ES2714716T3 - Anticuerpos anti-IL1RAP y su uso para el tratamiento de tumores sólidos - Google Patents

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Abstract

Un agente que comprende o consiste en un anticuerpo, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, en donde el anticuerpo es específico para la proteína accesoria del receptor de interleucina-1 (IL1RAP) para su uso en el tratamiento o la prevención de un cáncer en un paciente, en donde el cáncer es un tumor sólido que tiene células que expresan IL1RAP.

Description

DESCRIPCION
Anticuerpos anti-IL1 RAP y su uso para el tratamiento de tumores solidos
Campo de la invencion
La presente invencion se refiere a agentes para su uso en el tratamiento y el diagnostico de tumores solidos, tales como cancer de prostata, cancer de mama, cancer de pulmon, cancer colorrectal, melanomas, cancer de vejiga, cancer de cerebro/SNC, cancer de cuello uterino, cancer esofagico, cancer gastrico, cancer de cabeza y cuello, cancer de rinon, cancer de higado, linfomas, cancer de ovario, cancer de pancreas y sarcomas.
Antecedentes de la invencion
La resistencia a farmacos es un factor clave que limita la eficacia de la quimioterapia en tumores solidos. Tales tumores pueden ser intrinsecamente resistentes antes de la quimioterapia o la resistencia pueden adquirirla durante el tratamiento los tumores que son inicialmente sensibles a la quimioterapia.
Ademas, en el proceso de adquirir resistencia, el tumor puede llegar a tener resistencia cruzada a una serie de quimioterapias y tener como resultado la resistencia, que finalmente lleva al fracaso del tratamiento en mas del 90 % de los pacientes con enfermedad metastasica.
Balagurunathan 2008, Mol Cancer Ther.; 7(9): describe una identificacion basada en el perfil de expresion genica de dianas en la superficie celular para desarrollar ligandos multimericos en el cancer de pancreas. Usando este enfoque, los autores informan sobre la identificacion de combinaciones de genes que se expresan a un nivel de union eficiente en tumores pero no en tejidos normales, que se pueden usar para desarrollar ligandos multimericos para la obtencion de imágenes y el tratamiento del cancer de pancreas.
De acuerdo con lo anterior, la presente invencion pretende proporcionar nuevos agentes y metodos para su uso en el tratamiento y diagnostico de tumores solidos.
Sumario de la invencion
Un primer aspecto de la invencion proporciona un agente que comprende o consiste en un anticuerpo, o fragmento de union del mismo, con especificidad para la proteina accesoria del receptor de interleucina-1 (IL1RAP). Por lo tanto, la invencion proporciona agentes para uso en el tratamiento o prevencion de un tumor solido en un paciente. Por “proteina accesoria del receptor de interleucina-1", "IL1RAP" e "IL1-RAP" se incluye especificamente la proteina ILIRAp humana, por ejemplo, como se describe en el numero de Acceso de GenBank n.° AAB84059, Secuencia de Referencia de NCBI: NP_0o2173.1 y UniProtKB/N.° de Acceso de Swiss-Prot Q9NPH3-1 (vease tambien Huang et al., 1997, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 94 (24), 12829-12832). La IL1RAP tambien se conoce en la bibliografia cientifica como IL1R3, C3orf13, FLJ37788, IL 1RacP y EG3556.
Ventajosamente, el anticuerpo, o fragmento de union a antigeno del mismo, es capaz de unirse selectivamente (es decir, preferentemente) a IL1RAP en condiciones fisiologicas. El anticuerpo, o fragmento de union a antigeno del mismo, tiene, preferentemente, especificidad por la IL1 RAP humana, que puede localizarse en la superficie de una celula (por ejemplo, la celula tumoral solida).
Por "celulas asociadas a un tumor solido" se incluyen celulas de tumores solidos per se. Ademas, tales celulas incluyen celulas madre patologicas (es decir, celulas madre cancerosas, CMC) y celulas progenitoras que son responsables, directa o indirectamente, del desarrollo de un tumor solido en un individuo. Ejemplos de CMC se divulgan en Visvader y Lindeman, 2008, Nat Rev Cancer 8:755-768.
En una realización del primer aspecto de la invencion, el tumor solido se selecciona del grupo que consiste en cancer de prostata, cancer de mama, cancer de pulmon, cancer colorrectal, melanomas, cancer de vejiga, cancer de cerebral/SNC, cancer de cuello uterino, cancer esofagico, cancer gastrico, cancer de cabeza / cuello, cancer de rinon, cancer de higado, linfomas , cancer de ovario, cancer de pancreas y sarcomas. Por ejemplo, el tumor solido puede seleccionarse del grupo que consiste en canceres de prostata, mama, piel, colon, pulmon, organos urinarios y utero. En otra realizacion, el tumor solido puede seleccionarse entre los grupos que consisten en cancer de prostata, melanomas, cancer de cuello uterino, cancer esofagico y cancer de cabeza y/o cuello.
En una realización adicional del primer aspecto de la invencion, el tumor solido es un melanoma.
En relacion con los aspectos terapeuticos y profilacticos de la invencion, los expertos en la tecnica apreciaran que la union del agente a la IL1RAP presente en la superficie de las celulas asociadas al tumor solido puede llevar a una modulacion (es decir un aumento o disminucion) de una actividad biologica de la IL1RAP. Sin embargo, tal efecto modulador no es esencial; por ejemplo, los agentes de la invencion pueden producir un efecto terapeutico y profilactico simplemente en virtud de la union a IL1RAP en la superficie de las celulas asociadas al tumor solido, que a su vez puede activar al sistema inmunologico para inducir la muerte celular (por ejemplo, mediante CCDA y / o por la presencia dentro del agente de un resto citotoxico / radioactivo).
Por "actividad biologica de la IL1RAP” se incluye cualquier interaccion o acontecimiento de senalizacion que involucra a la IL1RAP en las celulas asociadas al tumor solido. Por ejemplo, en una realizacion, el agente es capaz de bloquear la union de uno o de mas correceptores a IL1 RAP (tal como IL1R1, ST2, C-KIT y/o IL1RL2).
Tal inhibicion de la actividad biologica de IL1RAP por un agente de la invencion puede ser completa o parcial. Por ejemplo, el agente puede inhibir la actividad biologica de IL1RAP en al menos un 10 %, preferentemente por lo menos 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 % o 90 %, y mas preferentemente en un 100 % en comparacion con la actividad biologica de IL1RAP en las celulas asociadas al tumor solido que no han sido expuestas al agente. En una realización preferida, el agente es capaz de inhibir la actividad biologica de IL1RAP en un 50 % o mas en comparacion a la actividad biologica de IL1RAP en celulas asociadas al tumor solido que no han sido expuestas al agente.
Asimismo, se apreciara que la inhibicion del crecimiento y / o la proliferation de las celulas asociadas al tumor solido puede ser total o parcial. Por ejemplo, el agente puede inhibir el crecimiento y / o la proliferacion de las celulas asociadas al tumor solido en al menos 10%, preferentemente al menos 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% o 90%, y lo mas preferentemente en 100% en comparacion con el crecimiento y / o proliferacion de celulas asociadas al tumor solido que no se han expuesto al agente.
En una realización adicional preferida, el agente es capaz de destruir las celulas asociadas al tumor solido. Por ejemplo, el agente puede inducir apoptosis mediante citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (CCDA). Como se ha indicado anteriormente, los agentes de la invencion pueden comprender o consistir en cualquier entidad quimica que constituya un resto de union con especificidad por IL1RAP.
En la tecnica se conocen metodos para detectar interacciones entre una entidad quimica de ensayo e IL1RAP. Por ejemplo, pueden utilizarse la ultrafiltracion con metodos de espectroscopia de masas con pulverization ionica / HPLC u otros metodos fisicos y analiticos. Ademas, pueden utilizarse metodos de Transferencia de Resonancia de Energia de Fluorescencia (FRET), en los cuales la union de dos las entidades marcadas con fluorescencia pueden medirse midiendo la interaccion de los marcadores fluorescentes cuando estan muy proximos entre si.
Como metodos alternativos para detectar la union de IL1RAP a macromoleculas, por ejemplo, ADN, ARN, proteinas y fosfolipidos, se incluyen un ensayo de resonancia de plasmon superficial, por ejemplo, como se describe en Plant et al., 1995, Analyt Biochem 226 (2), 342-348. Dichos metodos pueden utilizar un polipeptido que esta marcado, por ejemplo, con un marcador radioactivo o fluorescente.
Un metodo adicional para identificar una entidad quimica que sea capaz de unirse a IL1RAP es uno en donde la proteina se expone al compuesto y se detecta y/o se mide cualquier union del compuesto con dicha proteina. Se puede determinar la constante de union para la union del compuesto con el polipeptido. Los expertos en la tecnica conocen bien metodos adecuados para detectar y/o medir (cuantificar) la union de un compuesto con un polipeptido y se puede realizar, por ejemplo, utilizando un metodo capaz de realizar una operation de alto rendimiento, por ejemplo, un metodo basado en microplacas. La nueva tecnologia, denominada VLSIPS™, ha permitido la production de microplacas extremadamente pequenas que contienen cientos de miles o mas de diferentes sondas moleculares. Estas microplacas biologicas tienen sondas dispuestas en matrices, y a cada sonda se le asigna una ubicacion especifica. Se han producido microplacas biologicas en las que cada ubicacion tiene una escala, por ejemplo, de diez micrometros.
Las microplacas pueden utilizarse para determinar si las moleculas diana interaccionan con alguna de las sondas de la microplaca. Despues de exponer la matriz para dirigir moleculas en condiciones de ensayo seleccionadas, los dispositivos de escaneo pueden examinar cada ubicacion en la matriz y determinar si una molecula diana ha interaccionado con la sonda en esa ubicacion.
Otro metodo para identificar compuestos con afinidad de union por IL1 RAP es el sistema de doble hibrido de levadura, donde los polipeptidos de la invencion pueden utilizarse para "capturar" proteinas que se unen a IL1RAP. El sistema de doble hibrido de levadura se describe en Fields & Song, Nature 340: 245-246 (1989).
Por “anticuerpo” se incluyen moleculas sustancialmente intactas, asi como anticuerpos quimericos, anticuerpos humanizados, anticuerpos humanos (en los que al menos un aminoacido esta mutado con relacion con los anticuerpos humanos de origen natural), anticuerpos de cadena simple, anticuerpos biespecificos, cadenas pesadas de anticuerpos, cadenas ligeras de anticuerpos, homodimeros y heterodimeros de cadenas pesadas y/o ligeras de anticuerpos, y fragmentos de union a antigeno y derivados de los mismos.
Por “fragmento de union a antigeno” se entiende un fragmento funcional de un anticuerpo que es capaz de unirse a IL1RAP.
Preferentemente, el fragmento de union a antigeno se selecciona del grupo que consiste en fragmentos Fv (por ejemplo, Fv de cadena simple y Fv unido a disulfuro), fragmentos del tipo Fab (por ejemplo, fragmentos Fab, fragmentos Fab' y fragmentos F(ab)2), dominios variables sencillos (por ejemplo, dominios Vh y Vl) y anticuerpos de dominio (dAb, incluyendo los formatos simples y dobles [es decir dAb-enlazador-dAb]).
Las ventajas de utilizar fragmentos de anticuerpos, en lugar de anticuerpos enteros, son diversas. El tamano mas pequeno de los fragmentos puede dar lugar a propiedades farmacologicas mejoradas, tal como mejor penetracion del tejido solido. Ademas, los fragmentos de union a antigeno tales como los fragmentos de anticuerpo Fab, Fv, ScFv y dAb pueden expresarse en y secretados por E. coli, lo que permite la production facil de grandes cantidades de dichos fragmentos.
Dentro del alcance de la invention, tambien se incluyen versiones modificadas de anticuerpos y de fragmentos de union a antigeno de los mismos, por ejemplo, modificados por la union covalente de polietilenglicol u otro polimero adecuado (vease mas adelante).
Los metodos para generar anticuerpos y fragmentos de anticuerpos son bien conocidos en la tecnica. Por ejemplo, los anticuerpos pueden generarse mediante uno cualquiera de diversos metodos que emplean la induction de la produccion in vivo de moleculas de anticuerpo, detection selectiva en bibliotecas de inmunoglobulina (Orlandi. et al, 1989. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86:3833-3837; Winter et al., 1991, Nature 349:293-299) o generation de moleculas de anticuerpo monoclonal por lineas celulares en cultivo. Estos incluyen, pero no se limitan a, la tecnica del hibridoma, la tecnica de hibridoma de linfocito B humano, y la tecnica de hibridoma-virus de Epstein-Barr (EBV) (Kohler et al., 1975. Nature 256:4950497; Kozbor et al., 1985. J. Immunol. Methods 81:31-42; Cote et al., 1983. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:2026-2030; Cole et al., 1984. Mol. Cell. Biol. 62:109-120).
