JPS60197645A - 検出可能な分子を構成する修飾剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 により置換することができ、ＹはＥに対する直接結合で
あるか、またはＹはＥ　−Ｒ２であり、ここでＲはＣ，
−Ｃ，。の分枝鎖もしくは分枝鎖のないアルキルであり
、Ｚｏは塩素、臭素もしくは沃素であり、ＥはＯ，ＮＨ
または非環式の二価硫黄原子であり、Ｄｅ　ｔｂは好ま
しくはビオチンまたは式： の金属キレート化剤からなる検出しうる化学成分である
か、またはその４−ヒドロキシもしくはアシルオキシ誘
導体であり、ＲハＣ，−ｃ４アルキルもしくはＣＨ２Ｃ
００Ｍであり、ここでＭは同一でも異なってもよく水素
、金属もしくは非金属陽イオンよりなる群から選択され
、或いはＣ，−Ｃ，ｏのアルキル、アリールもしくはア
ラルキルであり、ｍはｌ乃至Ａ　における改変反応基の
全開数の範囲の整数である。この検出可能な分子は、試
験管内または生体内での分析もしくは治療に有用である
。

〔発明の属する技術分野〕

本発明は、金属錯化剤またはビオチン含有の検出しうる
基を有する分子の製造および使用方法、並びに化合物自
身に関するものである。

〔従来技術とその問題点〕

薬剤を金属イオンで標識することにより得られる放射能
標識した診断用および治療用薬剤を使用することは、近
年、新たな興味を集めている。この技術においては、キ
レート化成分を問題とする分子に共有結合させ、放射性
イオンをキレート化剤の金属封鎖基によりキレート化す
る。かくして、放射能標識した薬剤を試験管内（たとえ
ば、放射線免疫分析方式）および生体内（たとえば、診
断影像技術および放射線治療技術）の両者に使用するこ
とができる。非放射性型の金属標識を使用することも、
たとえば核磁気共鳴、電子スピン共鳴、触媒技術などを
利用する際に興味がある。

種々異なる金属キレート化基が、従来ビオポリマーに結
合されている。１−（Ｐ−ベンゼンジアゾニウム）ＥＤ
ＴＡ　（１）から得られるエチレンジアミンテトラ酢酸
（ＥＤＴＡ）の活性同族体が、蛋白質に対し使用されて
いる＝４．０４３，９９８号；サンドベルク等、ジャー
ナル・オブ・メジカル・ケミストリー、第１７巻、第１
３０４−１３０７頁（１９７４）　；またはサンドベル
ク等、ネイチャー、第２５０巻、第５８７−５８８頁（
１９４７）　）式１（７）Ｐ−ベンゼンジアゾニウムＥ
　Ｄ　Ｔ　Ａ　ハ、アゾ結合を介して選択チロシン、ヒ
スチジンもしくは蛋白質のアミン残部へ結合され、これ
らは酸性に弱いトリアジンを生成する。

ジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＤＴＰＡ）は金属キ
レート化剤であって、これもポリペプチドに結合されて
いる〔たとえば、クレジュヵレク等、バイオケミカル・
バイオフィジカル・リサーチ・コミューニヶーション、
第７７巻、第５８２−５８５頁（１９７７）　ｉヒナト
ビソチ、サイエンス、第２２０＠、第６１３−６１５頁
（１９８３）　；またはカラ、同上、第２０９巻、第２
９５−２９７頁（１９８０）　）。

キレート化剤は、そのカルボキシル基の１つによりアミ
ド結合を介して蛋白質由来のアミノ基に結合され、これ
を下記式■に示す： ”−Ｑ＋ 一〇【 このＤＴＰＡ結合体は、先ず二無水物を作成し、次いで
これを蛋白質と反応させることにょ約および構造もしく
は架橋における変化のような上記問題を克服しうる手段
が、本出願人による１９８２年６月２３日付は出願のエ
ンゲル／”％ルト等に係る「改変ヌクレオチド、その製
造および使用方法、並びにそれを含有する組成物」と題
する米国特許出願第３９１　、４４０号明細書に開示さ
れ、これを参考のためここに引用する。エンゲルノ＼ル
ト等の特許出願は、アリルアミン改変したデオキシＵＴ
Ｐに対するＤＣＴＡのチオシアン酸誘導体の結合、およ
びポリヌクレオチドに対する組み込みを開示している。

下記式■を参照。

（ＩＶ） デオキシＵＴＰアリルアミンの使用、およびたとえばビ
オチンのような他の検出しうる基に対するその結合も開
示されており〔たとえば、′ランガー等、プロシーディ
ング・ナショナル・アカデミ−・サイエンス、第７８巻
、第６６３３−６６３７頁（１９８１）または１９８１
年４月１７日付は出願のワード等に係る「改変ヌクレオ
チド並びにその製造および使用方法」と題する米国特許
出願第２５５，２２３号〕、これを参考のためここに引
用する。

ヌクレオチド自身を大して改変する必要なくＤＣＴＡキ
レート化剤またはその他のキレート化剤を使用し、生理
学的な化学工程条件を利用し、かつポリペプチド、ポリ
ヌクレオチド、多糖類および小分子化学に利用しうる広
範囲の代替法を提供すれば有利である。

この種の方法の開発は、高親和性の有能な金属キレート
化剤、たとえばＤＣＴＡの使用を可能にすると共に、他
のキレート化剤またはたとえばビオチンのような検出し
うる成分の結合に拡大適用することもできるであろう。

〔発明の目的〕

したがって、本発明は、従来の上記問題点を解決しかつ
広範囲に使用しうる検出可能な分子を提供することであ
る。

〔発明の要点〕

１部として、本発明は重合体、特にたとえばポリヌクレ
オチド、ポリペプチドもしくは多糖類のようなビオポリ
マーに対する金属キレート化基およびビオチンの迅速、
緩和かつ有能な結合法を見い出したことに基づいている
。結合法は公知の中間結合剤（しかしながら、これは、
この目的には従来使用されていなかった）の使用を含み
、或いは成る場合には新規な結合もしくは架橋基の開発
を含んでいる。さらに本発明はこれら方法により得られ
る生成物をも提供し、キレート化剤に結合された重合体
とその同族体との両者からなる生成物、ビオチンおよび
その同族体、並びに各種の中間体まで拡張される。

さらに本発明は、たとえば各種のキレート化剤のような
種々の検出しうる薬剤およびビオチン成分に結合した成
る種の低分子量（約２０００未満の分子量）を有する分
子を提供する。低分子量化合物は、直接結合により、ま
たは任意公知の結合手によりキレート化分子またはキレ
ート化能力を有する分子に結合することができる。

低分子量化合物とキレート化分子との間の低分子量結合
体は、したがって式（Ｖ）を有する：有する低分子量化
合物であり、Ｄｅｔｏはビオチンまたは検出しうる化学
成分であって、置換もしくは未置換の金属キレート化剤
または金属キレート化合物を生成しうる化合物であり、
特に好ましくは式（■）： 〔式中、ＭおよびＲは下記する通りであり、かつ結合「
・・・」は直接共有結合、またはＤｅｔの信号能力を妨
げずかつＡ　の分子識別特性を備え、さらにＡ　とｎｅ
ｔとの間の安定な結合体をｌｉｉ：保するような適当な
結合手を示す〕の１種である。

好適具体例において、本発明の他の面は式の検出可能な
分子からなり、式中Ａ　はＡ　まま たは重合体であり、Ａ　および重合体の両者はアミン、
ヒドロキシ、　ｃｉｓ−１＋２−ジＯＨ，ハロゲン、ア
リール、イミダゾイル、カルボニル。

カルボキシ、チオールまたは活性炭素を含む残基よりな
る群から選択される少なくとも１個の改変しうる反応基
を有し、 Ａ　は約２０００未満の分子量を有する化学実体であり
、 Ｘは −ＮＨ−Ｃｏ−，−ＮＨ−ＣＮＨ−、−Ｎ、Ｎ−、−Ｎ
Ｈ−５ｏ２−。

−０５０２−、−ＮＨ−Ｎ−Ｎ−、−ＮＨ−ＣＨ２−、
−ＣＨ２−ＮＨ−。

−０−Ｇｏ−、−ＮＨ−Ｃｏ−ＣＨ２−５−、−ＮＨ−
Ｃｏ−ＣＨ２−ＮＨ−。

−０−Ｃｏ−ＣＨ２−・−５−ＣＨ２−・−〇−ＣＯ−
ＮＨ−よりなる群から選択され、 Ｒば であるか、またはＯＨにより置換しうるＣ７−Ｃ１ｏの
分枝鎖もしくは分枝鎖のないアルキルもしくはアラルキ
ルであり、 ＹはＳに対する直接結合であるか、またはＹはＳ−Ｒ（
ここでＲはｃ、−ｃ、。の分枝鎮もしくは分枝鎖のない
アルキルである）であり、Ｚａ　は塩素、臭素もしくは
沃素であり、ＥはＯ，Ｎまたは非環式の二価硫黄原子で
あり、 Ｉ）ｅｔｂはビオチンまたは置換もしくは未置換の金属
キレート化剤または金属キレート化合物を生成しうる化
合物からなる検出しうる化学成分〔式中、ＲはＣ，−Ｃ
４アルキルであるか、またはＣＨ２−Ｃ００Ｍであり、
各Ｍは適当な陽イオンである〕 の化合物であり、 ｍは１乃至Ａ　における改変反応基の全個数の範囲の整
数である。

さらに本発明の他の面は、式： 〔式中、Ａ　は上記の意味を有し、ｊは電子吸引基であ
り、Ｋは信号発生特性を有するか、または固体マトリッ
クスであり、ｒは１〜約２の整数であり、ｎは上記の意
味を有する〕の１食出可能な分子を提供する。

本発明の他の具体例によれば、上記の基Ｘ−Ｒ−Ｅ−Ｄ
ｅｔにより改変された個々のヌクレオチド、糖類または
アミノ酸を提供する。

さらに本発明の他の面は、上記生成物の合成法、並びに
一般的使用法を提供する。

ビオポリマーもしくは小分子と金属キレート化剤もしく
はビオチン成分との間に得られる共有結合体は、広範囲
の用途に使用することができる。たとえば、これら生成
物は、これに放射性金属をキレート化させることにより
検出可能な化合物として使用することができる。さらに
、これらは広範囲の生体内および試験管内の治療。

診断、影像および分析（免疫分析またはハイブリッド化
分析）技術に使用することができる。

ビオチン標識したビオポリマーまたは小分子は、ビオチ
ン／アビジンまたはビオチン／ストレプトアビジンに基
づく検出方式が従来技術で使用されている所にはどこで
も検出可能な分子として使用することができる。本発明
の合成重合体は、この合成重合体をビオポリマーまたは
小分子へ結合させることにより、ビオポリマーまたは小
分子と同じ用途に使用することができる。

たとえば、この種の合成重合体は、ビオポリマーまたは
小分子１個当り多くの放射性金属を与えて、極めて強力
な信号を発生させることができる。

ＤＣＴＡに基づくキレート化剤を使用する際の導入の容
易さ、生理学的工程条件、有能性およびその他の利点に
より、特に高親和性を有し、構造を損うことな（、かつ
導入の際に架橋を防止するキレート化剤を提供すること
ができる。

さらに、この方法は、少なくとも下記する成る種の結合
法により、従来技術よりも多量の標識剤を１分子当りに
導入する能力を有する。゛〔好適具体例の説明〕 生成物 小分子量Ａ　は、測定に際し免疫分析法に一般に関与す
るいわゆるリガンドをも包含することを意味する。これ
らは治療目的に使用される薬剤、天然に生ずる生理学的
化合物１代謝物１殺虫剤、汚染物質、酵素基質、酵素と
その基質との反応生成物などを包含する（有用なＡ２　
としては、たとえばラウリー等に係る米国特許第４．２
２０．７２２号公報の第１２．１３．１４および１５欄
を参照することができ、これを参考のためここに引用す
る）。たとえば、Ａ　にはアルカロイド、ステロイド、
ラクタム、アミノアルキルベンゼン、ペンズヘテロシク
リック、プリン、ビタミン、プロスタグランジン、抗生
物質。

アミノ酸、殺虫剤などが包含される。Ａ２　の分子量は
約２０００未満、特に約１０００未満である。

他方、低分子量化合物Ａ　にはＡ　につき上記した全て
の化合物が包含され、ただしＡ　は単糖類またはモノヌ
クレオチドでない。好ましくは、Ａ　はアミノ酸でもな
い。したがって、一般にＡ　は殺虫剤、薬剤、汚染物質
、他の生理学的化合物などの化合物を包含する。たとえ
ば、Ａ　はアルカロイド、ステロイド、ラクタム、アミ
ノアルキルベンゼン、ペンズヘテロシクリック、プロス
タグランジン、抗生物質などを包含する。

本発明の範囲内にある成る種の他の化合物は、たとえば
ポリヌクレオチド、ポリペプチドもしくは多ｔｉｍまた
はこれらを含有する大型フラクションのような合成重合
体およびビオポリマーを包含する検出可能な重合体であ
る。

「ポリヌクレオチド」という用語は、ポリリボヌクレオ
チド、ポリデオキシリボヌクレオチド並びに全ゆるポリ
プリン、ポリピリミジン若しくはその同族体およびその
混合物を包含することを意味する。例としてはＤＮＡ、
ＲＮＡおよびその断片がある。

