BR112013018399B1 - Anticorpos anti-il1rap e seus usos para tratamento humano - Google Patents

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Abstract

ANTICORPOS ANTI-IL1RAP E SEUS USOS PARA TRATAMENTO HUMANO. A presente invenção fornece agentes compreendendo ou consistindo de uma porção de ligação com a especificidade para a proteína acessória do receptor de interleucina-1, IL1RAP) para utilização na indução de morte celular e / ou a inibição do crescimento e / ou a proliferação de células associadas a um tumor sólido, em que o células expressam IL1RAP. Um aspecto relacionado da invenção proporciona agentes compreendendo ou consistindo de uma porção de ligação com a especificidade para a a proteína acessória receptor de interleucina-1, (IL1RAP)uso na detecção de células patológicos associados com um tumor sólido, na qual a células expressam IL1RAP. É fornecido composições farmacológicas que compreendem os agentes da invenção e métodos usando o mesmo.

Description

Campo da Invenção
[001] A presente invenção se refere a agentes para uso no tratamento e diagnóstico de tumores sólidos, como câncer de próstata, câncer de mama, câncer de pulmão, câncer colo-retal, melanoma, câncer de bexiga, câncer de cérebro / CNS, câncer de colo do útero, câncer de esôfago, câncer gástrico, câncer de cabeçal pescoço, câncer de rim, câncer de fígado, linfomas, câncer de ovário, câncer de pâncreas, e sarcomas.
Antecedentes da Invenção
[002] A resistência às drogas é um fator importante que limita a eficácia da quimioterapia em tumores sólidos. Tais tumores podem ser intrinsecamente resistentes antes da quimioterapia, ou a resistência pode ser adquirida durante o tratamento de tumores que estão inicialmente sensíveis à quimioterapia.
[003] Além disso, no processo de aquisição de resistência, o tumor pode tornar-se multi-resistente a uma variedade de quimioterapias e resulta em resistência, o que acaba por conduzir ao fracasso do tratamento em 90% dos pacientes com a doença metastática.
[004] Assim, a presente invenção procura proporcionar novos agentes e métodos para uso no tratamento e diagnóstico de tumores sólidos. Sumário da Invenção
[005] Um primeiro aspecto da invenção proporciona um agente compreendendo ou consistindo de uma porção de ligação com a especificidade para a proteína acessória do receptor de interleucina-1 (IL1 RAP) para utilização na indução de morte celular (quer diretamente, quer indiretamente, através do acionamento do sistema imunológico) e / ou a inibição do crescimento (isto é, dimensões) e / ou a proliferação (isto é, número) de células associadas a um tumor sólido, em que as células expressam IL1 RAP. Assim, a invenção proporciona agentes para utilização no tratamento ou prevenção de um tumor sólido num paciente.
[006] Um segundo aspecto relacionado da invenção fornece um agente compreendendo ou consistindo de uma porção de ligação com a especificidade para proteína acessória do receptor de interleucina-1 (IL1 RAP) para uso em células associadas com a detecção de um tumor sólido, em que as células expressam IL1 RAP.
[007] Por "proteína acessória do receptor de interleucina-1", "IL1 RAP" e "IL1-RAP" que incluem especificamente a proteína humana IL1 RAP, por exemplo, tal como descrito no GenBank No. de acesso AAB84059, NCBI sequência de referência: NP_002173.1 e UniProtKB / Adesão Swiss-Prot No. Q9NPH3-1 (ver também a Huang et al. de 1997, Proc. Natl. Acad. Sci. EUA. 94 (24), 12829-12832). IL1 RAP é também conhecida na literatura científica como IL1 R3, C3orf13, FLJ37788, IL-1 e RACP EG3556.
[008] Por "porção de ligação" se incluem todos os tipos de entidade química (por exemplo, oligonucleotídeos, polinucleotídeos, polipeptídeos e compostos peptidomiméticos pequenos) que são capazes de se ligar a IL-1 RAP. Vantajosamente, a porção de ligação é capaz de se ligar seletivamente {isto é, preferencialmente) para a IL1 RAP sob condições fisiológicas. A porção de ligação tem de preferência a especificidade para RAP IL1 humana, que pode ser localizada na superfície de uma célula (por exemplo, a célula de tumor sólido).
[009] Por "células associados a um tumor sólido" se inclui células de tumores sólidos, por si só. Além disso, tais células incluem células tronco patológicas (isto é, células-tronco cancerígenas, ou CSCs) e as células progenitoras que são responsáveis, direta ou indiretamente para o desenvolvimento de um tumor sólido em um indivíduo. Exemplos de CSCs são divulgados em Visvader & Lindeman, 2008, Nat Rev Cancer 8:755-768.
[0010] Em uma concretização do primeiro aspecto da invenção, o tumor sólido é seleccionado de entre o grupo consistindo de câncer da próstata, câncer da mama, câncer do pulmão, câncer colorectal, melanomas, câncer de bexiga, câncer de cérebro / SNC, câncer de colo do útero, câncer de esôfago, câncer gástrico, câncer de cabeçal pescoço, câncer de rim, câncer de fígado, linfomas, câncer de ovário, câncer de pâncreas e sarcomas. Por exemplo, o tumor sólido pode ser selecionado a partir do grupo consistindo de cânceres da próstata, mama, pele, cólon, pulmão, útero e órgãos urinários. Em outra concretização, o tumor sólido pode ser selecionado a partir dos grupos que consistem de câncer de próstata, melanoma, câncer de colo uterino, câncer do esôfago, e de cabeça e / ou pescoço.
[0011] Em uma outra concretização do primeiro aspecto da invenção, o tumor sólido é um melanoma.
[0012] Em relação aos aspectos de diagnóstico da invenção, é suficiente que o agente seja apenas capaz de se ligar a IL-1 RAP presente na superfície das células associadas com o tumor sólido (sem ter qualquer impacto funcional sobre as células).
[0013] Em relação aos aspectos terapêuticos e profiláticos da invenção, irá ser apreciado pelos técnicos versados no assunto que a ligação do agente a IL1 RAP presente na superfície das células associadas com o tumor sólido pode levar a uma modulação (isto é, um aumento ou diminuição) de uma atividade biológica de IL-1RAP. No entanto, um tal efeito modulador não é essencial, por exemplo, os agentes da invenção podem provocar um efeito terapêutico e profilático simplesmente em virtude de se ligar a IL-1RAP sobre a superfície das células associada com o tumor sólido, o qual por sua vez pode provocar o sistema imunológico para induzir a morte celular (por exemplo, ADCC e / ou pela presença do agente dentro de uma porção citotóxical radioativa).
[0014] Por "atividade biológica de IL-1 RAP" incluímos qualquer interacção ou evento de sinalização que envolve a IL1 RAP sobre as células associadas com o tumor sólido. Por exemplo, em uma concretização o agente é capaz de bloquear a ligação de um ou vários co-receptores a IL1 RAP (tais como IL1 R1, ST2, C-kit e / ou IL-1 RL2).
[0015] Esta inibição da atividade biológica de IL-1 RAP por um agente da invenção pode ser, na totalidade ou em parte. Por exemplo, o agente pode inibir a atividade biológica de IL-1 RAP em pelo menos 10%, preferencialmente, pelo menos 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% ou 90%, e mais preferencialmente por 100%, comparado com a atividade biológica de IL-1RAP em células associadas com o tumor sólido, o qual não tenha sido exposto ao agente. Em uma concretização preferida, o agente é capaz de inibir a atividade biológica de IL-1RAP em 50% ou mais em comparação com a atividade biológica de IL-1RAP em células associadas com o tumor sólido, que não tenham sido expostos ao agente.
[0016] Do mesmo modo, será apreciado que a inibição do crescimento e / ou a proliferação das células associadas com o tumor sólido pode ser na totalidade ou em parte. Por exemplo, o agente pode inibir o crescimento e / ou a proliferação das células associadas com o tumor sólido em pelo menos 10%, preferencialmente, pelo menos 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% ou 90%, e mais preferencialmente, por 100% em comparação com o crescimento e / ou a proliferação de células associadas com o tumor sólido, que não tenham sido expostos ao agente.
[0017] Em uma outra concretização preferida, o agente é capaz de matar as células associadas com o tumor sólido. Em particular, o agente pode ser capaz de morte celular por apoptose ou autofagia. Por exemplo, o agente pode induzir apoptose por citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC).
[0018] Como acima indicado, os agentes da invenção podem compreender ou consistir em qualquer entidade química apropriada constituindo de uma porção de ligação com especificidade para a IL1 RAP.
[0019] Os métodos para a detecção de interações entre uma entidade química de teste e IL1RAP são bem conhecidos no estado da técnica. Por exemplo, métodos de ultrafiltração com espectroscopia de massa de vaporização iônical HPLC ou outros métodos físicos e analíticos podem ser utilizados. Além disso, métodos de Transferência de Ressonância de Energia fluorescência (FRET) podem ser utilizados, em que a ligação de duas entidades marcadas fluorescentes pode ser medida através da medição da interação dos marcadores fluorescentes quando em estreita proximidade uns dos outros.
[0020] Os métodos alternativos de detecção da ligação de IL-1RAP a macromoléculas, por exemplo, DNA, RNA, proteínas e fosfolípidos, incluem um ensaio de ressonância de plasmon de superfície, por exemplo, como descrito em Plant et al, 1995, Analyt Biochem 226 (2), 342 - 348. Tais métodos podem fazer uso de um polipeptídeo que é marcado, por exemplo, com um marcador radioativo ou fluorescente.
[0021] Um outro método de identificação de uma entidade química que é capaz de se ligar a IL-1 RAP é aquele em que a proteína é exposta ao composto e de qualquer ligação do composto à referida proteína é detectado e / ou medido. A constante de ligação para a ligação do composto para o polipeptídeo pode ser determinada. Os métodos adequados para a detecção e / ou medição (quantificação) a ligação de um composto a um polipeptídeo são bem conhecidos dos técnicos versados no assunto e pode ser realizada, por exemplo, utilizando um método capaz de operação de alto rendimento, por exemplo, um método baseado em chip. A nova tecnologia, chamada VLSIPS™, permitiu a produção de extremamente pequenos chips que contêm centenas de milhares ou mais de diferentes sondas moleculares. Esses chips biológicos têm sondas dispostas em matrizes, cada sonda atribuído um local específico. Chips biológicos têm sido produzidos em que cada local tem uma escala de, por exemplo, dez micra. Os chips podem ser usados para determinar se as moléculas alvo interagem com qualquer uma das sondas no chip. Depois de expor a matriz a moléculas alvo, sob condições de teste selecionadas, os dispositivos de digitalização pode examinar cada localização na matriz e determinar se uma molécula alvo interagiu com a sonda naquele local.
[0022] Outro método para identificar compostos com afinidade de ligação para IL-1 RAP é o sistema duplo- híbrido em leveduras, em que os polipeptídeos da invenção pode ser utilizado para "capturar" proteínas que se ligam a IL-1 RAP. O sistema duplo híbrido em levedura está descrito em Fields & Song, Nature 340:245-246 (1989).
[0023] Em uma concretização preferida, o agente compreende ou é constituído por um polipeptídeo.
[0024] Por exemplo, o agente pode compreender ou consistir de um anticorpo ou um fragmento de ligação ao antígeno deste com especificidade de ligação para IL-1 RAP ou uma variante, fusão, ou derivado do referido anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno, ou uma fusão de uma ou a referida variante seu derivado, que mantém a especificidade de ligação para IL1 RAP.
[0025] Por "anticorpo", incluímos moléculas de anticorpo substancialmente intactas, bem como anticorpos quiméricos, anticorpos humanizados, anticorpos humanos (em que, pelo menos um aminoácido é transformado em relação aos anticorpos humanos de ocorrência natural), anticorpos de cadeia simples, anticorpos biespecíficos, anticorpos de cadeias pesadas, anticorpos de cadeias leves, os homodímeros e heterodímeros de anticorpos de cadeias pesadas e / ou leves, e fragmentos antigênicos de ligação e derivados do mesmo.
[0026] Por "fragmento de ligação ao antígeno" significa um fragmento funcional de um anticorpo que é capaz de se ligar a IL-1 RAP.
[0027] Preferencialmente, o fragmento de ligação ao antígeno é selecionado a partir do grupo consistindo de fragmentos Fv (por exemplo, Fv de cadeia simples e Fv ligado por dissulfeto), os fragmentos semelhantes a Fab (por exemplo fragmentos Fab, fragmentos Fab' e fragmentos F(ab)2), domínios variáveis individuais (por exemplo, domínios VH e VL) e anticorpos de domínio (DAbs, incluindo formatos simples e duplo [i.e., dAb-ligante-dAb]).
[0028] As vantagens de utilizar fragmentos de anticorpo, em vez de anticorpos inteiros, são várias. O menor tamanho dos fragmentos pode conduzir a propriedades farmacológicas melhoradas, tais como uma melhor penetração do tecido sólido. Além disso, os fragmentos de ligação ao antígeno, tais como fragmentos de anticorpos Fab, Fv, ScFv e dAb podem ser expressos em e segregados a partir de E. coli, permitindo, assim, a produção fácil de grandes quantidades dos referidos fragmentos.
[0029] Também incluídos dentro do escopo da invenção são as versões de anticorpos de ligação ao antígeno e os seus fragmentos modificados, por exemplo, modificada pela ligação covalente de polietilenoglicol ou outro polímero apropriado (ver abaixo).
[0030] Métodos de produção de anticorpos e fragmentos de anticorpos são bem conhecidos no estado da técnica. Por exemplo, os anticorpos podem ser gerados por meio de qualquer um dos vários métodos que empregam a indução da produção in vivo de moléculas de anticorpos, o rastreio de bibliotecas de imunoglobulina (Orlandi. et al, 1989 Proc Natl Acad Sci USA 86:3833 - 3837; Winter et al, 1991, Nature 349:293-299) ou uma geração de moléculas de anticorpos monoclonais por linhagens de células em cultura. Estes incluem, mas não estão limitadas a, técnica de hibridoma, técnica de hibridoma de células B humanas e a técnica do hibridoma do vírus de Epstein-Barr (EBV) (Kohler et al, 1975 Nature 256:4950497, Kozbor et al, 1985 J. Immunol Methods 81 :31-42; Cote et al, 1983 Proc Natl Acad Sci USA 80:2026-2030, Cole et al, 1984 Cell Mol. Biol. 62:109-120).
[0031] Os anticorpos monoclonais adequados para antígenos selecionados podem ser preparados por técnicas conhecidas, por exemplo, como as divulgadas em "Monoclonal Antibodies: A Manual of techniques", H Zola (CRC Press, 1988) e em "Monoclonal Hybridoma Antibodies: Techniques and Applications", Hurrell, JGR (CRC Press, 1982).