Los anticuerpos monoclonales adecuados frente a antigenos seleccionados pueden prepararse mediante tecnicas conocidas, por ejemplo, las divulgadas en “Monoclonal Antibodies: A manual of techniques”, H Zola (CRC Press, 1988) y en “Monoclonal Hybridoma Antibodies: Techniques and Applications”, J G R Hurrell (CRC Press, 1982). Asimismo, los fragmentos de anticuerpo pueden obtenerse utilizando metodos bien conocidos en la tecnica (vease, por ejemplo, Harlow y Lane, 1988, "Antibodies: A Laboratory Manual”, Cold Spring Harbor Laboratory, New York). Por ejemplo, los fragmentos de anticuerpo según la presente invencion, pueden prepararse mediante hidrolisis proteolitica del anticuerpo o mediante expresion en celulas de E. coli o de mamifero (por ejemplo, cultivo de celulas de ovario de hamster chino u otros sistemas de expresion de proteinas) de ADN que codifica el fragmento. Como alternativa, los fragmentos de anticuerpo pueden obtenerse mediante digestion con pepsina o papaina de anticuerpos enteros por metodos convencionales.
Los expertos en la tecnica apreciaran que, para la terapia o el diagnostico en seres humanos, preferentemente se utilizan anticuerpos humanos o humanizados. Las formas humanizadas de anticuerpos no humanos (por ejemplo, murinos) son anticuerpos quimericos disenados geneticamente o fragmentos de anticuerpo que tienen preferentemente partes minimas derivadas de anticuerpos no humanos. Los anticuerpos humanizados incluyen anticuerpos en los que las regiones determinantes de la complementariedad de un anticuerpo humano (anticuerpo del receptor) se han reemplazado por residuos de una region determinante de la complementariedad de una especie no humana (anticuerpo de donante) tal como de raton, de rata, de conejo, que tiene la funcionalidad deseada. En algunos casos, los residuos del marco de Fv del anticuerpo humano son reemplazados por los correspondientes residuos no humanos. Los anticuerpos humanizados tambien pueden comprender residuos que no se encuentran ni en el anticuerpo del receptor ni en la region determinante de la complementariedad importada ni en las secuencias marco. En general, el anticuerpo humanizado comprendera sustancialmente todo de al menos uno, y normalmente dos, dominios variables, en los que todas o sustancialmente todas las regiones determinantes de la complementariedad corresponden a las de un anticuerpo no humano y todas, o sustancialmente todas, las regiones marco corresponden a las de una secuencia consenso humana relevante. 6ptimamente, los anticuerpos humanizados tambien incluyen al menos una parte de una region constante de anticuerpo, tal como una region de Fc, normalmente derivada de un anticuerpo humano (vease, por ejemplo, Jones et al,. 1986. Nature 321:522-525; Riechmann et al., 1988, Nature 332:323-329; Presta, 1992, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596).
Los metodos para humanizar anticuerpos no humanos son bien conocidos en la tecnica. Generalmente, el anticuerpo humanizado tiene uno o mas residuos de aminoacido introducidos en el desde una fuente que no es humana. Estos residuos de aminoacidos no humanos, a menudo denominados residuos importados, se obtienen normalmente de un dominio variable importado. La humanizacion puede realizarse esencialmente como se ha descrito (vease, por ejemplo, Jones et al., 1986, Nature 321:522-525; Reichmann et al., 1988. Nature 332:323-327; Verhoeyen et al., 1988, Science 239:1534-1536l; documento US 4,816,567) sustituyendo regiones determinantes de la complementariedad humanas con regiones determinantes de la complementariedad de roedor correspondientes. Por consiguiente, tales anticuerpos humanizados son anticuerpos quimericos, en los que sustancialmente menos que un dominio variable humano intacto se ha sustituido por la correspondiente secuencia de una especie no humana. En la practica, los anticuerpos humanizados pueden ser anticuerpos normalmente humanos en los que algunos residuos de la region determinante de la complementariedad y posiblemente algunos residuos de la region marco son sustituidos por residuos de sitios analogos en anticuerpos de roedor.
Los anticuerpos humanos tambien pueden identificarse utilizando varias tecnicas conocidas en la tecnica, incluyendo bibliotecas de reexpresion en fagos (vease, por ejemplo, Hoogenboom & Winter, 1991, J. Mol. Biol. 227:381; Marks et al., 1991, J. Mol. Biol. 222:581; Cole et al., 1985, In: Monoclonal antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, pp.
77; Boerner et al., 1991. J. Immunol. 147:86-95).
Una vez obtenidos los anticuerpos adecuados, pueden senalizarse para determinar la actividad, por ejemplo por ELISA.
Ademas del resto de union, los agentes de la invencion pueden comprender adicionalmente un resto para aumentar la semivida in vivo del agente, tal como, pero sin limitacion, polietilenglicol (PEG), seroalbumina humana, grupos de glicosilacion, acidos grasos y dextrano. Tales restos adicionales pueden conjugarse o, de otro modo, pueden combinarse con el resto de union utilizando metodos bien conocidos en la tecnica.
Igualmente, se apreciara que los agentes de la invencion pueden comprender ademas un resto citotoxico.
Por ejemplo, el resto citotoxico puede comprender o puede consistir en un radioisotopo, tal como, astatino-211, bismuto-212, bismuto-213, yodo-131, itrio-90, lutecio-177, samario-153 y paladio-109.
Como alternativa, el resto citotoxico puede comprender o puede consistir en una toxina (tal como saporina o calicamicina).
En una alternativa adicional, el resto citotoxico puede comprender o puede consistir en un agente quimioterapeutico (tal como un antimetabolito).
Igualmente, se apreciara que los agentes de la invencion pueden comprender ademas un resto detectable.
Por ejemplo, el resto detectable puede comprender o puede consistir en un radioisotopo, tal como tecnicio-99m, indio-111, galio-67, galio-68, arsenico-72, circonio-89, yodo-12 o talio-201.
Como alternativa, el resto detectable comprende o consiste en un isotopo paramagnetico, tal como gadolinio-157, manganeso-55, disprosio-162, cromo-52 o hierro-56.
Los restos citotoxicos y detectables pueden conjugarse, o de otro modo, combinarse, con el resto de union utilizando metodos bien conocidos en la tecnica (por ejemplo, la terapia existente del inmunoconjugado gemtuzumab ozogamicina [nombre comercial: Mylotarg®], comprende un anticuerpo monoclonal ligado a la citotoxina calicamicina).
En el presente documento tambien se describe una composicion farmaceutica que comprende una cantidad efectiva de un agente, como se define con relacion al primer aspecto de la invencion, junto con un tampon, diluyente, vehiculo, adyuvante o excipiente farmaceutico aceptable.
En las composiciones tambien pueden incluirse compuestos adicionales, incluyendo, agentes quelantes tales como EDTA, citrato, EGTA o glutation.
Las composiciones farmaceuticas pueden prepararse de una manera conocida en la tecnica de forma que sean lo suficientemente estables durante el almacenamiento y adecuadas para la administracion a seres humanos y animales. Por ejemplo, las composiciones farmaceuticas pueden liofilizarse, por ejemplo, por secado por congelacion, secado por aspersion, enfriado por aspersion, o mediante el uso de formacion de particulas de la formacion supercritica de particulas.
Por "farmaceuticamente aceptable" los inventores quieren decir un material no toxico que no disminuye la eficacia de la actividad de union a IL1RAP del agente de la invencion. Tales tampones, vehiculos o excipientes farmaceuticamente aceptables son muy conocidos en la tecnica (vease Remington's Pharmaceutical Sciences, 18a edicion, A.R Gennaro, Ed., Mack Publishing Company (1990) y handbook of Pharmaceutical Excipients, 3a edicion, A. Kibbe, Ed., Pharmaceutical Press (2000)).
Con el termino "tampon" se pretende decir una solucion acuosa que contiene una mezcla de acido-base con el proposito de estabilizar el pH. Ejemplos de tampones son Trizma, Bicina, Tricina, MOPS, MOPSO, MOBS, Tris, Hepes, HEPBS, MES, fosfato, carbonato, acetato, citrato, glicolato, lactato, borato, ACES, ADA, tartrato, AMP, ATMP, AMPSO, BES, CABS, cacodilato, CHES, DIPSO, EPPS, etanolamina, glicina, HEPPSO, imidazol, acido imidazolelactico, PIPES, SSC, SSPE, POPSO, TAPS, TABS, TAPSO y TES.
Con el termino "diluyente" se pretende decir una solucion acuosa o no acuosa con el proposito de diluir al agente en la preparacion farmaceutica. El diluyente puede ser uno o mas de solucion salina, agua, polietilenglicol, propilenglicol, etanol o aceites (tales como aceite colza, aceite de maiz, aceite de cacahuate, aceite de algodon o aceite de sesamo).
Con el termino "adyuvante" se pretende decir cualquier compuesto anadido a la formulacion para aumentar el efecto biologico del agente de la invencion. El adyuvante puede ser uno o mas de sales de cinc, cobre o plata con aniones diferentes, por ejemplo, pero sin limitaciones, fluoruro, cloruro, bromuro, yoduro, tiocianato, sulfito, hidróxido, fosfato, carbonato, lactato, glicolato, citrato, borato, tartrato, y acetatos de composicion diferente de acilo. El adyuvante tambien pueden ser polimeros cationicos tales como eteres cationicos de celulosa, esteres cationicos de celulosa, acido hialuronico desacetilado, quitosan, dendrimeros cationicos, polimeros sinteticos cationicos tales como poli (vinil imidazol), y polipeptidos cationicos tales como polihistidina, polilisina, poliarginina, y peptidos que contienen estos aminoacidos.
El excipiente puede ser uno o mas de carbohidratos, polimeros, lipidos y minerales. Ejemplos de carbohidratos incluyen lactosa, glucosa, sacarosa, manitol y ciclodextrinas, que se anaden a la composicion, por ejemplo, para facilitar la liofilizacion. Ejemplos de polimeros son almidon, eteres de celulosa, celulosa carboximetilcelulosa, hidroxipropilmetil celulosa, hidroxietil celulosa, etilhidroxietilcelulosa, alginatos, carragenina, acido hialuronico y derivados de los mismos, acido poliacrilico, polisulfonato, polietilenglicol/óxido de polietileno, copolimeros de óxido de polietileno/óxido de polipropileno, alcohol polivimlico/acetato de polivinilo de diferente grado de hidrolisis, y polivinilpirrolidona, todos de diferente peso molecular, que son agregados a la composicion, por ejemplo, para control de la viscosidad, para lograr la bioadhesion, o para proteger el lipido de la degradation quimica o proteolitica. Ejemplos de lipidos son acidos grasos, fosfolipidos, mono-, di-, y trigliceridos, ceramidas, esfingolipidos y glucolipidos, todos de longitud diferente de cadena de acilo y saturation, lecitina de huevo, lecitina de soya, lecitina de huevo y soya hidrogenada, que son anadidas a la composicion por razones semejantes a esas de los polimeros. Ejemplos de minerales son talco, óxido de magnesio, óxido de zinc y óxido de titanio, que son anadidos a la composicion para obtener beneficios tales como la reduction de la acumulacion de liquido o propiedades ventajosas de pigmento.
Los agentes de la invencion pueden formularse en cualquier tipo de composicion farmaceutica que en la tecnica se sabe que es adecuada para la administracion de la misma.
En una realization, las composiciones farmaceuticas pueden estar en forma de un liposoma, en donde el agente se combina, ademas de con otros vehiculos farmaceuticamente aceptables, con agentes anfipaticos tales como lipidos, que existen en formas agregadas tales como micelas, monocapas insolubles y cristales liquidos. Los lipidos adecuados para la formulacion en liposomas incluyen, sin limitation, monogliceridos, digliceridos, sulfatidos, lisolecitina, fosfolipidos, saponinas, acidos de bilis, y similares. Los lipidos adecuados tambien incluyen los lipidos anteriores modificados por poli(etilenglicol) en el grupo de cabeza polar para prolongar el tiempo de circulation en la corriente sanguinea. La preparacion de tales formulaciones liposomales se puede encontrar, por ejemplo, en el documento US 4.235.871.
