかの挿入、欠失、突然変異
型または置換であって、そのような変化によって、本明細書において定義した標
的部分に対して外部領域の結合は実質的には変化しない。「保存的置換」は、Gl
y、Ala；Val、Ile、Leu；Asp、Glu；Asn、Gln；Ser、Thr；Lys、Arg；およびPhe
、Tyrなどの組み合わせを意味する。変異体、例えば、相同体、類縁体、ムテイ
ンおよび模擬体（ミモトープ）も含まれる。翻訳後修飾を含む、多くのタイプの
タンパク質修飾が含まれる。例えば、米国特許第5,935,835号に開示された修飾
を参照。野生型のＨｓｐ４７と正常に会合しないが、外部領域は本発明の標的部
分に特異的に結合することができる特性を有するように修飾されたＨｓｐ４７分
子が包含される、

【００１４】 細胞表面に発現した（例えば、局在した、存在した）Ｈｓｐ４７に結合するこ
とができる物質は、任意の長さの、いずれかのＨｓｐ４７分子の部分または断片
の１またはそれ以上に結合することができる。そのような可能な配列は、本明細
書では、Ｈｓｐ４７タンパク質の「外部領域」と呼ぶ。

【００１５】 Ｈｓｐ４７の外部領域に「特異的に結合する」（特異的な；優先的に結合する
）物質または部分は、細胞の検出を可能にする、またはそれを調節する（例えば
、治療応答を引き出す）のに十分な時間および量で、それと相互作用するか、ま
たはそれとの物理学的会合を形成するかもしくは受ける。「特異的」または「選
択的に」は、その物質が高い親和性、例えば、Ｈｓｐ４７の外部領域に対する細
胞表面に存在する他の分子よりも高い選択性を意味する。同様に、特定のタイプ
の細胞、例えば癌細胞、に特異的に結合する物質または部分は、そのようなタイ
プの細胞に対して正常な（例えば、非癌）細胞に対するよりも高い親和性を有し
、その結果その結合によって癌細胞が検出され、正常細胞のバックグラウンドか
ら区別されおよび／または治療部分と癌細胞との接触が可能にであるが、非癌の
付近にたいしては、（有意な程度まで）接触は可能ではない。親和性または特異
性の程度は、様々な常套手段のいずれか、例えば、競合結合試験、によって測定
することができる。例えば、Czerwinski et al.（1998）Proc. Nat. Acad. Sci.
95、11,520−11、525およびMoe et al.（1998）. Phar. Res. 23、31−38を参
照。Ｈｓｐ４７の外部領域に特異的に結合する物質の一部分は、「標的部分」、
「部位特異的巨大分子」、「リガンド」または「アフィニティーリガンド」と呼
ぶこともある。

【００１６】 Ｈｓｐ４７の外部領域に特異的に結合する物質または部分は本発明に包含され
る。

【００１７】 標的部分の１つのタイプには、Ｈｓｐ４７の外部領域に特異的に結合する抗体
が含まれる。本明細書において使用される用語「抗体」は、ポリクローナルまた
は、好ましくはモノクローナル抗体であるか、またはポリクローナルまたはモノ
クローナル抗体の（任意のサイズの）断片、例えば、Fv、Fab'、Fab、F（ab'）₂ 、Fab'Fcなどを意味する。１本鎖の抗体もまた本発明に包含される。任意の形態
の免疫グロブリン、例えば、免疫グロブリンA、D、E、GまたはMが含まれる。インタ
クトな（例えば、IgG 分子）、少なくとも２つの抗原に対する特異性を有する２
価のまたは他価の抗体または１価の抗体断片を用いることを望んでもよい。本発
明の抗体は天然の供給源、リンパ腫ハイブリドーマなどから単離することができ
、またはそれらを合成および／または組換え法により製造することができる。そ
れらは、例えば、Jones et al.（1986）. Nature 321,522；Riechmann et al.（
1988）. Nature 332、323 ；Verhoyen et al.（1988）. Science 239,1534；Car
ter et al.（1992）. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89、4285；Sandhu（1992）.
Crit. Rev. Biotech. 12,437；およびSinger et al.（1933）. J. Immunol. 15
0,2844に記載されているような、慣用の、当分野において認識されている手段を
用いて部分的にまたは完全にヒト化することができる。

【００１８】 必要な選択性および／または親和性を示す抗体をスクリーニング、単離、精製
、操作などするための方法は、当分野において慣用的で常套的なものであって、
例えば、米国特許第4,196,265号；Roitt I.,（1994）. Essential Immunology，
Blackwell Scientific Publications，London；Coligan et al.，Current Proto
cols in Immunology；Barnes et al.，in Methods in Molecular Biology，Vol.
10，pages 79−104（Humana Press 1992）；Harlow et al.，Antibodies: A La
boratory Manual，page 726（Cold Spring Harbor Pub. 1988）；およびCurrent
Protocols in Immunology；Edited by John E. Coligan et al.，John Wiley &
Sons，Inc.に開示されている。

【００１９】 別のタイプの標的部分は、Ｈｓｐ４７の外部領域に特異的に結合するペプチド
を含む。そのようなペプチドは、検出可能な物質の形成または治療応答の生成が
可能なように、Ｈｓｐ４７の外部領域に対し特異的に結合に効果的な、任意のサ
イズまたはアミノ酸組成物であってよい。好ましい態様では、このペプチドは、
完全長のコラーゲンでなく、天然に存在するコラーゲンまたはその断片ではない
。好ましい態様では、このペプチドは約９０アミノ酸未満、例えば、約８０、７
０、６０、５０、４０、３０、２０または１０アミノ酸、最も好ましくは約１２
〜１６アミノ酸である。本発明はさらに、より大きなポリペプチド、例えば、完
全長プロコラーゲンと同じ長さであり、但し、検出可能な物質の形成または治療
応答の生成が可能なようにポリペプチドがＨｓｐ４７の外部領域を結合し得うる
ポリペプチドを包含する。

【００２０】 ペプチド（または他の目的の物質）が表面発現したＨｓｐ４７分子であるかど
うかを測定するための方法は、当分野において慣用的で常套的なものである。例
えば、Takemoto et al.（1992）. Arch. Biochem.およびBiophys. 296、323−32
9；Altemeyer et al.（1996）. International J. of Cancer 69、340−349；Fe
rrarini et al.（1992）. International J. of Cancer 51、613−619；Ullrich
et al.（1986）. Proc. Natl. Acad. Sci. 83、3121−3125； Vanburskirk et
al.（1989）. J. Exp. Med. 170、1799−1809；Freedman et al.（1992）. J. o
f Neuroimmunology 41、231−238；Sauk et al.（1997）. Connect. Tissue Res
. 37、105−119）；および米国特許第5,932,478号. Such methods include、例
えば、detection of an agent which is tagged、directlyまたはindirectly、w
ith a fluorescent label by immunofluorescence microscopy、including conf
ocal microscopy,またはby flow cytometry（FACscan）；detection of a radio
actively labeled agent by autoradiography；electron microscopy；immunost
aining；subcellular fractionationなどを参照。実施例１および６ではいくつ
かの典型的な方法を説明する。

【００２１】 細胞内のＨｓｐ４７および／またはその単離されたタンパク質と相互作用する
数多くのペプチドまたはペプチド配列が同定されている。これらのペプチドには
、例えば、アンチプロペプチド抗体 SP1.D8（Hu et al.（1995）. J. of Cellul
ar Biochemistry 59、350−367）によって特徴づけられるプロコラーゲンの領域
；α１（Ｉ）−鎖の残基２３〜１５１、特に残基Ｋ２３〜１０８の間のプロコラ
ーゲンのＮ−プロペプチド領域；プロコラーゲンのGly−Xaa−Yaa配列［ここで
ＸおよびＹは独立に任意のアミノ酸；コラーゲンの（Pro−Pro−Gly）n モデル
配列；およびゼラチンの部分（Nagata et al.（1988）. Biochem. Biophys. Res
. Comm. 153、428−434）が含まれる。そのようなペプチドまたは変異体、模擬
体（ミモトープ）、ムテイン、類縁体またはその断片は、Ｈｓｐ４７の外部領域
と特異的に相互作用するそれらの能力について容易に試験することができ；およ
び強くおよび／または選択的に結合するものは本発明の標的部分として使用する
ことができる。

【００２２】 「変異体」は、保存的または非保存的に関わらず、挿入、欠失、突然変異体ま
たは置換を意味し、そのような変化によってＨｓｐ４７の外部領域に対するペプ
チドの結合が実質的に変化しない。変異体の種類には、Ｈｓｐ４７分子を引用し
て本明細書に記載されたものが含まれる。修飾ペプチドのうち、本発明に含まれ
れるものは、常套的で慣用的な手段により製造することができるペプチド模擬体
である。例えば、al−Obeidi et al.（1998）. Mol. Biotechnol. 9、205−23；
Kieber−Emmons et al.（1997）.Curr. Opin. Biotechnol. 8、435−41；Bowdit
ch et al.（1996）Blood 88、4579−4584；およびPartidos et al.（1997）Immu
nology Letters 57、113−116を参照。

【００２３】 そのような結合係数を測定／親和力を測定する方法は当分野において慣用的な
ものである。例えば、Blond−Elguindi et al.（1993）Cell, 717−728を参照。
好ましい態様では、Ｈｓｐ４７に対するペプチドまたはペプチド領域の結合定数
（親和力）が１５〜４５μｍ；最も好ましくは、結合定数が２０〜３０μｍであ
る。

【００２４】 表面発現したＨｓｐ４７（外部領域）に特異的におよび／または強力に結合す
ることができるペプチドを同定する技術は、アフィニティーパンニングと組み合
わせたバクテリオファージディスプレー（ファージディスプレー）である。例え
ば、Smith et al.（1993）. Methods Enzymol. 217、228−57；Smith et al.（
1995）. J. Biol. Chem. 270、18,323−328；Kitamura et al.（1992）. Cell 6
9、823−831；Burkhardt et al.（1991）. Proc. Natl. Acad. Sci. 88、7410−
7414；Pasqualini et al.（1996）. Brazilian J. of Med. & Biol. Res. 29、1
151−1158 ；Pasqualini et al.（1996）. Molecular Psychiatry 1、423；Ruos
lahti（1996）. Ann. Rev. of Cell & Developmental Biology 12、697−715；
Ruoslahti（1997）. Kidney International 51、1413−1417；Hutchcroft et al
.（1992）. J. Biol. Chem. 267、8613−8619；およびBorst et al.（1993）. I
mmunological Reviews 132、49−84を参照。そのうち使用することができるファ
ージのタイプは、１本鎖の線状ファージである。例えば、fd、F2、F5、M13、お
よびその変異体。簡潔に言えば、選択された長さの一組のランダムペプチド（例
えば、７−ｍｅｒまたは１２−ｍｅｒ）をバクテリオファージ中へクローニング
しその表面にディスプレーし、表面発現したＨｓｐ４７を有する細胞に選択的に
結合するファージを選択した後、１またはそれ以上の選択のサイクルを行なう。

【００２５】 そのようなパンニングの説明は実施例５に示す。この実施例において同定され
たファージディスプレイされたペプチドは、通常、いずれかのモチーフXHyHyXXH
yXXXXHyHy（配列番号１）またはコンセンサスモチーフHyXXXHyHyXXHyXXX（配列
番号２）［式中、Ｘは独立に任意のアミノ酸であり、Ｈｙは独立に任意の疎水性
アミノ酸である］を含んでいる。好ましい態様では、疎水性アミノ酸大きなアミ
ノ酸、例えば、W（Trp）、L（Leu）またはF（Phe）である。そのうちコンセンサ
スモチーフ配列番号１を有するペプチドは、表１に示された配列番号３〜配列番
号１３の配列を有するものである。これらのペプチドは、主として疎水性ペプチ
ドとして特徴付ることができる。

【表１】 主な疎水性ペプチド WHWQWTPWSIQP （配列番号３) WHYPWFQNWAMA （配列番号４） WHWNGWKYPVVD （配列番号５） FHWPTLYNMYIP （配列番号６） FHWSWYTPSRPS （配列番号７） WHWSYPLWGPLE （配列番号８） NWTLPTAQFAYL （配列番号９） VLIPVKALRAVW （配列番号１０） TPQPNMMLRISP （配列番号１１） ANFTFFKLMPVS （配列番号１２） KVPPALPSPWTS （配列番号１３）

【００２６】 コンセンサスモチーフ配列番号２を有するペプチドは、表２に示す配列番号１
４〜配列番号２５を有するペプチドである。これらのペプチドは、主な疎水性ペ
プチドとして特徴付ることができる。

【表２】 主な疎水性ペプチド GLYMHPPTHTMR （配列番号１４） EGRSTLTSLTII （配列番号１５） SGAANQPSATSG （配列番号１６） KHNEQTFHPKVP （配列番号１７） TVLHSLAHQTFI （配列番号１８） AQSMDVYSRQPF （配列番号１９） NTPTAPWHPGES （配列番号２０） RYMNDHKSPTDS （配列番号２１） SNAQEDVHDLSS （配列番号２２） TPSPNKSTVSPG （配列番号２３） KFMQAQAGMTHN （配列番号２４） LDSRYSLQAAMY （配列番号２５）

【００２７】 実施例５において同定された主な疎水性ペプチドは、意外にも、アミノ酸のヒ
ドロパシープロファイル（実施例５の考察を参照）を勘案すれば、主として、コ
ラーゲンのＮ−プロペプチド領域（残基５９〜７１）またはＣ−プロペプチド領
域内の領域に対する（残基１３４４〜１４４５）なマップを除いて、Ｈｓｐ４７
に結合すると知られているプロコラーゲンの領域に対する特定の配列同一性を示
さない。主な疎水性ペプチドはまた、一般にプロコラーゲンのらせん領域内の領
域に対するマップを除いて,プロコラーゲンの領域に対する特定の配列同一性は
示さない。

【００２８】 実施例５においてファージディスプレイされた７−ｍｅｒペプチドは、表３に
示す配列番号２６〜配列番号６２を有するペプチドである。

【表３】 ７−ｍｅｒペプチド GITSLLS （配列番号２６） FHSGWPQ （配列番号２７） TTNYYTN （配列番号２８） EPAHRSY （配列番号２９） SNAATEY （配列番号３０） KLSMTIP （配列番号３１） LVNMPTP （配列番号３２） SPNPWYG （配列番号３３） SLSTTQK （配列番号３４） TDTPRRQ （配列番号３５） KLTNTVL （配列番号３６） NWVPRTN （配列番号３７） TATSLQW （配列番号３８） KLPNVNS （配列番号３９） NVPYVVH （配列番号４０） DRFSPMP （配列番号４１） HFQPRHH （配列番号４２） HSTSTPH （配列番号４３） YVASPWQ （配列番号４４） FRYDTFP （配列番号４５） HNYLNLT （配列番号４６） ISQGTTP （配列番号４７） EFLPVQL （配列番号４８） HNYLNLT （配列番号４９） HPSLNKP （配列番号５０） HSTSVTQ （配列番号５１） YVASWPO （配列番号５２） ITVQKNT （配列番号５３） VAGNPLQ （配列番号５４） FTIPSNL （配列番号５５） NVMIKGQ （配列番号５６） QKPPPYD （配列番号５７） NVPYGVH （配列番号５８） AFLPSKL （配列番号５９） HFQPRHH （配列番号６０） NTSPLEL （配列番号６１） DFNYNPL （配列番号６２）

【００２９】 本発明のペプチドには、本明細書に開示された配列番号、並びにそのペプチド
の両端または一端で、例えば、さらに２０アミノ酸程度（例えば、約１、３、６
、９、１２、１５または１８）伸長したペプチドが含まれる。但し、伸長したペ
プチドは、Ｈｓｐ４７の外部領域に対する必要な特異性／結合活性を示す。

【００３０】 好ましくは、本発明のペプチドは、「単離された」、例えば、天然に存在する
以外の形態で、例えば、緩衝液中で、再構成のための乾燥状態で、キット等の一
部として、存在する。ある態様では、ペプチドは実質的に精製される。本明細書
において使用される「実質的に精製された」なる用語は、天然の状態で付随する
他のタンパク質、脂質、炭水化物、核酸および他の生物学的物質を実質的に含ま
ないペプチド等の分子を意味する。例えば、実質的に純粋な、ペプチド等の分子
は、乾燥重量で少なくとも６０％、好ましくは約７０％、８０％、９０％、９５
％または９９％の目的の分子であり得る。当業者は、標準的なタンパク質の精製
方法を用いてペプチドを精製することができ、そのペプチドの純度は、例えば、
ポリアクリルアミドゲル電気泳動（例えば、SDS−PAGE）、カラムクロマトグラ
フィー（例えば、高速液体クロマトグラフィー（HPLC））、およびアミノ末端ア
ミノ酸配列解析を含む標準的な方法を用いて測定することができる。

【００３１】 表面発現したＨｓｐ４７に対して特異性を示すペプチドが同定されれば、それ
ぞれについて、自由エネルギー計算または他の特性を決定することができ、この
情報を他の作用物質または薬物、例えば、表面発現したＨｓｐ４７に優先的に結
合する有機化合物、を設計するために使用することができる。このような方法は
慣用的なものである。例えば、Rejyo et al.（1996）Proc. Natl. Acad. Sci. 9
3、8945−8950；Gabius et al.（1998）Phar. Res. 15、23−30；およびSelz et
al.（1998）Biophysical Jol. 75、2332−2343を参照。

【００３２】 ファージディスプレー／パンニング技術は本発明において使用されるペプチド
の同定に供するだけでなく、本発明において使用することができるそのようなペ
プチドをその表面に有するバクテリオファージの提供にも供する。即ち、本発明
の標的部分はペプチドを有するバクテリオファージ自身である。そのようなバク
テリオファージは、それが付着する細胞のＥＲ内へと容易に内在化されるという
利点を示す。例えば、実施例６参照。

【００３３】 本発明の１つの態様では、上記の標的部分は治療部分（例えば、薬物または毒
性物質）を、Ｈｓｐ４７をその表面に発現する細胞（例えば、癌細胞、例えば組
織または腫瘍の一部を構成している細胞）に送達するために使用する。本発明の
治療物質は、好ましくは、標的部分およびそれに付随する治療部分を含んでなる
。治療物質は、細胞をポジティブまたはネガティブに調節することができるが、
その細胞が存する環境（例えば、組織、腫瘍、転移、患者など）に対する正味の
治療効果を有する。「調節する」は、その細胞のいずれかの生理学的応答、例え
ば、代謝活性、内的または外的環境要因、合成または異化過程、活性化、抑制な
どが変化することを意味する。治療物質は、細胞または組織の成長、死滅、破壊
、除去、制御、修飾などの阻害または抑制を達成することができる。細胞破壊抑
制性、細胞溶解性、細胞毒性および制癌効果が含まれる。治療物質は、新生物表
現型を抑制することができる。または送達される細胞の正常な機能と相互作用す
るまたはそうでなければ無能力化する。１つの態様では、治療物質は、癌の確立
、成長または転移を阻止することができる。例えば、癌の再発を防止することが
できる。抗癌剤の代表例、例えば、免疫活性化剤および腫瘍増殖阻害物質が、例
えば米国特許第5,662,896号に開示されている。治療物質による（例えば、薬物
または毒性物質を含んでなる）、細胞、組織、腫瘍、転移、患者などにおける「
処置」のまたは「治療応答」の導出、本明細書において上記に記載したような応
答をもたらすことができる作用として定義される。治療物質の「有効量」とは、
そのような応答をもたらすのに十分な量を意味する。

【００３４】 物質が治療効果をもたらすかどうかの分析方法は、常套的であり慣用的であり
、インビトロまたはインビボで行なうことができる。動物モデルにおける薬動力
学的を実施するための典型的な方法は、実施例７に示す。腫瘍に対する物質の効
果を試験するための典型的な動物モデル、ヒト経口扁平肺胞細胞癌異種移植モデ
ルを実施例７に示す。分析し得る因子は、動物の生存率、処置した腫瘍の大きさ
の減少、およびリンパ節または肺転移などの転移の存在または不在である。

【００３５】 現在使用されている治療化合物を含め、様々な治療部分のいずれもが本発明に
包含されるが、その他の方法によって細胞に送達することができる。治療部分は
、天然の供給源から単離されるか、合成および／または組換え法により製造する
ことができ、その方法のすべては当業者によく知られている。本発明において使
用できる薬物または治療部分は、化学治療剤および／または細胞毒性物質、例え
ば、ステロイド、代謝拮抗物質、アントラサイクリン、ビンカアルカロイド、ネ
オカルチノスタチン（NCS）、アドリアマイシン、ジデオキシシチジン、シスプ
ラチン、ドキソルビシン、ピラルビシン、メルファランおよびドーモマイシンな
どである。標的部分にそのような部分を付ける方法は、常套的で慣用的なもので
ある。例えば、実施例７は、ドキソルビジンを抗体またはペプチド標的物質に付
ける方法を説明する。

【００３６】 １つの態様では、治療部分は毒素、例えば、リシン（例えば、そのＡおよび／
またはＢ鎖または脱グリコシル化された形態）、毒性のレクチン、ジフテリア毒
素、Psuedomonas aeruginosa由来の外毒物、アブリン、モデシン、ボツリナ毒素
、α−アマニチン、アメリカヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質（PAP、PAPI、PAP
IIおよびPAP−Sを含む）、リボソーム阻害タンパク質、特に大麦、小麦、トウモ
ロコシ、ライ麦またはゲロニン（gelonin）のリボソーム阻害タンパク質または
リボソーム不活性化糖タンパク質（GPIR）を含む。そのような毒物の断片、サブ
ユニット、ムテイン、模擬体、変異体および／または類縁体は、もちろん、当業
者に知られており、本発明に包含される。それらの毒性を保持するそのような変
異体または突然変異体のすべてが本発明にしたがって使用される.