「ポリペプチド」という用語は、分子量が大きくても小
さくても、全てのポリアミノ酸連鎖を包含することを意
味する。これらは蛋白質。

ホルモン、酵素、免疫グロブリン、たとえばモノクロー
ナル抗体、蛋白質錯体などを包含する。

「多糖類」という用語は、天然もしくは非天然の線状も
しくは非線状、或いは架橋された水溶性もしくは不溶性
の未置換または部分的にもしくは完全に置換された全ゆ
る多糖類を包含することを意味する。これらはセルロー
ス、澱粉。

アミロース、アミロベプチンなどを包含する。

「合成」重合体という用語は、アミノ、ヒドロキシ、１
＋２−ｃｉｓ−ジＯＨ，ハロゲン、アリール、イミダゾ
イル、カルボニル、カルボキシ。

チオールまたは活性炭素を含む残基よりなる群から選択
される少なくとも１個の改変しうる反応基を有する全て
の合成重合体を包含することを意味する。この種の改変
しうる反応基を有するよう改変しうる適当な重合体の例
は、限定はしないがポリエチレン、ポリアクリルアミド
。

ポリウレタン、ポリスチレン、ポリエチレングリコール
、ポリブタジェン、ポリビニルアルコールおよびそのハ
ロゲン化物および共重合体を包含する。重合体が改変し
うる反応基を含有しなければ、この種の反応基を有機化
学の分野における当業者に周知された任意の方法で重合
体へ結合させることもできる。

反応前のＡ３（これはＡ２（上記）または重合体であっ
てもよい）は少なくとも１個乃至数個までの改変しうる
反応基を有する必要があり、この反応基はアミノ基（た
とえばリジンのアミノ基、蛋白質中のアミノ基、アミノ
多糖類におけるアミノ基またはヌクレオチド塩基におけ
る反応性アミノ基）、ヒドロキシ基もしくはｃｉｓ−Ｏ
Ｈ基（たとえばステロイド、糖類、セリン、またはポリ
ヌクレオチドの糖成分に存在するもの、たとえば末端３
′　もしくは５′　ヒドロキシ）、カルボキシル基（た
とえばアスパラギン酸、グルタミン酸またはその誘導体
）、チホル基（たとえばシスティン）、カルボニル基（
たとえば成る種のステロイド、アルカロイド。

天然蛋白質の末端部分に存在するもの、或いは下記する
ように改変により得られるもの）、および活性炭素基を
含む残基（たとえばチロシン残基におけるＣ−３もしく
はＣ−５炭素部位。

ヒスチジン残基におけるＣ−４部位、グアニン。

イノシン、シチジンもしくはその同族体における反応性
炭素部位（たとえばグアニンは位置Ｃ−８に反応性炭素
原子を有する））よりなる群から選択される。さらにＡ
　は、ヒスチジン残基の１部としてのたとえば蛋白質中
のイミダゾイル基またはチロシン残基の１部としてのア
リール基または合成重合体の１部としてのハロゲンのよ
うな改変しうる反応基を有することもできる。Ａ３　に
おけるこれら分子もしくは分子部分の反応性炭素原子は
、たとえばジアゾアリール機能のような電子親和性物質
と共有反応して結合しうるちのでなければならない（た
とえば、ジアゾ結合反応）。

Ａ３　における改変しうる反応基は、さらにＡ３を改変
して或いはそこにこの種の基を導入して存在させること
もできる。さらに、たとえばポリペプチドに対し共有的
にまたは非共有的に結合させうる酵素の補助因子に存在
させることもできる。

Ａ３　における改変しうる反応基の個数は、Ａにおける
この種の基の存在もしくは不存在、或いはそれぞれポリ
ペプチド、ポリヌクレオチドもしくは多糖類における成
る種の反応性アミノ酸、塩基もしくは糖類に依存する。

ビオポリマーの場合、これはビオポリマーの実際の化学
組成、その分子量、並びにビオポリマーの三次元構造、
したがって到達しうる反応基の相対的能力、および反応
相手に対する共有結合作用に依存する。たとえば、蛋白
質には、成る種の活性領域に存在する表面などに対し、
より接近することができれば、他のものよりも反応性の
大きい成る種の残基が存在することも知られている。

ビオポリマーを本発明にしたがって過剰の改変剤により
改変させる場合、上記の因子が改変の程度を決定する。

したがって、１個、数個或いはできれば全ての反応性残
基、塩基または糖成分は適当な反応相手と反応すること
ができる。

或いは、たとえば個々のアミノ酸または個々のヌクレオ
チドもしくは糖類のようなビオポリマーの個々の単位は
上記のように改変され、次いで最終的にビオポリマー中
へ組み込むことができるであろう。

いずれにせよ、所定のＡ　またはビオポリマ−に反応基
が存在するかどうか、およびＡ　もしくはビオポリマー
と改変基との間の結合体の最終的化学量論を決定するた
めにどの程度の残基が反応したかを推定するのは当業者
の日常の仕事である。放射能標識のような技術を使用し
て、改変の程度を推定し、かつ改変反応基の個数を実際
に針数することができる。大抵の場合、実際に改変され
た基の個数は、任意特定の化学物質における使用可能な
改変しうる基の個数よりも少ない。

ポリペプチドもしくは多糖類からなるビオポリマーであ
る〕 を有するものである。

Ｘは一般にＡ３　改変性反応基の１個と基Ｒ１との間の
共有結合機能を備える。Ｘはたとえばアミドもしくはエ
ステルのような単一機能であっても、或いはＡ　におけ
る改変しうる反応基とＲ１基との間の架橋結合であって
もよい。たとえばＸがＮＨ−Ｇｏである場合、そのＮ　
Ｈ部分は一般にＡ　またはビオポリマーのアミン機能か
ら生じ、Ｘは標準的アミド基である。ＸがＮ＝Ｎ　（ア
ゾ結合）である場合、この結合は一般に活性炭素を含有
するＡ　もしくはビオポリマーの改変しうる基に結合さ
れる。

Ｒ１は未置換のフェニルまたはたとえば塩素もしくは臭
素のようなハロゲンにより置換されたフェニルとするこ
とができる。Ｒはさらに基Ｙにより置換されたフェニル
であってもよく、ここでＹはＳに対する直接共有結合ま
たはＳ−Ｒとすることができる。Ｒは二価のＣ７−Ｃ７
゜の分枝鎖もしくは分枝鎖のないアルキル。

好ましくは低級アルキル（Ｃ，−Ｃ６）　、特に好まし
くはメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ｎ−ブ
チル、イソブチルもしくはペンチルとすることができる
。

さらにＲは二価のＣ１−Ｃ７ｏの分枝鎖もしくは分枝鎖
のない上記Ｒ２につき記載したようなアルキル、好まし
くは低級アルキル（Ｃ，−０６）、特に好ましくはＣ２
−Ｃ４とすることができる。Ｒはさらにたとえば低級ア
ルキルにより置換されたフェニルのようなＣ７−Ｃ１゜
アラルキル、特にベンジルとすることもできる。

ｎｅｔは検出しうる化学成分であって、ビオチンまたは
改変ビオチン分子からなり、或いは金属キレート化合物
または金属キレート化合物を生成しうる化合物であるｎ
ｅｔ’からなっている。

これら化合物のうち好適なものは、たとえばＥＤＴＡ、
ＤＴＰＡもしくはＤＣＴＡまたはその同族体のような分
子である。特に好適なものこの式はシクロヘキサンに基
づく金属キレート化剤を示し、これは位置４もしくは５
を介して硫黄原子Ｓに結合することができ、かつ１〜４
個の金属もしくは非金属陽イオン、−価の陽イオンまた
はアルカリ土類金属を有する。たとえば、酸化状態＋１
を有する金属の場合、それぞれ個々のシクロヘキサンに
基づく分子は４個までの金属陽イオンを有することがで
きる（Ｒ３基の両−者はＣＨ２Ｃ００Ｍである）。しば
しば、より高い酸化状態の場合、金属の個数はシクロヘ
キサン骨格１個当り２個または１個にまで減少する。シ
クロヘキサン官能価は種々の立体化学を可能にし、かつ
上記の式は任意特定の立体化学に分子を限定する目的で
はない。特に、両アミノ基は互いにｃｉｓもしくはｔｒ
ａｎｓのいずれであってもよい。

シクロヘキサンは未置換（２個の窒素官能基と硫黄置換
基とを除く）であってもよく、或いは特に４位置にヒド
ロキシまたは、たとえば低級アシル置換のようなアシル
化ヒドロキシ基で置換されていてもよい。

本発明の目的で、その他のシクロヘキサンに基づく同族
体、たとえばアルキル誘導体（たとえば低級アルキル）
または置換生成物（ここで誘導体または置換体は硫黄に
対するシクロヘキサン骨格の結合、個々のキレート化成
分のキレート化能力（親和性、構造など）または改変Ａ
３の全体的生物学活性を妨げない）も上記に示したもの
と同等である。本発明の目的で同等な置換基はたとえば
ヒドロキシ、アシル、ハロゲン。

アミノなどである。

結合されたシクロヘキサン成分を有するＡ部分は酸型（
Ｍ＝Ｈ）または非放射性の金属もしくは非金属型（たと
えばＭ＝Ｍｇ”　、Ｎａ”　。

Ｋ”　、Ｌ　ｉ”　、ＮＨ：　など）または放射性金属
型とすることができる。

生体内または試験管内の診断法で検出しうる、或いは生
体内または試験管内で治療作用を行ないうる任意の金属
を使用することができる。非放射性金属および放射性金
属の両者をこの目的で使用することができる。たとえば
、化学反応を触媒しうる金属、ＮＭＲもしくはＥＳＲス
ペクトルを行ないうる金属、または種々の種類もしくは
強度の照射線を放出しうる金属も使用することができる
。特にヒトもしくは動物体内における治療もしくは診断
効果を与えうる、或いは試験管内の診断分析を可能にす
る任意の放射性金属を、本発明の実施に使用することが
できる。適するイオンは次のものを包含する：アンチモ
ンー１２４．７ンチモンー１２５．砒素−７４、バリウ
ム−１０３，バリウム−１０４゜べＩＪ　ＩＪウムー７
．ビスマス−２０６，ビスマス−２０７，カドミウム−
１０９，カドミウム−１１５ｍ、カルシウム−４５，セ
リウム−＝１３９゜セリウム−１４１，セリウム−１４
４，セシウム−１３７，クロム−５１，コバルト−５６
゜コバルト−５７，コバルト−５８，コバルト−６０、
エルビウム−１６９，ヨーロピウム−１５２、ガドリニ
ウム−１５３，金−１９５゜金−１９９，ハフニウム−
１７５，ハフニウム−１７５＋１８１．イ、ンジウムー
１１１．イリジウム−１９２，鉄−５５，鉄−５９，ク
リプトン−８５，鉛−２１０，マンガン−５４，水銀−
１９７，水銀−２０３，モリブデン−９９゜ネオジミウ
ム−１４７，ネプチニウムー２３７゜ニッケルー６３．
ミオブー９５．オスミウム−１８５＋１９１．パラジウ
ム−１０３，白金−１９５ｍ、プラセオジニウムー１４
３．プロメチウム−１４７，ブロククチニウム−２３３
゜ラジウム−２２６，レニウム−１８６，ルビジウム−
８６，ルテニウム−１０３，ルテニウム−１０６，スカ
ンジウム−４４，スカンジウム−４６，セレニウム−７
５，銀−１１０ｍ、銀−１１１，ナトリウム−２２，ス
トロンチウム−８５，ストロンチウム−８９，ストロン
チウム−９０，硫黄−３５，タンクルー１８２．テクネ
チウム−９９ｍ、テルル−１２５，テルル−１３２，ツ
ルビウム〜１６０．タリウム−２０４、トリウム−２２
８，）リウムー２３２゜タリウム−１７０，絹〜１１３
．チタン−４４゜タングステン−１８５，バナジウム−
４８，バナジウム−４９，イッテルビウム−１６９，イ
ツトリウム−８８，イツトリウム−９０，イツトリウム
−９１，亜鉛−６５およびジルコン−９５゜ 上記式（■）の範囲内の好適な種類は次のものである： Ｃ１−０１ｏの分枝鎖もしくは分枝鎖のないアルキルと
結合したＮＨ−Ｃｏ　１ Ｎ＝Ｎ−アリール（ここで了り−ルは式（■）で定義し
たと同様である）と結合したチロシン。

ヒスチジンまたはグアニジン、イノシンもしくはシチジ
ンにおける活性炭素； Ｃ，−Ｃ，。の分枝鎖もしくは分枝鎖のないアルキル、
或いはアリール（ここでアリールは式（■）に定義した
と同様である）と結合したに示す： 第１表 ２ Ａ　もしくはＡ　低分子量体の特定例はジゴキシン、モ
ルフイン、コディン、ヘロイン、ジテルペンアルカロイ
ド、エストロゲン、ＤＢＳ。

バルビッール、アンフェタミン、カテコールアミン、ク
ロルプロマジン、アゼピン、ジアゼピン、カフェイン、
テオフィリン、カナピノール。

Ｔ　ＨＣ、ペニシリン、エタムプゾール、クロロマイセ
チン、ニトロフラントイン、メタトン。

セロトニン、抗ヒスタミン、ポリハロゲン化ビフェニル
、燐酸エステル、チオ燐酸エステル。

カルバミン酸エステル、並びにその代謝物、誘導体およ
び同族体である。

本発明の他の好適な生成物は、式（■）；４　２　２ 〔式中、Ａ　はＡ　または重合体であり、Ａと重合体と
の両者はアミノ、アリール、イミダゾールおよび活性炭
素を含む残基よりなる鮮から選択される少なくとも１個
の改変しうる反応基を有し、Ａ　は約２０００未満の分
子量を有する化学実体であり、ｊは電子吸引基であり、
Ｋは信号発生特性を有するか、または固体マトリックス
であり、ｎは１〜約２、好ましくは２の整数゛であり、
かつｍは上記の通りである〕を有するものである。