Las composiciones farmaceuticas de la invencion tambien pueden estar en forma de microesferas biodegradables. Los poliesteres alifaticos, tales como poli(acido lactico) (PLA), poli(acido glicolico) (PGA), copolimeros de PLA y PGA (PLGA) o poli(carprolactona) (PCL), y polianhidridos se han usado ampliamente como polimeros biodegradables en la production de microesferas. Las preparaciones de tales microesferas pueden encontrarse en los documentos US 5.851.451 y EP 0213303.
Las composiciones farmaceuticas se pueden proporcionar en forma de geles de polimero, en los que los polimeros tales como almidon, eteres de celulosa, celulosa carboximetilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, hidroxietilcelulosa, etilhidroxietilcelulosa, alginatos, carragenina, acido hialuronico y derivados de los mismos, acido poliacrilico, polisulfonato, polietilenglicol/óxido de polietileno, copolimeros de óxido de polietileno/óxido de polipropileno, alcohol polivimlico/acetato de polivinilo de diferente grado de hidrolisis, y polivinilpirrolidona se usan para el espesamiento de la solucion que contiene al agente. Los polimeros tambien pueden comprender gelatina o colageno.
Como alternativa, los agentes pueden simplemente disolverse en solucion salina, agua, polietilenglicol, propilenglicol, etanol o aceites (tal como aceite de colza, aceite de maiz, aceite de cacahuate, aceite de algodon o aceite de sesamo), goma de tragacanto, y/o varios tampones.
Se apreciara que las composiciones farmaceuticas descritas en el presente documento pueden incluir iones y un pH definido para la potenciacion de la action del agente activo. Adicionalmente, las composiciones pueden someterse a operaciones farmaceuticas convencionales, tales como esterilizacion, y/o pueden contener adyuvantes convencionales tales como conservantes, estabilizadores, agentes humectantes, emulsionantes, tampones, cargas, etc.
Las composiciones farmaceuticas se pueden administrar a traves de cualquier via adecuada conocida por los expertos en la tecnica. Por tanto, las posibles vias de administration incluyen parenteral (intravenosa, subcutanea, e intramuscular), topica, ocular, nasal, pulmonar, bucal, oral, parenteral, vaginal y rectal. Tambien es posible la administracion de implantes.
En una realización preferida, las composiciones farmaceuticas se pueden administrar por v^a parenteral, por ejemplo, por las vias intravenosa, intracerebroventricular, intraarticular, intraarterial, intraperitoneal, intratecal, intraventricular, intraesternal, intracraneal, intramuscular o subcutanea, o se pueden administrar mediante tecnicas de infusion. Se usan de forma conveniente en forma de una solucion acuosa esteril que puede contener otras sustancias, por ejemplo, suficientes sales o glucosa para hacer la solucion isotonica con la sangre. Las soluciones acuosas deben tamponarse convenientemente (preferentemente a un pH de 3 a 9), si es necesario. La preparation de formulaciones parenterales convenientes en condiciones esteriles se logra facilmente mediante tecnicas farmaceuticas estandar bien conocidas por los expertos en la tecnica.
Las formulaciones adecuadas para la administracion parenteral incluyen soluciones inyectables acuosas y no acuosas esteriles que pueden contener antioxidantes, tampones, bacteriostatos y solutos que vuelven la formulation isotonica con la sangre del receptor previsto; y suspensiones esteriles acuosas y no acuosas que pueden incluir agentes de suspension y agentes de espesamiento. Las formulaciones pueden ser presentadas en contenedores de unidad de dosis o de multi-dosis, por ejemplo ampolletas y frascos sellados, y pueden ser almacenados en una condition secada por congelation (liofilizado) que requiere solo la adicion del vehiculo liquido esteril, por ejemplo agua para inyecciones, inmediatamente antes del uso. Las soluciones y suspensiones de inyeccion extemporanea pueden ser preparadas de polvos esteriles, granulos y comprimidos de la clase descrita anteriormente.
Por tanto, las composiciones farmaceuticas son particularmente adecuadas para administracion parenteral, por ejemplo intravenosa.
Como alternativa, las composiciones farmaceuticas pueden administrarse por via intranasal o por inhalation (por ejemplo, en forma de una presentation de rocio de aerosol de un contenedor presurizado, bomba, rociador o nebulizador con el uso de un propelente conveniente, tal como diclorodifluorometano, triclorofluoro-metano, diclorotetrafluoro-etano, un hidrofluoroalcano tal como 1,1,1,2-tetrafluoroetano (HFA 134A3 o 1,1,1,2,3,3,3-heptafluoropropano (HFA 227EA3), bióxido de carbono u otro gas conveniente). En el caso de un aerosol presurizado, la unidad de dosis puede ser determinada proporcionando una valvula para entregar una cantidad medida. El contenedor presurizado, la bomba, el rociador o nebulizador pueden contener una solucion o suspension del polipeptido activo, por ejemplo utilizando una mezcla de etanol y el propelente como el solvente, que puede contener adicionalmente un lubricante, por ejemplo trioleato de sorbitan.
Las capsulas y los cartuchos (formados, por ejemplo, de gelatina) para uso en un inhalador o insuflador pueden formularse para contener una mezcla de polvo de un compuesto de la invention y una base de polvo conveniente tal como la lactosa o almidon.
Las composiciones farmaceuticas se administraran a un paciente a una dosis farmaceuticamente efectiva. Una 'cantidad terapeuticamente efectiva', o "cantidad efectiva", o 'terapeuticamente efectiva', como se utiliza en la presente invencion, se refiere a esa cantidad que proporciona un efecto terapeutico para una condicion dada y regimen de administracion. Esto es una cantidad predeterminada de material activo que se calcula para producir un efecto terapeutico deseado junto con el aditivo o diluyente requerido, es decir, un vehiculo o vehiculo de administracion. Ademas, pretende significar una cantidad suficiente para reducir, y mas preferentemente, prevenir, un deficit clinicamente significativo en la actividad, la funcion y la respuesta del huesped. Como alternativa, una cantidad terapeuticamente efectiva es suficiente para causar una mejora en una condicion clinicamente significativa en un huesped. Como aprecian los expertos en la tecnica, la cantidad de un compuesto puede variar dependiendo de su actividad especifica. Las cantidades convenientes de la dosis pueden contener una cantidad predeterminada de composition activa que se calcula para producir el efecto terapeutico deseado en asociacion con el diluyente requerido. En los metodos y uso para la fabrication de las composiciones de la invencion, se proporciona una cantidad terapeuticamente efectiva del componente activo. El trabajador experto, medico o veterinario puede determinar una cantidad terapeuticamente efectiva segú lans caracteristicas de los pacientes, tales como la edad, el peso, el sexo, la afeccion, las complicaciones, otras enfermedades, etc., como es sabido en la tecnica. La administracion de la dosis farmaceuticamente efectiva puede ser llevada a cabo mediante una sola administracion en forma de una unidad de dosis individual o, en cambio, de varias unidades de dosis mas pequenas y tambien mediante multiples administraciones de dosis subdivididas en intervalos especificos. Como alternativa, las dosis pueden administrarse en forma de una infusion continua durante un periodo prolongado.
Los polipeptidos pueden formularse en varias concentraciones, dependiendo de la eficacia/toxicidad del compuesto a ser utilizado. Preferentemente, la formulacion comprende al agente activo en una concentration de entre 0,1 |jM y 1 mM, mas preferentemente entre 1 j M y 500 j M, entre 500 j M y 1 mM, entre 300 j M y 700 j M, entre 1 j M y 100 j M, entre 100 j M y 200 j M, entre 200 j M y 300 j M, entre 300 j M y 400 j M, entre 400 j M y 500 j M y mas preferentemente aproximadamente 500 j M.
Los expertos en la tecnica apreciaran que las composiciones farmaceuticas pueden administrarse solas o en combinacion con otros agentes terapeuticos utilizados en el tratamiento de tumores solidos, tales como antimetabolitos, agentes alquilantes, antraciclinas y otros antibioticos citotoxicos, tales como alcaloides vinca, etoposido, compuestos de platino, taxanos, inhibidores de topoisomerasa I, inmunosupresores antiproliferativos, corticosteroides, hormonas sexuales y antagonistas de hormonas, y otros anticuerpos terapeuticos (tal como trastuzumab).
En el presente documento tambien se describe un kit que comprende a un agente como se define en relacion con el primer aspecto de la invencion o una composicion farmaceutica del mismo.
En el presente documento tambien se describe el uso de un agente como se define en relacion con el primer aspecto de la invencion, en la preparacion de un medicamento para inducir muerte celular y/o inhibir el crecimiento y/o la proliferation de celulas asociadas a un tumor solido, en donde las celulas expresan IL1RAP.
En el presente documento tambien se describe el uso de un agente como se define en relacion con el primer aspecto de la invencion, para detectar celulas asociadas a un tumor solido, en donde las celulas expresan IL1 RAP. En los aspectos de uso anteriores, el tumor solido se selecciona del grupo que consiste en canceres de cancer de prostata, cancer de mama, cancer de pulmon, cancer colorrectal, melanomas, cancer de vejiga, cancer de cerebro/SNC, cancer de cuello uterino, cancer esofagico, cancer de cabeza/cuello, cancer de rinon, cancer de higado, linfomas, cancer de ovario, cancer de pancreas, y sarcomas. Por ejemplo, el tumor solido puede seleccionarse del grupo que consiste en canceres de la glandula prostatica, mama, piel, colon, pulmon, organos urinarios y utero. En otra realization, el tumor solido puede seleccionarse entre los grupos que consisten en cancer de prostata, melanomas, cancer de cuello uterino, cancer esofagico y cancer de cabeza y/o cuello.
En una realización adicional, el tumor solido es un melanoma.
En el presente documento tambien se describe un metodo para inducir la muerte celular y/o inhibir el crecimiento y/o la proliferacion de celulas asociadas a un tumor solido en un individuo, que comprende la etapa de administrar al individuo una cantidad efectiva de un agente, como se define con relacion al primer aspecto de la invencion, o una composicion farmaceutica del mismo, en donde las celulas expresan IL1RAP.
Por tanto, el metodo es para el tratamiento de tumores solidos. Por "tratamiento" los inventores incluyen tanto el tratamiento terapeutico como el profilactico del paciente. El termino "profilactico" se usa para abarcar el uso de un polipeptido o la formulation descrita en el presente documento que prevenga o reduzca la probabilidad de un tumor solido en un paciente o sujeto.
En una realización del metodo anterior, el tumor solido se selecciona del grupo que consiste en cancer de prostata, cancer de mama, cancer de pulmon, cancer colorrectal, melanomas, cancer de vejiga, cancer de cerebro/SNC, cancer de cuello uterino, cancer esofagico, cancer gastrico, cancer de cabeza y cuello, cancer de rinon, cancer de higado, linfomas, cancer de ovario, cancer de pancreas y sarcomas. Por ejemplo, el tumor solido puede seleccionarse del grupo que consiste en canceres de la glandula prostatica, mama, piel, colon, pulmon, organos urinarios y utero. En otra realizacion, el tumor solido puede seleccionarse de los grupos que consisten en cancer de prostata, melanomas, cancer de cuello uterino, cancer esofagico y cancer de cabeza y/o cuello.
En una realización adicional, el tumor solido es un melanoma.
Ejemplos preferidos no limitantes que abarcan ciertos aspectos de la invencion se describiran a continuation, con referencia a las figuras siguientes:
Figura 1. La expresion de P210 BCR/ABL1 induce IL1 RAP in celulas CD34+ sanguineas de cordon.
El analisis de citometria de flujo confirma que la expresion de IL1RAP es inducida por la expresion de P210 BCR/ABL1 retroviral en celulas CD34+ sanguineas de cordon, tres dias despues de la transduction. Las celulas CD34+GFP+ fueron ingresadas según las entradas en los graficos de puntos. El histograma muestra la expresion de IL1RAP para la tincion de control negativo (blanco), control MIG (gris claro) y MIG-P210 (gris oscuro). Los numeros en los graficos de puntos muestran el porcentaje de celulas dentro de entradas/cuadrantes individuales. Se muestra un experimento representativo de tres.
Figura 2. La IL1RAP esta regulada por aumento en celulas LMC primitivas.
