JPS62252759A - 架橋剤 - Google Patents

架橋剤

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JPS62252759A
JPS62252759A JP62060275A JP6027587A JPS62252759A JP S62252759 A JPS62252759 A JP S62252759A JP 62060275 A JP62060275 A JP 62060275A JP 6027587 A JP6027587 A JP 6027587A JP S62252759 A JPS62252759 A JP S62252759A
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JP
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oxaalkylene
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acid
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JP62060275A
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English (en)
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ダニューテ　エミリヤ　ニテッキ
マーガレット　モアランド
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Novartis Vaccines and Diagnostics Inc
Original Assignee
Cetus Corp
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Publication date
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Publication of JPS62252759A publication Critical patent/JPS62252759A/ja
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D213/00—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D213/02—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D213/04—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having no bond between the ring nitrogen atom and a non-ring member or having only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom
    • C07D213/60—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having no bond between the ring nitrogen atom and a non-ring member or having only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom with hetero atoms or with carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals, directly attached to ring carbon atoms
    • C07D213/62—Oxygen or sulfur atoms
    • C07D213/70—Sulfur atoms
    • C07D213/71—Sulfur atoms to which a second hetero atom is attached
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54353—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals with ligand attached to the carrier via a chemical coupling agent

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、生物学的に重要な部分に対するクロスリンカ
−（架橋剤）の製造および使用に関する。
より詳細には、本発明は、１つの生物学的な物質または
他の物質上に存在するまたはつくられたアルデヒド基を
別の物質上にあるスルフヒドリル基に連結するように働
