DE4101394A1 - Verfahren zum koppeln von kohlenhydraten an traeger, insbesondere proteine - Google Patents

Verfahren zum koppeln von kohlenhydraten an traeger, insbesondere proteine

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Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Koppeln von Kohlenhy­ draten, die über eine freie oder halbacetalisch gebundene Alde­ hydgruppe verfügen, an Träger, insbesondere Proteine.
Häufig besteht der Wunsch danach, Kohlenhydrate oder Kohlen­ hydratstrukturen an einen Träger koppeln zu können. Bei diesem Träger handelt es sich beispielsweise um Proteine.
Bei den bisher bekannten Verfahren sind die Ausbeuten jedoch ge­ ring. Zudem ist die Auftrennung der erhaltenen Komponenten häu­ fig schwierig. Es besteht daher derzeit noch kein effizientes und einfach durchzuführendes Verfahren zur Anbindung von Kohlen­ hydraten oder von eine Kohlenhydrateinheit aufweisenden Verbindungen an Proteine und andere Träger.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein einfaches Kopp­ lungsverfahren zur Anbindung von Kohlenhydraten oder Kohlen­ hydratstrukturen an Proteine und andere Träger bereitzustellen.
Gelöst wird diese Aufgabe durch die Lehre des Anspruchs 1.
Der Kern des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht darin, daß man ein Kohlenhydrat oder eine Verbindung, die eine Kohlenhydrat­ einheit besitzt, welche über eine freie oder halbacetalisch gebundene Aldehydgruppe verfügt, einsetzt und daß man dieses Kohlenhydrat mit einer sowohl eine Thiol-Gruppe als auch eine Amino-Gruppe tragenden, organischen Verbindung unter reduktiver Aminierung der Aldehydgruppe umsetzt. Mit anderen Worten, beim erfindungsgemäßen Verfahren wird die genannte Aldehydgruppe durch die Amino-Gruppe der sowohl eine Thiol-Gruppe als auch eine Amino-Gruppe tragenden organischen Verbindung reduktiv aminiert.
Auf diese Weise wird die sowohl eine Thiol-Gruppe als auch eine Amino-Gruppe tragende organische Verbindung in das Kohlenhydrat eingeführt und kann (wird später erläutert) als Kopplungsglied dieses Kohlenhydrats an den Träger dienen.
Das der ersten Stufe des erfindungsgemäßen Verfahrens zugrunde­ liegende Reaktionsprinzip wird anhand des nachfolgenden Schemas näher erläutert, wobei als organische Verbindung, die sowohl eine Thiol-Gruppe als auch eine Amino-Gruppe trägt und als Kopplungsglied fungiert, Cysteamin eingesetzt wird. Dies geschieht lediglich aus Zwecken der einfacheren Darstellbarkeit und soll keine Beschränkung darstellen.
Auf diese Weise wird in das Kohlenhydrat eine freie -SH-Gruppe eingeführt.
Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren kann eine Thiol-Gruppe nicht nur in "normale" Kohlenhydrate, beispielsweise Monosaccharide, Disaccharide und Oligosaccharide, sondern in alle solche Verbin­ dungen eingeführt werden, die eine Kohlenhydratstruktur be­ sitzen, sofern das Kohlenhydrat oder die Kohlenhydratstruktur bzw. -einheit eine freie oder halbacetalisch gebundene Aldehyd­ gruppe besitzt. Diese Aldehydgruppe kann sich im übrigen auch in einer Seitenkette des Kohlenhydrats befinden. Auch kann diese Aldehydgruppe eingeführt sein, beispielsweise durch Oxidation. Entscheidend ist lediglich, daß diese Aldehydgruppe in der Lage ist, durch die Amino-Gruppe der als Kopplungsglied eingesetzten Verbindung reduktiv aminiert zu werden, wobei sich eine C-N- Bindung bildet.