Analisis FACS en las celulas CD34+ de cinco pacientes con LMC y de 2 muestras de medula osea (mo) normales. El grafico de puntos de FACS muestra la entrada para celulas CD34+CD38+ o CD34+CD38- en un paciente con LMC representativo (A). El histograma muestra la expresion de IL1RAP dentro de las celulas CD34+CD38+ (B). El histograma muestra la expresion de IL1RAP dentro de las celulas CD34+CD38- (C). El blanco representa las muestras de control tenidas y el gris representa las muestras tenidas de IL1RAP. Las entradas de clasificacion para las celulas CD34+CD38-IL1RAP- y CD34+CD38-IL1RAP+ se resumen en los histogramas. Los numeros en el grafico de puntos e histogramas muestran el porcentaje de celulas dentro de las entradas/cuadrantes individuales.
Figura 3. La expresion de IL1RAP distingue las celulas de LMC Ph+ de Ph- dentro del compartimiento de celulas CD34+CD38-.
El Flujo-Gota-FISH en las celulas DE LMC CD34+CD381L1RAP- y CD34+CD38-IL1RAP+ de muestras de 5 pacientes con LMC revelo una separacion casi completa entre las celulas BCR/ABL1- y BCR/ABL1+, respectivamente. Las barras negras representan las celulas negativas a BCR/ABL1 y las barras blancas representan las celulas positivas a BCR/ABL1. Delineado en la parte superior de cada barra se encuentra el numero de celulas Ph+ de la puntuacion total de nucleos.
Figura 4. La expresion de IL1 RAP distingue celulas madre de LMC Ph+ de CMH normales.
El numero de Lt C-CFC derivado de las celulas CD34+CD38-IL1RAP- y CD34+CD38-IL1RAP+ (A). Las barras negras representan las celulas de IL1RAP- y las barras blancas representan las celulas de IL1RAP+. FISH de interfaz en LTC-CFC (B). Las barras negras representan las celulas negativas a BCR/ABL1 y las barras blancas representan las celulas positivas a BCR/ABL1. Delineado en la parte superior de cada barra se encuentra el numero de celulas Ph+ de la puntuacion total de nucleos.
Figura 5. Muerte de una lmea celular de LMC mediante direccionamiento del anticuerpo frente a la IL1RAP.
El histograma muestra la expresion de IL1RAP en celulas de KU812 derivadas de un paciente con LMC y que contiene un cromosoma Filadelfia, comparado con la expresion en las celulas kG-1 que carecen de un cromosoma Filadelfia (A). El blanco muestra muestras tenidas de control y el gris muestra muestras tenidas de KMT-1. La linea celular leucemica KG-1 carecia de expresion IL1RAP, mientras que KU812 expreso IL1RAP (B). Como resultado, se observo un nivel bajo de la muerte celular inducida por anticuerpos en KG-1, mientras que se observo un efecto dependiente de la dosis de CCDA utilizando KMT-1 en celulas KU812 (B). Como control para efectos no especificos de CCDA, en los experimentos se uso un anticuerpo de conejo IgG. El grafico muestra el promedio y la desviacion estandar de la muerte celular inducida por anticuerpos de tres experimentos independientes.
Figura 6. Destruccion de celulas madre de LMC mediante direccionamiento del anticuerpo frente a IL1RAP.
Utilizando KMT-1, las celulas CD34+CD38- de medula osea normal dieron tincion negativa para IL1RAP, mientras que las celulas de LMC CD34+CD38+ y CD34+CD38- expresaron IL1RAP. Se muestran los histogramas en LMC-1 de un experimento representativo (A). El blanco muestra muestras tenidas de control y el gris muestra muestras tenidas de KMT-1. De acuerdo con el nivel de expresion de IL1RAP, no se observo ningun efecto obvio de CCDA utilizando celulas CD34+CD38- de medula osea normal, mientras que KMT-1 indujo un efecto fuerte dependiente de dosis de CCDA tanto en las celulas LMC CD34+ como en las CD34+CD38- (B). Como un control para efectos no especificos de la CCDA, tambien se uso un anticuerpo de conejo IgG en los experimentos. El grafico muestra el promedio y la desviacion estandar de la muerte celular inducida por anticuerpos de tres experimentos independientes utilizando LMC-1, LMC-3, LMC-4, y cuatro muestras de medula osea normal. Figura 7. La IL1 RAP se expresa tambien en celulas madre primarias de LLA y LMA.
Las celulas de leucemia mieloide aguda (LMA) se recibieron de pacientes en el momento del diagnostico. Se presenta la expresion en celulas CD34+CD38- y CD34+CD38+ de un paciente de LMA representativo (A). La linea celular de LmA MONO-MAC-6 y la linea celular de LLA REH expresaron IL1RAP (B). Las celulas de leucemia linfoide aguda (LLA) se recibieron de pacientes en el momento del diagnostico. Se presenta la expresion de IL1RAP en celulas Cd34+CD38- y CD34+CD38+ de un paciente con LLA Ph+ representativo se presenta (C). El blanco muestra las muestras tenidas de control y el gris muestra las muestras tenidas de IL1RAP.
Figura 8. Destruccion de las lmeas celulares de LMA y LLA mediante direccionamiento de anticuerpo de IL1RAP.
En el ensayo de CCDA, se indujo muerte celular dependiente de la dosis de KMT-1 tanto en la linea celular MONO-MAC- 6 como en la REH, lo que sugiere que los anticuerpos de direccionamiento de IL1RAP pueden tener una ventana terapeutica mas amplia que solo para la LMC. Como un control para efectos no especificos de la CCDA, tambien se uso un anticuerpo de conejo IgG en los experimentos. El grafico muestra el promedio y la desviacion estandar de la muerte celular inducida por anticuerpos de tres experimentos independientes.
Figura 9. Destruccion de celulas madre de LMA y LLA por direccionamiento de anticuerpo de IL1RAP. En el ensayo de CCDA, se observo muerte celular inducida por KMT-1 tanto en las celulas primarias de LMA CD34+CD38- (A) como de LLA CD34+CD38- (B), lo que confirma que los anticuerpos de direccionamiento de IL1 RAP tambien tienen un efecto terapeutico en la LMA y la LLA con regulacion por incremento de IL1 RAP en su superficie celular. Como un control para efectos no especificos de la CCDA, tambien se uso en los experimentos un anticuerpo de conejo IgG. El grafico muestra la muerte celular inducida por anticuerpo especifico.
Figura 10. La IL1RAP se expresa en celulas madre leucemicas de pacientes con TMP y SMP.
Graficos de contorno que muestran la expresion de IL1RAP en celulas CD34+CD38- de dos pacientes con TMP (TMP-1 y TMP-2), con y sin la mutacion JAK2 (A). El histograma muestra la expresion de IL1RAP en un paciente de SMP que progreso a LMA (B). El blanco muestra las muestras tenidas de control y el gris muestra las muestras tenidas con anticuerpos anti-IL1RAP.
Figura 11. La IL1 RAP se expresa en la superficie de celulas cancerosas de tumores solidos.
Diferentes lineas celulares derivadas de tumores solidos humanos se tineron con IL-1 RAcP/IL-1 R3-APC antihumano (n.° de cat. FAB676A, R&D system) (lineas negras) y control de isotipo (lineas grises). El analisis por citometria de flujo muestra la expresion de IL1RAP en COLO829 (melanoma maligno), HCC1954 (carcinoma ductal de mama), NCI-8228 (adenocarcinoma de pulmon), NCI-H716 (cancer de colon), OV-90 (adenocarcinoma de ovario), H716 (cancer de colon), H2228 (adenocarcinoma de pulmon), SH-4 (melanoma), SR (linfoma) y SW 1783 (astrocitoma).
Figura 12. La IL1 RAP se expresa en la superficie de celulas cancerosas de tumores solidos.
El histograma del analisis por citometria de flujo en celulas de cuatro diferentes lmeas celulares de cancer humano marcadas con mab81.2, un anticuerpo contra IL1RAP, muestra la expresion de IL1RAP en H716 (cancer de colon), H2228 (adenocarcinoma de pulmon), HCC1954 (carcinoma ductal de mama), y SH-4 (melanoma). Figura 13. El direccionamiento de anticuerpo de IL1RAP dirige las celulas NK humanas de la CCDA en celulas cancerosas humanas.
Los graficos muestran el grado de la muerte celular especifica inducida por el anticuerpo mab81.2, IL1RAP antihumano y celulas NK humanas en un ensayo de CCDA. Como control de isotipo, en los experimentos se incluyo un anticuerpo IgG 1 humano no especifico.
Figura 14. Efecto del mAb 81.2 en el crecimiento in vivo de la lmea celular de melanoma SK-MEL-5.
El mAb 81.2 se administro a 10 mg/kg de peso corporal por via intraperitoneal dos veces a la semana. Se trato a los ratones control con volumenes equivalentes de PBS. Cada grupo experimental contenia diez ratones. Los resultados se presentan como el volumen tumoral promedio (mm3); las barras de error representan el Error Estandar de la Media (SEM).
EJEMPLO 1
La IL1 RAP es un biomarcador de superficie celular para celulas madre de leucemia mieloide cronica
Sumario
Las estrategias terapeuticas para la leucemia mieloide cronica (LMC) con el objetivo de lograr una cura permanente del trastorno, requeriran una erradicacion completa de las celulas madre de LMC. Las celulas madre de LMC, que comparten la capacidad de autorrenovarse con las celulas madre hematopoyeticas (CMH) normales, representan una pequena poblacion de celulas leucemicas que hasta ahora han sido indistinguibles de las normales (CMH) utilizando marcadores de superficie celular. Una estrategia para apuntar a las celulas madre de LMC seria identificar un biomarcador para las celulas madre de LMC, al que pudieran dirigirse los anticuerpos terapeuticos futuros. En este estudio, los inventores identificaron que la ILlRAP estaba habitualmente regulada por incremento tanto en celulas de LMC CD34 primitivas y como resultado de la expresion de P210 BCR/ABL1 ectopica utilizando analisis de expresion genica global. Los inventores mostraron ademas que la expresion de IL1RAP divide la poblacion rara de celulas CD34+CD38-, que alojan celulas tanto de LMC como de CMH normales, en dos fracciones; una con una expresion baja/ausente, y la otra con expresion mayor de IL1RAP. Despues de establecer un protocolo que permitiera la deteccion de BCR/ABL1 mediante FISH en pequenos numeros de celulas clasificadas, los inventores observaron que dentro de las celulas de LMC CD34+Cd38-; las celulas de IL1RAP+ fueron BCR/ABL1+, mientras que las celulas de IL1RAP- fueron casi exclusivamente BCR/ABL1-. Realizando ademas ensayos de celula de inicio de cultivo a largo plazo (LTC-IC) en las dos poblaciones de celulas, los inventores encontraron que las celulas madre de LMC y CMH normal podrian separarse de forma prospectiva. Por tanto, en este estudio se identifica a la IL1RAP como el primer biomarcador de la superficie celular que distingue celulas madre de LMC de CMH normales y abre nuevos caminos para las estrategias terapeuticas y de diagnostico en la LMC asi como en trastornos relacionados tales como leucemia mieloide aguda (LMA), leucemia linfoblastica aguda (LLA), trastornos mieloproliferativos (TMP) y sindrome mielodisplasico (SMD).
Introduction
Para identificar un biomarcador de superficie celular para celulas madre de LMC, los inventores realizaron analisis de expresion genica global e identificaron la proteina accesoria del receptor de interleucina 1 (IL1RAP) como el principal candidato, estando regulada por incremento tanto en las celulas de pacientes con LMC primitivas y como resultado de la expresion de P210 BCR/ABL1 ectopica. Con el desarrollo de un ensayo para detectar BCR/ABL1 en numeros bajos de celulas clasificadas, los inventores mostraron que la expresion de IL1RAP permite la separation prospectiva de las celulas leucemicas primitivas y las celulas normales. A traves de ensayos de celula de inicio de cultivo a largo plazo, los inventores mostraron ademas que la IL1RAP es un biomarcador de la superficie celular para celulas madre de LMC, lo que permite por primera vez la separacion prospectiva de las celulas madre de LMC de las CMH normales.