くヘテロ三官能性化合物に関する。
予め独立していた２つの物質の活性を合するように意識
的に設計されている生物学的に重要な接合体に関しての
文献が数多くある。その最も顕著な例として挙げられる
のは酵素結合イムノアッセイ（ＥＬＩＳＡ）であり、そ
こでは酵素が抗体に接合されて標識（ラベル）として働
く。他の適用として、トキシン（毒素）が抗体と連結さ
れてそのトキシンの標的組織への特異的輸送が行なわれ
るイムノトキシン、治療剤を抗体に連結することによっ
て行なわれる治療剤の輸送、および結合部分と標識とを
含んでいるヘテロ分子を用いて特異的組織レセプタを標
的（ターゲット）にすることによって特定の組織を検出
するかまたは特定の組織に局限するための試薬を挙げる
ことができる。腫瘍治療におけるこのような接合体のレ
ビュウはイムノロジカル・レビュウズ（Ｉｍｍｕｎｏｌ
ｏ　１ｃａ１７（１９８２年）姪：１〜２１６真に示さ
れた。
所望の連結の形成に対する数多くのアプローチがなされ
てきた。おそらく最もポピユラーなアプローチは、商業
的に入手可能な試薬Ｎ−サクシンイミジル−３−（２−
ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）を使用す
るものである。５ＰＤＰはそれ自体とある１つの部分と
の間のジスルフィド橋およびそれ自体と他の部分との間
のアミドの可能性を提供する。従って、例えば、一方の
蛋白質がアミドを形成する遊離のアミノ基を含んでおり
、そして他方の蛋白質がジスルフィドを形成するスルフ
ヒドリルを含んでいる場合に、それら２つの蛋白質は連
結され得る。または、側鎖アミノ基を有する２つの蛋白
質はそれぞれ５ＰＤＰによって誘導体化されて、それら
２つの蛋白質の間のジスルフィド橋のために必要なスル
フヒドリル官能性を提供することができる。
他の利用可能なリンカ−は、例えばマレイミドまたはハ
ロアセチル基を用いることによって蛋白質由来のまたは
つ（られたスルフヒドリル基と反応してチオエーテルを
形成する。これらのリンカ−は通常、活性化されたカル
ボキシル部分を提供することによって連結分子の反対の
末端にアミド形成するための官能性を有している。従っ
て、例えば、６−マレイミドカプロン酸、２−ブロモ酢
酸および２−ヨード酢酸の活性化されたエステルが使用
されてきた。それらの酸の活性化エステル型は好ましく
は１−ヒドロキシ−２−ニトロ−４−スルホン酸ナトリ
ウム塩から形成された水溶性エステルまたはスクシンイ
ミジルエステルの発生によって形成された。
使用可能な他の結合剤（カップリング剤）として、より
古いそして特異性に乏しいリンカ−例えばグルタルアル
デヒドおよび脱水剤例えばジシクロへキシルカルボジイ
ミドを挙げることができる。
前述したリンカ−は、接合体の２つの構成員が両方とも
蛋白質であるということを考えて選ばれてきた。そして
それら蛋白質の知られている側鎖の官能性が利用されて
きた。ごく最近、糖蛋白質が構成要素の１つである場合
には、その糖蛋白質のサツカリド部分の糖部分を使用し
得るということがわかった。このことは、例えば、１９
８３年９月１４日に公開された欧州特許出願公開第８８
６９５号明細書に示唆されている。とりわけ、他の示唆
の中で、この公開出願明細書は、一般に糖蛋白質上にお
よびとりわけ抗体上に存在している炭水化物を、酸化さ
れた形の炭水化物を用いてヒドラゾンを形成することに
よって利用する旨を開示している。
従って、この開示は、酸化された抗体サツカリド成分の
アルデヒド基をヒドラジン試薬またはアミン試薬と反応
させることを示唆している。これに関して、この開示は
、二官能性リンカ−の末端にヒドラジンまたは同等の部
分を有する二官能性リンカ−を使用することを考えてい
る。一方の末端にヒドラジン部分を含みかつ他方の末端
にスルフヒドリルとの反応可能な基を含んでいる特定の
リンカ−は何ら示唆されていない。
しかしながら、このような特定のリンカ−は、２−アセ
トアミド−メルカプト酪酸ヒドラジドの使用を示唆する
ティラー、グー。イー、　（Ｔａｙｌｏｒ。
Ｋ、ｆ！、）等によってバイオケミストリー・インター
ナショナル（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒ　　Ｉｎｔｅｒｎ
ａ刀Ａ朗刀−（１９８０年）土：３５３〜３５８真に標
識（ラベル）を細胞表面の炭水化物に結合する目的で示
唆されている。この試薬は、それ自体のスルフヒドリル
が例えば５ＰＤＰによって活性化される蛋白質とジスル
フィド結合形成が可能なＳＨ基を提供し、そしてを提供
する。
当業界において多数のへテロニ官能性連結部分（これら
の部分の商業上の一供給者により「ダブル・エージュン
ッ」と呼ばれる）が存在するが、一方の末端においてア
ルデヒドと反応するための能力を他方の末端においてジ
スルフィドを形成するように反応する能力を提供する入
手可能な特定の種類のリンカ−が存在しないことは明白
であろう。このような種類の試薬は、スルフヒドリル基
を有しているかまたはスルフヒドリル基を供給され得る
