JP2010507366A - インターロイキン−13受容体α1の抗体アンタゴニスト - Google Patents
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Abstract
【選択図】図1
Description
この出願は、2006年10月19日提出の米国仮特許出願第60/852,748号の優先権の利益を主張する。この仮特許出願全体の内容を参照によって本明細書に引用したものとする。
ヒトの研究と実験動物モデルのデータは、Th2誘導サイトカインをアトピー性喘息に寄与するとして、最も中心的役割を果たすインターロイキン-4(IL-4)及びインターロイキン-13(IL-13;例えば、Minty et al., 1993 Nature 362:248-250;McKenzie et al., 1993 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:3735-3739;受入番号:U31120及びL13029(ヒト)及びNM_001032929(アカゲザル(Macaca mulatta))参照)と強く関係づける。これらの2つのサイトカインは有意な構造類似を有し、かつ特定の受容体成分を共有する。IL-4及びIL-13が共有する受容体は、IL-4とIL-13の両方に結合する二重IL-4R/IL-13受容体(又はII型受容体)である。この受容体はIL-4Rα鎖(例えば、Idzerda et al., 1990 J. Exp. Med. 171:861-873参照)及びIL-13Rα1鎖(例えば、Hilton et al., 1996 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:497-501;Aman et al., 1996 J. Biol. Chem. 271:29265-29270;Miloux et al., 1997 FEBS Lett. 401:163-166;受入番号U62858及びCAA70508(ヒト)及びAAP78901(カニクイザル(Macaca fascicularis))参照)で構成される。この二重IL-4R/IL-13R受容体は、造血細胞及び非造血細胞(肺上皮細胞及び平滑筋細胞を含む)上に発現される。さらに、IL-4とIL-13は両方ともそれぞれ他方を除外してそれらを認識する1つの受容体を有する。例えば、IL-4Rα鎖及び共通のγ鎖(「γc」)で構成されるI型IL-4受容体(IL-4R)は特異的にIL-4と結合する。I型IL-4Rは排他的に造血起源の細胞上に発現される。IL-13に特異的な受容体、IL-13Rα2は、高い親和性でIL-13と結合するが、外見上シグナルを伝達しない。むしろ、この受容体はおとりとして作用して、IL-13に対する応答を減弱する。
IL-13とIL-4は多くの機能を果たし、両方ともアレルギー表現型、例えばB細胞内でIgEに切り替わるイソ型類に関係するいくつかの機能、例えば肥満細胞や好酸球の活性化、上皮細胞上の血管細胞接着分子-1(VCAM-1)の上方制御、並びにエオタキシン、胸腺及び活性化制御ケモカイン(thymus and activation-regulated chemokine)(TARC)、及びマクロファージ誘導ケモカイン(MDC)等のケモカインの産生を制御する。
しかし、IL-4とIL-13は、それらの受容体複合の差異のためin vitro及びin vivoで多くの異なる機能を有する。例えば、IL-13の隔離はマウス喘息モデルにおいて気道の反応性亢進を防止し、かつ粘膜産生を減らすが、IL-4はそうでないことが分かっている。このIL-13と喘息反応の関係は、他の研究によってさらに支持された;例えば、Hershey et al., 2003 J. Allergy Clin. Immunol. 111(4):677-690;Grunig et al., 1998 Science 282(5397):2261-2263;Mattes et al., 2001 J. Immunol. 167(3):1683-1692;及びFulkerson et al., 2006 Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol. 35(3)337-346を参照されたい。例えば、肺へのIL-13の送達は、マウスの喘息様表現型全体を誘導するのに十分であることが分かっている。処理動物は、気道の反応性亢進、好酸球に富む細胞炎症、粘膜の過剰産生を伴う杯状細胞の過形成、及び上皮下線維形成を発生する;例えば、Wills-Karp et al., 1998 Science 282(5397): 2258-2261;Reiman et al., 2006 Infect. Immun. 74(3): 1471-1479;及びKaviratne et al., 2004 J. Immunol. 173(6):4020-4029を参照されたい。さらに、IL-13の発現は、ヒト喘息患者の肺内で上昇することが報告された。さらに、数グループがIL-13遺伝子の多形とアレルギー形質及び喘息症状の高い危険との関連性を報告した。これらの多形のいくつかはIL-13の高発現と関係があることが示された;例えば、Huang et al., 1995 J. Immunol. 155(5)2688-2694;Naseer et al., 1997 Am. J. Respir. Crit. Care Med. 155(3):845-851;Vladich et al., 2005 J. Clin. Invest. 115(3):747-754;Chen et al., 2004 J. Allergy Clin. Immunol. 114(3):553-560;及びVercelli et al., 2002 Curr. Opin. Allergy Clin. Immunol. 2(5):389-393を参照されたい。
IL-13は、限定するものではないが、種々の呼吸器及びアレルギー媒介障害、線維症、強皮症、炎症性腸疾患及び特定の癌といった種々の他の状態とも関連している;例えば、Wynn, T.A., 2003 Annu. Rev. Immunol. 21:425-456;Terabe et al., 2000 Nat. Immunol. 1(6):515-520;Fuss et al., 2004 J. Clin. Invest. 113(10):1490-1497;Simms et al., 2002 Curr. Opin. Rheumatol. 14(6):717-722;及びHasegawa et al., 1997 J. Rheumatol. 24(2):328-332を参照されたい。
IL-13Rα1に対する抗体(モノクロナールとポリクロナールの両方)は技術的に開示されている;例えば、WO 97/15663、WO 03/80675;WO 03/46009;WO 06/072564;Gauchat et al., 1998 Eur. J. Immunol. 28:4286-4298;Gauchat et al., 2000 Eur. J. Immunol. 30:3157-3164;Clement et al., 1997 Cytokine 9(11):959 (Meeting Abstract);Ogata et al., 1998 J. Biol. Chem. 273:9864-9871;Graber et al., 1998 Eur. J. Immunol. 28:4286-4298;C. Vermot-Desroches et al., 2000 Tissue Antigens 5(Supp. 1):52-53 (Meeting Abstract);Poudrier et al., 2000 Eur. J. Immunol. 30:3157-3164;Akaiwa et al., 2001 Cytokine 13:75-84;Cancino-Diaz et al., 2002 J. Invest. Dermatol. 119:1114-1120;及びKrause et al., 2006 Mol. Immunol. 43:1799-1807を参照されたい。
アレルギー性及び喘息性応答と関連する活性並びにIL-13Rα1の発現/機能性の上昇に少なくとも部分的に起因している他の種々の状態に影響し得る有効な生物学的活性を有する抗体が要望されている。さらに、ヒトにおける免疫原性が低いIL-13Rα1に親和性のある抗体分子に対する要望がある。従って、IL-13Rα1の活性及びIL-13Rα1が種々の治療状態で果たす、対応する役割を阻害又はアンタゴナイズする、治療を基礎にしたIL-13Rα1のヒト抗体アンタゴニストを製造することが非常に重要である。
当業者には明らかなように、hIL-13Rα1に結合する能力を保持する抗体のフラグメントを種々のフレームワークに挿入することができる。例えば、抗原結合性に基づいて以前に選択された抗体ループを提示するために使用し得る種々の骨格を論じている米国特許第6,818,418号及び該特許に含まれる参考文献を参照されたい。さらに、VL及びVHをコードする遺伝子を、組換え法を用いて、例えば、VL及びVHを、VL及びVH領域が一対になって一価分子を形成しているか、そうでなければ単鎖Fvs(ScFVs)として既知の単一タンパク質鎖として生じさせ得る合成リンカーを用いてつなげることができる。例えば、Bird et al., 1988 Science 242: 423-426、及びHuston et al., 1988 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883を参照されたい。