Materiales y metodos
Recoleccion de celulas de pacientes con LMC
Aislamiento y transduccion de celulas sanguneas de cordon CD34+
Las muestras de sangre y, ocasionalmente de medula osea, de pacientes con LMC se obtuvieron en el momento del diagnostico antes de iniciar el tratamiento despues del consentimiento informado un s pergoútoncolo aprobado por la Consejo de etica local. Las muestras fueron recibidas tanto del Departamento de Hematologia en el Hospital de la Universidad de Lund, Suecia y de Rigshospitalet, Copenhague, Dinamarca. Las celulas mononucleares (CMN) se separaron utilizando Lymphoprep™ (Axis-Shield PoC AS, Oslo, Noruega) de acuerdo con las instrucciones del fabricante y las celulas CD34+ se enriquecieron utilizando el kit de aislamiento de celulas CD34+ (Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Alemania) como se ha descrito anteriormente22, en una base regular, produciendo asi una pureza de celulas CD34+ superior a 95 %. Una subfraccion de celulas mononucleares se almaceno viablemente en nitrogeno Kquido antes de iniciar la tincion de anticuerpo. Las celulas CD34+ se dividieron en dos fracciones; una fraccion se lavo con PBS y se resuspendio en Trizol y se congelo a -80 °C, mientras que la otra fraccion fue congelada en nitrogeno liquido. Como muestras de referencia, se obtuvieron muestras de medula osea de voluntarios sanos despues de consentimiento informado en el Hospital de la Universidad de Lund, seguido de aislamiento de las celulas CD34 como se ha descrito anteriormente.
Analisis en micromatriz
El analisis en micromatriz se realizo utilizando cortes de oligonucleotido del Swegene DNA Microarray Resource en la Universidad de Lund, Suecia. Se realizaron hibridaciones utilizando el kit Pronto Universal Hybridization (Corning Inc, Corning, NY). El aislamiento del ARN y el analisis de micromatriz se realizaron esencialmente como se ha descrito anteriormente23. La visualizacion de datos se realizo utilizando el software Qlucore Omics Explorer 2.0 (Qlucore, Lund, Suecia).
Analisis por citometria de flujo
Los analisis de citometria de flujo se realizaron en un FACS Canto y la clasificacion de las celulas por citometria de flujo se realizo en un FACS Aria (ambos de BD). Antes de la tincion celular, las celulas CD34+ se descongelaron de acuerdo con procedimientos estandar y se lavaron una vez en PBS con 2 % de FCS (medio de lavado). Se uso el anticuerpo policlonal frente a IL1RAP anti-humano de cabra marcado con biotina (lote 667, R&D Systems, Abingdon, Reino Unido) a una dilucion de 1:100 para la tincion de celulas durante 30 minutos en hielo. Despues, se lavaron las celulas y se utilizo estreptavidina conjugada con PE a una dilucion de 1:200 durante 30 minutos. Los anticuerpos monoclonales anti-CD34 conjugados con APC y anti-CD38 conjugados con FITC se usaron para cotincion (excepto IL1RAP, todos los anticuerpos usados se adquirieron en Beckton-Dickinson Immunocytometry Systems, Mountain View, CA). Antes de la clasificacion celular, las celulas se lavaron dos veces para evitar una union inespecifica de la estreptavidina conjugada con PE. Se utilizaron anticuerpos control de isotipo equivalente como controles negativos. Clasificacion celular y FISH de interfaz
Los portaobjetos de vidrio se trataron con poli-L-lisina al 0,01 % (Sigma-Aldrich, Estocolmo, Suecia) durante dos horas mientras se mantenian en una camara de humedad, se lavaron una vez con agua, y se secaron en una placa caliente a 37 °C hasta que estuvieran secos. Despues se uso un boligrafo hidrofobo (Daido Sangyo Co., Ltd. Tokio, Japon) para dibujar circulos con una placa de cultivo de tejido de 96 pocillos como molde. Antes de la clasificacion celular, pero despues de por lo menos dos horas de secado a temperatura ambiente, se aplicaron 25 ^l de PBS a los anillos para formar gotas. Durante la clasificacion de las celulas, se clasificaron de 30 a 3.000 celulas simultaneamente directamente en dos gotas. Para permitir la fijacion de las celulas a la superficie y para evitar el secado de las gotas, los portaobjetos se mantuvieron en una camara humeda en hielo durante 30 minutos antes de fijar las celulas en metanol: acido acetico (3:1) durante 10 min. Posteriormente, los portaobjetos se incubaron en un horno a 70 °C durante la noche, seguido por FISH. Se utilizaron sondas de doble color para BCR/ABL1 (Abbot, Wiesbaden, Alemania).
Celulas de inicio de cultivo a largo plazo (LTC-IC)
Las celulas de estroma M210B4 se cultivaron en medio RPMI-1640 suplementado con FCS al 10 % como se describio anteriormente2425. Dos dias antes de la clasificacion celular, las celulas de estroma se sembraron en pocillos de una placa de 96 pocillos a una densidad de 50.000 celulas por ml en 200 ^l de medio Myelocult (Stem Cell Technologies, Vancouver, Canada) con hidrocortisona 10-6 M (Sigma-Aldrich, Estocolmo, Suecia). Veinticuatro horas antes de la clasificacion celular, las celulas de estroma se irradiaron con 1000 Rad. Durante la clasificacion celular, 100-500 celulas se clasificaron directamente en los pocillos previamente revestidos con estroma por duplicado y 100 ^l de medio se intercambio 3 horas mas tarde. Una vez a la semana, se repitio el intercambio de 100 ^l de medio de cultivo. Despues de 5-6 semanas, las celulas se lavaron y sembraron en placas en medio de metilcelulosa (MethoCult H44435; Stem Cell Technologies) en una placa de 24 pocillos. Dos semanas mas tarde, se puntuo el numero de colonias. Las colonias de pocillos individuales se combinaron, se lavaron, se aplicaron gotas de PBS en portaobjetos, y seguido de analisis de FlSH como se ha descrito anteriormente.
Expresion de P210 BCR/ABL1 en celulas sanguneas de cordon CD34+
Las muestras de sangre del cordon umbilical se recolectaron de partos normales despues de obtener consentimiento informado según un protocolo aprobado por el Consejo de etica local. Las celulas CD34+ se enriquecieron como se ha descrito previamente 22, produciendo una pureza de CD34+ celulas superior a 95 %. Se utilizaron los vectores virales de Ms CV-IRES-GFP (MIG) de pseudotipo RD114 y MIG-P210 en este estudio23. Las celulas CD34+ se cultivaron y transdujeron en medio SFMM (Stem Cell Technology, Vancouver, Canada) suplementado con trombopoyetina (TPO; 50 ng/ml), factor de celulas madre (SCF; 100 ng/ml), y ligando Flt-3 (FL; 100 ng/ml) como se ha descrito anteriormente23.
Resultados y discusion
El analisis de expresion genica global identifica que la IL1RAP esta regulada por aumento en las celulas CD34+ de LMC
Se han realizado muchos esfuerzos en investigaciones dirigidas a identificar un biomarcador de superficie celular para celulas madre LMC Ph+ (revisado por C Eaves14). Las celulas leucemicas y normales pueden identificarse mas facilmente de forma retrospectiva en LMC despues de la deteccion del gen de fusion BCR/ABL1 especifico de leucemia por FISH, convirtiendolo en un trastorno ideal para evaluar intentos para separar prospectivamente celulas leucemicas y normales. Sin embargo, hasta ahora, no se ha identificado ningun marcador de superficie celular que permita la separacion prospectiva de las celulas madre de LMC de las CMH normales. Los analisis de expresion global de genes han demostrado ser una estrategia poderosa en la busqueda de nuevos marcadores de CMH tales como los receptores SLAM que distinguen las celulas hematopoyeticas y las progenitoras15. Para buscar genes regulados por aumento que codifican biomarcadores de superficie celular candidatos para celulas madre de LMC, se compararon los perfiles transcripcionales de las celulas de CD34+ de muestras de 11 pacientes con LMC y 5 muestras de medula osea (mo) normales. Los genes regulados por aumento identificados en la LMC fueron igualados a la categoria de Intologia de Genes (GO) “integral a la membrana de plasma" que ha sido curada manualmente para incluir todas las moleculas de CD conocidas (vease Materiales y Metodos para detalles). En total, 13 genes regulados por aumento en celulas de LMC CD34+ igualaron a la categoria de gen de membrana de plasma integral (datos no mostrados). Para ligar mas los genes regulados por aumento mas directamente con la expresion de P210 BCR/ABL1, los inventores generaron en paralelo una lista de genes regulados por aumento como resultado de la expresion de P210 BCR/ABL1 en celulas CD34+ sanguineas de cordon. Este analisis tuvo como resultado 23 genes regulados por aumento que igualan la misma lista de genes de categoria GO (datos no mostrados). De manera interesante, solo un gen, la proteina accesoria del receptor de interleucina 1 (IL1RAP), mostro una fuerte regulacion por aumento tanto en celulas CD34+ de LMC como en celulas CD34+ sanguineas de cordon a consecuencia de la expresion de P210 BCR/ABL1. Los hallazgos de que la IL1RAP estuvo presente en ambas listas de genes sugieren que su regulacion por aumento en celulas LMC primitivas esta asociada cercanamente a la expresion de P210 BCR/ABL1 e indica que la IL1RAP es un antigeno novedoso asociado a la leucemia en celulas de LMC primitivas.
La IL1RAP esta regulada por aumento en las celulas CD34+CD38- de pacientes con LMC y se induce a consecuencia de la expresion de P210 BCR/ABL1 ectopico
La IL1RAP es un miembro de la superfamilia de receptor del tipo Toll y es un correceptor bien conocido del receptor de interleucina 1 del tipo 1 (IL-1R1)16. Por tanto, la IL1RAP es crucial en la mediacion del efecto de la citocina IL-1 proinflamatoria, pero tambien esta involucrada en la mediacion de la serial de IL-33, una citocina que activa los linfocitos T y los mastocitos a traves de la union a su receptor ST2, que posteriormente se dimeriza con la IL1RAP17. La activacion de la IL-1R1 ha demostrado anteriormente que estimula el crecimiento de colonias de las celulas de LMC sensibles a interferon18, sin embargo, la IL1RAP se eglú cnonocimiento de los inventores no se ha relacionado directamente con la LMC.
Ya que P210 BCR/ABL1 esta presente en las celulas de LMC como una marca de la enfermedad, idealmente, un biomarcador de superficie celular confiable en LMC, debe estar asociado directamente a la presencia y expresion de P210 BCR/ABL1. De acuerdo con los datos de la micromatriz, la expresion de IL1RAP estaba, de hecho, regulada por aumento en la superficie celular en las celulas de CB CD34+ siguiendo la expresion de P210 BCR/ABL1 retroviral (Figura 1). Esto sugiere que el P210 BCR/ABL1 regula la expresion de IL1RAP, ya sea directamente o por un efecto indirecto, reforzando su candidatura como un biomarcador de LMC.
A continuacion, los inventores investigaron la expresion de IL1RAP en la superficie celular de las celulas de LMC CD34+CD38+, que representa la mayoria de las celulas CD34+ y las mas maduras. En esta poblacion de celulas, se observo una regulacion por aumento de la IL1RAP en comparacion a la expresion en correspondientes celulas normales de bm (Figuras 2A, 2B). Las celulas CD34+CD38+ normales mostraron una menor expresion de IL1RAP que se superpuso parcialmente con la expresion en las celulas LMC. Despues, los inventores cambiaron al compartimiento de las celulas CD34+CD38- de celulas normales, que contenian las CMH. De acuerdo con un estudio anterior, esta poblacion mostro una expresion de IL1RAP baja/ausente (Figura 2C)19. Marcadamente, las celulas CD34+CD38- de pacientes con LMC, que albergan tanto las celulas madre de Ph+ LMC como las CMH normales fueron divididas en dos poblaciones, una teniendo una expresion de IL1RAP baja/ausente, la otra teniendo mayor expresion de IL1RAP (Figura 2C). En la sangre periferica (PB) de cinco pacientes con LMC, la fraccion de celulas positivas a IL1RAP constituyo entre 75 % y 95 % de las celulas CD34+CD38- (n = 5). Basado en estas conclusiones, los inventores especularon que la expresion de IL1RAP quizas distinga las celulas normales y leucemicas dentro del compartimento de celulas CD34+c D38- en LMC. Ya que todas las celulas madre de LMC y CMH normales se encuentran exclusivamente dentro de las celulas CD34+CD38, tal separacion entre las celulas normales y leucemicas, permitiria una separacion prospectiva de celulas madre de LMC de las CMH normales.
