JP5940093B2 - 抗ｉｌ−１ｒａｐ抗体及びヒトを処置するためのそれらの使用 - Google Patents

Description

発明の分野
本発明は、固形腫瘍、例えば前立腺癌、乳癌、肺癌、大腸癌、黒色腫、膀胱癌、脳／ＣＮＳ腫瘍（brain/CNS cancer）、子宮頸癌、食道癌、胃癌、頭頸部癌、腎臓癌、肝臓癌、リンパ腫、卵巣癌、膵臓癌、及び肉腫の処置及び診断における使用のための薬剤に関する。

背景
薬剤耐性は、固形腫瘍における化学療法の有効性を制限する主要な因子である。このような腫瘍は、化学療法の前に本質的に耐性であり得るか、又は耐性は、化学療法に最初は感受性である腫瘍により処置の間に獲得され得る。

さらに、耐性を獲得する過程において、腫瘍は様々な範囲の化学療法に対して交差耐性になり得、そして耐性を生じ、これは最終的に転移性疾患を有する患者の患者の９０％より多くで処置の失敗をもたらす。

従って、本発明は、固形腫瘍の処置及び診断における使用のための新しい薬剤及び方法を提供することを探求する。

発明の要旨
本発明の第一の局面は、固形腫瘍に関連する細胞の、細胞死を誘導し（直接的か又は免疫系の誘発を介する間接的のいずれか）、かつ／又は成長（すなわち寸法）及び／若しくは増殖（すなわち数）を阻害するのに使用するための、インターロイキン−１受容体アクセサリータンパク質（IL1RAP）に対する特異性を有する結合部分を含むか、又は該結合部分からなる薬剤を提供し、ここで該細胞はIL1RAPを発現する。従って、本発明は、患者において固形腫瘍を処置又は予防するのに使用するための薬剤を提供する。

本発明の第二の関連する局面は、固形腫瘍に関連する細胞を検出するのに使用するための、インターロイキン−１受容体アクセサリータンパク質（ＩＬ１ＲＡＰ）に対する特異性を有する結合部分を含むか、又は該結合部分からなる薬剤を提供し、ここで該細胞はＩＬ１ＲＡＰを発現する。

「インターロイキン−１受容体アクセサリータンパク質（accessory protein）」、「IL1RAP」及び「IL1-RAP」により、我々は、例えばGenBank受入番号AAB84059、NCBI参照配列：NP_002173.1及びUniProtKB／Swiss-Prot受入番号Q9NPH3-1（Huang et al.、1997、Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 94 (24)、12829-12832も参照のこと）に記載されるようなヒトIL1RAPタンパク質を具体的に含める。IL1RAPは、科学文献においてIL1R3、C3orf13、FLJ37788、IL-1RAcP及びEG3556としても知られる。

「結合部分」により、我々は、IL1RAPに結合することができる全ての種類の化学物質（例えば、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、ペプチド模倣物及び小分子化合物）を含める。有利には、結合部分は生理条件下でIL1RAPに選択的に（すなわち優先的に）結合することができる。結合部分は、好ましくはヒトIL1RAPに対する特異性を有し、これは細胞（例えば固形腫瘍細胞）表面上に局在し得る。

「固形腫瘍に関連する細胞」により、我々は、固形腫瘍細胞自体を含める。さらに、このような細胞としては、病的幹細胞（すなわち癌幹細胞、又はCSC）及び個体における固形腫瘍の発達の直接的又は間接的な原因である前駆細胞が挙げられる。CSCの例はVisvader & Lindeman、2008、Nat Rev Cancer 8:755-768において開示される。

本発明の第一の局面の一実施態様において、固形腫瘍は、前立腺癌、乳癌、肺癌、大腸癌、黒色腫、膀胱癌、脳／ＣＮＳ腫瘍、子宮頸癌、食道癌、胃癌、頭頸部癌、腎臓癌、肝臓癌、リンパ腫、卵巣癌、膵臓癌、及び肉腫からなる群より選択される。例えば、固形腫瘍は、前立腺、乳房、皮膚、結腸、肺、泌尿器及び子宮の癌からなる群より選択され得る。別の実施態様において、固形腫瘍は前立腺癌、黒色腫、子宮頸癌、食道癌、及び頭部及び／又は頸部の癌からなる群より選択され得る。

本発明の第一の局面のさらなる実施態様において、固形腫瘍は黒色腫である。

本発明の診断的局面に関連して、薬剤が、固形腫瘍に関連する細胞の表面上に存在するIL1RAPに（それらの細胞に対していずれの機能的な影響を及ぼすことなく）単に結合することができるだけで十分である。

本発明の治療的及び予防的局面に関連して、当業者には当然のことながら、固形腫瘍に関連する細胞の表面上に存在するIL1RAPへの薬剤の結合は、IL1RAPの生物学的活性の調節（すなわち、増加又は減少）をもたらし得る。しかし、このような調節効果は必須ではない；例えば、本発明の薬剤は、固形腫瘍に関連する細胞の表面上のIL1RAPに単に結合するために治療的及び予防的効果を誘発し得、そしてそれが今度は免疫系の細胞死誘導を引き起こし得る（例えば、ADCCにより、かつ／又は細胞傷害性／放射性部分の薬剤内の存在により）。

「IL1RAPの生物学的活性」により、我々は、固形腫瘍に関連する細胞上のIL1RAPが関与するいずれの相互作用又はシグナル伝達事象も含める。例えば、一実施態様において、薬剤は１つ又はそれ以上の補助受容体のIL1RAP（例えばIL1R1、ST2、C-KIT及び／又はIL1RL2）への結合を遮断することができる。

本発明の薬剤によるIL1RAPの生物学的活性のこのような阻害は、全体的でも部分的でもよい。例えば、薬剤は、IL1RAPの生物学的活性を、薬剤に曝露されていない固形腫瘍に関連する細胞におけるIL1RAPの生物学的活性と比較して、少なくとも10％、好ましくは少なくとも20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％又は90％だけ阻害し得、そして最も好ましくは100％阻害し得る。好ましい実施態様において、薬剤は、薬剤に曝露されていない固形腫瘍に関連する細胞におけるIL1RAPの生物学的活性と比較してIL1RAPの生物学的活性を50％阻害することができる。

同様に、当然のことながら、固形腫瘍に関連する細胞の成長及び／又は増殖の阻害は、全体的でも部分的でもよい。例えば、薬剤は、薬剤に曝露されていない固形腫瘍に関連する細胞の成長及び／又は増殖と比較して、固形腫瘍に関連する細胞の成長及び／又は増殖を、少なくとも10％、好ましくは少なくとも20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％又は90％阻害し得、そして最も好ましくは100％阻害し得る。

さらなる好ましい実施態様において、薬剤は、固形腫瘍に関連する細胞を死滅させることができる。特に、薬剤はアポトーシス又は自家融解により細胞死させるこことができるかもしれない。例えば、薬剤は、抗体依存性細胞介在性細胞傷害（ADCC）によりアポトーシスを誘導し得る。

上で示したように、本発明の薬剤は、IL1RAPに対する特異性を有する結合部分を構成するいずれかの適切な化学物質を含み得るか又は該化学物質からなり得る。

試験化学物質とIL1RAPとの間の相互作用を検出するための方法は当該分野で周知である。例えば、イオンスプレー質量分析法／HPLC法を用いる限外濾過又は他の物理的及び分析方法が使用され得る。さらに、蛍光共鳴エネルギー移動（Fluorescence Energy Resonance Transfer）（FRET）法が使用され得、この方法では、２つの蛍光標識実体の結合が、互いに近位にある場合の蛍光標識の相互作用を測定することにより測定され得る。

IL1RAPの高分子、例えばDNA、RNA、タンパク質及びリン脂質への結合を検出する代替の方法としては、例えばPlant et al.、1995、Analyt Biochem 226(2)、342-348に記載されるような表面プラズモン共鳴アッセイが挙げられる。このような方法は、例えば放射性又は蛍光性の標識で標識されたポリペプチドを利用し得る。

IL1RAPに結合することができる化学物質を同定するさらなる方法は、タンパク質が化合物に曝露され、そして化合物の上記タンパク質へのいずれかの結合が検出及び／又は測定されるものである。化合物のポリペプチドへの結合についての結合定数が決定され得る。化合物のポリペプチドへの結合を検出及び／又は測定（定量）するために適した方法は当業者に周知であり、そしてハイスループット操作ができる方法、例えばチップベースの方法を使用して行われ得る。VLSIPS^TMと呼ばれる新しい方法は、何十万又はそれ以上の異なる分子プローブを含有する非常に小さいチップの製造を可能にした。これらの生物学的チップはアレイで（in arrays）配置されたプローブを有し、各プローブは特定の位置に帰属される。各位置が例えば１０ミクロンの規模を有する生物学的チップが製造されてきた。これらのチップは、チップ上のいずれかのプローブと標的分子が相互作用するかどうかを決定するために使用され得る。アレイを選択された試験条件下で標的分子に曝露した後、走査デバイスはアレイ中の各位置を調べて、標的分子がその位置のプローブと相互作用したどうかを決定することができる。

IL1RAPに対する結合親和性を有する化合物を同定するための別の方法は酵素ツーハイブリッド系であり、この場合本発明のポリペプチドは、IL1RAPに結合するタンパク質を「捕捉する」ために使用され得る。酵母ツーハイブリッド系はFields & Song、Nature 340:245-246 (1989)において記載される。

１つの好ましい実施態様において、薬剤はポリペプチドを含むか、又はポリペプチドからなる。

例えば、薬剤は、ＩＬ１ＲＡＰに対する結合特異性を有する抗体若しくはその抗原結合フラグメント、又はＩＬ１ＲＡＰに対する結合特異性を保持している、該抗体若しくは抗原結合フラグメントの変異体、融合体若しくは誘導体、若しくは該変異体若しくはその誘導体の融合体を含み得るかまたはこれらからなるものであり得る。

「抗体」により、我々は、実質的にインタクトな抗体分子、さらにはキメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体（ここで少なくとも１つのアミノ酸は天然に存在するヒト抗体と比較して変異している）、単鎖抗体、二重特異性抗体、抗体重鎖、抗体軽鎖、抗体重鎖及び／又は軽鎖のホモダイマー及びヘテロダイマー、並びに抗原結合フラグメント及びそれらの誘導体を含める。

「抗原結合フラグメント」により、我々は、IL1RAPに結合することができる抗体の機能的フラグメントを意味する。

好ましくは、抗原結合フラグメントは、Fvフラグメント（例えば、単鎖Fv及びジスルフィド結合Fv）、Fab様（Fab-like）フラグメント（例えば、Fabフラグメント、Fab'フラグメント及びF(ab)₂フラグメント）、単一可変ドメイン（例えばV_H及び_Lドメイン）及びドメイン抗体（dAb、単一及び二重形式［すなわち、dAb−リンカー−dAb］を含む）からなる群より選択される。

抗体全体ではなく抗体フラグメントを使用する利点は数倍である。より小さいサイズのフラグメントは、固形組織のより良好な浸透のような改善された薬理学的特性をもたらし得る。さらに、Fab、Fv、ScFv及びdAb抗体フラグメントのような抗原結合フラグメントは、E.coliで発現されて分泌され得、従ってそれらのフラグメントの容易な大量生産を可能にする。

抗体及びその抗原結合フラグメントの改変されたバージョン、例えばポリエチレングリコール又は他の適切なポリマーの共有結合により改変されたバージョンもまた本発明の範囲内に含まれる（以下を参照のこと）。

抗体及び抗体フラグメントを生成する方法は当該分野で周知である。例えば、抗体は、抗体分子のインビボ産生の誘導、免疫グロブリンライブラリーのスクリーニング（Orlandi. et al、1989. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86:3833-3837; Winter et al.、1991、Nature 349:293-299）又は細胞株による培養でのモノクローナル抗体分子の生成を使用するいくつかの方法のうちのいずれか１つにより生成され得る。これらとしては、限定されないが、ハイブリドーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術、及びエプスタイン・バーウイルス（EBV）−ハイブリドーマ技術（Kohler et al.、1975. Nature 256:4950497; Kozbor et al.、1985. J. Immunol. Methods 81:31-42; Cote et al.、1983. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:2026-2030; Cole et al.、1984. Mol. Cell. Biol. 62:109-120）が挙げられる。