蛋白質に糖蛋白質を結合するのにとりわけ有効である。
本発明は、酸化された糖または他のアルデヒド基を含有
する物質と、スルフヒドリルと反応性であるかまたは反
応性であるように変形可能な官能性を含有する物質との
接合を促進するように設計されたヘテロ三官能性リンカ
−の系を提供する。
大部分の適用において使用される場合、本発明のリンカ
−は、適度な水溶性を与え、２つの結合部分の間の立体
配置においである程度の独立を許容するのに足るだけの
柔軟性があり、かなり容易に水和され、そして最小限の
免疫原性を有していなければならない。もちろん、これ
らすべての性質が各架橋剤に存在することが必要という
わけではない。まず第一に、これらの性質は、目的とす
る適用に応じて最終生成物において必要でないことがあ
る。第二に、これらの性質が最終生成物において必要と
される場合でさえ、追加の手順によってこれらの性質を
与えることができるかもしれない。
本発明は、その主たる観点において、下記式で表わされ
る化合物に向けられている。
Ｌ−Ｓ−（Ｃ１！□）　、−ＣＯＮ）ｌ−スペーサー−
ＮＨ−Ｘ上記式中、Ｌは−Ｈまたは−５−Ａｒから選ば
れる脱離基であり、ここでＡｒは必要により置換されて
いるフェニルまたはピリジルを表わす；ｎｌは２〜４で
あり； Ｘは水素、−Ｃｏ　−Ｙ　−Ｃ０Ｎ）ｌＮＩｌｚ　　（
ヒドラジド）、（ヒドラジン）　、−Ｃｏ　　Ｙ　　Ｎ
ＨＣ０ＮＨＮＩｂ（セミカルバジド）および−Ｃｏ　　
Ｚ−Ｎ）ｌ　　Ｃ３ＮＨＮＨｚ（チオセミカルバジド）
から選ばれ、 ここでＹはアルキレンまたはオキサアルキレンであり、
そしてＺはアルキレン、オキサアルキレン、またはポリ
ペプチドのＮ末端アミノ基およびＣ末端カルボキシ基を
架橋する該ポリペプチドの残基である； スペーサーは必要により存在し、存在する場合にはオキ
サアルキレンまたはヒドロキシルによって置換されたオ
キサアルキレンであり、そしてとりわけ ａ　）　−（ＣＨｚ）　ａｚ−０−（ＣＨｇ）　ｎｚ−
０−（ＣＨｔ）　ａｚ−（式中、ｎ２は各々独立して２
〜４である）および （式中、ｎ３は２〜６である）から選ばれる式を有する
残基を含んでいる。
本発明の化合物は、ω−メルカプトカルボン酸のヒドラ
ジド、セミカルバジドおよびチオセミカルバジドも含ん
でいる。従って、これらは式１の化合物に似ているが、
スペーサージアミンを欠いている。
他の観点において、本発明はこれらの連結試薬の合成方
法およびこれらの合成方法における中間体に関する。さ
らに他の観点において、本発明は、適当な部分を連結し
て接合体を形成するこれらの連結試薬の使用、このよう
な接合における中間体、および接合体それ自体に関する
。
１画４日０１式 本発明の主たる中心である化合物は、一方の末端にカル
ボニル（アルデヒドまたはケトン）と反応可能な官能基
を、そして他方の末端にジスルフィドまたはチオエーテ
ルを形成するチオ（ＲＳ−）連結のための官能性を含ん
でいる。カルボニル反応性基は、ヒドラジド、ヒドラジ
ン、セミカルバジドおよびチオセミカルバジドから選ば
れる。カルボニル反応性基は、スペーサーによって、ω
−メルカプトカルボン酸から誘導された残基から隔てら
れている。
５二」」υ１性 リンカ−のジスルフィド形成性官能性におけるω−メル
カプトカルボン酸基のスルフヒドリルは、必要により置
換されているピリジルスルフヒドリル化合物または必要
により置換されているフエ、ニルスルフヒドリル化合物
を用いた中間体ジスルフィドの形成によって誘導体にさ
れていてもいなくてもよい。誘導体化によって付加され
たメルカプトピリジル部分またはメルカプトフェニル部
分およびω−スルフヒドリルカルボキシル部分の最初の
メルカプチル基のＨは両方とも、１つの接合相手へのジ
スルフィド結合またはチオエーテル結合の形成の際に失
われる脱離基である。脱離としての水素の使用は、反応
が意図されている基自体が活性化される場合、例えばジ
スルフィドとなる場合に可能であり、臭化物イオンまた
は沃化物イオンの求核置換反応によってまたは二重結合
への付加によってチオエーテルが形成される場合にも有
用である。予定の基質それ自体がスルフヒドリルを含ん
でおりそのスルフヒドリルとの反応が意図されている場
合、より活性化された形のリンカ−が用いられそして脱
離基はメルカプトアリール誘導体、すなわちメルカプト
ピリジルまたはメルカプトフェニルである。
最も通常に見い出されるメルカプトアリールは２−メル
カプトピリジルである。しかしながら、メルカプト基は
ピリジル部分の４位に位置していてよくそしてピリジル
部分は必要により比較的中性の置換基、例えば１個また
は２個の低級アルキル（１〜４Ｃ）基、によって置換さ
れていてもよい。同様に、記号して表わされる基は、必
要により電子供与性置換基、例えばメトキシ基またはア
ミノ基、によって置換されているメルカプトフェニルで
あってよい。いずれの場合にも、メルカプト基の硫黄へ
電子を供与する環の能力を実質的に減じない置換基はい
ずれも実施可能である。従って、ｒ−３−ＬＪ基におい
て、ＬはＳ−Ｓ結合の電子なしに脱離する脱離基を表わ
す。