El flujo-gota-FISH muestra que la expresion de IL1RAP separa las celulas normales y leucemicas dentro de las celulas LMC CD34+CD38-
Para analizar si la expresion de IL1RAP distingue las celulas normales (Ph-) y las leucemicas (Ph+) dentro del compartimiento de celulas de LMC CD34+CD38-, establecimos un nuevo protocolo para hacer la hibridacion fluorescente in situ (FISH) en numeros pequenos de celulas clasificadas (vease Material y Metodos). Los primeros pasos en este protocolo se basan en parte en un metodo de clasificacion celular en gotas en portaobjetos, seguido de inmunotincion de celula unica20. Aplicando este nuevo protocolo que implica la clasificacion celular directamente en gotas en portaobjetos seguido de FISH, en lo anterior referido como Flujo-gota-FISH, los inventores clasificaron tan solo 30 celulas en una gota, de las cuales, 15 nucleos se clasificaron con exito mediante FISH (LMC-5, Figura 3). De manera interesante, encontramos por Flujo-gota-FISH que las celulas LMC CD34+CD38-IL1RAP+ fueron BCR/ABL1+, mientras que las celulas lMc CD34+CD38-IL1RAP- fueron casi exclusivamente Ph- (n = 5, Figura 3). Estos datos muestran que la expresion de IL1RAP separa las celulas leucemicas y normales dentro del compartimiento de celulas LMC CD34+CD38-, indicando que las celulas madre de LMC y las CMH normales se pueden separar prospectivamente.
Las celulas madre de LMC son CD34+CD38-IL1RAP+ mientras las CMH normales son CD34+CD38-IL1 RAP-/ ow
Los estudios en celulas madre de LMC de fase cronica se han basado hasta ahora en el acceso a pacientes con LMC raro en los que el compartimento de celulas madre ha sido dominado por las celulas leucemicas despues de ensayos a largo plazo14. Ya que las celulas madre de LMC muestran generalmente un mal injerto en ratones inmunodeficientes, el ensayo de celula de inicio de cultivo a largo plazo (LTC-IC) se usa extensamente como un ensayo sustituto para la deteccion de celulas madre candidatas a lMc . Para probar si LMC CD34+CD38-IL1RAP+ y CD34+CD38-IL1RAP-/low contienen unicamente celulas madre de LMC y CMH normales, respectivamente, se probaron las dos poblaciones celulares en el ensayo de LTC-IC. Para las celulas de medula osea CD34+ de controles normales, las celulas formadoras de colonia de cultivo a largo plazo (LTC-CFC) fueron encontradas en una frecuencia >100 veces mayor entre las celulas CD34+CD38-IL1RAP- en comparacion con las celulas CD34+CD38-IL1RAP+ (Figura 4A, n= 2), indicando que CD34+CD38-IL1RAP- normales estan jerarquicamente arriba de las celulas CD34+CD38-IL1RAP+. En LMC, observamos un promedio de 3.6 veces mayor frecuencia de LTC-CFC dentro de las celulas CD34+CD38-IL1RAP- en comparacion con las celulas CD34+CD38-ILlRAP+ (n= 5, Figura 4A), sugiriendo que las celulas LMC CD34+CD38-IL1RAP- estan mas enriquecidas para las celulas primitivas. De manera importante, aunque se encontro un numero mayor de LTC-IC entre las celulas CD34+CD38-IL1RAP- que dentro de las celulas CD34+CD38-IL1RAP+ tanto de muestras de pacientes con LMC como de los controles normales, el FISH en las colonias de LMC LTC revelo una discriminacion casi completa entre las celulas Ph- y Ph+ en los dos grupos (Figura 4B). Las colonias de LMC LTC derivadas de celulas CD34+CD38-IL1RAP- fueron casi exclusivamente Ph-, mientras las CD34+CD38-IL1RAP+ fueron casi exclusivamente Ph+. Estos datos sugieren que la IL1RAP es un biomarcador de superficie celular novedoso que puede ser utilizado para separar celulas madre de LMC de CMH normales.
En el presente documento, los inventores identificaron mediante el analisis de expresion global de genes un antigeno novedoso de superficie celular, IL1RAP, que despues de la exposition en ensayos multiples cumplio con los criterios de ser un biomarcador de superficie celular novedoso para celulas madre Ph+ LMC. Basado en este descubrimiento, las terapias dirigidas futuras en LMC podrian ser disenadas para apuntar a las celulas madre de LMC mientras al mismo tiempo se preservan las CMH normales utilizando un anticuerpo terapeutico dirigido hacia la IL1RAP. Ademas, un coctel de anticuerpos que contiene anticuerpos anti-CD34, anti-CD38 y anti-ILIRAP puede usarse para propositos de diagnostico y para estudios de seguimiento de pacientes con lMc bajo tratamientos diferentes. De manera importante, una separation prospectiva de celulas normales y de celulas madre de LMC permitira futuros estudios mecanicistas de estas dos poblaciones de celulas. Ademas, los inventores mostraron tambien en el presente documento que el Flujo-gota-FISH podria servir como un metodo util para caracterizar aberraciones geneticas en pequenos numeros de celulas clasificadas, tales como celulas madre leucemicas, un tipo celula que se ha purificado hasta poblaciones de celulas cada vez mas pequenas y puras21. Para futuros estudios, este metodo podria por ejemplo permitir la deteccion de aberraciones geneticas en varias pequenas poblaciones de celulas madre leucemicas y celulas progenitoras, hallazgos que probablemente daran nuevas ideas acerca de los ordenes que han adquirido varias aberraciones, conocimiento clave para comprender la leuquimiogenesis. Ademas, el Flujo-gota-FISH podria ser utilizado para vigilar los efectos terapeuticos en las celulas madre leucemicas durante el tratamiento. De manera importante, en el presente documento, los inventores identificaron utilizando el Flujo-gota-FISH que la IL1RAP es el primer biomarcador de superficie celular que distingue las celulas madre de LMC de las CMH normales, un hallazgo que abre nuevas oportunidades terapeuticas para la LMC y otros trastornos hematologicos neoplasicos asociados a la regulation por aumento de ILIRAp en celulas madre y/o celulas progenitoras.
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EJEMPLO 2
Dirigir los anticuerpos de IL1RAP a celulas madre leucemicas y celulas progenitoras causa citotoxicidad mediada por celulas dependiente de anticuerpos (CCDA)
Sumario
Las estrategias terapeuticas para leucemias dirigidas a lograr una cura permanente requeriran una erradicacion completa de las celulas madre leucemicas. Las celulas madre leucemica, representan una pequena poblacion de celulas leucemicas, hasta ahora han sido indistinguibles de las celulas madre hematopoyeticas (CMH) normales utilizando marcadores de superficie celular. Un nuevo concepto para apuntar a las celulas madre leucemicas seria identificar un biomarcador de superficie celular para celulas madre leucemicas, a que los que podrian dirigirse futuros anticuerpos terapeuticos (vease el Ejemplo 1).
En este estudio, los inventores generaron un anticuerpo anti-IL1RAP y proporcionaron prueba de concepto de que los anticuerpos anti-IL1RAP dirigidos a las celulas madre de la leucemia mieloide cronica (LMC), a las celulas madre de la leucemia mieloide aguda (LMA), a las celulas madre de la leucemia linfoblastica aguda (LLA) pueden usarse para inducir citotoxicidad mediada por celulas dependiente de anticuerpos (CCDA), mientras que ningun efecto citotoxico fue observado en las CMH normales. Ademas, de los inventores mostraron una CCDA dirigida de IL1RAP dependiente de la dosis en las lineas celulares positivas de IL1RAP de KU812 (LMC), MONO-MAC-6 (leucemia mieloide aguda; LMA) y REH (linea celular linfoblastica aguda; LLA). Los inventores tambien mostraron que las celulas madre de SMP y TMP han aumentado la expresion de IL1RAP, indicativo de que los futuros anticuerpos de direccionamiento a anti-ILIRAP terapeuticos seran efectivos tambien en estos trastornos.
Este estudio asi abre una oportunidad terapeutica novedosa en LMC, en LMA, en LLA, en SMP, y en TMP por direccionamiento de anticuerpos de IL1RAP en celulas madre leucemicas.
Materiales y metodos
Generacion de KMT-1; un anticuerpo policlonal de conejo anti- humano frente a IL1RAP
Se inmunizo a los conejos con el dominio extracelular de IL1RAP. El suero de conejos se purifico segun procedimientos estandar, excepto que se anadio una etapa adicional, en la que los anticuerpos que se unen al dominio de inmunoglobulina, presentes en la proteina inmunizante para aumentar la semivida, se desecho mediante la union a columnas cargadas de inmunoglobulina. En los ELISA se confirmo que los anticuerpos purificados se unian al dominio extracelular de IL1RAP y que no habia anticuerpos que se unieran al dominio de inmunoglobulina humana. Cuando se uso en citometria de flujo, se utilizo un anticuerpo IgG de cabra anti-conejo conjugado con PE como reactivo secundario.
Ensayo de CCDA
El ensayo de CCDA se baso en un protocolo descrito anteriormente1. Brevemente, las celulas diana se marcaron con PKH26 (Sigma-Aldrich, St Louis, Missouri) de acuerdo con las instrucciones del fabricante y las celulas se introdujeron directamente dentro de los pocillos de una placa de 96 pocillos, o se sembraron dentro de los pocillos despues de la clasificacion de las celulas CD34+CD38- . Las lineas celulares KU812 y KG-1 y las celulas CD34+ primarias se sembraron a 10.000 celulas por pocillo, mientras las celulas CD34+CD38- primarias se sembraron a 2.000-3.000 celulas por pocillo. Posteriormente, los anticuerpos se anadieron a los pocillos a diferentes concentraciones y se incubaron durante 20 min antes de anadir 100.000 celulas efectoras NK a cada pocillo. Las celulas NK se extrajeron de voluntarios sanos despues de obtener el consentimiento informado utilizando un kit de aislamiento de celulas negativo a celulas NK de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Germana). Los anticuerpos IgG de conejo purificados de un conejo no inmunizado se usaron como anticuerpos de control en los experimentos (R&D Systems Abingdon, RU). Las celulas positivas a 7-AAD para deteccion de la muerte celular se midieron utilizando un citometro de flujo FACS CANTO (BD). El promedio y la desviacion estandar de la muerte celular inducida por anticuerpos se calcularon segun la ecuacion siguiente: (Porcentaje de celulas 7-AAD+ a la concentracion definida de anticuerpo - Porcentaje de celulas 7-AAD+ sin anticuerpo) / (0.01 x Porcentaje de celulas 7-AAD- sin anticuerpo) de por lo menos tres experimentos independientes (excepto la Figura 9; solo un experimento).
Las muestras de once pacientes con LMA y dos pacientes con LLA Ph+ se recibieron del hospital de la Universidad de Lund y la expresion de IL1RAP se analizo en las poblaciones de celulas CD34+CD38+ y CD34+CD38- utilizando los mismos ajustes que para el analisis de celulas de LMC. La linea celular de LMA MONO-MAC-6 y la linea celular de LLA REH tambien se analizaron en los ensayos de CCDA utilizando el mismo ajuste que para las lineas celulares KG-1 y KU812.
Resultados
Dirigir anticuerpos de IL1RAP en celulas madre de LMC y celulas progenitoras pero tambien en una Mnea celular de LMC dirige las celulas NK a CCDA
La citotoxicidad mediada por celulas dependiente de anticuerpos (CCDA) es un mecanismo conservado del sistema inmunologico innato, por el que se cree que varios anticuerpos terapeuticos, tales como Rituximab dirigidos contra CD20, ejercen por lo menos parcialmente su efecto terapeutico2. Para probar si la CCDA podria lograrse utilizando IL1RAP como diana, los inventores generaron un anticuerpo policlonal de conejo anti- IL1RAP humano, de ahora en adelante denominado KMT-1, ya que el dominio Fc de anticuerpos de conejo en contraste con los anticuerpos de cabra es reconocido por las celulas del sistema inmunologico humano.
Como se esperaba, se observaron niveles bajos de CCDA en la linea celular de leucemia negativa/baja para IL1RAP KG-1, aun a altas concentraciones de KMT-1 (Figura 5A, B). Por el contrario, en la linea celular de LMC KU812 que expresa IL1RAP, se observo CCDA mediada por celulas citopaticas naturales (NK) en presencia de KMT-1 (Figura 5A, B), lo que demuestra que KMT-1 tiene el potencial de inducir CCDA reclutando celulas inmunes citotoxicas para las celulas diana IL1RAP+.