ｊは主として電子吸引基とすることができる。

好ましくは、ｊは塩素、弗素、臭素、スルホン基および
沃素よりなる群から選択され、塩素が特に好適である。

Ｋは主として従来技術で使用された信号発生特性ををす
るものを包含し、将来開発される全てのものを包含する
。これは信号自体（たとえば放射能標識を発生しうる成
分、または後の反応操作に際し信号を発生する成分、た
とえば酵素結合した系とすることができる。限定はしな
いが、適する信号発生するものの例は、本出願人により
１９８２年６月２３日付けで出願された米国特許出願箱
３９１，４４０号明細書に開示されている。

Ｋは従来公知の任意の方法でベンゼン環に結合させるこ
とができる。さらにＫは、たとえばセルロースのような
固体マトリックスであってもよい。ジアゾニウム化合物
を、シードに係る米国特許第４，２８６，９６４号公報
に開示された方法でセルロースへ固定することができる
。

式（ＩＸ）の好適化合物は次の通りである：式（ＩＸ）
の化合物は驚く程安定であり、かつ強力な電子親和性の
ものである。このような安定性および強力な電子親和性
は、式（ＩＸ）の化合物を、改変性反応基が極めて不活
性である、たとえばグアニンのＣ−８位置における反応
性炭素のような場合に、Ａ　に式（ＩＸ）の化合物を結
合させることができる。このような安定性および強力な
電子親和性は、ベンゼン環における電子吸引基に基づく
ものと思われる。

本発明の範囲内にある他の化合物は、個々に改変された
モノヌクレオチド（リポ−およびデオキシリボー）であ
って、式（Ｘ）： 〔式中、Ｐ２は Ｑ　はＩ−１またはＯＨであり、 ＋３Ａはたとえばグアニン、イノシンまたはシチジンの
ような改変しうるプリンもしくはピリミジン塩基である
〕 を有する。

これら化合物のうち好適なものは、ＢＡが式％式％）： 本発明の他の好適化合物は下記するような種々の中間体
である。

方法 好適なシクロヘキサンに基づく骨格に関与する反応はＤ
ＣＴＡまたはその同族体、置換誘導体につき行なうこと
力ｊでき、これら化合物は次の方法のいずれかにしたが
って製造される一方法Ｉ：　ブロム−ＤＣＴＡの製造 ［１−４］ 方法Ｉば、３，４−ジニトロ−フェノール（■−１）か
ら３，４−ジアミノシクロヘキサン（Ｉ−２）への還元
、３．４−ジアミノシクロヘキサンから３．４−ジアミ
ノブロムシクロヘキサン（１−３）への臭素化、および
この化合物とハロゲン置換されたカルボキシルメチル化
合物との反応によるそのテトラカルボキシルメチル誘導
体の生成を示しており、これにより標記化合物（１−４
）を与える。これら反応の詳細は、エンゲルハルト等に
係る１９８２年６月２３日付は出願の米国特許出願第３
９１　、４４０号明細書に見ることができる。

（ＩＩ−７３ セン−１，２−ジカルボン酸無水物（ＩＩ−１）の使用
を示している。アルコールおよび次いでヒドラジンとの
反応はジヒドラジド（Ｉｆ−３）を生成し、これは硝酸
塩と反応させかつ加熱するとジウレタン（ＩＩ　−５）
まで再配列する。ジウレタンを塩基で処理するとジアミ
ン（Ｉｆ−６）が得られ、これは次いでカルボキシアル
キル化して１，２−ジアミノ−４−シクロヘキセンテト
ラ酢酸（ＩＩ−７）を生成することができる。

たとえば、この化合物を次いでＮ−ブロムスクシンイミ
ド（ＮＢＳ）で処理して４−ブロム−５−ヒドロキシＤ
ＣＴＡ誘導体（ＩＩ　−８）を生成させることができる
。これら反応の詳細は後記実施例に見ることができる。

（ジアルキルジ酢酸）誘導体の製造 方法■は、１．４−シクロへキサジエン（Ｉ（［−１）
を使用してジブロム誘導体（１−２）を生成させ、これ
を次いでＮ−アルキル置換したグリシンと反応させて標
記化合物（ＩＩＩ−３）を生成させる過程を示している
。

上記方法１．　ＩＩまたは■において、勿論、他のハロ
ゲン或いはハロゲン類似物も使用しうろことが理解され
る。何故なら、目的はシクロヘキサンをメルカプト基Ｓ
　Ｈにより置換されうる遊離基でシクロヘキサンを置換
することにあるからである。この種の遊離基は塩素、臭
素、シアノ、トシル、メシルなどの基とすることができ
る。

これら方法に使用する中間体または出発物質（たとえば
、ジエステルシクロヘキセン（Ｉｌ−２）を、さらに置
換されたシクロヘキサン骨格の製造に使用することがで
き、これは有機化学の当業者により容易に了解されるで
あろう。たとえば、各種の改変基または置換基を、キレ
ート化基または置換しうる遊離基の基礎的化学特性に影
響を与えることなく、シクロヘキサン骨格中へ導入する
ことができる。

Ａ３　に対する置換もしくは未置換のシクロヘキサン骨
格の結合は酸素、窒素または好ましくはジオール含有化
合物の硫黄原子と、シクロヘキサンにおける置換しうる
基との間の基本的な核親和性置換反応を介して行なわれ
る。結合は３つの一般的経路のいずれかを取ることがで
きる。

第１に、Ａ　−Ｘ　−Ｒ−Ｓ　Ｈ成分を核親和性置換に
より遊離基含有のシクロヘキサンへ結合させることがで
きる。

第２に、反応基を有するＡ　成分を予め製造されたＸ　
−Ｒ−３−Ｄｅｔ　（ここでＸｌ　はＡ３における改変
しうる反応基と反応してＸを生成しうる基である）へ結
合させることができる。

第３に、第１の方法と第２の方法とを組み合せて使用し
、Ａ　を先ず架橋基の１部と反応させ、次いでこれを予
め改変されたシクロヘキサンと反応させて最終結合体を
生成させることができる。

第２の方法（下記方法■）において、ジアゾアリール成
分を含有するシクロヘキサン（（ＩＶ−２）、硫黄を介
してシクロヘキサンに結合）を製造し、かつこれを蛋白
質もしくはポリヌクレオチドと次のように反応させるこ
とができる。

方法■； 第３の方法において、たとえば改変しうる反応基をハロ
アシル基と反応させ、次いでこの改変したＡ　をたとえ
ば、チオールもしくはアミンのような核親和性基を有す
る改変シクロヘキサンと反応させることにより、予めＡ
　を改変することができる（方法■）。

方法■： ３ 方法（Ｖ）におけるようなハロアシルＡ　の製造は、た
とえばミーンズおよびフイーネー。

ホールデンーディー・インコーボレー゛ジョン社（１９
７１）により刊行物「蛋白質の化学的改変」およびロー
レー等に係る米国特許第４，２２０．７２２号公報に示
されており、この両者を参考のためここに引用する。

上記方法（Ｖ）におけるｒＡ　−ＮＨＪ成分は、代案と
して、遊離基を有するジアゾアリール基（たとえば３．
４．５−トリクロルベンゼンジアゾニウム塩）を有する
化合物によって改変させることもできる。この種の化合
物は、テトラフルオロ硼酸型として公知である（コルゼ
ニオウスキー等、ジャーナル・オプ・オーガニック・ケ
ミストリー、（１９８１）　、第４６巻、第２１５３−
２１５９頁）。改変しうる反応基Ａ３　に対するこの化
合物の結合は、置換しうる塩素原子をそこに結合するこ
とによりＡ　を改変する（この種の方法は、工程を逆転
することにより得られる上記方法（ＩＶ）の変法である
）。一般に、ビオポリマーに対するアリールジアゾニウ
ム機能の結合は公知である〔シードに係る米国特許第４
、２８６．９６４号およびメールス等に係る米国特許第
４．０４３．９９８号参照〕。

本発明の最終生成物を製造するのに有用な特にビオポリ
マーに対する他の可能なＡ　改変は、アミノ基とジケテ
ンとの反応によりＡ　を有するアセトアセチルを生成さ
せ、できれば次いで還元することを含む（ミーンズおよ
びフイーネー、上記、第８０−８１頁）。アセトアセチ
ルにおけるケトン基の使用は還元アミノ化反応に有用で
あり、ここでシクロヘキサンキレート化剤は各親和性ア
ミンを有する。

アミンを含有するビオポリマーをアルカリ性溶液中でイ
ミドエステルと反応させて、イミドアミド（いわゆるア
ミジン）を生成させることができる（ミーンズおよびフ
ィーネー、上記、第９０−９１頁）。この反応は、やや
アルカリ性のｐＨにおいて水性溶媒中で室温にて生ずる
。

適当に置換されたアミジンを製造することができ、これ
を次いで改変シクロヘキサンキレート化剤と反応させる
ことができる。

ハロゲン化スルホニルおよび置換ハロゲン化スルホニル
、たとえば塩化物および弗化物は、蛋白質のアミノ、ス
ルフヒドロ、イミダゾールおよびフェノール性ヒドロキ
シ基と反応することが知られている（ミーンズおよびフ
ィーネー、上記、第９７頁）。脂肪族ヒドロキシ基との
反応はやや遅い。適当に置換されたハロゲン化スルホニ
ルを使用して、たとえば置換しうる塩素のような置換し
うる基をビオポリマー中へ導入することができる。

個々の改変モノヌクレオチドは、上記方法のいずれかを
モノヌクレオチドに適用して製造することができる。

多糖類に対するｎｅｔの結合は、たとえば任意のｃｉｓ
−ジオールを含有する多糖類を臭化シアノゲンと反応さ
せ、次いで得られた水溶性もしくは不溶性の活性多糖類
を適当に改変されたシクロヘキサンキレート化剤、その
先駆体もしくはビオチンを含む核親和性基と反応させて
行なうことができる。同じ方法を、たとえばジゴキシン
のような低分子量のｃｉｓ−ジオールを含有する分子の
製造に通用することもできる。

ビオチンからなる検出しうる成分の結合は、一般に硫黄
含有の核親和性化合物の結合によるビオチン側鎖の改変
を必要とする。この種の改変の例を下記方法（Ｖｌ）に
示す： 方法■： ＩＶＩ−４１ＩＶＩ−５１ 方法（ＶＩ）は１−アミノ−２−メルカプトエタンの使
用を例示している。さらに、この方法は３．４．５−　
トリクロルベンゼンジアゾニウム塩の使用を例示してい
るが、他の結合剤も使用することができる。たとえば、
Ａ　がビオポリマーである場合、これを適当なハロゲン
化物で改変させることができ、がっメルカプト誘導体（
Ｖｌ−５）をこれと反応させて最終生成物を得ることが
できる。

一般に、シクロヘキサンキレート化剤またはその誘導体
との反応は、中和型の分子（ＣＯＯＨまたはＣ００Ｎａ
もしくはＣＯＯ−アルキル型）を用いて、或いは化学理
論量のたとえばマグネシウムのような他の金属の存在下
で行なうことができる。非放射性の方法（ＮＭＲ，ＥＳ
Ｒなど）により検出しうるまたは影像化しうる金属また
は放射能標識した金属を含有する活性な検出しうるシク
ロヘキサン成分の製造は、有機合成における最終工程の
後に行なうことができる。

特に興味あるものは、放射能標識した化合物の製造の後
に、この化合物を使用することである。放射能標識した
診断用または治療用分子の製造方法は、一般に分子識別
しうる部分および放射性金属イオンとキレート化しうる
キレート化部分からなる治療用もしくは診断用薬剤を、
放射性金属イオンが結合され、かつ放射性金属イオンに
対するキレート化部分の結合親和性よりも小さい放射性
金属イオンに対する結合親和性を有するイオン交換物質
と接触させることであり、この場合接触させる前にキレ
ート化部分をキレート解除し、或いは放射性金属イオン
の結合親和性よりも小さいキレート化部分に対する結合
親和性を有する第２の金属イオンでキレート化させ、こ
れにより放射能標識した治療用もしくは診断用薬剤を接
触および次いでイオン交換物質からの放射能標識された
治療用もしくは診断用薬剤の分離により生成させる。こ
のように生成された放射能標識した物質を、次いで直ち
に試験管内または生体内の診断過程に使用する。この種
の方法は、ワイ・スタブリアノボラスにより本出願と同
時出願の「キレート化基を有する診断用および治療用薬
剤の放射能標識法」と題する米国特許出願明細書に開示
され、これを参考のため、ここに引用する。

本発明の他の面によれば、上記合成法に使用される種々
の中間体が提供される。したがって、本発明はさらに式
（ＸＩＩ）　Ｆ （ＸＩＩ） 〔式中、Ａ　は上記の意味を有しかつアミンおよび活性
炭素を含む残基よりなる群から選択される少なくとも１
個の改変しうる反応基を含有し、 Ｚｂは塩素、臭素もしくは沃素であり、ｍは１乃至Ａ　
における改変反応基の全個数に到る範囲の整数である〕 の改変化合物を包含する。