選択された抗原に対する適切なモノクローナル抗体は、公知の技術、例えば「Monoclonal Antibodies: A manual of techniques」、H Zola (CRC Press、1988）及び「Monoclonal Hybridoma Antibodies: Techniques and Applications」、J G R Hurrell (CRC Press、1982）に開示されるものにより製造され得る。

同様に、抗体フラグメントは、当該分野で周知の方法(例えば、Harlow & Lane、1988、「Antibodies: A Laboratory Manual」、Cold Spring Harbor Laboratory、New Yorkを参照のこと）を使用して得ることができる。例えば、本発明に従う抗体フラグメントは、抗体のタンパク質分解加水分解により、又はフラグメントをコードするDNAのE.coli若しくは哺乳動物細胞（例えばチャイニーズハムスター卵巣細胞培養又は他のタンパク質発現系）における発現により製造され得る。あるいは、抗体フラグメントは、従来の方法により抗体全体のペプシン又はパパイン消化により得ることができる。

当業者には当然のことながら、ヒトの治療又は診断には、ヒト抗体又はヒト化抗体が好ましく使用される。非ヒト（例えばマウス）抗体のヒト化形態は、遺伝子操作されたキメラ抗体又は非ヒト抗体に由来する好ましい最小部分を有する抗体フラグメントである。ヒト化抗体には、ヒト抗体（レシピエント抗体）の相補性決定領域が所望の機能を有する非ヒト種（ドナー抗体）、例えばマウス、ラットのウサギ（rat of rabbit）の相補性決定領域由来の残基で置き換えられている抗体が含まれる。いくつかの例では、ヒト抗体のFvフレームワーク残基が、対応する非ヒト残基で置き換えられる。ヒト化抗体はまた、レシピエント抗体中にも移入された相補性決定領域又はフレームワーク配列にも見られない残基も含み得る。一般的に、ヒト化抗体は少なくとも１つ、及び典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含み、ここで、相補性決定領域の全て又は実質的に全てが非ヒト抗体の相補性決定領域に対応し、そしてフレームワーク領域の全て、又は実質的に全てが関連するヒトコンセンサス配列のフレームワーク領域に対応する。ヒト化抗体はまた、最適には、典型的にはヒト抗体に由来する抗体定常領域、例えばFc領域の少なくとも一部も含む（例えば、Jones et al.、1986. Nature 321:522-525; Riechmann et al.、1988、Nature 332:323-329; Presta、1992、Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596を参照のこと）。

非ヒト抗体をヒト化するための方法は当該分野で周知である。一般的には、ヒト化抗体は非ヒトである供給源からそれに導入された1つ又はそれ以上のアミノ酸残基を有する。これらの非ヒトアミノ酸残基（しばしば移入残基と呼ばれる）は、典型的は移入された可変ドメインから取られる。ヒト化は、本質的には記載されたように（例えば、Jones et al.、1986、Nature 321:522-525; Reichmann et al.、1988. Nature 332:323-327; Verhoeyen et al.、1988、Science 239:1534-1536l; US 4,816,567を参照のこと）、ヒト相補性決定領域を対応する齧歯動物の相補性決定領域と置き換えることにより行われ得る。従って、このようなヒト化抗体はキメラ抗体であり、ここで実質的にインタクトなヒト可変ドメインより少ないものが非ヒト種からの対応する配列で置き換えられている。実際には、ヒト化抗体は典型的にはいくつかの相補性決定領域残基及び場合によりいくつかのフレームワーク残基が齧歯動物抗体における類縁部位からの残基で置き換えられているヒト抗体であり得る。

ヒト抗体はまた、ファージディスプレイライブラリーを含む当該分野で公知の様々な技術を使用して同定され得る（例えば、Hoogenboom & Winter、1991、J. Mol. Biol. 227:381; Marks et al.、1991、J. Mol. Biol. 222:581; Cole et al.、1985、In: Monoclonal antibodies and Cancer Therapy、Alan R. Liss、pp. 77; Boerner et al.、1991. J. Immunol. 147:86-95を参照のこと）。

適切な抗体が得られれば、それらを活性について、例えばELISAにより試験し得る。

本発明の第一の局面の代替の実施態様において、薬剤は、例えばSkerra、Curr Opin Biotechnol. 2007 Aug;18(4):295-304に記載されるような非免疫グロブリン結合部分を含むか、又は非免疫グロブリン結合部分からなる。

さらなる代替の実施態様において、薬剤はアプタマーを含むか、又はアプタマーからなる。例えば、薬剤はペプチドアプタマー若しくは核酸アプタマーを含むか、またはペプチドアプタマー若しくは核酸アプタマーからなる（Hoppe-Seyler & Butz、2000、J Mol Med. 78 (8): 426-30; Bunka DH & Stockley PG、2006、Nat Rev Microbiol. 4 (8): 588-96 and Drabovich et al.、2006、Anal Chem. 78 (9): 3171-8を参照のこと）。

なおさらなる代替の実施態様において、薬剤は低分子化学物質（small chemical entity）を含むか、または低分子化学物質からなる。IL1RAP結合特性を有するこのような実体は、低分子化合物の商業的ライブラリー（例えば、ChemBridge Corporation、San Diego、USAから利用可能なもの）をスクリーニングすることにより同定され得る。

結合部分に加えて、本発明の薬剤は、薬剤のインビボ半減期を延長させるための部分、例えば、限定されないが、ポリエチレングリコール（PEG）、ヒト血清アルブミン、グリコシル化基、脂肪酸及びデキストランをさらに含み得る。このようなさらなる部分は、当該分野で周知の方法を使用して結合部分に結合されても、その他の方法で組み合わされてもよい。

同様に、当然のことながら、本発明の薬剤は細胞傷害性部分をさらに含み得る。

例えば、細胞傷害性部分は、アスタチン−211、ビスマス−212、ビスマス−213、ヨウ素−131、イットリウム−90、ルテチウム−177、サマリウム−153及びパラジウム−109のような放射性同位体を含んでいてもよく、または放射性同位体からなるものであってもよい。

あるいは、細胞傷害性部分は、毒素（例えばサポリン又はカリケアミシン）を含んでいても、毒素からなるものであってもよい。

さらなる代替において、細胞傷害性部分は化学療法剤（例えば代謝拮抗薬）を含んでいても、化学療法剤からなるものであってもよい。

同様に、当然のことながら、本発明の薬剤は検出可能な部分をさらに含み得る。

例えば、検出可能な部分は、テクネチウム（technitium）−99m、インジウム−111、ガリウム−67、ガリウム−68、ヒ素−72、ジルコニウム−89、ヨウ素−12又はタリウム−201のような放射性同位体を含んでいても、放射性同位体からなるものであってもよい。

あるいは、検出可能な部分は、ガドリニウム−157、マンガン−55、ジスプロシウム−162、クロム−52又は鉄−56のような常磁性同位体を含むか、又は常磁性同位体からなる。

細胞傷害性及び検出可能部分は、当該分野で周知の方法を使用して結合部分に結合され得るか、又はその他の方法で組み合わされ得る（例えば、既存の免疫複合体療法であるゲムツズマブオゾガマイシン［商標名：Mylotarg^(R)］は、細胞毒カリケアミシンに連結されたモノクローナル抗体を含む）。

本発明の第三の局面は、本発明の第一及び第二の局面に関連して定義された有効量の薬剤を、薬学的に許容しうる緩衝液、賦形剤、担体、アジュバント又は添加剤とともに含む医薬組成物を提供する。

さらなる化合物も本組成物に含まれ得、これらとしては、キレート剤、例えばEDTA、クエン酸塩、EGTA又はグルタチオンが挙げられる。

十分に貯蔵安定であり、かつヒト及び動物への投与に適した医薬組成物は、当該分野で公知の方法で製造され得る。例えば、医薬組成物は、例えばフリーズドライ、噴霧乾燥、噴霧冷却により、又は超臨界粒子形成からの粒子形成の使用により凍結乾燥され得る。

「薬学的に許容しうる」により、我々は本発明の薬剤のIL1RAP結合活性の有効性を減少させない非毒性物質を意味する。このような薬学的に許容しうる緩衝液、担体又は添加剤は当該分野で周知である（Remington's Pharmaceutical Sciences、18th edition、A.R Gennaro、Ed.、Mack Publishing Company (1990）及びhandbook of Pharmaceutical Excipients、3rd edition、A. Kibbe、Ed.、Pharmaceutical Press (2000）を参照のこと、その開示（he disclosures）は参照により本明細書に加入される）。

用語「緩衝液」は、ｐHを安定化させる目的で酸−塩基混合物を含有する水溶液を意味することを意図される。緩衝液の例は、Trizma、Bicine、Tricine、MOPS、MOPSO、MOBS、Tris、Hepes、HEPBS、MES、リン酸塩、炭酸塩、酢酸塩、クエン酸塩、グリコール酸塩、乳酸塩、ホウ酸塩、ACES、ADA、酒石酸塩、AMP、AMPD、AMPSO、BES、CABS、カコジル酸塩、CHES、DIPSO、EPPS、エタノールアミン、グリシン、HEPPSO、イミダゾール、イミダゾール乳酸、PIPES、SSC、SSPE、POPSO、TAPS、TABS、TAPSO及びTESである。

用語「賦形剤」は、製剤中の薬剤を希釈する目的のための水溶液又は非水性溶液を意味することを意図される。賦形剤は、食塩水、水、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、エタノール又はオイル（例えばサフラワー油、トウモロコシ油、落花生油、綿実油又はゴマ油）の１つ又はそれ以上であり得る。

用語「アジュバント」は、本発明の薬剤の生物学的効果を増加させるために製剤に添加される化合物を意味することを意図される。アジュバントは、様々なアニオンとの亜鉛、銅又は銀の塩、例えば、限定されないが、フッ化物塩、塩化物塩、臭化物塩、ヨウ化物塩、チオシアン酸塩（tiocyanate）、亜硫酸塩、水酸化物塩、リン酸塩、炭酸塩、乳酸塩、グリコール酸塩、クエン酸塩、ホウ酸塩、酒石酸塩、及び異なるアシル組成の酢酸塩の1つ又はそれ以上であり得る。アジュバントはまた、カチオン性セルロースエーテル、カチオン性セルロースエステル、脱アセチル化ヒアルロン酸、キトサン、カチオン性デンドリマー、カチオン性合成ポリマー、例えばポリ（ビニルイミダゾール）、及びカチオン性ポリペプチド、例えばポリヒスチジン、ポリリジン、ポリアルギニン、及びこれらのアミノ酸を含有するペプチドのようなカチオン性ポリマーであり得る。

添加剤は、炭水化物、ポリマー、脂質及び無機物の1つ又はそれ以上であり得る。炭水化物の例としては、ラクトース、グルコース、スクロース、マンニトール、及びシクロデキストリン類が挙げられ、これらは例えば凍結乾燥を容易にするために組成物に添加される。ポリマーの例は、デンプン、セルロースエーテル、セルロースカルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、エチルヒドロキシエチルセルロース、アルギネート、カラギーナン（carageenans）、ヒアルロン酸及びそれらの誘導体、ポリアクリル酸、ポリスルホネート、ポリエチレングリコール／ポリエチレンオキシド、ポリエチレンオキシド／ポリプロピレンオキシドコポリマー、ポリビニルアルコール／加水分解の異なる程度ポリ酢酸ビニル、及びポリビニルピロリドンの、異なる分子量の全てであり、これらは例えば粘性制御のため、生体接着性を達成するため、又は化学的及びタンパク質分解的な分解から脂質を保護するために組成物に添加される。脂質の例は、全ての異なるアシル鎖長及び飽和の、脂肪酸、リン脂質、モノ−、ジ−、及びトリグリセリド、セラミド、スフィンゴ脂質及び糖脂質、卵レシチン、大豆レシチン、水素化卵レシチン及び大豆レシチンであり、これらはポリマーについての理由と類似した理由のために組成物に添加される。無機物の例は、タルク、酸化マグネシウム、酸化亜鉛及び酸化チタンであり、これらは液体蓄積の減少又は有利な顔料特性のような恩恵を得るために組成物に添加される。