別の局面では、本発明は、IL-13Rα1の活性又は機能(シグナル伝達、その他)をアンタゴナイズする方法であって、IL-13Rα1を発現する細胞を本明細書で開示する抗体分子と、前記抗体分子がIL-13Rα1に結合できるようにする条件下で接触させる工程を含む方法を提供する。本発明の特有の実施形態は、細胞がヒト細胞である、該方法を含む。この方法に従う抗体分子は、IL-13Rα1媒介活性の阻害に有効である。本発明の抗体分子は、正常なヒト皮膚線維芽細胞(以後、NHDF細胞)からのエオタキシンの放出を効率的に阻害し、NHDF細胞内におけるIL-13刺激STAT6リン酸化を効率的に阻害し、及び/又は全血(ヒト/アカゲザル)内におけるTARC(CCL17)のIL-13刺激放出を効率的に阻害することが分かった。
本発明は、IL-13Rα1、特にヒトIL-13Rα1の抗体アンタゴニストに関する。開示抗体分子は、選択的にIL-13Rα1を認識し、かつ特異的にIL-13Rα1に結合する。用語「選択的」又は「特異的」の使用は、開示抗体分子がIL-13Rα1以外に有意な結合を示さないという事実を指す。開示抗体分子は、hIL-13Rα1のチップ結合細胞外ドメインに対する表面プラズモン共鳴アッセイ、例えばBIACORETM(PHARMACIA AB Corporation, Upsala, Sweden)又はその適宜の等価物で決定した場合、20nM未満、好ましくは10nM未満、さらに好ましくは5nM未満のKDでヒトIL-13Rα1に結合する。KDは、Kd(特定の抗体-抗原相互作用の解離速度)対Ka(特定の抗体-抗原相互作用の会合速度)の比、つまりKd/Ka(モル濃度(M)で表される)から得られる解離定数を指す。技術的によく確立された方法を用いてKD値を決定することができる。抗体のKDを決定するための好ましい方法は、表面プラズモン共鳴を利用する方法、例えばBIACORETM(PHARMACIA AB Corporation)システムのようなバイオセンサーシステムを利用する方法である。
本発明の特定の実施形態は、2B6、4A10、6C11、若しくは8B4の重鎖及び/又は軽鎖可変部配列、並びにその等価配列(1つ以上の保存的アミノ酸置換を有するとして特徴づけられる)又は相同配列を含む抗体分子を包含する。特定の実施形態は、本明細書で開示するCDRドメイン或いは本明細書で開示する重鎖及び/又は軽鎖CDRドメインのセット、或いはその等価物(1つ以上の保存的アミノ酸置換を有するとして特徴づけられる)を含む単離された抗体分子である。本明細書における用語「ドメイン」又は「領域」の使用は、単に、問題の配列又はセグメントが存在するであろう、或いは、現に存在している、抗体分子のそれぞれの部分を表す。
特有の実施形態では、本発明は、下記配列:配列番号1、配列番号9、配列番号13及び配列番号21、並びに1つ以上の保存的アミノ酸置換を有するとして特徴づけられるその等価配列、及びその相同配列から成る群より選択される配列を有する重鎖可変部を含む単離された抗体分子を提供する。開示抗体は、以下の機能特性:(i)NHDF細胞内におけるIL-13誘導エオタキシン放出の阻害;(ii)NHDF細胞内におけるIL-13誘導STAT6リン酸化の阻害;又は(iii)血液又はPBMC内におけるTARCのIL-13刺激放出の阻害;の少なくとも1つを示す。特有の実施形態では、本発明は、開示抗体分子の相同体であって、開示抗体分子と少なくとも90%相同であるとして特徴づけられ、かつ上記機能特性の少なくとも1つを示す、相同体を提供する。提供される特有の抗体は、hIL-13Rα1への結合について、ATCC寄託番号PTA-6932(2B6)、PTA-6930(6C11)、若しくはPTA-6934(8B4)として寄託されたハイブリドーマ細胞系;又は本明細書で4A10として言及する抗体によって産生される抗体と競合するだろう。
下表1は、特に本発明によって包含される分子の一般化された概要を提供する。
特有の実施形態では、本発明は、(i)それぞれ配列番号1及び配列番号5;(ii)それぞれ配列番号13及び配列番号17;又は(iii)それぞれ配列番号21及び配列番号17で示される;或いは1つ以上の保存的アミノ酸置換を有するとして特徴づけられるその等価配列を有する軽鎖可変部を含む単離された抗体分子を提供する。特有の実施形態は、以下の機能特性:(i)NHDF細胞内におけるIL-13誘導エオタキシン放出の阻害;(ii)NHDF細胞内におけるIL-13誘導STAT6リン酸化の阻害;又は(iii)血液又はPBMC内におけるTARCのIL-13刺激放出の阻害;の少なくとも1つを示す前記抗体である。
特定の実施形態では、本発明は、配列番号8又は配列番号20;及びその保存的修飾から成る群より選択される可変軽鎖CDR3配列を含み、以下の機能特性:(i)NHDF細胞内におけるIL-13誘導エオタキシン放出の阻害;(ii)NHDF細胞内におけるIL-13誘導STAT6リン酸化の阻害;又は(iii)血液又はPBMC内におけるTARCのIL-13刺激放出の阻害;の少なくとも1つを示す単離されたIL-13Rα1抗体分子を提供する。特有の実施形態は、CDR1、CDR2、及び/又はCDR3配列が、(i)それぞれ配列番号6、配列番号7及び/又は配列番号8;又は(ii)それぞれ配列番号18、配列番号19及び/又は配列番号20として示され;或いはCDR配列の1つ以上のいずれかに1つ以上の保存的アミノ酸置換を有するとして特徴づけられるその等価配列である軽鎖可変部を含む単離された抗体分子を提供する。
特有の実施形態は、(i)それぞれ配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号6、配列番号7及び配列番号8;(ii)それぞれ配列番号14、配列番号15、配列番号16、配列番号18、配列番号19及び配列番号20;又は(iii)それぞれ配列番号22、配列番号15、配列番号23、配列番号18、配列番号19及び配列番号20に示される重鎖可変部CDR1、CDR2、及びCDR3配列並びに軽鎖可変部CDR1、CDR2、及びCDR3配列を含み;かつCDR配列の1つ以上のいずれかに1つ以上の保存的アミノ酸置換を有するとして特徴づけられるその等価配列を含む、単離されたIL-13Rα1抗体分子を提供する。
特有の実施形態では、本発明は、下記配列:配列番号53、配列番号54、配列番号55、配列番号56、配列番号57、配列番号58及び配列番号64;並びに1つ以上の保存的アミノ酸置換を有するとして特徴づけられるその等価配列、及びその相同配列から成る群より選択される配列を有する軽鎖可変部を含む単離された抗体分子を提供する。特定の実施形態では、(i)配列番号13及び配列番号21から成る群より選択される配列を含む重鎖可変部と、(ii)配列番号53、配列番号54、配列番号55、配列番号56、配列番号57、配列番号58及び配列番号64;並びに1つ以上の保存的アミノ酸置換を有するとして特徴づけられるその等価配列、及びその相同配列から成る群より選択される配列を含む軽鎖可変部とを有する単離された抗体分子が提供される。
特有の実施形態は、(i)それぞれ配列番号22、配列番号15及び配列番号23を含むCDR1、CDR2、及びCDR3配列を有する重鎖可変部;並びに(ii)下記配列:(a)それぞれ配列番号18、配列番号19及び配列番号24;(b)それぞれ配列番号18、配列番号19及び配列番号25;(c)それぞれ配列番号18、配列番号19及び配列番号26;(d)それぞれ配列番号18、配列番号19及び配列番号27;(e)それぞれ配列番号18、配列番号19及び配列番号28;(f)それぞれ配列番号18、配列番号19及び配列番号29;並びに(g)それぞれ配列番号18、配列番号19及び配列番号63;から成る群より選択されるCDR1、CDR2、及びCDR3配列を有する軽鎖可変部;又はCDR配列のいずれか1つ以上に1つ以上の保存的アミノ酸置換を有するとして特徴づけられるその等価物を含む、単離された抗体分子を提供する。
特有の実施形態は、(i)それぞれ配列番号14、配列番号15及び配列番号16を含むCDR1、CDR2、及びCDR3配列を有する重鎖可変部;並びに(ii)下記配列:(a)それぞれ配列番号18、配列番号19及び配列番号24;(b)それぞれ配列番号18、配列番号19及び配列番号25;(c)それぞれ配列番号18、配列番号19及び配列番号26;(d)それぞれ配列番号18、配列番号19及び配列番号27;(e)それぞれ配列番号18、配列番号19及び配列番号28;(f)それぞれ配列番号18、配列番号19及び配列番号29;並びに(g)それぞれ配列番号18、配列番号19及び配列番号63;から成る群より選択されるCDR1、CDR2、及びCDR3配列を有する軽鎖可変部;又はCDR配列のいずれか1つ以上に1つ以上の保存的アミノ酸置換を有するとして特徴づけられるその等価物を含む、単離された抗体分子を提供する。
本明細書で述べる特有の抗体分子のアミノ酸配列と相同のアミノ酸配列を有する抗体は、通常、そのIL-13Rα1に対する特異性を変えることなく、該抗体の1つ以上の特性を改良するために製造される。このような配列を得る1つの方法は、当業者が利用できる唯一の方法ではないが、本明細書で開示する重鎖及び/又は軽鎖可変部をコードする配列を部位特異的又はランダム突然変異誘発で変異させ、この変異した可変部を含む抗体分子を発現させ、かつこのコードされた抗体分子を、本明細書で開示する機能分析を利用して保持された機能について試験することである。
本明細書で使用する場合、2つのアミノ酸配列間の相同性パーセントは、2つの配列間の同一性パーセントに等しい。2つの配列間の同一性パーセントは、これら2つの配列が共有する同一位置の数の関数であり(すなわち、相同性パーセント=(同一位置の数/位置の総数)×100)、ギャップの数と、各ギャップの長さを考慮する(これら2つの配列の最適アラインメントのため導入する必要がある)。当業者に公知の方法を用いて、配列の比較及び配列間の同一性パーセントの決定を行い、かつ数学アルゴリズムを利用して完成することができる。例えば、ALIGNプログラム(バージョン2.0)に組み入れたMeyersとMillerのアルゴリズム(1988 Comput. Appl. Biosci. 4:11-17)を利用して、アミノ酸配列及び/又はヌクレオチド配列間の同一性パーセントを決定することができる。さらに、Accelrysからオンラインで入手可能なGCGソフトウェアパッケージのGAPプログラムを利用し、そのデフォルトパラメーターを用いてアミノ酸配列又はヌクレオチド配列間の同一性パーセントを決定することができる。
