JP2660276B2 - 癌悪性度の体外検出法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、癌悪性度の体外検出法
に関する。本発明を用いることにより、簡易な方法で癌
の悪性度を検出することができる。

【０００２】

【従来の技術】癌の悪性度を把握することは、臨床にお
いて、治療法の選択や患者の予後の推定などのために不
可欠である。癌の悪性度は、癌の増殖性、浸潤性、転移
性などによって定められるが、これらの癌悪性度関連因
子を評価する方法として種々のものが提案されている。

【０００３】まず、すべての臓器の癌に適用可能な分類
として、ＵＩＣＣ（国際対癌連合）の提唱するＴＮＭ分
類がある。Ｔは原発巣の状態（大きさ、深達度など）、
Ｎはリンパ節転移の有無とその広がり、Ｍは遠隔転移の
有無を表し、それぞれが０、１、２、３などと表現さ
れ、数が大きいほど進行した癌であることを示す。Ｔ、
Ｎ、Ｍの組み合わせで癌の病期が規定され、Ｔ、Ｎ、Ｍ
のそれぞれと病期が最も単純で且つ重要な予後因子とさ
れている。

【０００４】しかし、病期がかなり進行してしまった段
階では、癌そのものの増殖が緩慢であっても、いずれ患
者は死の転帰をとることなどから、Ｔ、Ｎ、Ｍの因子を
そのまま悪性度の診断に用いることができない。そのよ
うな場合の診断用因子として、組織学的分化度、細胞学
的異型度、脈管侵襲性、分裂期細胞数の頻度、原発巣に
おける反応細胞の多寡とその細胞種ならびに局所リンパ
節における反応性（癌免疫）等のミクロ予後因子が例示
される。例えば、分裂期細胞数の頻度が重要な予後因子
であることは、いくつかの臓器の腫瘍で既によく知られ
た事実であり、特に子宮の平滑筋腫瘍では、数視野あた
りの分裂期細胞数を腫瘍の良・悪性の診断根拠としてい
る。しかし、中期の極めて短い腫瘍では、増殖速度が速
くても分裂期細胞数の頻度は低いものがあり、その頻度
は必ずしも増殖性を示すとはいえず、客観性があまり高
くない。

【０００５】一方、この数年間、ある種の染色体異常、
遺伝子異常が癌の悪性度と関連するとして、予後因子と
して登場してきた。例えば、異常な核ＤＮＡ量をもった
腫瘍は進展が速やかで患者の予後が不良であり、平均核
ＤＮＡ量のより大きなクローンはより悪性度が高いとい
ったことなどである。また、増幅された遺伝子、点突然
変異を示す遺伝子、さらには再構成を示す遺伝子の異常
発現と癌の悪性度あるいは患者の予後との相関がいくつ
かの癌について明らかにされている。最近では各種増殖
因子やその他の生理活性物質のレセプターの発現と予後
との関連性についての研究も盛んとなってきている。し
かし、いまだ十分な成果を挙げるには至っていない。

【０００６】以上のように、癌の悪性度を診断する方法
としては、ＴＮＭ分類、遺伝子、染色体によるものが主
流をなしているが、そのいずれもが診断に時間を要し、
また長年の経験を必要とする等の問題があった。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】本発明は上記事情に鑑
みてなされたものであり、簡易な方法で癌の悪性度を体
外にて検出することのできる、癌悪性度の体外検出法を
提供することを目的とする。

【０００８】

【課題を解決するための手段】癌の治療において、早期
の正確な診断による的確な治療の施行が重要であること
は、いまさら言を待たない。癌の治療の選択や予後の予
測は、癌の悪性度に応じて対処されるべきであり、癌悪
性度の検出は不可欠である。例えば、癌の悪性度が低い
と診断された症例では、患者に必要最小限の強さのマイ
ルドな制癌剤による処置を施すことができ、不必要に強
力な制癌剤による処置のために患者に副作用による多大
な苦痛を強いるというようなことが避けられよう。

【０００９】本発明者らは、ＨＳＰ（＝heat shock pro
tein；ストレス蛋白質、熱ショック蛋白質ともいう）と
癌との関連に関して検討を重ねてきたが、患者から採取
した癌細胞、血液、尿などの試料中におけるＨＳＰ４
７、すなわち分子量４７キロダルトンのＨＳＰの量を測
定することにより、癌の悪性度の診断が、ひいては患者
の予後の推定が可能であるという知見を得、本発明を完
成するに至った。すなわち本発明者らは、癌化し、ある
いは癌が悪性化するに従い、癌患者由来の試料中におけ
るＨＳＰ４７の発現量が減少し、極端な場合には消失し
てしまうということを発見したのである。

【００１０】本発明によれば、癌患者由来の被検試料中
におけるＨＳＰ４７のレベル（存在量）を測定すること
により癌の悪性度を検出することを特徴とする、癌悪性
度の体外検出法が提供される。

【００１１】ここで、該癌悪性度の体外検出法は、癌患
者由来の被検試料に、ＨＳＰ４７と免疫学的に反応性の
ある免疫反応物質を加え、生じたＨＳＰ４７と前記免疫
反応物質との結合体（以下、ＨＳＰ４７−免疫反応物質
結合体と称することがある）から該試料中におけるＨＳ
Ｐ４７を検出し、その量を測定するのが好ましい。

【００１２】さらに、ＨＳＰ４７ｍＲＮＡに相補的な配
列をもつ放射能あるいは非放射能標識したオリゴヌクレ
オチドプローブを用い、ＨＳＰ４７ｍＲＮＡを測定する
ことによる体外検出法も可能である。