Als Verbindungen, die als Kopplungsglied fungieren können und sowohl eine Thiol-Gruppe als auch eine Amino-Gruppe tragen, kön­ nen die vielfältigsten Verbindungen eingesetzt werden. Dies hat seine Ursache darin, daß die organische Moleküleinheit zwischen der Amino-Gruppe und der Thiol-Gruppe lediglich als Spacerein­ heit oder als "Abstandseinheit" dient. Zweckmäßigerweise setzt man eine möglichst inerte Spacereinheit (beispielsweise eine Alkylengruppe mit 1 bis 20, insbesondere 2 bis 6 Kohlenstoffato­ men) ein. Die Spacereinheit kann jedoch auch eine oder mehrere funktionelle Gruppen tragen. Diese sollten natürlich die bei dem erfindungsgemäßen Verfahren stattfindenden Reaktionen nicht stören.
Es ist im übrigen auch möglich, ein Dimeres der als Kopplungs­ glied dienenden Verbindung zur Anwendung zu bringen. In diesem Fall haben die beiden Thiol-Gruppen von zwei derartigen Verbin­ dungen eine Disulfidbrücke gebildet, die im Anschluß an die reduktive Aminierung aufgespalten wird.
Vorzugsweise setzt man im übrigen Cysteamin ein.
Die erste Stufe des erfindungsgemäßen Verfahrens führt man zweckmäßigerweise in einem Lösungsmittel durch, in dem das Koh­ lenhydrat löslich ist.
Es darf an dieser Stelle darauf hingewiesen werden, daß der Aus­ druck "Kohlenhydrat" sofern er im Rahmen der allgemeinen Ausfüh­ rungen in Alleinstellung verwendet wird, nicht nur ein "richtiges" Kohlenhydrat, sondern auch die oben näher erläuter­ ten kohlenhydrathaltigen Strukturen etc. bezeichnet.
Als Lösungsmittel finden zweckmäßigerweise Wasser und Methanol sowie Gemische daraus Anwendung.
Die reduktive Aminierung kann man unter Verwendung von Natrium­ borhydrid und bevorzugt von Natriumcyanborhydrid durchführen.
In der zweiten Stufe des erfindungsgemäßen Verfahrens wird das in der ersten Stufe erhaltene Kohlenhydrat-Kopplungsglied-Konju­ gat über die eingeführte freie Thiol-Gruppe (SH-Gruppe) mit einem kopplungsfähigen Träger umgesetzt und dadurch daran gekop­ pelt. Der Träger muß dabei in der Lage sein, mit der Thiol- Gruppe des Kohlenhydrat-Kopplungsglied-Konjugates eine Disulfid­ brücke oder eine Thioetherbrücke auszubilden, so daß eine kova­ lente Bindung gebildet wird. Dies wird in dem nachfolgenden Schema exemplarisch dargestellt:
Die Reste R1-R4 im obigen Schema können beliebiger Natur sein.
Die Kopplung von Trägern über Thiol-Gruppen und auch die Modifi­ zierung von Trägermolekülen, so daß sie mit Thiol-Gruppen kop­ peln können, ist im übrigen bekannt. Eine Übersicht über derar­ tige Kopplungsreaktionen findet sich beispielsweise in Methods in Enzymology, Vol. 91 (Academic Press 1983), Seiten 580 bis 609.
In dem oben gezeigten Schema entstand durch die Kopplung aus der Thiol-Gruppe des Kohlenhydrat-Kopplungslieds-Konjugats und der Thiol-Gruppe des Trägers eine Disulfidbrücke. Es gibt nun zahl­ reiche Möglichkeiten, eine derartige Kopplung unter Ausbildung einer Disulfidbrücke vorzunehmen.
So ist es beispielsweise möglich, Träger mit N-Succinimidyl-3­ (2-Pyridyldithio)propionat (SPDP) zu aktivieren. Die aktivierte Verbindung wird dann mit einem erfindungsgemäß erhältlich, eine Thiol-Gruppe aufweisenden Kohlenhydrat-Kopplungsglied-Konjugat umgesetzt. Dies ist im nachstehenden Schema erläutert: Die oben beschriebene Aktivierung eines Trägers mit SPDP ist im übrigen in der in den nachstehenden Beispielen angeführten Literaturstelle von J. Carlsson (1978) näher erläutert.