この改変Ａ　は、本発明の好適な最終検出可能化合物を
製造するのに有用である。

さらに本発明は、式（Ｘｎｌ）　： ♂ 特開昭Ｇｏ−１９７Ｇ４５θの の化合物またはその４−ヒドロキシもしくはアシルオキ
シ誘導体を包含し、上記式中Ｍは前記した通りであり、 Ｓは二価の硫黄原子であり、 Ｑ　はＨ１分分枝鎖しくは分枝鎖のないＣ７−Ｃ７゜ア
ルキルもしくはアラルキルであって、ＯＨ，ＳＨ，ＮＨ
２，ＣＯＮＨＮＨ２またはＣ−ＬＶよりなる群から選択
される基を有し、ここで喝は置換しうる遊離基であり、
或いは、は水素、塩素、臭素もしくは沃素であり、Ｊは
ＮＨまたはＮ２ＣＡ−であり、ＣＡ−は対応陰イオンで
ある。

Ｌｖの例はＮ３　、　ＣＩ、　Ｂｒ、）シル基、メシル
基などである。ＣＡ−の例はフルオロ硼酸基。

テトラフルオロ硼酸基、トシル基、過塩素酸基などであ
る。

さらに他の中間体は、式（ＸＩＶ）： 〔式中、Ｐ２．ＢＡおよびＱ　は上記の通りである〕 の改変モノヌクレオチドである。

改変モノヌクレオチド（ＸＩＶ）は、ポリヌクレオチド
中へ組み込まれ、次いで適当なＳ　Ｈ基含有のシクロヘ
キサンキレート化剤またはビオチンと反応させることが
できる。代案として、改変モノヌクレオチド（ＸＩＶ　
）をシクロヘキサンキレート化剤またはビオチンと反応
させ、得られた生成物をポリヌクレオチド中へ組み込む
ことができる。

さらに、他の中間体は、式（ＸＶ）　：〔式中、ｊ、ｎ
およびＫは上記の意味を有し、かつＣＡ−は適当な対応
陰イオンである〕の化合物を包含する。

小分子量のキレート化剤を含有する化合物（Ｖ）： の製造は、金属キレート化成分または金属キレート化し
うる成分を分子へ結合させる任意周知の方法で行なうこ
とができる。たとえば、ＥＤＴＡ、ＤＴＰＡもしくはＤ
ＣＴＡのようなキレート化剤をＡ　のアミノもしくはヒ
ドロキシ基に結合させて、アミドもしくはエステルを生
成させることができる。ジアゾアリールを含有するキレ
ート化剤またはその能力を有するキレート化剤を、Ａ　
における活性化芳香族基に結合させることもできる。

用　途 本発明によるキレート化剤またはビオチン含有化合物の
使用および用途は限定されず、この種の着脱自在に標識
した化合物を従来技術で用いている全ゆる用途に拡張す
ることができる。

たとえば、試料中で検出しかつ分析することが望ましい
任意の化合物を、本発明の技術により改変させることが
できる。特に興味あるものは、たとえばサンドインチ免
疫分析法のような免疫分析法に使用するための抗体の改
変である。さらに、興味あるものは放射線免疫分析法の
ための薬剤または微生物隔膜に存在することが知られた
蛋白質の改変上ある。このように製造された着脱自在に
標識した蛋白質は１．競合免疫分析法にも使用すること
ができる。標識したポリヌクレオチドは、ハイブリッド
化分析に使用することができる。

本発明による検出可能な化合物、特にビオポリマーの他
の用途は、特にモノクローナル抗体による影像化である
。これらは本発明の技術により改変することができ、か
つたとえば動物体のような生体物質における所定部位に
金属を導入することもできる。次いで、検出を放射線技
術により行なうことができる。このような部位に導入さ
れた金属をエミッタとなるように選択して、局部的放射
線治療を行なうこともできる〔たとえば、ニス・デナル
ド等、［ヌクレア・メディスン・アンド・バイオロジー
」、第■巻、ベルガモン・プレス社、パリ、フランス（
１９８２）第１８２−１８５頁〕。

特に興味あるものは、ウィルス性および細菌性のＤＮＡ
配列の検出および同定である。

本発明により製造されたポリヌクレオチド生成物を使用
して、遺伝子障害に関連するＤＮＡ遺伝子配列に対し補
完的なヌクレオチドを作成し、かつハイブリッド化の存
在を検出することにより、遺伝子障害を診断することが
できる。

検出しうるポリヌクレオチドはさらに染色体の抜型分類
に使用することもでき、これは染色体に位置する一連の
所定遺伝子配列に対応する一連の改変ポリヌクレオチド
を使用し、次いでハイブリッド化を検出することからな
っている。

他の用途は、細胞の表面におけるホルモン受容部位を同
定し、または位置決定する方法を含み、この方法は本発
明による検出可能なビオポリマーであるホルモン受容体
結合化合物を結合させ、次いで検出装置により結合を検
出することからなっている。

本発明による金属キレート化結合体の他の用途は、金属
イオンの不必要かつ危険な蓄積をキレート化部分が結合
された特定ビオポリマーにより特定される目標物から除
去することである。

一般に、本発明によるキレート剤標識した分子は、公知
または将来具い出される他の検出装置に使用することが
できる。これらの用途は、放射性薬剤として使用するた
めの非放射性重金属イオンによるキレート化、ＮＭＲに
より検出しうる金属イオンのキレート化、触媒特性を有
しかつ染色体化学反応を触媒しうる金属によるキレート
化などを包含する。

ビオチン結合した化合物は、これらをアビジンまたはス
トレプトアビジンと一緒に培養して検出することができ
、この場合アビジンまたはストレプトアビジンは、たと
えば染色体化合物の生成を触媒しうる酵素（たとえばア
ルカルホスファタービまたはペルオキシダーゼ）のよう
な検出しうる標識へ共有結合される。これは標準的な周
知の酵素結合した免疫分析方式（ＥＬＩＳＡ　）であり
、１９８２年６月２３日付は出願のエンゲルハルト等に
よる［改変ヌクレオチド、その製造および使用方法並び
にそれを含有する組成物」と題する米国特許出願第３９
２．４４０号明細書に記載されており、これを参考のた
めここに引用する。

さらに、本発明は、キットの作成を容易に可能にする。

このキットは、分室を有してそこにたとえば試験管、小
壜、フラスコ、壜、注射器などの一連の容器手段を封入
する支持体から構成することができる。この種の一連の
容器手段の１つは、本発明による検出可能な化合物、ま
たは標準的内挿曲線を作成しうるような種々の濃度で存
在させた化合物を含有することができる。キレート剤結
合した化合物を非放射能標識金属型で設ければ、他の容
器手段が所望の放射性金属および適当なイオン交換物質
を含有して、放射性金属に対する「コールド」の交換を
与えることができる。たとえば、使用者は、キレート北
側結合化合物を放射性金属で容易に標識することができ
る。或いは、第２の容器手段または一連の容器手段はア
ビジンまたはストレプトアビジンを含有することができ
、これら分子をＳ素免疫分析系に使用するための酵素に
共有結合させることができる。

〔発明の実施例〕

以下、本発明を実施例につき説明するが、本発明はこれ
らのみに限定されない。

実施例１ 工程１： 無水４−シクロヘキセン−１，２−ジカルボン酸（１５
４ｇ、　１．０１モル）を７００ｍ１の等級２００の無
水エタノールに溶解させた。濃硫酸（４０ｍｌ）を加え
、反応混合物を３時間還流させた。約３５０ｍ１のエタ
ノールを蒸留により除去した。さらに蒸留によりエタノ
ール−水の共沸混合物の１部として水を除去した。約３
５゜ｎ＋１の等級２００の無水エタノールを加え、次い
で反応物をさらに９０分間還流させた。次いで空気ポン
プ（アスピレータでない）を備えた回転式蒸発器を用い
て、約４０Ｏｎ＋１の溶剤を除去した。残留する反応混
合物へ１１のエーテルを加え、そして反応生成物を溶解
させた。この反応混合物を氷水混合物（１ｊ！の水と１
βの氷）に注ぎ入れ、次いで分液漏斗に入れた。振とう
しかつエーテルと水層とを分離させた後、水層を除去し
て捨てた。エーテル相を１００ｍ１ずつの５％重炭酸ナ
トリウムの冷溶液で３回抽出して、Ｈ２ＳＯ４とモノエ
ステルとを除去した（最終重炭酸抽出物のｐＨは新たな
５％重炭酸溶液と同じであった）。エーテル相を無水Ｎ
　ａ　２　ＳＯ４で攪拌しながら９０分間脱水した。Ｎ
ａ２ＳＯ４を濾過により除去した。エーテルを、回転蒸
発器および空気ポンプで生成物４−シクロヘキサン−１
，２−ジカルボン酸エチルジエステルから除去した。殆
どのエーテルが除去された後、徐々に水浴温度を９０℃
まで高めて、残余のエーテルを定量的に除去した。収量
１６０ｇの液体ジエステルが得られた。

工程２： ４−シクロヘキセン−１，２−ジカルボン酸エチルジエ
ステル（１６０ｇ、　０．７０７モル）と２５０ｍ１の
市販縁ヒドラジン（５４％ヒドラジン＝　４．２２モル
）とを攪拌せずに還流装置へ入れた。次いで、油浴をア
ルゴン雰囲気中で１３０℃まで加熱した（ジエステルと
ヒドラジンとが二相として残留した）。無水（等級２０
０）。

エタノール（１００ｍｌ以下）を急速攪拌しながら還流
凝縮器の頂部から一相となるまで加えた（乳濁相が消失
した）。この反応混合物を、アルゴン雰囲気中で攪拌し
ながら（固化を防止する）　１３０℃にて２４時間還流
させた。生成物４−シクロヘキセン−１，２−ジヒドラ
ジンが生成されるにつれて沈澱した。反応混合物がまだ
暖かいうちに、これを２１のビーカーに注ぎ入れて冷却
させた。混合物が固化し、この粗生成物をブフナ漏斗で
濾過した。濾過に際し、ブフナ漏斗上にある固体をエタ
ノールで洗浄した。

１１１製ヒドラジドを次のように再結晶化させた：１１
の８５％エタノール（水中）を攪拌しながら加熱した。

粗製ヒドラジドの１部（４〇−５０ｇ）を加えた。ヒド
ラジドを溶解させながら、混合物を１０分間魚沸した。

この溶液をデカントして不溶性物質を除去し、溶液を徐
々に室温まで冷却させた。溶液が冷却されるにつれて、
ヒドラジドが沈澱した。これをプフナ漏斗により濾過し
、次いで少量のエタノールで洗浄した。

濾液の容量を無水エタノールで１１に調整した。次いで
、濾液を攪拌しながら加熱し、さらに粗製ヒドラジドの
４０〜５０ｇを上記と同様に再結晶化させた。粗製ヒド
ラジドの全部が再結晶化するまで上記手順を反復した。

全部で１２０ｇのヒドラジドが得られた。

工程３： ４−シクロヘキセン−１，２−ジヒドラジド（２０ｇ、
　０．１０１モル）を２００＋＋＋１の２Ｎ硫酸に溶解
させた。エーテル（２５０ｍｌ）を加え、そして反応フ
ラスコを氷−塩の浴に入れ、そして−２〜−３℃まで冷
却した。５〜１０分間かけて、激しく攪拌しながら亜硝
酸ナトリウム（１３，９ｇ、　０．２０２モル）を加え
た。混合物の温度は５℃より高くせず、攪拌を１０分間
続けた。

この反応混合物を冷めたい分液漏斗（この分液漏斗と１
１の三角フラスコとを冷凍機において冷却した）に注ぎ
入れ、相を分離させた。エーテル相を冷やした三角フラ
スコに移した。水相を約１００〜１５０ｎ＋１ずつの冷
エーテルにより次のように２回抽出した。水相を水浴（
塩を含まない）中でエーテルと共に１０分間攪拌し、次
いで冷やした分液漏斗を用いて相分離させた。

冷エーテル抽出物を合し、次いで３０ｍ１ずつの冷５％
重炭酸ナトリウム溶液で２回抽出した。

エーテル相を６０ｇの無水硫酸ナトリウムで４℃にて３
０分間攪拌することにより脱水した。

硫酸ナトリウムをガラスウールを介して濾過することに
より除去した。生成物４−シクロヘキセン−１，２−ジ
アジド（エーテル中）は、精製せず、或いは特性化しな
かった。次の反応を行なうため、アジドをエーテルから
ベンゼンに次のように移した。アジドを含有する゛エー
テル溶液の１部（全エーテル容量の１／３）を約１５０
ｍ１の無水ベンゼンに加えた。エーテルを、回転式蒸発
器および空気ポンプを用いて急速に蒸発させた。水浴の
温度は、エーテル除去の際４５’ｃ　Ｊｕｌ下に保った
。エーテル中のアジドの１部（それぞれ約１／３）を、
アジドの全部がベンゼンへ移されるまで加えた。

工程４： １００ｍ１の無水トルエン（１００ｍｌ）とベンジルア
ルコール（３０ｍｌ、　０．２８９モル）とをフラスコ
中に入れ、７０℃まで加熱した。ベンゼン溶液（上記工
程から得られたもの）における４−シクロヘキセン−１
，２−ジカルボキシルアジドの１部（１０ｍｌ）を徐々
に（約１５０ｍ１のベンゼン溶液に対する全時間は約３
０分間である）加えて、Ｎ２を発生させ、かつ温度が８
０℃を越えないようにした。上記工程からのベンゼン溶
液の全部を加えた。