[0032] Do mesmo modo, os fragmentos de anticorpos podem ser obtidos utilizando métodos bem conhecidos no estado da técnica (ver, por exemplo, Harlow & Lane, 1988, "Antibodies: A Laboratory Manuaf, Cold Spring Harbor Laboratory, Nova Iorque). Por exemplo, fragmentos de anticorpo, de acordo com a presente invenção podem ser preparados por hidrólise proteolítica do anticorpo ou por expressão em E. Coli ou células de mamífero (por exemplo, cultura de células de ovário de hamster chinês ou outros sistemas de expressão de proteínas) de DNA que codificam para o fragmento. Alternativamente, os fragmentos de anticorpo podem ser obtidos por digestão com pepsina ou papaína de anticorpos inteiros, através de métodos convencionais.
[0033] Será apreciado por técnicos versados no assunto que, para a terapia humana ou de diagnóstico, os anticorpos humanos ou humanizados são de preferência utilizados. Formas humanizadas de anticorpos não humanos (por exemplo, murinos) são geneticamente modificadas de anticorpos quiméricos ou fragmentos de anticorpos que possuam, de preferência, porções mínimas de derivados de anticorpos não humanos. Os anticorpos humanizados incluem anticorpos em que as regiões determinantes de complementaridade de um anticorpo humano (o anticorpo receptor) são substituídas por resíduos de uma região determinante de complementaridade de uma espécie não humana (anticorpo doador), tal como camundondo, rato, coelho, possuindo a funcionalidade desejada. Em alguns casos, resíduos da estrutura Fv do anticorpo humano são substituídos pelos correspondentes resíduos não humanos. Os anticorpos humanizados podem também compreender resíduos que não são encontrados nem no anticorpo receptor nem na região determinante de complementaridade ou sequências esqueleto importadas. Em geral, o anticorpo humanizado compreenderá substancialmente a totalidade de pelo menos um, e tipicamente dois domínios variáveis, em que todas ou substancialmente todas as regiões determinantes de complementaridade correspondem às de um anticorpo não humana e todas, ou substancialmente todos, as regiões estruturais correspondem às de uma sequência consenso humana relevante. Os anticorpos humanizados optimamente incluem também pelo menos uma porção de uma região constante de anticorpo, tal como uma região Fc, normalmente derivada de um anticorpo humano (ver, por exemplo, Jones et al, 1986 Nature 321 :522-525,.. Riechmann et al, 1988, Nature 332:323-329;. Presta, 1992, Curr Op. Struct Biol 2:593-596)
[0034] Métodos para humanizar anticorpos não humanos são bem conhecidos no estado da técnica. Geralmente, o anticorpo humanizado possui um ou mais resíduos de aminoácidos introduzidos nele de uma fonte que é não humana. Estes resíduos de aminoácidos não-humanos, frequentemente, referidos como resíduos importados, são tipicamente retirados de um domínio variável importado. A humanização pode ser realizada essencialmente como descrita (ver, por exemplo, Jones et al, 1986, Nature 321 :522-525, Reichmann et al, 1988 Nature 332:323-327; Verhoeyen et al, 1988., 239:1534-15361 Ciência; US 4,816,567) pela substituição de regiões determinantes de complementaridade humana com regiões determinantes de complementaridade de roedores correspondentes. Assim, estes anticorpos humanizados são anticorpos quiméricos, em que substancialmente menos de um domínio variável humano intacto foi substituído pela sequência correspondente de uma espécie não humana. Na prática, os anticorpos humanizados podem ser anticorpos tipicamente humanos, nos quais alguns resíduos da região determinante de complementaridade e possivelmente alguns resíduos estruturais são substituídos por resíduos de locais análogos em anticorpos de roedores.
[0035] Os anticorpos humanos também podem ser identificados utilizando várias técnicas conhecidas no estado da técnica, incluindo bibliotecas de exibição em fagos (ver, por exemplo, Hoogenboom & Winter, 1991, J. Mol. Biol 227:381, Marcas, ET al, 1991, J. Mol. Biol. 222:581; Cole et al, 1985, In: Monoclonal antibodies and Câncer Therapy, Alan R. Liss, pp 77; Boerner et ai, 1991, J. Immunol 147:86-95).
[0036] Uma vez que os anticorpos adequados são obtidos, eles podem ser testados quanto à atividade, por exemplo, por ELISA.
[0037] Em uma concretização alternativa do primeiro aspecto da invenção, o agente compreende ou é constituído por uma porção de ligação a não imunoglobulina, por exemplo, como descrito em Skerra, Curr Opin Biotechnol. 2007 Ago, 18 (4): 295 - 304.
[0038] Em uma outra concretização alternativa, o agente compreende ou é constituído por um aptâmero. Por exemplo, o agente pode compreender ou consistir de um aptâmero de peptídico ou aptãmero de ácido nucleico (ver Hoppe-Seyler & Butz, 2000, J. Mol. Med. 78 (8): 426-30; Bunka DH & Stockley JP, 2006, Nat. Rev Microbiol 4 (8): 588 - 96 e Drabovich ef al, 2006, Anal Chem 78 (9): 3171 - 8).
[0039] Em uma concretização alternativa ainda adicional, o agente compreende ou é constituído por uma entidade química pequena. Tais entidades com IL1 RAP propriedades de ligação podem ser identificadas por rastreio de bibliotecas de compostos pequenos comerciais (por exemplo, tal como disponível a partir de Chembridge Corporation, San Diego, EUA).
[0040] Em adição à porção de ligação, os agentes da invenção podem ainda compreender uma porção de aumentar in vivo a meia-vida do agente, tal como, mas não limitados a polietilenoglicol (PEG), albumina do soro humano, grupos de de glicosilação, ácidos graxos e dextrano. Tais outras porções podem ser conjugadas ou associadas de outra forma com a porção de ligação utilizando métodos bem conhecidas no estado da técnica.
[0041] Do mesmo modo, será apreciado que os agentes da invenção podem ainda compreender uma porção citotóxica.
[0042] Por exemplo, a porção citotóxica pode compreender ou consistir de um radioisótopo, tal como astatine-211, bismuto-212, bismuto-213, iodo-131, ítrio-90, o lutécio-177, samário-153 e paládio-109.
[0043] Alternativamente, a porção citotóxica pode compreender ou consistir de uma toxina (por exemplo, saporina ou caliqueamicina).
[0044] Em uma outra alternativa, a porção citotóxica pode compreender ou consistir de um agente quimioterapêutico (tal como, um anti-metabólito).
[0045] Do mesmo modo, será apreciado que os agentes da invenção podem ainda compreender uma porção detectável.
[0046] Por exemplo, a porção detectável pode compreender ou consistir de um radioisótopo, tal como Technitium-99m, índio-111, gálio-67, gálio-68, 72- arsénio, zircónio-89, iodo-12 ou tálio-201.
[0047] Alternativamente, a porção detectável compreende ou é constituído por um isótopo paramagnético, tal como o gadolínio-157, Manganês-55, disprósio-162, cromo-52 ou ferro-56.
[0048] Porções citotóxicas e detectáveis podem ser conjugados ou de outra forma com a porção de ligação utilizando métodos bem conhecidos no estado da técnica (por exemplo, terapia de imunoconjugado existente, gemtuzumab ozogamicina [nome comercial: Mylotarc], compreende um anticorpo monoclonal ligado a citotoxina caliqueamicina).
[0049] Um terceiro aspecto da invenção proporciona uma composição farmacêutica compreendendo uma quantidade eficaz de um agente, tal como definido em relação ao primeiro ou segundo aspectos da invenção, juntamente com um tampão, diluente, veículo, adjuvante ou excipiente farmaceuticamente aceitável.
[0050] Os compostos adicionais podem também ser incluídos nas composições, incluindo, agentes quelantes, tais como EDTA, citrato, EGTA ou glutationa.
[0051] As composições farmacêuticas podem ser preparadas de um modo conhecido no estado da técnica, que seja suficientemente estável em armazenamento e adequada para administração a seres humanos e animais. Por exemplo, as composições farmacêuticas podem ser liofilizadas, por exemplo, através de secagem por congelação, secagem por pulverização, refrigeração por pulverização, ou através da utilização de formação de partículas de formação de partículas supercrítica.
[0052] Por "farmaceuticamente aceitável" significa um material não tóxico que não diminui a eficácia da atividade de ligação IL1-RAP ao agente da invenção. Tais tampões farmaceuticamente aceitáveis, veículos ou excipientes são bem conhecidos no estado da técnica (ver Remington's Pharmaceutical Sciences, 18a edição, AR Gennaro, ed., Mack Publishing Company (1990) e Handbook of Pharmaceutical Excipients, 3rd edition, A. Kibbe, Ed., Pharmaceutical Press (2000), cujas descrições das quais são aqui incorporadas por referência).
[0053] O termo "tampão", destina-se a significar uma solução aquosa contendo uma mistura de ácido-base com a finalidade de estabilização do pH. Exemplos de tampões são Trizma, Bicine, Tricine, MOPS, MOPSO, MOBS, Tris, Hepes, HEPBS, MES, fosfato, carbonato, acetato, citrato, glicolato, lactato, borato, ACES, ADA, tartarato, AMP, AMPD, AMPSO, BES, CABS, cacodilato, CHES, DIPSO, EPPS, etanolamina, glicina, HEPPSO, imidazol, ácido imidazoleláctico, PIPES, SSC, SSPE, POPSO, TAPS, TABS, TAPSO e TES.
[0054] O termo "solvente" é pretendido a significar uma solução aquosa ou não-aquosa, com a finalidade de diluição do agente na preparação farmacêutica. O diluente pode ser um ou mais de solução salina, água, polietilenoglicol, propilenoglicol, etanol, ou óleos (tais como, óleo de cártamo, óleo de milho, óleo de amendoim, óleo de semente de algodão ou óleo de sésamo).
[0055] O termo "adjuvante" pretende significar qualquer composto adicionado à formulação para aumentar o efeito biológico do agente da invenção. O adjuvante pode ser um ou mais de sais de zinco, cobre ou prata, com diferentes anions, por exemplo, mas não limitado a de fluoreto, cloreto, brometo, iodeto, tiocianato, sulfito, hidróxido, fosfato, carbonato, lactato, glicolato, citrato, borato, tartarato, e acetatos de composição acila diferente. O adjuvante pode também ser polímeros catiônicos, como éteres de celulose catiônicos, ésteres de celulose catiônicos, ácido hialurónico desacetilado, quitosana, dendrímeros catiônicos, polímeros catiônicos sintéticos, tais como polivinil-imidazol), e polipeptídeos catiônicos, tais como poli-histidina, polilisina, poliarginina, e os peptídeos que contêm estes aminoácidos.
[0056] O excipiente pode ser um ou mais dos carboidratos, lípidos, polímeros e sais minerais. Exemplos de carboidratos incluem lactose, glucose, sacarose, manitol, ciclodextrinas e, os quais são adicionados à composição, por exemplo, para facilitar a liofilização. Exemplos de polímeros são o amido, éteres de celulose, carboximetil celulose, hidroxipropilmetilcelulose, hidroxietilcelulose, etilhidroxietilcelulose, alginatos, carageenans, ácido hialurônico e os seus derivados, ácido poliacrílico, polisulfonato, óxido de polietilenoglicol / polietileno, óxido de polietileno / polipropileno, copolímeros de óxido, álcool polivinílico / acetato de polivinilo de diferente grau de hidrólise, e polivinilpirrolidona, todos diferentes de peso molecular, os quais são adicionados à composição, por exemplo, para controle da viscosidade para alcançar bioadesão, ou para proteger o lípido da química e degradação proteolítica. Exemplos de lípidos são ácidos graxos, fosfolípidos, mono-, di-, e triglicerídeos, ceramidas, esfingolipídeos e glicolipídeos, todos os diferentes comprimentos de cadeia de acil e saturação, lecitina de ovo, lecitina de soja, lecitina de ovo hidrogenada e soja, que são adicionados à composição, por razões semelhantes às dos polímeros.Exemplos de minerais são o talco, óxido de magnésio, óxido de zinco e óxido de titânio, os quais são adicionados à composição para se obter benefícios, tais como a redução das propriedades vantajosas acumulação de pigmentos líquidos.
[0057] Os agentes da invenção podem ser formulados em qualquer tipo de composição farmacêutica conhecidas no estado da técnica para ser adequado para a distribuição dos mesmos.
[0058] Em uma concretização, as composições farmacêuticas da invenção podem estar na forma de um lipossoma, em que o agente é combinado, para além de outros veículos farmaceuticamente aceitáveis, com agentes anfipáticos, tais como lípidos, que existem em formas agregadas como micelas, monocamadas insolúveis e cristais líquidos. Lípidos adequados para formulação lipossomal incluem, sem limitação, monoglicerídeos, diglicerídeos, sulfatidos, lisolecitina, fosfolipídeos, saponina, ácidos biliares e semelhantes. Lípidos adequados incluem os lípidos acima modificados por poli (etileno-glicol), no grupo principal polar para prolongar o tempo de circulação sanguínea. A preparação de tais formulações de lipossomas pode ser encontrada em, por exemplo, US 4,235,871, cujas revelações são aqui incorporadas por referência.
[0059] As composições farmacêuticas da invenção podem também estar na forma de microesferas biodegradáveis. Poliésteres alifáticos, tais como poli (ácido láctico) (PLA), poli (ácido glicólico) (PGA), copolímeros de PLA e PGA (PLGA) ou poli (carprolactone) (PCL) e polianidridos têm sido amplamente utilizados como polímeros biodegradáveis a produção de microesferas. Preparações de tais microesferas podem ser encontradas em US 5,851, 451 e na EP 0 213 303, cujas revelações são aqui incorporadas por referência.
[0060] Em uma outra concretização, as composições farmacêuticas da invenção são proporcionadas sob a forma de géis de polímero, onde os polímeros, tais como amido, éteres de celulose, carboximetilcelulose de celulose, hidroxipropilmetilcelulose, hidroxietilcelulose, etilhidroxietil celulose, alginatos, carageenans, ácido hialurônico e os seus derivados, ácido poliacrílico, polivinil-imidazol, polisulfonato, óxido de polietilenoglicol / polietileno, óxido de polietileno / polipropileno, copolímeros de óxido, álcool polivinílico / acetato de polivinilo de diferente grau de hidrólise e polivinilpirrolidona são utilizados para o espessamento da solução que contém o agente. Os polímeros podem também compreender gelatina ou colágeno.
[0061] Alternativamente, os agentes podem ser simplesmente dissolvidos em solução salina, água, polietilenoglicol, propilenoglicol, etanol, ou óleos (tais como, óleo de cártamo, óleo de milho, óleo de amendoim, óleo de semente de algodão ou óleo de sésamo), goma de tragacanto, e / ou vários tampões.
[0062] Deve ser observado que as composições farmacêuticas da invenção podem incluir íons e um pH definido para a potenciação da ação do agente ativo. Além disso, as composições podem ser sujeitas a operações farmacêuticas convencionais, tais como esterilização e / ou podem conter adjuvantes convencionais, tais como conservantes, estabilizantes, agentes molhantes, emulsionantes, tampões, agentes de enchimento, etc.