Auch ist es möglich, die Thiol-Gruppe des Kohlenhydrat-Kopp­ lungsglied-Konjugats mit 2-Dipyridyl-disulfid oder 4-Dipyridyl­ disulfid zu aktivieren und dann mit einem eine Thiol-Gruppe tra­ genden Träger umzusetzen gemäß dem nachstehenden Schema:
Die oben beschriebene Aktivierung eines Trägers mit SPDP ist im übrigen in der in den nachstehenden Beispielen angeführten Literaturstelle von J. Carlsson (1978) näher erläutert.
Auch ist es möglich, die Thiol-Gruppe des Kohlenhydrat-Kopp­ lungs-Konjugats mit 2-Diyridyl-disulfid oder 4-Dipyridyldisulfid zu aktivieren und dann mit einem eine Thio-Gruppe tragenden Träger umzusetzen gemäß dem nachstehenden Schema:
Es ist auch möglich, einen Träger einzusetzen, der eine Malein­ imideinheit enthält bzw. in den eine derartige Einheit einge­ führt worden ist. Bei der Umsetzung mit dem eine Thiol-Gruppe enthaltenden Kohlenhydrat-Kopplungsglied-Konjugat findet dabei folgende Reaktion statt, die eine Art Michael-Addtion darstellt:
In diesem Fall wird somit eine Thioetherbrücke ausgebildet.
Eine Thioetherbrücke bildet sich auch, wenn man das erfindungs­ gemäß erhältliche Kohlenhydrat-Kopplungsglied-Konjugat mit einem Träger umsetzt, der durch die Thiol-Gruppe substituiert wird. Das nachfolgende Schema zeigt diesen Reaktionstyp anhand eines eine Jodacetylgruppe tragenden Trägers:
KH-NH-CH₂-CH₂-SH + I-CH₂-C(O)-Träger
→ KH-NH-CH₂-CH₂-S-CH₂-C(O)-Träger + HI
Auch die zweite Stufe des erfindungsgemäßen Verfahrens wird vor­ zugsweise in einem Lösungsmittel, beispielsweise einer wäßrigen Pufferlösung, durchgeführt.
Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht es somit, einerseits Kohlenhydrate derart zu modifizieren, daß sie eine zur Kopplung fähige Thiol-Gruppe aufweisen, und andererseits ein derart modi­ fiziertes Kohlenhydrat an Träger zu koppeln.
Bei den Trägern kann es sich beispielsweise um Proteine handeln. Diese Proteine mit einem darauf gekoppelten Kohlenhydrat können für Immunisierungszwecke eingesetzt werden. Dabei werden Anti­ körper unter anderem gegen die Kohlenhydrate gebildet, die man gewünschtenfalls isolieren kann.
Die entsprechenden Immunisierungsverfahren und Verfahren zur Gewinnung und Isolierung von Antikörpern sind üblicher Natur.
Träger, auf die mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens ein Kohlenhydrat gekoppelt wurde, können auch für die Affinitäts­ chromatographie eingesetzt werden, beispielsweise zur Isolierung und Reinigung von an Kohlenhydrate bindenden Proteinen.
Eine andere Anwendungsmöglichkeit besteht darin, erfindungsgemäß mit einem Kohlenhydrat gekoppelte, markierte Träger zur Lokali­ sierung von Kohlenhydrat-bindenden Molekülen einzusetzen. So kann man beispielsweise ein erfindungsgemäß erhältliches Konju­ gat mit einem Maleinimid-Biotin-Konjugat koppeln und auf diese Weise kohlenhydratbindende Proteine mit Hilfe von Avidin-Enzym- Konjugaten detektieren. Diese Biotin-Konjugate können ferner in der biochemischen Analytik (Lecthin-Detektion) und in der Patho­ biochemie (Suche von Tumorzellen über tumorspezifische Lecthine) Anwendung finden. Statt Biotin können auch andere Marker verwen­ det werden.
Erfindungsgemäß können somit Kohlenhydrate an die verschieden­ sten Proteine und für die verschiedensten Zwecke gekoppelt wer­ den.
Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren können auch Kohlenhydrat­ ketten in rekombinant hergestellte Protein-Moleküle eingeführt werden.