本発明の薬剤は、その送達に適していることが当該分野で公知のいずれかの種類の医薬組成物へと製剤化され得る。

一実施態様において、本発明の医薬組成物はリポソームの形態であり得、ここで薬剤は他の薬学的に許容しうる担体に加えて、両親媒性薬剤、例えば脂質と組み合わされ、これらはミセル、不溶性単層及び液晶のように凝集形態で存在する。リポソーム製剤に適した脂質としては、限定することなく、モノグリセリド、ジグリセリド、スルファチド、リゾレシチン、リン脂質、サポニン、胆汁酸などが挙げられる。適切な脂質としては、血流循環時間を延長させるために極性頭部においてポリ（エチレングリコール）で修飾された上記脂質も挙げられる。このようなリポソーム製剤の製造は、例えばUS 4,235,871（その開示は参照により本明細書に加入される）において見られ得る。

本発明の医薬組成物はまた、生分解性ミクロスフェアの形態であり得る。脂肪族ポリエステル、例えばポリ（乳酸）（PLA）、ポリ（グリコール酸）（PGA）、PLA及びPGAのコポリマー（PLGA）又はポリ（カルプロラクトン（carprolactone））（PCL）、及びポリ無水物は、ミクロスフェアの製造において生分解性ポリマーとして広く使用されてきた。このようなミクロスフェアの製造は、US5,851,451及びEP0 213303（これらの開示は参照により本明細書に加入される）において見出され得る。

さらなる実施態様において、本発明の医薬組成物は、ポリマーゲルの形態で提供され、ここでデンプン、セルロースエーテル、セルロースカルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、エチルヒドロキシエチルセルロース、アルギネート、カラギーナン（carageenans）、ヒアルロン酸及びそれらの誘導体、ポリアクリル酸、ポリビニルイミダゾール、ポリスルホネート、ポリエチレングリコール／ポリエチレンオキシド、ポリエチレンオキシド／ポリプロピレンオキシドコポリマー、ポリビニルアルコール／加水分解の異なる程度のポリ酢酸ビニル、及びポリビニルピロリドンのようなポリマーが、薬剤を含有する溶液の増粘のために使用される。ポリマーはまた、ゼラチン又はコラーゲンを含んでいてもよい。

あるいは、薬剤は、単に食塩水、水、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、エタノール又はオイル（例えば、サフラワー油、トウモロコシ油、落花生油、綿実油又はゴマ油）、トラガカントゴム及び／又は様々な緩衝液に溶解され得る。

当然のことながら、本発明の医薬組成物はイオンを含み得、そして活性薬剤の作用の相乗作用のための規定されたｐHである。さらに、組成物に従来の製剤操作、例えば滅菌を行なってもよく、かつ／又は組成物は従来のアジュバント、例えば保存料、安定剤、湿潤剤、乳化剤、緩衝液、フィラーなど含有し得る。

本発明の医薬組成物は、当業者に公知のいずれかの適切な経路により投与され得る。従って、可能な投与経路としては、非経口（静脈内、皮下、及び筋内）、局所、眼、鼻腔、肺、頬側、経口、非経口、膣及び直腸が挙げられる。また、移植物からの投与も可能である。

１つの好ましい実施態様において、医薬組成物は非経口で、例えば、静脈内、脳室内（intracerebroventricularly）、関節内、動脈内、腹腔内、くも膜下腔内、脳室内（intraventricularly）、胸骨内、頭蓋内、筋肉内若しくは皮下に投与され、又はそれらは注入技術により投与され得る。それらは、他の物質、例えば、血液と等張の溶液を作製するために十分な塩又はグルコースを含有し得る滅菌水性液剤の形態で都合良く使用される。必要な場合、水性液剤は適切に（好ましくは３〜９のｐHに）緩衝化されるべきである。滅菌条件下での適切な非経口製剤の製造は、当業者に周知の標準的な製剤技術により容易に達成される。

非経口投与に適した製剤には、抗酸化剤、緩衝液、静菌薬及び製剤を意図されたレシピエントの血液と等張性にする溶質を含有し得る水性及び非水性の滅菌注射液剤;並びに懸濁化剤及び増粘剤を含み得る水性及び非水性の滅菌懸濁剤が含まれる。製剤は、単位用量又は複数回用量の容器、例えば密封されたアンプル及びバイアルで提示され得、そして使用の直前に、滅菌液体担体（例えば注射用水）を添加するだけでよいフリーズドライ（凍結乾燥）状態で貯蔵され得る。即時注射液剤及び懸濁剤は、以前に記載した種類の滅菌の散剤、顆粒剤及び錠剤から調製され得る。

従って、本発明の医薬組成物は、非経口投与、例えば静脈内投与に特に適している。

あるいは、医薬組成物は、鼻腔内に、又は吸入により投与され得る（例えば、適切な噴霧剤、例えばジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロ−メタン、ジクロロテトラフルオロ−エタン、ヒドロフルオロアルカン、例えば1,1,1,2−テトラフルオロエタン（HFA 134A3又は1,1,1,2,3,3,3−ヘプタフルオロプロパン（HFA 227EA3）、二酸化炭素又は他の適切なガスを使用した加圧容器、ポンプ、スプレー又は噴霧器からのエアロゾルスプレー提示（presentation）の形態で）。加圧エアロゾルの場合、投薬量単位は定量送達のためのバルブを提供することにより決定され得る。加圧容器、ポンプ、スプレー又は噴霧器は、例えば溶媒としてエタノール及び噴霧剤の混合物を使用して、活性ポリペプチドの溶液又は懸濁液を含有し得、これは滑沢剤、例えばトリオレイン酸ソルビタンをさらに含有し得る。 吸入器又は注入器における使用のための（例えばゼラチンから作製された）カプセル剤及びカートリッジは、本発明の化合物及び適切な粉末基剤（例えばラクトース又はデンプン）の粉末混合物を含有するように製剤化され得る。

医薬組成物は、薬学的に有効な用量で患者に投与される。本明細書で使用される「治療有効量」、又は「有効量」、又は「治療上有効」は、所定の条件及び投与計画について治療上の効果をもたらす量を指す。これは、必要な添加剤及び賦形剤、すなわち担体又は投与ビヒクルに関連して所望の治療効果をもたらすように計算された活性物質の所定の量である。さらに、活性、機能及び宿主の応答における臨床的に有意な欠損を減少させ、そして最も好ましくは防止するために十分な量を意味することを意図される。あるいは、治療有効量は、宿主において臨床的に有意な条件で改善を生じるために十分である。当業者には当然のことながら、化合物の量は、その特異的活性に依存して変動し得る。適切な投薬量は、必要な賦形剤と関連して所望の治療効果をもたらすように計算された活性組成物の所定の量を含有し得る。本発明の組成物の製造のための方法及び使用において、治療有効量の活性成分が提供される。治療有効量は、当該分野で周知のように、患者の特徴、例えば年齢、体重、性別、状態、合併症、他の疾患などに基づいて医療又は獣医学の当業者により決定され得る。薬学的に有効な用量の投与は、個々の用量単位あるいは数個のより少ない用量単位の形態での単回投与により、そしてまた細分された用量の特定の間隔での複数回投与の両方により行われ得る。あるいは、用量は長期間にわたる連続的な注入として提供され得る。

ポリペプチドは、使用される化合物の効能／毒性に依存して、様々な濃度で製剤化され得る。好ましくは、製剤は0.1μMと１mMとの間、より好ましくは１μMと500μMとの間、500μMと１mMとの間、300μMと700μMとの間、１μMと100μMとの間、100μMと200μMとの間、200μMと300μMとの間、300μMと400μMとの間、400μMと500μMとの間、そして最も好ましくは約500μMの濃度で活性薬剤を含む。

当業者には当然のことながら、本発明の医薬組成物は、単独で、又は固形腫瘍の処置において使用される他の治療剤、例えば代謝拮抗薬、アルキル化剤、アントラサイクリン及び他の細胞傷害性抗生物質、ビンカアルキロイド（vinca alkyloids）、エトポシド、白金化合物、タキサン、トポイソメラーゼI阻害剤、抗増殖性免疫抑制剤、コルチコステロイド、性ホルモン及びホルモンアンタゴニスト、並びに他の治療用抗体（例えばトラスツマブ）と組み合わせて投与され得る。

本発明の第四の局面は、本発明の第一若しくは第二の局面に関連して定義された薬剤又は本発明の第三の局面に従う医薬組成物を含んでなるキットを提供する。

本発明の第５の局面は、固形腫瘍に関連する細胞の、細胞死を誘導し、かつ／又は成長及び／若しくは増殖を阻害するための医薬の製造における、本発明の第一又は第二の局面に関連して定義された薬剤の使用を提供し、ここで該細胞はIL1RAPを発現する。

本発明の関連する第６の局面は、固形腫瘍に関連する細胞を検出するための診断剤の製造における本発明の第一又は第二の局面に関連して定義される薬剤の使用を提供し、ここで該細胞はIL1RAPを発現する。従って、医薬は、患者において固形腫瘍を処置又は予防するのに使用するためのものである。

本発明の関連する第７の局面は、固形腫瘍に関連する細胞を検出するための本発明の第一又は第二の局面に関連して定義される薬剤の使用を提供し、ここで該細胞はIL1RAPを発現する。

本発明の上記の使用の局面の一実施態様において、固形腫瘍は、前立腺癌、乳癌、肺癌、大腸癌、黒色腫、膀胱癌、脳／ＣＮＳ腫瘍、子宮頸癌、食道癌、胃癌、頭頸部癌、腎臓癌、肝臓癌、リンパ腫、卵巣癌、膵臓癌、及び肉腫の癌からなる群より選択される。例えば、固形腫瘍は、前立腺、乳房、皮膚、結腸、肺、泌尿器及び子宮の癌からなる群より選択され得る。別の実施態様において、固形腫瘍は、前立腺癌、黒色腫、子宮頸癌、食道癌、並びに頭部及び／又は頸部の癌からなる群より選択され得る。

本発明の第一の局面のさらなる実施態様において、固形腫瘍は黒色腫である。

本発明の第８の局面は、個体において固形腫瘍に関連する細胞の、細胞死を誘導し、かつ／又は成長及び／若しくは増殖を阻害するための方法を提供し、この方法は、本発明の第一若しくは第二の局面に関連して定義された有効量の薬剤、又は本発明の第三の局面に従う医薬組成物を個体に投与する工程を含み、ここで該細胞はIL1RAPを発現する。

従って、本発明は、固形腫瘍の処置ための方法を提供する。「処置」により、我々は、患者の治療的処置及び予防的処置の両方を含める。用語「予防的」は、患者又は被験体において固形腫瘍の可能性を防止するか又は減少させる、本明細書に記載されるポリペプチド又は製剤の使用を包含するように使用される。

本発明の第９の局面は、個体において固形腫瘍に関連する細胞を検出するための方法を提供し、この方法は、本発明の第一若しくは第二の局面に関連して定義された有効量の薬剤、又は本発明の第三の局面に従う医薬組成物を個体に投与する工程を含み、ここで該細胞はIL1RAPを発現する。

本発明の上記の方法の局面の一実施態様において、固形腫瘍は、前立腺癌、乳癌、肺癌、大腸癌、黒色腫、膀胱癌、脳／ＣＮＳ腫瘍、子宮頸癌、食道癌、胃癌、頭頸部癌、腎臓癌、肝臓癌、リンパ腫、卵巣癌、膵臓癌、及び肉腫からなる群より選択される。例えば、固形腫瘍は、前立腺、乳房、皮膚、結腸、肺、泌尿器及び子宮の癌からなる群より選択され得る。別の実施態様において、固形腫瘍は前立腺癌、黒色腫、子宮頸癌、食道癌、並びに頭部及び／又は頸部の癌からなる群より選択され得る。

本発明の第一の局面のさらなる実施態様において、固形腫瘍は黒色腫である。

本発明の特定の局面を具体化する好ましい非限定的な例が、以下の図面を参照してここで記載される:

P210 BCR／ABL1発現は、臍帯血CD34⁺細胞におけるIL1RAPを誘導する。フローサイトメトリー分析は、IL1RAP発現が、形質導入の３日後に、臍帯血CD34⁺細胞においてレトロウイルスP210 BCR／ABL1発現の際に誘導されることを裏付けた。CD34⁺GFP⁺細胞は、ドットプロットにおいてゲートに従ってゲート開閉された。ヒストグラムは、ネガティブコントロール染色（白色）、MIGコントロール（明るい灰色）及びMIG−P210（暗い灰色）についてIL1RAPの発現を示す。ドットプロットにおける数は、個々のゲート／四分円内の細胞のパーセンテージを示す。３つからの代表的な実験を示す。 IL1RAPは原始CML細胞において上方調節される。５人のCML患者及び２人の正常骨髄（bm）サンプルからのCD34⁺細胞に対するFACS分析。CD34⁺CD38⁺又はCD34⁺CD38^-細胞についての代表的CML患者におけるゲート開閉を示すFACSドットプロット(A)。CD34⁺CD38⁺細胞内のIL1RAP発現を示すヒストグラム(B)。CD34⁺CD38^-細胞内のIL1RAP発現を示すヒストグラム(C)。白色はコントロール染色サンプルを表し、そして灰色はIL1RAP染色サンプルを表す。CD34⁺CD38^-IL1RAP^-及びCD34⁺CD38^-IL1RAP⁺細胞についての選別ゲートをヒストグラムに概要を示す。ドットプロット中の数及びヒストグラムは、個々のゲート／四分円内の細胞のパーセンテージを示す。 IL1RAPは原始CML細胞において上方調節される。５人のCML患者及び２人の正常骨髄（bm）サンプルからのCD34⁺細胞に対するFACS分析。CD34⁺CD38⁺又はCD34⁺CD38^-細胞についての代表的CML患者におけるゲート開閉を示すFACSドットプロット(A)。CD34⁺CD38⁺細胞内のIL1RAP発現を示すヒストグラム(B)。CD34⁺CD38^-細胞内のIL1RAP発現を示すヒストグラム(C)。白色はコントロール染色サンプルを表し、そして灰色はIL1RAP染色サンプルを表す。CD34⁺CD38^-IL1RAP^-及びCD34⁺CD38^-IL1RAP⁺細胞についての選別ゲートをヒストグラムに概要を示す。ドットプロット中の数及びヒストグラムは、個々のゲート／四分円内の細胞のパーセンテージを示す。 IL1RAP発現は、CD34⁺CD38^-細胞区画内でPh⁺をPh^- CML細胞と区別する。５人のCML患者サンプルからのCML CD34⁺CD38^-IL1RAP^-及びCD34⁺CD38^-IL1RAP⁺細胞に対するフロードロップ（Flow-drop）-FISHは、それぞれBCR／ABL1^-細胞とBCR／ABL1⁺細胞との間のほとんど完全な分離を明らかにした。黒いバーはBCR／ABL1ネガティブ細胞を表し、そして白色バーはBCR／ABL1ポジティブ細胞を表す。記録した全ての核のPh⁺細胞の数の概要を各バーの上に示す。 IL1RAP発現はPh⁺ CML幹細胞を正常HSCと区別する。CD34⁺CD38^-IL1RAP^-及びCD34⁺CD38^-IL1RAP⁺細胞に由来するLTC-CFCの数(A)。黒色バーはIL1RAP^-細胞を表し、そして白色バーはIL1RAP⁺細胞を表す。LTC-CFCに対する分裂間期FISH(B)。黒色バーはBCR／ABL1ネガティブ細胞を表し、そして白色バーはBCR／ABL1ポジティブ細胞を表す。記録した全ての核のPh⁺細胞の数の概要を各バーの上に示す。 IL1RAPを標的とする抗体によるCML細胞株の死滅。フィラデルフィア染色体を欠いたKG-1細胞での発現と比較して、CML患者由来の、フィラデルフィア染色体を含有するKU812細胞でのIL1RAP発現を示すヒストグラム(A)。白色はコントロール染色サンプルを示し、そして灰色はKMT-1染色サンプルを示す。白血病細胞株KG-1はIL1RAP発現が欠けており、一方でKU812はIL1RAPを発現する(B)。結果として、低レベルの抗体誘導細胞死がKG-1において観察されたが、用量依存性ADCC効果がKU812細胞においてKMT-1を使用して観察された(B)。非特異的ADCC効果のコントロールとして、ウサギIgG抗体も実験において使用した。グラフは３つの独立した実験からの抗体誘導細胞死の平均及び標準偏差を示す。 IL1RAPを標的とした抗体によるCML幹細胞の死滅。KMT-1を使用することにより、正常骨髄CD34+CD38-細胞はIL1RAPについてネガティブに染色されたが、一方でCML CD34+CD38+及びCD34+CD38-細胞はIL1RAPを発現した。CML-1でのヒストグラムを代表的な実験から示す(A)。白色はコントロール染色サンプルを示し、そして灰色はKMT-1染色サンプルを示す。IL1RAP発現のレベルと一致して、明らかなADCC効果は正常骨髄CD34+CD38-細胞を使用して見られなかったが、一方でKMT-1はCML CD34+及びCD34+CD38-細胞の両方において強い用量依存性ADCC効果を誘導した(B)。非特異的ADCC効果のコントロールとして、ウサギIgG抗体も実験において使用した。グラフはCML-1、CML-3、CML-4、及び４つの正常骨髄サンプルを使用した３つの独立した実験からの抗体誘導細胞死の平均及び標準偏差を示す。 IL1RAPを標的とした抗体によるCML幹細胞の死滅。KMT-1を使用することにより、正常骨髄CD34+CD38-細胞はIL1RAPについてネガティブに染色されたが、一方でCML CD34+CD38+及びCD34+CD38-細胞はIL1RAPを発現した。CML-1でのヒストグラムを代表的な実験から示す(A)。白色はコントロール染色サンプルを示し、そして灰色はKMT-1染色サンプルを示す。IL1RAP発現のレベルと一致して、明らかなADCC効果は正常骨髄CD34+CD38-細胞を使用して見られなかったが、一方でKMT-1はCML CD34+及びCD34+CD38-細胞の両方において強い用量依存性ADCC効果を誘導した(B)。非特異的ADCC効果のコントロールとして、ウサギIgG抗体も実験において使用した。グラフはCML-1、CML-3、CML-4、及び４つの正常骨髄サンプルを使用した３つの独立した実験からの抗体誘導細胞死の平均及び標準偏差を示す。 IL1RAPは初代ALL及びAML幹細胞でも発現される。急性骨髄性白血病(AML)細胞を診断時に患者から入手した。代表的なAML患者由来のCD34+CD38-及びCD34+CD38+細胞でのIL1RAP発現を示す(A)。AML細胞株MONO-MAC-6及びALL細胞株REHはIL1RAPを発現する(B)。急性リンパ性白血病(ALL)細胞を診断時に患者から入手した。代表的なPh+ ALL患者由来のCD34+CD38-及びCD34+CD38+細胞でのIL1RAP発現を示す(C)。白色はコントロール染色サンプルを示し、そして灰色はIL1RAP染色サンプルを示す。 IL1RAPを標的とする抗体によるAML及びALL細胞の死滅。ADCCアッセイにおいて、KMT-1用量依存性細胞死がMONO-MAC-6細胞株及びREH細胞株の両方において誘導され、IL1RAP標的抗体がCMLのみよりも広い治療域を有し得るということを示唆した。非特異的ADCC効果のコントロールとして、ウサギIgG抗体も実験で使用した。グラフは３つの独立した実験からの抗体誘導細胞死の平均及び標準偏差を示す。 IL1RAPを標的とする抗体によるAML及びALL幹細胞の死滅。ADCCアッセイにおいて、KMT-1誘導細胞死が初代AML CD34+CD38- (A)及びALL CD34+CD38- (B)細胞において観察され、IL1RAP標的抗体もまた、AML及びALLにおいてそれらの細胞表面上のIL1RAPの上方調節を伴う治療効果を有するということが確認された。非特異的ADCC効果のコントロールとして、ウサギIgG抗体も実験で使用した。グラフは特異的抗体誘導細胞死を示す。 IL1RAPはMPD及びMDS患者由来の白血病性幹細胞において発現される。JAK2変異を有するか又は有していない、２人のMPD患者(MPD-1及びMPD-2)のCD34+CD38-細胞におけるIL1RAP発現を示す等高図(A)。AMLに進行したMDS患者におけるIL1RAP発現を示すヒストグラム(B)。白色はコントロール染色サンプルを示し、そして灰色は抗IL1RAP抗体で染色したサンプルを示す。 IL1RAPは、固形腫瘍由来のがん細胞の表面上で発現される。ヒト固形腫瘍由来の異なる細胞株を抗ヒトIL-1 RAcP／IL-1 R3-APC(カタログ番号FAB676A、R&D system)(黒い線)及びアイソタイプコントロール(灰色線)で染色した。フローサイトメトリー分析は、COLO829 (悪性黒色腫)、HCC1954(乳管癌)、NCI-8228(肺腺癌)、NCI-H716(結腸癌)、OV-90(卵巣腺癌)、H716(結腸癌)、H2228(肺腺癌)、SH-4(黒色腫)、SR(リンパ腫)及びSW 1783(星状細胞腫)におけるIL1RAPの発現を示す。 図１１−１の続きである。 IL1RAPは固形腫瘍由来のがん細胞の表面上で発現される。H716(結腸癌)、H2228(肺腺癌)、HCC1954(乳管癌)、及びSH-4(黒色腫)でのIL1RAP発現を示す、mab81.2（IL1RAPに対する抗体）で標識された４つの異なるヒト癌細胞株からの細胞でのフローサイトメトリー分析からのヒストグラム。 L1RAPを標的とする抗体は、ヒトNK細胞をヒト癌細胞上のADCCに導く。ADCCアッセイにおける抗ヒトIL1RAP抗体mab81.2、及びヒトNK細胞により誘導される特異的細胞死の程度を示すグラフ。アイソタイプコントロールとして、非特異的ヒトIgG1抗体を実験に含めた。 SK-MEL-5黒色腫細胞株のインビボ成長に対するmAb 81.2の効果。MAb 81.2を、10mg／体重kgで週に２回腹腔内投与した。コントロールマウスを等体積のPBSで処置した。各実験グループは１０匹のマウスを含んでいた。結果を平均腫瘍体積(mm3)として示し；誤差バーは標準誤差(SEM)を表す。

実施例１
IL1RAPは慢性骨髄性白血病幹細胞に対する細胞表面バイオマーカーである
要旨
障害の永久治癒の達成を目的とする慢性骨髄性白血病（CML）の治療方策は、CML幹細胞の完全な根絶を必要とする。正常造血幹細胞（HSC）と自己再生能力を共有するCML幹細胞は、細胞表面マーカーを使用してこれまで正常（HSC）と区別できなかった白血病細胞の小集団を代表する。CML幹細胞を標的化するための１つの方策は、それ対して将来治療用抗体が特異的であり得る、CML幹細胞に対する細胞表面バイオマーカーを同定することだろう。この研究において、我々は、網羅的遺伝子発現分析を使用して、IL1RAPを、原始的CML CD34+細胞において、かつ異所性のP210 BCR／ABL1発現の結果としての両方で一般的に上方調節されると同定した。我々はさらに、IL1RAP発現がCML及び正常HSCの両方を有する稀なCD34+CD38-細胞集団を２つのフラクションに分けるということ示し；一方は低い発現を有し／発現がなく、他方はより高いIL1RAP発現を有する。少数の選別された細胞においてFISHによるBCR／ABL1の検出を可能にするプロトコルを確立した後、CML CD34+CD38-細胞内のうち；IL1RAP+細胞はBCR／ABL1+であり、一方IL1RAP-細胞はほとんどBCR／ABL1-のみであることが分かった。長期の培養をさらに行い、２つの細胞集団で細胞（LTC-IC）アッセイを開始することにより、我々は、候補CML幹細胞及び正常HSCが予測的に分離され得るということを見出した。従ってこの研究は、CML幹細胞を正常HSCと区別する最初の細胞表面バイオマーカーとしてIL1RAPを同定し、そしてCML、さらには関連する障害、例えば急性骨髄性白血病（AML）、急性リンパ芽球性白血病（ALL）、骨髄増殖性障害（MPD）及び骨髄異形成症候群（MDS）における治療的及び診断的方策のための新しい手段を切り開く。

導入
CML幹細胞についての細胞表面バイオマーカーを同定するために、網羅的遺伝子発現分析を行い、そして原始CML患者細胞において、かつ異所性P210 BCR／ABL1発現の結果としての両方で上方調節される、インターロイキン１受容体アクセサリータンパク質（IL1RAP）を最大の候補として同定した。少数の選別された細胞においてBCR／ABL1を検出するためのアッセイの開発に際し、我々は、IL1RAP発現が原始白血病細胞と正常細胞との有望な分離を可能にすることを示す。長期培養−開始細胞アッセイにより、IL1RAPが、CML幹細胞の正常HSCからの予測的分離を初めて可能にする、CML幹細胞についての細胞表面バイオマーカーであることをさらに示す。