当業者が、本明細書で開示するVH配列及び/又はVL配列との高い(すなわち、90%以上の)相同性を有するVH及び/又はVL配列を有する抗体を得ることができる一方法は、配列番号1、9、13及び21及び/又は配列番号5、17、53、54、55、56、57、58及び64をコードする核酸分子の突然変異誘発(例えば、部位特異的又はランダム突然変異誘発)後、変化したコード化抗体を、本明細書で述べる機能分析を利用して、保持された機能について試験することによる。例えば、重鎖及び軽鎖可変部CDR1、CDR2及びCDR3配列のセットを比較し、実施例で述べる8B4由来の最適化抗体はそれぞれ8B4と少なくとも90%相同である。或いは、他の抗体単離アプローチを介して相同抗体を得ることができる。例えば、6C11の重鎖可変部CDRのセットは、8B4の当該重鎖可変部CDRと少なくとも90%相同である。重鎖可変部全体にわたる相同性はずっと高い。
可変部の操作は、1つ以上のVH及び/又はVL CDR領域内でよい。部位特異的突然変異誘発又はランダム突然変異誘発を行って突然変異を誘発し、本明細書で述べるものを含め、利用可能なin vitro又はin vivoアッセイを利用して、問題の抗体機能特性に及ぼす効果を評価することができる。
本発明の抗体は、問題の抗体の1つ以上の特性を改善するためVH及び/又はVL内のフレームワーク残基に修飾を加えた当該抗体をも包含する。典型的に、このようなフレームワークの修飾を行って、抗体の免疫原性を低減する。例えば、1つのアプローチは、1つ以上のフレームワーク残基を対応する生殖細胞系列の配列に「逆突然変異(backmutate)」させることである。さらに詳細には、体細胞突然変異を受けた抗体が、該抗体が由来する生殖細胞系列の配列と異なるフレームワーク残基を含み得る。抗体フレームワーク配列を、該抗体が由来する生殖細胞系列の配列と比較することによって、該残基を同定することができる。このような「逆突然変異」した抗体も本発明に包含されるものとする。別のタイプのフレームワークの修飾は、フレームワーク領域内の1つ以上の残基、又は1つ以上のCDR内の残基でさえを突然変異させて、T細胞エピトープを除去し、ひいては該抗体の潜在的な免疫原性を低減することを含む。このアプローチは「脱免疫化」とも呼ばれ、Carrらによる米国特許公開第20030153043号に詳述されている。
一実施形態では、CH1のヒンジ部を修飾して、該ヒンジ部内のシステイン残基の数を変え、例えば、増減させて、例えば、軽鎖及び重鎖の構築を促進し、或いは該抗体の安定性を増減させる。このアプローチは、Bodmerらによる米国特許第5,677,425号にさらに開示されている。
別の実施形態では、抗体のFcヒンジ部を突然変異させて、該抗体の生物学的半減期を短縮する。このアプローチは、Wardらによる米国特許第6,165,745号にさらに詳述されている。
別の実施形態では、抗体を修飾して、その生物学的半減期を増やす。例えば、以下の1つ以上の突然変異を誘導することができる:Wardによる米国特許第6,277,375号に記載されているようなThr252Leu、Thr254Ser、Thr256Phe。或いは、生物学的半減期を増やすため、Prestaらによる米国特許第5,869,046号及び第6,121,022号に記載されているように、抗体をCH1又はCL領域内で変化させて、IgGのFc領域のCH2ドメインの2つのループから得られるサルヴェージ(salvage)受容体結合エピトープを含むことができる。
さらに他の実施形態では、少なくとも1つのアミノ酸残基を異なるアミノ酸残基で置換して該抗体のエフェクター機能を変えることによって、Fc領域を変化させる。例えば、両方ともWinterらによる米国特許第5,624,821号及び第5,648,260号を参照されたい。
別の例では、アミノ酸残基329、331及び322から選択される1つ以上のアミノ酸を異なるアミノ酸残基と置き換えて該抗体のC1q結合性を変え、及び/又は補体依存性細胞毒性(CDC)を低減若しくは撤廃することができる。このアプローチは、Idusogieらによる米国特許第6,194,551号にさらに詳述されている。
別の例では、アミノ酸位置231及び239内の1つ以上のアミノ酸残基を修飾することによって、該抗体の、補体を固定する能力を変える。このアプローチは、BodmerらによるWO94/29351でさらに開示されている。
さらに別の例では、Fc領域を修飾して、該抗体の、抗体依存性細胞の細胞毒性(ADCC)を媒介する能力を高め、及び/又は1つ以上のアミノ酸を修飾することによって、Fcγ受容体に対する該抗体の親和性を高める;例えばPrestaによるWO00/42072を参照されたい。さらに、FcγR1、FcγRII、FcγRIII及びFcRnのための、ヒトIgG1上の結合部位をマッピングし、結合性が改良された変異体が開示されている(Shields et al, J. Biol. Chem. 276:6591-6604, 2001参照)。
さらに別の実施形態では、抗体のグリコシル化を修飾する。例えば、アグリコシル化(aglycoslated)抗体を調製できる(すなわち、抗体がグリコシル化を欠いている)。例えば、グリコシル化を変えて、抗原に対する該抗体の親和性を高めることができる。例えば、抗体配列内のグリコシル化の1つ以上の部位を変えることによって、該炭水化物修飾を達成することができる。例えば、可変部フレームワークの1つ以上のグリコシル化部位の除去となる1つ以上のアミノ酸置換を行うことによって、当該部位でのグリコシル化を排除することができる。このようなアプローチは、Coらによる米国特許第5,714,350号及び第6,350,861号にさらに詳述されている。
さらに、或いはこれとは別に、グリコシル化の型を変えた抗体、例えばフコシル残基の量が少ない低フコシル化抗体又は二分(bisecting)GlcNac構造が多い抗体を調製することができる。このような変化したグリコシル化パターンは、抗体のADCC能力を高めることが実証された。例えば、グリコシル化機構が変化した宿主細胞内で抗体を発現させることによって、このような炭水化物修飾を達成することができる。グリコシル化機構が変化した細胞は技術的に開示されており、宿主細胞として用いて、本発明の組換え抗体を発現させることによって、グリコシル化が変化した抗体を生じさせることができる。
別の局面では、開示抗体分子をコードする単離された核酸を提供する。核酸は細胞全体、細胞ライセート、又は部分的に精製されたか若しくは実質的に純粋な形態で存在し得る。核酸は、例えば、標準的な方法(限定するものではないが、アルカリ/SDS処理、CsClバンド形成、カラムクロマトグラフィー、アガロースゲル電気泳動法及び他の技術上周知の適切な方法が挙げられる)を用いて、他の細胞成分又は他の混入物、例えば、他細胞の核酸又はタンパク質から精製された場合、「単離」又は「実質的に純粋に」されている。核酸は、DNA(cDNAを含め)及び/又はRNAを包含し得る。標準的な分子生物学的方法を用いて本発明の核酸を得ることができる。ハイブリドーマ(例えば、ヒト免疫グロブリンを保有するトランスジェニックマウスから調製したハイブリドーマ)によって発現される抗体については、標準的なPCR増幅又はcDNAクローニング法によって、該ハイブリドーマによって生成される抗体の軽鎖と重鎖をコードするcDNAを得ることができる。免疫グロブリン遺伝子ライブラリー(例えば、ファージディスプレイ法を用いて)から得られる抗体については、該抗体をコードする核酸を該ライブラリーから回収することができる。
特有の実施形態は、下記配列:配列番号30、配列番号38、配列番号42及び配列番号50から成る群より選択される核酸配列を有する重鎖可変部を含む抗体分子をコードする単離された核酸を提供する。本発明の特有の実施形態は、下記配列:(i)それぞれ配列番号31、配列番号32及び/又は配列番号33;(ii)それぞれ配列番号39、配列番号40及び/又は配列番号41;(iii)それぞれ配列番号39、配列番号40及び/又は配列番号83;(iv)それぞれ配列番号43、配列番号44及び/又は配列番号45;(v)それぞれ配列番号43、配列番号44及び/又は配列番号84;並びに(vi)それぞれ配列番号51、配列番号44及び/又は配列番号52;から成る群より選択される核酸配列を有する重鎖CDR1、CDR2及び/又はCDR3配列を含む抗体分子をコードする単離された核酸を提供する。
特有の実施形態は、下記配列:配列番号34、配列番号46、配列番号66、配列番号68、配列番号70、配列番号72及び配列番号74から成る群より選択される核酸配列を有する軽鎖可変部を含む抗体分子をコードする単離された核酸を提供する。本発明の特有の実施形態は、下記配列:(i)それぞれ配列番号35、配列番号36及び/又は配列番号37;(ii)それぞれ配列番号47、配列番号48及び/又は配列番号49;(iii)それぞれ配列番号47、配列番号48及び/又は配列番号65;(iv)それぞれ配列番号47、配列番号48及び/又は配列番号67;(v)それぞれ配列番号47、配列番号48及び/又は配列番号69;(vi)それぞれ配列番号47、配列番号48及び/又は配列番号71;(vii)それぞれ配列番号47、配列番号48及び/又は配列番号73;から成る群より選択される核酸配列を有する軽鎖CDR1、CDR2及び/又はCDR3配列を含む抗体分子をコードする単離された核酸を提供する。