En celulas primarias de pacientes con LMC y de controles normales, KMT-1 mostro un patron de tincion ligeramente mas debil, pero similar al del anticuerpo policlonal anteriormente usado de cabra anti-IL1RAP humano (Ejemplo 1, Fig. 6A). Las celulas inmaduras de LMC-1, LMC-3 y LMC-4 (no quedaba ninguna celula de LMC-2 y LMC-5) se analizaron en ensayos de CCDA en paralelo a las celulas de muestras sanas control. En las celulas de LMC CD34+, la union de KMT-1 dio lugar a una CCDA de mayores niveles que las celulas de control CD34+ normales, correlacionando al nivel de expresion de IL1RAP, en particular a menores concentraciones de anticuerpo (Figura 6B). De manera mas marcada, entre las celulas CD34+CD38- enriquecidas de celulas madre, KMT-1 no indujo CCDA de celulas CD34+CD38- normales, mientras que se observo un claro efecto de CCDA dependiente de la dosis en celulas LMC CD34+CD38-(Figura 6B), de nuevo mostrando una fuerte correlacion con el patron de expresion de IL1RAP en estos tipos de celulas.
Los anticuerpos dirigidos a IL1RAP en celulas de LMA y LLA dirigen las celulas NK a CCDA
Se observo expresion de IL1 RAP en celulas de LMA CD34+CD38- en 9 de 11 muestras analizadas (Figura 7A). En la poblacion de celulas CD34+CD38+, se observo un patron de expresion de IL1RAP similar (Figura 7A). Ademas, la IL1RAP se expreso en la linea celular de LMA MONO-MAC-6 y la linea celular de LlA REH (Figura 7B). La expresion IL1RAP tambien se observo en las celulas LLA CD34+CD38- pH en 2 de 2 muestras probadas (Figura 7C). Utilizando IL1RAP como objetivo, las lineas celulares de MONOMAC-6 y de REH tambien se analizaron en ensayos de CCDA. En ambas lineas celulares, se observo un efecto de direccionamiento a CCDA de la IL1RAP dependiente de la dosis (Figura 8), lo que demuestra que los anticuerpos anti-IL1RAP terapeuticos tienen una aplicacion mas amplia que solo para la LMC.
Los inventores tambien realizaron experimentos de CCDA en celulas primarias de LMA y LLA CD34+CD38- y demostraron prueba de principio de que tambien en estos trastornos puede lograrse un aumento en la muerte celular utilizando KMT-1 (Figura 9).
Ademas, las celulas CD34+CD38- de un paciente con SMP que progreso a LMA y dos pacientes con TMP (uno de ellos con mutacion+ JAK2) se tineron con un anticuerpo dirigido a IL1RAP. Se observo un aumento en la expresion de IL1RAP con respecto a celulas normales de medula osea CD34+CD38- (Figura 10, Figura 2C).
Discusion
En el presente estudio, los inventores han identificado la IL1RAP como el primer biomarcador de superficie celular que distingue celulas madre de LMC candidatas de las CMH normales y utilizado este conocimiento para inducir muerte celular dependiente de anticuerpos de celulas madre de LMC. Ademas, los inventores identificaron que la IL1RAP esta regulada por aumento en celulas madre de LMA, celulas madre de LLA, celulas madre de TMP y celulas madre de SMD y de los inventores mostraron que tanto las celulas madre de LMA y LLA pueden ser eliminados utilizando un anticuerpo de direccionamiento de IL1RAP, mientras que las celulas madre normales no fueron afectados. Basado en el hallazgo de que las celulas madre de LMC, LLA y LMA pueden ser eliminadas por anticuerpos redirigidos a la IL1RAP, se espera que tambien las celulas madre de TMP y SMD se eliminaran en el ensayo de CCDA. Estas conclusiones abren un nuevo concepto para tratamientos de pacientes con leucemia por direccionamiento directo de las celulas madre de leucemia, un concepto que es distinto de los inhibidores de tirosina cinasa actualmente utilizados, que de manera apuntan a celulas aguas abajo las celulas madre de LMC34.
La razon por la cual las celulas madre de LMC son resistentes a farmacos tales como Glivec es parcialmente confusa, pero los factores que pueden contribuir son caracteristicas tales como quietud y un nivel relativamente alto de expresion de BCR/ABL1, pero tambien la expresion combinada de proteinas especificas de transportadoras de membrana en estas celulas356. Dadas estas caracteristicas de las celulas madre de LMC, es sumamente deseable encontrar enfoques novedosos de tratamiento para finalmente erradicar las celulas madre de LMC. Una terapia a base de anticuerpos apuntando directamente a las celulas madre de LMC serviria en tal estrategia ya que el modo de accion de los anticuerpos es independiente de los mecanismos de resistencia conocidos que causan que las celulas madre de LMC no respondan a los tratamientos inhibidores de cinasa. Las limitaciones principales para tales desarrollos han sido la falta completa de un receptor de superficie celular que distingue LMC+ Ph+ de las celulas madre normales, sanos (Ph-). En el presente documento, los inventores identificaron a la IL1RAP como tal diana de los analisis de expresion global de genes y se ligo de manera importante su expresion a la expresion de BCR/ABL1 (vease el Ejemplo 1 anterior).
De manera Importante, por la generacion de un anticuerpo dirigido a IL1RAP, en el presente documento, los inventores, por primera vez, proporcionaron prueba de concepto de que las celulas madre de LMC candidatos pueden ser apuntados mientras al mismo tiempo se preserva la CMH normal. De manera Importante, ya que el modo de accion de los anticuerpos en CCDA es dirigir celulas inmunologicas a la destruccion de las celulas diana, los mecanismos terapeuticos son independientes de los mecanismos conocidos que causan resistencia al inhibidor de tirosina cinasa en LMC utilizando tratamientos actuales. Entonces, el direccionamiento de anticuerpo de celulas madre de LMC tiene la capacidad de erradicar las celulas madre de LMC, ya sea solo o en combinacion con los regimenes actuales, llevando finalmente a una cura permanente para pacientes de LMC.
De manera interesante, los inventores tambien observaron que los anticuerpos dirigidos a IL1RAP pueden causar CCDA de las celulas madre de LMA; el tipo mas comun de leucemia aguda entre adultos que tienen un pronostico malo, y tambien las celulas madre de LLA; el tipo mas comun de leucemia infantil. En conjunto, el hallazgo de expresion de la IL1RAP en las celulas madre leucemicas que tienen un inmunofenotipo de CD34+CD38- en LMC, en LMA, LLA, SMD, y TMP, y los experimentos de CCDA que demuestran muerte celular de una manera dependiente de IL1RAP, indica que estos trastornos pueden tratarse con anticuerpos terapeuticos anti-ILIRAP.
En los experimentos de CCDA presentados en el presente documento se utilizo un anticuerpo policlonal anti-ILIRAP humano (que es en esencia una mezcla de varios anticuerpos monoclonales diferentes). Sin embargo, los expertos en la tecnica apreciaran que tambien pueden identificarse anticuerpos monoclonales individuales dirigidos a IL1RAP que tengan potencial de CCDA.
Referencias
1. Wilkinson RW, Lee-MacAry AE, Davies D, Snary D, Ross EL. Antibodydependent cell-mediated cytotoxicity: a flow cytometry-based assay using fluorophores. J Immunol Methods. 2001;258:183-191.
2. Morris JC, Waldmann tA. Antibody-based therapy of leukaemia. Expert Rev Mol Med. 2009;11 :e29.
3. Copland M, Hamilton A, Elrick LJ, et al. Dasatinib (BMS-354825) targets an earlier progenitor population than imatinib in primary LMC but does not eliminate the quiescent fraction. Blood. 2006;107:4532-4539.
4. Jorgensen HG, Allan EK, Jordanides NE, Mountford JC, Holyoake TL. Nilotinib exerts equipotent antiproliferative effects to imatinib and does not induce apoptosis in CD34* CML cells. Blood. 2007;109:4016-4019.
5. Graham SM, Jorgensen HG, Allan E, et al. Primitive, quiescent, Philadelphiapositive stem cells from patients with chronic myeloid leukemia are insensitive to STI571 in vitro. Blood. 2002;99:319-325.
6. Jiang X, Zhao Y, Smith C, et al. Chronic myeloid leukemia stem cells possess multiple unique features of resistance to BCR-ABL targeted therapies. Leukemia. 2007;21:926-935.
EJEMPLO 3 Expresion genica en tumores solidos
Materiales y metodos
Utilizando el motor de busqueda Oncomine (www.oncomine.org), los inventores identificaron todos los conjuntos de datos que contenian varias lineas celulares establecidas de diferentes tipos de tumor. El conjunto de datos mas grande identificado fue el conjunto de datos "Wooster Cell Line2". Este conjunto de datos contiene 308 lineas celulares de cancer, representando 20 tipos diferentes de tumor. El termino de consulta utilizado fue "IL1 RAP" con el parametro indicador "205277_at".
Resultados
En total, los inventores identificaron 17 tipos diferentes de tumor solido que estaban representados por lineas celulares que cumplen sus criterios para una expresion regulada por aumento de IL1RAP (vease la tabla 1). El porcentaje de lineas celulares dentro de cada tipo de tumor que muestra regulacion por aumento de IL1 RAP vario de 4 % (cancer colorrectal) a 67 % (melanoma, cancer de prostata). Entre los tipos de tumor, los inventores identificaron algunas de las entidades de cancer mas comunes en seres humanos, incluyendo neoplasias malignas de mama, colon, pulmon, prostata y vejiga. Ademas, algunos tipos de tumor asociados a resultados clinicos malos, tales como melanoma y tumores cerebrales mostraron una expresion altamente regulada por aumento de IL1 RAP.
Conclusiones
Los inventores concluyeron que varias entidades tumorales diferentes muestran un nivel de expresion genica de IL1 RAP regulada por aumento.
Estos datos indican que el tratamiento con anticuerpos dirigidos contra IL1RAP proporcionara una nueva via terapeutica en varios tipos diferentes de cancer humano.
Tabla 1
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EJEMPLO 4 - Analisis de la expresion de IL1 RAP en lineas celulares humanas mediante citometria de flujo Materiales y metodos
Reactivos
• Bloqueadores del receptor Fc de BD Biosciences
o CD16 anti-humano (n.° de cat. 555404)
o CD32 anti-humano (n.° de cat. 555447)
• Control de isotipo IgG1 k APC-raton (n.° de cat. 555751) de BD Biosciences
• IL-1 RAcP/IL-1 R3-APC anti-humano (cat no FAB676A) de R&D system
Lneas celulares
Tabla 2
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Las lineas celulares se cultivaron en condiciones estandar en el medio recomendado por los proveedores.
Analisis de FACS
Las celulas (350 000) se resuspendieron en 2 ml de tampon para FACS (PBS sin suplementacion con calcio ni magnesio con 0,5 % de BSA), y se centrifugaron durante 4 minutos a 300 x g. El sobrenadante se desecho y los receptores de Fc se bloquearon incubando las celulas con mAb anti-CD16/CD32 a una concentracion de 3 |jg/ml en un volumen de 30 j l durante 5 minutos a temperatura ambiente. Despues se anadieron 55 j l de tampon para FACS y 4 j l de anticuerpo de isotipo marcado con APC o 5 j l de anticuerpo monoclonal marcado con APC dirigido contra IL1 RAP humana a las celulas y se incubaron durante 30 minutos a 4 °C. Las celulas se lavaron con 3 ml de tampon para FACS, se centrifugaron durante 4 minutos a 300 x g y se desecho el sobrenadante. Por ultimo, se resuspendieron las celulas en 200 j l de tampon para FACS y se realizo el analisis de citometria de flujo de acuerdo con los parametros estandar en un citometro de flujo FACS Cantoll (BD Biosciences).
Resultados
Los niveles de expresion de IL1RAP en las lineas celulares de tumor solido analizadas se muestran en la tabla 3 siguiente y en la Figura 11.
Tabla 3
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Conclusiones
La expresion de IL1RAP fue observada en las lmeas celulares de tumor solido NCI-H2228, NCI-H716, HCC1954, SR, OV-90, COLO 829, SH-4 y SW 1783. La expresion en estas lineas celulares fue comparable o mas alta que esa en la linea celular de leucemia mieloide cronica humana KU-812.
EJEMPLO 5 Dirigir los anticuerpos de IL1RAP a las celulas de tumor solido causa citotoxicidad mediada por celulas dependiente de anticuerpos (CCDA)
Materiales y metodos
Desarrollo y produccion del anticuerpo monoclonal quimerico 81.2 hIgGI.