【００１３】以下、本発明について詳細に説明する。

【００１４】本発明の目的とするところは、癌の悪性度
の早期検出の方法を提出することである。本発明におい
ては、ＨＳＰ４７（またはこれと交差反応性の抗原）が
癌の悪性度の診断マーカーとなり得る特定の蛋白質であ
る。ＨＳＰは、高温条件または他のストレスをかけた時
に細胞から産生される蛋白質である。ＨＳＰ４７は永田
等によって１９８６年に発見された蛋白質で、分子量４
７キロダルトンの塩基性蛋白質（ｐＩ＝９．０）であ
る。

【００１５】本発明者らにより、癌が悪性化するに従
い、当該癌患者由来の被検試料中におけるＨＳＰ４７の
発現量が減少し、極端な場合には消失してしまうという
ことが見出された。つまり、癌の悪性度とＨＳＰ４７の
発現レベルは逆相関の関係にある。このことから、上記
試料中のＨＳＰ４７の存在量を測定し、その存在量の減
少の度合いが大きいか、あるいは消失していれば癌の悪
性度が高いと診断し、存在量の減少の度合いが小さい
か、あるいは全く減少していなければ癌の悪性度は低い
と診断することができる。

【００１６】本発明において用いられる癌患者由来の被
検試料としては、癌患者から採取した癌細胞等の組織ま
たはその抽出物や、血清、尿、脳脊髄液等の体液などが
例示されるが、通常の臨床検査等において用い得る採取
物であれば何でもよく、特に限定されない。また、癌の
種類は特に限定されず、各種の悪性腫瘍が適用できる。

【００１７】癌患者由来の被検試料中におけるＨＳＰ４
７のレベルの測定は、例えば、該試料に、ＨＳＰ４７と
免疫学的に反応性のある免疫反応物質を加え、ＨＳＰ４
７−免疫反応物質結合体を生成させることによって、該
試料中におけるＨＳＰ４７を検出し、その量を測定する
ことができる。試料として組織切片あるいは細胞を用
い、蛍光抗体法あるいは酵素抗体法により、組織あるい
は細胞中のＨＳＰ４７を測定することも可能である。

【００１８】ＨＳＰ４７と免疫学的に反応性のある免疫
物質としては、例えば、抗ＨＳＰ４７抗血清、抗ＨＳＰ
４７ポリクローナル抗体、抗ＨＳＰ４７モノクローナル
抗体等が挙げられる。これらは単独でも、また組み合わ
せて同時に用いることもできる。また、これら免疫反応
物質以外にも、例えば放射能あるいは非放射能標識した
オリゴヌクレオチドプローブ等を用いてＨＳＰ４７ｍＲ
ＮＡを測定することにより、該試料におけるＨＳＰ４７
のレベルを検出することも可能である。

【００１９】癌患者由来の被検試料中に免疫反応物質を
加え、生じたＨＳＰ４７−免疫反応物質結合体から該試
料中におけるＨＳＰ４７を検出し、その量を測定する方
法を、免疫反応物質が抗体の場合を一例として、以下に
説明する。

【００２０】抗体は、抗原として知られる他の分子との
結合およびそれを認識する能力を有する蛋白質である。
モノクローナル抗体は、他の抗体と本質的には異ならな
いが、それらはその性質が非常に均一であり、ただ１種
の抗原または抗原決定基を認識する。抗体は、例えば次
のようにして調製される。

【００２１】まず、ＨＳＰ４７を用いて動物を免疫し、
抗体産生細胞を採取する。免疫する動物として、例えば
ラット、マウス、ハムスターなどの実験動物が有利に使
用できるが、特にラットが好ましい。免疫方法は、例え
ばラットの場合、皮下、腹腔内、静脈内、筋肉内、皮内
等いずれのルートからでも可能であるが、皮下、腹腔
内、静脈内に注入するのが好ましい。抗体産生細胞は、
免疫した動物の脾細胞が有利に使用される。株化された
ヒト脾細胞株でもよい。

【００２２】次に、得られた免疫動物の脾細胞と骨髄腫
細胞を融合し、ハイブリドーマを得る。本発明において
は、細胞融合の方法、条件等は常法によることができ、
例えばケーラー（Ｋoehler）とミルスタイン（Milstei
n）らによる公知方法（"Nature",256,495,1975 ）によ
って行うことができる。ハイブリドーマを常法によりス
クリーニングし、さらにクローニングすることによって
モノクローナル抗体を産生させることができる。

【００２３】このようにして得られた抗体を、癌患者由
来の被検試料中に加え、ＨＳＰ４７−抗体結合体を生成
させる。そして、免疫化学的測定法により、抗体に結合
したＨＳＰを認識し、その量を測定することによって、
該試料中のＨＳＰレベルを知ることができる。

【００２４】免疫化学的測定法としては、原則的には、
すべての慣用のイムノアッセイ、例えばＥＩＡ法、ＥＬ
ＩＳＡ法、ＲＩＡ法等を用いることができる。これらの
免疫化学的測定法は、一般に次の方法に大別することが
できる。 （１）競合法：未知量の抗原を含む被検液と標識剤で標
識した抗原の一定量とを対応する抗体の一定量に対して
競合反応させ、抗体と結合した標識剤若しくは抗体と結
合しなかった標識剤の活性を測定する。 （２）サンドイッチ法：未知量の抗原を含む被検液に担
体上に保持された過剰量の抗体を加えて反応させ（第１
反応）、次に標識剤で標識した過剰量の抗体の一定量を
加えて反応させる（第２反応）。担体上に保持された標
識剤若しくは担体上に保持されなかった標識剤の活性を
測定する。第１反応、第２反応は同時に行ってもよいし
時間をずらして行ってもよい。標識剤が放射性同位元素
である場合、ウェルカウンター若しくは液体シンチレー
ションカウンターで測定する。標識剤が酵素である場
合、基質を加えて放置し、比色法若しくは蛍光法で酵素
活性を測定する。標識剤が蛍光物質、発光物質であって
も、それぞれ公知の方法に従って測定する。