本発明の特有の実施形態は、Fc領域が遺伝子操作された(結果として抗体の該部分上のFcγR受容体又はC1qへの結合が減った)抗体分子をコードする核酸を包含する。本発明の1つの特有の実施形態は、配列番号80に示される配列を有する単離された核酸である。特有の実施形態では、適切な発現ベクター内で合成及び構築されたオリゴヌクレオチドから生成された核酸からの発現によって合成抗体分子を生じさせ得る;例えばKnappick et al., 2000 J. Mol. Biol. 296:57-86、及びKrebs et al., 2001 J. Immunol. Methods 254:67-84を参照されたい。
また、本明細書で述べるヌクレオチド配列と少なくとも約90%同一、好ましくは少なくとも約95%同一であるヌクレオチド配列を含み、かつヌクレオチド配列が本発明の抗体をコードする核酸も本発明に包含される。同一性を決定するための配列比較法は当業者に周知であり、以前に述べた当該方法が挙げられる。「少なくとも約90%同一」との言及は、少なくとも約90、91、92、93、94、95、96、97、98、99又は100%同一を包含する。
別の局面では、本発明は、前記核酸を含むベクターを提供する。本発明のベクターとして、限定するものではないが、意図した用途に適したレベルで所望の抗体分子の発現に好適なプラスミド及び他の発現構成物(例えば、必要に応じて、ファージ又はファージミド)が挙げられる;例えば、Sambrook & Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual: 3rd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Pressを参照されたい。多くのクローニング目的のため、DNAベクターを使用し得る。典型的ベクターとして、プラスミド、改変ウイルス、バクテリオファージ、コスミド、酵母人工染色体、及びエピソーム又は組込みDNAの他の形態が挙げられる。個々の遺伝子導入、組換えヒト抗体の生成、又は他の用途に適切なベクターを決定することは、十分に当業者の理解範囲内である。特有の実施形態では、組換え遺伝子に加え、ベクターは、宿主内における自己複製の複製起点、適切な制御配列、例えばプロモーター、終止配列、ポリアデニル化配列、エンハンサー配列、選択可能マーカー、限定数の有用な制限酵素部位、必要に応じて他の配列及び高いコピー数の可能性をも含み得る。抗体及び抗体フラグメントの生産用の発現ベクターの例は技術上周知であり;例えばPersic et al., 1997 Gene 187:9-18; Boel et al., 2000 J. Immunol. Methods 239:153-166、及びLiang et al., 2001 J. Immunol. Methods 247:119-130を参照されたい。所望により、技術上周知の方法を利用して、抗体をコードする核酸を宿主の染色体中に組み込むことができる;例えば、Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, 1999、及びMarks et al., WO 95/17516を参照されたい。エピソームに保持され或いは人工染色体中に組み込まれたプラスミド上で核酸を発現させることもできる;例えば、Csonka et al., 2000 J. Cell Science 113:3207-3216; Vanderbyl et al., 2002 Molecular Therapy 5:10を参照されたい。抗体軽鎖遺伝子と抗体重鎖遺伝子を別々のベクターに挿入することができ、或いはさらに典型的には、両遺伝子を同一の発現ベクターに挿入する。標準的な方法(例えば、抗体遺伝子フラグメント又はベクター上の相補的制限部位のライゲーション、又は制限部位が存在しない場合の平滑末端ライゲーション)で抗体遺伝子を発現ベクターに挿入する。本明細書で述べる抗体の軽鎖及び重鎖可変部を用いて、それらを所望イソ型の重鎖定常部と軽鎖定常部を既にコードしている発現ベクターに挿入することによって(該VHセグメントがベクター内のCHセグメントに動作可能に連結され、かつ該VLセグメントがベクター内のCLセグメントに動作可能に連結されるように)、いずれの抗体イソ型の全長抗体遺伝子をも作製することができる。さらに或いはこれとは別に、組換え発現ベクターは、宿主細胞からの抗体鎖の分泌を促進するシグナルペプチドをコードすることができる。抗体鎖遺伝子をベクターに挿入してクローンを発生させ得る(シグナルペプチドが抗体鎖遺伝子のアミノ末端にインフレーム連結されるように)。シグナルペプチドは、免疫グロブリンシグナルペプチド又は異種シグナルペプチド(すなわち、非免疫グロブリンタンパク質由来のシグナルペプチド)でよい。当業者が利用可能ないずれの方法を利用しても宿主細胞に核酸を導入することができる;例えば、Morrison, 1985 Science, 229:1202を参照されたい。問題の核酸分子を発現ベクターに挿入してサブクローニングし、該ベクターを含有する宿主細胞を形質転換又はトランスフェクトする方法、並びにそれぞれの発現ベクターを宿主細胞に導入する工程、及び該宿主細胞を適切な条件下で培養する工程を含んでなる実質的に純粋なタンパク質を生じさせる方法は周知である。そのように生成された抗体は、常法により宿主から収集される。核酸を問題の細胞に導入するのに適した方法は、使用する細胞型によって決まる。一般的な方法として、限定するものではないが、リン酸カルシウムトランスフェクション、DEAE-デキストラン、電気泳動、リポソーム媒介トランスフェクション及び問題の細胞系に適したウイルス(例えば、レトロウイルス、ワクシニア、バキュロウイルス、又はバクテリオファージ)を利用するトランスフェクションが挙げられる。
別の局面では、本発明は本発明のポリヌクレオチドを含んでなる単離された細胞を提供する。
元の抗体の特異性を保持する他の抗体分子を組換えによって生じさせるために利用可能な方法が存在する。この特有の例では、免疫グロブリン可変部又はCDRをコードするDNAが、別の抗体分子の定常部、又は定常部とフレームワーク部中に組み込まれる;例えば、EP-184,187、GB 2188638、及びEP-239400、並びに当該分野の科学文献を参照されたい。キメラ抗体を含め、抗体分子のクローニング及び発現については文献に記載されている;例えば、EP 0120694及びEP 0125023、並びに当該分野の他の科学文献を参照されたい。
これとは別に、本発明の抗原結合フラグメントのライブラリーをIL-13Rα1と接触させて、抗原との1pM〜200pMのKDを示すこと、及び選択したIL-13Rα1媒介活性をアンタゴナイズする能力を実証することができる。濃縮技術を用いてライブラリーから抗体フラグメントを選択するための方法を専門家は利用可能である。この濃縮技術として、限定するものではないが、ファージディスプレイ(例えば、米国特許第5,565,332号;第5,733,743号;第5,871,907号;第5,872,215号;第5,885,793号;第5,962,255号;第6,140,471号;第6,225,447号;第6,291,650号;第6,492,160号;第6,521,404号;第6,544,731号;第6,555,313号;第6,582,915号;第6,593,081号並びに他の米国ファミリーメンバー及び/又は1992年5月24日提出のGB 9206318の優先権に頼る出願で開示されるCambridge Antibody Technology(CAT)の技術参照;またVaughn et al., 1996, Nature Biotechnology 14:309-314参照)、リボソームディスプレイ(例えば、Hanes and Pluckthun, 1997 Proc. Natl. Acad. Sci. 94:4937-4942参照)、細菌ディスプレイ(例えば、Georgiou, et al., 1997 Nature Biotechnology 15:29-34参照)及び/又は酵母ディスプレイ(例えば、Kieke, et al., 1997 Protein Engineering 10:1303-1310参照)が挙げられる。例えば、その表面上に発現かつ提示された抗原結合フラグメントをコードする核酸を有する、バクテリオファージ粒子の表面上にライブラリーを提示させることができる。次に、所望レベルの活性を示すバクテリオファージ粒子から核酸を単離して、この核酸を抗体分子の開発で使用することができる。本発明の個々の重鎖又は軽鎖クローンを用いて、それぞれ、それと相互作用して、重鎖と軽鎖を組合せた分子を形成できる相補性重鎖又は軽鎖をスクリーニングすることもできる;例えば、WO 92/01047を参照されたい。ファージディスプレイは文献に記載されており;例えば、Kontermann & Stefan(上記)、及びWO 92/01047を参照されたい。
当業者に利用可能な方法でモノクロナール抗体(MAbs)を精製することができる。種々の血清学的又は免疫学的アッセイで関連腹水、ハイブリドーマ培養液、又は問題の試験サンプルの抗体力価を決定できる。このアッセイとして、限定するものではないが、沈殿、受身凝集、酵素結合免疫吸着測定(ELISA)法及び放射性免疫測定(RIA)法が挙げられる。