Erfindungsgemäß ist es auch möglich, eine eine Thiol-Gruppe auf­ weisende und als Kopplungsglied dienende Verbindung in Ganglio­ side einzuführen und diese so modifizierten Ganglioside an Trägerproteine gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren zu koppeln.
Beispiele 1. Stufe
Reduktive Aminierung von Kohlenhydraten mit Cysteamin (beschrieben am Beispiel von Neuraminyl-Lactose).
Man löst 2,38 mg Neuraminyl-Lactose-Ammoniumsalz (3,66 µmol), 64 mg Cysteamin-HCl (571 µmol) und 9 mg NaCNBH3 (144 µmol) in 3 ml absolutem Methanol und erhitzt am Rückfluß. Man hält den pH-Wert der Lösung während der Reaktion bei 4 bis 5, wobei man den pH- Wert erforderlichenfalls mit 100%iger Essigsäure (Kontrolle mit Indikatorpapier) einstellt. Nach 1,5 h gibt man weitere 7 mg NaCNBH3 (112 µmol) in 0,5 ml Methanol gelöst zu. Nach 4 h engt man den Ansatz im Rotationsverdampfer im Vakuum zur Trockne ein.
Das so erhaltene Neuraminyl-Lactose-Cysteamin-Konjugat reinigt man anschließend mittels Kieselgelchromatographie. Dazu suspen­ diert man Kieselgel 60 im Laufmittel 1 (Chloroform : Methanol : Wasser = 25 : 20 : 4 (V/V)) und füllt es in eine Glassäule mit Glas­ fritte (Durchmesser 0,8 cm) bis zu einer Gelhöhe von ca. 18 cm. Den zur Trockne eingedampften Reaktionsansatz löst man in 0,2 ml Wasser und gibt ihn auf die Säule. Man eluiert die Säule mit Laufmittel 1 und sammelt Fraktionen zu 1 ml. Die erhaltenen Fraktionen untersucht man dünnschichtchromatographisch (DC- System - DC-Platten: Kieselgel 60-HPTLC; Laufmittel: 32%ige Ammoniaklösung : Ethanol = 40 : 60). Die DC-Detektion führt man durch, indem man die DC-Platten nach der Chromatographie zunächst mit einem thiolspezifischen Detektionsmittel besprüht (8 mg Ellmans-Reagens/10 ml 0,1 mol/1 Natriumphosphatpuffer, pH 8), danach kurz erhitzt und anschließend mit Resorcinol-Lösung besprüht.
Als erste Fraktion eluiert man Cysteamin, dann Natriumcyanborhy­ drid und schließlich nicht umgesetzte Neuraminyl-Lactose. Sobald man diese Komponenten dünnschichtchromatographisch im Eluat nicht mehr nachweisen kann (nach einem Elutionsvolumen von ca. 20 ml), stellt man auf Laufmittel 2 (32%ige Ammoniaklösung : Methanol = 40 : 60) um und eluiert die Säule damit. Unter diesen Elutionsbedingungen eluiert man reines Neuraminyl-Lactose- Cysteamin-Konjugat von der Säule. Man vereint die betreffenden Fraktionen und engt mit Hilfe eines Rotationsverdampfers im Vakuum ein. Den Rückstand löst man zur Abtrennung störender Ionen in 1 ml 0,1 mol/l Natriumphosphatpuffer, pH 8, und ver­ setzt mit etwas Dithiothreit (um die Cysteaminkonjugate im redu­ zierten Zustand zu erhalten). Anschließend eluiert man mit Was­ ser über eine Sephadex G-10 Säule (Durchmesser: 1 cm; Länge: 18 cm). Die Fraktionen untersucht man ebenfalls dünnschichtchro­ matographisch (DC-System wie oben beschrieben) und vereint die entsprechenden Fraktionen und lyophilisiert.
Zur Ausbeutebestimmung quantifiziert man das Lyophilisat, indem man mit Hilfe des Resorcinol-Tests die Anzahl von Sialinsäure und mit Hilfe von Ellmans-Reagens die Anzahl von Thiol-Gruppen bestimmt. Es ergibt sich ein Wert von 1,53 µmol für Sialinsäure und 1,45 µmol für Thiol; Gesamtausbeute 40% bezogen auf Thiol.