この時点で、さらに上記工程からのヒドラジド２０ｇを
アジドに変化させた。しかしながら、上記工程は、次の
ように改変した。１５０ｍ１でなく１００ｍ１のベンゼ
ンをヒドラジド出発物質２０ｇ当りに使用した。上記か
らの残余のトルエン−ベンジルアルコール混合物に２０
ｍ１のベンジルアルコールを追加し、次いで１００ｍ１
のベンゼン溶液を上記と同様に１０ｍ１ずつ反応させた
。この工程をさらに他の２０ｇのヒドラジドにつき反復
した。３つのバッチを合し、そして１０ｍ１のベンジル
アルコールを加えた（６０ｇのヒドラジドにつき全部で
０．７７２モル）。できるだけ多量のベンゼンを蒸留に
より除去し、次いで残留する反応混合物を１２０℃の浴
温度にて１晩還流させた。この時間中に反応混合物は赤
褐色となった。トルエンを減圧ポンプ（０，５＋ｎＨｇ
）を備えた回転式蒸発器で除去した。酢酸（１００〜２
００ｍ１の水中５０％の氷酢酸）を反応フラスコに加え
、そして混合物をガラス棒で攪拌した。所望のウレタン
生成物（４−シクロヘキセン−ｔｒａｎｓ　−Ｌ２−ジ
ベンジルウレタン）は不溶性であったが、赤褐色は液相
中へ移行した。このウレタン生成物をブフナ漏斗で濾過
し、水中の冷５０％氷酢酸で洗浄した。分析のため、ウ
レタンを水中５０％の氷酢酸から再結晶化させた。収量
６０ｇのウレタンが得られた。

工程５ 上記工程からの４−シクロヘキセン−ｔｒａｎｓ−１，
２−ジベンジルウレタン（６０ｇ）を３００Ｉ１１の７
Ｎ水酸化ナトリウムへ加え、１時間還流させた。極めて
効率的な凝縮器を用いて、約７０ｍ１の水を蒸留除去し
て、約ＩＯＮの最終水酸化ナトリウム濃度にした。この
水酸化ナトリウム濃度にて、反応の際生成した炭酸ナト
リウムが沈澱した。混合物を冷却させ、次いで炭酸ナト
リウムをプフナ漏斗での濾過により除去した。炭酸ナト
リウムを１００〜１５０＋＋＋１のｎ　−ブチルアルコ
ールで洗浄した。得られた濾液は二相を有し、この濾液
を分液漏斗に入れ、かつ振とうして水層を除去した。次
いで、１５０ｍ１の水および濃塩酸をｐｏが１になるま
で加えた。

混合物を振とうし、かつ相を分離させた。この時点で、
殆んどの生成物ｔｒａｎｓ　１＋２−ジアミノ−４−シ
クロヘキセンは水相中で二塩酸塩型であった。濃塩酸（
５０＋ｎｌ）を有機相に加え、生成物アミンニ塩酸塩の
大部分が沈澱した。固体をブフナ漏斗で濾過し、次いで
水酸化ナトリウムペレットを含むデシケータで乾燥して
、塩酸を除去した。殆んどの生成物を含有する水相を減
圧ポンプ（０，５＋ｎｍＨｇ　）を備えた回転式蒸発器
で蒸発乾固させた。２つの生成物バッチを合し、これを
精製することなく次の工程に使用した。アミンへの変換
は１００％であると推定された。

工程６： 塩酸塩型のアミンｔｒａｎｓ　−Ｌ２−ジアミノ−４−
シクロヘキセン（ウレタンからの定量的な変換と推定さ
れる。　０．１５８モル）および７５ｇのクロル酸＃　
（０，７９モル）（両者とも固体）を、大型攪拌器と水
浴とを備えた三角フラスコにおいて混合した。冷７Ｎ水
酸化ナトリウム（約１１３　ｍｌ＞を徐々に加えて、ク
ロル酢酸を中和した。反応混合物を冷却し続けるよう注
意した（２０℃以下）。次いで水酸化ナトリウムを添加
すると、アミンの懸濁物が得られた。この反応混合物を
ゆっくり攪拌し、かつ５５℃の油浴中で加熱した。ｐｎ
を監視するため、ｐＨ計を用いながら７Ｎ水酸化ナトリ
ウムを加え、ｐＨを９〜１０の範囲に保った。全てのア
ミンが熔解した後、油浴温度を９０〜９５℃まで１時間
で上昇させた。この間、ｐＨを７ＮＡＭ化ナトリウムに
より９〜１０の範囲に維持した。反応混合物を冷却し、
次いでｐＨを濃塩酸により、１．２に調整した。Ｉｌの
アセトンを室温にてゆっくり加え、そして大半の副生物
、塩化ナトリウムが沈澱した。この塩化ナトリウムをブ
フナ漏斗での濾過により除去した。所望生成物、すなわ
ちｔｒａｎｓ−１，２−ジアミノ−４−シクロヘキセン
テトラ酢酸が濾液中に残留し、これは淡赤褐色であった
。アセトンを、最終８０℃の浴温度にて回転式蒸発器に
より除去した。水ｆ４液中に生成物が残留し、これを１
晩冷却させた。僅かに沈澱物が生じた。ｐｉを１．２に
再調整しく０．９であったもの）、フラスコの壁部を引
っ掻いて結晶化を誘発させた。磁気攪拌器により攪拌す
ると、さらに生成物の沈澱を生じた。生成物、ｔｒａｎ
ｓ　−１，２−ジアミノ−４−シクロヘキセンテトラ酢
酸（１１ｇ）が最初の生成物として結晶化し、かつ６ｇ
の生成物がさらに１ケ月間で徐々に沈澱した。この沈澱
物を濾過により集め、冷水で一洗浄し、かつ１００℃に
て減圧下に乾燥させた。

全部で１７ｇのモノ不飽和ＤＣＴＡ生成物が得られた。

実施例２ Ｎ−ブロムスクシンイミド（ＮＢＳ）を次の手順により
再結晶化させた。１１の水を磁気攪拌器を備えたフラス
コ中に入れ、そして７５℃まで加熱した。粗製ＮＢＳ　
（乳鉢と乳棒とを用いて微細な粉末まで磨砕したもの１
００　ｇ）を攪拌しながら加え、次いで２分間攪拌した
。溶液を、加温したブフナ漏斗により迅速に濾過した（
漏斗は暖くなければならず、さもないと沈澱物が濾過の
際に生ずる）。濾液を迅速に氷冷ビーカ中へ注ぎ入れて
、ＮＢＳを沈澱させ、その分解を最小に保った。ＮＢＳ
を１晩凍結乾燥して、微量の水を除去した。全部で８０
ｇが回収された。

ｔｒａｎｓ　−Ｌ２−ジアミノ−４−シクロヘキセンテ
トラ酢酸（１ｇ　、　０．００２８モル）の遊離酸を１
．５　ｍｌの７Ｎ　ＮａＯＨに溶解させて、約５．２の
最終ｐＨにした。この溶液を１０℃まで冷却し、次いで
磁気攪拌器と水浴とを備えたガラス管における０、５ｇ
のＮ　Ｂ　Ｓ　（０，００２８モル）に加えた。

反応混合物を温度針で攪拌し、温度を８−１０℃に１時
間保った。この混合物を４℃にて１晩攪拌し、固体がも
はや見えなくなるまで反応を完結させた。ナトリウム塩
としての生成物４−ブロム−５−ヒドロキシ−ＤＣＴＡ
を、１０倍容量の乾燥メタノールの添加により沈澱させ
た。

プフナ漏斗での濾過により生成物を集め、少量のメタノ
ールで洗浄し、かつ迅速に空気乾燥させた。光に対する
露出を最小にして、分解を防止した。生成物をアルミニ
ウム箔で覆ったフラスコに入れ、そして高減圧度にて１
晩凍結乾燥させた。全部で１ｇのナトリウム塩が得られ
た（Ｂｒ−およびＯＨ−を有する炭素に関する立体化学
はまだ充分に説明されていない。しかじながら、本発明
の目的でこの立体化学は重要でない）。

実施例３ ０ピオン酸ヒドラジド 」）２ 」し この反応を行なう前に、反応体β−メルカプトプロピオ
ン酸ヒドラジドは次の手順にしたがって合成せねばなら
ない。β−メルカプトプロピオン酸（５３ｇ、０．５モ
ル、液体）を０．６モルのＮａ０ＩＩ　（２４ｇ）　、
０．２モルのＫ　Ｉ　（３３，２ｇ　）および０．５モ
ルの結晶１２（１２６，９ｇ　）と混合した。ビスチオ
ールが生成し、かつ一度に沈澱した。これをブフナ漏斗
で濾過し、水から再結晶化させ、かつ９５℃で１５分間
乾燥させて、４８ｇ　（０，２３モル、９２％収率）の
ビスチオールジプロピオン酸を得た。

このビスチオールジプロピオン酸（４８ｇ、０．２３モ
ル）を、１０＋ｎｌの濃硫酸（０，１３８モル）を含有
する４００ｏ＋１の無水エタノール中に溶解させ、そし
て混合物を２時間還流させた。蒸留によりエタノール（
２００ｎ＋１）を除去した。無水エタノール（追加２０
０　ｍｌ）を混合物に加え、そして混合物をさらに２時
間還流させ、かつ２００〜２５０ｍ１のエタノールを蒸
留により除去した。エーテル（５００Ｔｓｌ）を生成溶
液に加え、次いで混合物を氷上へ注ぎ入れた。固体重炭
酸ナトリウム（３０，７ｇ、　０．３６６モル）を攪拌
しながら加えて、溶酸を中和した。分液漏斗にて相を分
離させた。水相を捨て、エーテル相を１００ｍ１の冷５
％重炭酸ナトリウムで１回洗浄し、次いで２００ｍ１の
０．１モル塩化ナトリウムで１回洗浄した。エーテル層
を５０ｇの無水Ｎ　ａ　２　Ｓ　Ｏｃ　で攪拌しながら
９０分間脱水した。このＮ　ａ２　ＳＯｔを濾過により
除去した。エーテルを空気ポンプを備えた回転式蒸発器
で生成物〔（ＣＨ３−ＣＨ２−０−Ｃｏ−ＣＨ２−ＣＨ
２Ｓ）２　〕から除去した。殆どのエーテルが除去され
た後、徐々に水浴温度を９０℃まで高めて残留エーテル
を定量的に除去した。粗生成物を次いで１００ｍ１の市
販縁のヒドラジン（５４％ヒドラジン−１，７モル）お
よび１００ｍ１の無水エタノールと混合して、エチルエ
ステルをヒドラジドに変化させた。この混合物を攪拌し
ながらアルゴン雰囲気中で一晩還流させて、酸化を防止
した。溶液は黄褐色となった。エーテルを回転式蒸発器
により除去した。固体生成物を２０（ｌｓｌの無水エタ
ノールと共にトリチル化し、次いでプラナ漏斗上で濾過
して集めた。黄色粉末の生成物を２５０　ｍ　ｌのエタ
ノールから再結晶化させて、２０．３ｇのビスジチオー
ルヒドラジド（ＮＨ−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ−ＣＨＳ−）　
（０，１７モ２　２　２ ル、３７％）を得た。この生成物を３０倍モル過剰の硼
水素化ナトリウムにより次のように１段階で還元した。

ビスジチオヒドラジド（０，７５ミリモル）を１．０ｍ
ｌの水中に熔解させた。固体の硼水素化ナトリウム（２
，２５モル、８５■）を加え、反応温度を時々冷却しな
がら２５℃に維持した。生成物チオールの生成を５分間
隔で次のように監視した。

５μｌの試料を２００μｌの冷水中に溶解させ、残留す
る硼水素化物を５０μｌのＩＮ　ＨＣＪ！の添加により
分解し、チオールをクリ−ランド試薬により測定した。

反応が完結した後、混合物を冷却し、ＩＮ塩酸を流加し
て過剰の硼水素化物を分解した。

ＨＣｌ１　（ＩＮ）を、ガスの発生がもはや観察されな
（なるまで加えた。反応混合物を５ＮのＮａＯＨにより
ｐｌ＋７．８まで中和した。試験紙を用いてｐＨを監視
した。この時点で、所望の最終生成物β−メルカプトプ
ロピオン酸ヒドラジドが得られた。これを次のように直
ちに使用した。

４−ブロム−５−ヒドロキシ−ＤＣＴＡ　（４４１■、
ｉミリモル）およびｌｓｌの２Ｍ炭酸カリウノ、をβ−
メルカプトプロピオン酸ヒドラジドに加え、９５℃にて
アルゴン雰囲気中で２時間反応させ、次いで反応混合物
を冷却し、水で希釈し、そしてダウエックス１０カラム
に充填した。

未反応のヒドラジドはこのカラムに結合せず、ピクリル
スルホン酸をカラムに通して監視したく赤色溶液の発生
）。このカラムを０．ＩＮの酢酸で洗浄し、次いで生成
物５−ヒドロキシ−ＤＣＴＡ−４−チオプロピオン酸ヒ
ドラジドを０．２Ｎの塩酸で熔出させた。ヒドラジド陽
性フラクション（ピクリルスルホン酸との反応により監
視）を合し、次いで５Ｍ　ＮａＯＨで中和した。

