DE2808523C2 - - Google Patents

Info

Publication number
DE2808523C2
DE2808523C2 DE2808523A DE2808523A DE2808523C2 DE 2808523 C2 DE2808523 C2 DE 2808523C2 DE 2808523 A DE2808523 A DE 2808523A DE 2808523 A DE2808523 A DE 2808523A DE 2808523 C2 DE2808523 C2 DE 2808523C2
Authority
DE
Germany
Prior art keywords
radical
pyridyl
disulfide
reaction
formula
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired
Application number
DE2808523A
Other languages
English (en)
Other versions
DE2808523A1 (de
Inventor
Jan Per Erik Uppsala Se Carlsson
Rolf Erik Axel Verner Baelinge Se Axen
Haakan Nils Yngve Brunna Se Drevin
Goeran Einar Samuel Almunge Se Lindgren
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Cytiva Sweden AB
Original Assignee
Pharmacia Fine Chemicals AB
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Pharmacia Fine Chemicals AB filed Critical Pharmacia Fine Chemicals AB
Publication of DE2808523A1 publication Critical patent/DE2808523A1/de
Application granted granted Critical
Publication of DE2808523C2 publication Critical patent/DE2808523C2/de
Granted legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
    • C12N11/02—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier
    • C12N11/06—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier attached to the carrier via a bridging agent
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D213/00—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D213/02—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D213/04—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having no bond between the ring nitrogen atom and a non-ring member or having only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom
    • C07D213/60—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having no bond between the ring nitrogen atom and a non-ring member or having only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom with hetero atoms or with carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals, directly attached to ring carbon atoms
    • C07D213/62—Oxygen or sulfur atoms
    • C07D213/70—Sulfur atoms
    • C07D213/71—Sulfur atoms to which a second hetero atom is attached
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54353—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals with ligand attached to the carrier via a chemical coupling agent

Description

Die Erfindung betrifft die in den Patentansprüchen 1 bis 3 beschriebenen Pyridinverbindungen und die im Patentanspruch 4 beschriebene Verwendung dieser Verbindungen als bifunktionelle Kupplungsmittel und Thiolierungsmittel.
Die erfindungsgemäßen Pyridinverbindungen haben die allgemeine Formel
R¹-S-S-A-Z,
worin R¹ einen 2-Pyridylrest, 5-Nitro-2-pyridylrest oder den 4-Pyridylrest, A einen Kohlenwasserstoffrest mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, und Z einen Rest der Formeln
oder die Säureadditionssalze des letztgenannten Restes bedeuten, worin n 2 oder 3 ist, R¹ die gleiche Bedeutung wie vorstehend für R¹ angegeben besitzt und diesem gleich ist und R² einen Methylrest oder einen Ethylrest bedeutet.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen sind insbesondere als bifunktionelle Kupplungsmittel und als Thiolierungsmittel brauchbar.
Bei der Herstellung von Konjugaten aus zwei Substanzen, von welchen mindestens eine ein Protein oder ein Polypeptid ist, ist es bekannt, bifunktionelle Mittel zu verwenden, um die Komponenten des Konjugates kovalent zu kuppeln, wobei die Aminogruppen in den konjugierten Molekülen normalerweise zur Konjugierungsreaktion verwendet werden. Ein in diesem Zusammenhang verbreitetes Mittel ist Glutardialdehyd. Ein Protein oder ein Polypeptid enthält jedoch normalerweise mehr als eine Aminogruppe, während die Substanz, die die zweite Komponente des Konjugates ausmacht, ebenfalls mehr als eine Aminogruppe enthalten kann. Beim Kuppeln mit Glutardialdehyd und anderen bifunktionellen Mitteln, die Aminogruppen in den konjugierten Molekülen verwenden, werden zusätzlich zu der gewünschten Reaktion zur Bildung eines Konjugates von bestimmter Zusammensetzung (z. B. ein bimolekulares Konjugat, das nur ein einziges Molekül jeder Komponente enthält) ebenfalls Nebenreaktionen erhalten, welche zur intramolekularen Vernetzung im Protein oder im Polypeptid oder zur Bildung von Konjugaten mit zwei Molekülen der gleichen Komponente oder drei oder mehreren Molekülen von einer oder beiden Arten des Moleküls und in gewissen Fällen ebenfalls zur Polymerisation des Kupplungsmittels (z. B. wenn Glutardialdehyd verwendet wird) unter Bildung von Aggregaten, welche etwa die gleiche Größe wie die Konjugate besitzen, führen. Daher wird dort ein äußerst heterogenes Gemisch erhalten. Es ist lediglich durch Verwendung spezieller Reaktionsbedingungen und Reinigung des Reaktionsgemisches durch solche Abtrennmethoden, wie Affinitätschromatographie und Gelfiltration möglich, ein Konjugat mit zufriedenstellernder Einheitlichkeit und Reinheit zu erhalten, jedoch fordern diese Methoden erheblichen Arbeits- und Zeitaufwand. Darüber hinaus sind die Ausbeuten häufig sehr gering.