【００３７】 毒物の選択および標的部分（例えば、ペプチドまたは抗体）との結合（例えば
、会合、付加または複合）方法は、当分野において常套的で慣用的なものである
。例えば、米国特許第5,840,522号；5,079,163号；4,520,011号；5,667,786号；
5,686,072号；4,340,535号；6,020,145号；5,254,342号；4,911,912号；4,450,1
54；および5,928,873号を参照。ペプチドまたはポリペプチド毒物を、例えば、
ペプチドまたは抗体標的部分に付加する方法は、例えば、共有結合、アフィニテ
ィー結合、インターカレーション、配位結合および錯体形成が含まれる。共有結
合は、存在する側鎖の直接の縮合または外部の架橋分子の取込みのいずれかによ
って達成することができる。多くの２価のまたは多価の物質は、タンパク質分子
をその他のタンパク質、ペプチドまたはアミン官能基などとカップリングさせる
のに有用である。例えば、文献は、カルボジイミド、ジイソシアネート、グルタ
ルアルデヒド、ジアゾベンゼンおよびヘキサメチレンジアミンなどを十分記載し
ている。ある態様では、当業者は、標的部分を最初に誘導体化し、次いで毒素成
分を誘導体化された生成物に付加することを望むかもしれない。この方法におい
て使用するための適当な架橋剤には、例えば、SPDP（N−サクシンイミジル−3−
（2−ピリジルチオ）プロピオネート）およびSMPT（4−サクシンイミジル−オキ
シカルボニル−α−メチルα（2−ピリジルチオ）トルエン）が含まれる。１つ
の態様では、毒素および標的部分は天然の遊離チオール基（例えば、リシンのＡ
鎖の）および／またはペプチド鎖の類縁体（例えば、ジスルフィド結合が可能な
システインを有するゲロニンの類縁体）に導入されたチオールまたは活性化ジス
ルフィド基との間のジスルフィド結合を形成することによって共有結合し得る。

【００３８】 別の態様では、治療部分は、当分野で認識されている様々なラジオアイソトー
プまたは放射性核種のいずれかを含むことができる。放射線療法の細胞毒性用量
を細胞に送達する放射線療法（核医学）は、当分野において慣用的であり、例え
ばEP 481,526；米国特許第5,962,424； Roeske et al（1990）. Int. J. Radiat
ion Oncology Biol. Phys. 19、1539−48；およびLeichner et al（1993）. Med
. Phys. 20（2 Pt. 2）、569−77に記載されている。そのような放射性化合物は
、標的細胞並びにその隣接する腫瘍細胞に影響を及ぼすことができ、ある理由ま
たは別の理由のために、それらの表面にＨｓｐ４７をディスプレーしない。使用
することができる放射能作用物質の種類およびどのようにしてそれらの標的部分
へ付加するかののさらなる開示は、造影剤を引用して以下に議論する。最も好ま
しい照射源は、Tc−99およびIn−111である。

【００３９】 別の態様では、治療部分は抗体を含み、例えば、さらなる治療部分に関連しな
い抗体に関して以下に議論するように、慣用のタイプの免疫療法の基礎として使
用することができる。

【００４０】 もちろん、様々な治療部分の組み合わせを１つの標的部分にカップリングする
ことができ、それによって可変の細胞毒性を適応させることができる。別の態様
では、２またはそれ以上の異なる治療物質を一緒に投与する。処置の多くの変法
が本発明に包含される。例えば、免疫応答を生じさせるのに有効な毒物（または
他の治療物質）の量で前もって患者を処置し、それにより患者に対する毒物の全
身的な保護をもたらすことが望ましいかもしれない。次いで、腫瘍細胞を死滅さ
せるのに有効な量で毒物を患者に投与することができる。例えば、米国特許第5,
667,786号を参照。

【００４１】 別の態様では、免疫療法において、さらなる治療部分と会合しない抗Ｈｓｐ４
７抗体を癌の処置に使用することができる。標的部分として本明細書に記載され
た抗体のいずれかのタイプを免疫療法に使用することができる。免疫療法の方法
は、慣用的であり、例えば号、米国特許第6,015,567号、5,478,556および6,017,
540号に記載されている。

【００４２】 １つのそのような態様において、抗体は細胞表面のＨｓｐ４７との会合により
効果がもたらされる。実施例３は、細胞表面に局在したＨｓｐ４７がテトラスパ
ニンタンパク質、CD9、に会合し、細胞の細胞マトリックスとの相互作用に関与
することができる。したがって、Ｈｓｐ４７に対する抗体は、細胞、例えば、癌
細胞、の細胞内マトリックスとの相互作用を調節することができる。さらに、Ｈ
ｓｐ４７の細胞表面発現は、細胞侵襲性およびphagokinesis（移動性）ト相関し
得、それが今度は発癌性細胞の転移能力と相関し得る。実施例４はいくつかの細
胞系においては、Ｈｓｐ４７の細胞表面発現と侵襲性／移動性との間に逆相関す
る。いずれか特定の機構に固執することを望むことなく、本発明は、抗Ｈｓｐ４
７抗体を用いて細胞（例えば、癌細胞、腫瘍など）を調節（細胞の生理学的な活
性または特性を増大または減少させる）、例えば腫瘍（例えば、癌）の侵入、遊
走／運動性、および／または腫瘍細胞（例えば、癌細胞）の転移を処置する方法
を含む。

【００４３】 Ｈｓｐ４７細胞表面発現が腫瘍と逆相関する場合において、侵襲性および／ま
たは転移、表面発現したＨｓｐ４７の検出は、実質的に非転移性および／または
より良好な予後に関連する腫瘍（例えば、癌）を同定するための診断方法の基礎
として供する。Ｈｓｐ４７の発現が実質的により低いその表面における

【００４４】 別のそのような態様では、抗体は免疫学的な効果を導出することができる。特
定の機構に固執することを望むことなく、本発明は、抗体が抗体介在細胞介在毒
性についてＮＫ細胞を補充する状況を含む。二機能性抗体は、腫瘍細胞付近のＮ
ＫおよびＴ細胞のようなエフェクターを有することができる。多くの様々な免疫
療法が当業者には明らかであろう。例えば、２つの二重特異性ヘテロ抗体コンジ
ュゲート、例えば、抗腫瘍／抗CD3および抗腫瘍/抗CD28、を同時投与することが
できる。いずれか特定の機構に固執することを望むことなく、２つのそのような
ヘテロコンジュゲートは相乗的に作用してＴ細胞と腫瘍との間の接触を誘導する
ことができ、Ｔ細胞それ自身が、たとえ腫瘍標的に対して慣用的な特異性を有し
なくても、直接細胞毒性を活性化することができる。

【００４５】 他の治療物質について本明細書に記載されているような、慣用の送達法および
用量を用いて、患者内へ直接抗体を誘導することにより、免疫療法を行なうこと
ができる。別法として、細胞介在の免疫応答を導き出すために、免疫エピトープ
を含むＨｓｐ４７の１またはそれ以上の外部領域またはその断片を患者へワクチ
ンとして導入することができる。好ましい態様では、外部領域は単離される。例
えば、膜貫通および細胞質領域を本質的に含まない。外部領域またはその断片は
任意のサイズであってよいが、少なくとも１つの免疫エピトープを含んでいる。
所望ならば、外部領域は、免疫応答を増大させる１またはそれ以上の他の試薬、
例えば、Ｂ７またはサイトカインIFNγ、GMCSF、L2/4および7などの共刺激分子
；抗原分子、ペプチド；または適当なアジュバントとともに同時投与するかまた
はコンジュゲートを形成させることができる。

【００４６】 別の態様では、その表面にＨｓｐ４７に特異的なペプチドを含むバクテリオフ
ァージは、遺伝子治療の実施のためのベクターとして供することができる。その
ような方法において使用することができるファージを得るために設計されたファ
ージディスプレーおよびアフィニティーパンニングの典型的な方法は、本明細書
に記載されている。その哺乳類宿主における発現が望ましい遺伝子を哺乳類発現
カセットに挿入するしたのち、ファージゲノムへクローニングすることができる
。哺乳類遺伝子発現のためのカセットは、目的の核酸中へそのようなカセットを
クローニングするための方法であるように、当分野において慣用的なものである
、例えば、線状ファージのＤＮＡ。遺伝子をクローニングまたは発現させるため
の方法は、当業者にとって常套的なものである。例えば、Sambrook、J. et al（
1989）. Molecular Cloning，a Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Labor
atory Press，Cold Spring Harbor，NY；Ausubel，F.M. et al（1995）. Curren
t Protocols in Molecular Biology，N.Y.，John Wiley & Sons；およびDavis e
t al.（1986），Basic Methods in Molecular Biology，Elsevir Sciences Publ
ishing，Inc.，New Yorkを参照。特に、ファージを哺乳類細胞のための遺伝子送
達ビークルとして使用する方法は慣用的なものであり、例えば、Larocca et al
（1999）. FASEB Journal 13，727−734；Barry et al（1996）. Nat. Biotechn
ology 1282，7711；Larocca et al（1998）. Hum. Gene Ther. 9，2393−2399；
Poul et al（1999）. J. Mol. Biol. 288，203−11；およびKassner et al（199
9）. Biochem. Biophys. Res. Comm. 264，921−8に記載されている。

【００４７】 単離、クローニング、修飾、標識、操作、配列決定およびそうでなければ処置
または核酸および／またはタンパク質の解析を含む、本出願において引用されて
いる多くの分子生物学的技術に関しては、例えば、Hames et al.（1985），Nucl
eic Acid Hybridization，IL Press. Dracopoli，N.C. et al.，Current Proto
cols in Human Genetics，John Wiley & Sons，Inc.；および Coligan，J.E. et
al.，Current Protocols in Protein Science，John Wiley & Sons，Inc.を参
照。

【００４８】 様々な治療遺伝子のいずれかは、遺伝子治療の方法においてそのようなベクタ
ーを用いて細胞内へ導入することができる。そのような遺伝子はタンパク質に翻
訳され、アンチセンス核酸配列またはリゾザイムなどとして発現され得る。遺伝
子を宿主のゲノムへ組込むことができるか、または安定に維持することができる
か、または組込まれない形態で一過性発現させることができる。

【００４９】 投与することができる遺伝子の種類は、当分野でよく知られており、遺伝子治
療のためのそれらの使用方法とともに、例えば、Culver et al（1994）. TIG 10
，1744−178および米国特許第6,017,896号；同第5,916,803号；同第5,871,726号
；同第5,688,773号；同第5,496,731号；同第5,631,236号；同第5,962,424号；同
第5,922,685号；同第5,789,244号；同第5,662,896号；同第5,532,220号；同第5,
888,502号；同第5,888,814号；同第5,932,210号；および同第5,916,803号に開示
されている。遺伝子は生体外で細胞に導入し、患者内へ再び導入することができ
るかまたは生体内で導入することができる。投与することができる一般的クラス
の遺伝子は:腫瘍の免疫原性を増大する遺伝子、例えば、外来抗原をコードする
遺伝子；アポトーシスを開始する遺伝子；免疫細胞を増大させて抗腫瘍活性を増
大させる遺伝子、例えば、IL−1、IL−2、IL−4、IL−6、IL−12、TNF−αまた
はβ；GM−CSF、G−CSF、M−CSF、IFN−α、βまたはγ、TGF−αまたはβ、TNF
−αまたはβ、NGFなどのサイトカインをコードする遺伝子；感受性または自殺
遺伝子（例えば、HSV−またはVZV−Tkをコードする遺伝子、ガンシクロビルに対
する感受性を与える遺伝子；またはシトシンデアミナーゼをコードする遺伝子、
５−フルオロシトシンに対する感受性を与える遺伝子；または非ヒトプリン開裂
酵素をコードする遺伝子、例えばプリンヌクレオシドホスホリラーゼ、酵素によ
って開裂されるとき、細胞に対して毒性になるプリン基質に対する感受性を与え
る遺伝子）；オンコジーンの発現をブロックする遺伝子、例えば、アンチセンス
K−RASメッセージをコードする遺伝子）；野生型腫瘍抑制因子遺伝子（例えば、
p53；p16；網膜芽細胞腫（RB）遺伝子、全長p110^RBまたはp94^RBまたはp56^RB等の
突然変異体タンパク質；ミトシン；またはH−NUC）；腫瘍が免疫学的な破壊を回
避する機構をブロックする遺伝子、例えば、アンチセンスIGF（インスリン様成
長因子）−１メッセージをコードする遺伝子；ヌクレアーゼ（例えば、RNase A
）またはプロテアーゼ（例えばトリプシン、パパイン、プロテイナーゼＫ、カル
ボキシペプチダーゼなど）処理を施された細胞質変異体をコードする遺伝子；お
よび上記のタンパク質毒性毒物のいずれかをコードする遺伝子。

【００５０】 多くの他の種類の遺伝子治療が本発明に含まれ、当業者には明らかであるだろ
う。例えば、上記のいずれかの標的部分は、目的の遺伝子と会合（例えば、共有
的にまたは非共有的に結合）し、目的遺伝子の細胞への送達に供する。別の態様
では、標的部分は、１またはそれ以上のa）挿入する遺伝子のための非ウイル担
体；b）その細胞の細胞質および場合により核へのベクターの侵入を増大させる
ための融合タンパク質；およびｃ）バクテリオファージ介在の遺伝子治療につい
て上に記載した治療遺伝子もまた含んでなるベクターの部分を含んでなる。成分
ａ）およびｂ）の多くの変異体が当業者に知られるであろう。これら成分のさら
なる記述については、例えば、米国特許第5,916,803号および細胞へのペプチド
および類似物質の導入に関して以下の節を参照。

【００５１】 治療物質を、インビトロまたはインビボで、細胞、組織または腫瘍または患者
に送達（投与、導入）し、誘導された効果を監視する方法は、当業者には明らか
であろう。例えば、本明細書に引用されている文献、およびVitetta et al（199
1）. Cancer Res. 51、4052を参照。インビボで投与される物質は、製薬的に許
容し得る担体、賦形剤または媒質とともに製剤化することができ、さらにその他
の薬剤、例えば、アジュバント、安定化剤、増強剤などを添加することができる
。本発明により処理を施される標的の特異性は、全身的投与が可能である。別法
として、物質を処置される組織または腫瘍の部位でまたはその近くに投与するこ
とができる。（もちろん、本明細書に開示された投与経路を、処置する方法と同
様、標的を検出（造影）する方法のために使用することができる）投与の方法は
、非経口および非腸管外経路を含め、慣用的なものである。非経口経路には、例
えば、静脈内、鼻内、門脈内、筋肉内、皮下、腹腔内；髄腔内、鞘内、脳室内、
頭蓋内、胸腔内または他の注入経路が含まれる。非腸管外経路には、例えば、経
口、鼻、経皮、肺、直腸、口腔内、経膣、眼が含まれる。非腸管外経路送達に関
して、例えば、ブレフェルジンＡまたはモネンシンの投与によって、細胞表面受
容体／リガンド複合体のトランスサイトーシスを増大させる物質を使用すること
が望ましい。例えば、米国特許第5,254,342号を参照。

【００５２】 投与する薬物は慣用の手順によって決定することができ、一般に、当業者によ
く知られている。考慮すべき要素としては、関与する具体的な物質の活性、代謝
に関する安定性、およびその物質の作用の長さ、投与の形態と時間、薬物の組み
合わせ、排出速度、処置される種、および年齢、体重、一般的健康状態、性別、
食生活および治療を受ける宿主の具体的な病的状態の重さが含まれる。例えば、
免疫毒素のための適当な治療レジメは、（即ち、１またはそれ以上の毒素分子と
コンジュゲートした、抗体または変異体またはその断片を含んでなるコンジュゲ
ート）は、約０．５〜２ｍｇ／ｋｇの用量で患者への投与することによるもので
ある。

【００５３】 治療物質は、細胞または組織内の様々な場所のいずれかに内在化することがで
きる。ある場合では、治療物質を、ＥＲ内へ回収されるようにＨｓｐ４７を伴う
ことによって細胞に内在化することが望ましい。他の場合では、治療物質が細胞
のエンドソームまたはリソソーム内へ取り込まれることが望ましい、例えば、活
性になるためにはタンパク質加水分解によりプロセシングされねばならないタン
パク質毒素。さらに他の場合では、その物質が酵素による分解を回避し、細胞質
および／または核内に輸送される事が望ましい。表面で結合した物質の細胞内へ
の輸送を増大させるための様々な慣用の方法を使用することができ、ある場合に
はそのようなタンパク質加水分解を回避することができる。例えば、直接または
間接的に、治療物質を、担体および／または融合タンパク質と会合させて、治療
物質の送達のためのベクターを作成することが望ましいかもしれない。

【００５４】 様々な適当な担体（例えば、非ウイルス性担体）が当分野においてよく知られ
ており、例えば、米国特許第5,916,803号；Cotten et al（1993）. Curr. Biol.
4，705；Behr（1993）. Acc. Chem. Res. 26，274；Felgner（1990）. Adv. De
liv. Rev. 5，163；Behr（1994）. Bioconjugate Chem. 5，382；およびLedley
（1995）. Hum. Gene Ther. 6，1129に記載されている。好ましい態様では、担
体は、生体内で長い半減期を示し、標的細胞に対し結合可能なベクターを最大に
することが可能である。好ましい担体は、リポソームまたはカチオン性脂質、ポ
リペプチドまたはタンパク質などである。担体は、様々な慣用的な手段のいずれ
かによって、直接（例えば、カップリング）または間接的に治療物質と会合する
ことができる。

【００５５】 様々な融合タンパク質が、細胞へのおよび／またはエンドソームまたはリソソ
ームから細胞の細胞質へのベクターの侵入を増大させることができる。多くのタ
ンパク質またはその断片または変異体は、多くのウイルスタンパク質を含め、融
合原性（fusiogenic）特性を有する。そのようなタンパク質は、当業者によく知
られており、例えば、米国特許第5,916,803号；Hughson（1995）. Current Biol
. 5，265；Iloekstra（1990）. J. Bioenergetics Biomembranes 22，675；およ
びWhite（1990）. Ann. Rev. Physiol. 52，675に記述されている。

【００５６】 ある場合では、Ｈｓｐ４７の外部領域より効率的に結合するようにおよび／ま
たは細胞内により効率的に内在化されるように、標的部分を修飾することができ
る。例えば、表３に示される７−ｍｅｒのペプチドのような合成より製造された
短いペプチド、は時として結合するが、標的細胞によって取り込まれない；とこ
ろが、いくつかのペプチドは、それがバクテリオファージのｐＩＩＩ末端にディ
スプレーされた時に内在化される。例えば、短い合成ペプチドの内在化を増大さ
せるために、所望の特性、例えば、短いペプチドを、それがＨｓｐ４７を表面に
有する細胞に結合することができ、およびその細胞によって内在化され得るが、
それ自身はＨｓｐ４７をその表面にディスプレーする細胞以外の細胞には結合し
ないようなやり方で、ディスプレーするリンカー；循環内で安定であり；内在化
の後でプロセシングされることができるなど、を有する合成ペプチドリンカーを
そのペプチドに付加することができる。その他の、標的部分のこのような改良の
ための修飾は当業者には明らかであろう。

【００５７】 本発明の別の態様では、上記の標的部分は、Ｈｓｐ４７をその表面に発現する
細胞、例えば、癌細胞、いずれかの進行段階にある癌、腫瘍、転移（微小癌組織
の転移を含む）などの検出（造影、同定）を可能にする検出可能な部分と会合す
る。標的部分および検出可能な部分を含む物質は、本明細書では検出可能な作用
物質または造影剤と呼ばれる。このような検出は、インビトロまたはインビボで
行なうことができる。検出方法は、定量的なものである。例えば、細胞の表面に
発現したＨｓｐ４７の大部分またはＨｓｐ４７をその表面に発現する細胞数は、
細胞、腫瘍、動物、患者などを、検出可能なマーカーを同定および定量すること
ができる検出装置に暴露させることによって定量することができる。