別の局面では、本発明は、IL-13Rα1の活性に関係がある状態を示す対象のIL-13Rα1の活性をアンタゴナイズする方法であって、前記対象に、治療的に有効な量の本発明の抗体分子を投与する工程を含む方法を提供する。本明細書では、「アンタゴナイズする」とは、標的の1つ以上の機能(結合、シグナル伝達など)に反対し、対抗し、又は該機能を削減する作用を意味する。技術上周知な方法及び本明細書で開示する方法により、IL-13Rα1の機能特性の1つ以上の阻害又は拮抗作用を容易に決定することができる。さらに、このような阻害又は拮抗作用は、その抗体の非存在下で見られる活性、又は例えば、無関係な特異性のコントロール抗体が存在するときに見られる活性と関係する特定の活性の低減を実現すべきであることが分かるだろう。好ましくは、本発明の抗体分子は、IL-13媒介IL-13Rα1機能性を、測定パラメーターが少なくとも10%低減、さらに好ましくは測定パラメーターが少なくとも20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、及び95%低減する点までアンタゴナイズする。このようなIL-13Rα1機能性の阻害/拮抗作用は、受容体機能性が、対象に負の影響を与える特定の表現型、疾患、障害又は状態に少なくとも部分的に寄与する場合に特に有効である。IL-13Rα1媒介疾患、障害又は状態の治療用薬物の製造で開示抗体分子を使用する方法をも想定される。
本明細書で開示する抗体分子を特定の個体(ヒト又は霊長類)の治療又は診断法で使用することができる。本治療方法は、実際は予防的又は治療的であり得る。別の局面では、本発明は、本発明の抗体分子と、医薬的に許容しうる担体、賦形剤、希釈剤、安定剤、緩衝剤、又は治療個体への所望の形式と量での抗体分子の投与を容易にするように設計された代替物とを含んでなる医薬的に許容しうる組成物を提供する。本発明の治療方法は、治療的(又は予防的に)有効な量の本発明の抗体分子を個体に投与する工程を含む。「治療的に有効な」又は「予防的に有効な」量とは、所望時間の間、所望の治療的/予防的効果を果たすために意図した投与量で必要な量を意味する。例えば、所望効果は、治療状態に関係がある少なくとも1つの症状の改善でよい。これらの量は、当業者に明らかなように、種々の因子によって変わる。このような因子として、限定するものではないが、疾患状態、個体の年齢、性別及び体重、並びに抗体分子の、該個体内で所望効果を引き出す能力が挙げられる。その応答は、in vitroアッセイ、in vivo非ヒト動物研究で証明され、かつ/又は臨床治験でさらに支持される。技術上周知の多くのいずれの戦略によっても本発明の抗体を基礎にした医薬組成物を調合し得る。例えば、McGoff and Scher, 2000 Solution Formulation of Proteins/Peptides, In: McNally, E.J., ed. Protein Formulation and Delivery. New York, NY: Marcel Dekker; pp. 139-158; Akers & Defilippis, 2000, Peptides and Proteins as Parenteral Solutions. In: Pharmaceutical Formulation Development of Peptides and Proteins. Philadelphia, PA: Taylor and Francis; pp. 145-177; Akers et al., 2002, Pharm. Biotechnol. 14:47-127を参照されたい。患者投与に適した医薬的に許容しうる組成物は、生物学的活性を保持しながら、許容しうる温度範囲内で貯蔵中に最大の安定性をも助長する製剤中に有効量の抗体分子を含むだろう。
抗体を基礎にした医薬的に許容しうる組成物は、液体又は固体形態でよい。液体又は固体製剤のいずれの製造法をも利用できる。このような方法は、当業者の能力の十分範囲内である。いずれの利用可能な方法によっても固体製剤を製造でき、該方法として、限定するものではないが、凍結乾燥、噴霧乾燥、又は超臨界液体技術が挙げられる。経口投与用の固体製剤は、処方量及び処方期間内で患者が抗体分子にアクセスしやすくするいずれの形態でもよい。経口製剤は、限定するものではないが、錠剤、カプセル剤、又は散剤といった多くの固体製剤の形態をとり得る。固体製剤を凍結乾燥し、単回投与又は連続投与のいずれかの投与前に溶液にし得る。通常、生物学的に適切なpH範囲内で抗体組成物を調製すべきであり、緩衝させて、貯蔵中、適切なpH範囲を維持することができる。液体及び固体製剤はともに一般的に長期間安定性を保持するため低温(例えば、2〜8℃)で貯蔵する必要がある。製剤化された抗体組成物、特に液体製剤は、貯蔵中のタンパク質分解を防止又は最小限にするため静菌剤を含有し得る。静菌剤として、限定するものではないが、有効濃度(例えば、≦1%w/v)のベンジルアルコール、フェノール、m-クレゾール、クロロブタノール、メチルパラベン、及び/又はプロピルパラベンが挙げられる。患者によっては静菌剤が禁忌であり得る。従って、該成分を含有するか含有しない溶液で凍結乾燥製剤を再構成させ得る。追加成分を緩衝液又は固形抗体製剤に添加してよい。追加成分として、限定するものではないが、凍害防御物質としての糖(限定するものではないが、ポリヒドロキシ炭化水素、例えばソルビトール、マンニトール、グリセロール、及びズルシトール及び/又は二糖、例えばスクロース、ラクトース、マルトース、又はトレハロースが挙げられる)並びに、場合によっては、適切な塩(限定するものではないが、NaCl、KCl、又はLiClが挙げられる)が挙げられる。該抗体製剤、特に長期貯蔵のためスレート化(slated)した液体製剤は、有効範囲の全モル浸透圧濃度に依存して、例えば、2〜8℃又はそれより高い温度での長期安定性を助長しながら、該製剤を非経口注射で利用できるようにする。必要に応じ、保存剤、安定剤、緩衝剤、抗酸化剤及び/又は他の添加剤を含めてよい。製剤は、二価カチオン(限定するものではないが、MgCl2、CaCl2、及びMnCl2が挙げられる);及び/又は非イオン性界面活性剤(限定するものではないが、Polysorbate-80(TWEEN 80TM, Polysorbate-60(TWEEN 60TM), Polysorbate-40(TWEEN 40TM)、及びPolysorbate-20(TWEEN 20TMが挙げられる)、ポリオキシエチレンアルキルエーテル(限定するものではないが、BRIJ 58TM、BRIJ 35TMが挙げられる)、並びに他のもの、例えばTRITON X-100TM、TRITON X-114TM、NP40TM、Span 85及びPLURONIC(登録商標)シリーズの非イオン性界面活性剤(例えば、PLURONIC(登録商標)121)を含んでよい。このような成分のいずれの組合せも本発明の特有の実施形態を形成する。
医薬組成物は、適切なpH、浸透圧、及び安定性で熱源のない非経口的に許容しうる水溶液の形態でよい。等張ビヒクル、例えば、塩化ナトリウム液、リンゲル液、又は乳酸リンゲル液で希釈後、投与のため医薬組成物を調製し得る。
抗体治療薬の投与は当業者の十分理解範囲内であり(例えば、Lederman et al., 1991 Int. J. Cancer 47:659-664; Bagshawe et al., 1991 Antibody, Immunoconjugates and Radiopharmaceuticals 4:915-922参照)、多くの因子に基づいて変化する。このような因子として、限定するものではないが、利用する抗体分子、治療する患者、患者の状態、治療する部位、投与経路、及び望まれる治療が挙げられる。通常スキルの医師又は獣医は、有効な量の抗体を容易に決定かつ処方することができる。用量範囲は、約0.01〜100mg/kg、さらに一般的に0.05〜25mg/kg(宿主の体重)でよい。例えば、用量は、0.3mg/kg(体重)、1mg/kg(体重)、3mg/kg(体重)、5mg/kg(体重)若しくは10mg/kg(体重)又は1〜10mg/kgの範囲内でよい。説明目的のため、かつ限定でなく、特有の実施形態では、5mg〜2.0gの用量を利用して、抗体分子を全身に送達することができる。毒性なしで効力を生じさせる範囲内の抗体濃度を達成するのに最適な精度は、標的部位に対する該薬物の有効性のキネティクスに基づいた投与計画を必要とする。これは、抗体分子の分布、平衡、及び排出という考慮事項を含む。本明細書で述べる抗体を単独で適切な用量にて使用し得る。或いは他の薬剤の同時投与又は逐次投与が望ましいこともある。本発明の抗体分子用の治療投与計画を代替治療計画と共に提供することができるだろう。治療できる個体(対象)として、霊長類、ヒト及び非ヒトが挙げられ、商業上若しくは家庭内の獣医学上重要ないずれの非ヒト哺乳動物又は脊椎動物も含まれる。
特定の実施形態では、治療する状態は、下記状態:喘息、アレルギー、アレルギー性鼻炎、慢性副鼻腔炎、花粉症、アトピー性皮膚炎、慢性閉塞性肺疾患(COPD)、肺線維症、食道好酸球増加症、乾癬、乾癬性関節炎、線維症、強皮症、炎症性腸疾患(特に潰瘍性結腸炎)、アナフィラキシー、及び癌(特に、ホジキンリンパ腫、神経膠腫、及び腎癌)、並びに一般的なTh2媒介障害/状態から成る群より選択される。従って、IL-13Rα1媒介状態、例えば上述した状態の治療用薬物の製造における抗体分子の使用は、本発明の重要な実施形態を形成する。
本発明は、遺伝子療法の目的のための開示抗-hIL-13Rα1抗体分子の投与をさらに提供する。この方法では、本発明の抗体分子をコードする核酸で対象の細胞を形質転換させるだろう。そして、該核酸を含む対象は自己発生的に抗体分子を産生するだろう。以前に、Alvarez, et al, Clinical Cancer Research 6:3081-3087, 2000は、遺伝子療法アプローチを利用して単鎖の抗-ErbB2抗体を対象に導入した。本発明の抗-hIL-13Rα1抗体をコードする核酸の対象への導入のため、Alvarezらが開示した方法を容易に適合させ得る。
本発明のいずれのポリペプチド又は抗体分子をコードする核酸も対象に導入することができる。特有の実施形態では、抗体分子はヒトの単鎖抗体である。
技術上周知のいずれの手段を用いても対象の細胞に核酸を導入することができる。特有の実施形態では、核酸をウイルスベクターの一部として導入する。ベクターが由来し得る特有のウイルスの例として、レンチウイルス、ヘルペスウイルス、アデノウィルス、アデノ随伴ウイルス、ワクシニアウイルス、バキュロウイルス、アルファウイルス、インフルエンザウイルス、及び所望の細胞親和性を有する他の組換えウイルスが挙げられる。