2. Stufe
Kopplung des in der ersten Stufe erhaltenen Kohlenhydrat- Cysteamin-Konjugats an Träger (dargestellt am Beispiel von Neuraminyllactose-Cysteamin und bovinem Serumalbumin).
Man setzt bovines Serumalbumin (BSA) mit SPDP (J. Carlsson et al. (1978) Biochem. J. 173, 723-737; Protein Thiolation and Reversible Protein-Protein Conjugation, N-Succinimidyl 3-(2- Pyridyldithio) propionate, a new heterobiofunctional reagent; SPDP) um, so daß etwa 20 SPDP-Moleküle an 1 BSA-Molekül gebunden werden.
Zur Kopplung des Kohlenhydrat-Cysteamin-Konjugats an BSA ver­ fährt man wie folgt: man löst 0,43 mg Neuraminyl-Lactose- Cysteamin-Konjugat und 1 mg BSA-SPDP in 0,7 ml Puffer (0,1 mol/l Phosphatpuffer; pH 7,5; enthält 0,1 mol/l NaCl; molares Ver­ hältnis von Neuraminyl-Lactose-Cysteamin-Konjugat zu BSA = 40:1) und inkubiert 18 h bei 37°C. Danach gibt man den Reaktionsan­ satz auf eine Sephadex G-100 Säule (2 cm·17 cm) und eluiert mit Wasser. Man sammelt Fraktionen von 1 ml. Die Elution ver­ folgt man dünnschichtchromatographisch und über die Extinktion bei 280 nm. Man eluiert das Kohlenhydrat-Cysteamin-BSA-Konjugat im Ausschlußvolumen der Säule, gut abgetrennt vom restlichen nicht umgesetzten Kohlenhydrat-Cysteamin-Konjugat, das man für eine weitere Kopplung je nach Bedarf verwenden kann.
Das Produkt wurde anschließend hinsichtlich des molaren Verhält­ nisses von Sialinsäure zu Albumin mit Hilfe des Resorcinol-Tests bzw. durch Messung der Absorption bei 280 nm (unter Berücksich­ tigung von nicht umgesetzten SPDP-Gruppen) analysiert. Es ergab sich ein Wert von 16 Sialinsäure-Resten pro BSA-Molekül sowie von 4 am BSA-Molekül noch verbleibenden, nicht umgesetzten SPDP- Gruppen.
Gemäß dem oben beschriebenen Beispiel ist es auch möglich, Lac­ tose an den Träger zu koppeln. Dabei setzt man 10 mg Lactose (entspricht 27,8 µMol), 142 mg Cysteamin (entspricht 1270 µMol), 10 mg NaCNBH3 (entspricht 160 µMol) ein. Man arbeitet dabei in 3 ml H2O bei pH ca. 5. Man erhitzt dabei 4 h bis ca. 80°C am Rück­ fluß, wobei man den pH-Wert bei 4 bis 5 hält. Die Aufarbeitung erfolgt wie bei der in der zweiten Stufe im obigen Beispiel beschriebenen Aufarbeitung der Neuraminyllactose. Die Ausbeute beträgt ca. 50%. Die Kopplung an den Träger erfolgt dann wie oben für Neuraminyl-Lactose beschrieben.