[0063] As composições farmacêuticas, de acordo com a invenção podem ser administradas por qualquer via adequada conhecida pelos técnicos versados no assunto. Assim, as possíveis vias de administração incluem a administração parentérica (intravenosa, subcutânea e intramuscular), tópica, ocular, nasal, pulmonar, bucal, oral, parentérica, retal e vaginal. Também a administração de implantes é possível.
[0064] Em uma concretização preferida, as composições farmacêuticas são administradas por via parentérica, por exemplo, por via intravenosa, intracerebroventricular, intraarticular, intraarterial, intraperitoneal, intratecal, por via intraventricular, intrasternamente, intracranianamente, intramuscularmente ou subcutaneamente, ou elas podem ser administradas por técnicas de infusão. Elas são convenientemente usadas na forma de uma solução aquosa estéril, a qual pode conter outras substâncias, por exemplo, sais suficientes ou glicose para tornar a solução isotônica com o sangue. As soluções aquosas devem ser adequadamente tamponadas (preferencialmente a um pH de 3 a 9), se necessário. A preparação de formulações parenterais adequadas sob condições estéreis é prontamente alcançada por técnicas farmacêuticas padrão bem conhecidas dos técnicos versados no assunto.
[0065] As formulações adequadas para administração parentérica incluem soluções aquosas e não aquosas estéreis de injeção que podem conter antioxidantes, tampões, bacteriostáticos e solutos que tornam a formulação isotônica com o sangue do destinatário pretendido, e suspensões estéreis aquosas e não-aquosas que podem incluir agentes de suspensão e agentes espessantes. As formulações podem ser apresentadas em recipientes de dose unitária ou de doses múltiplas, por exemplo, ampolas e frascos selados, e podem ser armazenadas em uma condição criodessecada (liofilizada) requerendo apenas a adição do veículo líquido estéril, por exemplo, água para injeções imediatamente antes da utilização. As soluções para injeção extemporâneas e suspensões podem ser preparadas a partir de pós estéreis, grânulos e comprimidos do tipo previamente descrito.
[0066] Assim, as composições farmacêuticas da invenção são particularmente adequadas para administração parenteral, por exemplo, por via intravenosa.
[0067] Alternativamente, as composições farmacêuticas podem ser administradas por via intranasal ou por inalação (por exemplo, sob a forma de uma apresentação em spray de aerossol a partir de um recipiente pressurizado, bomba, pulverizador ou nebulizador com a utilização de um propulsor adequado, tal como diclorodifluorometano, triclorofluor-metano, diclorotetrafluor-etano, hidrofluoroalcano, tais como 1,1,1,2-tetrafluoretano (HFA 134A3 ou 1,1,1,2,3,3,3- heptafluoropropano (HFA 227EA3), dióxido de carbono ou outro gás adequado). No caso de um aerossol pressurizado, a unidade de dosagem pode ser determinada proporcionando uma válvula para liberar uma quantidade medida. O recipiente pressurizado, bomba, pulverizador ou nebulizador pode conter uma solução ou suspensão do polipeptídeo ativo, por exemplo, usando uma mistura de etanol e o propulsor como solvente, que pode adicionalmente conter um lubrificante, por exemplo, trioleato de sorbitano. As cápsulas e cartuchos (feitos, por exemplo, de gelatina) para uso num inalador ou insuflador podem ser formulados para conter uma mistura em pó de um composto da invenção e uma base em pó adequada, tal como lactose ou amido.
[0068] As composições farmacêuticas serão administradas a um paciente em uma dose farmaceuticamente eficaz. Uma "quantidade terapeuticamente eficaz" ou "quantidade eficaz" ou "terapeuticamente eficaz", tal como é aqui utilizado, se refere à quantidade que proporciona um efeito terapêutico para uma dada condição e regime de administração. Esta é uma quantidade pré-determinada de material ativo calculado para produzir o efeito terapêutico desejado em associação com o aditivo e diluente requerido, isto é, um transportador ou veículo de administração. Além disso, pretende-se significar uma quantidade suficiente para reduzir e impedir ainda mais preferencialmente, um défice clinicamente significativo na atividade, função e a resposta do hospedeiro. Alternativamente, uma quantidade terapeuticamente eficaz é suficiente para provocar um melhoramento num estado clinicamente significativo no hospedeiro. Como é apreciado por aqueles técnicos versados no assunto, a quantidade de composto pode variar em função da sua atividade específica. As quantidades de dosagem adequada pode conter uma quantidade predeterminada de composição ativa calculada para produzir o efeito terapêutico desejado em associação com o diluente requerido. Nos métodos de fabricação e utilização das composições da invenção, uma quantidade terapeuticamente eficaz do componente ativo é fornecida. Uma quantidade terapeuticamente eficaz pode ser determinada pelo médico assistente ou veterinário com base em características do doente, tais como idade, peso, sexo, condição, complicações, outras doenças, etc., como é bem conhecido no estado da técnica. A administração de uma dose farmaceuticamente eficaz pode ser efetuada tanto, através de administração única sob a forma de uma unidade de dose individual quanto de várias unidades de dose menores, e também por administração múltipla de doses subdivididas em intervalos específicos. Alternativamente, o que pode ser proporcionado como uma infusão contínua ao longo de um período prolongado.
[0069] Os polipeptídeos podem ser formulados em várias concentrações, dependendo da toxicidade / eficácia do composto a ser utilizado.Preferencialmente, a formulação compreende o agente ativo a uma concentração de entre 0,1 e 1 e 1 mM, mais preferivelmente, entre 1μM e 500 μM, entre 500 μM e 1 mM, entre 300 e 700 , entre 1 e 100 , entre 100 e 200 μM, entre 200 μM e 300 μM, entre
[0070] 300 μM e 400 μM, entre 400 μM e 500 μM e, mais preferivelmente, cerca de 500 μM.
[0071] Será apreciado pelos técnicos versados no assunto que as composições farmacêuticas da invenção podem ser administradas isoladamente ou em combinação com outros agentes terapêuticos utilizados no tratamento de tumores sólidos, tais como antimetabólitos, agentes alquilantes, antraciclinas e outros antibióticos citotóxicos, vinca alquilóides, etoposídeo, compostos de platina, taxanos, inibidores da topoisomerase I, imunossupressores antiproliferativos, corticosteróides, hormônios sexuais e antagonistas hormonais, e outros anticorpos terapêuticos (tal como, trastuzumab).
[0072] Um quarto aspecto da invenção proporciona um kit compreendendo um agente tal como definido em relação ao primeiro ou segundo aspecto da invenção ou uma composição farmacêutica, de acordo com o terceiro aspecto da invenção.
[0073] Um quinto aspecto da invenção proporciona a utilização de um agente tal como definido em relação ao primeiro ou segundo aspecto da invenção na preparação de um medicamento para induzir a morte celular e / ou inibição do crescimento e / ou a proliferação de células associadas com um tumor sólido, em que as células expressam IL1 RAP.
[0074] Um sexto aspecto relacionado da invenção proporciona a utilização de um agente tal como definido em relação ao primeiro ou segundo aspecto da invenção na preparação de um agente de diagnóstico para as células associadas com a detecção de um tumor sólido, em que as células expressam IL1 RAP. Assim, o medicamento é para utilização no tratamento ou prevenção de um tumor sólido num paciente.
[0075] Um sétimo aspecto relacionado da invenção proporciona a utilização de um agente, tal como definido em relação ao primeiro ou segundo aspecto da invenção para células associadas com a detecção de um tumor sólido, em que as células expressam IL1RAP.
[0076] Em uma concretização dos aspectos da invenção ao uso acima, o tumor sólido é selecionado a partir do grupo constituído por cânceres da próstata, câncer da mama, câncer do pulmão, câncer coloretal, melanomas, câncer da bexiga, câncer do cérebro / do SNC, câncer do colo do útero, câncer de esôfago, câncer gástrico, câncer de cabeça / pescoço, câncer de rim, câncer de fígado, linfomas, câncer de ovário, câncer de pâncreas e sarcomas. Por exemplo, o tumor sólido pode ser selecionado a partir do grupo consistindo de cânceres da próstata, mama, pele, cólon, pulmão, útero e órgãos urinários. Em uma outra concretização, o tumor sólido pode ser selecionado a partir dos grupos que consistem de câncer de próstata, melanoma, câncer de colo uterino, câncer do esôfago, e câncer de cabeça e / ou pescoço.
[0077] Em uma outra concretização do primeiro aspecto da invenção, o tumor sólido é um melanoma.
[0078] Um oitavo aspecto da invenção proporciona um método para induzir a morte celular e / ou inibição do crescimento e / ou a proliferação de células associadas a um tumor sólido em um indivíduo, compreendendo a etapa de administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de um agente, tal como definido em relação ao primeiro ou segundo aspectos da invenção, ou uma composição farmacêutica, de acordo com o terceiro aspecto da invenção, em que as células expressam IL1RAP.
[0079] Assim, a invenção proporciona métodos para o tratamento de tumores sólidos. Por "tratamento", incluímos tanto o tratamento terapêutico e profilático do doente. O termo "profilaxia" é utilizado para abranger o uso de um polipeptídeo ou uma formulação que aqui impeça ou reduz a probabilidade de um tumor sólido num paciente ou sujeito descrito.
[0080] Um nono aspecto da invenção proporciona um método para detectar células associadas a um tumor sólido num indivíduo, compreendendo a etapa de administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de um agente, tal como definido em relação ao primeiro ou segundo aspecto da invenção, ou uma composição farmacêutica, de acordo com o terceiro aspecto da invenção, em que as células expressam IL1RAP.
[0081] Em uma concretização dos aspectos acima do método da invenção, o tumor sólido é selecionado de entre o grupo consistindo de câncer da próstata, câncer da mama, câncer do pulmão, câncer coloretal, melanomas, câncer da bexiga, câncer do cérebro / do SNC, câncer do colo do útero, câncer esofágico, câncer gástrico, câncer de cabeça / pescoço, câncer de rim, câncer de fígado, linfomas, câncer de ovário, câncer de pâncreas, e sarcomas. Por exemplo, o tumor sólido pode ser selecionado a partir do grupo consistindo de cânceres da próstata, mama, pele, cólon, pulmão, útero e órgãos urinários. Em outra concretização, o tumor sólido pode ser selecionado a partir dos grupos que consistem de câncer de próstata, melanoma, câncer de colo uterino, câncer do esôfago, e de cabeça e / ou pescoço.
[0082] Em uma outra concretização do primeiro aspecto da invenção, o tumor sólido é um melanoma.
Breve Descrição dos Desenhos
[0083] Exemplos preferidos, não limitativos serão agora descritos, os quais concretizam determinados aspectos da invenção, com referência às figuras seguintes:
[0084] A Figura 1 mostra a expressão P210 BCR/ABL1 induz a expressão IL1RAP em células CD34* no sangue do cordão umbilical
[0085] Análise citométrica confirma que a expressão de IL-1RAP é induzido após expressão retroviral P210 BCR/ABL1 em células CD34* no sangue do cordão umbilical, três dias após a transdução. Células CD34*GFP* eram passadas, acordo com os pasagens nos gráficos de pontos. O histograma mostra a expressão de IL1RAP para a coloração de controle negativo (branco), controle MIG (cinza claro) e MIG-P210 (cinza escuro). Os números nos gráficos de pontos mostram a porcentagem de células dentro de portas / quadrantes individuais. Um experimento representativo de três é mostrado.
[0086] A Figura 2 mostra que IL1RAP é regulada em células CML primitivas
[0087] A análise FACS em células CD34+ de amostras de cinco pacientes CML e 2 bm normais. Gráfico pontual de FACS mostrando passagem para células CD34+CD38+ ou CD34+CD38- em um paciente CML representativo (A). Histograma mostrando a expressão IL1 RAP dentro de células CD34+CD38+ (B). Histograma mostrando a expressão IL1RAP dentro de células CD34+CD38- (C). Branco representa a amostra controle amostras marcadas e cinza representam amostras IL1RAP marcadas. Os gráficos CD34+CD38- IL1RAP e células CD34+CD38- IL1RAP são descritas nos histogramas. Os números no gráfico de pontos e histogramas mostram a porcentagem de células dentro de portas / quadrantes individuais.
[0088] A Figura 3 mostra a expressão IL1RAP distinguida de células Ph* de células LMC Ph dentro do compartimento de células CD34+CD38-
[0089] Fluxo de queda FISH em células CML CD34+CD38- IL1RAP- e células CD34+CD38- IL1RAP+ de cinco amostras de pacientes com CML revelou uma separação quase completa entre células BCR/ABL1- e BCR/ABL1+, respectivamente. Barras pretas representam células BCR / ABL1 negativas e barras brancas representam as células BCR/ABL1 positivas. Esboçado no topo de cada barra representa o número de células Ph+ do total de núcleos marcados.
[0090] A Figura 4 mostra a Expressão IL1RAP distinguida de células tronco Ph+ CML a partir de HSC normais
[0091] Número de LTC-CFC derivado de células CD34+CD38- IL1RAP- e CD34+CD38+IL1RAP+ (células A). As barras pretas representam as células IL1RAP- e as barras brancas representam as células IL1RAP+. Interfase FISH em LTC-CFC (B). barras pretas representam células negativas BCR/ABL1 e barras brancas representam células BCR/ABL1 positivas. esboço no topo de cada barra é o número de células Ph+ do total de núcleos marcados.
[0092] A Figura 5 mostra matança de uma linhagem de células CML pelo anticorpo alvo de IL1RAP
[0093] Histograma mostrando a expressão IL1RAP em células U812 derivadas de um paciente CML e contendo um cromossoma de Filadélfia, em comparação com a expressão em células KG-1 faltando um cromossoma Filadélfia (A). Branco mostra o controle de amostras manchadas e cinza mostra amostras de KMT-marcadas. A linhagem de células leucêmicas KG-1 era desprovida de expressão IL1RAP, enquanto KU812 expressa IL1RAP (B). Como consequência, o baixo nível de morte celular induzida por anticorpo foi observado em KG-1, enquanto que um efeito dose-dependente ADCC foi observado usando KMT-1 em células KU812 (B). Como um controle para efeitos ADCC inespecíficas, um anticorpo IgG de coelho também foi utilizado nos experimentos. O gráfico apresenta à média e desvio padrão de morte celular induzida por anticorpos a partir de três experiências independentes.
[0094] A Figura 6 mostra a morte de células- tronco CML pelo anticorpo alvo de IL1RAP
[0095] Usando KMT-1, células CD34+CD38- da medula óssea normal coradas negativo para IL1RAP, enquanto células CML CD34+CD38+ e CD34+CD38- expressaram IL1RAP. Os histogramas em CML-1 são mostrados a partir de um experimento representativo (A). Branco mostrar o controle de amostras manchadas e o cinza mostra amostra KMT manchadas. Em consonância com o nível de expressão IL1RAP, nenhum efeito ADCC óbvio foi visto utilizando células CD34+CD38+ da medula óssea normal, ao passo que KMT-1 induziu um forte efeito ADCC dependente da dose em ambas as células CML CD34+ e CD34+CD38- (B). Como um controlo para efeitos ADCC inespecíficas, um anticorpo IgG de coelho também foi utilizado nos experimentos. O gráfico apresenta a média e desvio padrão de morte celular induzida por anticorpos a partir de três experimentos independentes utilizando CML-1, CML-3, CML-4, e quatro amostras de medula óssea normal.