種々の会社がウイルスベクターを商業的に製造しており、決して限定するものではないが、AVIGEN, Inc. (Alameda, CA;AAVベクター)、Cell Genesys (Foster City, CA;レトロウィルス、アデノウイルス、AAVベクター、及びレンチウイルスベクター)、CLONTECH (レトロウイルス及びバキュロウイルスベクター)、Genovo, Inc. (Sharon Hill, PA;アデノウイルス及びAAVベクター)、GENVEC (アデノウイルスベクター)、IntroGene (Leiden, Netherlands;アデノウイルスベクター)、Molecular Medicine (レトロウイルス、アデノウイルス、AAV、及びヘルペスウイルスベクター)、Norgen (アデノウイルスベクター)、Oxford BioMedica (Oxford, United Kingdom;レンチウイルスベクター)、及びTransgene (Strasbourg, France;アデノウイルス、ワクシニア、レトロウイルス、及びレンチウイルスベクター)が挙げられる。
弱毒化又は欠陥DNAウイルス配列を含むベクターの例として、限定するものではないが、欠陥ヘルペスウイルスベクターが挙げられる(Kanno et al, Cancer Gen. Ther. 6:147-154, 1999;Kaplitt et al, J. Neurosci. Meth. 71:125-132, 1997及びKaplitt et al, J. Neuro Onc. 19:137-147, 1994参照)。
アデノウイルスは、修飾して種々の細胞型に本発明の核酸を効率的に送達できる真核生物DNAウイルスである。弱毒化アデノウイルスベクター、例えば、Strafford-Perricaudet et al, J. Clin. Invest. 90:626-630, 1992に記載されているベクターが望ましい場合もある。種々の複製欠陥アデノウイルス及び最小アデノウイルスベクターが開示されている(WO94/26914、WO94/28938、WO94/28152、WO94/12649、WO95/02697及びWO96/22378)。当業者に既知のいずれの方法によっても本発明の複製欠陥組換えアデノウイルスを調製することができる(Levrero et al, Gene 101:195, 1991; EP 185573; Graham, EMBO J. 3:2917, 1984; Graham et al, J. Gen. Virol. 36:59, 1977)。
アデノ随伴ウイルス(AAV)は、それらが感染する細胞のゲノム中に、安定した部位特異的様式で組み込める比較的小さいサイズのDNAウイルスである。アデノ随伴ウイルスは、細胞の成長、形態又は分化に如何なる作用をも及ぼすことなく、広範な細胞を感染させることができ、かつヒト病原には関係ないようである。遺伝子をin vitro及びin vivo伝達するためのAAV由来ベクターの使用が開示されている(Daly, et al, Gene Ther. 8:1343-1346, 2001, Larson et al, Adv. Exp. Med. Bio. 489:45-57, 2001;WO 91/18088及びWO 93/09239;米国特許第4,797,368号及び第5,139,941号及びEP 488528B1参照)。
脳、網膜、筋肉、肝臓及び血液といったいくつかの組織タイプにおける、本発明の抗体分子をコードする核酸の直接送達及び持続発現用薬剤としてレンチウイルスベクターを使用することができる。このベクターは、これらの組織内で分裂及び非分裂細胞に効率的に形質導入を生じさせ、かつ抗体分子の長期発現を維持することができる。精査のため、Zufferey et al, J. Virol. 72:9873-80, 1998及びKafri et al, Curr. Opin. Mol. Ther. 3:316-326, 2001を参照されたい。レンチウイルスパッケージング細胞系は入手可能であり、技術上周知である。それらは遺伝子療法用の高力価レンチウイルスベクターの生成を促進する。例はテトラサイクリン誘導性VSV-G偽型レンチウイルスパッケージング細胞系であり、少なくとも3〜4日間で106IU/mlを超える力価でウイルス粒子を生成できる(Kafri et al, J. Virol. 73:576-584, 1999参照)。誘導性細胞系によって生成されたベクターを、効率的に非分裂細胞にin vitro及びin vivo形質導入を生じさせるために必要なように濃縮することができる。
別の実施形態では、リポフェクションによるか又は他のトランスフェクション促進物質(ペプチド、ポリマー等)を用いてベクターを細胞に導入することができる。合成カチオン性脂質を用いて、マーカーをコードする遺伝子のin vivo及びin vitroトランスフェクション用のリポソームを調製できる(Feigner et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:7413-7417, 1987及びWang et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:7851-7855, 1987)。核酸の伝達に有用な脂質化合物及び組成物はPCT公開第WO95/18863号及び第WO96/17823号、並びに米国特許第5,459,127号に開示されている。
裸のDNAプラスミドとしてベクターをin vivo導入することもできる。遺伝子療法用の裸のDNAベクターを技術上周知の方法、例えばエレクトロポレーション、マイクロインジェクション、細胞融合、DEAE-デキストラン、リン酸カルシウム沈殿法、遺伝子銃の使用、又はDNAベクター輸送体の使用によって、所望の宿主細胞に導入することができる(例えば、Wilson, et al, J. Biol. Chem. 267:963-967, 1992;Williams et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:2726-2730, 1991参照)。受容体媒介DNA送達アプローチを使用することもできる(Wu et al, J. Biol. Chem. 263:14621-14624, 1988)。米国特許第5,580,859号及び第5,589,466号は哺乳動物内におけるトランスフェクション促進物質のない外因性DNA配列の送達を開示している。最近、電気転移(electrotransfer)と称する、比較的低い電位の高効率in vivo DNA転移法が開示された(Vilquin et al, Gene Ther. 8:1097, 2001;Payen et al, Exp. Hematol. 29:295-300, 2001;Mir, Bioelectrochemistry 53:1-10, 2001;PCT公開第WO99/01157号、第WO99/01158号及び第WO99/01175号)。
該遺伝子療法アプローチに好適かつ本発明の抗-hIL-13Rα1抗体分子をコードする核酸を含む医薬組成物は、本発明の範囲に包含される。
本発明のさらなる局面は、本明細書で開示する抗体分子又は医薬組成物及び使用説明書を含んでなるキットである。キットは、典型的に該キットの中身の意図した用途を示す標識を含むが、必要なわけではない。用語「標識」は、キット上に供給されるか又はキットと共に供給され、或いは別の方法でキットに随伴するいずれの記載資料、又は記録資料をも包含する。
下記非限定実施例によって、本発明をさらに詳述する。
本明細書で開示するプロトコルを利用して、安定してトランスフェクトされた(IL-13Rα1.ECRをコードするpEFBOS-S-FLAG(登録商標)ベクター)CHO細胞クローンによる馴化培養基から、ヒトIL-13Rα1の大部分の細胞外領域(配列番号81のアミノ酸数3〜317)を包含するN末端FLAG(登録商標)標識融合タンパク質を精製した。精製されたhIL-13Rα1.ECRタンパク質(配列番号82)を濃縮し、引き続きリン酸緩衝食塩水(PBS)、0.02%v/v TWEENTM20中で脱塩後、ろ過滅菌した。典型的回収量は、馴化培地1リットル当たり0.4mgのタンパク質だった。必要になるまでタンパク質を-80℃で貯蔵した。
トランスジェニックマウスの免疫化:HCo7、HCo12及びHCo7xHCo12系統(HUMABTMマウス, Medarex, USA)由来トランスジェニックマウスを実施例1のhIL-13Rα1.ECRで免疫化した。最初の免疫化では、20〜50μgのhIL-13Rα1.ECRを完全フロイントアジュバント(CFA)内で乳化させて腹腔内(i.p.)経路で投与した。最低2回及び最高3回の引き続く腹腔内免疫化では、20〜50μgのhIL-13Rα1.ECRを不完全フロイントアジュバント(IFA)内で乳化させた。IFA内のhIL-13Rα1.ECRで第2及び第3の免疫化後、血清をサンプリングし(後眼窩神経叢)、本明細書で述べる通りにELISAでhIL-13Rα1.ECRに対するヒト抗体についてアッセイした。高応答マウス(血清力価が一般的に>1:3200)をハイブリドーマ作製用に選択した。場合によっては、この時点でハイブリドーマ作製に動物を使用せず、PBS中20〜50μgのhIL-13Rα1.ECRでさらに腹腔内免疫化した。3匹の動物から血清を再びELISAでhIL-13Rα1.ECRに対するヒト抗体についてアッセイし、高応答マウスをハイブリドーマ作製に使用した。ハイブリドーマ作製用に選択したマウスを脾臓細胞融合の3〜4日前に20-50μgのhIL-13Rα1.ECRで静脈内注射にて追加免疫した。