Erfindungsgemäß wurde eine neue Gruppe von Verbindungen gefunden, die als bifunktionelle Mittel zur Herstellung, unter milden Bedingungen, von relativ gleichförmigen sowohl Homo- als auch Heterokonjugaten bimolekularer oder oligomerer Natur verwendet werden können, ohne daß, wie im Falle der bekannten Mittel, Nebenreaktionen auftreten. Daher wird bei Verwendung der neuen erfindungsgemäßen Kupplungsmittel eine höhere Ausbeute des gewünschten Konjugates erhalten.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen können ebenfalls als Thiolierungsmittel für Thiolierung von Substanzen, welche Aminogruppen enthalten, verwendet werden. Dies ist besonders vorteilhaft in bezug auf makromolekulare Substanzen, die Aminogruppen enthalten und in wäßrigen Flüssigkeiten löslich sind, insbesondere Biopolymere und Derivate derselben, die Aminogruppen enthalten, hauptsächlich Proteine, Polypeptide und Polysaccharide oder Derivate derselben, die Aminogruppen enthalten.
Bei den erfindungsgemäßen Verbindungen bedeutet der Kohlenwasserstoffrest A vorzugsweise einen aliphatischen Rest, kann jedoch ebenfalls ein aromatischer Rest sein. A bedeutet z. B. einen gerad- oder verzweigkettigen Alkylenrest, z. B. -(CH₂) m -, worin m eine Zahl von 1 bis 10, vorzugsweise 1 bis 6, bedeutet, z. B. -CH₂-CH₂-.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen der Formel I können auf eine Anzahl von verschiedenen Wegen hergestellt werden. Die bevorzugten Methoden sind folgende:
Verbindungen der Formel I, worin Z einen Rest der Formel
bedeutet, werden durch Umsetzen eines Disulfides der Formel II
R¹-S-S-A-COOH (II)
worin R¹ und A die vorstehend angegebene Bedeutung besitzen, mit N-Hydroxysuccinimid, wenn n = 2 (oder die analoge Verbindung mit n = 3, wenn Verbindungen mit n = 3 gewünscht werden), in Gegenwart eines Kondensationsmittels hergestellt.
Die Reaktion wird in einem organischen Lösungsmittel bei einer Temperatur von 10-30°C durchgeführt. Ein geeignetes Lösungsmittel ist z. B. Methylenchlorid, Ethylenacetat und Dioxan. Die Reaktionszeit variiert mit der Wahl der Reaktionskomponenten und der Reaktionstemperatur.
Das verwendete Kondensationsmittel kann eines sein, welches gewöhnlich in Veresterungsreaktionen angewandt wird, z. B. N,N′-Dicyclohexylcarbodiimid.
Die Ausgangsverbindung der Formel II kann durch Umsetzen einer Mercaptoalkyl-carbonsäure der Formel III
HS-A-COOH (III)
mit einem Dipyridyl-disulfid der Formel IV
R¹-S-S-R¹, (IV)
worin A und R¹ die vorstehend angegebene Bedeutung besitzen, hergestellt werden.
Diese Reaktion wird in einem organischen Lösungsmittel bei einer Temperatur von 10-30°C durchgeführt. Ein geeignetes Lösungsmittel ist z. B. Ethanol, Ehtylacetat und Dioxan. Die Reaktionszeit variiert mit der Wahl der Reaktionskomponenten und der Reaktionstemperatur.
Die Verbindungen der Formel I, worin Z einen Rest der Formel
bedeutet, werden durch Umsetzen eines Disulfides der vorstehend angegebenen Formel II mit einem entsprechenden Thiopyridon in Gegenwart eines Kondensationsmittels in einem organischen Lösungsmittel bei einer anfänglich niederen Temperatur, z. B. -20°C über etwa ein bis zwei Stunden und anschließend bei Umgebungstemperatur (etwa +20°C) hergestellt. Ein geeignetes Lösungsmittel ist z. B. Methylenchlorid, Ethylacetat und Dioxan. Das verwendete Kondensationsmittel ist vorzugsweise N,N′-Dicyclo­ hexylcarbodiimid.
Das verwendete Ausgangsmaterial ist vorzugsweise ein Gemisch, das durch Umsetzen einer Verbindung der Formel III mit einer Verbindung der Formel IV erhalten wird.
Verbindungen der Formel I, worin Z einen Rest der Formel
bedeutet, werden durch Umsetzen eines Thiolimidates der Formel
worin R² und A die vorstehend angegebene Bedeutung besitzen, mit einem Pyridyldisulfid der Formel R¹-S-S-R¹, worin R¹ die vorstehend angegebene Bedeutung besitzt, in einem organischen Lösungsmittel hergestellt. Das Lösungsmittel kann z. B. Methanol sein, das etwa 10% Eisessig enthält.
Wenn die erfindungsgemäßen Verbindungen als bifunktionelle Kupplungsmittel verwendet werden, wird die folgende Methode angewandt. Zur Erläuterung wurden zwei Substanzen, von denen jede der Reaktion an mindestens einer Aminogruppe (z. B. Proteine und Peptide) zugänglich ist und die im allgemeinen als B₁-NH₂ und B₂-NH₂ bezeichnet werden können, zur Kupplung mit Hilfe von N-Succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)-propionat gemäß der vorliegenden Erfindung ausgewählt
Die beiden Substanzen werden zuerst jeweils mit dem Mittel gemäß folgenden Gleichungen umgesetzt.
und
Eines dieser Produkte, z. B. das Produkt von Stufe b) wird anschließend mit z. B. Dithiothreitol (DTT) in einem sauren Medium gemäß der folgenden Gleichung
reduziert.