[0096] A Figura 7 mostra que IL1RAP também é expressada em todas células-tronco AML e ALL primárias
[0097] As células de leucemia mielóide aguda (LMA) foram recebidas a partir de doentes com o diagnóstico. A expressão de IL1RAP em células CD34+CD38- e CD34+CD38- a partir de um paciente AML representativo é apresentado (A). A linhagem celular AML MONO-MAC-6 e a linhagem de células ALL REH expressa IL1RAP (B). Células de leucemia linfóide aguda (LLA) foram recebidas de pacientes em diagnóstico. A expressão IL1RAP em células CD34+CD38- e CD34+CD38+ a partir de um pacinete representante Ph+ ALL é apresentada (C). Branco mostram amostras controle marcadas e cinza mostra amostras marcadas IL1RAP.
[0098] A Figura 8 mostra a mosrte de linhagens celular AML e ALL por anticorpo alvo de IL1 RAP
[0099] No ensaio de ADCC, uma KMT-1 dependente da dose da morte celular foi induzida em ambos as linhagens celulares MONO-MAC-6 e REH, sugerindo que a IL-1 RAP alvejando os anticorpos podem ter uma janela terapêutica mais ampla do que simplesmente CML. Como um controlo para efeitos ADCC inespecíficas, um anticorpo IgG de coelho também foi utilizado nos experimentos. O gráfico apresenta a média e desvio padrão de morte celular induzida por anticorpos a partir de três experimentos independentes.
[00100] A Figura 9 mostra a morte de células-tronco AML e ALL por anticorpos alvo de IL1RAP
[00101] No ensaio de ADCC, uma morte cellular foi observada em ambos as células AML CD34+CD38- (A) e ALL CD34+CD38- (B) confirmando que IL1RAP alveja anticorpos também têm um efeito terapêutico em AML e ALL com a regulação positiva de IL1 RAP na sua superfície celular. Como um controle para efeitos ADCC inespecíficos, um anticorpo IgG de coelho também foi utilizado nos experimentos. O gráfico mostra a morte celular induzida por anticorpo específico.
[00102] A Figura 10 mostra que IL1RAP é expressada em células tronco leucêmicas de pacientes MPD e MDS.
[00103] Os gráficos de contorno mostrando a expressão IL1 RAP em células CD34+CD38- de dois pacientes MPD (MPD-1 e MPD-2), com e sem a mutação JAK2 (A). Histograma mostrando a expressão IL1RAP em um paciente MDS evoluiu para AML (B). Branco mostrar amostras controle marcadas e cinza mostra amostra marcadas com anticorpos anti-IL1RAP.
[00104] A Figura 11 mostra que IL1RAP é expressa na superfície de células de câncer de tumores sólidos.
[00105] Diferentes linhagens celulares derivadas de tumores sólidos humanos foram coradas com anti-humano IL-1 RAcP/IL-1 R3-APC (cat no FAB676A, R & D System) (linhas pretas) e controle de isotipo (linhas cinza). A análise de citometria de fluxo mostram a expressão de IL1RAP em COL0829 (melanoma maligno), HCC1954 (carcinoma ductal de mama), NCI-8228 (adenocarcinoma pulmonar), NCI-H716 (câncer de cólon), OV-90 (adenocarcinoma de ovário), H716 (câncer de cólon), H2228 (adenocarcinoma pulmonar), SH-4 (melanoma), SR (linfoma) e SW 1783 (astrocitoma).
[00106] A Figura 12 mostra que IL1RAP é expressa na superfície de células de câncer de tumores sólidos
[00107] Histograma da análise de citometria de fluxo em células de quatro diferentes linhagens celular de câncer humano marcadas com mab81.2, um anticorpo contra IL1RAP, mostrando a expressão IL1RAP em H716 (câncer de cólon), H2228 (adenocarcinoma pulmonar), HCC1954 (carcinoma ductal de mama), e SH-4 (melanoma).
[00108] A Figura 13 mostra que um anticorpo alvo de IL1RAP direciona células NK-humanos para ADCC em células cancerosas humanas
[00109] Os gráficos mostram o grau de morte celular específica induzida pelo anticorpo anti-humano IL1RAP mab81.2, e as células NK humanos num ensaio ADCC. Como controlo de isotipo, um anticorpo lgG1 humana inespecífico foi incluído nos experimentos.
[00110] A Figura 14 mostra o efeito do mAb 81.2 no crescimento in vivo de linhagem celular de melanoma SK-MEL-5.
[00111] MAb 81.2 foi administrado em 10mg/kg de peso corporal por via intraperitoneal, duas vezes por semana. Os camundongos de controlo foram tratados com volumes equivalentes de PBS. Cada grupo experimental continha dez camundongos. Os resultados sãoapresentados como o volume médio do tumor (mm3), as barras de erro representam o erro padrão da media (SEM).
EXEMPLO 1 IL1RAP é um biomarcador de superfície celular para células-tronco da leucemia mielóide crônica Sumário
[00112] Estratégias terapêuticas para leucemia mielóide crônica (CML) com o objetivo de alcançar uma cura definitiva da doença, vai exigir uma erradicação completa das células-tronco CML. As células tronco CML, compartilham a capacidade de auto-renovação de células troncos hematopoiéticas normais (HSCs), representam uma pequena população de células leucêmicas, que até agora têm sido indistinguível do normal (HSCs) utilizando marcadores de superfície celular. Uma estratégia para atingir a célula tronco CML seria identificar um biomarcador da superfície celular para células tronco CML, a que os anticorpos terapêuticos futuros possam ser dirigidos. Neste estudo, identificamos IL1RAP como comumente superregulado as ambas células CD34+ CML primitivas e, como consequência da expressão ectópica P210 BCR/ABL1 usando análises de expressão gênica global. Mostramos ainda que a expressão IL1RAP divide a população de células raras CD34+CD38-, abrigando tanto CML e HSCs normais, em duas frações, uma com baixo / ausente expressão, e a outra com a expressão RAPIL1 superior. Depois de estabelecer um protocolo, permitindo a detecção de BCR/ABL1 por FISH em um pequeno número de células classificadas, observamos que dentro da células CD34 + CD38- de CML, as células IL1RAP+ foram BCR/ABL1+, enquanto que as células RAP-IL1- foram quase exclusivamente BCR / ABL1-. Ao realizar cultura a longo prazo em ensaios (LTC-IC) de células de iniciação em duas populações de células, observou-se que as células troncos CML candidatos e HSC normal podia ser separada prospectivamente. Este estudo identifica, assim, IL1RAP como o primeiro biomarcador de superfície celular distingui as células-tronco CML de HSC normal e abre novos caminhos para as estratégias diagnósticas e terapêuticas em CML, bem como em distúrbios relacionados, tais como leucemia mielóide aguda (LMA), leucemia linfoblástica aguda (ALL), doenças mieloproliferativas (MPDs) e síndrome mielodisplásica (SMD).
Introdução
[00113] Para identificar um biomarcador da superfície celular para células tronco CML, foi realizada análise de expressão de genes globais e identificou o receptor da proteína interleucina-1 acessório (IL1RAP) como principal candidato, sendo regulada positivamente tanto em células primitivas de doentes CML e como consequência da expressão ectópica P210 BCR / ABL1. Após o desenvolvimento de um ensaio para detectar BCR/ABL1 em baixos números de células classificadas, mostramos que a expressão IL1RAP prospectiva permite a separação das células leucêmicas e normal primitivas. Através da cultura de longo prazo de iniciação ensaios celulares, que mostram que mais IL1RAP é um biomarcador da superfície celular para células tronco CML, pela primeira vez, permitindo a separação em perspectiva de células tronco CML de HSC normal.
Material e Métodos Coleção de células de pacientes com CML Isolamento e a transdução de células CD34+ do sangue do cordão umbilical
[00114] Sangue e, ocasionalmente, amostras de medula óssea de pacientes com LMC foram obtidos no diagnóstico antes do tratamento tenha sido iniciado após o consentimento informado, de acordo com um protocolo aprovado pelo Comitê de Ética Local. As amostras foram recebidas, tanto do Departamento de Hematologia do Hospital Universitário de Lund, na Suécia e de Rigshospitalet, Copenhagen, Dinamarca. As células mononucleares (MNC) foram separadas utilizando Lymphoprep ™ (Axis-Shield PoC AS, Oslo, Noruega), de acordo com as instruções do fabricante e as células CD34 + foram enriquecidas com o kit de isolamento de células CD34 + (Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Alemanha), como anteriormente descrita22, em uma base regular, isto produziu um grau de pureza de células CD34 + acima de 95%. A subfração de células mononucleares foi viavelmente guardada em nitrogênio líquido antes da coloração de anticorpo tenha sido iniciada. As células CD34 + foram divididas em duas frações, uma fração foi lavada em PBS e ressuspensa em Trizol e congelada em -80 C, enquanto que a outra fração foi congelada em nitrogênio líquido. Dado que as amostras de referência, as amostras de medula óssea a partir de voluntários saudáveis foram obtidas após consentimento informado no Hospital da Universidade de Lund, seguido pelo isolamento de células CD34, como descrito acima.
Análise de Microarranjo
[00115] Análise de microarranjo foi realizada utilizando lâminas de oligonucleotídeos da Swegene DNA Microarray Resource Center da Universidade de Lund, na Suécia. Hibridizações foram realizadas utilizando o kit de hibridação Universal Pronto (Corning Inc, Corning, Nova Iorque). O isolamento do RNA e análise de microarranjo foi realizado essencialmente como previamente descrito23. Visualização de dados foi realizada utilizando o software Qlucore Omics Explorer 2.0 (Qlucore, Lund, Suécia).
Análise citométrica
[00116] As análises de citometria de fluxo foram realizadas num FACS Canto e separação de células por citometria de fluxo foi realizada num Aria FACS (ambos a partir de BD). Antes da coloração celular, células CD34 + foram descongeladas, de acordo com os procedimentos padrão e lavadas uma vez em PBS contendo 2% de FCS (meio de lavagem). Marcado com biotina de cabra anti-humano IL-1 RAP anticorpo policlonal (lote 667, R & D Systems, Abingdon, Reino Unido) foi utilizada em uma diluição 1:100 de diluição para a coloração das células durante 30 minutos em gelo. Subsequentemente, as células foram lavadas e PE- estreptavidina conjugada foi usado em uma diluição 1:200 de diluição durante 30 min. Os anticorpos monoclonais anti-CD38 e anti-CD34 conjugado com FITC de APC-conjugado foram usados para co-coloração (excepto IL1RAP todos os anticorpos utilizados foram adquiridos de Beckton-Dickinson Immunocytometry Systems, Mountain View, CA). Antes da separação de células, as células foram lavadas duas vezes a fim de evitar ligação inespecífica de estreptavidina conjugada com PE. Anticorpos controle correspondentes isotipo foram usados como controles negativos.
Separação de células e FISH de interfase
[00117] Lâminas de vidro foram tratadas com 0,01% de poli-L-lisina (Sigma-Aldrich, Estocolmo, Suécia) durante duas horas, enquanto se manteve em uma câmara úmida, lavadas uma vez em água, e seca em uma placa quente a 37 ° C até secar. Subsequentemente, uma caneta hidrofóbica (Daido Sangyo Co., Ltd. Tóquio, Japão) foi utilizado para desenhar os círculos com uma placa de cultura de tecidos de 96 poços como molde. Antes da separação de células, mas depois de pelo menos duas horas de secagem à temperatura ambiente, 25 l PBS foi aplicado para os anéis, de modo a formar gotas. Durante a separação de células, de 30 a 3.000 células foram classificados simultaneamente diretamente em duas gotas. Para permitir a ligação das células à superfície e para evitar a secagem das gotas, as lâminas foram mantidas em uma câmara úmida em gelo durante 30 min antes de as células tenham sido fixadas em metanol: ácido acético (3:1) durante 10 min.
[00118] Posteriormente, as lâminas foram incubadas num forno de 70°C durante a noite, seguido por FISH. Foram utilizadas sondas de duas cores para BCR/ABL1 (Abbot, Wiesbaden, Alemanha).
Cultura a longo prazo - células de iniciação (LTC-IC)
[00119] Células do estroma M210B4 foram cultivadas em meio RPMI-1640 suplementado com FCS a 10% conforme anteriormente descrito24,25. Dois dias antes da separação de células, as células do estroma foram semeadas em poços de uma placa de 96 poços a uma densidade de 50.000 células por 200 μl de meio Myelocult (Stem Cell Technologies, Vancouver, Canadá) que contém 10-6 M de hidrocortisona (Sigma-Aldrich, Estocolmo, Suécia). Vinte e quatro horas antes da separação de células, células de estroma, foram irradiadas com 1000 Rad. Durante a separação de células, 100-500 células foram classificadas diretamente nos poços estroma pré-revestidos em duplicata e 100 μl de meio foi trocado 3 horas mais tarde. Uma vez por semana, a troca de 100 meio de cultura foi repetida. Após 5 - 6 semanas de cultura, as células foram lavadas e plaqueadas em meio de metilcelusose (Methocult H44435; Stem Cell Technologies) em uma placa de 24 poços. Duas semanas depois, o número de colônias foi marcado. Colônias de poços individuais foram reunidas, lavadas, aplicadas gotas de PBS em lâminas, e seguido por análise por FISH, como descrito acima.
Expressão de P210 BCR/ABL1 em células CD34+ do sangue do cordão umbilical.