【００２５】上記の方法以外に、最近では、電気泳動し
た蛋白質をニトロセルロース等のフィルターに移し、抗
体を用いて目的の蛋白質を検出する、ウェスタン・ブロ
ット法が行われるようになってきたが、本発明における
ＨＳＰ４７の検出にもちろん利用することができる。

【００２６】これらの測定法において用いる抗体は、公
知の抗体標識法によって標識することができ、例えば放
射性同位元素、酵素、蛍光物質、発光性物質等の適当な
マーカーで標識しておくことができる。放射性同位元素
としては、例えば¹²⁵ Ｉ、¹³¹ Ｉ、³ Ｈ、¹⁴Ｃ、³⁵Ｓな
どが用いられる。酵素としては、安定で比活性の大きな
ものが好ましく、例えばグリコシダーゼ（例、β−ガラ
クトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、β−グルクロニダ
ーゼ、β−フルクトシダーゼ、α−ガラクトシダーゼ、
α−グルコシダーゼ、α−マンノシダーゼ）、アミラー
ゼ（例、α−アミラーゼ、β−アミラーゼ、イソアミラ
ーゼ、グルコアミラーゼ、タカアミラーゼ）、セルラー
ゼ、リゾチーム等のカルボヒドラーゼ；ウレアーゼ、ア
スパラギナーゼ等のアミダーゼ；コリンエステラーゼ
（例、アセチルコリンエステラーゼ）、ホスファターゼ
（例、アルカリホスファターゼ）、スルファターゼ、リ
パーゼ等のエステラーゼ；デオキシリボヌクレアーゼ、
リボヌクレアーゼ等のヌクレアーゼ；カタラーゼ、ペル
オキシダーゼ、チトクロームオキシダーゼ等の鉄・ポル
フィリン酵素；チロシナーゼ、アスコルビン酸オキシダ
ーゼ等の銅酵素；アルコール脱水素酵素、リンゴ酸脱水
素酵素、乳酸脱水素酵素、イソクエン酸脱水素酵素等の
脱水素酵素などが用いられる。蛍光物質としてはフルオ
レスカミン、フルオレッセンスイソチオシアネートなど
が、発光性物質としてはルミノール、ルミノール誘導
体、ルシフェリン、ルシゲニンなどがそれぞれ挙げられ
る。

【００２７】抗体と標識剤とを結合させる方法として、
常法であるクロラミンＴ法（"Nature",194:495,1962
）、過ヨウ素酸法（"Journal of Histochemitry and C
ytochemistry",22:1084,1974 ）、マレイミド法（"Jour
nal of Biochemistry",79:233,1976 ）などが用いられ
る。

【００２８】上記測定方法のうち、例えばＥＩＡ法は次
のようにして行う。まず、担体に保持された抗体に被検
試料を加えて結合反応を起こさせ、これに標識剤（例え
ばペルオキシダ−ゼ）を結合させた抗体を加えて反応さ
せる。得られた反応生成物にペルオキシダーゼの基質を
加え、生じた物質の吸光度若しくは蛍光強度を測定する
ことにより前記の反応生成物の酵素活性を測定する。上
記の一連の操作を既知量の該抗体反応物質の標準溶液に
対して予め行っておき、反応物質と吸光度若しくは蛍光
強度との関係を標準曲線として作成しておく。そして、
未知量の分析対象物（被検試料）について得られた吸光
度若しくは蛍光強度を標準曲線にあてはめ、被検試料中
の抗体と反応する物質の量を測定する。

【００２９】また、ＲＩＡ法は例えば次のようにして行
う。まず、担体に保持された抗体に被検試料を加えて結
合反応を起こさせ、これに標識剤（例えば¹²⁵ Ｉ）で標
識された抗体を加えて反応させる。得られた反応生成物
のγ−放射活性を測定する。上記の一連の操作を既知量
の該抗体反応物質の標準溶液に対して予め行っておき、
反応物質とγ−放射活性との関係を標準曲線として作成
しておく。そして、未知量の分析対象物（被検試料）に
ついて得られたγ−放射活性を標準曲線にあてはめ、被
検試料中の抗体と反応する物質の量を測定する。

【００３０】抗体を利用する方法以外にも、例えばＨＳ
Ｐ４７ｍＲＮＡに相補性の配列を有する標識したアンチ
センスオリゴヌクレオチドを利用し得ることはもちろん
である。すなわち、本発明によれば、被検試料に、ＨＳ
Ｐ４７ｍＲＮＡに相補的な配列をもつオリゴヌクレオチ
ドを加え、生じたＨＳＰ４７ｍＲＮＡと前記オリゴヌク
レオチドとの結合体の量を測定することにより癌の悪性
度を検出することを特徴とする、癌悪性度の体外検出法
が提供される。アンチセンス分子は、選択された遺伝子
から転写されたＲＮＡの一部と相補的な若しくは実質的
に相補的な配列を有し、標的遺伝子から転写されたＲＮ
Ａとの間で二重鎖を形成する。その標的ＲＮＡと安定な
複合体を形成するために十分な相補性を有するいずれの
オリゴヌクレオチドも適当であると考えられる。アンチ
センスオリゴヌクレオチドは、実質的に標的ＲＮＡ内の
どの領域の範囲で相補的であってもよい。アンチセンス
分子は、ＨＳＰ４７遺伝子に特異的なｍＲＮＡ発現の増
減を検出するＤＮＡプローブとして用いることができ
る。すなわち、標的であるＨＳＰ４７のｍＲＮＡに特異
的に付着し、分子ハイブリッドを形成することにより、
細胞内のＨＳＰ４７の発現の程度を検出することができ
る。