材料及び方法
CML患者細胞の収集
臍帯血CD34⁺細胞の単離及び形質導入
血液サンプル、及び時には骨髄サンプルをCML患者から、処置の前に診断時に得て、そして地域倫理委員会（local ethical board）により認められたプロトコルに従ったインフォームドコンセントの後に開始した。サンプルを、Lund University Hospital、Swedenの血液学科及びRigshospitalet、Copenhagen、Denmarkの両方から入手した。単核細胞（MNC）をLymphoprep^TM（Axis-Shield PoC AS、Oslo、Norway）を使用して製造者の指示に従って分離し、そしてCD34⁺細胞をCD34⁺細胞単離キット(Miltenyi Biotech、Bergisch Gladbach、Germany）を使用して、以前に記載されたように²²定期的に濃縮し、これにより95％より高い純度のCD34⁺細胞を得た。単核細胞の副画分を、抗体染色を開始する前に液体窒素で生存可能に貯蔵した。CD34⁺細胞を２つのフラクションに分割した；一方のフラクションをPBSで洗浄し、そしてTrizolに再懸濁して-80Cで凍結させ、他方のフラクションを液体窒素で凍結させた。参照サンプルとして、健常ボランティアからの骨髄サンプルをインフォームドコンセントの後にLund University Hospitalで入手し、続いてCD34細胞単離を上記のように行った。

マイクロアレイ分析
マイクロアレイ分析を、Lund University、SwedenのSwegene DNA Microarray Resource
Centerからのオリゴヌクレオチドスライドを使用して行った。ハイブリダイゼーション（Hybridizationss）を、Pronto Universal Hybridizationキット（Corning Inc、Corning、NY）を使用して行った。RNA単離及びマイクロアレイ分析を、本質的に以前に記載されたように²³行った。データ可視化を、ソフトウェアQlucore Omics Explorer 2.0（Qlucore、Lund、Sweden）を使用して行った。

フローサイトメトリー分析
フローサイトメトリー分析をFACS Cantoで行い、そしてフローサイトメトリー細胞選別をFACS Ariaで行った（両方共BDより）。細胞染色の前に、CD34⁺細胞を標準的な手順に従って解凍し、そして２％FCSを含有するPBS（洗浄媒体）で１回洗浄した。ビオチン標識ヤギ抗ヒトIL1RAPポリクローナル抗体（バッチ667、R&D Systems、Abingdon、UK）を1：100希釈で３０分間氷上で細胞を染色するために使用した。続いて、細胞を洗浄し、そしてPE結合ストレプトアビジンを1：200希釈で３０分間使用した。APC結合抗CD34及びFITC結合抗CD38モノクローナル抗体を共染色のために使用した（IL1RAPを除いて使用した全ての抗体をBeckton-Dickinson Immunocytometry Systems、Mountain View、CAから購入した）。細胞選別の前に、PE結合ストレプトアビジンの非特異的結合を避けるために細胞を２回洗浄した。アイソタイプ整合コントロール抗体をネガティブコントロールとして使用した。

細胞選別及び分裂間期FISH
ガラススライドを湿室中に維持しながら0.01％ポリL−リジン（Sigma-Aldrich、Stockholm、Sweden）で２時間処理し、水で１回洗浄し、そしてホットプレート上で３７℃にて乾燥した。続いて、疎水性ペン（Daido Sangyo Co.、Ltd. Tokyo、Japan）を使用して、テンプレートとして96ウェル組織培養プレートを用いで円を描いた。細胞選別の前であるが室温での乾燥の少なくとも２時間後に、25μL PBSをこれらの円に適用して液滴を形成した。細胞選別の間、30〜3000個の細胞を直接２つの液滴中に同時に選別した。細胞の表面への接着を可能にするため、かつ液滴の乾燥を避けるために、スライドを３０分間氷上で湿室中に維持し、その後細胞をメタノール：酢酸（3：1）で１０分間固定した。続いて、スライドを７０℃のオーブン中で終夜インキュベートし、続いてFISHを行った。BCR／ABL1について二色プローブ（Abbot、Wiesbaden、Germany）を使用した。

長期培養−開始細胞（LTC−IC）
M₂10B₄間質細胞を、以前に記載されたように^24,2510％ FCSを補給したRPMI-1640培地で培養した。細胞選別の２日前に、間質細胞を９６ウェルプレートのウェルに１mLあたり50,000細胞で、10^-6 Mヒドロコルチゾン（Sigma-Aldrich、Stockholm、Sweden）を含有する200μL Myelocult培地（Stem Cell Technologies、Vancouver、Canada）に播種した。細胞選別の２４時間前に、間質細胞を1000Radで照射した。細胞選別の間、100〜500個の細胞を直接間質プレコートウェル中に二連で選別し、そして培地100μLを３時間後に交換した。週に１回、培地100μLの交換を繰り返した。５〜６週の培養の後、細胞を洗浄し、そしてメチルセルロース培地（MethoCult H44435; Stem Cell Technologies）中に24ウェルプレートでプレーティングした。２週後、コロニーの数を記録した。個々のウェルからのコロニーをプールし、洗浄し、スライド上のPBS液滴に適用し、続いて上記のようにFISH分析を行った。

臍帯血CD34⁺細胞におけるP210 BCR／ABL1発現
臍帯血サンプルを、地域倫理委員会により認められたプロトコルに従ってインフォームドコンセントを得た後に正常分娩から集めた。CD34⁺細胞を以前に記載されたように²²濃縮し、９５％より高い純度のCD34⁺細胞を得た。RD114偽型MSCV-IRES-GFP（MIG）及びMIG-P210ウイルスベクターをこの研究において使用した²³。CD34⁺細胞を培養し、そして以前に記載されたように²³、トロンボポエチン（TPO；50ng／mL）、幹細胞因子（SCF；100ng／mL）、及びFlt-3-リガンド（FL；100ng／mL）を補充したSFMM培地（Stem Cell Technol
ogy、Vancouver、Canada）で形質導入した。

結果及び考察
網羅的遺伝子発現分析は、IL1RAPをCML CD34⁺細胞で上方調節されると同定する
Ph⁺ CML幹細胞に対する細胞表面バイオマーカーを同定することを目的とした研究に多くの努力が注がれてきた（C Eavesによる概説¹⁴）。白血病細胞及び正常細胞は、FISHによる白血病特異的BCR／ABL1融合遺伝子の検出後にCMLにおいて遡及的に容易に同定され得、このため白血病細胞と正常細胞とを予測的に分離する試みを評価するための理想的な障害となっている。しかしこれまでに、CML幹細胞の正常HSCからの予測的分離を可能にする細胞表面マーカーは同定されていなかった。網羅的遺伝子発現分析は、造血幹細胞と前駆細胞とを区別するSLAM受容体のような¹⁵新しいHSCマーカーを探索する際の強力な方策であることがわかった。CML幹細胞に対する候補細胞表面バイオマーカーをコードする上方調節される遺伝子を探すために、11のCML患者サンプル及び5つの正常骨髄（bm）サンプルからのCD34⁺細胞の転写プロフィールを比較した。同定されたCMLにおいて上方調節された遺伝子は、全ての公知のCD分子を含むように手作業で監督された（curated）遺伝子オントロジー（GO）カテゴリー「形質膜内在性（integral to plasma membrane）」に適合した（詳細については材料及び方法を参照のこと）。CML CD34⁺細胞において合計で１３の上方調節された遺伝子が形質膜内在性カテゴリーに適合した（データは示していない）。上方調節された遺伝子をより直接的にP210 BCR／ABL1発現と関連付けるために、我々は、臍帯血CD34⁺細胞においてP210 BCR／ABL1発現の結果として上方調節される遺伝子のリストを並行して作成した。この解析の結果、23の上方調節遺伝子が同じGOカテゴリー遺伝子リストに適合した（データは示していない）。興味深いことに、１つの遺伝子、インターロイキン１受容体アクセサリータンパク質（IL1RAP）のみが、CD34⁺ CML細胞及び臍帯血CD34⁺細胞の両方において、P210 BCR／ABL1発現の結果として強い上方調節を示した。IL1RAPが両方の遺伝子リストに存在したという知見は、原始CML細胞でのその上方調節がP210 BCR／ABL1発現と密接に連動しているということを示唆し、そしてIL1RAPが原始CML細胞に対する新規な白血病関連抗原であるということを示す。

IL1RAPはCML患者由来のCD34⁺CD38^-細胞で上方調節され、そして異所性P210 BCR／ABL1発現の結果として誘導される
IL1RAPは、Toll様受容体スーパーファミリーのメンバーであり、かつインターロイキン１受容体1型（IL-1R1）に対する補助受容体として周知である¹⁶。従ってIL1RAPは、炎症促進性サイトカインIL-1の効果を媒介する際に重要であるが、これはまたIL-33（その受容体ST2の結合によりT細胞及びマスト細胞を活性化するサイトカイン）のシグナルの媒介に関与し、これがその後IL1RAPと二量化する¹⁷。IL-1R1活性化は、インターフェロン感受性CML細胞のコロニー成長を刺激することが以前に示されているが¹⁸、しかし我々の知る限り、IL1RAPは以前にCMLと直接関連付けられていなかった。

P210 BCR／ABL1は、この疾患の顕著な特徴としてCML細胞に存在するので、理想的には、CMLにおける信頼性のある細胞表面バイオマーカーは、P210 BCR／ABL1の存在及び発現と直接連動するべきである。マイクロアレイデータと一致して、IL1RAP発現は、レトロウイルスP210 BCR／ABL1発現後にCB CD34⁺細胞において細胞表面上で実際に上方調節された（図1）。このことは、P210 BCR／ABL1が、直接的に、又は間接的な影響を通じて、IL1RAP発現を調節するということを示唆し、CMLバイオマーカーとしてのその立候補（candidature）を強めた。

我々は次に、大多数でかつより成熟したCD34⁺細胞を代表するCML CD34⁺CD38⁺細胞での細胞表面IL1RAP発現を調べた。この細胞集団において、対応する正常ｂｍ細胞における発現と比較してIL1RAPの上方調節が観察された（図2A、B）。正常CD34⁺CD38⁺細胞は、CML細胞での発現と部分的に重なるより低いIL1RAP発現を示した。次いで我々は、HSCを含む、正常細胞のCD34⁺CD38^-細胞区画に移った。以前の研究と一致して、この集団は低いIL1RAP発現を示すか／IL1RAP発現を示さなかった（図2C）¹⁹。Ph⁺ CML幹細胞及び正常HSCの両方を有する、CML患者由来のCD34⁺CD38^-細胞は、顕著に２つの集団に分けられた；一方は低いIL1RAP発現を有するか／IL1RAP発現がなく、他方はより高いIL1RAP発現を有する（図2C）。５人のCML患者の末梢血（PB）において、IL1RAPポジティブ細胞フラクションは、CD34⁺CD38^-細胞の75％と95％との間を構成していた（n＝5）。これらの知見に基づいて、我々は、IL1RAP発現が、CMLにおいてCD34⁺CD38^-細胞区画内で正常細胞と白血病細胞とを区別し得ると仮定した。全てのCML幹細胞及び正常HSCはCD34⁺CD38^-細胞内でのみ見られるので、正常細胞と白血病細胞との間のこのような分離は、CML幹細胞の正常HSCからの予測的分離を可能にするだろう。

フロードロップ-FISHは、IL1RAP発現がCML CD34⁺CD38^-細胞内で正常細胞と白血病細胞とを分離するということを示す
IL1RAP発現がCML CD34⁺CD38^-細胞区画内で正常（Ph^-）細胞と白血病（Ph⁺）細胞とを区別するかどうかを試験するために、我々は、少数の選別された細胞に対して蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（FISH）を行うための新しいプロトコルを確立した（材料及び方法を参照のこと）。このプロトコルの最初の工程は、細胞をスライド上の液滴中に選別するための方法に一部基づき、続いて単一細胞免疫染色²⁰を行う。細胞をスライド上の液滴中に直接選別し、その後FISHを行うこの新しいプロトコル（本明細書では今後フロードロップ−FISHと呼ぶ）を適用することにより、我々は３０程度の少ない細胞を液滴中に選別し、これから１５の核をFISHにより首尾よく選別した（CML-5、図3）。興味深いことに、我々は、フロードロップ-FISHにより、CML CD34⁺CD38^-IL1RAP⁺細胞がBCR／ABL1⁺であり、一方でCML CD34⁺CD38^-IL1RAP^-細胞がほとんどPh^-のみであること見出した（n＝5、図3）。これらのデータは、IL1RAP発現がCML CD34⁺CD38^-細胞区画内で白血病細胞と正常細胞とを分離することを示し、CML幹細胞及び正常HSCが予測的に分離され得ることを示す。