カルボニル　、ｌＰ″ゞ 本発明の成分を調製するにおいて、カルボニル反応性官
能性は、−３−Ｌ基を提供するω−メルカプトカルボン
酸との適当な反応によって与えられる。従って、式ｌの
化合物は、 Ｌ　−Ｓ　−（ＣＨ２）ｌ１１−　Ｃ−と種々の適当な
試薬との組み合わせである。
−−なしの誼。
本発明の化合物は、スペーサーを含めることなくω−ス
ルフヒドリルカルボン酸から、所望により最初にメルカ
プトアリール脱離基を提供し、次いでカルボキシル基を
所望のカルボニル反応性基、例えばヒドラジド、に転化
することによって直接に製造することができる。従って
、これらの本発明化合物については、以下に示す反応図
式１を用いる。
１１ｓ−（ＣＩり１−Ｃ０ＯＨ＋Ｌ−Ｌ−→Ｌ−Ｓ−（
ＣＨｚ）　１ＣＯＯＨＬ−３−（ＣＨ２）Ｉ、ＩＣ０Ｎ
ＨＮＨＢＯＣＬ−Ｓ−（Ｃ１ｈ）、１＋ＣＯＣｌ２　ａ
　　　　　　　Ｌ−Ｓ−（Ｃ１ｈ）ｎ＋ＮＨＣＯＮＨＮ
ｌｈＬ−Ｓ−（ＣＨｚ）□ＮＨＣＳＮＨＮＨｚ主且 反応図式　１ ヒドラジドを得るためのこの図式において、誘導体化さ
れたカルボン酸を、Ｂｏｃ保護ヒドラジンと反応させる
（Ｂｏｃは第三ブチルオキシカルボニルに対する標準的
略語であり、ペプチド合成において通常使用される保護
基である）。もちろん、他の保護基、例えばベンジルオ
キシカルボニル、トリフルオロアセチル、トリチルまた
はフェニル、によって保護されているヒドラジンも用い
ることができるが、Ｂｏｃが好ましい。この反応は脱水
剤、例えばジシクロへキシルカルボジイミド（Ｄ　ＣＣ
’）またはカルボニル−ビス−イミダゾールの存在にお
いて起こり得る。他の方法において、カルボキシル基を
アシルハリドまたは反応性エステルに転化し次いで保護
されているヒドラジン誘導体と反応させることができる
。次いで、保護基を、適当な試薬を用いて、Ｂｏｃの場
合には蟻酸またはトリフルオロ酢酸を用いて除去する。
他の態様に対して、同様に、セミカルバジドは、ω−メ
ルカプトカルボン酸をアシル活性化剤、例えばｐｃｘ、
またはスルホニルクロリド、と反応させて活性化カルボ
キシル基を得、次いでこの反応性カルボキシル基をアジ
化ナトリウムを用いて処理することによって得られる。
次いで、得られたアシルアジドを、当業者に公知の条件
下でクルチウス転位に付して対応するセミカルバジドを
得る。
次いで、本発明のこの化合物は、所望により、カルボニ
ル基を対応するチオカルボニルに転化するのに適当な試
薬、例えば最も好ましくはローソン（Ｌａｗｅｓｏｎ）
試薬、を用いて処理することによってチオアナローブに
転化することができる。これも反応図式ｌに示されてい
る。
得られた式２ａ　、２ｂまたは２ｃのリンカ−は機能性
を有しているが、その効用は接合された部分の間を規定
している短い距離によってやや減じられる。従って、式
１のスペーサーを含む、追加の、より複雑な態様もつく
られ、そしてそれらの態様は好ましいものである。
−・なスペーサ一 式１の化合物の典型的なスペーサー要素についての構造
かられかるように、スペーサーは、−ａに、酸素を含む
ことによっである程度の親水性を有し、そして１個また
はそれ以上の環を含むよりむしろ直鎖としてのその組成
によっである程度の柔軟性を有している。さらに、スペ
ーサーは必要とされる柔軟性を可能とするのに十分な長
さである。カルボニル反応性官能基がヒドラジンまたは
チオセミカルバジドであり、Ｘ基がポリペプチド型のＺ
を含んでいる態様について、これらの特性はＺの性質に
よって少なくとも部分的に与えられ得る。他の態様につ
いて、これらの特性は、存在する程度まで、スペーサー
によって与えられる。
２つの特に好ましい典型的スペーサーは、オキサアルキ
レンジアミンおよびヒドロキル化オキサアルキレンジア
ミンである。
、　オキサアルキレンとは、１個またはそれ以上のメチ
レン基が酸素によって置換されている飽和炭化水素直鎖
二価部分をいう。従って、典型的なオキサアルキレンは
、以下に説明されるものの他に、−ＣＨｔＣＨｚＯＣＨ
ｚＣＨｚＣ）１２−、−ＣＨｇＯＣ）ＩｚＯＣＨｚＯＣ
ｌｌｇ−９−ＣＱｇＯＣＨＩＣＨｚＣＨｚＯＣＨｔ−、
ＣＨｚＯｃＨＩＣ）＋　２０ＣＨｚｃＨｔＯｃＨｚ　−
および−ＣＨｚＯＣＨｇＣＨｚＣＨｚＯＣＨｚＣＨｚ−
を含んでいる。
１　スペーサーくジオキサアルキレンジアミン為゛９合
成が反応図式２に示されている、とりわけ好ましい態様
は、接合される２つの部分の間に追加の間隔を提供する
。
Ｌ−Ｓ−（ＣＨｚ）□Ｃ００Ｈ＋ｔｌｚＮ−（Ｃ４１ｇ
）、１ｇ−０−（ＣＨｚ）−ｚ−０−（ＣＨｔ）、Ｉｚ
−ＮＨＢ。
↓　ＩｗｔＣＯｌＣＨＣｌｉ Ｌ−Ｓ−（ＣＨｚ）、Ｃ０Ｎｔｌ　（ＣＨ２）ｎ２−０
−（ＣＨｔ）−ｚ−０−（ＣＨｚ）。−ＮＨＢｏｃ　Ｔ
ＦＡ Ｌ−５−（ＣＨｚ）１ＣＯＮＨ（ＣＨｚ）、１ｇ−０−
（ＣＨｚ）−ｚ−０−（ＣＨｔ）、ｔ−ＮＨｚ反応図式
　２ 反応図式２に示されるように、ω−ＬＳ含有カルボン酸
を、長鎖ジオキサアルカンの適当なモノ保護ジアミンと
反応させる。この実例的態様において、ジアミンは互に
他から分離されそして種々の長さの直鎖アルキル基によ