【００３１】使用されるオリゴヌクレオチドは、修飾さ
れていないオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチ
ド類似体を示すことができる。適当な類似体として、例
えばエチル−若しくはメチルホスホネート類似体、ホス
ホロチオエート修飾されたオリゴデオキシヌクレオチド
（"Nucleic Acids Res.",14:9081,1986; "J. Am. Chem.
Soc.",106:6077,1984）等が挙げられる。さらに、近年
のオリゴヌクレオチド類似体の製造における進歩は、例
えば２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド（"Nucleic Aci
ds Res.",15:6131,1987 ）および複合ＲＮＡ−ＤＮＡ類
似体であるキメラオリゴヌクレオチド（"FEBS Lett.",2
15:327,1987 ）のようなその他の物質をここに記載され
た目的のために使用することができることを意味する。

【００３２】選択されたオリゴヌクレオチドは、電荷を
もつもの、もたないものを含め、いかなる種類のもので
もよい。種々の長さのオリゴヌクレオチドを使用するこ
とができるが、約８〜４０の塩基を有するものが好適で
ある。インビトロまたはインビボでこのような実験を行
うために、オリゴヌクレオチドは放射性同位元素、蛍光
物質等の公知の標識剤で常法によって標識される。放射
性同位元素としては、例えば¹²⁵ Ｉ、¹³¹ Ｉ、³ Ｈ、¹⁴
Ｃ、³⁵Ｓ等がある。なかでも、放射性同位元素としてラ
ンダムプライマー法（"Anal. Biochem.",132:6,1983 ）
を用いて³²Ｐで標識するのが好適である。また、より容
易で危険性の少ない取扱が可能なものとして誘導体形成
した蛍光色素が挙げられる。蛍光色素としては、オリゴ
ヌクレオチドと結合するすべての色素を用いることがで
きるが、フルオレセイン、ローダミン、テキサスレッ
ド、４−フルオロ−７−ニトロベンゾフラザン（ＮＢ
Ｄ）、クマリン、フルオレサミン、スクシニルフルオレ
セインおよびダンシル等が好適に用いられる。

【００３３】また、ｃＤＮＡを用いたノーザンブロット
解析は以下のごとく行うことができる。すなわち、対象
とする細胞、組織より調製したＲＮＡをアガロースゲル
電気泳動し、ニトロセルロースまたはナイロンメンブラ
ンにトランスファーした後、標識ＨＳＰ４７ｃＤＮＡプ
ローブと反応させることによりＨＳＰ４７ｍＲＮＡを測
定する。使用するＨＳＰ４７ｃＤＮＡプローブはＨＳＰ
４７ｍＲＮＡに相補的なＤＮＡであり、１７塩基以上の
長さをもつものが望ましい。

【００３４】本発明では、以上のようにして癌患者由来
の被検試料中におけるＨＳＰ４７又はＨＳＰ４７ｍＲＮ
Ａを検出ならびにその存在量を測定し、この測定量を、
健常人由来の被検試料中における平均的なＨＳＰ４７存
在量又はＨＳＰ４７ｍＲＮＡ存在量である標準量と比較
することによって、癌の悪性度の検出を行う。すなわ
ち、健常人の該試料中に通常存在するＨＳＰ４７量又は
ＨＳＰ４７ｍＲＮＡ量として設定された標準量に比し
て、癌患者からの試料中にＨＳＰ４７の存在量（レベ
ル）又はＨＳＰ４７ｍＲＮＡ存在量が低いほど、癌の悪
性度が高いと検出される。標準量に比して癌患者からの
試料中のＨＳＰ４７存在量又はＨＳＰ４７ｍＲＮＡ存在
量があまり減少していなければ、癌の悪性度はそれほど
高くないと検出できる。すなわち、本発明においてＨＳ
Ｐ４７又はＨＳＰ４７ｍＲＮＡの存在量の測定は、被検
者における疾病段階を検出し、危険を特定するのに使用
され得る。ＨＳＰ４７又はＨＳＰ４７ｍＲＮＡの存在量
の減少は、癌の悪性度の増加を示し、不十分な予後を予
測させる。

【００３５】本発明を用いることにより、患者の癌の悪
性度を早期に検出することができ、また、癌の悪性度の
程度を知ることによりその後の治療処置の選択や予後の
推定に有用な情報を提供することができる。治療処置と
しては、放射線治療、薬物投与、免疫抑制または免疫促
進、摂生等が例示されるが、これに限定されるものでは
ない。さらに、本発明は、治療処置を受けた被検者に対
する治療処置の効果の検査にも用いられ得る。