CML幹細胞はCD34⁺CD38^-IL1RAP⁺であり、一方で正常HSCはCD34⁺CD38^-IL1RAP^-/lowである
慢性期CML幹細胞に関する研究はこれまでに、長期アッセイ後に¹⁴、幹細胞区画が白血病細胞で占められている稀なCML患者への接近に中継された（relayed on access）。CML幹細胞は一般的に免疫欠損マウスにおいて乏しい生着を示すので、長期培養開始細胞（LTC-IC）−アッセイは、候補CML幹細胞の検出のための代理アッセイとして広く使用される。CML CD34⁺CD38^-IL1RAP⁺及びCD34⁺CD38^-IL1RAP^-/lowがそれぞれ独自に候補CML幹細胞及び正常HSCを含むかどうかを試験するために、我々はLTC-ICアッセイにおいて２つの細胞集団を試験した。正常コントロールからの骨髄CD34⁺細胞については、長期培養-コロニー形成細胞（LTC-CFC）が、CD34⁺CD38^-IL1RAP⁺細胞と比較してCD34⁺CD38^-IL1RAP^-の中で＞１００倍高い頻度で見られ（図4A、n＝2）、正常CD34⁺CD38^-IL1RAP^-が階層的にCD34⁺CD38^-IL1RAP⁺細胞の頂上にあるということを示した。CMLにおいて、我々は、CD34⁺CD38^-IL1RAP⁺細胞と比較してCD34⁺CD38^-IL1RAP^-細胞内で平均で3.6倍高い頻度のLTC-CFCを観測し（n＝5、図4A）、CML CD34⁺CD38^-IL1RAP^-細胞が原始細胞についてより濃縮されているということを示した。重要なことには、より多数のLTC-ICが両方のCML患者サンプル及び正常コントロールからのCD34⁺CD38^-IL1RAP⁺細胞内よりもCD34⁺CD38^-IL1RAP^-細胞で見られたが、CML LTCコロニーでのFISHは、２つのグループにおいてPh^-細胞とPh⁺細胞との間のほとんど完全な区別を明らかにした（図4B）。CD34⁺CD38^-IL1RAP^-細胞由来のCML LTCコロニーはほとんどPh^-のみであり、一方でCD34⁺CD38^-IL1RAP⁺はほとんどPh⁺のみであった。これらのデータは、IL1RAPがCML幹細胞を正常HSCから分離するために使用され得る新規な細胞表面バイオマーカーであるということを示唆する。

本明細書において、我々は網羅的遺伝子発現分析により、新規な細胞表面抗原IL1RAPを同定し、これは多数のアッセイにおける挑戦の後にPh⁺ CML幹細胞についての新規な細胞表面バイオマーカーであることについての基準を満たした。この発見にもとづいて、CMLにおける未来志向的（future directed）治療が、IL1RAPに特異的な治療用抗体を使用することにより、正常HSCを保護しながら、CML幹細胞を標的とするように設計され得る。さらに、抗CD34、抗CD38及び抗IL1RAP抗体を含有する抗体カクテルは、診断目的のため、及び異なる処置下のCML患者の経過観察研究のために使用され得る。重要なことには、正常細胞及びCML幹細胞の予測的分離は、これらの２つの細胞集団の将来の機構的な研究を可能にする。さらに、我々は本明細書において、フロードロップ−FISHが少数の選別された細胞、例えば白血病幹細胞、次第により小さくかつ純粋な細胞集団へと精製された²¹細胞型における遺伝子異常を特徴付ける際に有用な方法として役立ち得るということも示す。将来の研究のために、この方法は例えば様々な小さい白血病幹細胞及び前駆細胞集団における遺伝子異常の検出、様々な異常が獲得されてきた規則の新規な見識、白血病誘発を理解するための鍵となる知識をもたらす可能性のある知見を可能にする。さらに、フロードロップ−FISHは、処置の間の白血病幹細胞に対する治療効果をモニタリングするために使用され得る。重要なことには、我々は本明細書において、フロードロップ−FISHを使用することにより、IL1RAPがCML幹細胞を正常HSCと区別する最初の細胞表面バイオマーカーであるということ、CML並びに幹細胞及び／又は前駆細胞におけるIL1RAPの上方調節に関連する他の新生物性血液学的障害についての新しい治療機会を切り開く知見を同定した。

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実施例２
白血病幹細胞及び前駆細胞でIL1RAPを標的とする抗体は、抗体依存性細胞介在性細胞傷害（ADCC）を引き起こす
要旨
永久治癒の達成を目的とした白血病の治療方策は、白血病幹細胞の完全な根絶を必要とする。白血病細胞の小集団を代表する白血病幹細胞はこれまで、細胞表面マーカーを使用して正常造血幹細胞（HSC）と区別できなかった。将来の治療用抗体が導かれ得る、白血病幹細胞を標的とするための新しい概念は、白血病幹細胞のための細胞表面バイオマーカーを同定することだろう（実施例１を参照のこと）。

この研究において、我々は抗IL1RAP抗体を生成し、そして慢性骨髄性白血病（CML）幹細胞、急性骨髄性白血病（AML）幹細胞、及び急性リンパ芽球性白血病（ALL）幹細胞を標的とする抗IL1RAP抗体が抗体依存性細胞介在性細胞傷害（ADCC）を誘導するために使用され得るという概念の証拠を提供し、一方で、細胞傷害作用は正常HSCにおいて観察されなかった。さらに、我々は、IL1RAPポジティブ細胞株KU812（CML）、MONO−MAC−6（急性骨髄性白血病；AML）及びREH（急性リンパ芽球性細胞株；ALL）において用量依存性IL1RAP標的化ADCCを実証する。我々はまた、MDS及びMPD幹細胞が増加したIL1RAP発現を有することを実証し、これは将来の治療用の抗IL1RAP標的化抗体がこれらの障害においても有効であるだろうということを示す。

従ってこの研究は、白血病幹細胞でのIL1RAP標的化抗体によるCML、AML、ALL、MDS、及びMPDにおける新規な治療機会を切り開く。

材料及び方法
KMT-1の生成；ポリクローナルウサギ抗ヒトIL1RAP抗体
ウサギをIL1RAPの細胞外ドメインで免疫した。ウサギからの血清を、追加の工程を加えたこと以外は標準的な手順に従って精製し、ここで、増加した半減期のために免疫タンパク質上に存在する、免疫グロブリンドメインに結合する抗体を、免疫グロブリンロードカラムへの結合により廃棄した。精製された抗体を、ELISAで、IL1RAPの細胞外ドメインに結合すること、及びヒト免疫グロブリンドメインに結合する抗体がないことを確認した。フローサイトメトリーで使用される場合、PE結合ヤギ抗ウサギIgG抗体を二次試薬として使用した。

ADCCアッセイ
ADCCアッセイは、以前に記載されたプロトコル¹に基づくものであった。手短には、製造者の指示に従って標的細胞をPKH26（Sigma-Aldrich、St Louis、Missouri）で標識し、そして細胞を９６ウェルプレートのウェル中に直接入れるか、又はCD34⁺CD38^-細胞の選別後にウェル中に播種した。KU812及びKG-1細胞株並びに初代CD34⁺細胞を１ウェルあたり10,000細胞で播種し、一方で初代CD34⁺CD38^-細胞を１ウェルあたり2,000〜3,000細胞で播種した。続けて、抗体をウェルに様々な濃度で加え、そして２０分インキュベートした後、100,000個のNK-エフェクター細胞を各ウェルに加えた。NK細胞を、インフォームドコンセントの後に健常ボランティアからNK細胞ネガティブ細胞単離キットを使用することにより製造者の指示（Miltenyi Biotech、Bergisch Gladbach、Germany）に従って抽出した。非免疫ウサギから精製されたウサギIgG抗体をコントロール抗体として実験で使用した（R&D Systems Abingdon、UK）。細胞死の検出のための7-AADポジティブ細胞を、FACS CANTOフローサイトメーター（BD）を使用して測定した。抗体誘導細胞死の平均及び標準偏差を以下の等式に従って、少なくとも３回の独立した実験から計算した（図9を除く；１回の実験のみ）：（規定された抗体濃度での7-AAD+細胞のパーセンテージ − 抗体を用いない場合の7-AAD+細胞のパーセンテージ）／（0.01x抗体を用いない場合の7-AAD-細胞のパーセンテージ）。

１１人のAML患者及び２人のPh+ ALL患者からのサンプルを、Lund University病院から入手し、そしてIL1RAPの発現をCD34⁺CD38⁺細胞集団及びCD34⁺CD38^-細胞集団においてCML細胞の分析と同じ設定を使用して分析した。AML細胞株MONO-MAC-6及びALL細胞株REHもまた、KG-1細胞株及びKU812細胞株と同じ設定を使用してADCCアッセイにおいて試験した。

結果
CML幹細胞及び前駆細胞でIL1RAPを標的化するがCML細胞でも標的化する抗体は、NK細胞をADCCに導く
抗体依存性細胞介在性細胞傷害（ADCC）は、先天免疫系の保存された機構であり、それによりいくつかの治療用抗体（例えばCD20に特異的なリツキシマブ）が、少なくとも部分的にそれらの治療効果を発揮すると考えられている²。標的としてIL1RAPを使用してADCC
が達成され得るかどうかを試験するために、我々は、ヤギ抗体と対照的にウサギ抗体のFcドメインはヒト免疫系の細胞により認識されるので、ポリクローナルウサギ抗ヒトIL1RAP抗体（本明細書では以後KMT-1と呼ぶ）を生成した。

期待されたように、たとえ高濃度のKMT-1でも、低レベルのADCCが、IL1RAPネガティブ／低白血病細胞株KG-1において観察された（図5A、B）。対照的に、IL1RAPを発現するCML細胞株KU812では、ナチュラルキラー（NK）細胞媒介ADCCがKMT-1の存在下で観察され（図5A、B）、KMT-1が細胞傷害性免疫細胞をIL1RAP+標的細胞へと動員することによりADCCを誘導する可能性を有するということを示した。

CML患者及び正常コントロールからの初代細胞において、KMT-1は、わずかに弱いが、以前に使用されたポリクローナルヤギ抗ヒトIL1RAP抗体と類似した染色パターンを示した（実施例１、図6A）。CML-1、CML-3及びCML-4からの未熟細胞（CML-2及びCML-5からの細胞は残っていない）を、健常コントロールサンプルからの細胞と並行してADCCアッセイで試験した。CML CD34⁺細胞において、KMT-1の結合は正常CD34⁺コントロール細胞よりも高いレベルでADCCを生じ、これは、特により低い抗体濃度で、IL1RAPの発現レベルと相関していた（図6B）。より顕著には、幹細胞濃縮CD34⁺CD38^-細胞のうち、KMT-1は正常CD34⁺CD38^-細胞のADCCを誘導せず、一方で、明らかな用量依存性ADCC効果がCML CD34⁺CD38^-細胞において観察され（図6B）、これらの細胞型でのIL1RAPの発現パターンとの強い相関を再び示した。

AML及びALL細胞においてIL1RAPを標的とする抗体はNK細胞をADCCへと導く
IL1RAP発現は、11の試験したサンプルのうち９つにおいてAML CD34⁺CD38^-細胞細胞で観察された（図7A）。CD34⁺CD38⁺細胞集団において、類似したIL1RAP発現パターンが観察された（図7A）。さらに、IL1RAPはAML細胞株MONO-MAC-6及びALL細胞株REHにおいて発現された（図7B）。IL1RAP発現はまた２つの試験したサンプルのうち２つにおいてPh+ ALL CD34⁺CD38^-細胞で観察された（図7C）。IL1RAPを標的として使用して、MONOMAC-6及びREH細胞株もADCCアッセイにおいて試験した。両方のこれらの細胞株において、用量依存性IL1RAP標的化ADCC効果が観察され（図8）、治療用抗IL1RAP標的化抗体がCMLのみよりも広い適用を有するということを示した。