Claims (9)

1. Verfahren zum Koppeln von Kohlenhydraten oder von Verbin­ dungen, die eine Kohlenhydrateinheit enthalten, an Träger, insbesondere Proteine, dadurch gekennzeichnet, daß man in einer ersten Stufe ein Kohlenhydrat, das über eine freie oder halbacetalisch gebundene Aldehydgruppe verfügt, oder eine eine derartige Kohlenhydrateinheit enthaltende Verbin­ dung einsetzt und mit einer eine Thiol-Gruppe und eine Amino-Gruppe tragenden, organischen, als Kopplungsglied fungierenden Verbindung unter reduktiver Aminierung der Aldehydgruppe durch diese Amino-Gruppe umsetzt, wobei ein Kohlenhydrat-Kopplungsglied-Konjugat gebildet wird, und in einer zweiten Stufe dieses so gebildete Konjugat mit einem kopplungsfähigen Träger zur Reaktion bringt, so daß das Konjugat über seine Thiol-Gruppe unter Ausbildung einer Disulfidbrücke oder einer Thioetherbrücke kovalent an den Träger gebunden wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man in der ersten Stufe eine Verbindung der folgenden allgemeinen Formel I: H₂N-[----]-SH (I)worin [----] eine divalente organische Molküleinheit bedeu­ tet, die sowohl die Amino-Gruppe als auch die Thiol-Guppe trägt und als Spacereinheit dient, oder ein Dimeres davon als als Kopplungsglied fungierende Verbindung einsetzt.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Verbindung der allgemeinen Formel I einsetzt, worin die Moleküleinheit der Formel [----] eine ver­ zweigte oder gerade Alkylengruppe mit 1 bis 20 C-Atomen bedeutet oder für folgende allgemeine Formel steht: worin
x für einen Phenylenrest, -NH-NH-, -S-S-, -C(O)-O-, -C(O)-N-, -5(O)-, -5(O)2-, -C(OH, H)- oder -C(NH2,H)- steht und
n und m, die gleich oder verschieden sein können, für eine ganze Zahl von 0 (falls x = Phenylen) oder (ansonsten) von 1 bis 20 stehen, wobei die aus (CH2)m,n-Gruppen bestehenden Alkyleneinheiten gerade oder verzweigt sein können und wobei die terminale(n) Gruppen dieser Alkyleneinheiten eine CH3-Gruppe ist.
4. Verfahren nach Anspruch 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß man als Verbindung der allgemeinen Formel I Cysteamin einsetzt.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-4, dadurch gekennzeichnet, daß man die Umsetzung in der ersten Stufe in Gegenwart von Natriumcyanborhydrid (NaCNBH3) durchführt.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß man in der zweiten Stufe einen Träger einsetzt,
  • a) der mindestens eine Thiol- oder Disulfid-Gruppe tragt oder in den mindestens eine derartige Gruppe zuvor einge­ führt worden ist, so daß die Thiol-Gruppe des Konjugats zusammen mit der Thiol- oder Disulfid-Gruppe des Trägers eine Disulfidbrücke bildet
  • b) der eine Maleinimideinheit enthält und mit der Thiol- Gruppe des Konjugats in einer Art Michaeladdition eine Thioetherbrücke bildete, oder
  • c) der eine funktionelle Gruppe trägt, die durch die Thiolgruppe des Konjugats unter Bildung einer Thioether­ gruppe substituiert wird, wodurch durch das Konjugat kovalent an den Träger gekoppelt wird.
7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet,
daß man zur Durchführung des Verfahrensschrittes a) ent­ weder den Träger mit N-Succinimidyl-3-(2-pyridyl­ dithio)propionat (SPDP) aktiviert und dann mit dem eine Thiol-Gruppe tragenden Konjugat umsetzt oder
daß man das eine Thiol-Gruppe tragende Konjugat mit 2-(oder 4-)Dipyridyl-disulfid aktiviert und dann mit dem eine Thiol-Gruppe tragenden Träger umsetzt.
8. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß man zur Durchführung des Verfahrensschrittes c) einen Träger einsetzt, der eine Iodacetylgruppe trägt.
9. Verfahren zum Einführen einer eine Thiol-Gruppe tragenden organischen Verbindung in Kohlenhydrate oder in eine Kohlenhydrateinheit enthaltende Verbindungen, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Kohlenhydrat, das über eine freie oder halb­ acetalisch gebundene Aldehydgruppe verfügt, oder eine eine derartige Kohlenhydrateinheit enthaltende organische Ver­ bindung einsetzt und mit einer sowohl eine Thiol-Gruppe als auch eine Amino-Gruppe tragenden organischen Verbindung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4 unter reduktiver Aminie­ rung der Aldehydgruppe durch diese Amino-Gruppe, insbeson­ dere in Gegenwart von Natriumcyanborhydrid, umsetzt.
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