【００３６】このように、本発明による癌悪性度の検出
方法は、臨床的意義が極めて高く、有用である。

【００３７】

【実施例】以下、本発明を実施例によって具体的に説明
するが、これらは本発明の範囲を限定するものではな
い。実施例１ 抗ＨＳＰ４７モノクローナル抗体の作製 ＨＳＰ４７を１６０μｇ含むＰＢＳ（−）（コスモバイ
オ、Cat.#320-01 ）０．２ｍｌを、等量のフロイト完全
アジュバント（ヤトロン、Cat.#RM606-1）と混和し、得
られた混合液０．２ｍｌを、ルーラット（５週令、雌
性）（日本クレア）の皮下に投与し、免疫した。同様の
方法で第２次、第３次免疫を繰り返した後９０日後に、
免疫ラットから脾臓を摘出した。脾臓に付着した脂肪組
織を除去し、ハンクス平衡塩溶液（GIBCO,Cat.#310-417
0PJ ）中でピンセットでしごいて細胞をほぐし出した
後、ステンレスメッシュで濾過した。このようにして集
めた細胞に、トリス緩衝塩化アンモニウム溶液１０ｍｌ
を加えて赤血球を破壊、除去した。トリス緩衝塩化アン
モニウム溶液は、トリスヒドロキシメチルアミノメタン
２０．５９４ｇを精製水約８００ｍｌに溶解し、１Ｎ−
塩酸でｐＨ７．６５に調製した後、精製水で全量を１ｌ
としたものをＡ液とし、このＡ液１容を０．８３％塩化
アンモニウム溶液９容に加え、ミリポアフィルターにて
除菌し、調製した。

【００３８】この免疫ラットの脾臓細胞１．３８×１０
⁸ 個をＲＰＭＩ１６４０培地（GIBCO,Cat.#320-1875PJ
）１ｍｌで分散し、同様にＲＰＭＩ１６４０培地１．
４ｍｌに分散したラット骨髄腫細胞Ｙ３−Ａｇ１．２．
３．（大日本製薬、Cat.#09-1631）２．７×１０⁷ 個と
を混合し（細胞数比５：１の割合で）、５０％ポリエチ
レングリコール１５００液（ベーリンガー・マンハイム
山之内 Cat.#783641）１ｍｌを加えて、ＲＰＭＩ１６４
０培地を１４ｍｌ加え、３７℃で５分間放置し、細胞融
合を行った。

【００３９】融合後、細胞を洗浄し、ＨＡＴ培地〔ＭＥ
Ｍダルベッコ液（大日本製薬、Cat.#12-333-54）２００
ｍｌ、硫酸カナマイシン（明治製菓）１ｇをハンクス
（大日本製薬、Cat.#12-132-54）４０ｍｌに溶かしたも
のを０．８ｍｌ、グルタミン（日水製薬、Cat.#05908）
０．３ｇをハンクス１０ｍｌに溶かしたものを２ｍｌ、
１００ｍＭピルビン酸（大日本製薬、Cat.#16-820-49）
２ｍｌ、１０ｍＭ β−メルカプトエタノール（生化学
工業、Cat.#137-06862）ハンクス溶液１ｍｌ、ＨＡＴ５
０倍液（大日本製薬、Cat.#16-808-49）４ｍｌ、牛胎児
血清（Sera-Lab.,Cat.#S-0001a）３０ｍｌを混ぜ合わ
せ、ここへＢＭ−Ｃｏｎｄｉｍｅｄ（ベーリンガー・マ
ンハイム山之内、Cat.#1088 947 ）を２０ｍｌ加えたも
の〕９８ｍｌを加えて細胞をよく懸濁させ、細胞培養用
２４穴プレート（Falcon,Cat.#3047）４枚に１ｍｌ／ウ
ェルずつ分注し、３７℃、ＣＯ₂ インキュベータ中で培
養を開始した。１週間後に各ウェルにＨＴ培地〔上記Ｈ
ＡＴ培地と同様の組成で、ＨＡＴ５０倍液の代わりにＨ
Ｔ５０倍液（大日本製薬、Cat.#16-809-49）を１／５０
容量加えたもの〕を２５０μｌずつ添加し、１週間培養
した。ハイブリドーマの増殖を顕微鏡で観察すると共
に、各ウェルの培養上清中の抗体価をＥＬＩＳＡ法で測
定した。抗体価の高かった１２ウェルの細胞のうち、ウ
ェスタンブロット法によりＢＡＬＢ／３Ｔ３細胞・ｌｙ
ｓａｔｅ中のマウスＨＳＰ４７との反応性の高かった３
ウェルの細胞について、限界希釈法によるクローニング
を行った。すなわち、該細胞分散液をクローニング培地
〔上記ＨＡＴ培地の組成でＨＡＴ５０倍液を除く〕で希
釈し、細胞０．５個／ウェルとなるように、９６穴プレ
ート（Falcon,Cat.#3072）３枚にまきこみ、クローニン
グ培地にて培養した。全２８８ウェルの内、細胞の増殖
がみられた９５ウェルの培養上清に関し、マウスＨＳＰ
４７との反応性が確認されたクローン中で反応性の高か
ったクローンに関し、再度、限界希釈法によりクローニ
ングを行い、抗体分泌能が高く、増殖性に優れ、しかも
安定なクローンを選び、抗体産生ハイブリドーマを樹立
し、１２Ｈ６Ｇと命名した。このハイブリドーマは、Ｈ
ＳＰ４７と特異的に反応する抗体を産生することが、下
記に示すＥＬＩＳＡ法、ウェスタンブロット法により確
認された。