【００５８】 本発明に包含される検出可能な部分としては、例えば、シグナル発生物質［電
磁放射線の形で検出可能な量のエネルギーを放出することが可能な物質（Ｘ線、
紫外線照射、赤外線照射、可視光放射など）、燐光性および蛍光性物質、生物発
光マーカー、ガンマ線およびＸ線放射物などが含まれる]；シグナル反射物（例
えば、常磁性物質）；またはシグナル吸収物（例えば、電子ビームオパシファイ
アー色素）が挙げられる。

【００５９】 検出可能な部分は、標的部分への治療部分への結合に関する上記の方法を含め
、様々なよく確立された方法のいずれかによって標的部分と結合する（会合する
）ことができる。例えば、インビトロ検出に特に適した方法において、放射性の
エレメント（例えば、アミノ酸）を標的部分（例えば、ペプチド鎖）に直接取り
こませることができ、オートラジオグラフィーにより検出することができ；また
は蛍光標識を、ビオチン／アビジン相互作用、フルオレセインとコンジュゲート
した抗体との会合などにより、そのような標的部分と会合させることができ、免
疫蛍光顕微鏡検査法、フローサイトメトリー（FACscan）などにより検出するこ
とができる。

【００６０】 標的を増大する金属は本発明に包含され、特にインビボ造影に適している。本
発明に従う金属には、例えば、ＭＲＩのための常磁性金属；例えば、原子数が少
なくとも３７、好ましくは少なくとも５０の、Ｘ線または超音波画像診断のため
の重金属イオン；シンチグラフィーのための放射性同位元素のイオンが含まれる
。金属の選択は、所望の診断的（または治療的）応用によって決定する。放射性
イオンの例としては、例えば、ランタニドのイオンまたは他の金属イオン、同位
体およびその放射性同位体を含む、例えば、ヨウ素¹²³、ヨウ素¹²⁵、ヨウ素¹³¹
、テクにシウム^99m、インジウム¹¹¹、レニウム¹¹⁸、レニウム¹⁸⁶、銅⁶⁷、イット
リウム⁹⁰、アスタチン²¹¹、ガリウム⁶⁷、イリジウム¹⁹²、コバルト⁶⁰、ラジウム²² 、金¹⁹⁸、セシウム¹³⁷、リン³²、炭素¹⁴、およびトリチウムイオンが含まれる
。蛍光発生物質（fluorogenic agents）の例としては、ガドリニウムおよびレナ
グラフィンが挙げれあれる。

【００６１】 金属は、当業者によく知られた任意の様々な手段によって標的部分と会合する
ことができる。造影増強部分を作製、その標的部分への付加およびその検出のた
めの使用の方法に関して、例えば、EP 481,526；GB−A−2169598；およびEP 136
,812を参照。例えば、ポリキレート剤（polychelant）、二価性ポリキレート剤
（bifunctional polychelant）、およびその塩または大環状中間体を含むキレー
ト剤により、金属を標的部分に結合（会合、付着）させることができる。増加を
倍増させるために存在する様々な方法、例えば、多数のキレート剤がそこに結合
する、骨格分子の成分となる化合物、例えばポリアミン、の使用がある。

【００６２】 造影剤を投与することができる経路は、治療剤の送達に関して上に記載されて
いる。本発明の造影剤は、特定の造影技術を用いて所望のコントラストが得られ
るに十分な量で患者に投与することができる。一般に、患者の体重１ｋgあたり
約０.００１〜５.０モルの錯体化された造影金属イオンの用量が、適当なコント
ラスト強度を達成するのに有効である。 大部分のＭＲＩ適用に関して、造影金
属イオンの好ましい用量は、約０.０２〜１.２モル／ｋg体重の範囲内であろう
；一方、Ｘ線適応については、約０.５〜１.５モル／ｋgの用量が、Ｘ線の減衰
に一般的に有効である。大部分のＸ線適応に好ましい用量は０.８〜１.２モルの
ランタニドまたは重金属／ｋｇ体重である。

【００６３】 本発明の別の態様は、Ｈｓｐ４７をその少なくともいくつかの細胞の表面に発
現する癌に対して特異的に結合する物質、好ましくはその物質が患者における癌
を処置するのにまたは患者における癌を診断するのに有用である物質、をスクリ
ーニングする方法であって、Ｈｓｐ４７の外部領域に特異的に結合する物質を同
定することを含んでなる方法である。その物質がＨｓｐ４７の外部領域に結合す
かどうかを決定するため、および特異性および／または結合の親和力を測定する
ための物質は、本出願のどこかに記載されている。そのような方法を用いる目的
物質をスクリーニングするための常套的な手順が可能である。

【００６４】 本発明の別の態様は、Ｈｓｐ４７がその癌細胞のいくつかの表面に発現してい
る癌に罹患している患者を処置するため、またはＨｓｐ４７がその癌細胞のいく
つかの表面に発現している癌に罹患している患者を検出するためのキットであっ
て、Ｈｓｐ４７の外部領域に特異的に結合する物質を癌に対する細胞増殖抑制ま
たは細胞溶解効果をもたらすのに有効な量で含んでなるキットである。好ましい
態様では、この物質は、標的部分として、その部分のそれぞれがＨｓｐ４７の外
部領域に特異的に結合する、抗体またはその断片、ペプチドまたはその表面がペ
プチドであるバクテリオファージを含んでなる。好ましい態様では、標的部分は
、モノクローナル抗体、コンセンサスモチーフXHyHyXXHyXXXXHyHy（配列番号１
）またはコンセンサスモチーフHyXXXHyHyXXHyXXX（配列番号２）［式中、Ｘは、
独立に、任意のアミノ酸であり、およびHyは、独立に、任意の疎水性アミノ酸で
ある］を含んでなるペプチド、表１および表２の配列番号３〜配列番号２５のい
ずれかを有するペプチド、またはその表面がＨｓｐ４７の外部領域に特異的に結
合するペプチドであるバクテリオファージであり得る。

【００６５】 一態様では、この物質は治療成分、毒素、放射性同位体または放射性核種、抗
体、または治療遺伝子をコードする核酸を含む。本発明はまた、Hsp47をその表
面に発現する細胞を調節するキットであって、Hsp47の外部ドメインに特異的に
結合する、該細胞を調節するのに有効な量の物質を含むものを含む。 もちろん
、本発明のキットは、治療物質および／または造影剤（imaging agents）用の１
個またはそれ以上の容器を含むであろう。

【００６６】 実施例 以下の実施例１〜６に開示するデータは原稿 1) Hebert et al. (1999). J. C
ellular Biochemistry 73, 248-258（これはその全ての内容が引用により包含さ
れる）および 2) Sauk et al. (2000). J. Cellular Biochemistry（２０００年
１月にアクセプトされたもの。これは補遺１として本明細書中に含まれ、引用に
よりその全ての内容が包含される）に示されている。

【００６７】 実施例１ 口類表皮癌腫細胞の表面でのコリジン／Ｈｓｐ４７の発現 実験は、確立されたセルラインである、ヒト口扁平上皮細胞癌腫 (SCC-4, SCC
-9, SCC-15 および SCC-25) およびマウス類表皮セルライン、Lewis Lung Carci
noma (LL/2)（ATCCから入手）を用いて行う。さらに初期の歯肉繊維芽セルライ
ンをコントロールとして用いる。

【００６８】 Ａ．フローサイトメトリー分析： これらの実験では、コリジン／Ｈｓｐ４７に対するモノクロナ−ル抗体 SPA-4
70 (StressGen, Victoria, BC) およびマウスコリジン／Ｈｓｐ４７のＮ末端配
列に対応する22-merペプチドに対して作成されたコリジン／Ｈｓｐ４７ウサギポ
リクローナル抗体を用いる。サイトメトリー分析用のモノクローナル抗体は、5(
6) カルボキシフルオレセイン−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルキット
(Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) を用いて直接フルオレセインとコン
ジュゲートされたものであるか、あるいはEZ-Link（商標）スルホ-NHS-LC-ビオ
チニル化キット (Pierce, Rockville, Ill) を用いる抗体のビオチニル化にした
がって、SA-Red670（商標）でラベルされたものである。

【００６９】 インビトロで生育させた細胞を洗浄し、ポリグロビンＮの0.5%溶液中でインキ
ュベートして不飽和Ｆｃレセプターをブロックし、モノクローナル抗体の非特異
的結合を減少（reduce）させる。次いで細胞懸濁液（1X106 cell/ml）５０ｍＬ
をフルオレセインまたは SA-Red670（商標）(GibcoBRL, Gaithersburg, MD) と
コンジュゲートされた抗体２．５ｍＬ（１ｍｇ）とインキュベートする。洗浄後
、この細胞ペレットを、フローサイトメトリーアッセイ用のＢＳＡを含むＰＢＳ
に再懸濁する。細胞内コリジン／Ｈｓｐ４７を評価するため、まず細胞を０．１
％サポニンで透過化処理する。次いでサンプルをFACScanフローサイトメーター
(Becton Dickinson, San Josee, CA) で分析する。４８８ｎｍアルゴンレーザー
を１５ｎＷのパワーで作動させる。フルオレセインコンジュゲートからのデータ
を 530/30 BP フィルターによって収集する。二色フローサイトメトリー分析で
は、フルオレセインまたは Red670（商標）のいずれかをヨウ化プロピジウムと
ともに用いる。用いるフィルターは 600 nm 二塩素 SP; 525 ± 15nm BP (フル
オレセイン) および 645 LP (Red670(商標)) である。

【００７０】 ヨウ化プロピジウムを用いて、細胞周期を評価し、死細胞を染色する。これら
の実験では、ＰＩを含む低張のクエン酸溶液を〜１×１０⁶洗浄細胞に濃度１ｍ
Ｍまで加える。細胞を２０分間ラベルした後、その染色溶液中、FACScanで分析
する。585/42 nm BP フィルターによってオレンジＰＩ蛍光を収集する。

【００７１】 蛍光チャンネル収集発光中で電気補正（electronic compensation）を用いて
残りのスペクトル重複（residual spectral overlap）を除去する。蛍光データ
を４−１０ロングスケールで表示する。各サンプルに対して１０，０００イベン
トの最小値を収集する。データの分析は LYSYS II ソフトウェア (Becton Dicki
nson, Mansfield, MA) で行う。細片および凝集塊の排除のため、蛍光二重パラ
メータ輪郭プロット（Fluorescence dual parameter contour plots）を用いる
。このゲーティング方法は、死細胞から細片を容易に区別することを可能にする
(低前方光散乱（forward light scatter）および 高PI蛍光)。G_1/0, S, of G₂/
M DNA 相補物（complement）を伴う細胞のパーセンテージを、オンボード Multi
cycle（登録商標）データ分析ルーチン(Phoenix Flow Systems, San Diego, CA)
を用いる領域積分によってＤＮＡヒストグラムから測定する。

【００７２】 ＳＣＣセルライン、ＬＬ／２マウスセルラインおよびヒト歯肉繊維芽細胞のフ
ローサイトメトリー分析は、これら全てのセルラインが細胞内コリジン／Ｈｓｐ
４７を有していることを示す。さらに、細胞周期分析は、コリジン／Ｈｓｐ４７
発現が、歯肉繊維芽細胞または類表皮癌腫細胞のいずれにおいても細胞周期のい
ずれの時期にも限定されないことを示す。しかし、細胞周期分析を細胞表面の発
現に関してのみ行った場合、コリジン／Ｈｓｐ４７は類表皮癌腫セルラインにの
み限定される。

【００７３】 Ｂ．免疫蛍光実験： Tang et al. (Tang et al. (1994). Eur. J. Cell Biology 65, 298-304; Tan
g et al. (1993). Eur. J. Cell Biology 120, 325-328) の方法にしたがって免
疫蛍光顕微鏡観察を行う。細胞表面のコリジン／Ｈｓｐ４７を可視化するため、
細胞を透過化処理せず、サイトメトリー分析に関して記載されるように１％パラ
ホルムアルデヒドで処理および固定する。次いでこの細胞を一次抗体である抗−
コリジン／Ｈｓｐ４７抗体で染色し、次いでFITCヤギ−抗−ウサギまたは抗−マ
ウスＩｇＧで染色する。

【００７４】 フローサイトメトリー分析用に調製された非透過化処理細胞の免疫蛍光顕微鏡
観察により、その表面の抗−コリジン／Ｈｓｐ４７染色を確認する。

【００７５】 Ｃ．細胞成分膜フラクション： 原形質膜の分画方法は、Weber et al. (1988). "Subcellular distribution o
f Insulin Receptors" in Insulin Receptors. Kahn CR and Harison LS, eds.
(New York: Alan R. Liss, Inc), pp. 171-187 に記載される方法にしたがい、
これを修飾したものである。本質的に、細胞［(2-5) x 10⁶ 細胞／ｍＬ］５ｍＬ
を１ｍＭ アミロライドとインキュベートするか、あるいはせず、次いで細胞懸
濁液を室温で６０秒間、１００ｇで遠心する。細胞ペレットを１８〜２０℃のト
リス／ＥＤＴＡ／スクロースバッファー（２０ｍＭ トリス／ＨＣｌ、１ｍＭ Ｅ
ＤＴＡおよび２５５ｍＭ スクロース、ｐＨ７．４）１０ｍＬに懸濁する。この
ペレットを、ガラス−テフロン（登録商標）ホモジナイザーを用いてトリス／Ｅ ＤＴＡ／スクロースバッファー５００μＬに再懸濁し、２０ｍＭ トリス／１ｍ Ｍ ＥＤＴＡバッファー（ｐＨ７．４）中の１．２Ｍ スクロースのクッション６ ００μＬに重ね、Beckman TLS55 ローター中、４℃で３０分間、８,１５０ｇで 遠心する。クッション界面で収集された原形質膜をトリス／ＥＤＴＡ／スクロー スバッファー２．５ｍＬに懸濁し、Beckman TLA100.3 ローター中、４℃で２０ 分間、４１０,０００ｇで遠心する。最終原形質膜ペレットをバッファー６０μ Ｌに再懸濁する。次いでこのサンプルを細菌コラゲナーゼで処理し、細胞分画の 結果、細胞質由来のプロコラーゲン−コリジン／Ｈｓｐ４７が細胞表面のインテ グリンレセプターに結合する可能性を排除する。初期上清を Sorvall SS34 ロー ター中、４℃で１５分間、４８,０００ｇで遠心し、高密度ミクロソームペレッ トをバッファー４０μＬに最懸濁する。この上清をさらに、Beckman 70.1 ロー ター中、４℃で７５分間、３００,０００ｇで遠心し、低密度ミクロソームペレ ットをバッファー６０μＬに再懸濁する。

【００７６】 この膜フラクションは原形質膜のマーカーである５'−ヌクレオシダーゼ活性
の分布によって特徴付けられる。タンパク質はBCAタンパク質アッセイキット(Pi
erce, Rockford, IL)を用いて測定する。原形質膜を直接ＰＡＧＥおよびウエス
タン分析に付する。ウエスタンブロットでは、タンパク質をSDS-PAGE上で電気泳
動し、直ちにニトロセルロース紙に電気的にトランスファーし、１０ｍＭ トリ
ス−ＨＣｌ ｐＨ７．４、０．９ｍＭ ＮａＣｌ（ＴＢＳ）中の１０％ ＮＦＤＭ
で２時間ブロックし、次いで２％ NGS (GIBCO, Grand Island, NY) を含むTBS/N
FDM中でブロックする。抗血清またはペル免疫(perimmune)血清を同じバッファー
中で１：２０００希釈し、一晩穏やかに振りながらインキュベートする。次いで
ニトロセルロースをＴＢＳ／トウィーン中で５分間、３回すすぐ。 [¹²⁵Ｉ]−ラ
ベルプロテインＡ (New England Nuclear, Boston, MA) を用いてHsp47を検出す
る。

【００７７】 原形質膜フラクションを得るためのアミロライドおよびコントロール細胞の細
胞成分膜分画およびその後のウエスタンブロット分析により、原形質膜５'−ヌ
クレオシダーゼフラクション中のコリジン／Ｈｓｐ４７の存在が確認される。

【００７８】 実施例２ 細胞表面コリジン／Ｈｓｐ４７のα１ (Ｉ) Ｎ−プロペプチドへの結
合： プロα１(Ｉ)−Ｎ−プロペプチド球状ドメイン（ＮＰ１）[残基２３〜１０８] およびこの球状ドメイン＋プロペプチドGlyXaaYaaドメイン（ＮＰ２）[残基２
３〜１５１] をコードするＤＮＡ配列を、以前に記載されるようにＧＳＴ融合タ
ンパク質として調製する (Hu et al. (1995). Cellular Biochemistry 59, 350-
367)。融合タンパク質発現は、細菌が対数増殖中期に達した後、０．１ｍＭ Ｉ
ＰＴＧによって誘導する。融合タンパク質をグルタチオニン−セファロース４Ｂ
ビーズ(Pharmacia, Piscataway, NJ)によって製造元の指示書にしたがって精製
する。このタンパク質をSDS-PAGEおよびウエスタンブロット分析によって以前 (
Hu et al., 同箇所) に記載されるように特徴付けする。

【００７９】 Hu ら (1995)（同箇所）の方法にしがたい、ＮＰ１およびＮＰ２のアフィニテ
ィービーズを調製する。本質的には、ＧＳＴ融合タンパクをトロンビンで処理し
、透析し、このＧＳＴタンパク質をグルタチオン−セファロースのカラムに通し
て各反応混合物から取り出す。溶出物を収集し、凍結乾燥し、ＣＮＢｒ活性化セ
ファロースとカップリングさせる。最終ビーズは２５０μＬ当たりペプチド１〜
２ｍｇを含む。Hsp47表面結合実験は、ペプチド−セファロース(Pharmacia, Pis
cataway, NJ)の５０％(ｖ／ｖ)懸濁液２５０μＬを表面ビオチニル化ＳＣＣ細胞
由来の原形質膜の懸濁液と混合することによって行う。４℃で１時間インキュベ
ートした後、このビーズを遠心によって収集し、等量のLaemmliバッファーで３
回洗浄する。サンプルを５分間ボイルすることにより、このビーズをLaemmli電
気泳動サンプルバッファーで抽出する。SDS-PAGEによって分離した後、タンパク
質をニトロセルロース膜にトランスファーし、Renaissance 化学発光試薬 (NEN,
Cambridge) を用いて HRPO-コンジュゲート化 ExtrAvidin (Sigma Chemical Co
., St. Louis, MO.) で可視化する。

【００８０】 生存細胞中のプロコラーゲンプロペプチドを結合する細胞表面コリジン／Ｈｓ
ｐ４７のアベイラビリティーを示すため、ＧＳＴ融合タンパク質（１μｇ／ｍＬ
）を〜１×１０⁶ＳＣＣ細胞の培養培地に加え、小分けスライド（chambered sli
des）(Nalgene NUNC, Milwaukee, WI) 中、３７℃で１０分間培養（plate）する
。次いでこの細胞をＰＢＳで洗浄し、パラホルムアルデヒドで前記のように固定
し、Sauk et al., (1994). I. Biol. Chem. 269, 3941-3946 の手法にしたがい
、細胞結合融合タンパク質（ＮＰ１、ＮＰ２）を HRPO-コンジュゲート化抗−Ｇ
ＳＴ抗体を用いて同定する。

【００８１】 ビオチンラベル原形質膜およびセファロース結合プロα１(１) 球状ドメイン
（残基２３〜１０８）またはプロα１(１) 球状ドメイン＋プロペプチドGlyXaaY
aaドメイン（残基２３〜１５１）を用いて行った結合実験は同様の結果を示す。
両例では、４６Ｋおよび４７Ｋでのバンドの移動が同定される。ウエスタンブロ
ット分析により、４６Ｋの非グリコシル化コリジン／Ｈｓｐ４７ (Hirayoshi et
al., 1991) および４７Ｋのバンドの両方が抗−Hsp47抗体と反応することを確
認する。これらの知見は全てのセルラインに一貫している。

【００８２】 培養中の細胞と結合したＧＳＴ融合タンパク質のイムノペルオキシド（Immuno
peroxide）細胞化学染色は、より高いパーセンテージの、表面コリジン／Ｈｓｐ
４７を発現する細胞を伴うセルラインほど、より高いパーセンテージの結合ＧＳ
Ｔ−ＮＰ１およびＧＳＴ−ＮＰ２融合タンパク質を表示することを示す。