ってＮ末端アミノ基から分離された２個のエーテル結合
を含んでいる。
モノ保護はジアミンを適当なアミノ保護基、最も好まし
くは活性化されたＢｏｃと反応させることによって得ら
れ、そしてこのモノ保護されたジアミンをクロマトグラ
フィーによって単離する。
標準的脱水剤、例えば任意のカルボジイミド、Ｃ混合無
水物、またはカルボニル−ビス−イミダゾール、好まし
くはカルボニルニル−ビス−イミダゾールの存在におい
て実施される脱水反応の結果物は、保護された形のもの
である。この中間体は、図示のように、Ｂｏｃ保護基の
場合に、例えばトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を用いて保
護が解除される。
次いで、反応図式２の生成物を適当な試薬と反応させ、
以下に記載のようにカルボニル反応性官能性を与える。
本発明のこの態様を準備するために利用容易であるジオ
キサアルキレンジアミンは、例えば、４．９−ジオキサ
−１，１２−ドデカンジアミンを含んでいる。他の適当
なオキサアルキレンジアミンは、３〜２０のモノマ一単
位を含有するポリエチレングリコールポリマーから、下
記式で表わされるこれらの化合物： ＨＯ−（ＣＨ２ＣＩ＋２０）　１ＩＧＨｚｃＨｔＯＨ（
上式中、ｍは２〜１９である）を自体公知の方法によっ
て対応するジアミンに転化することによって調製される
。かかる方法のレビュウは、ハリス、ジエイ、エム、　
（ｌＩａｒｒｉｓ、Ｊ、Ｍ、）　、レグ。マクロモル、
ケム、フイズ（Ｒｅｖ　Ｍａｃｒｏｍｏｌ　Ｃｈｅｗ　
Ｐｈ３）（１９８５年）３２５〜３７３頁に見られる。
ジエポキシド１′憬　　れる冨、（ｂ）スペーサーがヒ
ドロキシル化されている式１の化合物に対する中間体で
あってエポキシドから誘導される中間体を得るための一
般的手順を反応図式３に示す。
反応図式　３ 分子のスペーサー含有部分はジオキサエポキシドに由来
している。典型的な商業的に入手可能なジオキサエポキ
シドは、１．４−ブタンジオールジグリシジルエーテル
およびエチレングリコールジグリシジルエーテルを含ん
でいる。
合成はアンモニアを用いた開環によって始まり対応する
ジアミンを得、次いでＢｏａ試薬を用いてモノ保護を行
なう。モノ保護されたジアミンは標準的クロマトグラフ
ィー法または他の便利な方法を用いてジ保護されたまた
は保護されていない不純物から分離される。次いで、得
られたスペーサー含有部分を、反応図式２の方法と同様
にして脱水剤の存在において誘導体にされたω−メルカ
プトカルボン酸と反応させて、ジスルフィド結合を形成
する能力を有する中間体を得る。カルボニル反応性部分
は以下に記載のようにして付加される。
カルボニル　・　　４　の・ 好ましいスペーサーおよび上述した類似のオキサアルキ
レンジアミンに対して、中間体化合物は下記一般式： ％式％（３） を有しており、所望の官能基は第一アミンとの反応によ
って付加される。
ヒドラジドまたはセミカルバジドの形成に対して、アミ
ド結合は式３の中間体と環状無水物、例えばグルタル酸
無水物、無水琥珀酸または無水グリコール酸との反応に
よって得られる。この反応順序を反応図式４に示す。
以下余白 Ｌ−５−（Ｃ１１□）、１．Ｃ０ＮＨ−スペーサー−Ｎ
ｌｌｚ　十〇Ｃ−Ｙ−Ｃ０Ｌ−Ｓ−（Ｃ１１□）、１．
Ｃ０ＮＨ−スペーサー−ＮＨＣＯ−Ｙ−Ｃｏｏ１反応図
式　４ ％式％ ［： 次いで、得られたカルボン酸を、保護されたヒドラジン
との反応によってヒドラジドに転化するか、または活性
化、アジドを得るためのアジドイオンとの反応、そして
セミカルバジドを得るためのクルチウス転位によってセ
ミカルバジドに転化する。セミカルバジドはローソンの
試薬を用いた反応によってチオセミカルバジドに転化す
ることができるが、この結果メルカプトカルボン酸とス
ペーサーとの間のアミド結合はチオアミドに変わる。従
って、チオセミカルバジドは以下に記載のようにして調
製するのが好ましい。
これに代えて、無水物をモノ保護されたヒドラジンと反
応させるかまたはアジドイオンと直接に反応させること
ができ、そして式３の化合物の存在において脱水剤を用
いて処理することによってＬ　　Ｓ　　（Ｃｌｈ）　、
Ｃ０ＮＨ−スペーサー−ＮＨ，との縮合を行なう。
Ｘのヒドラジンおよびチオセミカルバジド態様物は下記
の反応図式５に従って調製される。
以下余白 し−Ｓ−（ＣＨｚ）ア Ｌ−Ｓ−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−
反応図式　５ ％式％（ 反応図式５のブランチＡにおいて、式３の中間体Ｌ　　
Ｓ−（ＣＴｏ）１−ＣＯＮＨ−スペーサー−ＮＨｚを、
１９８３年９月１４日公開の欧州特許出願公開第０８８
６９５号明細書に記載のようにｐ−フルオロ−フェニル
ヒドラジンと直接に反応させてフェニルヒドラジン誘導
体を与える。ブランチＢにおいて、２で表わされた追加
配列は、式３の中間体とのアミド形成用類似試薬を得る
ために一般式Ｈ２Ｎ−Ｚ−ＣＯＯＨの化合物をｐ−フル
オロ−フェニルヒドラジンと反応させることによって導