【００４０】このハイブリドーマ（細胞数３．６５×１
０⁶ 個）を、１７５Ｔ細胞培養フラスコ（培養表面積１
７５ｃｍ² ）でハイブリドーマ培養用に調製した培地
〔ＭＥＭダルベッコ液（大日本製薬、Cat.#12-333-54）
２００ｍｌ、硫酸カナマイシン（明治製菓）１ｇをハン
クス（大日本製薬、Cat.#12-132-54）４０ｍｌに溶かし
たものを０．８ｍｌ、グルタミン（日水製薬、Cat.#059
08）０．３ｇをハンクス１０ｍｌに溶かしたものを２ｍ
ｌ、１００ｍＭピルビン酸（大日本製薬、Cat.#16-820-
49）２ｍｌ、１０ｍＭ β−メルカプトエタノール（シ
グマ、Cat.#M-6250 ）ハンクス溶液１ｍｌ、牛胎児血清
（Sera-Lab.,Cat.#S-0001a）３０ｍｌを混ぜ合わせたも
の〕６４ｍｌに懸濁させ、得られた懸濁液を組織培養用
フラスコに２５ｍｌずつ分注して、３７℃で培養した。
培養４日目に培養上清を採取して、硫安塩析により抗体
画分と分離した後、常法により抗体アフィニティーカラ
ムで精製して抗ＨＳＰ４７モノクローナル抗体を得た。
なお、この抗ＨＳＰ４７モノクローナル抗体は、Ｒａｔ
ＭｏｎｏＡＢ ＩＤ／ＳＰ Ｋｉｔ（Zymed,Cat.#93-
9550）を用いたイムノグロブリンクラス測定により、Ｉ
ｇＧクラスの免疫グロブリンであることが確認された。抗ＨＳＰ４７モノクローナル抗体特性の評価 （１）酵素抗体法（ＥＬＩＳＡ法） ＨＳＰ４７をｐＨ９．６の０．０５Ｍ炭酸ナトリウム−
炭酸水素ナトリウムバッファー（Ｃ−Ｂバッファー）に
０．６２５μｇ／ｍｌとなるように溶解し、イムノプレ
ート（Nunc,Cat.#439454）の各ウェルに１００μｌずつ
滴下した。最も外側のウェルにはＣ−Ｂバッファーを入
れ、湿潤下４℃で一晩放置した後、抗原溶液を捨て、Ｐ
ＢＳ−Ｔｗｅｅｎ（Ｔｗｅｅｎ−２０を０．０５％（ｖ
／ｖ）となるようにＰＢＳ（−）に溶かした溶液）で各
ウェルを洗浄した。各ウェルに３００μｌのＰＢＳ−Ｔ
ｗｅｅｎを入れ、室温で３分間放置した後、ＰＢＳ−Ｔ
ｗｅｅｎで３回洗浄し、サンプル（１次抗体）１５０μ
ｌを各ウェルに入れ、室温で２時間放置後、ＰＢＳ−Ｔ
ｗｅｅｎでプレートを６回洗浄した。その後、２次抗体
（ペルオキシダーゼ標識抗ラットＩｇＧ）を各ウェルに
２００μｌ入れ室温で２時間放置し、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅ
ｎで９回洗浄した。ＯＰＤ（o-phenylenediamine）（Si
gma,Cat.#P8287）１０ｍｇ１個を５μｌ過酸化水素水を
加えた０．１ＭのｐＨ５．０クエン酸リン酸バッファー
１２．５ｍｌに溶解した基質液を各ウェルに２００μｌ
ずつ滴下し、室温遮光下３０分間放置した後、各ウェル
に１２．５％（ｗ／ｗ）硫酸５０μｌを加えて発色さ
せ、各ウェルの４９２ｎｍのＯ．Ｄ．をマイクロプレー
トリーダー（東ソーＭＰＲ−Ａ４ｉ型）にて測定した。 （２）ウェスタンブロット法 １０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法によりＬａｅｍｍｌｉのバッ
ファー系（Laemmli,N.K., "Nature",283: pp.249-256,1
970 ）にてＢＡＬＢ／３Ｔ３細胞のｌｙｓａｔｅの電気
泳動を行った。濃縮ゲルとして以下の組成のものを用い
た。蒸留水６．１ｍｌ、０．５Ｍトリス（Bio-Rad,Cat.
#161-0716)−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）２．５ｍｌ、１０％
ＳＤＳ（Bio-Rad,Cat.#161-0301)１００μｌ、３０％ア
クリルアミド（Bio-Rad,Cat.#161-0101)／ビス（Bio-Ra
d,Cat.#161-0201)１．３ｍｌを混合して最低１５分間脱
気し、１０％過硫酸アンモニウム（Bio-Rad,Cat.#161-0
700)５０μｌ、ＴＥＭＥＤ（Bio-Rad,Cat.#161-0800)１
０μｌを加えた。また、分離ゲルの調製は次のように行
った。蒸留水４．０４５ｍｌ、１．５Ｍトリス−ＨＣｌ
２．５ｍｌ、１０％ＳＤＳ１００μｌ，３０％アクリル
アミド／ビス３．３ｍｌをゆっくり混合して最低１５分
間アスピレータで脱気し、１０％過硫酸アンモニウム５
０μｌ、ＴＥＭＥＤ５μｌを加えた。泳動バッファーと
しては、トリス９．０ｇ、グリシン（Bio-Rad,Cat.#161
-0717)４３．２ｇ、ＳＤＳ３．０ｇに蒸留水を加え６０
０ｍｌにし、これを蒸留水で５倍希釈したものを用い
た。サンプルバッファーは、蒸留水２ｍｌ、２Ｍトリス
−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）５００μｌ、ＳＤＳ０．３２
ｇ、β−メルカプトエタノール８００μｌ、０．０５％
（ｗ／ｖ）ブロモフェノールブルー（Bio-Rad,Cat.#161
-0404)４００μｌを混合したものを用いた。その後、Tr
ans-Blot Electorphoretic Transfer Cell(Bio-Rad) を
用いて、室温にて１００Ｖにて、０．４５μｍニトロセ
ルロースメンブラン（Schleicher & Schuell,Cat.#4011
96) にゲルを密着させ、３時間ブロッティングを行っ
た。ブロッティングバッファーとしては、Tris Gly Run
ning and BlottingBuffer( Enprotech,MA.,U.S.A.,Cat.
No.SA100034) ２０％ＭｅＯＨを用いた。