【００８３】 実施例３ 細胞表面ラベルおよび免疫沈降： 用いた方法は、インテグリンとのＴＭ４ＳＦ複合体の特徴付けに関して以前 (
Berditchevski et al., (1996) Molec. Biol. of the Cell 7, 193-207) に記載
されているものであった。本質的には、細胞をキットのプロトコルにしたがって
NHS-LC-ビオチン (Pierce, Rockford, IL) でラベルし、免疫沈降バッファー[1%
Brij 96, 25 mM ヘペス, pH 7.4, 150 mM NaCl, 5 mM MgCl₂, 2 mM PMSF, 20
μg/ml アポチニン (apotinin) および 10 μg/ml ロイペプチン]に溶解する。
免疫複合体を抗体とあらかじめ結合させたプロテインＡビーズ上で集めた後、免
疫沈降バッファーで４回洗浄する。より「ストリンジェント」な条件では、免疫
沈降バッファーに０．２％ＳＤＳを補う。免疫複合体をプロテインＡビーズから
Laemmli溶出バッファーで溶出し、タンパク質をSDS-PAGEによって分離する。タ
ンパク質をニトロセルロース膜にトランスファーし、Renaissance 化学発光試薬
(NEN, Cambridge) を用いて HRPO-コンジュゲート化 ExtrAvidin (Sigma Chemi
cal Co., St. Louis MO) で可視化する。表面ビオチニル化ＳＣＣ細胞から調製
したBrij 96ライセートから再沈降を行う。免疫沈降バッファーで５回洗浄した
後、タンパク質複合体を免疫沈降バッファーに加えた０．５％ ＳＤＳで解離さ
せる。次いで溶出液を免疫沈降バッファーで１：１希釈し、セファロースビーズ
と直接カップリングさせた適当な抗体で再沈降させる。次いでサンプルを上記の
ように処理する。

【００８４】 架橋では、細胞をDTSSP、膜不透過クロスリンカーまたはDSPで処理する。０．
２％ ＳＤＳを補った免疫沈降バッファーに可溶化後、タンパク質複合体を上記
のように免疫沈降させ、還元条件下で分析する。 膜表面タンパク質は一貫して抗-コリジン／Ｈｓｐ４７抗体と共に沈降する。
架橋実験では、SCC および LL/2 細胞をまず、開裂可能クロスリンカー、DSPで
前処理し、次いでビオチンまたは[¹²⁵]−Ｉで表面をラベルし、次いでストリン
ジェントな条件下で免疫沈降を行い、Hspとテトラスパニン（tetraspanin）タン
パク質間の非共有結合を崩壊させる。抗-CD9 mAbs または抗−コリジン／Ｈｓｐ
４７抗体を用いて コリジン／Ｈｓｐ４７-CD9複合体を免疫沈降させる。特徴的
な４７Ｋバンドは全ての抗−ＣＤ９免疫沈降物において容易に検出され、ＣＤ９
／またはＣＤ８１と同様のサイズの〜２２Ｋのタンパク質バンドが抗−コリジン
/ Hsp47と共に沈降する。しかし、同様の実験を抗-CD81 mAbsを用いて行った場
合、免疫沈降物中にコリジン／Ｈｓｐ４７は同定されない。しかし、ＣＤ９免疫
沈降物を抗−コリジン／Ｈｓｐ４７で再免疫沈降すると、全てのSCC細胞およびL
L/2セルラインにおいて４７Ｋバンドが見られる。Hsp47およびCD9の細胞外領域
が直接相互作用するかどうかを確かめるため、膜不透過クロスリンカーであるＤ
ＴＳＳＰを用いて、同様の架橋実験を行う。無傷のＳＣＣおよびＬＬ／２細胞を
ＤＳＰまたはＤＴＳＳＰで処理すると、ＣＤ９とコリジン／Ｈｓｐ４７が共に免
疫沈殿する。１ｍＭ アミロライドでの処理は、沈降されるタンパク質のプロフ
ァイルを変更することなく、免疫沈降後に回収されるコリジン／Ｈｓｐ４７量を
大きく高める。

【００８５】 実施例４ 腫瘍細胞侵襲およびファゴキネシス（Phagokinesis）： Ａ：コロイド性金移動アッセイ： 腫瘍細胞を８０μｇ／ｍＬのタイプＩコラーゲン、１００μｇ／ｍＬの Matri
gel（登録商標）またはラミニン−５ １００μｇおよびコロイド性金粒子の混合
物でプレコーティングされた小分けスライド（チャンバースライド）上で培養し
、種々の抗体を含むか、あるいは含まない培地中でインキュベートする。コロイ
ド性の金でコーティングされた小分けスライドは、ケラチノサイトおよびマトリ
クスタンパク質の封入 (Woodley et al., (1988) J. of Cellular Phys. 136, 1
40-146; Kim et al., (1994) Laboratory Investigation 71, 401-408; Kim et
al., (1994) J. of Biol. Chem. 269, 26,926-26,932.) に関して修飾を施し、A
lbrecht-Buehler ((1977). Cell 12, 333-339) に記載されるように調製する。S
CC または LL/2 細胞を各区画（チャンバー）に加え、２０分後、非接着細胞を
取り出し、培地を交換する。培養を２４時間維持した後、１× Histochoice (Am
resco, Solon, OH) 中で１分間固定し、ＰＢＳ中で洗浄し、段階的にエタノール
を通して脱水する。金粒子を欠いている領域はファゴキネティックトラック（th
e phagokinetic tracks）を同定する。移動指数（migration index）はイメージ
分析ソフトウェアを用いて、１００Ｘでのダークフィールドイルミネーション(P
ilcher et al., 1997)下におけるランダムフィールド内の細胞と結合したファゴ
キネティックトラックの領域を測定することにより測定される（J. Cell Biol.
137, 1445-1457.)。フィールド内の全ての細胞を数え、各実験に関して２５細胞
を数える。各実験では、全ての条件は３回行う。

【００８６】 Ｂ：腫瘍細胞侵襲アッセイ： Matrigel（登録商標）、再組成された基底膜を利用し、 Chu et al. (1993)
Proc. Nat'l. Acad. Sci. 90, 4261-4265 に以前に記載されるアッセイにしたが
い、インビトロアッセイを修飾する。本質的に、８μｍ−有孔性ポリビニルピロ
リドン不含ポリカルボナートフィルターを含む修飾Boydenチャンバーを Matrige
l（登録商標）(Collaborative Biomedical Products, Becton Dickinson, Bedfo
rd, MA) でプレコーティングする。次いでチャンバーの下部のウェルを、３Ｔ６
細胞条件化培地５００μＬを化学誘引物質として含む血清不含培地で満たす。次
いで上部のウェルに１．０×１０⁴細胞／チャンバーの細胞懸濁液２００μＬプ
ラス記載の添加物質を播種（seed）する。次いでこのチャンバーを３７℃で２４
時間インキュベートする。膜の上部表面から綿棒で非侵襲細胞を除去し、このチ
ャンバーを Dispase (Collaborative Biomedical Products, Becton Dickinson,
Bedford, MA) ３ｍＬ中で２時間インキュベートし、反応を１０ｍＭ ＥＤＴＡ
で停止する。Matrigel（登録商標）中に含まれる、得られた細胞ならびに下部チ
ャンバー中の細胞をCoulterカウンターで数える。データはコントロール膜を介
する移動と比較したマトリクスおよび膜を介する侵襲のパーセントとして表記す
る。「侵襲指数（Invasion Index）」は、コントロール細胞の侵襲パーセントに
対する試験細胞の侵襲パーセントとして表記する。

【００８７】 全処理およびグループ効果は分散分析（ＡＮＯＶＡ）を用い、Newman-Keuls
試験 (p ＜ 0.05) に基づくpost-hoc比較によって評価する。平均のHSP47蛍光ラ
ベルの侵襲指数との関係は非パラメトリック Spearman の順位序列相関係数 (rh
o) を用いて評価する。

【００８８】 修飾Boydenチャンバーを用いて腫瘍細胞の侵襲を評価すると、セルライン間の
侵襲指数において SCC 細胞および LL/2 細胞が有意な分散を示すことを表す。
この分散は細胞表面で発現されたコリジン／Ｈｓｐ４７量と関連する。次いでチ
ャンバーアッセイを行い、ここでは細胞をＣＤ９、ＣＤ８１およびコリジン／Ｈ
ｓｐ４７に対する抗体の存在下でインキュベートする。Matrigel（登録商標）チ
ャンバー中で抗−コリジン／Ｈｓｐ４７とインキュベートされた細胞は、侵襲指
数の増加を示すが、一方、抗−ＣＤ９または抗−ＣＤ８１抗体とインキュベート
すると、影響がなく、コントロールと同様である。各例におけるアミロライドで
の処理は、全ての腫瘍セルラインにおいて侵襲指数を劇的に減少させる。しかし
、アミロライド処理細胞は抗−コリジン／Ｈｓｐ４７抗体での処理によって影響
されない。

【００８９】 コロイド性金アッセイに対するＳＣＣ細胞移動の結果は、Boydenチャンバーア
ッセイから得られた結果と匹敵するが、これはコロイド性金が Matrigel（登録
商標）、コラーゲンまたはラミニン−５を含むかどうかに依存する。ＳＣＣ細胞
のファゴキネティック移動指数はラミニン−５に対して最も高く、次いでコラー
ゲンおよび Matrigel（登録商標）である。特に、この移動トラックは、コラー
ゲンまたは Matrigel（登録商標）に対して観察されるものよりラミニン−５コ
ーティングコロイド性金に対して広く長い。コラーゲンおよび Matrigel（登録
商標）マトリクスの両者に対するファゴキネティック移動指数は、抗−コリジン
／Ｈｓｐ４７抗体での処理にしたがって増加するが、抗−ＣＤ９抗体での処理に
は影響されないことがわかる。ラミニン−５コーティング表面において、ファゴ
キネティック指数は抗-コリジン／Ｈｓｐ４７での処理には影響されない。

【００９０】 実施例５ Hsp47結合ペプチドの同定および分析： Ａ．ペプチドライブラリーのアフィニティーパニング： ランダム７ペプチド(Ph.D.-7, New England Biolabs; Beverly, MA)またはラ
ンダム１２ペプチド(Ph.D.-12, New England Biolabs; Beverly, MA)をｐIIIタ
ンパク質のＮ末端に挿入した２つのバクテリオファージライブラリーを用いる。
Ph.D.-7ライブラリーは、〜２．８×１０⁹のエレクトロポレーションされた配列
からなり、これが増幅されると、供給されたファージ１０μＬ中〜７０コピーの
各配列を生じさせる。Ph.D.-12ライブラリーは、〜２．７×１０⁹のエレクトロ
ポレーションされた配列からなり、これが増幅されると、供給されたファージ１
０μＬ当たり〜５５コピーの各配列を生じさせる。

【００９１】 Ｂ．アフィニティーパニングによるHsp47結合バクテリオファージの選択： Ph.D.-7 または Ph.D.-12 キットおよび、ビオチニル化標的に関して修飾され
たプロトコルを用いて、Hsp47によって認識されるペプチドを表示するバクテリ
オファージを同定する。本質的には、加湿チャンバー中、４℃で一晩穏やかに攪
拌しながら、ミクロ滴定プレートの９６ウェルを０．１Ｍ ＮａＨＣＯ₃ ｐＨ８
．６ １３５μＬ中のストレプトアビジン（１ｍｇ／ｍＬ）１５μＬでコーティ
ングする。ストレプトアビジン溶液を除去した後、ウェルを、０．０５％トゥイ
ーン２０を含むＴＢＳ(TBS-Tween)で３回洗浄し、次いで３７℃で１時間、０．
１μｇ／ｍＬのストレプトアビジンを含むＰＢＳ中の１％ＢＳＰとインキュベー
トすることによりブロックする。

【００９２】 次いで、TBS-Tween ４００μＬ中のビオチニル化Hsp47 ０．１μｇおよび2 x
10¹¹ pfuのインプットファージ加えることにより、ファージをHsp47とプレ複合
体化させ、６０分間インキュベートする。次いでファージ−標的複合体溶液を洗
浄されたブロック化プレートに加え、室温で１０分間インキュベートする。ビオ
チンを最終濃度０．１ｍＭまで加え、５分間インキュベートし、ストレプトアビ
ジン結合ファージを取り出す。非結合ファージを廃棄し、このプレートをTBS-Tw
een（０．１％）で１０×洗浄する。次いでこのウェルを、１ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡ
を含む１Ｍ トリス−ＨＣｌ；ｐＨ２．２ １５μＬで５分間処理し、Hsp47-ファ
ージを溶出する。このサンプルを１Ｍ トリス−塩酸；ｐＨ９．１で中和し、Ｅ
Ｒ ２５３７培養２０ｍＬに加え、強く攪拌しながら３７℃で４．５時間インキ
ュベートすることによって増幅する。次いでこの培養を新たな試験管に移し、１
０，０００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心する。上清を新たな試験管に移し、１／
６容量のＰＥＧ／ＮａＣｌを用いて４℃で一晩ファージを沈降させる。ＬＢ培地
４ｍＬに単一コロニーのＥＲ２５３７を播種し、次いで培養が対数増殖中期（O.
D.₆₀₀ 〜０．５）に達するまで強く振りながら３７℃でインキュベートする。４
℃において１０，０００ｒｐｍで１５分間遠心してペレットを獲得する。このペ
レットをＴＢＳ１ｍＬに再懸濁し、４℃において１０，０００ｒｐｍで５分間遠
心する。上清を新たな試験管に移し、１／６容量のＰＥＧ／ＮａＣｌを用いて氷
上で１時間沈降させる。遠心後、ペレットをＴＢＳ ２００μＬに再懸濁する。
溶出液を滴定（titer）し、LB/IPTG/XGalプレートにまき、一晩インキュベート
する。ライブラリーファージは、lacＺα遺伝子を保持する通常のクローニング
ベクターＭ１３ｍｐ１９由来であるため、Xgal および IPTG を含む培地にプレ
ートした場合、ファージプラークは青色を呈する。青色コロニーを配列決定用に
選択するか、あるいはパニングの第二ラウンドに使用する。コントロールとして
は、ストレプトアビジンを標的として用い、３ラウンドのパニング後にストレプ
トアビジン結合ペプチドに関して共通配列を確かめる。

【００９３】 Ｃ．Hsp47結合バクテリオファージのスクリーニング： ５０〜２００コロニーを含むプレートから青色コロニーのクローンをニトロセ
ルロースフィルターにトランスファーする。細菌を、０．０５％トゥイーン２０
および１％ウシ血清アルブミンを含むＰＢＳでフィルターから洗浄し、次いでこ
のフィルターを同じバッファー中で３０分間インキュベートした後、PBS-Tween
で３回洗浄する。ビオチニル化Hsp47（PBS-Tween中０．１〜２μｇ／ｍＬ）５ｍ
Ｌ中で１時間インキュベートした後、このフィルターをPBS-Tween中で３回再洗
浄する。次いで、Hsp47結合バクテリオファージを分泌したクローンの位置を２
つの方法のうち一方によってつきとめる：このフィルターをアルカリホスファタ
ーゼコンジュゲート化ストレプトアビジン（PBS-Tween中１／１０，０００希釈;
Pierce, Rockford, IL）５ｍＬと室温で１時間インキュベートした後、PBS-Twe
enで何度も洗浄するか、あるいはこのフィルターを抗−ビオチン抗体（PBS-Twee
n中１／５０，０００希釈; Pierce, Rockford, IL）５ｍＬ中で１時間インキュ
ベートし、洗浄し、アルカリホスファターゼにコンジュゲートされたウサギ抗−
ヤギ免疫グロブリン抗体（PBS-Tween中１／５，０００希釈; Pierce, Rockford,
IL）とインキュベートする。各場合では、ニトロブルー テトラゾリウム／およ
び５ ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェート トリジウム（tolidium
）(Bethesda Research Labs, Rockville, MD) の混合物を基質として用いてアル
カリホスファターゼ活性を示す。

【００９４】 Ｄ．バクテリオファージ表示ペプチドの配列の決定： 一本鎖バクテリオファージＤＮＡを精製し、オリゴヌクレオチド（5' -CCCTCA
TAGTTAGCGTAACG-3'）(配列番号 63) を−９６プライマーとして配列決定する。
配列決定反応は ABI Prism Model 373 Version 3.0 を用いて行う。

【００９５】 Ｅ．Hsp47結合ペプチドを評価（score）するプログラム 出発ライブラリーと選択ライブラリーを位置依存的に比較する。最尤法および
ブートストラップリサンプリングによって統計分析を行う。これは、元のライブ
ラリー中におけるペプチドと比べたHsp47結合ペプチド中の位置によって残基 (r
esidues) の分布を表す。上で得られた選択物（the preferences）を分類するた
め、BiPに関して以前 (Cwirla et al. (1990) Proc. Nat'l. Acad. Sci. 87, 6
378-82) に記載される評価系（scoring system）を用いて合成ポリペプチドおよ
び天然に存在するポリペプチド中のHsp47結合部位を予想する。その実行におい
て、評価は、７残基コア配列の各位置において可能な２０アミノ酸それぞれに対
して行う。これらの評価は、選択および非選択バクテリオファージ集団によって
表示されたペプチド内の各残基の全量の差異（倍）から導く。各７ペプチドに存
在する７残基配列それぞれに対する評価を以前 (Cwirla et al., 同箇所) に記
載されるように測定する。

【００９６】 Hsp47結合配列のスコアセットを確認するため、評価マトリクスを作成するた
めに用いたデータベースの部分でないHsp47結合配列の第２セットが必要である
。これを達成するため、ランダム１２ペプチドを表示する独立した組換えバクテ
リオファージからなる第２ライブラリーを用いる (Ph.D-12, New England Biola
bs, Beverly, MA)。次いで配列を、位置特異的な反復BLAST、お互いに対するパ
ターンHit Initiated BLAST および BLAST 2 配列（NCBI）によって比較する。
さらに、the Weizmann Institute of Sciences Genome and Bioinformatics デ
ータベースを利用して２つのペプチドのハイドロパシープロファイルを比較する
。

【００９７】 Ｆ．Hsp47結合ペプチドの分析： ｐIIIタンパク質のＮ末端にランダム７ペプチドまたは１２ペプチド挿入を有
する２つのバクテリオファージライブラリーを用いる；第一に実験されるのは７
ペプチドライブラリーである。非選択ライブラリーから７０の個別のバクテリオ
ファージクローンをランダムに選び、種々の７ペプチド挿入のアミノ酸配列を、
対応するコード領域のヌクレオチド配列から演繹する。全てのアミノ酸を示すが
、その頻度は各残基をコードするコドンの相対数から予測されるものと必ずしも
対応しない。

【００９８】 パニングによって得られる５４のHsp47結合バクテリオファージによって表示
される７ペプチドの配列は、バクテリオファージゲノムの対応する領域のＤＮＡ
配列分析によって決定する。この５４クローン由来の、Hsp47を結合するペプチ
ド配列をまず単一集団として考え、出発ライブラリーからランダムに選択される
７０クローン由来のものと比較する。Hsp47結合バクテリオファージの親水性を
作表すると、パニングによって選択される２つの一般的ペプチド集団が示される
。一方の群のペプチドは親水性ペプチドであり、他方は低疎水性群のペプチドで
ある。

【００９９】 ７ペプチドの、選択および非選択の、二集団の全アミノ酸組成を比較すると、
アスパラギン（Ｎ）、スレオニン（Ｔ）、チロシン（Ｙ）およびプロリン（Ｐ）
が特に豊富であり、一方フェニルアラニン（Ｆ）、アスパラギン酸（Ｄ）および
アルギニン（Ｒ）は有意に涸渇することが示される。しかし、個別に考えると、
疎水性群のペプチドは顕著にトリプトファンおよびロイシン、ならびにバリンお
よびアラニンに富む。

【０１００】 種々の７ペプチドを成熟ｐIIIタンパク質に連結する５残基スペーサーには豊
富な残基は含まれない。選択された疎水性ペプチドを調べると、XHyHyXXXHyHy（
ここに、Hyは大きな疎水性アミノ酸（通常はＷ、ＬまたはＦ）であり、Xは任意
のアミノ酸である）として最もよく表すことができる残基モチーフが示される。
このコアモチーフはまた、モチーフXHyHyXXHyXXXXHyHyとして表される Ph.D-12
ライブラリー由来の選択残基中にも同定される。XXHyHyXXXとして記載されるペ
プチドモチーフは、このライブラリーから選択される選択親水性ペプチドを最も
よく表す。興味深いことに、同様のコアモチーフ（HyXXXHyHyXXHyXXX）は１２ペ
プチドライブラリー由来の選択残基中にも同定できる。しかし、少数のペプチド
は、Hsp47のパニング時に選択されるが、完全に疎水性残基を欠いている。

【０１０１】 BLASTプログラム分析を行って、バクテリオファージ表示ペプチドとプロコラ
ーゲンＩと選択１２ペプチド間の配列相同性を評価する。配列のみに基づくと、
特定の相同性はほとんど観察されない。しかし、ウィンドウレングス（window l
ength）７にわたる親水性を計算するKyte-Doolittle法を用いてプロコラーゲン
Ｉ（１）のハイドロパシープロファイルを３ラウンドのパニングによって得られ
た１２ペプチドと比較した場合、全てのファージ表示ペプチドはプロコラーゲン
分子内の特定領域によって表される。ほとんどの疎水性ペプチド（表１参照）は
Ｎ−プロペプチド領域（残基５９〜７１）またはＣ−プロペプチド領域（残基１
３４４〜１４４５）内領域に位置する。逆に、ほとんどの親水性ペプチド（表２
参照）はプロコラーゲンのらせん状領域を伴う領域（残基：２８３〜２９５、４
７０〜４８２、６６６〜６７８、７２７〜７３９、１０４０〜１０５２および１
０８７〜１０９９）に位置し、１つのペプチドのみがＮ−プロペプチド領域（残
基１００〜１１２）内配列に位置する。