０．６ミリモルの収量が得られた。

実施例４ ４−ブロム−５−ヒドロキシ−ＤＣＴＡ（８８２■、２
．０ミリモル）および３４０■の２−アミノエタンチオ
ールヒドロクロライド（３，０ミリモル）をアルゴン雰
囲気下にて１．０　ｍｌの２Ｍ炭酸カリウム中で合し、
次いで９０℃にて２時間加熱した。クリ−ランド試薬（
５，５’−ジチオ−ビス−（２−二トロ安息香酸）〕を
用いてチオールの消失を追跡することにより反応を監視
した。約９０％のチオールが消失した後、反応混合物を
酸素を含まない水で約５０倍希釈し、次いで６ｍｌのダ
ウエックス−１カラムへ充填した（酢酸型、０．８　ミ
ＩＪ当量／ａ＋１樹脂）。未反応の２−アミノエタンチ
オール塩酸塩はカラムに結合しなかった。カラムを０．
Ｉ　Ｎ酢酸で洗浄した。

ニンヒドリンを用いてアミンの存在につキ洗浄液を監視
した。生成物に対し塩として結合したアミンをピークと
して洗浄除去し、次いでアミンの量は水平となった。こ
の時点で、カラムを０．２Ｍ塩酸（約ＰＩ（１）で溶出
させた。溶出の際、生成物４−アミノ−エチルチオ−５
−ヒドロキシ−ＤＣＴＡの１部が沈澱したが、ｐｏが約
１に達すると生成物は熔解し、したがって生成物を全能
溶出しないよう注意せねばならない。

ニンヒドリンを用いてアミンにつき溶出液を試験した。

アミン陽性の全フラクションを合し、かつ凍結乾燥させ
た。収量１．０７ｇの生成物がアミン三塩酸塩として得
られた。

実施例５ 改変ヌクレオチドー−−ｄＵＴＰアリルアミンの合成 （ａｌ　水銀化のｄＵＴＰの製造 デオキシリボウリジン三燐酸（ｄＵＴＰ。

５５４■）を１００１の０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液
（ｐＨ６，０）に熔解させ、酢酸水銀（１，５９ｇ、５
．０ミリモル）を加えた。この溶液を５０℃で４時間加
熱し、ついで水冷した。塩化リチウム（３９２■、９．
０ミリモル）を加え、溶液を同量の酢酸エチルで６回抽
出して、過剰のＨｇＣｌ２を除去した。抽出過程の効率
を、有機層における水銀イオン濃度を４，４−ビス（ジ
メチルアミノ）−チオベンゾフェノンを用いて測定する
ことにより監視した〔ニー・エヌ・クリストファー、ア
ナリスト、第９４＠、第３９２頁（１９６９））。ヌク
レオチド形成の程度を分光光度法により測定し、次いで
ゾール等により記載されたように水溶液の１部を法度化
させ〔アール・エム・ケー・ゾール、ディー・シー・ワ
ード、ディー・シー・リビングトンおよびイー・マーチ
ン、ヌクレイツク・アシッド・リサーチ、第２巻、第９
１５頁（１９７５））、これは通常９０〜１００％の範
囲であった。酢酸エチル抽出の際しばしば濁りを生じた
水層におけるヌクレオチド生成物を３倍容量の水冷エタ
ノールの添加により沈澱させ、遠心分離により集めた。

沈澱物を冷無水エタノールで２回、エチルエーテルで１
回ずつ洗浄し、次いで風乾した。このように製造された
水銀化ヌクレオチドを、さらに生成することなくアリル
アミン−ヌクレオチドの合成に使用した。

（ｂｌ　ｄ　Ｕ　Ｔ　Ｐアリルアミン 水銀化ヌクレオチド（工程ａからのもの）を０．１Ｍ酢
酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５，０）に溶解し、そして２
０ミリモルの濃度（２６７ｎｍにて１０００　Ｄ／ｍｌ
）に調整した。酢酸水溶液中の酢酸アリルアミンの新た
な２．０Ｍ溶液は、１５５ＩＩｌｌのアリルアミン（１
３，３ミリモル）を８．５　ｍｌの水冷４Ｍ酢酸へ徐々
に加えて作成した。３ｍ１（６，０ミリモル）の中和さ
れたアリルアミン保存物を２５　ｍｌ　（０，５ミリモ
ル）のヌクレオチド溶液へ加えた。４ｍｌの水中に溶解
させたヌクレオチド１当量のに２ＰｄＣ１４（１６３■
、０．５ミリモル）を次いで加えて、反応を開始させた
。

パラジウム塩（アルファーベントン社）を添加すると、
溶液は徐々に金属（ＨｇおよびＰｄ）の付着物が反応容
器の壁部に生ずることにより黒色となった。室温に１８
〜２４時間静置した後、反応混合物を０．４５寵の膜フ
ィルタ（ナルゲン）に通して殆どの残留金属沈澱物を除
去した。黄色濾液を５倍希釈し、そして１００ｍ１のＤ
ＥＡＲ−セファデックスＴＭＡ−２５（ファルマシア社
）カラムへ加えた。１カラム容量の０．１　Ｍ酢酸ナト
リウム緩衝液（ｐＨ５，０）で洗浄した後、生成物を１
βの直線勾配（０，１〜０．６Ｍ）の酢酸ナトリウム（
ｐＨ約８〜９）または重炭酸トリエチルアンモニウム（
ＴＥＡＢ）　（ｐＨ７，５）のいずれかで溶出させた。

所望の生成物は主たるＵＶ−吸収部分に存在し、これを
０．３０〜０．３５Ｍの塩で溶出させた。スペクトル分
析は、このピ−りが数種の生成物を含有することを示し
た。

最終的精製は、０．５ＭのＮＨ４Ｈ２ＰＯ４緩衝液（ρ
１１３．３　）　（分析的分離）または０．５Ｍの酢酸
トリエチルアンモニウム（ｐＨ４，３）　（製造約分％
１ｆｔ）のいずれかを溶出剤として用いてパルチシルー
〇ＤＳ２のカラムによる逆相−ＨＰＬＣクロマトグラフ
ィーで行った。５−（３−アミノプロペン−１−イル）
ウリジンの５′　−三燐酸塩（ウリジンに対するアリル
アミン付加物）が最後にＨＰＬＣカラムから溶出され、
これらはまだ未確認の不純物として３種から分離された
。

実施例６ ルアミン ５−ヒドロキシ−ＤＣＴＡ−４−β−チオプロピオン酸
ヒドラジド（１２ミリモル、４倍過剰）を０．３　Ｒ１
１の水に溶解させた。ＨＣＩ（５０７！、ＩＮ）を加え
、反応混合物を０℃まで冷却した。

冷０．０５　ＭのＮａＮ０□（０，３ｍｌ）を反応混合
物に加え、これを０℃で１０分間反応させた。この時点
で、ＤＣＴＡヒドラジドはアジド（−Ｎ　）まで変化し
た。炭酸カリウム（２５μｉ、２Ｍ）を加え、反応混合
物を中和し、そして１ｏｐｅの１０Ｍ硫酸マグネシウム
を加えて中和した。

ｐｌ＋を１５μｌの２Ｍ炭酸カリウムで約８に調整し、
次いで５００μβ　ｄＵＴＰアリルアミン（０，６モル
　ＮａＣ１中３ミ中上ミリおよびｉｏ。

μｌの冷５％重炭酸ナトリウムを０　’ｃで加えた。

この混合物を０℃にて１晩（約１２時間）反応させた。

生成物を未反応出発物質から次のように分離した。反応
混合物をＩＮ塩酸によりｐ１１７まで中和し、次いで予
め０．０１Ｍ燐酸カリウム（−塩基性および二塩基性の
燐酸カリウム等モル、約、Ｈ６，８＞　で平衡化させた
１ｍｌのヒドロキシルアパタイトカラムへ充填した。０
．３　ｍｌのフラクションを集めた。カラムを同じ緩衝
液（４ｍｌ）で、Ａ２６ｏもしくはＡ２５５における吸
収帯がもはや溶出されなくなるまで洗浄した。

生成物であるＤＣＴＡ−標識されたｄＵＴＰと未反応の
ｄＵＴＰアリルアミンとを０．３Ｍの燐酸カリウム緩衝
液（−塩基性および二塩基性の燐酸カリウムの等モル液
）で溶出した。２９０ｎｍにおける吸収を有する全ての
フラクションを７７％。

この生成物を次の手順により異なる緩衝液に移した。生
成物（０，９ｍｌ）を冷水により２０倍希釈し、次いで
０．５　ｍｌのＤＥ−５２セルロースカラム（塩素型）
に充填した。全Ａ　２９０が吸収された。このカラムを
０．５　ｍｌ　（１床容量）の０．０５Ｍ　ＮａＣ１で
洗浄した。生成物を１．０　ｍｌの容量の０．６　Ｍ　
ＮａＣ１で溶出させた。回収されたＡ２９０＝１７．８
０　Ｄ　、回収率１００％であった。

ｄＵＴＰアリルアミンの代りにｄＴＴＰを用いた比較反
応を平衡して行ない、同様に処理した。それぞれ１０μ
ｌを２０μｌのグリシンと０．０５Ｍの酢酸アンモニウ
ムとで放射性ニッケルの存在下に希釈し、かつ１５分間
結合させた。

各パンチをダウエックス５０（ＮＨ，＋型）カラムに充
填した。ｄＵＴＰアリルアミンとの反応生成物のみを放
射性ニッケルで標識した。少な（とも８４％の生成物が
ＤＣＴＡ同族体であった。

キレート北側標識したｄＵＴＰ了りルアミン生成物の構
造は次の通りであった： 実施例７ １当量のＤＣＴＡ−ヒドラジド（水中）を１０倍過剰の
ＩＮ塩酸で処理し、０℃まで冷却した。

１当量の予備冷却されたピペットにおける冷０．０５Ｍ
　Ｎ　ａ　Ｎ　Ｏ２溶液を０°Ｃの反応混合物へ加えた
。混合物を０℃にて１０〜１５分間反応させた。反応混
合物を冷５％重炭酸ナトリウムで中和した（ｐ１１約８
．５まで）。これは高い塩モル濃度を与えた。免疫グロ
ブリンＧ蛋白質を加え、０℃にて１晩培養した。過剰の
活性化ＤＣＴＡをＧ−５０カラムに保持し、蛋白質を空
隙容積に通過させた。

１ミリモルのＤＣＴＡ−臭化物を、０．２　ｍｌの１．
２−ジチオエチレンと０．５　ｍｌのトリエチルアミン
とを含有する５ｍｌの５０％ＤＭＦに加えた。

混合物をアルゴン雰囲気中で６０〜７０℃にて２時間培
養した。反応後、混合物を酸素を含まないＨＯで５０ｍ
１まで希釈し、ｐｉを氷酢酸により４．０〜４．５に調
整し、過剰の）ｉ　Ｓ　−ＣＨ２−ＣＨ−３Ｈを１５＋
＋＋１のベンゼンにより攪拌して（振とうでない）３回
抽出した。次いで、水相をダウエックスＡＣ−１カラム
（比容量９ｍ１）へ充填した。このカラムを５０μｌの
０．１Ｍ酢酸溶液で流過物がチオールを含まなくなるま
で洗浄した。次いで、ＤＣＴＡ−３Ｈを０．２５Ｍ　Ｈ
ＣＩで溶出させた。チオール含有のフラクシ日ンを合し
、減圧下に４０℃にて蒸発乾固させ、遊離酸（３００■
）を−２０℃にてアルゴン雰囲気中で貯蔵した。

実施例９ ３．４．５−トリクロルアニリンによるＤＮＡの活性化 ｔｏｏ■の３．４．５−　）リクロルアニリンを２．５
ｎｉ１の５０％ＤＭＳＯにおける０、５Ｍ　ＨＣＩに溶
解させ、氷上で激しく攪拌しながら冷却し、当モル量の
ＮａＮ０□を冷ＩＭｆ６液からできるだけ迅速に加え、
次いで１０分間攪拌を続けた。

３００ｍ１の水における１■の３ＨもしくはｆｄＤＮＡ
を３００μｌの２Ｍカコジル酸緩衝液（ｐＨ６，６）お
よび６００μｌのＤＭＳＯと混合した（ＤＭＳＯの添加
により溶液のｐｕは８．３まで上昇した）。２０μβの
新たに調製したジアゾニウム溶液をこれに加え、そして
混合物を室温で２時間培養した。培養の際に生じた僅か
な沈澱を遠心分離により除去した。この溶液を、次いで
酢酸アンモニウムにより０．４Ｍとなし、ＤＮＡをエタ
ノールで沈澱させた。

実施例１０ ３．４．５−　）リクロルアニリンで活性化したｆｄＤ
ＮＡ　（実施例９）を、同量の０．１Ｍのに２ＨＰＯ４
と共に０．１Ｍの水酸化ナトリウム中に熔解させた。こ
の溶液を等容量の０．ＩＭＤＣＴＡ−３Ｈ（実施例８）
で処理し、アルゴン雰囲気中で６５℃にて２時間培養し
た。沈澱したジスルフィドを遠心分離により除去し、Ｄ
ＮＡをＧ−５０クロマトグラフイーにより楕製し、−２
０℃にて貯蔵した。放射性Ｎｉを用いて誘導体ＤＮＡの
量を推定することにより、グアニンの６０％が標識され
たこと＾檻確認された。