入される。Ｚに対して好都合な選択は、一般にアミノ酸
を含んでいるが、より好ましくは、親水性および柔軟性
を含む、追加のスペーサー機能を捉供し得るポリペプチ
ドである。例えば、ポリ−し一セリンまたはポリーＬ−
グリシンを用いることができる。ポリペプチドはホモポ
リマーである必要はないが、アミノ酸残基は、水溶性が
維持され、そして多数の反応性中心が存在しないように
選ばれなければならない。
例えば、ポリ−Ｌ−グルタミン酸は実行可能な選択とは
なり得ない。
反応図式５のブランチＣにおいて、式３の中間体を下記
式の化合物と反応させる： ＨＯＯＣ−Ｚ　−ｔ４ＨｃｓＮＨＮＨＢｏｃこの化合物
は式ＨＯＯＣＺ　　ＮＨｚで表わされる化合物から数回
の工程で製造される。カルボン酸基は最初に、適当な容
易に除去可能なエステル化基、例えば９−フルオレンメ
チル（ＦＭ）　、を用いて保護される。次いで、この保
護された化合物を反応させて対応するチオシアネート（
−３ＣＮ）を得る。次いで、このチオシアネートを保護
されたヒドラジンと反応させてチオセミ力ルバジドヲ得
、続いてＦＭエステル化部分を除去する。
次いで、得られた式ｌの化合物を標準法を用いて精製し
、そしてこれをアルデヒドまたは反応性ケトンに転化さ
れるまたは転化され得る部分を含む化合物とスルフヒド
リルまたはスルフヒドリル反応性部分を含む化合物との
間を接合するリンカ−として用いる。
１ンカーとしての 式１の化合物およびω−スルフヒドリル力ルボン酸の誘
導体は、一方でカルボニル残基、通常はアルデヒド残基
、を含有しているかまたは含有するように転化され得る
化合物または蛋白質と、他方でジスルフィド連結形成可
能である化合物との間に接合を提供するのに有用である
。この接合は、リンカ−をカルボニルと反応させ、続い
て新たなジスルフィドまたはチオエーテルに転化するこ
とによって行なわれる。反応条件の詳細は使用される特
定の部分に依存しており当業者に理解されるところであ
る。
免疫グロブリンがアルデヒドの供給源である、とりわけ
好ましい態様について、糖蛋白質の予備酸化が必要であ
る。免疫グロブリンは、過沃素酸ナトリウムまたは他の
適当な酸化剤を用いて適当なｐＨ（過沃素酸塩に対して
、約６．５）において暗中で１時間処理される。この酸
化後、反応混合物をサイズ分離ゲル上で分離しそして、
水溶液（ｐＨ約５）中の本発明のリンカ−を用いて１〜
５時間、通常は約２時間処理する。脱塩後、反応の程度
を、３４３ｎｍにおける吸光度を測定することによる、
ＤＴＴを用いた還元後のピリジン−２−チオン放出の分
析によって測定する。形成されたヒドラゾン、セミカル
バゾンまたはチオセミカルバゾンは、適当な還元剤、例
えば、水素化硼素ナトリウム、または、好ましくは、ナ
トリウムシアノボロハイドライドを用いた還元によって
安定化させることができる。
次いで、誘導体化された免疫グロブリンを、スルフヒド
リル含有部分、例えば、リシン（ｒｉｃｉｎ）Ａ鎖また
は他の蛋白質含有遊離Ｓ！（基を用いて処理する（ｐＨ
約８）。誘導体化された免疫グロブリンおよびスルフヒ
ドリル含有部分を約１：２の比で用い、そして可溶化剤
、例えばプロピレングリコールを沈澱防止のために添加
する。次いで、接合体をイムノトキシンとして使用する
ために、適当なカラム、例えばサイズ分離ゲル上で精製
する。
■ 以下の例は本発明の説明のために与えるものであって本
発明を限定するためのものではない。
以下４白 り 表題化合物の合成は反応図式１，２および４に概説され
ている。出発材料３−（２−ピリジルジチオ）プロピオ
ン酸は３−メルカプトプロピオン酸とエタノール中２−
ピリジルジスルフィドとの反応によって製造し、そして
アルミナ上でのクロマトグラフィーおよびそれに続く水
からのおよびトルエンからの再結晶によって精製した。
他の出発材料であるモノ保護された４、９−ジオキサ−
１，１２−ドデカンジアミンはジアミンとメタノール中
２　　　（ｔｅｒｔ−ブチルオキシ−カルボニルオキシ
イミノ）−２−フヱニルアセトニトリル（Ｂｏｃ−ＯＮ
）　　（アルドリッチ（Ａｌｄｒｔｃｈ）　）との反応
によって製造し、そして抽出およびシリカゲル上での３
）１！！！用低圧クロマトグラフイーによって精製した
。
３−（２−ピリジルジチオ）プロピオン酸をクロロホル
ム中に溶解しそして１当量のカルボニルジイミダゾール
を添加した。約２０分後、二酸化炭素の発生が止んだ際
、１当量のモノ保護されたジアミンを添加した。反応を
ＴＬＣによって追った。反応は２時間以内に完了した。
この生成物をシリカゲル上でのクロマトグラフィーによ
って精製した。収率は７４％であった。Ｂｏｃ保護基を
、トリフルオロ酢酸（Ｔ　Ｆ　Ａ）を用いた室温で１時
間の処理によって除去し、ＴＦＡを真空下での蒸発によ
って除去した。
式３に対応する中間体化合物をアセトニドニル中に溶か
し、トリエチルアミンを添加して残存するＴＦＡを中和
した。グルタル酸無水物とメタノール中ｔ−プチルオル
バゼートとの反応によって調製されそしてクロロホルム
−トルエンから６０％収率で再結晶された、保護された
グルタル酸モノヒドラジドをジアミン含有中間体に対し