【０１０２】 実施例６ 腫瘍細胞上のHsp47結合ファージ（ＨＢＰ）の細胞下局在：

【０１０３】 実験は上記のセルライン、SCC4, SCC9, SCC15 および SCC25、およびトランス
フォームされた正常口ケラチノサイトセルラインGMSM-K（これはDr. V. Murrah
(UNC, Chapel Hill, NC)の好意によるものである）を用いて行う。乳癌[HTB126,
HTB127]およびHTB125正常乳房細胞をATCCから獲得する。さらに、前立腺セルラ
イン PC-3, LNCaP および PZ-HPV はDr. R. Franklin (UM, Baltimore, MD) の
好意によるものである。 Ａ．フローサイトメトリー分析： Hsp47に対する抗体は上に記載するものであり、それらをフルオレセインまた
はTexas Redとコンジュゲートさせる方法はそのままである。抗−Ｍ１３モノク
ローナル抗体はAmersham Pharmacia Biotech (Piscataway, NJ)から獲得する。
サイトメトリー分析は上記のように行う。

【０１０４】 ＨＢＰ２５μＬを、培地中、３７℃で１時間、１０⁶細胞 (SCC4, SCC9,SCC15,
SCC25, HTB126, HTB127, PC-3 および LNCaP) とインキュベートする。次いで
この細胞をTBS-Tweenで３回洗浄し、ＨＢＰを FITC-抗-M13 抗体で染色し、フロ
ーサイトメトリーによって分析する。こららの実験は非透過化処理腫瘍セルライ
ン (SCC4, SCC9, SCC15, SCC25, HTB126, および PC-3) がその細胞表面に種々
のレベルのＭ１３ファージ染色を有することを示す。さらに、細胞を抗体の添加
前に透過化処理した場合、内部移行されたファージとカップリングされた細胞表
面染色は高められた染色を示す。しかし、同様に処理された GMSM-K（確立され
た上皮セルライン）は染色がほとんどないか、あるいは全く示さない。GMSM-K
細胞に関して得られたものと同様の結果が、HTB125 および PZ-HPV 正常乳房セ
ルラインおよび前立腺セルラインそれぞれに関しても得られる。

【０１０５】 Ｂ．免疫沈降分析： Ｍ１３結合ファージの特定のセルラインとの結合を証明するため、SCC4 およ
び GMSM-K をＨＢＰで１時間処理し、次いでTBS-Tweenで３回洗浄し、原形質膜
を単離し、抗―Ｍ１３抗体と免疫沈降させる。これにより、２つのタンパク質バ
ンドが生じ、一方のバンドはＭｒ＝４７ｋであり、もう一方のバンドはＭｒ＝２
７ｋである。４７ｋのバンドはウエスタンブロット分析により、Hsp47と同定さ
れる。

【０１０６】 Ｃ．免疫蛍光および共焦点顕微鏡観察： １．免疫蛍光および共焦点顕微鏡観察： 免疫蛍光顕微鏡観察は上記のように行う。細胞表面の Hsp47 または M13 バク
テリオファージを可視化するため、サイトメトリー分析に関して記載のように、
細胞を透過化処理せず、１−％ パラホルムアルデヒドで処理および固定する。
しかし、非特異的結合を妨げるため、細胞をＰＢＳ中の１０％ ブタ血清で１時
間ブロックする。次いでこの細胞を抗Hsp47または抗Ｍ１３バクテリオファージ
抗体(Amersham Pharmacia-Biotech, Piscataway, NJ)とインキュベートし、ＰＢ
Ｓで洗浄し、フルオレセインまたは Texas red とコンジュゲートされたヤギ抗
−ウサギＩｇＧと１時間インキュベートする。抗漂白剤を含有するマウント溶媒
（mounting media）(Kirkegaard & Perry Laboratories, Inc.; Gaithersburg,
MD) 中のカバーガラスをマウントする。細胞をエピフルオレセンス(epifluoresc
ence)を備えた Zeiss II 光学顕微鏡下で検査する。一次抗体で処理しない細胞
を負のコントロールとして用いる。

【０１０７】 共焦点イメージを Zeiss LSM410 共焦点顕微鏡を用いて収集する。590 のバリ
ヤーフィルターを有する 488/568 のＦＴを用いて、Texas red 染色を検出し、5
15〜540 でバリヤーを有する560 のＦＴを用いて、フルオレセインラベル化イメ
ージを作成する。デジタルイメージをＺＩＰドライブで収集し、Adobe Photosho
p 3.0 ソフトウェア (Adobe Systems Inc. Mountain View, CA) を用いて作図す
る。二次抗体のみとインキュベートしても細胞に蛍光は結合しない。

【０１０８】 共焦点顕微鏡観察では、ＨＢＰの破壊（fate）および共局在化が示される。こ
れらの実験は、腫瘍セルラインをＨＢＰで処理すると、細胞表面の、微小胞中に
染色が分布し、ＥＲと一致する核周囲の領域に強い染色が分布することを示す。
次いで細胞をＭ１３バクテリオファージで処理し、その後 Texas red−抗−Hsp4
7抗体および FITC-M13 抗体で二重染色する。Hsp47 の局在は M13 ファージ染色
のものと類似し、抗体が共に局在することは、Ｍ１３染色とHsp47染色パターン
の両者の重なり、黄色を表す。

【０１０９】 ２．リソソームおよびＥＲ リソソーム成分をラベルするため、５％ＣＯ₂中で、生育培地中、３７℃で４
時間、細胞を１ｍｇ／ｍＬリジン−固定可能 FITC-デキストラン (Molecular Pr
obes; Eugene, OR) とインキュベートする。洗浄後、細胞をさらに３０分間イン
キュベートし、初期エンドソームからリソソーム成分までデキストランを追跡す
る。初期および再循環エンドソーム成分を同定するため、５％ ＣＯ₂中、５０μ
ｇ／ｍＬ FITC-トランスフェリン (Molecular Probes; Eugene, OR) を含む血清
不含培地中、３７℃で３０分間、細胞をインキュベートする。特定の細胞成分を
同定する処理を行った後、細胞を固定し、免疫蛍光および／または共焦点顕微鏡
観察に用に処理する。

【０１１０】 細胞をFITC-コンジュゲート化デキストランの存在下で培養し、次いで３０分
間追跡してデキストランを初期エンドソームから除去した後、固定し、Texas re
d コンジュゲート化抗Ｍ１３抗体で免疫染色する。他のセルラインの代表として
、SSC4 細胞は小胞構造への FITC-デキストランの明確な同定を示すが、ＨＢＰ
染色は主として細胞質および核周囲域において点状の小胞に限定されている。Ｈ
ＢＰがリソソームに有意に標的化されていないことを証明するため、SCC4 細胞
をラテックスビーズおよびＨＢＰに送り、次いで固定し、抗Ｍ１３抗体を用いる
免疫沈降用に処理する。SCC4 細胞では、Ｍ１３シグナルはビーズの周囲に局在
せず、このことはファゴソームとの結合は最小であることを示す。

【０１１１】 エンドソームをラベルするため、SCC4 および GMSM-K 細胞を、FITC-コンジュ
ゲート化または Texas red-コンジュゲート化トランスフェリンの存在下で培養
した後、固定し、抗Ｍ１３抗体で染色する。共焦点顕微鏡観察による分析はトラ
ンスフェリンは原形質膜（細胞の端の部分の環状染色）および再循環エンドソー
ム（細胞下点状染色）の両者を染色することを示す。Ｍ１３抗体染色では、非常
に類似し、重なっているパターンが観察され、結果的に２つのイメージを重ね合
わせると、点状細胞下領域および原形質膜に２つのシグナルが共に局在（黄色）
することが示される。注目すべきは、GMSM-K 細胞が、コンジュゲート化デキス
トランおよびトランスフェリンでの同様の染色パターンを提供するが、抗Ｍ１３
抗体によって染色されないことである。

【０１１２】 Ｄ．細胞成分フラクション 原形質膜を上記のように分画する。 この膜フラクションは、原形質膜のマーカーである、５'−ヌクレオシダーゼ
活性の分布によって特徴付けられる。原形質膜を直接 PAGE およびウエスタン分
析に付する。ウエスタンブロットでは、タンパク質をSDS-PAGEで電気泳動し、す
ぐにニトロセルロース紙に電気的トランスファーし、１０％ 脱脂乾燥乳 (NFDM)
でブロックする。抗血清またはペル免疫(perimmune)血清を同じバッファーで１
：２０００希釈し、穏やかに振りながら一晩インキュベートする。次いでこのニ
トロセルロースをTBS/Tween中で５分間、３回すすぐ。Hsp47およびＭ１３バクテ
リオファージに対する抗体を[¹²⁵Ｉ]−ラベルプロテインＡ (New England Nucle
ar, Boston, Mass) またはウエスタンブロット分析で検出する。

【０１１３】 Ｅ．ペプチド合成 ７ペプチドおよび１２ペプチドは連続フロー固相合成によって製造し、高圧液体
クロマトグラフィーおよび質量分光測定によって、以前(Cwirla et al., 同箇所
)に記載されるように分析する。

【０１１４】 実施例７ 口扁平上皮癌異種移植における腫瘍部位へのホーミング化学療法薬物
中のHsp47結合ペプチドおよびHsp47モノクローナル抗体の効力の測定 Ａ． 腫瘍進行に対するドキソルビシンコンジュゲート化Hsp47腫瘍ホーミング
ペプチドおよびHsp47モノクローナル抗体の作用： ドキソルビシン（Doxorubicin）をモデル化合物として用いて、十分に分化し
た腫瘍における細胞表面Hsp47への薬物のホーミング（homing）が効果的に腫瘍
応答に必要とされる薬物の用量を減少させるか、あるいはヒト口扁平上皮細胞癌
異種移植モデルにおける薬物の化学療法指数に対する有効性を増大させることを
示す。

【０１１５】 Ｂ．Hsp47モノクローナル抗体ドキソルビシンコンジュゲート： マロネートリンカーを用いてドキソルビシン免疫コンジュゲートを製剤化する
。本質的には、モノクローナル抗体を、０．５Ｍボレートバッファー中、ジメチ
ルホルムアミドの存在下、BAMME-CH DMBリンカーとコンジュゲートする。クロマ
トグラフィーによって精製し、１００ｍＭカルボヒドラジドを加えて機能的抗体
を脱ブロックし、クロマトグラフィー精製する。最後に、脱ブロックされた機能
的抗体を１０−ｍＭ ドキソルビシンと反応させ、クロマトグラフィー精製する
。同様の免疫コンジュゲートは、抗体の免疫反応性を維持し、コンジュゲート化
されていない遊離のドキソルビシンと等価な強度を有し、ヌードマウスの異種移
植様式において体重減少および死によって測定される毒性を現すことはないこと
が示された。

【０１１６】 Ｃ．Hsp47結合タンパク質ドキソルビシンコンジュゲート： the UM Biopolymer Laboratory Core Laboratory によってHsp47ペプチドを合
成し、高性能液体クロマトグラフィーによって精製する。１０エチル−３−(３
−ジメチル−アミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩 (EDC, Sigma) およびＮ−
ヒドロキシスクシンイミド (NHS, Sigma) を用いてこのペプチドをドキソルビシ
ン (Aldrich) とコンジュゲート（結合）する。次いでこのコンジュゲートを Se
phadex G25 でゲルろ過して反応物を除く。遊離の薬物の存在をＨＰＬＣおよび
核磁気共鳴によってモニターしたところ、調製物の＜５％である。

【０１１７】 Ｄ．遊離の薬物、ペプチドコンジュゲートおよびモノクローナル抗体コンジュゲ
ートとしてのドキソルビシン分布の薬物動態学： １．動物および薬物投与： 特定の病原を有さない成体マウス（年齢５〜６週）を慣用の生育条件下で維持
する。薬物、遊離のドキソルビシン、ペプチド−コンジュゲートドキソルビシン
およびモノクローナル抗体コンジュゲート化ドキソルビシンの静脈内ボーラス用
量を外側尾部静脈を介して投与する。

【０１１８】 ２．サンプル化： 血液を投与後 5, 10, 15, 30, 45, 60, 90, 120, 180, 240, 360, 480, 960
および 1440 分でサンプル化する。さらに、心臓、肺、肝臓、腎臓、脾臓、骨格
筋および腫瘍を、血液サンプルに関して記載されるものと同じ時点で収集する。
各実験では、ビヒクルデリバリー５分後に犠牲にしたマウス由来の血液および組
織をコントロールとして使う。心臓穿刺によって血液をヘパリン処理シリンジ中
へ収集し、エッペンドルフミクロ遠心チューブに移し、氷上に保存した後、１３
，０００ｘｇで５分間遠心して血漿を得る。組織はすばやく解剖し、氷上に保持
した後、重量測定し、次いで液体窒素中で急速凍結する。血漿、組織、および投
与溶液は分析まで−７０℃で凍結保存する。

【０１１９】 ３．ドキソルビシンの分析： ドキソルビシンの血漿および組織濃度を高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰ
ＬＣ）によって測定する。血漿サンプルを慣用の手法によって抽出する。２００
μＬの血漿サンプルを内部標準（４'−エピドキソルビシン）と混合し、次いで
クロロホルム／２−プロパノール（１：１、ｖ／ｖ）０．６ｍＬと１５秒間強く
混合する。硫酸アンモニウム（約０．５ｇ）を得られたゲルに加え、十分に混合
する。三相混合物を１３，０００ｘｇで１５分間遠心する。得られた上の相を円
錐試験管に移し、Ｎ₂ジェットで乾燥する。乾燥残留物を移動相１００μＬに溶
解し、オートサンプラービンに移し、７５μＬを以下のＨＰＬＣ系に注入する。

【０１２０】 組織サンプルを解凍し、すぐに１７×１００ｍｍポリプロピレン管に移し、こ
れを氷浴に保持し、Polytron (Brinkman Instruments, Westbury, NY) を用いて
リン酸バッファー塩溶液（1.2mM KH₂PO₄, 2.9 mM Na₂HPO₄, 154mM NaCl, pH 7.4
, Biofluids, Inc., Rockville, MD）の部分（重量／容量）中でホモジナイズす
る。各ホモジネートの一部を内部標準と混合し、クロロホルム／２−プロパノー
ルで抽出し、ＨＰＬＣ系への注入のために調製する。 用いるＨＰＬＣ系はHewlett-Packard (Palo Alto, CA) モデル１１００オート
サンプラーおよびWaters (Milford, MA) M45 ポンプを含む。用いるカラムはALL
TECH (Deerfield, IL) １０μｍ C₁₈ Econosil カラム（２５０長、４．６ｍｍ
i.d.）である。移動相はアセトニトリル：０．３２Ｍ オルトリン酸 (27:43, v/
v) からなり、１ｍＬ／分でポンプする。カラム溶出物はAminco フルオロモニタ
ーセットを用い、励起波長４７０ｎｍ、放射波長＞５００ｎｍでモニターする。
この方法を用いると、ドキソルビシン、ドキソルビシノールおよび内部標準の良
好な分離が、それぞれ保持時間１２．５、７および１５分において達成される。
定量下限は０．１ｎｍである。検出シグナルは Hewlett-Packard 3392A インテ
グレーターによってプロセッシングされ、各ピーク下領域が積分される。各サン
プル中のドキソルビシン濃度は、ドキソルビシンピーク領域の、対応する内部標
準ピークのものに対する割合を測定し、適当なマトリクス中で作成された、同時
に行われた標準曲線に対する割合を比較することによって計算する。

【０１２１】 ４．薬物動態分析： ドキソルビシンの血漿濃度対時間のタイムコースは、非区画および区画法の両
方によって分析する。０から無限大までの曲線下領域(AUC)および末端半減期（
ｔ_1/2）は、LAGRAN コンピュータープログラムによって実行される LaGrange 関
数を用いる非区画分析によって評価する。ＣＬ_tbは定義： CL_TB=用量/AUC から計算し、分布の安定状態容量(V_DSS)は式： V_DSS = Cl_tb/kel. から計算する。 さらに血漿中のドキソルビシンの個別濃度対時間を、Nelder Mead simplex をア
ルゴリズムとして用いるプログラム ADAPT II を用いる区画モデルに適合させる
。２および３区画、オープン、リニアモデルをこのデータに適合させる。モデル
識別は Akaike's Information Criteria (AIC) に基づく。これは以下のように
定義される： AIC - 2p + n(lnWSSR) （ここにｐはモデル中のパラメータの数を表し、ｎは観察数と等しく、ＷＳＳＲ
は二乗残余の加重和（the weighted sum of squares residuals）を表す）。

【０１２２】 Ｅ．腫瘍保持マウスのHsp47ホーミング薬物での処置： サイズにマッチする腫瘍（size-matched tumors）(〜１ｃｍ³) を有するマウ
スを群当たり６動物に劣らない６処置群に無作為化する：ビヒクルのみ、遊離の
ドキソルビシン、ドキソルビシン-Hsp47結合ペプチド、ドキソルビシン−コント
ロール非結合ペプチド、ドキソルビシン−モノクローナルコンジュゲート、Hsp4
7モノクローナル抗体。パワー分析は、生存率の３０％差異を示すのに群当たり
少なくとも６動物が必要とされることを示す。一般に、ヒト移植片を有するヌー
ドマウスにおけるドキソルビシン投与量は５０〜２００μｇ／週）である。薬物
の腫瘍に対するホーミングは、遊離の薬物より有効であるから、初期実験では、
５、１０および１５μｇ／週の投与量で行う。等価物としてのドキソルビシンの
濃度は、４９０ｎｍにおける薬物およびコンジュゲートの吸光度を測定すること
によって調節し、較正曲線を確立してペプチドおよびモノクローナルコンジュゲ
ートに対する等価物をつきとめる。生存動物のフラクションを、４０日のコース
にわたって測定し、Kaplan-Meier 生存曲線としてプロットする。生存率は動物
を毎日検査し、死亡率を測定することによって測定する。次いで、用量上昇実験
を行い、ここでは、マウスを、ドキソルビシン等価物３０μｇの用量のドキソル
ビシン-Hsp47結合ペプチドおよびドキソルビシン−コンジュゲート化Hsp47モノ
クローナル抗体で２１日毎に８４日間処理する。Kaplan-Meier 生存曲線を構築
する。さらに、剖検後、最初の腫瘍重量およびサイズをつきとめ、リンパ節およ
び肺転移の存在を測定する。また、組織学的評価によって支持される転移の総測
定として、リンパ節重量および肺重量を測定する。

【０１２３】 毒性を評価するため、薬物投与量をマウス当たりドキソルビシン−等価物２０
０μｇに高める。高められた用量の薬物を受けるマウスは、単一投与量の遊離の
ドキソルビシン、ドキソルビシン-Hsp47結合ペプチドまたはドキソルビシン-Hsp
47モノクローナル抗体を服用する。次いで動物を１４日間試験し、動物の平均フ
ラクションを Kaplan-Meier 生存曲線に描く。

【０１２４】 腫瘍ホーミングドキソルビシン−コンジュゲートで処置した動物は、遊離の薬
物を服用した動物より低い薬物等価用量でより長く生存する。さらに、生存率が
より高くなるにつれて、重量としての腫瘍サイズ、リンパ節および薬物転移が減
少する。非コンジュゲート化Hsp47モノクローナル抗体自身が、腫瘍に対する応
答の仲介において免疫療法的作用を有する場合、免疫不全ヌードマウスがそのよ
うに応答せず、ならびに非コンジュゲート化コントロールの使用によって、これ
はC57BLモデルのみにおいて明らかである。

【０１２５】 前記記載から、当業者であれば、本発明の本質的特徴を容易につきとめること
ができ、その思想および範囲から逸脱することなく、本発明に変化および修飾を
施して、種々の用途および条件に適合させることができる。

【０１２６】 当業者であれば、さらなる労力を使わずに、前記記載を利用して、本発明を最
大限に利用できると考えられる。したがって、前記の好ましい具体的態様は、単
に例示として考えられるべきであり、いかなる意味においても開示の残りの部分
を限定するものではない。