我々はまた、初代AML及びALL CD34+CD38-細胞に対してADCC実験を行い、これらの障害においても、KMT-1を使用して増加した細胞死が達成され得るという法則の証拠を実証した（図9）。

さらに、AMLに進行するMDS患者の１人及び２人のMPD患者（そのうち１人はJAK2変異+）からのCD34+CD38-細胞をIL1RAP標的化抗体で染色した。正常骨髄CD34+CD38-細胞と比較して増加したIL1RAP発現が観察された（図10、図2C）。

考察
本研究において、我々は、IL1RAPを、候補CML幹細胞を正常HSCと区別する最初の細胞表面バイオマーカーとして同定し、そしてこの知識をCML幹細胞の抗体依存性細胞死滅を誘導するために使用した。さらに我々は、IL1RAPを、AML幹細胞、ALL幹細胞、MPD幹細胞及びMDS幹細胞において上方調節されると同定し、そしてAML幹細胞及びALL幹細胞の両方がIL1RAP標的化抗体を使用して死滅し得るが、一方で正常幹細胞は影響を受けないということを示した。CML、ALL及びAML幹細胞がIL1RAP標的化抗体により死滅し得るという知見に基づいて、MPD幹細胞及びMDS幹細胞もADCCにおいて死滅し得るということも期待される。これらの知見は、白血病幹細胞の直接的標的化による白血病患者の処置のための新しい概念、CML幹細胞の下流の細胞を優先的に標的とする^3,4現在使用されているチロシンキナーゼ阻害剤と異なる概念を切り開く。

CML幹細胞がグリベックのような薬物に耐性である理由は部分的に不明であるが、寄与し得る要因は、静止状態及び比較的高いレベルのBCR／ABL1発現のような特徴、そしてまたこれらの細胞における特異的膜輸送体タンパク質のコンビナトリアル発現である^3,5,6。CML幹細胞のこれらの特徴を考えると、最終的にCML幹細胞を根絶させるための新規な処置アプローチを見つけることが非常に望ましい。CML幹細胞を直接標的とした抗体ベースの治療は、抗体の作用様式が、CML幹細胞をキナーゼ阻害剤処置に対して非応答性にする公知の抵抗性機構と独立しているような方策において役立つだろう。このような開発についての主要な制限は、CML Ph+を正常な健常（Ph-）幹細胞と区別する細胞表面受容体を完全に欠いていたことであった。我々は本明細書において、網羅的遺伝子発現分析からIL1RAPをそのような標的と同定し、そして重要なことには、その発現をBCR／ABL1発現と関連付けた（上記の実施例１を参照のこと）。

重要なことには、IL1RAPを標的とする抗体の生成により、我々は本明細書において、初めて、候補CML幹細胞が正常HSCを維持したまま標的とされ得るという概念の証拠を提供する。重要なことには、ADCCにおける抗体の作用様式は免疫細胞を標的細胞の死滅へと導くことであるので、治療機構は、現在の処置を使用してCMLにおいてキナーゼ阻害剤抵抗性を引き起こす公知の機構と独立している。それ故、CML幹細胞を標的とする抗体は、単独で、又は現在の治療計画と組み合わせて、CML幹細胞を根絶し、最終的にはCML患者に永久治癒をもたらす能力を有する。

興味深いことに、我々はまた、IL1RAP標的化抗体が、AML幹細胞（不良な予後を有する成人の間で最も一般的な型の急性白血病）、そしてまたALL幹細胞（小児白血病の最も一般的な型）のADCCを引き起こし得るということを観測した。集合的に、CML、AML、ALL、MDS、及びMPDにおけるCD34⁺CD38^-免疫表現型を有する白血病幹細胞でのIL1RAP発現の知見、並びにIL1RAP依存性様式での細胞死滅を実証したADCC実験は、これらの障害が抗IL1RAP治療用抗体を用いて処置され得るということを示す。

本明細書において示されるADCC実験において、ポリクローナル抗ヒトIL1RAP抗体を使用した（これは本質的にはいくつかの異なるモノクローナル抗体の混合物である）。しかし、当業者には当然のことながら、IL1RAPを標的とする個々のモノクローナル抗体もまたADCCの可能性を有するものと同定され得る。

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実施例３−固形腫瘍での遺伝子発現
材料及び方法
Oncomine検索エンジン（www.oncomine.org）を使用して、我々は様々な腫瘍型から樹立された様々な細胞株を含む全てのデータセットを同定した。同定された最大のデータセットはデータセット「Wooster Cell Line2」であった。このデータセットは308の癌細胞株を含み、20の異なる腫瘍型を代表する。使用した問い合わせ語は「IL1RAP」であり、「205277_at」のレポーター設定を用いた。

結果
我々はIL1RAPの上方調節された発現についての我々の基準に合う細胞株により代表される異なる固形腫瘍型を合計で17同定した（表１を参照のこと）。上方調節されたIL1RAPを示す各腫瘍型内の細胞株のパーセンテージは４％（大腸癌）から67％（黒色腫、前立腺癌）の範囲に及んだ。腫瘍型の中で、我々はヒトにおける最も一般的な癌実体のうちのいくつか（乳房、結腸、肺、前立腺及び膀胱からの悪性を含む）を同定した。さらに、いくつかの腫瘍型は不良な臨床成績を伴い、例えば黒色腫及び脳腫瘍は、IL1RAPの高度に上方調節された発現を示した。

結論
我々は、いくつかの異なる腫瘍実体がIL1RAPの上方調節された遺伝子発現を示すと結論づけた。

これらのデータは、IL1RAPに特異的な抗体を用いた処置がいくつかの異なるヒト癌型において新しい治療手段を提供するということを示す。

実施例４−ヒト細胞株でのIL1RAP発現のフローサイトメトリー分析
材料及び方法
試薬
・BD BiosciencesからのFc-受容体遮断薬
- 抗ヒトCD16（カタログ番号555404）
- 抗ヒトCD32（カタログ番号555447）
・BD BiosciencesからのAPC-マウスIgG1 kアイソタイプコントロール（カタログ番号555751）
・R&D systemからの抗ヒトIL-1 RAcP／IL-1 R3-APC（カタログ番号FAB676A）。

細胞株

細胞株を供給業者により推奨される培地で標準的な条件下で培養した。

FACS分析
細胞（350000）を、２ml FACS緩衝液（0.5％BSAを補充されたカルシウム及びマグネシウムを含まないPBS）中に再懸濁し、そして４分間300xgで遠心分離した。上清を廃棄し、そしてFc受容体を、細胞を抗CD16／CD32 mAbと共に３μg／mlの濃度で30μlの体積中で５分間室温にてインキュベートすることにより遮断した。次いで、55μl FACS緩衝液及び４μl APC標識アイソタイプ抗体又は５μl ヒトIL1RAP特異的APC標識モノクローナル抗体を細胞に加え、そして30分間＋４℃でインキュベートした。これらの細胞を３ml FACS緩衝液で洗浄し、４分間300xgで遠心分離し、そして上清を廃棄した。細胞を最終的に200μl FACS緩衝液に再懸濁し、そしてフローサイトメトリー分析を標準的な設定に従ってFACS CantoIIフローサイトメーター（BD Biosciences）で行った。

結果
試験した固形腫瘍細胞株でのIL1RAP発現レベルを以下の表３及び図１１に示す。

結論
IL1RAPの発現を固形腫瘍細胞株NCI-H2228、NCI-H716、HCC1954、SR、OV-90、COLO 829、SH-4及びSW 1783で観察した。これらの細胞株での発現は、ヒト慢性骨髄性白血病細胞株KU-812に匹敵するかそれより高かった。

実施例５−固形腫瘍細胞においてIL1RAPを標的とする抗体は抗体依存性細胞介在性細胞傷害（ADCC）を引き起こす
材料及び方法
キメラモノクローナル抗体81.2 hIgG1の開発及び製造
ヒトIL1RAPの細胞外部分に対して特異的なモノクローナル抗体を分泌するマウスハイブリドーマ細胞株を標準的な手順により生成した。手短には、BALB／cマウスを、IL1RAPの細胞外部分及びヒトIgG1のFc部分（Pro100-Lys330）からなる融合タンパク質で免疫した。脾細胞をマウス骨髄腫細胞株Sp2／0と融合させ、そしてIL1RAPの細胞外部分に特異的な抗体を産生するクローンを、免疫に使用した融合タンパク質を用いてスクリーニングすることにより単離し、そしてヒトIgG1で対比スクリーニングした（counter-screened）。

ハイブリドーマ細胞株クローン81.2により産生される抗体はIgG1／カッパ型であり、そしてIL1RAPポジティブ細胞及び組み換えタンパク質ヒトIL1RAP（21-367）に対して高い特異性を有することが見出された。この細胞株から、全RNAを単離し、そして重鎖及び軽鎖の可変領域（VH及びVK）を表すcDNAをPCRにより増幅し、クローン化し、そして配列決定した。

ヒトカッパ遺伝子の定常部分とインフレームでマウスVKをコードする遺伝子要素を合成し、そしてプラスミド哺乳動物発現ベクター中にクローン化した。

マウスVHをコードするPCRフラグメントをヒトIgG1の定常領域と組み合わせてプラスミド哺乳動物発現ベクター中にクローン化した。

HEK 293細胞を両方のプラスミドと共に同時形質導入し、そして細胞を100ng／ml キフネンシン（kifunensine）を補充した無血清培地で培養した。キメラ抗体81.2 hIgG1をプロテインＧクロマトグラフィーにより培地から精製した。

フローサイトメトリー
４つの異なるヒト固形癌細胞株、H2228（腺癌；非小細胞肺癌）、H716（結腸直腸腺癌）、HCC1954（乳管癌）、及びSH-4（黒色腫）からの細胞を採取し、そして抗ヒトIL1RAP抗体のmab81.2で染色した（Cantargia AB、Lund、Sweden）。検出のために、細胞を二次抗ヒトIgG PE結合抗体（Thermo-Fisher、Waltham、MA）で染色し、そして細胞をFACS CANTOフローサイトメーター（BDImmunocyteometry Systems、Mountain View、CA）を使用して分析した。

ADCCアッセイ
ADCCアッセイは、以前に記載されたプロトコルに基づくものであった（上記の実施例２を参照のこと）。手短には、標的細胞を製造者の指示に従ってPKH26（Sigma-Aldrich、St
Louis、MO）で標識し、そして96ウェルプレート中に１ウェルあたり10,000細胞の密度で播種した。続いて、抗体をウェルに様々な濃度で加え、そして３０分インキュベートした後、100,000個のＮＫ−エフェクター細胞を各ウェルに加えた。ＮＫ細胞を、健常ボランティアからインフォームドコンセントの後にＮＫ細胞ネガティブ細胞単離キットを使用することにより製造者の指示（Miltenyi Biotech、Bergisch Gladbach、Germany）に従って抽出した。非特異的ヒトIgG1抗体をコントロールとして実験で使用した（Eureka Therapeutics、Emeryville、CA）。

細胞死の程度を、7-AADポジティブ細胞の検出によりFACS CANTOフローサイトメーター（BD）を使用して評価した。抗体誘導細胞死のレベルを、以下の等式に従って計算した：規定された抗体濃度での7-AAD+細胞のパーセンテージ − 抗体を用いない場合の7-AAD+細胞のパーセンテージ

結果
ヒトIL1RAPに対する抗体はヒト非白血病癌細胞をフローサイトメトリーにおいて分類し、そしてNK細胞をADCCへと導いてヒト癌細胞の死滅をもたらす
我々は、ヒトIL1RAPに対するポリクローナル抗体であるKMT1が、NK細胞をADCCへと導き、そしてIL1RAP高発現CML細胞株KU812の細胞死を誘導するが、IL1RAP低発現KG1細胞においては誘導しないということを示した（上記の実施例２を参照のこと）。

本研究からの結果は、白血病細胞だけでなく、固形ヒト癌由来の細胞もIL1RAPにより媒介されるADCCに対して感受性であるということを示す。４つの異なる固形ヒト癌型を代表する４つの異なるヒト癌細胞株を調べ、そして全てが細胞表面上のIL1RAPの発現を示した（図12）。