[00120] Amostras de sangue de cordão umbilical foram coletadas de partos normais após a obtenção do consentimento informado de acordo com um protocolo aprovado pelo comitê de ética local. Células CD34 + foram enriquecidas como previamente descrito22, obtendo-se um grau de pureza de células CD34 + acima de 95%. O RD114 pseudotipado MSCV-IRES-GFP (MIG) e vetores virais MIG-P210 foram usados neste estudo23. Células CD34 + foram cultivadas e transduzidas em meio SFMM (Stem Cell Technology, Vancouver, Canadá) suplementado com trombopoietina (TPO, 50 ng / mL), fator de células tronco (FCE, 100 ng / mL), e ligante-Flt-3 (FL, 100 ng / mL) como descrito previamente23. Resultados e Discussão
Análise de expressão gênica global identifica IL1RAP como superregulado em células CD34 + de CML
[00121] Muito esforço tem sido colocado em investigações que visam identificar um biomarcador de superfície celular para células-tronco CML Ph+ (revisado por C Eaves14). As células leucêmicas e normais podem sim ser facilmente identificadas retrospectivamente na CML após a detecção do gene de fusão de leucemia específico BCR/ABL1 por FISH, tornando-se um transtorno ideal para avaliar as tentativas de prospectivamente de separação de células leucêmicas e normais. No entanto, até agora, nenhum marcador de superfície celular foi identificado que permite a separação em perspectiva de células tronco de CML de HSC normal. As análises de expressão de genes globais provaram ser uma poderosa estratégia na busca de novos marcadores de HSC, tais como os receptores de SLAM distinguem células tronco hematopoiéticas e progenitoras15. Para procurar os genes que codificam superregulados biomarcadores candidatos da superfície celular para células tronco LMC, os perfis de transcrição de CD34 + foram comparados as células a partir de 11 amostras de pacientes com LMC e 5 amostras da medula óssea normal (bm). Os genes identificados superrugulados em CML foram pareados com o Gene Ontology (GO) categoria "integral a membrana plasmática", que havia sido curado manualmente para incluir todas as moléculas CD conhecidos (ver Material e Métodos para detalhes). No total, 13 genes reguladas positivamente em células CD34 + de CML combinado para o integral à categoria do gene da membrana plasmática (dados não mostrados). Para vincular ainda mais os genes superregulados mais diretamente para a expressão P210 BCR/ABL1, que em paralelo gerou uma lista de genes superregulado como conseqüência da expressão P210 BCR/ABL1 no sangue do cordão umbilical de células CD34 +. Esta análise resultou em 23 genes superregulado correspondentes à mesma lista gene categoria GO (dados não mostrados). Interessantemente, apenas um gene, o receptor da proteína acessória de interleucina-1 (IL1 RAP), mostrou uma forte superregulação tanto em células CD34 + quanto em células CD34- em sangue do cordão como uma consequência da expressão BCR/ABL1 P210. As descobertas de que a IL1 RAP estava presente em ambas as listas de genes sugerem que a sua super-regulação em células primitivas CML está estreitamente acoplado a expressão BCR/ABL1 P210 e indica que a IL1RAP é um novo antígeno associado a leucemia das células primitivas de CML.
IL1RAP é superregulada em células CD34+CD38- de pacientes com LMC e é induzida em conseqüência da expressão ectópica P210 BCR/ABL1
[00122] IL1RAP é um membro da superfamília de receptores como Toll e é um co-receptor bem conhecido para um tipo de receptor de interleucina-1 (IL-1R1)16. IL1RAP é, então, crucial na mediação do efeito da citocina IL-1 pró- inflamatória, mas também está envolvida na mediação do sinal de IL-33, uma citocina que ativa as células T e mastócitos, através da ligação a receptor de ST2, a qual, posteriormente dimeriza com IL1RAP17. A ativação da IL-1R1 tem sido mostrado previamente para estimular o crescimento de colônias de células CML sensíveis ao interferon18, no entanto, a IL1RAP não tem ao nosso conhecimento sido previamente ligada direatamente à CML.
[00123] Como P210 BCR/ABL1 está presente nas células CML como uma característica da doença, o ideal é um biomarcador confiável de superfície celular em CML, deve ser acoplado diretamente à presença e expressão de P210 BCR/ABL1. De acordo com os dados de microarranjo, expressão IL-1RAP foi efetivamente regulada na superfície das células CB CD34 + seguido da expressão retroviral P210 BCR/ABL1 (Fig. 1). Isto sugere que o P210 BCR/ABL1 regula a expressão IL1RAP, diretamente ou através de um efeito indireto, reforçando a sua candidatura como um biomarcador CML.
[00124] A seguir foi investigado a superfície celular de expressão IL1RAP em células CD34 + CD38 + de CML, que representam a maioria e células CD34+ mais maduros. Nesta população de células, uma regulação positiva de IL1RAP foi observada em comparação com a expressão em células de bm normais correspondentes (Fig. 2A, B). As células normais CD34 + CD38 + apresentaram uma menor expressão IL1RAP que parcialmente sobrepõe com a expressão em células de CML. Em seguida, virou-se as células CD34 + CD38 - do compartimento das células normais, contendo as HSCs. De acordo com um estudo anterior, essa população apresentou uma expressão RAPIL1 baixa / ausente (Figura 2C)19. Surpreendentemente, as células CD34 + CD38 - de pacientes com LMC, abrigando tanto células-tronco Ph + de CML e HSCs normais foram divididas em duas populações, uma com expressão RAPIL1 baixa / ausente, a outra com a expressão RAPIL1 superior (Fig. 2C). No sangue periférico (SP), de cinco pacientes com LMC, a fração celular positiva RAPIL1 constituída entre 75% e 95% das células CD34 + CD38 - (n = 5). Baseado nestas descobertas, especulamos que a expressão RAPIL1 pode distinguir as células normais e leucêmicas dentro do compartimento celular CD34 + CD38 - em CML. Como todas as células tronco e HSC normal, LMC são encontradas exclusivamente nas células CD34 + CD38-, como a separação entre as células normais e leucêmicas, que permitem o isolamento em perspectiva de células tronco de CML de HSC normal.
Flow-drop-FISH mostra que a expressão IL1RAP separa as células normais e leucêmicas dentro de células CD34 + CD38- de CML
[00125] Para testar se a expressão IL1RAP distingue células normais (Ph-) e leucêmicas (Ph+) dentro do compartimento celular CML CD34+CD38-, que estabeleceu um novo protocolo para fazer hibridização fluorescente in situ (FISH) em um pequeno número de células classificadas (ver Material e Métodos). O primeiro passo neste protocolo é parcialmente baseado em um método para classificar as células em gotas em lâminas seguida por uma única célula imuno-coloração20. Ao aplicar este novo protocolo envolvendo classificação de células diretamente em gotas em slides seguidos por FISH, adiante designado como Flow-drop-FISH, classificamos apenas 30 células na gota, da qual 15 núcleos foram marcados com sucesso por FISH (CML-5, Figura 3). Curiosamente, encontramos por Flow-drop- FISH que a CML de células CD34 + CD38 IL1RAP + células foram BCR ABL1+. Considerando CML CD34 + CD38 - IL1RAP eram quase exclusivamente Ph- (n = 5, Fig. 3). Estes dados mostram que a expressão de IL-1RAP separa as células leucêmicas e normais dentro da CML do compartimento da célula CD34+ CD38-, o que indica que as células troncos de CML e HSC normal pode ser separada de forma prospectiva.
[00126] Células-tronco CML são CD34+CD38- IL1RAP+, enquanto HSC normal são CD34+CD38 -IL1RAPbaixo
[00127] Estudos sobre células tronco de CML de fase crônica tem até agora retransmitida no acesso aos pacientes com LMC raras em que o compartimento de células tronco têm sido dominado por células leucêmicas seguindo ensaios a longo prazo14. Como as células tronco CML mostram geralmente pobres enxerto em camundongos imunodeficientes, a cultura de longo prazo de células de iniciação (LTC-IC) - teste é amplamente usado como um substituto para o ensaio de detecção de células tronco CML candidatos. Para testar se CML de CD34+CD38-IL1RAP+ e CD34+CD38-IL1RAP/baixo exclusivamente contem células tronco CML candidatos e HSC normal, respectivamente, foram testadas duas populações de células no ensaio de LTC-IC. Para medula óssea células CD34+ a partir de controles normais, a duração de cultura de células formadoras de colônias longos (LTC-CFC) foram encontrados para uma frequência mais elevada > 100 vezes entre as células CD34+CD38-IL1RAP comparada com células CD34+CD38- IL1RAP+ (Fig. 4A, n = 2), indicando que CD34 + CD38-IL1RAP- normal estão hierarquicamente em cima de células CD34+CD38-IL1RAP+. Na CML, observou-se, em média, de 3,6 vezes frequência mais elevada de LTC-CFC em células CD34+CD38-IL1RAP- em comparação com as células CD34+CD38 - IL1AP+ (n = 5, Fig. 4A), sugerindo que a CML de células CD34+CD38-IL1RAP- são mais enriquecidas em células primitivas. É importante ressaltar que apesar de um maior número de LTC-IC foram encontrados entre células CD34+CD38- IL1RAP- do que dentro de células CD34+CD38-IL1RAP+ de duas amostras de pacientes com LMC e dos controles normais, FISH na CML LTC-colônias revelou uma quase discriminação completa entre células Ph- e Ph + nos dois grupos (Figura 4B). CML LTC-colônias derivadas de células CD34+CD38-IL1RAP- foram quase exclusivamente Ph-, enquanto CD34+CD38-IL1RAP+ eram quase exclusivamente Ph+. Estes dados sugerem que IL1RAP é um novo biomarcador de superfície celular que podem ser usados para separar as células-troncos a partir de LMC HSC normal.
[00128] Aqui, foram identificados através da análise de expressão gênica global de um novo antígeno de superfície celular, IL1RAP, que, após um desafio em vários ensaios preencheram os critérios para ser um novo biomarcador de superfície celular para células- tronco Ph + de CML. Baseado nesta descoberta, as futuras terapias dirigidas em CML podem ser concebidas para direcionar células-troncos as CML preservando HSC normal usando um anticorpo terapêutico dirigido para IL1RAP. Além disso, um coquetel de anticorpos contendo anticorpos anti-CD34, anti-CD38 e anti-IL-1RAP podem ser usados para fins de diagnóstico e para estudos de acompanhamento de pacientes com LMC em diferentes tratamentos. Importante, uma separação de potencial normal e células-tronco CML permitirá que os futuros estudos mecanicistas das duas populações de células. Além disso, aqui também mostram que o fluxo de gota FISH poderia servir como um método útil na caracterização de aberrações genéticas em um pequeno número de células classificadas, tais como células-tronco leucêmicas, um tipo de célula que tem sido purificada a cada vez mais as populações de células menores e mais pura21. Para estudos futuros, este método seria, por exemplo, permitir a detecção de aberrações genéticas em vários pequenas populações leucêmicas e populações de células tronco progenitoras, achados que são susceptíveis de fornecer novos insights sobre o que ordena as diversas aberrações foram adquiridos, o conhecimento fundamental para compreender leucemogênese. Além disso, o fluxo de gota FISH pode ser utilizado para monitorar os efeitos terapêuticos em células tronco leucêmicas durante o tratamento. É importante ressaltar que foi identificado, através de Flow-drop-FISH que IL1RAP é o primeiro biomarcador de superfície celular que distingue as células-tronco a partir de LMC HSCs normais, uma descoberta que abre novas oportunidades terapêuticas para a LMC e outras doenças hematológicas neoplásicas associado com a alta regulação de IL1RAP sobre células-tronco e / ou células progenitoras. Referências 1. Deininger MW, Goldman JM, Melo JV. The molecular biology of chronic myeloid leukemia. Blood. 2000;96:3343-3356. 2. Fialkow PJ, Denman AM, Jacobson RJ, Lowenthal MN. Chronic myelocytic leukemia. Origin of some lymphocytes from leukemic stem cells. J Clin Invest. 1978;62:815-823. 3. Kavalerchik E, Goff D, Jamieson CH. Chronic myeloid leukemia stem cells. J Clin Oncol. 2008;26:2911-2915. 4. Jiang X, Zhao Y, Smith C, et al. Chronic myeloid leukemia stem cells possess multiple unique features of resistance to BCR-ABL targeted therapies. Leukemia. 2007;21:926-935. 5. Copland M, Hamilton A, Elrick LJ, et al. Dasatinib (BMS-354825) targets an earlier progenitor population than imatinib in primary CML but does not eliminate the quiescent fraction. Blood. 2006;107:4532-4539. 6. Jin L, Hope KJ, Zhai Q, Smadja-Joffe F, Dick JE. Targeting of CD44 eradicates human acute myeloid leukemic stem cells. Nat Med. 2006;12:1167-1174. 7. Tavor S, Petit I, Porozov S, et al. CXCR4 regulates migration and development of human acute myelogenous leukemia stem cells in transplanted NOD/SCID mice. Cancer Res. 2004;64:2817-2824. 8. Jin L, Lee EM, Ramshaw HS, et al. Monoclonal antibody-mediated targeting of CD123, IL-3 receptor alpha chain, eliminates human acute myeloid leukemic stem cells. Cell Stem Cell. 2009;5:31-42. 9. Majeti R, Chao MP, Alizadeh AA, et al. CD47 is an adverse prognostic factor and therapeutic antibody target on human acute myeloid leukemia stem cells. Cell. 2009;138:286-299. 10. Hosen N, et al. CD96 is a leukemic stem cellspecific marker in human acute myeloid leukemia. Proc Natl Acad Sci U S A. 2007;104:11008-11013. 11. van Rhenen A, van Dongen GA, Kelder A, et al. The novel AML stem cell associated antigen CLL-1 aids in discrimination between normal and leukemic stem cells. Blood. 2007;110:2659-2666. 12. Eisterer W, Jiang X, Christ O, et al. Different subsets of primary chronic myeloid leukemia stem cells engraft immunodeficient mice and produce a model of the human disease. Leukemia. 2005;19:435-441. 13. Bhatia M, Wang JC, Kapp U, Bonnet D, Dick JE. Purification of primitive human hematopoietic cells capable of repopulating immune-deficient mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 1997;94:5320-5325. 14. Jiang X, Zhao Y, Forrest D, Smith C, Eaves A, Eaves C. Stem cell biomarkers in chronic myeloid leukemia. Dis Markers. 2008;24:201-216. 15. Kiel MJ, Yilmaz OH, Iwashita T, Terhorst C, Morrison SJ. SLAM family receptors distinguish hematopoietic stem and progenitor cells and reveal endothelial niches for stem cells. Cell. 2005;121:1109-1121. 16. Subramaniam S, Stansberg C, Cunningham C. The interleukin 1 receptor family. Dev Comp Immunol. 2004;28:415-428. 17. Ali S, Huber M, Kollewe C, Bischoff SC, Falk W, Martin MU. IL-1 receptor accessory protein is essential for IL-33-induced activation of T lymphocytes and mast cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 2007;104:18660-18665. 18. Estrov Z, et al. Suppression of chronic myelogenous leukemia colony growth by interleukin-1 (IL-1) receptor antagonist and soluble IL-1 receptors: a novel application for inhibitors of IL-1 activity. Blood. 1991;78:1476-1484. 19. Hystad ME, Myklebust JH, Bo TH, et al. Characterization of early stages of human B cell development by gene expression profiling. J Immunol. 2007;179:3662-3671. 20. Ema H, Morita Y, Yamazaki S, et al. Adult mouse hematopoietic stem cells: purification and singlecell assays. Nat Protoc. 2006;1:2979-2987. 21. Dick JE. Stem cell concepts renew cancer research. Blood. 2008;112:4793-4807. 22. Nilsson M, Karlsson S, Fan X. Functionally distinct subpopulations of cord blood CD34+ cells are transduced by adenoviral vectors with serotype 5 or 35 tropism. Mol Ther. 2004;9:377-388. 23. Jaras M, Johnels P, Agerstam H, et al. Expression of P190 and P210 BCR/ABL1 in normal human CD34(+) cells induces similar gene expression profiles and results in a STAT5-dependent expansion of the erythroid lineage. Exp Hematol. 2009;37:367-375. 24. Hogge DE, et al.. Enhanced detection, maintenance, and differentiation of primitive human hematopoietic cells in cultures containing murine fibroblasts engineered to produce human steel factor, interleukin-3, and granulocyte colony-stimulating factor. Blood. 1996;88:3765-3773. 25. Castor A, Nilsson L, Astrand-Grundstrom I, et al. Distinct patterns of hematopoietic stem cell involvement in acute lymphoblastic leukemia. Nat Med. 2005; 11:630-637.