抗体精製用上清液(SNF)作製のため、ハイブリドーマをT175cm2フラスコ(FALCON, #3028)又はローラーボトル(900cm2)(CORNING, #430849)中で増殖させた。ハイブリドーマSNFの作製に用いた培地は、5%の超低IgG FBS、2mMのグルタミン及び50U/50μg/mlのペニシリン/ストレプトマイシンで補充したHSFMだった。ハイブリドーマを増殖させてコンフルエンスにし、90%を超える細胞が死亡後約5〜10日に遠心分離で収集した。STERICUPTMろ過装置(MILLIPORE, #SCGPU11RE)(0.45μm)を用いて全ての馴化培地をろ過後、mAb精製した。
精製mAbの作製:例えば、以下の試薬を用いて、標準的なタンパク質A親和性クロマトグラフィーを基礎とした戦略でSNFからモノクロナール抗体を精製した。HPLC:AKTA探索装置(AMERSHAM Biosciences, Sweden);カラム:タンパク質A(HITRAPTM-1ml, AMERSHAM Biosciences, Sweden);緩衝液A:PBS, 0.02% TWEENTM20;緩衝液B:0.1Mのグリシン pH 2.8;緩衝液C:2Mのトリス(pH 8.0)。
5容量の緩衝液Aで洗浄してカラムを調製した。馴化培地を専用カラム上に装填した。100容量の緩衝液Aで洗浄し、20ml(10×2ml)の緩衝液Bで溶出した。0.2mlの緩衝液を含有する管に回収した。緩衝液Aでカラムを洗浄して4℃で保存した。10Kカットオフ透析膜で脱塩してPBS、0.02% TWEENTM20に入れた。COOMASSIE(登録商標)ブルー染色を用いてSDS-PAGEでmAb純度を実証した。
1.34mg/mlの抗体に等価である1.0吸光度単位の免疫グロブリン吸光係数を用いて280nmにおける分光光度分析によって抗体を定量化した。
BIACOREを基礎とした研究:製造業者の説明書に従い、所定の固定化値、例えば1000RUにて標準的なNHS/EDC化学を利用して実施例1のヒトIL-13Rα1.ECR(40μg/ml、20mMの酢酸ナトリウム中、pH 4.2)をセンサーチップ(CM5, Biosensor, Sweden)に固定化した。hIL-13Rα1.ECR固定化後の残存活性エステルをエタノールアミン(1.0M)(pH 8.0)を用いてクエンチした。
固定化hIL-13Rα1.ECRへの抗体の結合の分析(1.4nM〜150nMの濃度範囲、2倍希釈)を二通り行った。生成されたセンサーグラムを二価リガンド結合モデルに適合させて同時に会合速度(ka)と解離速度(kd)を導き、かつセンサーグラムを用いて結合親和性を決定した(KD, Biaevaluationソフトウェア, BIACORETM, Sweden)。
正常ヒト皮膚線維芽細胞(NHDF)エオタキシンアッセイ:NHDF細胞をCambrex(#CC-2509)から購入し、提供された添加剤で補充したFGM培地(Cambrex CC3132)(以下、完全培地と称する)内で培養した。1週間に1回細胞を1:3又は1:5に継代し、使用前にIL-13に対する応答性についてモニターした。IL-13Rα1抗体に対する拮抗活性を評価するため20ng/mlのPMA(SIGMA P8139)と20μg/mlのポリミキシン(SIGMA #P4932)を含む完全培地中2×106/mlで細胞を再懸濁させ、96ウェル平底プレート(COSTAR #3595)に1×105細胞/ウェルで蒔いた。抗体滴定を細胞に加え、5%のCO2インキュベーター内30分間37℃でインキュベートした。組換えアカゲザルIL-13を10ng/mlの最終濃度で加え、プレートを5%のCO2インキュベーター内で一晩37℃にてインキュベートした。上清を除去し、以下のようにイムノアッセイでエオタキシン含量についてアッセイした。IMMULON(登録商標)-4プレート(DYNATECH #3855)をPBS(INVITROGEN, #14190-144)中の2μg/mlの抗-ヒトエオタキシン抗体(PHARMINGEN #555035)で一晩4℃で被覆した。プレートを遮断緩衝液で1時間室温にて遮断し、洗浄緩衝液で3回洗浄した。NHDF細胞からの上清を組換えヒトエオタキシン標準物質(R&D Systems, #320-EO)と共にプレートに加えた。サンプルを2時間室温で捕獲し、洗浄し、ビオチン化抗-ヒトエオタキシン検出抗体(PHARMINGEN, #555060)を200ng/mlで1時間室温にて加えた。プレートを洗浄し、ストレプトアビジン-ユウロピウム(Wallac, #1244-360)を100ng/mlの濃度で20分間室温で加えた。最終洗浄工程を行い、増強溶液(Wallac, #1244-105)を1時間室温で加えた。VICTOR(PERKIN-ELMER)プレートリーダーで時間遅延蛍光によってプレートを解読した。
結果:NHDFアッセイでIL-13Rα1媒介活性をアンタゴナイズする能力について抗体を調べた。ELISAアッセイで完全に良い結合を有するとして及びNHDアッセイでIL-13のアンタゴニストとして選択された抗体は2B6、4A10、6C11及び8B4だった。チップ結合hIL-13Rα1細胞外ドメインへの結合をBIACORETM分析で評価した。これらの各アッセイの結果を下表2に示す。
2B6、6C11及び8B4を発現するハイブリドーマを以下のようにATCCに寄託した:PTA-6932の下に2B6;PTA-6930の下に6C11;及びPTA-6934の下に8B4。
2B6、4A10、6C11及び8B4のCDR領域はVHCDR1を除き、カバット(Kabat)システム(Kabat et al, Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH公開番号91:3242, 1991)を用いて描写される。VHCDR1は、配列と構造の両定義(Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917, 1987)、すなわちVH残基26〜35を包含するように拡張される。
NHDF IL-13-誘導STAT6リン酸化アッセイ:NHDF細胞をCambrex(#CC-2509)から購入し、提供された添加剤で補充したFGM培地(Cambrex CC3132)内で培養した。96-ウェルV-底ポリエチレンPCRプレート(#1442-9596, USA scientific)内RPMI培地(#22400-071, INVITROGEN)内50μlの容量で2e6/mlにてNHDF細胞を蒔いた。抗-IL13R抗体を25μl容量で加えて4℃で30分インキュベートした。組換えアカゲザルIL-13を100ng/mlの最終濃度で加えた。PCR機内でプレートを20分間37℃に加温し、即座に、等容量の2×溶解緩衝液(100μl)を加えた。イムノアッセイでpSTAT6を測定した。IMMULON(登録商標)-4プレート(#3855, DYNATECH)を抗-ヒトホスホSTAT6(621995, BD Transduction Labs)でPBS中10μg/mlにて(#14290-144, INVITROGEN)(50μl/ウェル)一晩4℃で被覆した。遮断緩衝液(200μl/ウェル)を室温で1時間添加した。プレートを洗浄緩衝液で3回洗浄した。5μl/ウェルのライセートを加えて室温で2時間インキュベートした。プレートを洗浄緩衝液で3回洗浄した。室温で1時間加えた遮断緩衝液(60μl/ウェル)中2μg/mlのビオチン抗-STAT6(621141, BD Transduction Labs 抱合20:1モル比)で検出が可能だった。プレートを洗浄緩衝液で3回洗浄した。ストレプトアビジン-ユウロピウム(#1244-360, Wallac)(100μl/ウェル)を100ng/mlでユウロピウム緩衝液に室温で20分間添加した。プレートを洗浄緩衝液で3回洗浄した。増強溶液(#12244-105, Wallac)(150μl/ウェル)を室温で1時間加え、VICTOR(PERKIN-ELMER)リーダーで時間遅延蛍光によってプレートを解読した。
結果:2B6のEC50を7.0μg/mlと決定した。8B4のEC50は平均して約2.9μg/mlだった。6C11のEC50を3.8μg/mlと決定した。
胸腺及び活性化-制御ケモカイン(Thymus and Activation-Regulated Chemokine)(TARC)放出アッセイ(イヌ、アカゲザル又はヒト):ヘパリン化VACUTAINERTM管(VT6480, VWR)に血液を収集した。PBMCをLymphocyte Separation Media(ICN, 50494X)上で単離した。PBMC又は全血を96ウェル平底プレート(#2595, COSTAR)に蒔いた。抗体を加えてプレートを室温で30分間インキュベートした。組換えアカゲザルIL-13を10ng/mlの最終濃度で加え、加湿チャンバー内でCO2と共に37℃で24〜72時間プレートをインキュベートした。上清又は血漿を収集した(24時間ほどの早さでTARCを検出できるが、レベルは上昇し続ける)。TARCをイムノアッセイで測定した。IMMULON(登録商標)-4プレート(#3855, DYNATECH)を抗-ヒトTARC(R&D #AF364)でPBS中2μg/mlで被覆した(#14290-144, INVITROGEN)(50μl/ウェル)。プレートを4℃で一晩インキュベートした。遮断緩衝液(200μl/ウェル)を加えて室温で1時間インキュベートした。プレートを洗浄緩衝液で3回洗浄した。血漿又は上清を50μl/ウェル加え、室温で2時間インキュベートした(血漿希釈1:2)。2倍希釈した20ng/mlの組換えヒトTARCで始まる標準曲線が含まれた。プレートを洗浄緩衝液で3回洗浄した。ビオチン抗-ヒトTARC(RDI, #RDI-TarcabrP1 ビオチンに抱合20:1モル比)を用いて遮断緩衝液(60μl/ウェル)中250ng/mlで室温にて1時間検出を行った。プレートを洗浄緩衝液で3回洗浄した。ストレプトアビジン-ユウロピウム(#1244-360, Wallac)を100μl/ウェル、ユウロピウム緩衝液中100ng/mlで室温にて20分間加えた。プレートを洗浄緩衝液で3回洗浄した。増強溶液(#12244-105, Wallac)150μl/ウェルを加えて室温で1時間インキュベートした。時間遅延蛍光をVICTOR(PERKIN-ELMER)リーダーで解読した。