【０１２７】 本明細書中および図面に引用される全ての出願、特許および刊行物の全開示内
容は引用により本明細書中に包含される。

【０１２８】 補遺１ 癌腫細胞に対するＣＢＰ２Ａポテンシャル細胞表面標的の結合モチーフ これまでに、我々は、多くの細胞系の中で、ＣＢＰ２遺伝子産物であるＨｓｐ
４７が、その保持受容体ｅｒｄ２Ｐを回避し、その結果、テトラスパニンタンパ
ク質ＣＤ９に関連する細胞表面上のＨｓｐ４７が出現することを明らかにしてい
る（J.Cellular Biochem.、１９９９）。Ｈｓｐ４７が高度に制限された結合裂
片をもつことにおいて、ランダムペプチドディスプレーライブラリーを用いて、
Ｈｓｐ４７に対するペプチド結合の特徴付けを行い、次いで、インビトロにて癌
腫細胞系に対してこのタンパク質を標的化した。選別して得られたクローンを比
較すると、配列のみに基く特異的相同性はほとんどないことが示された。Ｈｓｐ
４７を発現している癌腫細胞が選択されたバクテリオファージを選択的に取り込
むことができるかどうかを決定するために、慣例の免疫蛍光法および共焦顕微鏡
法を用いた。これらの実験から、ファージ提示Ｈｓｐ４７結合ペプチドが、Ｈｓ
ｐ４７を発現している細胞系に結合し、Ｈｓｐステイニングに一致する位置にす
ばやく取り込まれることが明らかになった。これらの観察は、サイトメトリー分
析によって確認された。これらのデータは、ＣＢＰ２産物が、悪性腫瘍の化学療
法および／または造影用の分子標的を提供することを示す。 略語：ＣＢＰ２（collagen binding protein ２、コラーゲン結合タンパク質
２）；ＥＲ（endoplasmic reticulum、小胞体）；ＡＴＣＣ（アメリカン・タイ
プ・カルチャー・コレクション）；ＴＢＳ（Tris buffered saline、トリス緩衝
食塩水）；ＰＢＳ（phosphate buffered saline、リン酸緩衝食塩水）；ＰＥＧ
（ポリエチレングリコール）；ＦＩＴＩＣ（フルオレセインイソチオシアネート
）。

【０１２９】 新生物細胞を直接処置または造影するための特異的細胞表面標的を同定するた
めの追求が続けられている。たとえば、ドラッグデリバリーのための標的として
用いられているタンパク質の１つのグループは、ガン関連染色体異常によって作
成されたキメラ分子である。しかし、このような分子は通常、特定の腫瘍に対し
て独特である（Baronら、１９９７；Diez de Medina ＳＧら、１９９７）。上記
タンパク質に加えて、このような標的の潜在的源は、悪性腫瘍において特定の染
色体座で増幅される遺伝子の産物である。たとえば、遺伝子座１１ｑ１３→１４
は通例、頭部および頚部、肺、食道、膀胱ならびに乳房のガンなどのヒトガンに
おいて増幅される（Schuuringら、１９９２）。この増幅物は大きく（２．５〜
５Ｍｂに及ぶ）、公知の腫瘍形成潜在力をもつ数個の遺伝子を内包する（Bekri
ら、１９９７）。乳癌では、この遺伝子座は、初期腫瘍の〜１３％において増幅
されるが、頭部および頚部では、増幅は、腫瘍の４０％〜７６％で起こる。この
領域のさらに詳細なマップは、５個もの別の増幅ユニットが１１ｑ１３に存在す
ることを示している。これらのユニットでは、遺伝子エリアは、１１ｑ１３．５
→１４．１にあるＧＡＲＰ遺伝子を包含している。ＣＣＤＮ１およびＥＭＳ１に
対してテロメリックに位置するこの領域の評価は、領域マップに存在する多くの
遺伝子、すなわち、染色体座１１ｑ１３．５におけるＣＢＰ２（Ｈｓｐ４７）お
よび“スポット１４”ならびにこの後者の領域に対してテロメリックに位置する
ＣＬＮＳ１Ａ、ＵＶＲＡＧおよびＰＡＫ１を明らかにしている。したがって、１
１ｑ１３→ｑ１４増幅物のコアを３５０ｋｂエリアまで狭めると、そのテロメリ
ック側においてＤ１１Ｓ５３３を包含する（Bekriら、１９９７；Moncur、１９
９８）。

【０１３０】 この増幅物を評価すると、ＣＢＰ２の遺伝子産物が、悪性腫瘍のグループに関
連しており、それを識別しうること（Morinoら、１９９７；Morinoら、１９９５
；Morinoら、１９９４；Shirakamiら、１９９５ａ；Shirakamiら、１９９５ｂ；
Shirakamiら、１９９５）ならびに胎児物質インターフェースにおける絨毛外の
栄養芽層細胞および脱落膜細胞に位置すること（Pakら、１９９７；Shirakamiら
、１９９５ｂ；Morinoら、１９９５；Morinoら、１９９４；Morinoら、１９９７
；Shirakamiら、１９９５）が明らかになった。興味深いことに、染色体１１ｑ
１３．５に位置するＣＢＰ２は、脂質生成新生物に発現するキー遺伝子であるＳ
ｐｏｔ１４と遺伝子座を共有している（Moncur、１９９８）。

【０１３１】 通常、ＣＢＰ２遺伝子産物であるＨｓｐ４７は、発生期鎖の翻訳中の早期時点
でプロコラーゲン鎖にまず関連するＥＲ−Ｇｏｌｇｉに限定される（Saukら、１
９９４）。Ｈｓｐ４７は、Ｈｓｐ４７のＣＯＯＨ末端配列ＲＤＥＬに関連するｅ
ｒｄ２遺伝子産物であるＫＤＥＬ受容体のリサイクルによって、これらの細胞コ
ンパートメント内に保持される（Saukら、１９９７）。しかし、幾つかの腫瘍で
は、Ｈｓｐ４７は、そのシャペロン特性とは無関係に発現され、この監視メカニ
ズムをのがれて、細胞表面に現れるが、培地へは分泌されない。これまでの実験
から、ｇｐ９６といったようなＨｓｐが、周縁膜タンパク質に強く表面結合して
いることが実証されているが、他のタンパク質とのイオン相互作用を無視するこ
とができるにもかかわらず、固定の正確なメカニズムは不明である（Tamura Y、
１９９７）。ｇｐ９６のようなＨｓｐ４７は、ファルネシル化、パルミチン酸化
、イソプレニル化またはミリスチル化のための配列特性が欠如している；したが
って、共有結合が、ありそうもない固定のメカニズムであるようにもみえる（Ta
mura Y、１９９７；Altmeyerら、１９９６；Tamura Y、１９９７）。興味深いこ
とに、幾つかの類表皮癌腫細胞系において、Ｈｓｐ４７が、テトラスパニンタン
パク質ＣＤ９に関連することがわかっている（Hebertら、１９９９）。さらに、
これらの場合、Ｈｓｐ４７が、架橋反応を用いなくとも、抗ＣＤ９抗体を用いて
膜免疫沈降物から容易に再生されることがわかっており、これらのタンパク質間
の疎水性相互反応の存在が示唆される（Hebertら、１９９９）。

【０１３２】 多くの他のタンパク質とは異なり、Ｈｓｐ４７は、限られた数の細胞内リガン
ドをもつことがわかっている（Nakaiら、１９８９）。これまでの実験から、抗
プロピプチド抗体ＳＰ１．Ｄ８によって定義される領域（Huら、１９９５）、２
３−１５１残基の間のα１（ｌ）鎖のＮ−プロペプチドへのプロコラーゲンの領
域、およびゼラチン（Nagataら、１９８８）へのＨｓｐの結合が明らかにされて
いるが、この結合については、特異的ペプチドモチーフはいまだ決定されていな
い（Huら、１９９５）。

【０１３３】 ここに、我々は、Ｈｓｐ４７の選別実験から得られたバクテリオファージ−ペ
プチドのレパートリーについて報告する。多くの腫瘍細胞系におけるＨｓｐ４７
をもつこれらのペプチドの幾つかの共局在化は、空間的にＨｓｐ４７に一致する
細胞内位置に該ペプチドを方向付けうることを実証する。これらの結果から、細
胞表面Ｈｓｐ４７が、細胞表面に永続的には固定されず、このタンパク質が、細
胞内プールでリサイクルを受けることが示される。さらに、これらの実験は、腫
瘍におけるＣＢＰ２の発現が、遺伝子療法に関するファージのための標的、薬物
をデリバリーするメカニズム、あるいは肉眼で見えない疾患および転移を造影す
る手段を提供するかもしれないということを示唆する。

【０１３４】 材料および方法 細胞系：実験は、ＡＴＣＣから入手した多数のヒト口腔扁平上皮細胞癌腫の樹
立細胞系（ＳＣＣ４、ＳＣＣ９、ＳＣＣ１５およびＳＣＣ２５）を用いて行い、
形質転換した正常口腔ケラチン生成細胞系ＧＭＳＭ−Ｋは、V. Murrah博士（Ｕ
ＮＣ、チャペル・ヒル、ＮＣ）より提供を受けた。乳癌（ＨＴＢ１２６、ＨＴＢ
１２７）およびＨＴＢ正常乳房細胞も同様にＡＴＣＣから入手した。さらに、前
立腺細胞系ＰＣ−３、ＬＮＣａＰおよびＰＺ−ＨＰＶは、R. Franklin博士（Ｕ
Ｍ、ボルティモア、ＭＤ）から提供を受けた。ここに記載する実験では、５％Ｃ
Ｏ₂空気雰囲気下、３７℃にて、１０％ウシ胎児血清、ヒドロコルチゾン（０．
４μｇ／ｍｌ、シグマ）を含む、ハムのＦ１２およびダルベッコ変法イーグル培
地の１：１混合培地中で細胞を培養した。乳癌細胞系については、ＡＴＣＣの指
示にしたがって１０μｇ／ｍｌのインスリンを培地に加え、ＰＺ−ＨＰＶ細胞は
、ＫＳＦ培地にて成長させた。リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）（ｐＨ７．５）中、
トリプシン（０．１％）−ＥＤＴＡ（０．０１％）で解離することによって継代
培養した。

【０１３５】 抗体：Ｈｓｐ４７にはモノクローナル抗体ＳＰＡ−４７０（ストレスジェン、
ビクトリア、ＢＣ）ならびにキーホールリンペットヘモシアニン（Saukら、１９
９４）にコンジュゲートしたマウスＨｓｐ４７のＮ末端配列に対応する２２量体
ペプチドに対して製造されたウサギポリクローナル抗体を用いた。抗Ｍ１３モノ
クローナル抗体は、アマーシャム・ファルマシア・バイオテック（ピスカタウェ
イ、ＮＪ）から調達した。サイトメトリー分析用のモノクローナル抗体は、５（
６）カルボキシフルオレセイン−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルキット
（ベーリンガー・マンハイム、インディアナポリス、ＩＮ）を用いたフルオレセ
インに直接コンジュゲートさせるか、またはＳＡ−Ｒｅｄ６７０（商標）で標識
し、次いでＥＺ−Ｌｉｎｋ（商標）Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチニル化キ
ット（ピアス、ロックビル、Ｉｌｌ）を用いて抗体をビオチニル化した。

【０１３６】 ペプチドライブラリーのアフィニティー選別：Ｈｓｐ４７の結合特異性を調査
するために、我々は、ｐlllタンパク質のＮ末端にランダムセプタペプチド（Ph.
D.−７、ニュー・イングランド・バイオラブズ；ベヴァリー、ＭＡ）またはドデ
カペプチド（Ph.D.−１２、ニュー・イングランド・バイオラブズ；ベヴァリー
、ＭＡ）インサートをもつ２つのバクテリオファージライブラリーを利用した。
〜２．８×１０⁹個の電気穿孔配列からなるPh.D.−７ライブラリーを一回増幅し
て、供給したファージ１０μｌ当たり〜７０コピーの各配列を得た。〜２．７×
１０⁹個の電気穿孔配列からなるPh.D.−１２ライブラリーを一回増幅して、供給
したファージ１０μｌ当たり〜５５コピーの各配列を得た。

【０１３７】 アフィニティー選別によるＨｓｐ４７結合バクテリオファージの選択：Ph.D.
−７またはPh.D.−１２キット（ニュー・イングランド・バイオラブズ；ベヴァ
リー、ＭＡ）およびビオチニル化標的用に変更されたプロトコルを用いてＨｓｐ
によって認識されたペプチドを提示しているバクテリオファージを同定した。不
可欠の要素として、９６ウエルのマイクロタイタープレートに、０．１Ｍ Ｎａ
ＨＣＯ₃（１３５μｌ）（ｐＨ８．５）中のストレプトアビジン（１ｍｇ／ｍｌ
）１５μｌを塗布し、４℃の加湿室にて一夜緩やかに震とうした。ストレプトア
ビジンを除去した後、０．０５％Tween２０（ＴＢＳ−Tween）を含むＴＢＳで３
回ウエルを洗浄し、次いで、０．１μｇ／ｍｌのストレプトアビジンを含むＢＳ
Ｐの１％ＰＢＳ溶液とともに３７℃で１時間インキュベートすることによってブ
ロックした。

【０１３８】 次いで、０．１μｇのビオチニル化Ｈｓｐ４７およびＴＢＳ−Tween４００μ
ｌ中のインプットファージ２×１０¹¹ｐｆｕを加え、６０分インキュベートした
。次いで、ブロックし、洗浄したプレートにファージ−標的複合体溶液を加え、
室温にて１０分間インキュベートした。最終濃度が０．１ｍＭとなるようにビオ
チンを加え、ストレプトアビジン結合ファージを置換するために５分間インキュ
ベートした。非結合ファージを捨て、ＴＢＳ−Tween（０．１％）で１０回プレ
ートを洗浄した．次いで、１ｍｇ／ｍｌＢＳＡを含む１Ｍのトリス−ＨＣｌ（ｐ
Ｈ２．２）１５μｌで５分間ウエルを処理してＨｓｐ４７−ファージを溶離した
。１Ｍのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ９．１）でサンプルを中和し、ＥＲ２５３７培養
物２０ｍｌを加えて増幅し、激しく攪拌しながら３７℃にて４．５時間インキュ
ベートした。次いで、培養物を新たな遠沈管に移し、４℃にて１００００ｒｐｍ
で１０分間遠心分離した。上清を新たな遠沈管に移し、４℃にて１／６容のＰＥ
Ｇ／ＮａＣｌで一夜処理してファージを沈澱させた。ＬＢ培地４ｍｌに、ＥＲ２
５３７の単一コロニーを植え、次いで、培養物が中期対数相（Ｏ.Ｄ.₆₀₀〜０．
５）に到達するまで、３７℃にて激しく攪拌しながらインキュベートした。４℃
にて、１００００ｒｐｍで１５分間遠心分離することによりペレットを得た。Ｔ
ＢＳ１ｍｌにペレットを懸濁し、４℃にて１００００ｒｐｍで５分間遠心分離し
た。上清を新たな遠沈管に移し、氷上にて１／６容のＰＥＧ／ＮａＣｌで１時間
処理して沈澱させた。遠心分離した後、ペレットを２００μｌのＴＢＳに再懸濁
した。溶離液の力価決定を行い、ＬＢ／ＩＰＴＧ／ＸＧａｌプレートに置き、一
夜インキュベートした。ライブラリーファージは、lacＺα遺伝子をもつ通例の
クローニングベクターＭ１３ｍｐ１９から誘導されるので、ＸｇａｌおよびＩＰ
ＴＧを含む培地に植えた場合、ファージプラークは、青く見える。青いコロニー
を選択して配列決定を行うか、または選別の第２ラウンドに用いる。コントロー
ルストレプトアビジンを標的として用い、３ラウンドの選別後、ストレプトアビ
ジン結合ペプチドの共通配列を確かめた。

【０１３９】 Ｈｓｐ４７結合バクテリオファージのスクリーニング： ５０〜２００のコロニーを含むプレートからの青いコロニーのクローンをニト
ロセルロースフィルターに移した。０．０５％Tween２０および１％ウシ血清ア
ルブミンを含むＰＢＳで細菌をフィルターから洗浄し、次いで、フィルターを同
じ緩衝液中で３０分間インキュベートした後、ＰＢＳ−Tweenで３回洗浄する。
ビオチニル化Ｈｓｐ４７（０．１〜２μｇ／ｍｌ、ＰＢＳ−Tween溶液）５ｍｌ
中で１時間インキュベートした後、フィルターを再度ＰＢＳ−Tweenで３回洗浄
した。次いで、ｓｐ４７結合バクテリオファージを分泌したクローンの位置をワ
ン・オブ・ツー法で決定した：５ｍｌのアルカリホスファターゼ複合ストレプト
アビジン（ＰＢＳ−Tweenにより１／１００００希釈；ピアス、ロックフォード
、ＩＬ）とともに室温にて１時間フィルターをインキュベートした後ＰＢＳ−Tw
eenでさらに洗浄するか、または抗ビオチン抗体（ＰＢＳ−Tweenにより１／５０
０００希釈；ピアス、ロックフォード、ＩＬ）とともに１時間フィルターをイン
キュベートし、洗浄し、次いでウサギ抗ヤギ免疫グロブリン抗体−アルカリフォ
スファターゼ（ＰＢＳ−Tweenにより１／５００００希釈；ピアス、ロックフォ
ード、ＩＬ）複合体とともにインキュベートした。ケース毎に、ニトロブルー、
テトラゾリウム混合物および基質として５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリ
ルホスフェートトリジウム（ベセスダ・リサーチ・ラブズ、ロックビル、ＭＤ）
を用いてアルカリフォスファターゼ活性を明らかにした。

【０１４０】 バクテリオファージ提示ペプチドの配列の決定： 一本鎖バクテリオファージＤＮＡを精製し、９６プライマーとしてオリゴヌク
レオチド（５'−ＣＣＣＴＣＡＴＡＧＴＴＡＧＣＧＴＡＡＣＧ−３'）を用いて配
列決定を行った。配列決定は、ＡＢＩプリズムモデル３７３バージョン３．０を
用いて行った。

【０１４１】 Ｈｓｐ４７結合ペプチドの評点をつけるためのプログラム： Ｈｓｐに結合するペプチドを特徴付けるために、我々は、位置従属法において
出発および選択されたライブラリーを比較した。最尤推定法およびブーツストラ
プリサンプリングによって、統計的分析を行った。これによって、オリジナルラ
イブラリーにおけるペプチドと比較した場合のＨｓｐ４７結合ペプチドにおける
位置による残基の分布が示された。上記で得られた選択物を分類するために、我
々は、合成および天然のポリペプチドにおけるＨｓｐ４７結合部位を予測するた
めに、ＢｉＰのために先行文献（Cwirlaら、１９９０）に記載された評点システ
ムを用いた。そのようにして、７残基コア配列の各位置における可能な２０アミ
ノ酸のそれぞれに評点を付与する。これらの評点は、選択および非選択バクテリ
オファージ集団によって提示されたペプチド中の各残基の総合発生量における折
り畳み差（fold difference）から誘導された。各セプタペプチドに存在する各
７残基配列に対する評点を、先行文献（Cwirlaら、１９９０）に記載の方法で決
定した。

【０１４２】 我々のＨｓｐ４７結合配列の評点セットを有効にするために、評点マトリック
スを作成するのに用いたデータベースの一部ではないＨｓｐ４７結合配列の第２
のセットが必要である。ランダムドデカペプチドを提示している独立した組換え
バクテリオファージからなる第２のライブラリーを使用した（Ph.D.−１２、ニ
ュー・イングランド・バイオラブズ；ベヴァリー、ＭＡ）。次いで、位置特異的
反復ＢＬＡＳＴ、パターンヒット反復ＢＬＡＳＴおよび対相互ＢＬＡＳＴ２配列
（ＮＣＢＩ）によって配列を比較した。さらに、ワイズマン・インスティチュー
ト・オブ・サイエンス・ゲノム・アンド・バイオインフォマティックス・データ
ベースを用いて２つのペプチドの水治療法プロファイルを比較した。

【０１４３】 ペプチド合成： 連続フロー固相合成によって、セプタペプチドおよびドデカペプチドを製造し
、先行文献（Cwirlaら、１９９０）に記載の高圧液体クロマトグラフィーおよび
質量分析によって分析した。

【０１４４】 サイトメトリー分析： 前記と同様にして、インビトロにおいて増殖した細胞を洗浄し、ポリグロビン
Ｎの０．５％溶液中でインキュベートして、未飽和Ｆｃ受容体をブロックし、モ
ノクローナル抗体の非特異的結合を減らした（Takeshitaら、１９９５）。次に
、細胞懸濁液（１×１０⁶細胞／ｍｌ）５０ｍｌを抗体２．５ｍｌ（１ｍｇ）と
ともにインキュベートし、フルオレセインまたはＳＡ−Ｒｅｄ６７０（商標）（
ギブコＢＲＬ、ゲーサーズバーグ、ＭＤ）とコンジュゲートさせた。洗浄後、フ
ローサイトメトリーを行うために、ＢＳＡを含むＰＢＳに細胞ペレットを再懸濁
した。細胞内Ｈｓｐ４７とＭ１３バクテリオファージを評価するために、まず、
先行文献（Tangら、１９９４；Tangら、１９９３）に記載されているように、０
．１％サポニンを用いて細胞を透過性にした。次いで、ＦＡＣＳｃａｎフローサ
イトメーター（ベクトン・ディキンソン、サンホセ、ＣＡ）でサンプルを分析し
た。４８８ｎｍのアルゴンレーザーを１５ｎＷの電力で照射した。５３０／３０
ＢＰフィルター後のフルオレセイン複合体からのデータを集めた。２色フローサ
イトメトリー分析のために、フルオレセインまたはＲｅｄ６７０（商標）のいず
れかをヨウ化プロピジウムとともに用いた。使用したフィルターは、６００ｎｍ
２色性ＳＰ；５２５±１５ｎｍＢＰ（フルオレセイン）および６４５ＬＰ（Ｒｅ
ｄ６７０（商標））であった。