実施例１１ ビオチン−３Ｈ ３ミリモルのビオチン−ＮＨＳエステルを２５ｍ１の無
水ＤＭＦに溶解させ、かつ０．５Ｍ重炭酸ナトリウム溶
液１２ｍ１におけるシステアミン塩酸塩の１Ｍ溶液と混
合し、そして混合物を室温にて１晩培養した。培養の間
、重質沈澱物が生じた。液体を減圧下で４５℃にて除去
し、残留物を５０ｍ１の無水エタノールに懸濁させ、１
ｇのＮａＢ　Ｈｔ、を加え、かつ懸濁物を７５℃にて１
時間攪拌した。エタノールを除去し、冷ＩＭ塩酸を加え
て、ｐＨを４．５となし、そして水を３５℃にて減圧下
に除去した（これらの操作は全てアルゴン雰囲気下で行
なって、チオールの酸化を防止した）。固体残留物を粉
末化し、４ｍｌの冷０．０１Ｍ脱気酢酸と共にトリチル
化した。

この手順を２回反復し、残留物を凍結乾燥させた。ＴＬ
Ｃクロマトグラフィーは、主たるビオチンスポットがチ
オールを含有し、２つの小さいスポットがチオール陰性
であることを示した。

全ての反応において、使用したビオチンの量はチオール
含有量に基づいている。ビオチン−３Ｈを実施例１０と
同様にトリクロルアニリン−活性化ＤＮＡとの反応に使
用することができる。

水０．２　ｍｌにおける活性化ＤＮＡ　（実施例９）の
０．５■を９０％ＤＭＦにおける０、５Ｍの酢酸トリエ
チルアンモニウム２．０　ｍｌと混合した。トリエチル
アンモニウム型のＤＣＴＡ−３Ｈ（実施例８）５０■を
加えた。この混合物を暗所中で５０℃にて４時間攪拌し
た。ＤＭＦを減圧下で４５℃にて除去し、ＤＮＡをＧ−
５０での濾過により脱塩した。標識の程度を、次いで放
射性Ｎｉ　−６３を用いて測定した。平均して５．３個
の塩基が計算により標識された。

実施例１３ ４−アミノ：ｔＳ−ｔ ３−アミノ：１３−２ ８８２ｍ＋ｒの４−ブロム−５、−ヒドロキシ−ＤＣＴ
Ａ　（２，０Ｍモル）および３７６■の４−アミノチオ
フェノールまたは３２０μｌの３−アミノチオフェノー
ルを２＋ｗｌの炭酸カリウム溶液（１モル）に熔解させ
、混合物をアルゴン雰囲気中で９０℃にて２時間攪拌し
た。混合物を５０μｌの酸素を含有しないＨ２Ｃで希釈
し、１０ｍ１のダウエックスカラムに充填した。このカ
ラムを０．１　ＭＮ：酸で流通物がチオールを含有しな
くなるまで洗浄し、生成物を０．２Ｎ　ＨＣＩで熔出し
た。チオールを含゛有する全フラクションを合し、そし
てＨＣＩをＫＯＨで中和した。この溶液を一４０゛Ｃで
貯蔵した。チオール含有量により測定した収率はそれぞ
れ９２．７％（１３−１）および８６．３％（１３−２
）であった。

ＢＳＡの標識 ４−アミノチオフェニルＤＣＴＡ　（実施例１３−１）
で標識する場合、貯蔵４−アミノ溶液は０．１Ｍとした
。１００μｌの４−アミノチオフェニルＤＣＴＡ溶液＋
２５μβの０．１　Ｍ塩酸＋１００μｌの０　、Ｉ　Ｍ
　ＮａＮ　Ｏ２を混合し、そして０℃にて３０分間培養
した。５０μｌのＩＭ　Ｋ２ＨＰＯ４を加えて、ｐＨを
６．７となし、その５０ｐｌのｌ＋ａｌの０−　Ｉ　Ｍ
　Ｎ　ａ　Ｂ　Ｏ３中のＢＳＡ（７，０■／ｍｌ）と混
合した。この混合物を４℃にて１時間培養した。ジアゾ
ニウム塩は極めて不安定であった。４℃にて１時間後、
β−ナフトールとの結合は観察されず、標識の割合は１
．７であった。

３−アミノチオフェニルＤＣＴＡは使用しなかったが、
その高い安定性のため、より良好な試薬である。

ここに使用したＢＳＡは予め９５℃にてｐ）１３．５で
１５分間加熱することにより、ヌクレアーゼを失活させ
た。

２００μｌのヒドラジド溶液（６，７μモル）および５
０μｌのＩＭ　ＨＣＩを０℃に冷却した。

１ｐｌのＩＭ　ＮａＮ０□を加え、０℃にて１５分間培
養した。３０μｌの氷冷２　ＭＮ　ａ３　Ｃ０３を溶液
に加えてｐ）１を約８．５〜９．０にした。０．１Ｍ　
ＮａＢＯ３におけるＢＳＡの溶液（７，０ｍｇ／ｍｌ）
の１ｍｌへ１２５μｌのアジド溶液を加え、そして混合
物を４℃にて１晩培養した。過剰のアジドを０５０カラ
ムによる濾過で除去した。

ＢＳＡ濾液を０．５■／ｍｌまで希釈し、その１００μ
ｅをＮｉで標識した。全カウントは８６，７２８　（６
，９１モル）であった。ＢＳＡの分子量が６８０００と
仮定すれば、０．５■は７．３μモルである（１００ｍ
ｌにおける０、１２ｐモルは９．４分子のＤＣＴＡ／Ｂ
５Ａｌ分子に相当する）。

実施例１６ ２００μ７！（０，０１緩衝液、トリス−ＨＣＬ　ｐＨ
７，４，０，００１Ｍ　ＥＤＴＡ）における３、２０Ｄ
／２６０の２００μｇのλＤＮＡを８０μｌのＤＮＡ分
解酵素（１Ｍｇ／μＪＢＳＡで５０００分のｌに希釈、
０．００５　Ｍ　ＭｇＣｌ□）と混合した。

この混合物を３７℃で５分間培養し、５０μｌの０．Ｉ
ＭＥＤＴＡと混合し、６５℃にて１５分間加熱すること
により酵素を失活させた。培養混合物を０．２Ｍ　ＫＣ
Ｉで平衡化した０、５　ｓｏｌのＤＥＡＥカラムに充填
し、このカラムを５ｍｌの０．２Ｍ　ＫＣＩで洗浄した
。ＤＮＡを０．５　ＭＫＯＨで溶出させ、２６０　ｎｍ
の吸収フラクションを合し、そして酢酸で中和した。

この培養混合物は３．０１中に０．２Ｍのコカジル酸緩
衝液（ｐＨ７，３）と、０．１Ｍの酢酸カリウムと、１
ミリモルのｄＵＴＰと、０，３ミリモルのアリル−アミ
ノｄＵＴＰと、１ミリモルのＣａＣｌ２と、１ミリモル
のβ−メルカプトエタノールと、消化されたＤＮＡと、
４００単位の末端トランスフェラーゼとを含有した。培
養を３７℃にて１晩行なった。５１．８％のヌクレオチ
ド三燐酸がＤＮＡ断片に末端組み込みされた。この混合
物を０．５　ｍｌのＤＥＡＥカラムに充填し、１０ＩＩ
１１の０．２Ｍ　ＫＣＩで洗浄し、生成物を１．５Ｍの
Ｌ　ｉ　Ｃｌで溶出させた（９゜３０Ｄ／２６０　；　
３．２０Ｄの出力＝６．１０Ｄ／２６Ｑ＝２４４μｇ重
合体）。

Ｂ、アリルアミノ基の放射能標識 １ｍｌのヒドラジド−ＤＣＴＡ　（実施例３）（１６，
４ミリモル）および２００ｍ１のＩＭＭＣＩを０℃で冷
却した一５０ｍ１の冷０−３５Ｍ　剰ａＮｏ　２を攪拌
下に加え、そして混合物を０℃で１５分間培養した。１
００＋Ｉｌｌの冷２Ｍ　Ｋ２　ＣＯ３を加えて酸を中和
し、次いで２００ｍ１の０．５　Ｍ硼酸緩衝液（ｐＨ９
，２）を加えた。この混合物へ「冷Ｊ　ＤＮＡ溶液（１
ｍｌ）を加え、０℃にて１晩培養した。次いで、混合物
を０．５　ｍｌのＤＥＡＲカラム（０，２Ｍ　ＫＣＩで
平衡化）に充填した。

このカラムを１０ｍ１の０．２Ｍ　ＫＣＩで洗浄し、生
成物を１．５　Ｍ　ＬｉＣ１で溶出させた。ＯＤ　／　
２６０の半分をこの塩により溶出させた。残部を０．２
Ｍ酢酸における１、５Ｍ　ＬｉＣ１で熔出させた。次い
で、放射性ＣＯＣｌ２を少しづつ加えた。

フラクションＩ　：　８，８００，０００　ｃｐｍ　／
μｇフラクションＩＩ　：　９２１６００＋０００Ｃｐ
Ｈｌ　／　／’　ｇ次いで、フラクションＩを次のよう
にＤＮＡとハイブリッド化させた。

Ｃ，ハイブリッド化 Ｃ・１　サウザンゲル ＤＮＡを旧ｎｄｌ［［で制限し、クロマトグラフにかけ
、かつサウザンプロント技術により適当なフィルタへ移
した。比較として、制限Ｍ１３ファージを使用した。コ
バルト標識したＤＮＡ（実験１６．１１．２μｇ）およ
びキャリヤＤＮＡ（１■）を５ｍｌのハイブリッド化溶
液に溶解させた。比較試料および試験試料をこの溶液と
共に４２℃で１晩培養し、次いで緩衝液において０．１
％ＳＤＳにより５５℃で３回洗浄し、風乾し、そして標
準トルエン溶液において計数した。

結果 （１）Ｍ１３比較：　７４７５ｃｐｍ （２ａ）λ試験：　２５．７２４ｃｐｍ（２ｂ）λ試験
：　２９．４１２ｃｐｍこれらの結果は、背景としての
カウントは高いものであったが、コバルト標識した試料
を用いるハイブリッド化は約３．５〜４倍高いカウント
を与えることを示した。

Ｃ・２　スポットハイブリッド化 上記Ｃ・１につき記載したような１晩の条件下でスポッ
トハイブリッド化を行なった。Ｃ〇−標識したＤＮＡ試
料を用いて、１２５ｐｇのλＤＮＡを検出することがで
きた。

Ｗ道 ２５０μ！容量の０．１　Ｍ硼酸緩衝液における０、４
０Ｄ／２８０の抗ヒト絨毛ゴナドトロピン抗体と０．２
２μモルのヒドラジドＤＣＴＡ　（実施例３）とを０℃
にて１晩培養した。過剰のＤＣＴＡヒドラジドをＧ５０
での濾過により除去した。

濾液： ＯＤ／２８０　＝０．３７６ ０Ｄ／２８０　＝０．２１６ 誘導された抗体を含有する部分（１００μβ）を１０Ｍ
モルの比活性６２９．２６２　ｃｐｍ　／μモルを有す
るｌＯμモルのＮｉと混合した。蛋白質に結合されたカ
ウント：　２９７，３５０　ｃｐｍ　＝　０．４７２　
ｐモル（１■の抗体および１５０．０００の分子量につ
き］、、４０Ｄ／２８０と仮定する）。１００ｓ＋１は
２６．４μｇ””０．１７５μモルの抗体に等しい０．
０３７６０　Ｄ／２８０を含有した。０．１７５μモル
の抗体は０．４７２μモルのＮｉを含有した。したがっ
て、１モルの抗体は０．４７２１０．１７６　＝　２．
６０モルのニソ、ケルを含有した。

実施例１８ ダウエックストＸ２　は第４級アミノ基を含有する。こ
れらの基はＤＣＴＡ−ヒドラジドのカルボキシル基を極
めて強力に結合して、下記の塩（Ｉ）を生成する； Ｈ） 塩（１）は０．０３Ｍの塩酸中で安定であり、高ＨＣＩ
濃度（０，Ｉ　Ｍ）にて置換される。これ番よ、０．０
３Ｍの塩酸中でＮａＮＯ２と反応して、アジド（ＩＩ）
を生成する； ＣＩ＋） ベンゼン中で塩（ｎ）を加熱することにより、アジドが
再配列してイソシアネート（■）を生成した： （１［１） 式（ＩＩＩ）のイソシアネート基は次いでアルコールと
８０〜１３０℃で反応して、ウレタン（ｍＶ）を生成し
た： （１ｖ） これらのウレタンは生理学的ｐＨにて安定な物質であり
、濃厚な酸または濃厚なアルカリで加水分解してアミン
を生成する。ダウエックスに対するＤＣＴＡの固定は、
そのＯＨ基が他の分子のイソシアネート基と反応するの
を相当な程度で防止し、ＤＣＴＡアジドが不溶性である
ベンゼンもしくはトルエンまたはその他の不活性溶剤中
で操作することを可能にする。

ウレタン（ＩＶ）の生成後、これを５０％エタノールに
おける冷ＬｉＣ１によりダウエックスから溶出させた。

冷却時かつ中性ｐＨにおいて、エステル変換は生じなか
った。

実施例１９ セラミドの標識 セラミドは２個の遊離アルコール基を有するジクリセラ
イドである。

実施例１８からのＤＣＴＡ−ヒドラジド（１）の１０ミ
リモルを、５０ｍ１のＩ（２０におけるダウエックスＡ
Ｇ−１−Ｘ２の懸濁物へ攪拌下に徐々に加えた。攪拌を
１５分間続け、樹脂をブフナ漏斗で５００ｍ１の冷水に
より洗浄した。次いで、この樹脂を１００ｍ１の冷０．
０３Ｍ　ＨＣ１に懸濁させ、懸濁物を水浴中に入れた。