結果:8B4は、平均して約2.6μg/mlのIC50をもたらした。6C11は、2.50μg/mlのIC50をもたらした。
Fabファージ-ディスプレイベクター、pFab3d(図1)内で軽鎖構成物内の入れ物(stuffer)としてXhoI/ApaI部位でクローン化された真菌Glarea lozoyensisのPKS3遺伝子座由来の1929bpのXhoI/ApaIフラグメントを用いて8B4の可変重鎖及び可変軽鎖配列をクローン化してから、該可変重鎖及び軽鎖CDR3配列内でランダムに変異させた(各ライブラリーは108超えの機能多様性を有する)。結果として生じた変異体を、標準的なファージディスプレイプロトコルを用いて(例えば、Phage Display: A Laboratory Manual, 2001, Cold Spring Harbor Laboratory Press参照)、溶液中のビオチン化したヒト及び霊長類(アカゲザル及びカニクイザル(cynomologous monkey))IL-13Rα1に対してパニングした。ヒト及び霊長類の配列は文献に開示されている;例えば、受入番号:U62858、CAA70508、及びAAP78901を参照されたい。引き続く各ラウンドのパニングで標的の濃度を下げることによって(例えば、10nM、1nM、0.1nM、及び0.01nM)、パニングのストリンジェンシーを効率的に高めることによって、引き続くラウンドごとにどんどん高くなる親和性のためファージを濃縮した。ファージELISAを一次アッセイとして用いて、ファージ結合組換えFabの、ストレプトアビジンプレート上に固定化したビオチン化IL-13Rα1を認識する能力を決定した(例えば、上記のPhage Display: A Laboratory Manual参照)。二次スクリーニングツールとして、Myc-捕獲ELISA及び解離アッセイ(後述する一般プロトコル)を使用した。BIACORETM表面プラズモン共鳴及び/又はKINEXATM動態排除(kinetic exclusion)アッセイを行って、同定された抗体の結合キネティクスを特徴づけた。公開された製造業者のプロトコル及び常法で決定された結合キネティクスに準拠してこれらのアッセイを行った。哺乳動物細胞における発現、産生及び特徴づけのためサブクラIgG4の全長抗体に特異的抗体を変換させた(本明細書で述べる一般プロトコル)。
アッセイ(I):IMMULON(登録商標)-4プレート(DYNATECH #3855)をポリクロナール抗-ヒトκ抗体(Immunology Consultants Lab #GKBF-80A-K116)、PBS(#14290-144, INVITROGEN)中5μg/ml、50μl/ウェルを4℃で一晩インキュベートした。遮断緩衝液(200μl/ウェル)を加えてプレートを室温で1時間インキュベートした。プレートを洗浄緩衝液で3回洗浄した。純粋ペリプレップを加え(50μl/ウェル)、室温で2時間放置した。プレートを洗浄緩衝液で3回洗浄した。5μg/mlのヒトγグロブリン(Pierce #31879)を遮断緩衝液に加えて4℃で一晩放置してインキュベートした。朝と午後にプレートを洗浄緩衝液で3回洗浄した後、始めから終わりまで37℃でインキュベートしながら150μl/ウェルの遮断緩衝液を添加した。プレートを洗浄緩衝液で3回洗浄した。結合した抗体を、遮断緩衝液(60μl/ウェル)中1μg/mlでビオチン抗-Myc(Upstate #16-212)を用いて1時間室温で検出した。プレートを洗浄緩衝液で3回洗浄した。ストレプトアビジン-ユウロピウム(Wallac, #1244-360)(100μl/ウェル、ユウロピウム緩衝液中100ng/mlで)を20分間室温で添加した。最終工程(3回)を行い、増強溶液(Wallac, #1244-105)、150μl/ウェルを1時間室温で添加した。VICTOR (PERKIN-ELMER)プレートリーダーで時間遅延蛍光によってプレートを解読した。
これらのプライマー対を利用し、8B4可変部配列を運ぶFabを用いて20サイクルで可変部をPCR増幅した。PCR産物を軽鎖用のHindIIIとBsiWI及び重鎖用のHindIIIとApaIで消化した。酵素消化されたPCRフラグメントをLonzaのベクター(軽鎖用のpCONKAPPA及び重鎖用のpCONGAMMA4)中でクローン化した。NotI及びSalIで消化されたpCONGAMMA4ベクターからのそれぞれの重鎖の発現カセット全体を、同一酵素で消化された対応する軽鎖ベクター中に挿入した。軽鎖と重鎖の両方のオープンリーディングフレーム全体をDNAシークエンシングで検証した。
抗体の発現、精製及び特徴づけ:結合した軽鎖及び重鎖プラスミドDNA又は対応する軽鎖及び重鎖プラスミドDNAの1:1比の混合物を293由来細胞系にトランスフェクトした。pCONベクターでは、INVITROGENからの293 FREESTYLETMサスペンション細胞系をそのトランスフェクション試薬と共に使用した。200mlの293 FREESTYLETM細胞では、トランスフェクションのため100μgの重鎖及び軽鎖の各プラスミドDNAと300μlのトランスフェクション試薬を用いた。トランスフェクトされた細胞を37℃/5%のCO2で7〜8日間インキュベート後、収集した。培地を収集し、ろ過し、低速MILLIPORE CENTRICONTM遠心分離(濃縮器, MilliPore)を利用して濃縮した。
結果:選択抗体についてKINEXA(登録商標)分析を行った。IgG4として特異的な全長抗体のデータを表3に示す。
実施例3の方法により、8B4-IGg4のIC50及びIL-13での刺激によるNHDF細胞からのエオタキシン放出を阻害するための8B4由来の最適化抗体8B4-78MのIC50は、それぞれ約1μg/ml及び約0.1μg/mlだった。さらに、8B4-74C、8B4-36、8B4-82、及び8B4021CのIC50値は、それぞれ0.10μg/ml、0.17μg/ml、1.31μg/ml、及び0.75μg/mlだった。
Claims (18)
- ヒトインターロイキン13受容体α1に結合する単離された抗体であって、
(a)前記抗体の重鎖可変部が、以下:
(i)それぞれ配列番号2、3及び4;
(ii)それぞれ配列番号14、15及び16;又は
(iii)それぞれ配列番号22、15及び23
に示されるCDR1、CDR2及びCDR3アミノ酸配列を含み;かつ
(b)前記抗体の軽鎖可変部が、以下:
(i)それぞれ配列番号6、7及び8;又は
(ii)それぞれ配列番号18、19及び20
に示されるCDR1、CDR2及びCDR3配列を含み、
前記抗体が、NHDF細胞からのインターロイキン13誘導ヒトインターロイキン13受容体α1媒介エオタキシン放出をアンタゴナイズする、単離された抗体。 - 配列番号79に示される重鎖定常部をさらに含む、請求項1記載の単離された抗体。
- 請求項2記載の抗体及び医薬的に許容しうる担体を含んでなる組成物。
- ヒトインターロイキン13受容体α1に結合する単離された抗体であって、
(a)配列番号1、配列番号9、配列番号13、若しくは配列番号21に示されるアミノ酸配列、又は該配列と少なくとも90%相同の配列を有する重鎖可変部;
(b)配列番号5若しくは配列番号17に示されるアミノ酸配列、又は該配列と少なくとも90%相同の配列を有する軽鎖可変部;又は
(c)(a)と(b)の組合せ
を含んでなり、
前記抗体が、NHDF細胞からのインターロイキン13誘導ヒトインターロイキン13受容体α1媒介エオタキシン放出をアンタゴナイズする、単離された抗体。 - ATCC寄託番号PTA-6933として寄託されたハイブリドーマ細胞系によって産生される、請求項4記載の単離された抗体。
- ATCC寄託番号PTA-6930として寄託されたハイブリドーマ細胞系によって産生される、請求項記載4の単離された抗体。
- ATCC寄託番号PTA-6934として寄託されたハイブリドーマ細胞系によって産生される、請求項4記載の単離された抗体。
- 配列番号79に示される重鎖定常部をさらに含む、請求項4記載の単離された抗体。
- 前記重鎖可変部及び軽鎖可変部のアミノ酸配列が、それぞれ配列番号1及び配列番号5に示される、請求項8記載の単離された抗体。
- 前記重鎖可変部及び軽鎖可変部のアミノ酸配列が、それぞれ配列番号13及び配列番号17に示される、請求項8記載の単離された抗体。
- 前記重鎖可変部及び軽鎖可変部のアミノ酸配列が、それぞれ配列番号21及び配列番号17に示される、請求項8記載の単離された抗体。
- 請求項8記載の抗体及び医薬的に許容しうる担体を含んでなる組成物。
- インターロイキン13受容体α1媒介活性によって起こるか又は悪化する状態を改善する方法であって、治療が必要な対象に、有効量の請求項2記載の組成物を投与することによって、前記インターロイキン13受容体α1媒介活性によって起こるか又は悪化する状態を改善する方法。
- 前記状態が、喘息、アレルギー、アレルギー性鼻炎、慢性副鼻腔炎、花粉症、アトピー性皮膚炎、慢性閉塞性肺疾患、肺線維症、食道好酸球増加症、強皮症、乾癬、乾癬性関節炎、線維症、炎症性腸疾患、潰瘍性結腸炎、アナフィラキシー、又は癌である、請求項13記載の方法。
- 前記癌が、ホジキンリンパ腫、神経膠腫、又は腎癌である、請求項14記載の方法。
- 請求項4記載の抗体をコードする単離された核酸。
- 請求項16記載の核酸を含んでなるベクター。
- 請求項17記載のベクターを含んでなる単離された宿主細胞。
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