【００４１】然る後、５％スキムミルク（雪印）−ＰＢ
Ｓ（−）溶液に室温にて３０分間浸し、ブロッキングを
行った。ブロッキング後、スクリーナーブロッター
（（株）サンプラテック）を用いて、ハイブリドーマの
培養上清を１次抗体として、１次抗体反応を行った。し
かる後、ＰＢＳ（−）で５分間、溶液を取り替え２回、
スロー・ロッキング・シェイカーによる洗浄とＰＢＳ−
０．１％Ｔｗｅｅｎ２０（Bio-Rad,Cat.#170-6531)溶液
で１５分間、溶液を取り替え４回の洗浄を行った。最終
的に、ＰＢＳ（−）で５分間、２回の洗浄を行った。

【００４２】洗浄終了後、ペルオキシダーゼ標識ヤギ抗
ラットＩｇＧ抗体（Southern Biotechnology,Cat.#3030
-05)を５％ＢＳＡ（生化学工業、Cat.# 250020) −ＰＢ
Ｓ（−）溶液で５００倍に希釈して２時間、２次抗体反
応を行った。反応終了後、メンブランに関して、ＰＢＳ
（−）溶液およびＰＢＳ−０．１％Ｔｗｅｅｎ２０溶液
で洗浄を行った。余分なＰＢＳ（−）溶液を除去後、EC
L Western blotting detection reagent(Amersham,Cat.
#RPN2106) をメンブラン上に振りかけ、１分間インキュ
ベートした後、余分な検出試薬を除去後、メンブランを
ラップに包み、反応面をＸ線フィルム（コダック X-OMA
T,AR Cat.#165 1454) に密着させて露光し、現像して、
ＨＳＰ４７に相当する分子量４７キロダロトン付近のバ
ンドを測定することによって抗ＨＳＰ４７モノクローナ
ル抗体の反応性の検討を行った。 実施例２ メラノーマ癌細胞Ｂ１６系統でのＨＳＰ４
７の測定 メラノーマＢ１６細胞に、lysis buffer〔ＮＰ−４０
１．０％、ＮａＣｌ０．１５Ｍ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐ
Ｈ８．０）５０ｍＭ、ＥＤＴＡ ５ｍＭ、Ｎ−エチルマ
レイミド ２ｍＭ、ＰＭＳＦ ２ｍＭ、ロイペプチン
２μｇ／ｍｌ、ペプスタチン ２μｇ／ｍｌ〕を１ｍｌ
加え、氷上で２０分間インキュベートした。しかる後、
４℃／１２０００ｒｐｍにて、２０分間、遠心を行っ
た。ＰＢＳ（−）７９０μｌに遠心後の上清１０μｌを
加え、さらに蛋白質測定用 Dye Reagent Concentrate(B
io-Rad,Cat.#500-0006) を２００μｌ加え、５分間、室
温にてインキュベ−ト後、５９５ｎｍで吸光度を測定し
て蛋白質定量を行った後に、電気泳動の試料として供し
た。

【００４３】上記の試料を用い、１０％ＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅ法により Laemmli のバッファー系にて電気泳動を行
った。その後、かかる試料を用いて、実施例１で述べた
のと同じ方法により、ブロッティングおよびそれに続く
ブロッキングを行った。すなわち、Trans-Blot Elector
phoretic Transfer Cell(Bio-Rad) を用いて、室温にて
１００Ｖにて、０．４５μｍニトロセルロースメンブラ
ン（Schleicher & Schuell,Cat.#401196) にゲルを密着
させ、３時間ブロッティングを行った。ブロッティング
バッファーとしては、Tris Gly Running and Blotting
Buffer( Enprotech,MA.,U.S.A.,Cat.No.SA100034) ２０
％ＭｅＯＨを用いた。然る後、５％スキムミルク（雪
印）−ＰＢＳ（−）溶液に室温にて３０分間浸し、ブロ
ッキングを行った。

【００４４】ブロッキング後、スクリーナーブロッター
（（株）サンプラテック）を用いて、実施例１にて製造
した抗ＨＳＰ４７抗体により、１次抗体反応を行った。
然る後、ＰＢＳ（−）で５分間、溶液を取り替え２回、
スロー・ロッキング・シェイカーによる洗浄とＰＢＳ−
０．１％Ｔｗｅｅｎ２０（Bio-Rad,Cat.#170-6531)溶液
で１５分間、溶液を取り替え４回の洗浄を行った。最終
的に、ＰＢＳ（−）で５分間、２回の洗浄を行った。