EXEMPLO 2 Anticorpo de alvejamento de IL1RAP em cpelulas tronco e progenitora provocam citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC) Sumário
[00129] Estratégias terapêuticas para leucemias destinadas a alcançar uma cura definitiva vai exigir uma erradicação completa das células-tronco leucêmicas. As células-tronco leucêmicas, que representa uma pequena população de células leucêmicas, que até agora têm sido indistinguíveis de células-tronco hematopoéticas normais (CTH), utilizando marcadores da superfície celular. Um novo conceito para a alvejamento de células tronco leucêmicas seria identificar um biomarcador da superfície celular para células tronco da leucemia, para o qual os anticorpos terapêuticos futuros possam ser dirigidos (ver Exemplo 1).
[00130] Neste estudo, podemos gerar um anticorpo anti-IL1RAP e fornecer prova de conceito de que os anticorpos anti-IL1RAP alvejando células-trono de leucemia mielóide crônica (LMC), células-tronco leucemia mielóide aguda (LMA), e as células-tronco de leucemia linfoblástica aguda (ALL) pode ser utilizada para induzir a citotoxicidade dependente do anticorpo- mediada por células (ADCC), enquanto não se observou efeito citotóxico em HSC normal. Além disso, nós demonstramos uma IL1 RAP dose-dependente visando ADCC nas linhagens celulares IL1RAP positivas KU812 (CML), MONO- MAC-6 (leucemia mielóide aguda; AML) e REH (linha celular linfoblástica aguda; ALL). Nós também demonstramos que o MDS e as células-tronco do MPD aumentaram IL1 expressão RAP, indicativo de que os futuros anticorpos anti-IL1 RAP segmentação terapêuticas serão eficazes também nesses transtornos.
[00131] Este estudo abre-se, assim, uma oportunidade terapêutica em CML, AML, ALL, MDS e MPD pelo anticorpo alvo de IL1 RAP sobre as células-tronco leucêmicas.
Materiais e Métodos Geração de KMT-1; um anticorpo policlonal de coelho anti- humano IL1RAP
[00132] Os coelhos foram imunizados com o domínio extracelular de IL-1 RAP. O soro de coelhos foi purificado, de acordo com procedimentos padrão, com excepção de que uma etapa adicional foi adicionada, em que os anticorpos de ligação ao domínio de imunoglobulina, presentes na imunização de proteína para aumentar a sua meia-vida, foi descartado através da ligação a imunoglobulina a colunas carregadas. Os anticorpos purificados foram confirmados por ELISA para ligar o domínio extracelular de IL1RAP e ser desprovido de anticorpos que se ligam ao domínio de imunoglobulina humana. Quando utilizado em citometria de fluxo, um anticorpo de cabra anti-IgG de coelho conjugado com PE foi utilizado como reagente secundário. Ensaio ADCC
[00133] O ensaio ADCC foi baseado num protocolo previamente descrito 1. Em resumo, as células alvo foram marcadas com PKH26 (Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri) de acordo com as instruções do fabricante e quer as células foram colocadas diretamente em poços de uma placa de 96 poços, ou semeadas nos poços após a separação de células CD34 + CD38. As linhagens de células KU812 e KG-1 e células primárias CD34 + foram semeadas a 10000 células por poço, enquanto as células CD34 + CD38 " foram semeadas a 2.000 - 3.000 células por poço. Subsequentemente, os anticorpos foram adicionados aos poços, em diferentes concentrações e incubados durante 20 min antes de 100.000 células efetoras NK tenham sido adicionados a cada poço. NK- células foram extraídas de voluntários saudáveis, após consentimento informado por meio de um kit de isolamento de células negativa de células NK, de acordo com as instruções do fabricante (Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Alemanha). Os anticorpos IgG de coelho purificados a partir de um coelho não- imunizado foi usado como anticorpo de controle nas experiências (R & D Systems Abingdon, Reino Unido). Células positivas 7-AAD para a detecção de morte celular foram medidas usando um FACS CANTO citômetro de fluxo (BD). O desvio médio e padrão de anticorpo a morte celular induzida foi calculada de acordo com a seguinte equação: (Percentagem Células + no anticorpo definido concentração Percentagem 7-AAD células 7-AAD + sem anticorpo) / (0,01 x Percentagem células 7-AAD-sem anticorpo) de pelo menos três experiências independentes (com exceção da figura 9, apenas uma experiência).
[00134] Amostras de onze pacientes com LMA e dois Ph + Todos os pacientes foram recebidos de Lund Hospital Universitário e a expressão de IL1 RAP foi analisada nas populaçãos de células CD34 + CD38 + e CD34 + CD38 " usando as mesmas configurações para a análise de células LMC. A linhagem MONO-MAC-6 e toda a linhagem de REH célula AML também foram testadas em ensaios ADCC utilizando a mesma configuração como para as linhas de células KG-1 e KU812. Resultados
Anticorpo-alvejando IL1RAP em células tronco e progenitoras CML, mas também sobre uma linhagem de células CML dirige células NK para o ADCC
[00135] Citotoxicidade dependente de anticorpos, mediada por células (ADCC) é um mecanismo conservado do sistema imune inato, em que diversos anticorpos terapêuticos, tais como Rituximab dirigido contra CD20, o que acredita-se que, pelo menos parcialmente, exercer o seu efeito terapêutico 2. Para testar se o ADCC pode ser conseguido usando IL1RAP como um alvo, geramos IL1RAP um anticorpo anti-humano policlonal de coelho, seguidamente referidas como KMT-1, tal como o dominio de Fe de anticorpos de coelho em anticorpos de cabra contraste são reconhecidas pelas células do sistema imunológico humano sistema.
[00136] Como esperado, os níveis baixos de ADCC foram observados na linha negativa IL1 RAP / baixa de células de leucemia KG-1, mesmo em altas concentrações KMT-1 (Fig. 5 A, B). Em contrapartida, na linha de células CML KU812 IL1RAP expressando, um natural killer (NK)-célula mediada por ADCC foi observada na presença de KMT-1 (Fig. 5 A e B), demonstrando que KMT-1 tem o potencial para induzir ADCC através do recrutamento de células imunitárias citotóxicas para IL1RAP + células-alvo.
[00137] Em células primárias a partir de doentes com CML e de controles normais, KMT-1 apresentaram um padrão um pouco mais fraco, mas semelhante de coloração como o anticorpo anti-humano de cabra policlonal IL1RAP utilizado anteriormente (Exemplo 1, a fig. 6A). As células imaturas de LMC-1, 3-CML e CML-4 (não há mais células permaneceram de LMC-2 e CML-5) foram testados em ensaios de ADCC em paralelo com as amostras de controlo a partir de células saudáveis. Na CML das células CD34 +, a ligação de KMT-1 resultou em ADCC em níveis mais elevados do que o normal em células CD34 + do que células de controle, correlacionando- se com o nível de expressão de IL1RAP, em particular, em concentrações de anticorpos mais baixos (Fig. 6B). Mais notavelmente, entre a célula-tronco enriquecido CD34 + CD38 " células KMT-1 não induzir ADCC normais de células CD34 + CD38 " as células, enquanto um efeito dose dependente claro ADCC foi observada em CML CD34 + CD38 " células (Fig. 6 B), mais uma vez mostrando forte correlação com o padrão de IL1 RAP sobre estes tipos de células de expressão.
Anticorpos de alvejamento de IL1RAP em AML e todas as células diretas de células NK para o ADCC
[00138] A expressão de IL RAP foi observada em AML CD34 + CD38 " de células em 9 de 11 amostras testadas (Fig. 7A). Nas células CD34 + CD38 + da população de células, expressão de um IL1 RAP semelhante
[00139] Observou-padrão (Fig. 7A). Além disso, a IL1 RAP foi expressa na linhagem celular AML MONO-MAC-6 e a linhagem de células REH ALL (Fig. 7B). Expressão IL1 RAP também foi observada em LLA Ph + CD34 + CD38 " células em 2 de 2 amostras testadas (Fig. 7C). Usando IL1RAP como alvo, os MonoMac-6 e linhagens celulares REH também foram testados em ensaios ADCC. Nestas duas linhagens celulares, observou-se uma dose-dependente RAP IL1 segmentação efeito ADCC (Fig. 8), demonstrando que a terapêutica anti-RAP IL1 segmentação anticorpos têm uma aplicação mais ampla do que simplesmente CML.
[00140] Também foram realizados ensaios de ADCC em AML e ALL primária de células CD34 + e CD38 demonstraram a prova do princípio que também nestas desordens, um aumento da morte celular pode ser conseguido usando KMT-1 (Fig. 9).
[00141] Além disso, células CD34 + e células CD38- de um paciente de progressão MDS em dois pacientes AML e MPD (um deles mutação JAK2 +) foram coradas com um anticorpo alvo RAP IL1. Uma expressão aumentada de IL-1RAP foi observada em comparação com a medula óssea normal, células CD34 + CD38- (Fig. 10, Fig. 2C).
Discussão
[00142] No presente estudo, nós identificamos IL1 RAP como o primeiro biomarcador da superfície da célula que distingue as células tronco CML candidatos de HSCs normais e utilizaram este conhecimento para induzir uma célula dependente do anticorpo morte de células tronco de CML. Além disso, identificamos IL1 RAP como superregulado em células-tronco AML, todas as células-tronco, células-tronco do MPD e células-tronco MDS mostraram que ambos AML e todas as células-tronco podem ser mortos com uma RAP de metas IL1 de anticorpos, enquanto que as células-tronco normais não foram afetadas. Com base na conclusão de que a CML, ALL e células tronco LBC podem ser mortos por anticorpos IL RAP alvo, espera-se que também o MPD e células tronco MDS seriam mortas no ensaio de ADCC. Estes resultados abrem um novo conceito para o tratamento de pacientes com leucemia por alvo direto das células- tronco da leucemia, um conceito que é diferente dos inibidores da tirosina quinase utilizados atualmente, que preferencialmente as células-alvo a jusante das células- tronco CML 3,4.
[00143] A razão pela qual as células tronco LMC são resistentes a drogas, tais como Glivec é parcialmente obscura, mas os fatores que podem contribuir são características, tais como a quiescência e relativamente BCR/ABL1 elevado nível de expressão, mas também a expressão combinatória de proteínas transportadoras de membrana específicos em células desses três5,6. Dadas estas características de células-tronco a CML, é altamente desejável encontrar novas abordagens de tratamento para finalmente erradicar as células-tronco dos LMC. Uma terapia com anticorpos diretamente alvejando as células tronco CML serviria de tal estratégia como o modo de ação de é independente dos mecanismos resistentes conhecidas causando células tronco CML não responder aos tratamentos inibidor da quinase. As principais limitações para tais desenvolvimentos tenham sido a falta completa de um receptor da superfície da célula para distinguir LMC Ph + a partir de (Ph), as células tronco normais, saudáveis. Nós aqui identificamos IL1RAP como tal alvo a partir de análises de expressão de genes globais e importante para a sua expressão ligada a expressão BCR/ABL1 (ver Exemplo 1 acima).
[00144] Importante, pela geração de um anticorpo alvo IL1RAP, temos aqui, pela primeira vez, a prova do conceito de que as células-tronco CML candidatos pode ser alvo, preservando HSC normal. Importante, como o modo de acção no ADCC anticorpos é a de dirigir células do sistema imune para a morte da célula alvo, os mecanismos terapêuticos são independentes dos mecanismos conhecidos que causam resistência aos inibidores da quinase na LMC utilizando os tratamentos actuais. Assim, o anticorpo alvo de células tronco com LMC tem capacidade para erradicar as células tronco CML, sozinhos ou em combinação com os regimes atuais, finalmente, conduzindo a uma cura permanente para doentes com CML.
[00145] Curiosamente, observamos também que IL1RAP visando anticorpos podem causar ADCC de células-tronco AML, o tipo mais comum de leucemia aguda entre adultos que têm um mau prognóstico, e também todas as células-tronco, o tipo mais comum de leucemia infantil. Coletivamente, o achado de IL1 expressão RAP sobre as células-tronco leucêmicas com a CD34 + CD38 " imuno- fenótipo em CML, AML, ALL, MDS e MPD, e os experimentos ADCC demonstrando célula matando em um RAP forma dependente da IL-1, indica que estes distúrbios podem ser tratados com anticorpos anti-RAP terapêuticos IL1.
[00146] Nos ensaios ADCC aqui apresentados, um anticorpo anti-RAP IL1 humano policlonal foi utilizado (o que é essencialmente uma mistura de vários anticorpos monoclonais diferentes). No entanto, será apreciado pelos técnicos versados no assunto de que os anticorpos monoclonais individuais dirigidos IL1 RAP também pode ser identificados tendo potencial ADCC. Referências 1. Wilkinson RW, Lee-Macary AE, D Davies, Snary D, Ross EL. Antibodydependent citotoxicidade mediada por células: um ensaio baseado em citometria de fluxo, utilizando fluoróforos. J Immunol Methods. 2001, 258:183191. 2. Morris JC, Waldmann TA. Terapia baseada em anticorpos de leucemia. Especialista Rev Mol Med. 2009; 11: E29. 3. Copland M, Hamilton A, Elrick LJ, et ai. Dasatinibe (BMS-354825) tem como alvo uma população progenitor mais cedo do que o imatinib no ensino primário CML, mas não elimina a fração de repouso. Sangue. 2006; 107:4532-4539. 4. Jorgensen HG, Allan EK, Jordanides NE, Mountford JC, Holyoake TL. Nilotinib exerce efeitos antiproliferativos equipotentes ao imatinib e não induz a apoptose em células CD34 * células CML. Sangue. 2007; 109:4016-4019. 5. Graham SM, Jorgensen HG, Allan E, et al. ,, As células-tronco primitivas Philadelphiapositive quiescentes de pacientes com leucemia mielóide crônica são insensíveis a STI571 in vitro. Sangue. 2002, 99:319-325. 6. Jiang X, Y Zhao, Smith, C, et ai. Células- tronco da leucemia mielóide crônica possuem várias características únicas de resistência a terapias específicas BCR-ABL. Leucemia. 2007, 21:926-935. EXEMPLO 3 - Expressão do gene em tumores sólidos Materiais e Métodos
[00147] Usando a ferramenta de busca Oncomine (www.oncomine.org), foram identificados todos os conjuntos de dados contendo várias linhas celulares estabelecidas a partir de diferentes tipos de tumores.Os maiores conjuntos de dados foi identificado o conjunto de dados "Wooster celular Line2". Este conjunto de dados contém 308 linhas de células de câncer, representando 20 tipos diferentes de tumor. O termo de consulta utilizado foi "IL1 RAP" com o repórter ajustando "205277_at".