Una linea celular de hibridoma murino que secretaba anticuerpos monoclonal especificos de la parte extracelular de IL1RAP humana se genero mediante procedimientos estandar. Brevemente, se inmunizo a ratones BALB/C con una proteina de fusion que consiste en la parte extracelular de IL1RAP y la parte de Fc de IgG1 humana (Pro100-Lys330). Los esplenocitos se fusionaron con la linea celular de mieloma de raton Sp2/0 y los clones productores y los anticuerpos dirigidos contra la parte extracelular de IL1RAP se aislaron mediante deteccion selectiva con la proteina de fusion utilizada para las inmunizaciones y se sometieron a contraseleccion con IgG 1 humana.
El anticuerpo producido por el clon de la linea celular de hibridoma 81.2 fue del tipo de IgG1/kappa y se encontro que tenia una especificidad alta por celulas positivas a IL1RAP y la proteina recombinante humana ILlRAP (21-367). De esta linea celular, se aislo el ARN total y el ADNc que representa las regiones variables de las cadenas pesada y ligera, VH y VK, se amplifico mediante PCR, se clono y se secuencio.
El elemento genetico que codifica la VK murina en el marco con la parte constante de gen kapa humano se sintetizo y se clono en un vector de expresion de mamifero plasmidico.
El fragmento de PCR que codifica para la VH murino se combino con las partes constantes de IgG 1 humana y se clono en un vector de expresion de mamifero plasmidico.
Las celulas HEK 293 se cotransfectaron con ambos plasmidos y las celulas se cultivaron en medio sin suero suplementado con 100 ng/ml de kifunensina. El anticuerpo quimerico 81.2 hIgG1 se purifico del medio de cultivo mediante cromatografia de Proteina G.
Citometna de flujo
Se recogieron celulas de cuatro lineas celulares diferentes de cancer solido humano, H2228 (adenocarcinoma; cancer de pulmon no microcitico), H716 (adenocarcinoma colorrectal), HCC1954 (carcinoma ductal de mama), y SH-4 (melanoma) y se tineron con mab81.2, un anticuerpo anti-IL1RAP humano (Cantargia AB, Lund, Suecia). Para la deteccion, las celulas se tineron con un anticuerpo IgG anti-humano secundario conjugado con PE (Thermo-Fisher, Waltham, MA), y las celulas se analizaron utilizando un citometro de flujo FACS CANTO (BD Immunocyteometry Systems, Mountain View, CA).
Ensayo de CCDA
El ensayo de CCDA se baso en un protocolo descrito anteriormente (vease el Ejemplo 2 anterior). En breve, las celulas diana se marcaron con PKH26 (Sigma-Aldrich, St Louis, MO) de acuerdo con las instrucciones del fabricante, y se sembraron en una placa de 96 pocillos a una densidad de 10.000 celulas por pocillo. Despues, se anadieron anticuerpos a los pocillos a concentraciones diferentes y se incubaron durante 30 minutos antes que anadir 100.000 celulas efectoras NK a cada pocillo. Las celulas NK se extrajeron de voluntarios sanos despues de que dieran su consentimiento informado utilizando un kit de aislamiento de celulas negativo para celulas NK de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Alemania). Un anticuerpo IgG1 humano no espedfico se uso como control en los experimentos (Eureka Therapeutics, Emeryville, CA).
El grado de muerte celular se evaluo mediante deteccion de las celulas positivas para 7 AAD utilizando un citometro de flujo FACS CANTO (BD). El nivel de muerte celular inducida por anticuerpos se calculo segun la ecuacion siguiente: Porcentaje de celulas 7 AAD a la concentracion de anticuerpo definida - Porcentaje de celulas 7 AAD sin anticuerpo.
Resultados
Un anticuerpo contra IL1RAP humano marca las celulas cancerosas no leucemicas humanas en la citometria de flujo, y dirige las celulas NK a CCDA, dando como resultado la muerte de las celulas cancerosas humanas
Los inventores han mostrado que KMT1, un anticuerpo policlonal contra la IL1RAP humana, puede dirigir las celulas NK a CCDA, e inducir la muerte celular de la linea celular KU812 de LMC de alta expresion de IL1RAP, pero no en las celulas KG1 de baja expresion de IL1RAP (vease el Ejemplo 2 anterior).
Los resultados del presente estudio muestran que no solo las celulas leucemicas son sensibles a la CCDA mediada por IL1RAP, sino tambien las celulas de canceres humanos solidos. Se estudiaron cuatro lineas celulares de cancer humano diferentes, representando cuatro tipos diferentes de cancer humanos solido y todas mostraron expresion de IL1RAP en la superficie celular (Fig. 12).
Tambien se demostro que las cuatro lineas celulares analizadas eran sensibles a la CCDA mediada por mab81.2, un anticuerpo contra la IL1 RAP humana, en lo que parece ser una manera dependiente de la dosis (Fig. 13).
Conclusion
El presente estudio confirma que la IL1RAP se expresa en la superficie celular de varios tipos de cancer humano, incluyendo cancer de pulmon, cancer de colon, cancer de mama, y melanoma maligno.
Utilizando un anticuerpo dirigido contra la IL1RAP, se mostro que las celulas de las cuatro lineas celulares de tumor solido eran una diana de la muerte mediada por NK especificas en un ensayo de CCDA.
EJEMPLO 6 Eficacia del anticuerpo monoclonal 81.2 in vivo en un modelo de xenoinjerto en raton SK-MEL-5 de melanoma humano
Materiales y metodos
Desarrollo y produccion del anticuerpo monoclonal de raton 81.2 de isotipo IgG 1 e IgG2a.
Una linea celular de hibridoma murino que secretaba anticuerpos monoclonal especificos de la parte extracelular de la IL1RAP humana se genero mediante procedimientos estandar. Brevemente, se inmunizo a ratones BALB/C con una proteina de fusion que consiste en la parte extracelular de IL1RAP y la parte de Fc de IgG 1 humana (Pro100-Lys330). Los esplenocitos se fusionaron con la linea celular de mieloma de raton Sp2/0 y los clones productores y los anticuerpos dirigidos contra la parte extracelular de IL1RAP se aislaron mediante deteccion selectiva con la proteina de fusion utilizada para las inmunizaciones y se sometieron a contraseleccion con IgG 1 humana.
El anticuerpo producido por el clon de la linea celular de hibridoma 81.2 fue del tipo de IgG1/kappa y se encontro que tenia una especificidad alta por las celulas positivas a IL1RAP y la proteina recombinante humana IL1RAP (21­ 367). De esta linea celular, se aislo el ARN total y el ADNc que representa las regiones variables de las cadenas pesada y ligera, VH y VK, se amplificaron mediante PCR, se clonaron y se secuenciaron.
El elemento genetico que codifica para la VK murina en marco con la parte constante del gen kapa murino se sintetizo y se clono en un vector de expresion de mamifero plasmidico.
El fragmento de PCR que codifica la VH murina se combino con las partes constantes de IgG2a murina y se clono en un vector de expresion de mamifero plasmidico.
Las celulas HEK 293 se cotransfectaron con ambos plasmidos y las celulas se cultivaron en medio sin suero. El anticuerpo de raton 81,2 de isotipo de IgG2a se purifico del medio de cultivo mediante cromatografia de Proteina G. Citometria de flujo
Para confirmar la expresion de IL1RAP en la linea celular de melanoma maligno humano, SK-MEL-5, y comparar la expresion con la linea celular de LMC humano KU812, ambas lineas celulares se cultivaron segun procedimientos estandar y se mantuvieron en fase de crecimiento logaritmico. En la recogida celular se marcaron 3,5 - 5,0 x 105 celulas/ml con el anticuerpo monoclonal de raton IgG 181.2 a 1 - 50|jg/ml. Un anticuerpo control de isotipo de IgG 1 se uso como control. La tincion se analizo utilizando el Citometro de Flujo Accuri C6.
Farmacos y Tratamiento
Tabla 4
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Administracion in vivo de mAb espeafico de IL1RAP humano 81.2 o vehculo
Ratones CD.17 SCID hembra de ocho a 12 semanas de edad recibieron una inyeccion, por via subcutanea en el costado, de 1 x 107 celulas tumorales SK-MEL-5 en 50 % de Matrigel por animal. El tratamiento se inicio aproximadamente una semana despues de la inyeccion de las celulas de melanoma cuando los tumores habian alcanzado un tamano de 108 - 128 mm3. Se realizo un emparejamiento del tamano del tumor en 20 animales dando 10 ratones cada uno en los dos grupos de tratamiento.
Un anticuerpo monoclonal IgG2a de raton 81.2, se preparo a una dosis de 10 mg/kg y con un volumen de 10 ml/kg en PBS. A los animales de control se les dio volumenes iguales de PBS. Los tratamientos se administraron por via intraperitoneal. El volumen del tumor mediante determinacion con calibrador y los pesos totales se controlaron dos veces a la semana.
El criterio de valoracion del estudio es el retraso del crecimiento tumoral.
Resultados
Citometria de flujo
Tabla 5
Expresion de IL1RAP en la linea celular de melanoma humana SK-MEL-5 y la linea celular de LMC humana KU812.
Los valores representan la intensidad media de fluorescencia
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Soo secu da a jg/ 309
Actividad in vivo de mAb 81.2 a modo de ejemplo
El analisis del estudio en el dia 33 desde el comienzo de la dosificacion mostro una demora estadisticamente significativa en el crecimiento del tumor en el grupo de tratamiento en comparacion al grupo de control en los dias 22 (P<0.05), 26 y 29 (p<0.001) y el dia 33 (p<0.0001) (vease la Figura 14).
Conclusion
La expresion de IL1 RAP fue confirmada por citometria de flujo en la linea celular de tumor de melanoma SK-MEL-5 y mostro una expresion que fue mas alta que esa en la linea celular de leucemia mieloide cronica humana KU-812. Los datos in vivo indican que el anticuerpo monoclonal especifico de IL1RAP, 81,2, administrado dos veces por semana a una dosis de 10 mg/kg, causo inhibition en el crecimiento de las celulas de tumor de la linea celular de melanoma humano que expresa IL1RAP, SK-MEL-5.

Claims (13)

REIVINDICACIONES
1. Un agente que comprende o consiste en un anticuerpo, o un fragmento de union a antigeno del mismo, en donde el anticuerpo es espedfico para la protema accesoria del receptor de interleucina-1 (IL1RAP) para su uso en el tratamiento o la prevencion de un cancer en un paciente, en donde el cancer es un tumor solido que tiene celulas que expresan IL1RAP.
2. Un agente para su uso de acuerdo con la 1, en donde re eliv tuinmdoirca socliidóon se selecciona del grupo que consiste en cancer de prostata, cancer de mama, cancer de pulmon, cancer colorrectal, melanomas, cancer de vejiga, cancer de cerebro/SNC, cancer de cuello uterino, cancer esofagico, cancer gastrico, cancer de cabeza/cuello, cancer de rinon, cancer de higado, linfomas, cancer de ovario, cancer de pancreas y sarcomas.
3. Un agente para su uso de acuerdo con las reivindicaciones 1 o 2, en donde el tumor solido se selecciona del grupo que consiste en cancer de pulmon, de colon, de mama, linfoma, cancer de ovario, cancer de pancreas, melanoma y astrocitoma.
4. Un agente para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el agente es capaz de destruir las celulas asociadas al tumor solido.
5. Un agente para su uso de acuerdo con la 4, en donde e rel aivgienndteic easci cóanpaz de inducir la apoptosis de las celulas asociadas al tumor solido.
6. Un agente para su uso de acuerdo con la 4, en donde re liavi dnedsitcruaccciióonn de las celulas esta inducida por citotoxicidad mediada por celulas dependiente de anticuerpos (CCDA).
7. Un agente para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el agente es capaz de bloquear la union de uno o mas co-receptores a IL1RAP.
8. Un agente para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el agente comprende o consiste en un anticuerpo intacto.
9. Un agente para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde el agente comprende o consiste en un fragmento de union a antigeno de un anticuerpo.
10. Un agente para su uso de acuerdo con la 9, en don redeivi enld fircaagmcieónnto de union a antigeno se selecciona del grupo que consiste en fragmentos Fv (por ejemplo, Fv de cadena sencilla, Fv unido por disulfuro y anticuerpos de dominio) y fragmentos similares a Fab (por ejemplo, fragmentos Fab, fragmentos Fab' y fragmentos F(ab)2).
11. Un agente para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el anticuerpo, o el fragmento de union a antigeno del mismo, es un anticuerpo humano o un anticuerpo humanizado.
12. Un agente para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende ademas un resto para aumentar la semivida in vivo del agente.
13. Un agente para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende ademas un resto citotoxico.
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