て当量で添加した。１当量の１−エチル−３−（３’−
ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド（Ｅ　Ｄ　
Ｃ’）を添加し、この混合物を一夜間室温で攪拌した。
溶剤を蒸発させ、その残留物を酢酸エチルと水との間で
分配した。酢酸エチル溶液を水性酸および水性塩基で洗
浄しそして蒸発させた。
保護型の式１化合物をシリカゲル上でのクロマトグラフ
ィー、によって精製して、この反応に対して２５％の収
率を得た。ＴＦＡを用いた室温で２時間の処理によって
保護Ｂｏｃ基を除去し、続いて真空下でＴＦＡを除去し
、そしてこの残留物をメタノール中に再溶解しそして再
蒸発させた。略称［アリス（ＡＩｉｃｅ）　Ｊの、わず
かに黄色の油状物である式１の生成物をデシケータ−中
に室温で貯蔵した。
胸腫瘍抗原と反応性であるモノクロナール抗体ＩｇＧ　
２８００１１　（Ｐ　Ｂ　Ｓ中３３．３ｍｇ／ｍＡ　、
　ｐＨ７）を使用した。酸化のために、この溶液２ｍｆ
に対して、新たに調製した４　０　ｎ＋Ｍ　Ｎａ０Ａｃ
中メタ過沃素酸ナトリウムの１００　ｍＭ溶液（ｐＨ５
，５）を２５倍過剰で暗中において室温で添加した。１
時間のインキュベーションの後、反応混合物を、０．０
１Ｍ燐酸ナトリウムおよび０．１５Ｍ　ＮａＣ１（ｐ１
１４．８５）中Ｂ１ｏ−Ｇｅ１Ｐ−６ＤＧ　（Ｂｉｏ−
Ｒａｄ）の１００　ｍｌカラムに通した。酸化されたＩ
ｇＧ　２８００１１の両分を、さらに濃縮することなし
に、合した。
例１において製造したリンカ−３０■を脱イオン水０．
６ｍＪ中に溶解し、これを１００倍過剰で酸化されたＩ
ｇＧ混合物に添加した。２時間のインキュベーションお
よび時折の渦巻き攪拌の後、この反応混合物を、０．１
Ｍ燐酸ナトリウムおよび０．０１Ｍ　ＥＤＴＡ（ｐＨ８
）中Ｐ６０Ｇの１００　ｍｌカラムに通した。
ＩｇＧの両分を合し、アリコートを、ＤＴＴを用いた還
元の後３４３　ｎｍの吸光度を測定することによってピ
リジン−２−スルフィド放出（Ｐ２Ｔ）について分析し
た。誘導体にされたＩｇＧ当りＰ２Ｔの比は２．８であ
った。
リジンＡ　（ＰＴＡ）への結合のため、誘導体にされた
抗体をセントリコン・アミコン・マイクロコンセントレ
ータ−（Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ　Ａｍ１ｃｏｎ　Ｍｉｃｒ
ｏｃｏ−ｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ）を用いて同じ緩衝液中
４．８ｒｎｇ／ｍｌまで濃縮した。５，５′−ジチオビ
ス（２−ニトロ安息香酸）　（ＤＴＮＢ）および４１２
　ｒ＋ｓ＋における吸光度を用いたＲＴＡ調製物の予備
分析はＲＴＡＩ分子当り０．７９ＳＨ部分を示した。４
．８■／　ｍ　ｌの濃縮されたＩｇＧ　９　ｍｆ　　（
４３，７ｗ）を５．５　ｍｇ／　ｍｌ　ＲＴＡ　１３ｍ
１　（７１，５■）に添加した。沈澱防止のためポリエ
チレングリコール（５％）を添加し、１．５時間後、こ
の混合物を同容積の緩衝液を用いて稀釈しプロピレング
リコールを２０％まで増やした。混合物中の免疫グロブ
リンおよびＲＴＡの最終濃度はそれぞれ０．８ｍｇ／ｍ
ｊ２および１．３ｍｇ／ｍｆであった。この接合混合物
を室温で３時間および冷蔵庫で一夜間保持した。６．５
％ポリアクリルアミド・ゲル上でのゲル電気泳動は接合
体の形成を示した。
この接合体は、未反応ＲＴＡを除去するための燐酸塩緩
衝塩水中セファクリルＳ−２００カラム上でのクロマト
グラフィーを行ない、および次いで５％〜３０％のプロ
ピレングリコールグラジェントを用いてフェニル−セフ
ァロースＣＬ−４Ｂ　（ファーマシア（Ｐｈａｒｍａｃ
ｉａ）　）上で接合体と未反応抗体との混合物をクロマ
トグラフィーすることによって精製した。遊離の抗体お
よび接合体は十分に分離した。いくつかの接合反応の結
果を第１表に示す。
以下余白 回収および収率（％）は第４４１ｊｌについてのみ示し
である。なぜならば、その場合に接合体が精製され、従
ってこれらの値の正確な測定が可能となったからである
。しかしながら、未精製材料の評価に基づき第１〜３欄
においても同様の結果が得られた。
ＩｇＧへのリンカ−の付加の１時間後に、ナトリウムシ
アノボロハイドライドを等モル量でリンカ−に添加し、
そしてこの混合物をさらに１時間インキュベーションし
たという相違点を除いては、ＩｇＧへのリンカ−の結合
手順は例２に記載の手順に従った。次いで、５，５′−
ジチオビス（２−二トロ安息香酸）（ＤＴＮＢ）を添加
し、ｐＨを７に調整し、そして反応を０．５時間続けた
。この混合物を０．１Ｍ燐酸塩および０．０ＩＭ　ＥＤ
ＴＡ（ｐＨ８）中バイオゲル（Ｂ　ｉｏｇｅ　１）　Ｐ
６ＤＧに適用しそして溶離を行なうことによって得られ
たＩｇＧ含有画分を合し、ＤＴＴによる還元の後４１２
　ｎｍにおける吸収を測定することによってＴＮＢ放出
についての分析を行なった。
次いで、ＩｇＧを接合されたリンカ−を用いて例２に記
載のようにＲＴＡを結合した。
■土 のリンカ−による−′　人 反応図式１の式２ａ　、２ｂまたは２ｃのヒドラジド、