Resultados
[00148] No total, foram identificados 17 tipos de tumores sólidos diferentes, que foram representadas por linhagens celulares cumprindo os nossos critérios para uma expressão superregulado de IL1 RAP (ver Tabela 1). A percentagem de linhagens de células dentro de cada tipo de tumor que mostra RAP IL1 suprarreguladas variou de 4% (câncer colorretal) a 67% (melanoma, câncer da próstata). Entre os tipos de tumor, identificamos algumas das entidades cancerígenas mais comum em seres humanos, incluindo tumores malignos de mama, cólon, pulmão, próstata e bexiga. Além disso, alguns tipos de tumores associados com os resultados clínicos pobres, tais como o melanoma e tumores cerebrais exibidido expressão altamente regulada positivamente de IL1 RAP.
Conclusões
[00149] Conclui-se que várias entidades tumorais diferentes mostram um nível de expressão de gene superregulado IL1 RAP.
[00150] Estes dados indicam que o tratamento com anticorpos dirigidos contra a IL-1 RAP irá proporcionar uma nova via terapêutica, em vários tipos de câncer humano.Tabela 1
[00151] Super reguação de IL1RAP em 308 linhagens de células cancerosas que representam diferentes tipos de tumores*
Figure img0001
Figure img0002
[00152] Os dados Wooster estabelecidos em 308 linhagens de células tumorais foi pesquisado utilizando Oncomine (www.oncomine.org). O termo de consulta utilizado foi "IL RAP" com o repórter ajustando "205227_at". A plataforma utilizada foi Genoma Humano U 33 Plus 2.0 Matrizes (Affymetrix Inc.)
[00153] ** só linhagens celulares tumorais que indicam um nível igual ou maior expressão de IL-1 do que o RAP na linha celular positiva Philadelphia KU812 foram pontuadas como "superregulado". KU812 foi previamente demonstrada por nós tendo uma expressão de proteína regulada positivamente de IL1 RAP na superfície da célula (Jaras ef al, 2010, PNAS 107 (14):16.280-5).
EXEMPLO 4 - Análise de expressão IL1RAP em linhagens de células humanas por citometria de fluxo Materiais e métodos Reagentes
[00154] Bloqueadores do receptor de Fc-BD Biosciences
[00155] anti-human CD16 (cat no 555404)
[00156] anti-human CD32 (cat no 555447)
[00157] APC-rato lgG1 k controle Isotype (cat não 555.751) de BD Biosciences
[00158] IL-1 anti-humano RAcP/IL-1 R3-APC (cat não FAB676A) do sistema de I & D.
[00159] As linhagens celulares Linhage celular
Figure img0003
Figure img0004
[00160] As linhagens de células foram cultivadas sob condições padrão em meio recomendado pelos fornecedores.
Análise FACS
[00161] As células (350 000) foram ressuspensas em 2 ml de tampão de FACS (PBS sem cálcio e magnésio, suplementada com BSA a 0,5%) e centrifugadas durante 4 minutos a 300 x g. O sobrenadante foi rejeitado e os receptores Fc foram bloqueados por células com Mabs anti- CD16/CD32 incubação a uma concentração de 3 pg / ml num volume de 30 l durante 5 minutos à temperatura ambiente.Em seguida, 55l de tampão FACS e 4 l de anticorpo isotipo marcado com APC ou 5 l de anticorpo monoclonal marcado com APC dirigido contra IL-1 humana RAP foram adicionados às células e incubou-se durante 30 minutos a 4 ° C. As células foram lavadas com 3 mL de tampão de FACS, centrifugadas durante 4 minutos a 300 xg e o sobrenadante foi descartado.As células foram finalmente ressuspenso em 200 tampão FACS e análise por citometria de fluxo foi realizada de acordo com as configurações padrão em um Cantoll citômetro de fluxo FACS (BD Biosciences).
Resultados
[00162] IL1 RAP sobre os níveis de expressão das linhagens celulares de tumores sólidos testados estão apresentados na Tabela 3 a seguir, e na Figura 11.Tabela 3
[00163] A expressão de IL-1RAP em diferentes 10 linhagens celulares humanas.
[00164] Os valores representam a intensidade de fluorescência média.
Figure img0005
Conclusões
[00165] Expressão de IL1 RAP foi observada nas linhagens celulares de tumores sólidos NCI-H2228, NCI-H716, HCC1954, SR, OV-90, COLO 829, SH-4 e SW 1783. A expressão nestas linhagens de células foi comparável ou maior do que na linhagem de células de leucemia mielóide crônica humana KU-812.
EXEMPLO 5 - Anticorpo-alvo de IL1RAP em células tumorais sólidas causa citotoxicidade anticorpo-dependente mediado por célula (ADCC) Materiais e Métodos Desenvolvimento e produção do anticorpo monoclonal quimérico 81,2 hlgG1.
[00166] Uma linhagem celular de hibridoma murino, o qual foi secretado anticorpos monoclonais específicos para a parte extracelular de IL-1 humana RAP foi gerado através de procedimentos padrão. Resumidamente camundongos BALB / c foram imunizados com uma proteína de fusão que consiste em a parte extra-celular de IL1RAP e a parte de Fc-lgG1 humana (Pro100-Lys330). Os esplenócitos foram fundidos com a linhagem de células de mieloma de rato Sp2 / 0 e os clones que produzem e anticorpos dirigidos contra a parte extracelular de IL1RAP foram isolados por seleção com a proteína de fusão utilizada para a imunização e contra- selecionados com lgG1 humana.
[00167] O anticorpo produzido pela linhagem celular de hibridoma do clone 81,2 era do tipo lgG1/kappa e verificou-se ter uma elevada especificidade para as células positivas de IL-RAP e IL1RAP a proteína humana recombinante (21-367). A partir desta linhagem de células, o RNA total foi isolado e DNAc representando as regiões variáveis das cadeias pesada e leve, VH e VK foram amplificados por PCR, clonados e sequenciados.
[00168] O elemento genético que codifica para a VK de murino na estrutura com a parte constante do gene capa humana foi sintetizado e clonado em um vetor plasmídeo de expressão de mamífero.
[00169] O fragmento de PCR que codifica para a VH dos murinos foram combinadas com as partes constantes de lgG1 humana e clonado em um vetor plasmídeo de expressão de mamífero.
[00170] As células HEK 293 foram co-transfectadas com ambos os plasmídeos e as células foram cultivadas em meio livre de soro suplementado com 100 ng / ml kifunensine. O anticorpo quimérico 81.2 hlgG1 foi purificado a partir do meio de cultura por Proteína G chromatograhy.
Citometria de fluxo
[00171] Células de quatro diferentes linhagens de células cancerosas humanas sólidas, H2228 (adenocarcinoma, carcinoma de pulmão não-pequenas células), H716 (adenocarcinoma colorretal), HCC 954 (carcinoma ductal de mama) e SH-4 (melanoma), foram colhidas e coradas com mab81.2, um anticorpo humano anti-IL1RAP (Cantargia AB, Lund, Suécia). Para a detecção, as células foram coradas com um anticorpo secundário conjugado com PE-anti-IgG humana (Thermo Fisher, Waltham, MA), e as células foram analisadas usando um citômetro de fluxo FACS CANTO (BD Immunocyteometry Systems, Mountain View, CA).
Ensaio ADCC
[00172] O ensaio ADCC foi baseado num protocolo anteriormente descrito (ver Exemplo 2 acima). Em resumo, as células alvo foram marcadas com PKH26 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) de acordo com as instruções do fabricante, e foram semeadas em uma placa de 96 poços a uma densidade de 10.000 células por poço. Subsequentemente, os anticorpos foram adicionados aos poços, em diferentes concentrações e incubado durante 30 min antes de 100.000 células efetoras NK foram adicionados a cada poço. NK-células foram extraídas de voluntários saudáveis, após consentimento informado por meio de um kit de isolamento de células negativa de células NK de acordo com as instruções do fabricante (Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Alemanha). Um anticorpo não específico lgG1 humano foi utilizado como controle nos experimentos (Eureka Therapeutics, Emeryville, CA).
[00173] O grau de morte celular foi avaliado por detecção de células positivas para 7-AAD, utilizando um citômetro de fluxo FACS CANTO (BD). O nível de morte celular induzido por anticorpo foi calculado de acordo com a seguinte equação: Percentagem de células 7-AAD+ com concentração de anticorpo definido - Percentagem de células 7-AAD sem anticorpo.
Resultados Anticorpo contra células cancerosas não-leucêmicas humanas marcadas com IL1RAP em citometria de fluxo e direciona células NK para ADCC resultando na morte de células cancerosas humanas.
[00174] Foi mostrado que KMT1, um anticorpo policlonal humano contra o IL-1 RAP, pode dirigir células NK para o ADCC, e induzir a morte da célula da linhagem celular expressando IL1RAP maior KU812 CML, mas não em IL1RAP menor expressando células KG1 (ver Exemplo 2 acima).
[00175] Os resultados do presente estudo mostram que não apenas as células leucêmicas são sensíveis à mediada por ADCC IL1RAP, mas também as células de tumores humanos sólidos. Quatro linhagens diferentes de células de câncer humanas, o que representa quatro tipos de câncer humano sólidos diferentes, foram estudadas, e todos apresentaram expressão de IL1RAP na superfície da célula (fig. 12).
[00176] Todas as quatro linhagens celulares testadas foram também mostradas ser sensível a ADCC mediada por mab81.2, um anticorpo contra IL1RAP humana, no que parece ser uma maneira dependente da dose (fig. 13).
Conclusão
[00177] O presente estudo confirma que IL1RAP é expressa na superfície das células de vários tipos de câncer humano, incluindo câncer de pulmão, câncer de cólon, câncer de mama e melanoma maligno.
[00178] Usando um anticorpo dirigido contra IL1RAP, as células de todas as quatro linhagens celulares de tumores sólidos testados foram mostrados para ser alvo de matança NK mediada específico de uma ADCC-ensaio.
Exemplo 6 - Eficácia de anticorpo monoclonal 81.2 in vivo em um modelo xenoenxerto de rato com melanoma humano SK- MEL-5 Materiais e Métodos Desenvolvimento e produção do anticorpo monoclonal de 81,2 lgG1 e lgG2a isotipo.
[00179] Uma linhagem celular de hibridoma murino, que foi secretando anticorpos monoclonais específicos para a parte extracelular de IL-1RAP humano foi gerado através de procedimentos padrão. Resumidamente camundongos BALB / c foram imunizados com uma proteína de fusão que consiste em a parte extra-celular de IL1RAP e a parte de Fc-lgG1 humana (Pro100-I_ys330). Os esplenócitos foram fundidos com a linhagem de células de mieloma de rato Sp2 / 0 e clones de produção e os anticorpos dirigidos contra a parte extracelular de IL-1 RAP foram isolados por seleção com a proteína de fusão utilizado para a imunização e contra- selecionados com lgG1 humana.
[00180] O anticorpo produzido pela linhagem celular de hibridoma do clone 81,2 era do tipo lgG1/kappa e verificou-se ter uma elevada especificidade para as células positivas de RAP-ILI e da proteína IL-1RAP humano recombinante (21-367). A partir desta linhagem de células, o RNA total foi isolado e DNAc representando as regiões variáveis das cadeias pesada e leve, VH e VK foram amplificados por PCR, clonados e sequenciados.
[00181] O elemento genético que codifica para a VK de murideo na estrutura com a parte constante do gene capa murino foi sintetizado e clonado em um vetor plasmídeo de expressão de mamífero.
[00182] O fragmento de PCR que codifica para a VH dos murinos foram combinados com as partes constantes de lgG2a de murino e clonado em um vetor de expressão plasmidico de mamífero.
[00183] As células HEK 293 foram co-transfectadas com ambos os plasmídeos e as células foram cultivadas em meio livre de soro. O anticorpo de ratinho 81,2 isotipo de lgG2a foi purificado a partir do meio de cultura por cromatografia de Proteína G.
Citometria de fluxo
[00184] A fim de confirmar a expressão de IL-1RAP sobre a linhagem de células de melanoma maligno humano, SK- MEL-5, e comparar a expressão da linhagem de células CML humano KU812, ambas as linhagens celulares foram cultivadas de acordo com procedimentos convencionais e mantidas na fase de crescimento logarítmica. Na colheita celular 3,5 - 5,0 x 105 células / mL foram marcadas com lgG1 81,2 anticorpo monoclonal de rato a 1 - 50 pg/ml. Um anticorpo controle isotipo lgG1 foi utilizado como controle. A coloração foi analisada através do citômetro de fluxo Accuri C6.
[00185] Fármacos e Tratamento Tabela 4
Figure img0006
[00186] A administração in vivo de IL1RAP humana mAb específico 81,2 ou veículo
[00187] Ratas fêmeas de oito a 12 semanas de idade, CD.17 SCID foram injetados com 1 x 107 células tumorais 5- SK-MEL em 50% de Matrigel por animal, por via subcutânea no flanco. O tratamento foi iniciado aproximadamente uma semana após a injeção de células de melanoma quando os tumores tinham atingido um tamanho de 108 - 128 mm3. A combinação emparelhada do tamanho do tumor em 20 animais foi feito dando 10 camundongos cada, nos dois grupos de tratamento.
[00188] Um anticorpo monoclonal de camundongo lgG2a 81.2, foi preparado em uma dose de 10 mg/kg, e com um volume de 10 mUkg em PBS. Os animais de controle receberam volumes iguais de PBS. Os tratamentos foram administrados por via intra-peritoneal. O volume do tumor por pinça de medição e pesos totais foram monitorados duas vezes por semana.
[00189] O ponto final do estudo é o atraso no crescimento do tumor. Resultados Citometria de Fluxo Tabela 5
[00190] Expressão de IL1RAP em SK-MEL-5, linhagem celular de melanoma humano e uma linhagem celular humana CML KU812. Os valores representam a intensidade média de fluorescência.
Figure img0007
[00191] Atividade in vivo exemplificativa de mAb 81.2
[00192] Análise do es tudo no dia 33 a partir de início da dosagem mostrou um atraso estatisticamente significativo no crescimento do tumor no grupo de tratamento comparado com o grupo de controle no dia 22 (p <0,05), 26 e 29 (p <0,001) e no dia 33 (p <0,0001) (ver Figura 14).
Conclusão
[00193] Expressão de IL1RAP foi confirmada por citometria de fluxo na linhagem de células de tumor de melanoma SK-EL-5 e mostrou uma expressão que foi maior do que na linhagem de células de leucemia mielóide crônica humana KU-812.
[00194] Os dados in vivo indicam que o anticorpo monoclonal específico IL1RAP humano, 81,2, administrado duas vezes por semana a uma dose de 10 mg/kg, causou inibição do crescimento da célula do tumor RAPIL1 expressando linhagem celular de mlanoma humano, SK-MEL-5.