【００４５】洗浄終了後、ペルオキシダーゼ標識ヤギ抗
ラットＩｇＧ抗体（Southern Biotechnology,Cat.#3030
-05)を５％ＢＳＡ（生化学工業、Cat.# 250020) −ＰＢ
Ｓ（−）溶液で５００倍に希釈して２時間、２次抗体反
応を行った。反応終了後、メンブランに関して、ＰＢＳ
（−）溶液で５分間、溶液を変えて２回、ＰＢＳ−０．
１％Ｔｗｅｅｎ２０溶液で１５分間、溶液を変えて５回
の洗浄をスロー・ロッキング・シェイカーにより行っ
た。最後にＰＢＳ（−）溶液で５分間２回の洗浄を行っ
た。余分なＰＢＳ（−）溶液を除去後、ECL Western bl
otting detectionreagent(Amersham,Cat.#RPN2106) を
メンブラン上に振りかけ、１分間インキュベートした
後、余分な検出試薬を除去後、メンブランをラップに包
み、反応面をＸ線フィルム（コダック X-OMAT,AR Cat.#
165 1454) に密着させて露光し、現像してＨＳＰ４７の
有無の検討を行った。

【００４６】同様の操作を、Ｂ１６よりも悪性度が大で
転移性の大きいメラノーマＢ１６−ＢＬ６細胞について
も行い、ＨＳＰ４７に相当する分子量４７キロダルトン
付近のバンドを測定し、ＨＳＰ４７の有無の検討を行っ
た。結果は下記の表１に示す通りであった。

【００４７】

【表１】 表１から明らかなように、メラノーマ癌細胞であるＢ１
６系統では、悪性度の低い細胞ではＨＳＰ４７が発現し
ているが、転移性が高く悪性度の高いサブ系統であるＢ
１６−ＢＬ６では、ＨＳＰ４７は検出されなかった。悪
性度が高い細胞ではＨＳＰ４７が消失するということが
明らかである。実施例３ Ｓａｒｃｏｍａ １８０でのＨＳＰ４７の
測定 実施例１の方法にて製造した抗ＨＳＰ４７抗体を用い
て、Ｓａｒｃｏｍａ １８０の固型、および腹水の細胞
について、実施例２と同様の方法にて実験を行い、ＨＳ
Ｐ４７に相当する分子量４７キロダルトン付近のバンド
を測定することにより、ＨＳＰ４７の有無を検討したと
ころ、下記の表２で示す結果を得た。

【００４８】

【表２】 Ｓａｒｃｏｍａ １８０は、一般に固型よりも腹水型の
方が短命であり、悪性度が大であるといわれている。表
２から明らかなように、固型癌に比べて悪性度が高い腹
水型の癌では、ＨＳＰ４７が消失してしまって検出され
なかった。実施例４ Ｌ−１２１０、エールリッヒ（腹水型）、
Ｐ３８８細胞でのＨＳＰ４７の測定 実施例１の方法にて製造した抗ＨＳＰ４７抗体を用い
て、Ｌ−１２１０、エールリッヒ（腹水型）およびＰ３
８８細胞について、実施例２と同様の方法にて実験を行
い、ＨＳＰ４７に相当する分子量４７キロダルトン付近
のバンドを測定することによりＨＳＰ４７の有無を検討
したところ、下記の表３で示す結果を得た。

【００４９】

【表３】 Ｌ−１２１０、エールリッヒ（腹水型）、Ｐ３８８はい
ずれも悪性度が大である。表３から明らかなように、こ
れら悪性度の高いいずれの細胞からも、ＨＳＰ４７が消
失して検出されなかった。

【００５０】

【発明の効果】以上詳述したように本発明によれば、癌
患者由来の被検試料中のＨＳＰ４７のレベルを測定する
ことによって、患者の癌の悪性度を早期に検出すること
ができ、また、癌の悪性度の程度を知ることによりその
後の治療処置の選択や予後の推定に有用な情報を提供す
ることができる。また、治療処置を受けた被検者に対す
る治療処置の効果の検査にも用いられ得る。このように
本発明の臨床的意義は極めて高い。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 // Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ 15/02 9282−4Ｂ 15/00 Ｃ

Claims (7)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 癌患者由来の被検試料中におけるＨＳＰ
   ４７のレベルを測定することにより癌の悪性度を検出す
   ることを特徴とする、癌悪性度の体外検出法。
2. 【請求項２】 癌患者由来の被検試料に、ＨＳＰ４７と
   免疫学的に反応性のある免疫反応物質を加え、生じたＨ
   ＳＰ４７と前記免疫反応物質との結合体から該試料中に
   おけるＨＳＰ４７を検出し、その存在量を測定すること
   により癌の悪性度を検出する、請求項１記載の癌悪性度
   の体外検出法。
3. 【請求項３】 免疫反応物質がＩｇＧである、請求項１
   または２に記載の癌悪性度の体外検出法。
4. 【請求項４】 ＩｇＧが抗ＨＳＰ４７モノクローナル抗
   体である、請求項３記載の癌悪性度の体外検出法。
5. 【請求項５】 被検試料に、ＨＳＰ４７ｍＲＮＡに相補
   的な配列をもつオリゴヌクレオチドを加え、生じたＨＳ
   Ｐ４７ｍＲＮＡと前記オリゴヌクレオチドとの結合体の
   量を測定することにより、ＨＳＰ４７のレベルを測定す
   る、請求項１記載の癌悪性度の体外検出法。
6. 【請求項６】 ＨＳＰ４７と免疫学的に反応性のある免
   疫反応物質を含むことを特徴とする、癌悪性度の体外検
   出用試薬。
7. 【請求項７】 ＨＳＰ４７ｍＲＮＡに相補的な配列をも
   つオリゴヌクレオチドを含むことを特徴とする、癌悪性
   度の体外検出用試薬。