１０ミリモルの固体Ｎ　ａ　Ｎ　Ｏ２を３０分間かけて
攪拌下に加え、温度を５℃以下に保った。最後のＮａＮ
０２を添加した後、懸濁物を同温度で１５分間攪拌した
。次いで、樹脂を冷ブフナ漏斗で濾過し、１００＋ｗｌ
の冷（−２０℃）エタノールで洗浄した。最後に、１０
０ｍ１の冷（−２０℃）エタノールに懸濁させ、氷−塩
の浴において一２０℃で３０分間攪拌した。エタノール
を吸引除去し、そして残留する微量のエタノールを高減
圧で除去した。乾燥樹脂を無水条件下で分は取り、封入
アンプル中に一７０℃で貯蔵したが、少なくとも８ケ月
にわたり活性は喪失しなかった。

セラミドを標識するため、０．５ｇのアジド樹脂を１５
ｍ１の無水ベンゼンに懸濁させ、６００μモルのセラミ
ドを加え、そして懸濁物を７５℃にて３０分間加熱した
。次いで、ベンゼンを減圧下で除去し、１５ＩＩｌｌの
無水トルエンを加え、そして懸濁物を１２０℃で無水条
件下に１晩攪拌した。

樹脂を濾過し、エタノールで洗浄して微量のトルエンを
除去し、そして未反応セラミドを次いで３倍床容量の水
中における５０％エタノールで除去した。生成物を５０
％エタノール／Ｈ２０における０、６　Ｍ　ＬｉＣ１で
溶出させた。

ＤＣＴＡ活性を有するフラクションを合し、そしてセラ
ミド含有量を法度測定法により測定した。６３．８％の
収量であることが判明した。

実施例２０ Ａ、　ｃｉｓ−ジオール基による物質の一般的ＤＣＴＡ
標識 ジオールをに″２ＣＯ３溶液において臭化シアノゲンで
活性化させ、過剰の臭化多アノゲンをトリエタノールア
ミンで失活させ、そして活性化ジオールをＤＣＴＡアミ
ンと反応させた。物質が水中に可溶性でなければ、ジギ
トキシンの場合と同様に、活性化をジグリム／水中で行
なった。

Ｂ、ジギトキシンの標識 ６５．４ＭモルのＨ−ジギトキシン（１０１０００ｃｐ
／　ｎｒ　）を４０１のジグリムに熔解させ、４°Ｃま
で冷却した。同容量の０．１Ｍ冷に２ＣＯ３を加え、そ
して３００■のアセトニトリル２ｍｌにおける臭化シ７
ノゲンを攪拌および冷却下で１度に加えた。この混合物
を４℃で１５分間保ち、過剰の臭化シアノゲンを５ｍｌ
の２Ｍトリエタノールアミン塩酸塩（ｐＨ１，２）によ
りｐＨ８，５〜９．０として失活させた。２ｍｌのＨ２
Ｏに熔解した２００μモルのＤＣＴＡアミンを加え、そ
して混合物を４℃にて１晩培養し、次いでダウエ・ノク
スＡＧ−１−Ｘ２カラムに充填した。このカラムを流過
物中にカウントが検出されなくなるまで５０％エタノー
ルで洗浄し、結合体を５０”％エタノールにおける０、
６　Ｍ　’ＬｉＣ１で溶出させた。全ての放射性フラク
ションを合した。結合したジギトキシンを示す放射能の
回収率は５７．６％であった。

ＤＣＴＡにより燐酸４−アミノ−１−ナフトールを標識
するために開発した方法は、第一級アミノ基を有する全
ての物質に適用される。

２０ｎ＋の０．２Ｍ　）（ＣＩに溶解させた５００μモ
ルの５−ヒドロキシ−ＤＣＴＡ−４−β−チォプロピオ
ン酸ヒドラジドの溶液を０℃まで冷却し、そして５００
μモルの固体Ｎ　ａ　Ｎ　０２を２０分間かけて加え、
温度を５℃以下に保った。最後のＮａＮ０２　を添加し
てから１５分後、ｐＨを冷Ｎａ２ＣＯ３により８．５と
なし、かつ５ｍｌのＩＭＮ　ａ　ＨＣ０３に溶解した４
５−θμモルの燐酸４−アミノ−１−ナフトールを加え
た。この混合物を４℃にて１晩培養し、１００ｍ１のＨ
２Ｃで希釈し、そして酢酸型のダウエックストＸ２カラ
ムに充填した。

このカラムを３倍床容量の０，１Ｍ酢酸で洗浄し、生成
物をＨ２Ｃにおける０、６　Ｍ　ＬｉＣ１で溶出させた
。ＤＣＴＡ含有フラクションを合し、生成物を３倍床容
量のエタノールにて、−２０°Ｃで１晩沈澱させた。

収率：生成物８６．４％ Ｕビリ３ この生成物はアルカリホスファターゼの基質となる。生
成フェノールをジアゾニウム塩と結合させることにより
、放射性金属で標識されうる沈澱が生じた。これは、ア
ルカリホスファターゼに対する極めて感度のよい分析を
可能にする。

以上、本発明を実施例につき充分説明したが、本発明は
これらのみに限定されず、本発明の範囲内において同等
な広範囲の構造、方法および用途が可能であることが当
業者には了解されよ特許出願人　エンシー　バイオケム インコーポレイテッド 手続補正書（ｊｉ力 ｌ訓６０年　３月１９日 特許庁長官　志　賀　学　殿 ■、事件の表示 昭和６０年　特許願　第１４６３６号 ２、発明の名称 検出可能な分子並びにその製造および使用方法３、補正
をする者 名称　エンシー　バイオケム　インコーポレイテッド代
表者　エラザール　ラバンニー Ｇ聞）　（アメリカ合衆国） ４、代理人

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１１式：３　１　ｂ Ａ−（−Ｘ−Ｒ−Ｅ−Ｄｅｔ　） ペプチドまたは多′糖頻であり、Ａ２　と重合体とポリ
   ペプチドと多糖類とはアミノ、ヒドロキシｃｉｓ−ＯＨ
   ＋ハロゲン、アリール、イミダゾイル、カルボニル、カ
   ルボキシル、チオールまたは活性炭素を含む残基よりな
   る群から選択される少なくとも１個の改変しうる反応基
   を有し、 Ａ　は約２０００未満の分子量を有する化学実体であり
   、 Ｘは −Ｎ＋４−．−ＮＨ−’Ｃ−，−Ｎ＝Ｎ−、−ＮＳＨＯ
   −、−０５０−−ｘＨ−ｘ＝・２２′ よりなる群から選択され、 またはＣ７−ｃ、ｏの分枝鎖もしくは分枝鎖のないアル
   キルもしくはアラルキルであってＯＨにより置換するこ
   とができ、 ＹはＥに対する直接結合であるが、またはＹはＥ−Ｒで
   あり、ここでＲはｃ　−ｃ１０ の分枝鎖または分枝鎖のないアルキルであり、Ｚａ　は
   塩素、臭素または沃素であり、Ｅは０．ＮＨまたは非環
   式の二価硫黄原子であり、 Ｊ−。 ｎｅｔ　はビオチンまたは置換もしくは未置換の金属キ
   レート化剤または金属キレート化剤を生成しうる化合物
   からなる検出しうる化学成分であり、かつ ｍは１乃至Ａ３　に対する改変反応基の全個数の整数で
   ある ことを特徴とする検出可能な分子。 （２）金属キレート化剤が式： を有するかまたはその４−ヒドロキシもしくはアシルオ
   キシ誘導体であり、Ｒ３はＣ−Ｃ４アルキルであるかま
   たはＣＨ２−ｃｏｏＭであり、各Ｍは金属もしくは非金
   属陽イオンであることを特徴とする特許請求の範囲第１
   項記載の分子。 よりなる化合物の群から選択されることを特徴とする特
   許請求の範囲第１項記載の分子。 （４）　Ｄｅｔｂが式： および式： よりなる化合物の群から選択されることを特徴とする特
   許請求の範囲第２項記載の分子。 （５）式： ％式％ を有し、Ａ　は約２０００未満の分子量を有する化合物
   であって、単糖類もしくはモノヌクレオチドでなく、 ｎｅｔはビオチンまたは置換もしくは未置換の金属キレ
   ート化剤または金属キレート化剤を生成しうる化合物か
   らなる検出可能な化学成分であり、「・・・」はＡ　と
   ｎｅｔ’との間の共有結合を示すことを特徴とする検出
   可能な分子。 （６）　式： を有し、Ａ　はＡ　または重合体であり、Ａ２と重合体
   との両者はアミノおよび活性炭素を有する残基よりなる
   群から選択される少なくとも１個の改変しうる反応基を
   有し、 Ｚｂ　は塩素もしくは臭素であり、 ｍは１乃至Ａ３　における改変反応基の全個数の整数で
   ある ことを特徴とする分子。 （７）式： を有する化合物またはその４−ヒドロキシもしくはアシ
   ルオキシ誘導体であって、Ｒ３はｃ、−Ｃ４アルキルで
   あるかまたはＣＨ２Ｃ００Ｍであり、各Ｍは金属もしく
   は非金属陽イオンであり、 Ｓは二価硫黄原子であり、 Ｃ２ばＨ１分枝鎖もしくは分枝鎖のないＣ４−Ｃ７゜ア
   ルキルもしくはアラルキルであってＯＨ，ＳＨ，ＮＨ２
   ，ＣＯＮＨＮＨ２またはＣ−ＬＶよりなる群から選択さ
   れる少なくとも１間の基を有し、ここでＬＶはＷ換しう
   る残基であり、またはＱ　は式： を有し、ここでＺ。は水素、塩素もしくは臭素であり、
   かつＪはＮＨまたばＮ２ＣＡ−であり、ここでＣＡ−は
   対応陰イオンであることを特徴とする化合物。 （８）式： ） ） よりなる群から選ＩＲされることを特徴とする特許請求
   の範囲第７項記載の化合物。 （９）式： を有する化合物またはその金属もしくは非金属陽イオン
   塩またはＣ，−Ｃ，。アルキルエステルもしくはアミド
   。 を有する化合物またはその金属もしくは非金属カチオン
   塩。 （１１）式： ％式％ であるか、またはその金属もしくは非金属塩であり、 １ Ｑ　はＨまたはＨＯであり、 ＢＡは改変しうるプリンもしくはピリミジン塩基であり
   、 よりなる群から選択され、 Ｒは式： であるか、またはＣ，−Ｃ，ｏの分枝鎖もしくは分枝鎖
   のないアルキルもしくはアラルキル基であってＯＨによ
   り置換することができ、ＹはＳに対する直接結合である
   か、またばＹは５−Ｒ２であり、ここでＲ２はＣ７−Ｃ
   １゜の分枝鎖もしくは分枝鎖のないアルキルであり、 Ｚａ　は塩素、臭素もしくは沃素であり、Ｓは非環式の
   二価硫黄原子であり、 ｎｅｔはビオチンまたは式； の金属キレート化剤からなる検出しうる化学成分または
   その４−ヒドロキシもしくはアシルオキシ誘導体であり
   、ここでＲ３はＣ−ＣアルキルもしくはＣＨ２Ｃ００Ｍ
   であり、各Ｍは金属もしくは非金属陽イオンであること
   を特徴とする化合物。 （１２）式： ％式％ であるか、またはその金属もしくは非金属塩であり、 Ｑ　ばＨまたはＨＯであり、 ＢＡは改変しうるプリンもしくはピリミジン塩基である
   ことを特徴とする化合物。 （１３）式： を有する化合物またはその金属もしくは非金属塩または
   Ｃ７−Ｃ１ｏアルキルエステルもしくばアミド。 １４）ビオポリマーを改変しかつそこに塩素もしくは臭
   素基を導入する方法において、前記ビオポリマーはジア
   ゾ化合物と結合しうる活性炭素からなる少なくとも１個
   の残基を有し、結合条件下で前記ビオポリマーを式： 〔式中、ＣＡ−は適当な不活性対応陰イオンであり、か
   つｚｂ　は塩素もしくは臭素である〕のジアゾ化合物と
   反応させることを特徴とする方法。 （１５）Ｍが放射性金属であることを特徴とする特許請
   求の範囲第２項記載の分子を使用する放射能標識した分
   子を用いる分析法。 （１６）動物生息地に局部的に存在する放射性金属から
   放出される照射線を動物生息地に照射し、前記放射性金
   属は特許請求の範囲第１項記載の分子における位置Ａ３
   　にてモノクローナル抗体によりキレート化され、かつ
   キレート化剤を放射性金属にキレート化させることを特
   徴とする照射治療法。 （１７）式（■）： の化合物をヒドロキシ臭素化することを特徴とする、式
   （Ｉ）： の化合物またはその金属もしくは非金属塩の製造方法。 を有し、Ａ４　はＡ２　または重合体であり、Ａ２と重
   合体との両者はアミノ、アリール、イミダゾイルおよび
   活性炭素を含む残基よりなる群から選択される少なくと
   も１個の改変しうる反応基を有し、 Ａ２　は約２０００未満の分子量を有する化学実体であ
   り、 ｊは電子吸引基であり、 Ｋは信号発生特性を有するか、または固体マトリックス
   であり、 ｒは１〜約２の整数であり、