Claims (29)

1. Uso de um agente consistindo em um anticorpo, ou um Fv de cadeia simples, Fv ligado por dissulfeto, anticorpo de domínio, Fab, Fab' ou F(ab)2 do mesmo, com a especificidade para proteína acessória de receptor de interleucina-1 (IL1RAP) caracterizado pelo fato de ser na preparação de um medicamento para tratar ou prevenir um tumor sólido, por indução de morte celular e/ou inibição do crescimento e/ou a proliferação de células associadas com o tumor sólido, em que as células expressam IL1RAP, em que o tumor sólido é selecionado do grupo que consiste em câncer de mama, câncer de pulmão, câncer colorretal, melanomas e câncer de pâncreas.
2. Uso de um agente consistindo em um anticorpo, ou um Fv de cadeia simples, Fv ligado por dissulfeto, anticorpo de domínio, Fab, Fab' ou F(ab)2 do mesmo, com a especificidade para a proteína acessória do receptor de interleucina-1 (IL1RAP) caracterizado pelo fato de ser na preparação de um medicamento para o diagnóstico de um tumor sólido, por detecção de células associadas a um tumor sólido, em que as células expressam IL1RAP.
3. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 2, caracterizado pelo fato de que o tumor sólido é selecionado a partir do grupo consistindo em câncer de pulmão de células não pequenas, câncer colorretal, câncer de mama e melanomas.
4. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o tumor sólido é um melanoma.
5. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que a porção ligante possuir especificidade por IL1RAP humana.
6. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que IL1RAP está localizada na superfície celular.
7. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que o agente é capaz de bloquear a ligação de um ou mais correceptores à IL1RAP.
8. Uso, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que o um ou mais correceptores são selecionados do grupo que consiste em IL1R1, ST2, C-KIT e IL1RL2.
9. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que o agente é capaz de matar as células associadas com o tumor sólido.
10. Uso, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o agente é capaz de induzir apoptose das células associadas com o tumor sólido.
11. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 10, caracterizado pelo fato de que a destruição das células é induzida pela citotoxicidade celular mediada por anticorpo (ADCC).
12. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo fato de que o agente compreende ou consiste em um anticorpo intacto.
13. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é um anticorpo recombinante.
14. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é um anticorpo monoclonal.
15. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é um anticorpo policlonal.
16. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15, caracterizado pelo fato de que o anticorpo, ou um Fv de cadeia simples, Fv ligado por dissulfeto, anticorpo de domínio, Fab, Fab' ou F(ab)2 do mesmo, é humano ou humanizado.
17. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 16, caracterizado pelo fato de que o agente compreende ainda uma porção para aumentar a meia-vida do agente in vivo.
18. Uso, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que a porção para aumentar a meia-vida in vivo é selecionado a partir do grupo consistindo em polietilenoglicol (PEG), albumina de soro humano, grupos de glicosilação, ácidos graxos e dextrano.
19. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 17 a 18, caracterizado pelo fato de que o agente é PEGuilado.
20. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 19, caracterizado pelo fato de que o agente compreende ainda uma porção citotóxica.
21. Uso, de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que a porção citotóxica compreende ou consiste em um radioisótopo.
22. Uso, de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que o radioisótopo é selecionado do grupo que consiste em astato-211, bismuto-212, bismuto- 213, iodo-131, ítrio-90, lutécio-177, samário-153 e paládio-109.
23. Uso, de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de que a porção citotóxica compreende ou consiste em uma toxina, tal como saporina ou caliqueamicina.
24. Uso, de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que a porção citotóxica compreende ou consiste em um agente quimioterapêutico, tal como um antimetabólito.
25. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 24, caracterizado pelo fato de que o agente compreende ainda uma porção detectável.
26. Uso, de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de que a porção detectável compreende ou consiste em um radioisótopo.
27. Uso, de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo fato de que o radioisótopo é selecionado do grupo que consiste em tecnécio-99m; índio-111; gálio-67; gálio-68; arsênico-72; zircônio-89; iodo-12 e tálio-201.
28. Uso, de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de que a porção detectável compreende ou consiste em um isótopo paramagnético.
29. Uso, de acordo com a reivindicação 28, caracterizado pelo fato de que o isótopo paramagnético é selecionado do grupo que consiste em gadolínio-157; manganês-55, disprósio-162, cromo-52 e ferro-56.
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US (4) US9403906B2 (pt)
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RU (1) RU2597831C2 (pt)
WO (1) WO2012098407A1 (pt)

Families Citing this family (42)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2009120903A2 (en) 2008-03-26 2009-10-01 Cellerant Therapeutics, Inc. Cytokine receptors associated with myelogenous haematological proliferative disorders and uses thereof
GB2472856B (en) 2009-08-21 2012-07-11 Cantargia Ab IL1-RAP modulators and uses thereof
KR101989134B1 (ko) 2011-01-19 2019-06-13 칸타르기아 아베 항―ｉｌ１ｒａｐ 항체 및 그의 인간 치료 용도
US9765148B2 (en) 2011-03-16 2017-09-19 Argen-X N.V. Antibodies to CD70
US9873918B2 (en) 2011-08-11 2018-01-23 Albert Einstein College Of Medicine, Inc. Treatment of acute myeloid leukemia and myelodysplastic syndromes
EP3083678B1 (en) 2013-12-17 2019-04-03 Aimm Therapeutics B.V. Means and methods for counteracting myeloproliferative or lymphoproliferative disorders
GB201403875D0 (en) * 2014-03-05 2014-04-16 Cantargia Ab Novel antibodies and uses thereof
GB201413913D0 (en) 2014-08-06 2014-09-17 Cantargia Ab Novel antibodies and uses thereof
US10391168B1 (en) 2014-08-22 2019-08-27 University Of Bern Anti-CD70 combination therapy
WO2016085832A1 (en) * 2014-11-24 2016-06-02 Albert Einstein College Of Medicine, Inc. Peptides for blocking il1rap protein-protein interaction and uses thereof for treatment of disease
CA2990305A1 (en) 2015-06-26 2016-12-29 Mab Discovery Gmbh Monoclonal anti-il-1racp antibodies
BR112018008908A2 (pt) * 2015-11-02 2018-11-27 Janssen Pharmaceutica Nv anticorpos anti-il1rap, moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas que se ligam il1rap e cd3, e seus usos
EP3241845A1 (en) * 2016-05-06 2017-11-08 MAB Discovery GmbH Humanized anti-il-1r3 antibodies
US11359025B2 (en) 2016-10-16 2022-06-14 Cantargia Ab Anti-IL1-RAP antibodies
CA3045466A1 (en) 2016-12-01 2018-06-07 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Radiolabeled anti-pd-l1 antibodies for immuno-pet imaging
US10067409B2 (en) 2017-02-02 2018-09-04 James Harrison Elias Camera supporting base
EP3401332A1 (en) * 2017-05-08 2018-11-14 MAB Discovery GmbH Anti-il-1r3 antibodies for use in inflammatory conditions
CA3063622A1 (en) 2017-05-16 2018-11-22 Synthon Biopharmaceuticals B.V. Anti-sirp.alpha. antibodies
USD951260S1 (en) 2017-05-19 2022-05-10 James Harrison Elias Electronic device mount
US11162632B2 (en) 2017-06-02 2021-11-02 James Harrison Elias Tripod stabilizing base
CN110997725A (zh) 2017-06-12 2020-04-10 蓝鳍生物医药公司 抗-il1rap抗体和抗体药物缀合物
JP2020533960A (ja) * 2017-08-01 2020-11-26 シティ・オブ・ホープＣｉｔｙ ｏｆ Ｈｏｐｅ 抗ｉｌ１ｒａｐ抗体
GB201800649D0 (en) 2018-01-16 2018-02-28 Argenx Bvba CD70 Combination Therapy
TW202021618A (zh) 2018-08-17 2020-06-16 美商２３與我有限公司 抗ｉｌ１ｒａｐ抗體及其使用方法
USD896878S1 (en) 2018-11-29 2020-09-22 James Harrison Elias Tripod mount
USD897414S1 (en) 2018-11-29 2020-09-29 James Harrison Elias Tripod mount
USD900201S1 (en) 2018-11-29 2020-10-27 James Harrison Elias Tripod mount
USD888815S1 (en) 2018-11-29 2020-06-30 James Harrison Elias Tripod mount
USD888139S1 (en) 2018-11-29 2020-06-23 James Harrison Elias Tripod mount
USD888140S1 (en) 2018-11-29 2020-06-23 James Harrison Elias Tripod mount
USD888141S1 (en) 2018-11-29 2020-06-23 James Harrison Elias Tripod mount
USD888142S1 (en) 2018-11-29 2020-06-23 James Harrison Elias Tripod mount
USD888816S1 (en) 2018-11-30 2020-06-30 James Harrison Elias Tripod mount
USD896879S1 (en) 2018-11-30 2020-09-22 James Harrison Elias Tripod mount
USD896880S1 (en) 2018-11-30 2020-09-22 James Harrison Elias Tripod mount
USD888817S1 (en) 2018-11-30 2020-06-30 James Harrison Elias Tripod mount
TW202038958A (zh) 2018-12-18 2020-11-01 比利時商阿根思公司 Ｃｄ７０組合治療
AU2020308053A1 (en) * 2019-06-26 2022-01-20 Glaxosmithkline Intellectual Property Development Limited IL1RAP binding proteins
CN114599678A (zh) * 2019-08-12 2022-06-07 希望之城 Il1rap抗体
CA3192323A1 (en) 2020-09-14 2022-03-17 Julie MACOIN Antibodies that bind to il1rap and uses thereof
US11479610B2 (en) 2020-12-23 2022-10-25 Cantargia Ab Anti-IL1RAP antibody
CN114736885A (zh) * 2022-05-27 2022-07-12 四川大学华西医院 一种携带bcr-abl1基因激酶区双位点突变的细胞株及其构建方法

Family Cites Families (38)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4235871A (en) 1978-02-24 1980-11-25 Papahadjopoulos Demetrios P Method of encapsulating biologically active materials in lipid vesicles
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
SE459005B (sv) 1985-07-12 1989-05-29 Aake Rikard Lindahl Saett att framstaella sfaeriska polymerpartiklar
US5094941A (en) * 1987-12-31 1992-03-10 Zymogenetics, Inc. Monoclonal antibodies to PDGF
CA1329119C (en) * 1988-03-29 1994-05-03 Milton David Goldenberg Cytotoxic therapy
US5120525A (en) * 1988-03-29 1992-06-09 Immunomedics, Inc. Radiolabeled antibody cytotoxic therapy of cancer
US5530101A (en) * 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
GB9314623D0 (en) * 1993-07-14 1993-08-25 Nordion Int Inc Localization and therapy with agents directed against prostate specific antigen in breast cancer
PE64396A1 (es) * 1995-01-23 1997-01-28 Hoffmann La Roche Proteina accesoria del receptor de la interleucina 1
CN1169754A (zh) * 1995-01-23 1998-01-07 霍夫曼-拉罗奇有限公司 人白介素-1受体辅助蛋白
CA2192782C (en) 1995-12-15 2008-10-14 Nobuyuki Takechi Production of microspheres
US6280955B1 (en) 1997-12-16 2001-08-28 Tularik Inc. Interleukin-1 receptor accessory proteins, nucleic acids and methods
US20030215453A1 (en) 2002-05-14 2003-11-20 Dedera Douglas A. Methods of therapy and diagnosis using immunotargeting of cells expressing VpreB1 protein
US20030026806A1 (en) 2000-10-27 2003-02-06 Amgen Inc. Antibodies and other selective IL-1 binding agents that allow binding to IL-1 receptor but not activation thereof
WO2002064630A2 (en) 2000-10-31 2002-08-22 Immunex Corporation Il-1 receptor accessory protein
EP1450837A4 (en) 2001-08-07 2006-01-04 Immunex Corp INTERLEUKIN-1 RECEPTORS IN THE TREATMENT OF DISEASES
WO2004100987A2 (en) 2003-05-06 2004-11-25 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of using il-1 antagonists to treat neointimal hyperplasia
CN1852974A (zh) * 2003-06-09 2006-10-25 密歇根大学董事会 用于治疗和诊断癌症的组合物和方法
WO2005005601A2 (en) 2003-06-09 2005-01-20 The Regents Of The University Of Michigan Compositions and methods for treating and diagnosing cancer
RU2007130722A (ru) 2005-02-16 2009-03-27 Вайет (Us) Способы и устройства для диагностики, прогнозирования и выбора лечения лейкоза
WO2006110593A2 (en) 2005-04-07 2006-10-19 Macrogenics, Inc. Biological targets for the diagnosis, treatment and prevention of cancer
US7612181B2 (en) 2005-08-19 2009-11-03 Abbott Laboratories Dual variable domain immunoglobulin and uses thereof
BRPI0615026A8 (pt) * 2005-08-19 2018-03-06 Abbott Lab imunoglobulina de domínio variável duplo e seus usos
US8014957B2 (en) 2005-12-15 2011-09-06 Fred Hutchinson Cancer Research Center Genes associated with progression and response in chronic myeloid leukemia and uses thereof
US20090324618A1 (en) 2006-03-24 2009-12-31 Armstrong Scott A Novel signature self renewal gene expression programs
WO2008049098A2 (en) 2006-10-19 2008-04-24 Merck & Co., Inc. ANTIBODY ANTAGONISTS OF INTERLEUKIN-13 RECEPTOR α1
JP2011518313A (ja) 2008-01-15 2011-06-23 ボード オブ トラスティーズ オブ ザ レランド スタンフォード ジュニア ユニバーシティ 急性骨髄性白血病幹細胞のマーカー
WO2009120903A2 (en) * 2008-03-26 2009-10-01 Cellerant Therapeutics, Inc. Cytokine receptors associated with myelogenous haematological proliferative disorders and uses thereof
EP2166021A1 (en) * 2008-09-16 2010-03-24 Ganymed Pharmaceuticals AG Monoclonal antibodies for treatment of cancer
GB0823445D0 (en) 2008-12-23 2009-01-28 Univ Surrey Biomarker
GB2472856B (en) 2009-08-21 2012-07-11 Cantargia Ab IL1-RAP modulators and uses thereof
KR101989134B1 (ko) 2011-01-19 2019-06-13 칸타르기아 아베 항―ｉｌ１ｒａｐ 항체 및 그의 인간 치료 용도
GB201403875D0 (en) 2014-03-05 2014-04-16 Cantargia Ab Novel antibodies and uses thereof
GB201413913D0 (en) 2014-08-06 2014-09-17 Cantargia Ab Novel antibodies and uses thereof
CA2990305A1 (en) 2015-06-26 2016-12-29 Mab Discovery Gmbh Monoclonal anti-il-1racp antibodies
BR112018008908A2 (pt) 2015-11-02 2018-11-27 Janssen Pharmaceutica Nv anticorpos anti-il1rap, moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas que se ligam il1rap e cd3, e seus usos
US11359025B2 (en) 2016-10-16 2022-06-14 Cantargia Ab Anti-IL1-RAP antibodies
WO2018071910A2 (en) 2016-10-16 2018-04-19 Cellerant Therapeutics, Inc. Anti-il1-rap antibodies

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