試験した４つ全ての細胞株はまた、用量依存性のような様式で、ヒトIL1RAPに対する抗体であるmab81.2により媒介されるADCCに対して感受性であることが示された（図13）。

結論
本研究は、肺癌、結腸癌、乳癌、及び悪性黒色腫を含むいくつかのヒト癌型の細胞表面上でIL1RAPが発現されることを裏付けた。

IL1RAPに特異的な抗体を使用して、試験した４つの細胞固形腫瘍株の全ての細胞が、ADCCアッセイにおいて特異的NK媒介死滅により標的とされるということが示された。

実施例６−ヒト黒色腫SK-MEL-5異種移植マウスモデルにおけるインビボでのモノクローナル抗体81.2の有効性
材料及び方法
IgG1及びIgG2aアイソタイプのマウスモノクローナル抗体81.2の開発及び産生
ヒトIL1RAPの細胞外部分に対して特異的なモノクローナル抗体を分泌していたマウスハイブリドーマ細胞株を標準的な手順により生成した。手短には、BALB／cマウスを、IL1RAPの細胞外部分及びヒトIgG1のFc部分（Pro100-Lys330）からなる融合タンパク質で免疫した。脾細胞をマウス骨髄腫細胞株Sp2／0と融合させ、そしてクローンを製造し、そしてIL1RAPの細胞外部分に対して特異的な抗体を産生する細胞を、免疫に使用した融合タンパク質を用いてスクリーニングすることにより単離し、そしてヒトIgG1を用いて対比スクリーニングした。

ハイブリドーマ細胞株クローン81.2により産生された抗体はIgG1／カッパ型であり、IL1RAPポジティブ細胞及び組み換えタンパク質ヒトIL1RAP（21-367）に対して高い特異性を有することがわかった。この細胞株から、全RNAを単離し、そして重鎖及び計算の可変領域（VH及びVK）を表すcDNAをPCRにより増幅し、クローン化し、そして配列決定した。

マウスカッパ遺伝子の定常部分とインフレームでマウスVKをコードする遺伝子要素を合成し、そしてプラスミド哺乳動物発現ベクター中にクローン化した。

マウスVHをコードするPCRフラグメントをマウスIgG2aの定常部分と組み合わせてプラスミド哺乳動物発現ベクター中にクローン化した。

HEK 293細胞を両方のプラスミドで同時形質導入し、そして細胞を無血清培地で培養した。IgG2aアイソタイプのマウス抗体81.2をプロテインＧクロマトグラフィーにより培地から精製した。

フローサイトメトリー
ヒト悪性黒色腫細胞株SK-MEL-5におけるIL1RAP発現を確認し、そして発現をヒトCML細胞株KU812と比較するために、両方の細胞株を標準的な手順に従って培養し、そして対数増殖期に維持した。3.5−5.0x10⁵細胞／mLの細胞採取物を、マウスIgG1 81.2モノクローナル抗体で１〜50μg／mLで標識した。IgG1アイソタイプコントロール抗体をコントロールとして使用した。染色をAccuri C6 Flow Cytometerを使用して分析した。

薬物及び処置

ヒトIL1RAP特異的mAb81.2又はビヒクルのインビボ投与
８〜12週齢の雌性CD.17 SCIDマウスに１x10⁷ SK-MEL-5腫瘍細胞を１動物あたり50％マトリゲルで側腹に皮下注射した。処置は、黒色腫細胞注射の約１週間後に、腫瘍が108〜128mm³の寸法に達した場合に開始した。２０匹の動物における腫瘍寸法の対適合（paired match）を行い、２つの処置グループにおいてそれぞれ１０匹のマウスとした。

マウスIgG2aモノクローナル抗体81.2を、10mg／kgの用量で、かつPBS中10mL／kgの体積で調製した。コントロール動物に等体積のPBSを与えた。腹腔内経路により処置を行った。カリパス測定により腫瘍体積、及び総体重を週に２回モニタリングした。

研究の終点は腫瘍成長遅延であった。

結果
フローサイトメトリー

例となるmAb 81.2のインビボ活性
投薬開始から３３日目における研究の分析は、22日目（p＜0.05）、26及び29日目（p＜0.001）並びに33日目（p＜0.0001）にコントロールグループと比較して、処置グループにおいて腫瘍成長の統計的に有意な遅れを示した（図14を参照のこと）。

結論
IL1RAPの発現を、黒色腫腫瘍細胞株SK-MEL-5においてフローサイトメトリーにより確認し、そしてヒト慢性骨髄性白血病細胞株KU-812における発現より高い発現を示した。

インビボデータは、週に２回、10mg／kgの用量で投与されたヒトIL1RAP特異的モノクローナル抗体81.2が、IL1RAPを発現するヒト黒色腫細胞株SK-MEL-5の腫瘍細胞成長において阻害を生じたことを示す。

Claims (45)

1. 固形腫瘍に関連する細胞の、細胞死を誘導し、かつ／又は成長及び／若しくは増殖を阻害するのに使用するための、インターロイキン−１受容体アクセサリータンパク質（ＩＬ１ＲＡＰ）に対する特異性を有する抗体又はその抗原結合フラグメントを含む又はからなる薬剤であって、ここで該細胞がＩＬ１ＲＡＰを発現する、上記薬剤。
2. 患者における固形腫瘍の処置又は予防における使用のための、請求項１に記載の薬剤。
3. 固形腫瘍に関連する細胞を検出するのに使用するための、インターロイキン−１受容体アクセサリータンパク質（ＩＬ１ＲＡＰ）に対する特異性を有する抗体又はその抗原結合フラグメントを含む又はからなる薬剤であって、ここで該細胞がＩＬ１ＲＡＰを発現する、上記薬剤。
4. 固形腫瘍が、前立腺癌、乳癌、肺癌、大腸癌、黒色腫、膀胱癌、脳／ＣＮＳ腫瘍、子宮頸癌、食道癌、胃癌、頭頸部癌、腎臓癌、肝臓癌、リンパ腫、卵巣癌、膵臓癌、及び肉腫からなる群より選択される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の薬剤。
5. 固形腫瘍が、乳房、皮膚、結腸、肺、リンパ系、脳及び卵巣の癌からなる群より選択される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の薬剤。
6. 固形腫瘍が、非小細胞肺癌、結腸直腸癌、乳癌及び黒色腫からなる群より選択される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の薬剤。
7. 固形腫瘍が黒色腫である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の薬剤。
8. 結合部分がヒトＩＬ１ＲＡＰに対する特異性を有する、請求項１〜７のいずれか１項に記載の薬剤。
9. ＩＬ１ＲＡＰが細胞表面上に局在する、請求項１〜８のいずれか１項に記載の薬剤。
10. ＩＬ１ＲＡＰに対する１つ又はそれ以上の補助受容体の結合を遮断することができる、請求項１〜９のいずれか１項に記載の薬剤。
11. １つ又はそれ以上の補助受容体が、ＩＬ１Ｒ１、ＳＴ２、Ｃ−ＫＩＴ及びＩＬ１ＲＬ２からなる群より選択される、請求項１０に記載の薬剤。
12. 固形腫瘍に関連する細胞を死滅させることができる、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の薬剤。
13. 固形腫瘍に関連する細胞のアポトーシスを誘導することができる、請求項１２に記載の薬剤。
14. 細胞の死滅が、抗体依存性細胞介在性細胞傷害（ＡＤＣＣ）により誘導される、請求項１２又は１３に記載の薬剤。
15. インタクトな抗体を含むか、又はインタクトな抗体からなる、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の薬剤。
16. 抗体の抗原結合フラグメントを含むか、又は抗体の抗原結合フラグメントからなる、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の薬剤。
17. 抗原結合フラグメントが、Ｆｖフラグメント（例えば、単鎖Ｆｖ、ジスルフィド結合Ｆｖ及びドメイン抗体）及びＦａｂ様フラグメント（例えば、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント及びＦ（ａｂ）₂フラグメント）からなる群より選択される、請求項１６に記載の薬剤。
18. 抗体が組み換え抗体である、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の薬剤。
19. 抗体がモノクローナル抗体である、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の薬剤。
20. 抗体がポリクローナル抗体である、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の薬剤。
21. 抗体又はその抗原結合フラグメントがヒト又はヒト化されたものである、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の薬剤。
22. 薬剤のインビボ半減期を延長させるための部分をさらに含む、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の薬剤。
23. インビボ半減期を延長させるための部分が、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ヒト血清アルブミン、グリコシル化基、脂肪酸及びデキストランからなる群より選択される、請求項２２に記載の薬剤。
24. 薬剤がＰＥＧ化される、請求項２２又は２３に記載の薬剤。
25. 細胞傷害性部分をさらに含む、請求項１〜２４のいずれか１項に記載の薬剤。
26. 細胞傷害性部分が放射性同位体を含むか、又は放射性同位体からなる、請求項２５に記載の薬剤。
27. 放射性同位体が、アスタチン−２１１、ビスマス−２１２、ビスマス−２１３、ヨウ素
    −１３１、イットリウム−９０、ルテチウム−１７７、サマリウム−１５３及びパラジウム−１０９からなる群より選択される、請求項２６に記載の薬剤。
28. 細胞傷害性部分が、毒素（例えばサポリン又はカリケアミシン）を含むか、又は毒素からなる、請求項２５に記載の薬剤。
29. 細胞傷害性部分が、化学療法剤（例えば代謝拮抗薬）を含むか、又は化学療法剤からなる、請求項２５に記載の薬剤。
30. 検出可能な部分をさらに含む、請求項１〜２９のいずれか１項に記載の薬剤。
31. 検出可能な部分が放射性同位体を含むか、又は放射性同位体からなる、請求項３０に記載の薬剤。
32. 放射性同位体が、テクネチウム−９９ｍ；インジウム−１１１；ガリウム−６７；ガリウム−６８；ヒ素−７２；ジルコニウム−８９；ヨウ素−１２；タリウム−２０１からなる群より選択される、請求項３１に記載の薬剤。
33. 検出可能な部分が、常磁性同位体を含むか、又は常磁性同位体からなる、請求項３０に記載の薬剤。
34. 常磁性同位体が、ガドリニウム−１５７；マンガン−５５、ジスプロシウム−１６２、クロム−５２；鉄−５６からなる群より選択される、請求項３３に記載の薬剤。
35. 有効量の請求項１〜３４のいずれか１項において定義される薬剤、及び薬学的に許容しうる賦形剤、担体又は添加剤を含む、医薬組成物。
36. 非経口送達に適合された、請求項３５に記載の医薬組成物。
37. 静脈内送達に適合された、請求項３５に記載の医薬組成物。
38. 請求項１〜３４のいずれか１項において定義される薬剤、又は請求項３５〜３７のいずれか１項において定義される医薬組成物を含んでなるキット。
39. 固形腫瘍に関連する細胞の、細胞死を誘導し、かつ／又は成長及び／若しくは増殖を阻害するための医薬の製造における、請求項１〜３４のいずれか１項において定義される薬剤の使用であって、ここで該細胞はＩＬ１ＲＡＰを発現する、上記使用。
40. 医薬が、患者における固形腫瘍を処置又は予防するのに使用するためのものである、請求項３９に記載の使用。
41. 固形腫瘍に関連する細胞を検出するための診断剤の製造における、請求項１〜３４のいずれか１項において定義される薬剤の使用であって、ここで該細胞がＩＬ１ＲＡＰを発現する、上記使用。
42. 固形腫瘍が、前立腺癌、乳癌、肺癌、大腸癌、黒色腫、膀胱癌、脳／ＣＮＳ腫瘍、子宮頸癌、食道癌、胃癌、頭頸部癌、腎臓癌、肝臓癌、リンパ腫、卵巣癌、膵臓癌、及び肉腫からなる群より選択される、請求項３９〜４１のいずれか１項に記載の使用。
43. 固形腫瘍が、乳房、皮膚、結腸、肺、リンパ系、脳及び卵巣の癌からなる群より選択さ
    れる、請求項４２に記載の使用。
44. 固形腫瘍が、非小細胞肺癌、結腸直腸癌、乳癌及び黒色腫からなる群より選択される、請求項４２に記載の使用。
45. 固形腫瘍が黒色腫である、請求項３９〜４１のいずれか１項に記載の使用。

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