【０１４５】 ヨウ化プロピジウムを用いて細胞周期を評価し、死細胞を着色した。これらの
実験のために、〜１×１０⁶個の洗浄した細胞に、Ｐｌを含む低浸透圧クエン酸
溶液を、濃度が１ｍＭとなるまで加えた。細胞を２０分間標識し、次いで、着色
溶液をＦＡＣＳｃａｎで分析した。５８５／４２ｎｍＢＰフィルター後のオレン
ジ色のＰｌ蛍光を集めた。

【０１４６】 電子的補償（ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ ｃｏｍｐｅｎｓａｔｉｏｎ）を放射が集
まっている蛍光チャネル間で用い、残基のスペクトルの重複を除いた。蛍光デー
タは４−１０スケール長（ｆｏｕｒ−ｄｅｃａｄｅ ｌｏｎｇ ｓｃａｌｅ）で
表示した。各サンプルあたり最小１０，０００事象を収集した。ＬＹＳＹＳ Ｉ
Ｉソフトウェア（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｍａｎｓｆｉｅｌｄ，Ｍ
Ａ）を用いてデータの分析を行った。細片および凝集を取り除くために蛍光２重
パラメーターカウンタープロットを用いた。このゲーティング方法により、死細
胞由来の細片の予備区別が可能となる（前方への低い光散乱および高いＰ１蛍光
）。

【０１４７】 免疫蛍光法および共焦点顕微鏡 Ｔａｎｇらの方法（Ｔａｎｇら、１９９４；Ｔａｎｇら、１９９３）にしたが
って、免疫蛍光法顕微鏡法を行った。細胞表面Ｈｓｐ４７またはＭ１３バクテリ
オファージを可視化するため、細胞の透過処理は行なわかったが、サイトメトリ
ー分析に関して記載したように処理し、１％パラホルムアルデヒドで固定した。
但し、非特異的な結合を防ぐため、細胞をＰＢＳ中１０％ブタ血清で１時間、ブ
ロックした。次いで、細胞を抗Ｈｓｐ４７または抗Ｍ１３バクテリオファージ抗
体（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ−Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｐｉｓｃａｔａ
ｗａｙ，ＮＪ）とともにインキュベートし、ＰＢＳで洗浄し、フルオレセインま
たはテキサスレッドのいずれかと結合させたヤギ抗ウサギＩｇＧと共に１時間イ
ンキュベートした。カバーガラスを、抗脱色剤（ａｎｔｉｂｌｅａｃｈｉｎｇ
ａｇｅｎｔ）（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ＆Ｐｅｒｒｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ
，Ｉｎｃ．；Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を含むマウント用培地(ｍｏｕ
ｎｔｉｎｇ ｍｅｄｉａ）中で載せた。細胞を、エピフルオロッセンス（ｅｐｉ
ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）を備えたＺｅｉｓｓ ＩＩ顕微鏡写真機の下で検査
した。１次抗体で処理しなかった細胞をネガティブコントロールとして用いた。

【０１４８】 共焦点画像をＺｅｉｓｓ ＬＳＭ４１０共焦点顕微鏡を用いて収集した。５９
０のバリアフィルタを備えた４８８／５６８のＦＴを用いてテキサスレッド染色
を検出し、５１５−５４０のバリアを備えた５６０のＦＴを用いて蛍光標識した
画像を作製した。デジタル画像をＺＩＰドライブで収集し、Ａｄｏｂｅ Ｐｈｏ
ｔｏｓｈｏｐ ３．０ソフトウェア（Ａｄｏｂｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．Ｍ
ｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ）を用いて図を作製した。二次抗体のみとイン
キュベーションした後の細胞は、蛍光を伴わなかった。

【０１４９】 リソソーム画分を標識するために、細胞を１ｍｇ／ｍｌリジン固定化可能ＦＩ
ＴＣ−デキストラン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ；Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ
）とともに、増殖培地中で３７℃で４時間、５％ＣＯ₂中でインキュベートした
。洗浄後、細胞をさらに３０分間インキュベートして初期エンドソーム（ｅａｒ
ｌｙ ｅｎｄｏｓｏｍａｌ）画分からリソソーム画分へとデキストランを追い出
した。初期エンドドームおよび再利用エンドソーム画分を同定するために、細胞
を、５０μｇ／ｍｌ ＦＩＴＣ−トランスフェリンを含む無血清培地（Ｍｏｌｅ
ｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ；Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）中で、３７℃で３０分間、５
％ＣＯ₂下でインキュベートした。処理を行なって、特定の亜細胞（ｓｕｂｃｅ
ｌｌｕｌａｒ）画分を同定したのち、細胞を、免疫蛍光および／または共焦点顕
微鏡のために固定化し処理した。

【０１５０】 原形質膜の亜細胞画分 原形質膜を分画する方法は、Ｗｅｂｅｒら（Ｗｅｂｅｒ ＴＭら、１９８８）
に記載の方法にしたがって修飾した。サンプルを細菌コラゲナーゼで処理して、
細胞分画の結果として細胞質由来のプロコラーゲン−Ｈｓｐ４７＿が細胞表面イ
ンテグリン（integrin）レセプターに結合する可能性を排除した。初期上清をＳ
ｏｒｖａｌｌ ＳＳ３４ローター中で４８，０００ｇで４℃で１５分間、遠心分
離し、高密度のミクロソームペレットを緩衝液中（４０μｌ）に再懸濁した。さ
らに上清をＢｅｃｋｍａｎ７０．１ローター中で３００，０００ｇで４℃で７５
分間遠心分離し、低密度のミクロソームペレットを緩衝液中（６０μｌ）で再懸
濁した。

【０１５１】 膜画分を、５’−ヌクレオシダーゼ活性（原形質膜のマーカー）（Ａｖｒｕｃ
ｈおよびＷａｌｌａｃｈ，１９７１）の分布により特徴付けた。原形質膜を、直
接、ＰＡＧＥおよびウェスタン分析に供した。ウェスタンブロットに関しては、
ＳＤＳ−ＰＡＧＥで泳動したタンパク質を、すぐにニトロセルロース紙に電子移
動させ（electrotransfer）、１０％乾燥脱脂粉乳（ＮＦＤＭ）を用いてブロッ
クした。抗血清または過免疫（ｐｅｒｉｍｍｕｎｅ）血清を同一の緩衝液中で１
：２０００に希釈し、一晩穏やかに攪拌しながらインキュベートした。次いで、
ニトロセルロースをＴＢＳ／Ｔｗｅｅｎ中で、５分間、３回リンスした。Ｈｓｐ
４７およびＭ１３バクテリオファージに対する抗体を［¹²⁵Ｉ］−標識プロテイ
ンＡ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｎｕｃｌｅａｒ、Ｂｏｓｔｏｎ、Ｍａｓｓ）を
用いてか、または以前に記載（Ｓａｕｋら、１９９７）されているようにウェス
タンブロット分析を用いて検出した。

【０１５２】 結果 Ｈｓｐ４７の結合モチーフを解明するために、本発明者らは、ｐＩＩＩタンパ
ク質のＮ末端にランダムなセプタペプチドまたはドデカペプチド挿入物を有する
２種類のバクテリオファージライブラリーを利用した。一般的に、少なくとも７
個または８個の残基を含むペプチドは効率的な結合に必要であるので、本発明者
らはまず、セプタマーの（ｓｅｐｔａｍｅｒｉｃ）ペプチドを示すバクテリオフ
ァージのライブラリーを選択した（Ｐｈ．Ｄ．−７，Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ
Ｂｉｏｌａｂｓ；Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）。これらのペプチドの特徴づけを開始
するため、７０個の個別のバクテリオファージクローンを無選択ライブラリーか
ら無作為に拾い上げ、種々のセプタペプチドインサートのアミノ酸配列を対応す
るコード領域のヌクレオチド配列から推測した。全てのアミノ酸を表示するが、
各残基をコードするコドンの相対数から予測されるコドン頻度は常に対応するわ
けではない。

【０１５３】 パンニング（ｐａｎｎｉｎｇ）により得られた５４個のＨｓｐ４７−結合バク
テリオファージにより示されるセプタペプチドの配列は、バクテリオファージゲ
ノムの対応する領域のＤＮＡ配列分析により決定した。まず、Ｈｓｐ４７に結合
した５４個のクローン由来のペプチド配列を単一の集団であるとみなし、そして
開始ライブラリーから無作為に拾い上げた７０個のクローン由来のものと比較し
た。Ｈｓｐ４７−結合バクテリオファージの親水性の作表により、パンニングに
より選択された２つの一般集団のペプチドが示された。１つのペプチドグループ
は親水性ペプチドにより示され、他方はより小さい親水性基のペプチドの基によ
り示される（図１）。

【０１５４】 セプタペプチドの選択したものと選択していないものとの２つの集団の全体的
なアミノ酸組成を比較すると、アスパラギン（Ｎ）、トレオニン（Ｔ）、チロシ
ン（Ｙ）およびプロリン（Ｐ）が特に豊富であり、他方、フェニルアラニン（Ｆ
）、アスパラギン酸（Ｄ）およびアルギニン（Ｒ）がわずかに枯渇していた（図
２ａ、２ｂ）。しかしながら、個別に考慮すると、ペプチドの親水性基は顕著に
トリプトファンおよびロイシンならびにバリンおよびアラニンが豊富であった。

【０１５５】 種々のセプタペプチドを成熟ｐＩＩＩタンパク質に連結する５個の残基のスペ
ーサーは、豊富な残基を含まなかった。従って、スペーサーの残基はおそらく選
択したバクテリオファージの結合活性に寄与しないことを示すので、結合モチー
フの存在に関しては種々のセプタペプチド配列内のみを観察すれば良い。選択し
た疎水性ペプチドを観察すると、ＸＨｙＨｙＸＸＸＨｙＨｙ（ここで、Ｈｙは大
型の疎水性アミノ酸（通常、Ｗ、ＬまたはＦであり、Ｘは任意のアミノ酸である
）のような残基のモチーフが最も良く観察されることが示された。このコアモチ
ーフはまた、モチーフＸＨｙＨｙＸＸＨｙＸＸＸＸＨｙＨｙにより表されるＰｈ
．Ｄ−１２ライブラリー由来の選択した残基中で同定される。これらのデータを
考慮すると、ペプチド結合部位は、荷電した親水性残基により区別される深い疎
水性ポケットを有することが示される（図３）。ＸＸＨｙＨｙＸＸＸと記載され
るペプチドモチーフにより、ライブラリーから選択された、選択した親水性ペプ
チドが最も良く示される。興味深いことに、また、類似のコアモチーフ（ＨｙＸ
ＸＸＨｙＨｙＸＸＨｙＸＸＸ）をドデカペプチドライブラリー由来の選択した残
基中で同定することができた。しかしながら、少数のペプチドは、Ｈｓｐ４７の
パンニングの間に選択されるが、疎水性残基中で完全に欠損している。

【０１５６】 プロコラーゲンＩがＨｓｐ４７に対する天然のリガンドであることの認識。バ
クテリオファージ提示ペプチドおよびプロコラーゲンＩおよび選択したドデカペ
プチドの間の配列ホモロジーを評価するためにＢＬＡＳＴプログラム分析を行っ
た。興味深いことに、配列のみに基づいては特異的なホモロジーはほとんど観察
されなかった。しかし、プロコラーゲンＩのハイドロパシープロフィール（１）
を、ウィンドウ長７にわたり親水性を計算するＫｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ法
を用いて、３回のパンニングから得たドデカペプチドと比較すると、ファージ提
示ペプチドの全てはプロコラーゲン分子内の特定の領域により示された。興味深
いことに、ほとんどの疎水性ペプチドは、Ｎ−プロペプチド領域（残基５９〜７
１）またはＣ−プロペプチド領域（残基１３４４〜１４４５）内の領域に局在す
る。逆にいえば、親水性ペプチドのほとんどはプロコラーゲンの螺旋領域を有す
る領域に局在し（残基：２８３〜２９５、４７０〜４８２、６６６〜６７８、７
２７〜７３９、１０４０〜１０５２および１０８７〜１０９９）、１つのペプチ
ドはＮ−プロペプチド領域内の配列に局在する（残基１００〜１１２）（図４）
。

【０１５７】 腫瘍細胞上のＨｓｐ４７−結合ファージ（ＨＢＰ）の亜細胞局在を見抜くため
に、本発明者らはＨＢＰ（２５μl）を１０⁶個の細胞（ＳＣＣ４、ＳＣＣ９、Ｓ
ＣＣ１５、ＳＣＣ２５、ＨＴＢ１２６、ＨＴＢ１２７、ＰＣ−３およびＬＮＣａ
Ｐ）と、培地中で１時間、３７℃でインキュベートした。次いで、細胞をＴＢＳ
−Ｔｗｅｅｎで３回洗浄し、ＦＩＴＣ−抗−Ｍ１３抗体を用いてＨＢＰ染色し、
フローサイトメトリーにより分析した。これらの研究により、透過処理していな
い腫瘍細胞株（ＳＣＣ４、ＳＣＣ９、ＳＣＣ１５、ＳＣＣ２５、ＨＴＢ１２６お
よびＰＣ−３）が、その細胞表面に種々のレベルのＭ１３ファージ染色を有する
ことが示された。さらに、細胞は、抗体の添加前に透過処理すると、インターナ
リゼーションしたファージと関連する細胞表面染色により染色が増加することを
示した。しかし、同様の様式で処理したＧＭＳＭ−Ｋ（確立された上皮細胞株）
は、ほとんどまたは全く染色を示さなかった。図５は、代表的な腫瘍細胞株、Ｓ
ＣＣ４細胞をＧＭＳＭ−Ｋ細胞と比較したことを示す。ＧＭＳＭ−Ｋ細胞に関し
て得られた結果と類似する結果が、ＨＴＢ１２５およびＰＺ−ＨＰＶ（それぞれ
、正常乳房（ｂｅａｓｔ）および前立腺細胞株）に関しても得られた。

【０１５８】 Ｍ１３−結合ファージと特定の細胞株との関連を証明するために、ＳＣＣ４お
よびＧＭＳＭ−Ｋ細胞をＨＢＰで１時間処理し、次いでＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎで３
回洗浄し、原形質膜を単離し、抗−Ｍ１３抗体を用いて免疫沈降させた。これに
より２つのタンパク質バンドが生じ、１つのバンドはＭｒ＝４７ｋであり、そし
て他方のバンドはＭｒ＝２７ｋであった（図６）。ウェスタンブロット分析によ
り４７ｋバンドをＨｓｐ４７であると同定した。

【０１５９】 共焦点顕微鏡を用いてＨＢＰの運命および同時局在（co-licalization）を決
定した。これらの研究により、腫瘍細胞株を、顕微鏡下で細胞表面での染色の分
布が生じるＨＢＰで処理した場合には、ＥＲと一致する核周囲領域での強い染色
を示した（Ｈｅｂｅｒｔら、１９９９）。次いで、細胞をＭ１３バクテリオファ
ージで処理し、続いてテキサスレッド−抗−Ｈｓｐ４７抗体およびＦＩＴＣ−Ｍ
１３抗体を用いる２重染色により処理した。Ｈｓｐ４７の局在は、Ｍ１３ファー
ジ染色の局在と類似しており、抗体の同時局在は、Ｍ１３染色およびＨｓｐ４７
染色パターンの両方の重ね合わせである黄色の着色を示した（図７）。

【０１６０】 次いで、本発明者らは、ＨＢＰが、後期エンドソーム／リソソーム画分に局在
するかどうかを決定した。リソソーム画分を標識するために、細胞をＦＩＴＣ−
結合型デキストランの存在下で培養し、次いで、固定およびテキサスレッド結合
型抗Ｍ−１３抗体での免疫染色の前に、３０分間チェイス（ｃｈａｓｅ）するこ
とによりデキストランを初期エンドソーム画分から除いた。ＳＳＣ４細胞（これ
は他の細胞株の代表例である）により、ＦＩＴＣ−デキストランが小胞構造にあ
ることをはっきりと同定したが、ＨＢＰ染色は主に細胞質内の斑点（ｐｕｎｃｔ
ａｔｅ）小胞および核周囲領域に限定されることを実証した（図８）。ＨＢＰは
顕著にリソソームに標的化されているわけではないことを証明するために、ＳＣ
Ｃ４細胞にラテックスビーズおよびＨＢＰを供給し、次いで抗−Ｍ１３抗体を用
いて免疫蛍光のために固定化し、そして処理した。ＳＣＣ４細胞では、Ｍ１３シ
グナルはビーズ周辺に配置し得ず、このことによりファゴソームとは最小限の関
連しかないことが示唆される。

【０１６１】 これまでに、本発明者らはＨｓｐ４７が細胞表面で発現されることを示してき
たので、細胞表面Ｈｓｐ４７と結合したＨＢＰが再利用エンドソーム（ｒｅｃｙ
ｃｌｉｎｇ ｅｎｄｏｓｏｍｅ）中に存在し得るかどうかを考察した。これらの
画分を標識するために、ＳＣＣ４およびＧＭＳＭ−Ｋ細胞を、固定化および抗−
Ｍ１３抗体での染色の前に、ＦＩＴＣ−結合型またはテキサスレッド結合型トラ
ンスフェリンの存在下で培養した。共焦点顕微鏡での分析により、トランスフェ
リンが原形質膜（細胞の縁での環状の染色）および再利用エンドソーム（亜細胞
の斑点の染色）の両方を染色したことを示した。非常に類似した重複したパター
ンをＭ１３抗体染色について観察し、続いて２つの画像の重ね合わせにより斑点
亜細胞領域および原形質膜での２つのシグナルの着色（ｃｏｌｏｃａｌｉｚａｔ
ｉｏｎ）（黄色の着色）を示した。（図９）。注目すべきことは、ＧＭＳＭ−Ｋ
細胞が結合型デキストランで同様の染色パターンを提供するが、しかしトランス
フェリンは抗Ｍ１３抗体により染色されなかったことである（示さず）。

【０１６２】 パンニングにより単離したペプチド配列に基づき、スコアリングから得られた
推定モデルと一致するセプタペプチドおよびドデカペプチドを合成し、ＦＩＴＣ
で標識し、そしてＨＢＰとの結合および取り込みを示すＳＣＣ細胞とインキュベ
ートした。細胞株はいずれもセプタペプチドを取り込まなかったが、合成ドデカ
ペプチドは全て、インキュベーションの１５分後には腫瘍細胞の細胞質に見出す
ことができた（図１０）。

【０１６３】 考察 ランダムペプチドライブラリーの使用は、新規な治療用分子を同定するために
有用な道具であることが示されている。ライブラリーは、線状ファージクローン
のビリオン表面か、または固相合成支持体上のいずれかに提示される多数のペプ
チド配列を示す。このストラテジーの中心は、このようなライブラリーからのア
フィニティー選択により単離したペプチドは、代表的には、標的タンパク質の生
物学的に関連するドメインと相互作用するという知見である（Ｓｍｉｔｈおよび
Ｓｃｏｔｔ、１９９３；Ｋｉｔａｍｕｒａら、１９９２；Ｂｕｒｋｈａｒｄｔら
、１９９１；Ｓｍｉｔｈら、１９９５；Ｐａｓｑｕａｌｉｎｉら、１９９６；Ｐ
ａｓｑｕａｌｉｎｉおよびＲｕｏｓｌａｈｔｉ、１９９６；Ｒｕｏｓｌａｈｔｉ
、１９９７；Ｒｕｏｓｌａｈｔｉ、１９９６；Ｈｕｔｃｈｃｒｏｆｔら、１９９
２；Ｂｏｒｓｔら、１９９３）。しばしば、このストラテジーは、タンパク質ま
たはレセプターのただ１つのドメインに明らかに結合する多数のペプチドを生じ
る。珍しいことに、ペプチドは、しばしば配列類似性を失っており、それゆえミ
モトープ（ｍｉｍｏｔｏｐｅ）の発見のもとである（Ｂｏｗｄｉｔｃｈら、１９
９６；Ｐａｒｔｉｄｏｓら、１９９７；Ｂｏｗｄｉｔｃｈら、１９９６）（ここ
で、短いペプチドは、それらの配列が抗原と異なっていたとしても抗体の抗原結
合部位に結合する）。