またはティラー（Ｔａｙｌｏｒ）およびつ（Ｗｕ）の２
−アセトアミノ−４−チオ酪酸ヒドラジドを用いてリシ
ントキシンＡおよび免疫グロブリンによってつくられた
同様の接合体は前述の手順を用いて調製されたが、収率
は１％未満であった。

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １、下記式で表わされる化合物： Ｌ−Ｓ−（ＣＨ＿２）＿ｎ＿１−ＣＯＮＨ−スペーサー
    −ＮＨ−Ｘ〔上記式中、 Ｌは−Ｈまたは−Ｓ−Ａｒから選ばれる脱離基であり、
    ここでＡｒは必要により置換されているフェニルまたは
    ピリジルを表わす； ｎ＿１は２〜４であり； Ｘは水素、−ＣＯ−Ｙ−ＣＯＮＨＮＨ＿２、−ＣＯ−Ｙ
    −ＮＨ−ＣＯＮＨＮＨ＿２、および−ＣＯ−Ｚ−ＮＨ−
    ＣＳＮＨＮＨ＿２から選ばれ、ここでＹはアルキレンま
    たはオキサアルキレンであり、そしてＺはアルキレン、
    オキサアルキレン、またはポリペプチドのＮ末端アミノ
    基およびＣ末端カルボキシ基を架橋する該ポリペプチド
    の残基である； スペーサーは必要により存在し、存在する場合にはオキ
    サアルキレンまたはヒドロキシルによって置換されたオ
    キサアルキレンであり、そしてとりわけ ａ）−（ＣＨ＿２）ｎ２−Ｏ−（ＣＨ＿２）＿ｎ＿２−
    Ｏ−（ＣＨ＿２）＿ｎ＿２（式中、ｎ＿２は各々独立し
    て２〜４である）およびｂ）▲数式、化学式、表等があ
    ります▼ （式中、ｎ＿３は２〜６である）から選ばれる式を有す
    る残基を含んでいる〕。 ２、下記式： ＬＳ−（ＣＨ＿２）＿ｎ＿１ＣＯＮＨ−スペーサー−Ｎ
    Ｈ＿２〔上記式中、 Ｌは−Ｈまたは−Ｓ−Ａｒから選ばれる脱離基であり、
    ここでＡｒは必要により置換されているフェニルまたは
    ピリジルを表わす； ｎ＿１は２〜４であり； Ｘは水素、−ＣＯ−Ｙ−ＣＯＮＨＮＨ＿２、▲数式、化
    学式、表等があります▼、▲数式、化学式、表等があり
    ます▼、 −ＣＯ−Ｙ−ＮＨ−ＣＯＮＨＮＨ＿２、および−ＣＯ−
    Ｚ−ＮＨ−ＣＳＮＨＮＨ＿２から選ばれ、ここでＹはア
    ルキレンまたはオキサアルキレンであり、そしてＺはア
    ルキレン、オキサアルキレン、またはポリペプチドのＮ
    末端アミノ基およびＣ末端カルボキシ基を架橋する該ポ
    リペプチドの残基である； スペーサーは必要により存在し、存在する場合にはオキ
    サアルキレンまたはヒドロキシルによって置換されたオ
    キサアルキレンであり、そしてとりわけ ａ）−（ＣＨ＿２）＿ｎ＿２−Ｏ−（ＣＨ＿２）＿ｎ＿
    ２−Ｏ−（ＣＨ＿２）＿ｎ＿２−（式中、ｎ＿２は各々
    独立して２〜４である）およびｂ）▲数式、化学式、表
    等があります▼ （式中、ｎ＿３は２〜６である）から選ばれる式を有す
    る残基を含んでいる〕 によって表わされる、遊離アミン部分を有する架橋剤の
    製造方法であって、下記の工程： （ａ）式ＨＳ−（ＣＨ＿２）＿ｎ＿１−ＣＯＯＨ（式中
    、ｎ＿１は２〜４である）で表わされるω−メルカプト
    カルボン酸を用意する工程、 （ｂ）必要により、ω−メルカプトカルボン酸を、式Ｌ
    −Ｌで表わされる化合物〔式中、ＬはＨおよび−Ｓ−Ａ
    ｒからなる群より選ばれる脱離基（ここでＡｒは必要に
    より置換されているフェニルまたはピリジルである）で
    あるが、但し２個のＬ部分が双方とも水素であることは
    ない〕と反応させることによって、メルカプトアリール
    脱離基をω−メルカプトカルボン酸上に提供する工程、
    （ｃ）前記酸を脱水剤の存在下に式Ｈ＿２Ｎ−スペーサ
    ー−ＮＨＸ 〔式中、 （１）スペーサーは必要により存在し、存在する場合に
    はオキサアルキレンまたはヒドロキシルによって置換さ
    れたオキサアルキレンであり、そしてとりわけ −（ＣＨ＿２）＿ｎ＿２−Ｏ−（ＣＨ＿２）＿ｎ＿２−
    Ｏ−（ＣＨ＿２）＿ｎ＿２−（式中、ｎ＿２は各々独立
    して２〜４である）および ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、ｎ＿３は２〜６である）から選ばれる式を有す
    る残基を含んでおり、そして （２）Ｘは第三ブチルオキシカルボニル、ベンジルオキ
    シカルボニル、トリフルオロアセチル、トリチルおよび
    フェニルからなる群より選ばれる保護基である〕で表わ
    される化合物と反応させて、下記式： ＬＳ−（ＣＨ＿２）＿ｎ＿１−ＣＯＮＨ−スペーサー−
    ＮＨＸで表わされる保護された化合物を与える工程、お
    よび （ｄ）前記保護された化合物を、蟻酸およびトリフルオ
    ロ酢酸からなる群より選ばれる保護解除剤と反応させる
    工程 を含んでなる製造方法。
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