【０１６４】 無数のペプチドが両方のライブラリーに局在している場合、このことは明らか
である。しかし、これらのペプチドは、２つのグループに分割することができる
。１つのグループは疎水性残基の普及により特徴付けられ、そして第２のグルー
プは多数の荷電親水性残基により特徴付られる。選択したバクテリオファージの
群により示される、ペプチド内におけるバリンおよびアラニンならびにトリプト
ファンおよびロイシンの豊富さは、疎水性特性により決定される領域に対するＨ
ｓｐ４７の親和性と一致する。さらに、ＸＸＸＸＸＨｙＸＸＨｙＸＨｙＨｙのモ
チーフを有するドデカペプチドによるＨＢＰ結合を実証することにより、リガン
ドの疎水性ドメインはｐＩＩＩ末端に位置する必要がないことが示される。それ
ゆえ、本発明者らのデータは、これらの選択したペプチドが大型疎水性および芳
香族アミノ酸の側鎖に適応し得る長いポケットを含み、荷電した残基と相互作用
しうる隣接領域を含む、Ｈｓｐ４７に対するペプチド結合部位を記載することを
示唆する。これらの結論は、成熟Ｈｓｐ４７が、生理学的なｐＨで長く深い裂け
目としての結合領域（これは底部はβ−シートにより形作られ、側面はらせんに
より形成される）を有することを示す３次元構造モデリング研究により支持され
る。らせんにより、疎水性アミノ酸残基側鎖が裂け目のほうへと突き出すと同時
に、β−シート突出疎水性アミノ酸残基側鎖は底部から持ちあがる（Ｄａｖｉｄ
ｓら、１９９５）。さらに、このモデルは、これまでに記載されているＨｓｐ４
７のＮ−プロペプチド内の疎水性領域（Ｈｕら、１９９５）、同様に、変性コラ
ーゲン骨格（ゼラチン）（Ｎａｇａｔａら、１９８８）に結合する能力を説明す
る。プロコラーゲン鎖のカルボキシ末端の会合が鎖アセンブリの原因であるため
、プロコラーゲンのＣ−プロペプチド領域内の領域もまた、Ｈｓｐ４７に対する
結合部位を提供するという知見も、興味深いものである（Ｃｈｅｓｓｌｅｒ，１
９９３ｂ；Ｌｅｅｓ，１９９７；Ｏｌｉｖｅｒ，１９９６；Ｌｅｅｓ，１９９４
；Ｃｈｅｓｓｌｅｒ，１９９３ａ）。

【０１６５】 腫瘍細胞の細胞表面に提示されるＨｓｐ４７の性質および運命をさらに理解す
るため、本発明者らは、フローサイトメトリー分析を用いてバクテリオファージ
ライブラリーから選択されるＭ１３−ファージを多数の口腔癌、乳房および前立
腺の細胞株の細胞表面に対する位置決定を行った。そのようにすることにより、
本発明者らは抗体染色の前の細胞の透過処理によりＦＡＣＳシグナルが向上し、
Ｍ１３が細胞内へとインターナリゼーションされることを示唆することを示した
。Ｈｓｐ４７結合ペプチドを提示する、選択したバクテリオファージに曝した腫
瘍細胞の原形質膜の免疫沈降により、Ｈｓｐ４７がＭ１３バクテリオファージな
らびに別の２７ｋＤタンパク質（これはＣＤ９を意味し得る）で免疫沈降するこ
とが示され（Ｈｅｂｅｒｔら、１９９９）、したがって、選択されたＨＢＰが細
胞表面Ｈｓｐ４７複合体と関連することを実証する。次いで、共焦点画像を利用
してインターナライズした選択されたペプチド提示バクテリオファージの運命の
位置決めを始めることができる。これらの研究は、短期インキュベーションによ
り細胞表面および再利用エンドソームへと局在する選択されたペプチドが生じる
ことを示した。細胞表面タンパク質およびレセプターの膜代謝は、通常、このよ
うな経過にしたがうので、これは予想外のことではない。しかしながら、驚くべ
きことに、少量のインターナライズされたペプチドのみがＦＩＴＣ−デキストラ
ン染色により区別されるリソソーム中で同定され得る。対照的に、細胞をＭ１３
提示ＨＢＰおよびＨｓｐ４７の両方について染色した場合、両方の抗体の同時局
在である黄色の着色が生じ、これは再利用エンドソームおよびＥＲにより表され
る細胞内局在と一致する。

【０１６６】 まとめると、これらのデータにより、異なる細胞表面ペプチドホルモンレセプ
ターは、リガンドに結合した際にエンドサイトーシスによりインターナリゼーシ
ョンをうけ、次いでエンドソーム中でリソソームへと分類され、ここで、おそら
く分解されることを示す（Ｇｒｕｅｎｈｅｉｄ、１９９９）。細胞表面ＥＲタン
パク質は、リガンドと共にＥＲへと戻ることが定められており、少量のリガンド
のみがリソソーム処理を運命付けられている。考えられるところでは、限定され
た数のリガンドに結合する能力を有するＥＲタンパク質の使用により、薬物結合
体または画像化化合物のこれらのタンパク質を発現する腫瘍細胞に対する直接的
な標的化が可能となる。このような標的化は、非選択的な毒性効果を最小限にす
る可能性を提供する。さらに、細胞膜を越えての細胞表面ＥＲ−媒介性薬物輸送
の場合において、多剤耐性がその重篤性を減少すると予想される（Ｃｚｅｒｗｉ
ｎｓｋｉら、１９９８）。これらのインビトロデータは、細胞表面発現型Ｈｓｐ
４７が非常に選択的な腫瘍薬剤を送達し得るかもしれないエレメントを含むこと
、この活性を決定する際に重要性を有するかもしれないエレメントはもまた、や
はりこのモデルで試験されるはずであることを示す。これらのエレメントは、そ
の効果をＥＲへと送達し得る型の毒性部分、および薬物を送達するために必須の
レベルの細胞表面に発現されたＨｓｐ４７、およびさらなるリガンド結合のため
の再利用および輸送のための能力を備える（Ｃｚｅｒｗｉｎｓｋｉら、１９９８
）。バクテリオファージのｐＩＩＩ末端に提示されるセプタペプチドは腫瘍細胞
により取り込まれるが、合成ホモログはインターナライズされない場合、このよ
うなペプチドの使用は、循環中で安定であり、結合のためにペプチドを提示し得
、そしてなおインターナリゼーションに従い処理され得るペプチドリンカーを必
須とする。本発明者らの研究所で継続している研究は、これらの問題を解決する
ことおよび本発明者らの知見を関連する腫瘍に臨床的に適用することに関する。

【０１６７】 参考文献

【０１６８】

【０１６９】

【０１７０】

【０１７１】

【０１７２】 図面の説明 図１.Ｈｓｐ４７に対するパンニング後のＰｈＤ−７ライブラリーから選択され
たバクテリオファージによりディスプレーされたペプチドについて計算された疎
水性スコア化合物の分布 KyteおよびDoolittle（1982）のヒドロパシースケールを用いて各ペプチドに
ついて計算された全体の疎水性スコアの分布は、バクテリオファージによってデ
ィスプレイされた５４個のペプチドについて示している。

【０１７３】 図２.ＰｈＤ−７バクテリオファージのライブラリーによってディスプレイされ
たセプタペプチドにおける２０アミノ酸の相対吸光度 １本鎖のＤＮＡを、ＰｈＤ−７ライブラリー由来の７０バクテリオファージク
ローンから精製し、これらバクテリオファージによってディスプレイされたセプ
タペプチドの配列をバクテリオファージの対応する領域のＤＮＡ配列から推定し
た。図は、観察された数を７０個のセプタペプチドの全残基数で割ることにより
計算した各アミノ酸が現れる頻度を示す。アミノ酸はそれを特定するコドンの番
号によってグループ分けし、すべてのコドンが等しい効率で利用された場合の、
各グループについて期待される頻度を白棒で示す（Cwirla et.al., 1990）。（
Ｂ）Ｈｓｐ４７結合ＰｈＤ−７バクテリオファージ由来の５４個のセプタペプチ
ドの全アミノ酸組成を、ＰｈＤ−７出発ライブラリーからランダムに選択したク
ローンに由来する７０個のセプタペプチドの全アミノ酸組成を比較した。吸光度
が何倍増加または何倍減少したか示す。

【０１７４】 図３.Ｈｓｐ４７のペプチド結合部位のモデル図 ペプチド骨格は伸長鎖で示す。２つの隣り合った残基の側鎖は、大きな疎水性
または芳香族の側鎖に対する全体の選択性を有するペプチド結合部位における深
いポケットへ伸びている。図３のデータは、セプタペプチドにおける２＆３位の
アミノ酸、２＆３位および／または１１＆１２位によりＨｓｐ４７側鎖と望まし
く接触する。疎水性のポケットは、セプタペプチドの４、５、６位およびデドカ
ペプチドの４＆５位、および７、８、９＆１０位に荷電したアミノ酸残基を含ん
でいる領域に結合している。

【０１７５】 図４：ＰｈＤ−１２ライブラリー由来の選択されたペプチドと比較した選択され
たプロコラーゲンＩのヒドロパシープロファイル ヒドロパシーを計算するKyte Doolittle法（1982）を、ウインドウ長７につい
て用い、ＰｈＤ−１２ライブラリー由来の選択されたファージをプロコラーゲン
Ｉα鎖と比較した。プロコラーゲンＩプロファイルの上のボックス内に示された
残基は、パンニングの３ヶ月後にＰｈＤ−１２ライブラリーから選択されたＨｓ
ｐ４７結合ペプチドと同様の残基を示す。Ｃ−ペプチド領域の矢印は、プロコラ
ーゲンの会合およびアッセンブリーにとって重要なアミノ酸を示す（Chessler,
1983b； Lees, 1997； Oliver, 1996； Lees, 1994； Chessler, 1983b）。

【０１７６】 図５：ＧＭＳＭ−Ｋ（対照）およびＳＣＣ−４細胞のＦＩＴＣ抗アンチファージ
Ｍ１３染色 パネルａおよびｂは対象のＧＭＳＭ−Ｋ細胞およびＳＣＣ−４細胞それぞれの
膜染色を示す。パネルｃおよびｄは、それぞれＧＭＳＭ−Ｋ細胞およびＳＣＣ−
４細胞であり、細胞を透して細胞内染色を示す。ボックス内の領域は、ファージ
−ペプチドのＦＩＴＣ染色を示す。

【０１７７】 図６：抗ファージＭ１３抗体による膜タンパク質の免疫沈降 バンドは、Methodsに記載されているように、免疫沈降したタンパク質が結合
している抗Ｍ１３ファージを表す。レーンａ〜ｃは、それぞれＰｈＤ−７クロー
ン３、５＆７であり、レーンｄ〜ｆは、それぞれＰｈＤ−１２クローン２、５＆
９である。

【０１７８】 図７：抗Ｈｓｐ４７および抗Ｍ１３抗体で染色したＳＣＣ−４細胞の共焦点顕微
鏡画像 パネルａは、ＦＩＴＣコンジュゲート抗Ｍ１３抗体で染色された腫瘍細胞を示
し、パネルｂは、テキサスレッドコンジュゲート抗Ｈｓｐ４７抗体、およびパネ
ルｃは、ＦＩＴＣの黄色の色素とテキサスレッド染色の空間的な共存を示す。

【０１７９】 図８：ＦＩＴＣ−デキストランおよびテキサスレッド抗Ｍ１３抗体で染色したＳ
ＣＣ−４細胞の共焦点顕微鏡画像 パネルａは、ＦＩＴＣコンジュゲートデキストランで染色された腫瘍細胞を示
し、パネルｂはテキサスレッドコンジュゲート抗Ｍ１３抗体を示し、そしてパネ
ルｃは、ＦＩＴＣおよびテキサスレッド染色の空間的な共存を示す。抗Ｍ１３抗
体のごく一部分のみが黄色の色素であるＦＩＴＣ−デキストランと共存する。

【０１８０】 図９：ＦＩＴＣ−トランスフェリンおよびテキサスレッド抗Ｍ１３抗体で染色し
たＳＣＣ−４細胞の共焦点顕微鏡画像 パネルａは、ＦＩＴＣコンジュゲートトランスフェリンで染色された腫瘍細胞
を示し、パネルｂはテキサスレッドコンジュゲート抗Ｍ１３抗体を示し、パネル
ｃは黄色の色素であるＦＩＴＣとテキサスレッド染色の空間的な共存を示す。

【０１８１】 図１０：ＳＣＣ細胞における、フルオレセインイソチオシアネートコンジュゲー
トドデカペプチド取込み クローンペプチドに対応するドデカペプチドを合成しMthodsに記載されている
ようにフルオレセインイソチオシアネートにコンジュゲートした。次いで、ペプ
チドをＳＣＣ−４細胞と３０分間インキュベーションし、洗浄し、蛍光顕微鏡用
に処理した。核の領域についておよび点状の染色で検出された緑色蛍光は、ペプ
チド取込みの細胞内の分布を示している。

【０１８２】

【０１８３】

【０１８４】

【０１８５】

【０１８６】

【０１８７】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 49/00 Ａ６１Ｐ 35/00 Ａ６１Ｐ 35/00 Ｃ０７Ｋ 14/47 ＺＮＡ Ｃ０７Ｋ 14/47 ＺＮＡ 16/18 16/18 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ Ｇ０１Ｎ 33/15 33/50 Ｚ 33/50 33/53 Ｄ 33/53 33/574 Ａ 33/574 Ｄ 33/577 Ｂ 33/577 Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ， ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ Ｒ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ， ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，Ｋ Ｚ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ， ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，Ｓ Ｋ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ Ｆターム(参考） 2G045 AA26 AA40 CB02 DA36 DA78 FB03 4C084 AA02 AA06 AA13 AA17 BA01 BA08 BA18 BA23 MA01 NA14 ZB262 4C085 AA14 CC32 EE01 GG01 KA04 KA29 KA30 LL18 4C086 AA01 AA02 EA16 MA01 MA04 NA14 ZB26 4H045 AA10 AA11 AA30 BA50 CA40 DA76 EA20 EA51 FA74

Claims (32)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 Ｈｓｐ４７が少なくともいくつかの細胞の表面に発現してい
   る癌に罹患している患者を処置する方法であって、Ｈｓｐ４７の外部領域に選択
   的に結合する標的部分を含んでなる物質の有効量を患者に投与ことを含んでなる
   方法。
2. 【請求項２】 標的部分が抗体またはその断片である請求項１に記載の方法
   。
3. 【請求項３】 抗体がモノクローナル抗体である、請求項２に記載の方法。
4. 【請求項４】 標的部分がペプチドである、請求項１に記載の方法。
5. 【請求項５】 ペプチドが、XHyHyXXHyXXXXHyHy（配列番号１）またはHyXXX
   HyHyXXHyXXX（配列番号２）［式中、Ｘは独立にいずれかのアミノ酸であってよ
   く、Ｈｙは独立にいずれかの疎水性アミノ酸であってよい］である、請求項４に
   記載の方法。
6. 【請求項６】 ペプチドが、表１および表２の配列番号３〜配列番号２５の
   うちの１つである、請求項４に記載の方法。
7. 【請求項７】 標的部分が、その表面におけるバクテリオファージがＨｓｐ
   ４７の外部領域に特的に結合するペプチドである、請求項１に記載の方法。
8. 【請求項８】 前記物質が、毒物、ラジオアイソトープまたは放射性核種、
   抗体または治療遺伝子をコードする核酸である治療部分をさらに含んでなる請求
   項１に記載の方法。
9. 【請求項９】 細胞内マトリックス、腫瘍細胞の侵入、悪性細胞の遊走また
   は運動、または腫瘍細胞転移との相互作用を調節するための、請求項１に記載の
   方法。
10. 【請求項１０】 Ｈｓｐ４７を細胞表面に発現している細胞を調節するため
    の方法であって、その細胞にＨｓｐ４７の外部領域に結合する標的部分を含む物
    質の有効量を投与することを含んでなる方法。
11. 【請求項１１】 Ｈｓｐ４７がヒトである請求項１に記載の方法。
12. 【請求項１２】 Ｈｓｐ４７が少なくともいくつかの細胞の表面に発現して
    いる癌を検出する方法であって、癌をＨｓｐ４７の外部領域と特異的に結合する
    標的部分を含んでなる検出可能な物質と接触させる事を含んでなる方法。
13. 【請求項１３】 標的部分が、その部分のそれぞれがＨｓｐ４７の外部領域
    と特異的に結合する、抗体またはその断片、 ペプチドまたはその表面がペプチ
    ドであるバクテリオファージである請求項１２に記載の方法。
14. 【請求項１４】 検出可能な物質が、ＭＲＩ、Ｘ線、ガンマシンチグラフィ
    、またはＣＴスキャンにより検出可能である、請求項１２に記載の方法。
15. 【請求項１５】 Ｈｓｐ４７をその表面に発現する細胞を検出するための方
    法であって、Ｈｓｐ４７の外部領域に特異的に結合する標的部分を含んでなる検
    出可能な物質を細胞に投与することを含んでなる方法。
16. 【請求項１６】 Ｈｓｐ４７がヒトである、請求項１２に記載の方法。
17. 【請求項１７】 Ｈｓｐ４７が少なくともいくつかの細胞の表面に発現する
    癌に特異的に結合する物質をスクリーニングするための方法であって、Ｈｓｐ４
    ７の外部領域に特異的に結合する標的部分を含んでなる物質を同定することを含
    んでなる方法。
18. 【請求項１８】 物質がその患者における癌の処置に有用である、請求項１
    ７に記載の方法。
19. 【請求項１９】 物質がその患者における癌の診断に有用である、請求項１
    ７に記載の方法。
20. 【請求項２０】 Ｈｓｐ４７が少なくともいくつかの細胞の表面に発現する
    癌に罹患している患者を処置する、またはＨｓｐ４７が少なくともいくつかの細
    胞の表面に発現する癌を検出するためのキットであって、その癌に対する細胞増
    殖抑制効果または細胞溶解効果を生じるまたは非癌細胞のバックグラウンドより
    も上の細胞を造影するのに有効な量で、Ｈｓｐ４７の外部領域と特異的に結合す
    る標的部分を含んでなる物質を含んでなるキット。
21. 【請求項２１】 標的部分が、そのそれぞれがＨｓｐ４７の外部領域に特異
    的に結合する、抗体またはその断片、ペプチドまたはその表面がペプチドである
    バクテリオファージである、請求項２０に記載のキット。
22. 【請求項２２】 前記物質が、毒物、ラジオアイソトープまたは放射性核種
    、抗体、または治療遺伝子をコードする核酸である治療部分をさらに含んでなる
    、請求項２０に記載のキット。
23. 【請求項２３】 Ｈｓｐ４７をその表面に発現する細胞を調節するためのキ
    ットであって、Ｈｓｐ４７の外部領域に特異的に結合する標的部分をその細胞の
    活性を調節するのに有効な量で含んでなる物質を含んでなるキット。
24. 【請求項２４】 XHyHyXXHyXXXXHyHy（配列番号１）またはHyXXXHyHyXXHyXX
    X（配列番号２）［式中、Ｘは独立にいずれかのアミノ酸であってよく、Ｈｙは
    独立にいずれかの疎水性アミノ酸であってよく、結合がその細胞を調節するのに
    有効である］を含んでなる、細胞の表面に発現するＨｓｐ４７の外部領域に特異
    的に結合するペプチド。
25. 【請求項２５】 XHyHyXXHyXXXXHyHy（配列番号１）またはHyXXXHyHyXXHyXX
    X（配列番号２）［式中、Ｘは独立にいずれかのアミノ酸であってよく、Ｈｙは
    独立にいずれかの疎水性アミノ酸であってよい］を含んでなり、その癌に対する
    細胞増殖抑制効果または細胞溶解効果を生じるまたは非癌細胞のバックグラウン
    ドよりも上の細胞を造影するのに有効であるペプチド。
26. 【請求項２６】 前記ペプチドが、全長コラーゲン、天然のコラーゲンまた
    はその断片でない、請求項２４に記載のペプチド。
27. 【請求項２７】 表１の配列番号３〜１３のペプチド。
28. 【請求項２８】 表２の配列番号１４〜２５のペプチド。
29. 【請求項２９】 細胞の表面に発現したＨｓｐ４７の外部領域に特異的に結
    合した標的部分を、その細胞ノ活性を調節するのに有効な量で含む物質。
30. 【請求項３０】 請求項２４記載のペプチドおよび製薬的に許容し得る担体
    を含んでなる医薬組成物。
31. 【請求項３１】 請求項２９記載の物質および製薬的に許容し得る担体を含
    んでなる医薬組成物。
32. 【請求項３２】 その癌に対する細胞増殖抑制効果または細胞溶解効果を生
    じるのに有効な量の、癌の表面に存在するＨｓｐ４７の外部領域に特異的に結合
    する標的部分を含んでなる物質、および製薬的に許容し得る担体を含んでなる医
    薬組成物。