Das so erhaltene Thiol wird anschließend mit dem Disulfid aus - in diesem Fall - Stufe a) gemäß der Gleichung d)
umgesetzt.
Die Stufen a) und b) werden in einer wäßrigen Lösung bei einem pH-Wert von 5-8, die 1-10 Vol.-% Methanol oder Ethanol enthält, bei einer Temperatur von normalerweise 20-25°C durchgeführt.
Stufe c) kann in einem wäßrigen Medium bei einem pH-Wert von 3-5 und einer Temperatur von normalerweise 20-25°C durchgeführt werden. Falls das modifizierte Molekül B₂ keine nativen Disulfid-Bindungen enthält, kann die Reduktion ebenfalls mit anderen Reduktionsmitteln und bei höheren pH-Werten, z. B. bis zu pH 8 bis 8,5 durchgeführt werden.
Stufe d) wird normalerweise in einem wäßrigen Medium bei pH 4 bis 8 und einer Temperatur von 20-25°C durchgeführt.
Wenn eine der Substanzen bereits eine reaktive Thiolgruppe (z. B. eine aliphatische Thiolgruppe), die der Reaktion zugänglich ist, enthält, können die vorstehend genannten Stufen b) und c) weggelassen werden.
Wenn ein bimolekulares Hetero-Konjugat gewünscht wird, sollten die beiden Substanzen nicht mehr als etwa monosubstituiert sein. Ge­ wünschtenfalls kann ein größeres Konjugat als ein bimolekulares durch Substituieren der beiden Substanzen mit mehr als einer Substituentengruppe pro Molekül hergestellt werden. Ein Erfordernis dafür ist natürlich, daß die Substanzen eine entsprechende Anzahl von Aminogruppen, die der Reaktion zugänglich sind, enthalten. Bei der Synthese von Oligo-Konjugaten (z. B. Tri- und Tetra-Konjugaten) sollte eine der Substanzen im allgemeinen nicht mehr als etwa monosubstituiert sein. Es ist ebenfalls möglich, Homo-Konjugate (d. h. B₁ = B₂) in der gleichen Art und Weise, wie vorstehend beschrieben, herzustellen.
Die Verwendung der erfindungsgemäßen Verbindungen als Thiolierungsmittel ist aus den vorstehenden Stufen b) und c) ersichtlich. Es ist besonders vorteilhaft in dieser Beziehung, daß die eingeführte Thiolgruppe in Pyridyldisulfidform geschützt ist. Auf diese Art und Weise werden während der Modifizierungsstufe und beim Lagern der modifizierten Substanz, z. B. modifiziertem Protein, unerwünschte Thiol-Disulfid-Austauschreaktionen zwischen der eingeführten Thiolgruppe und irgendwelchen Disulfid-Brücken, die in der Substanz vorliegen (z. B. wenn die Substanz ein Protein oder ein Polypeptid, die Disulfid-Brücken enthalten, ist) vermieden. Wenn es gewünscht wird, die R¹-S-S-Gruppe, die in die Substanz (z. B. Protein) eingeführt ist, in eine Thiol-Gruppe (HS-) zu überführen, kann dies durch selektive Reduktion ohne gleichzeitige Reduktion irgendeiner nativen Disulfid-Brücke, die in der Substanz vorliegen kann, bewirkt werden. Dies ist möglicherweise auf den Unterschied in der chemischen Reaktivität zwischen der R¹-S-S-Gruppe und z. B. den nativen aliphatischen Disulfid- Brücken in den Proteinen zurückzuführen.
Die Thiol-Disulfid-Austauschreaktionen gemäß den Stufen c) und d) erfordern, daß die Gruppe R¹ in der Verbindung der allgemeinen Formel I reduktiv zur Verbindung R¹-SH gespalten wird, die in die entsprechende Verbindung HR¹ = S tautomerisiert wird. Zusätzlich dazu, daß die Bedingung durch 2-Pyridyl- und 4-Pyridylgruppen erfüllt wird, wird die Bedingung ebenfalls durch entsprechende Gruppen, die mit einem Substituenten von solcher Art und in solcher Stellung substituiert sind, daß die Thiol-Thion- Tautomerie nicht gestört wird, erfüllt. Es wurde gefunden, daß die 5-Nitro-2-pyridyl-Gruppe zu diesen substituierten Pyridylgruppen gehört.
Die nachfolgenden Beispiele dienen der Erläuterung der vorliegenden Erfindung.
Beispiel 1 N-Succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)-propionat
1,9 g (8,6 mM) 2,2′-Dipyridyldisulfid wurden in 10 ml Ethylacetat gelöst. Zu dieser Lösung wurde innerhalb von 15 Minuten unter Rühren eine Lösung von 0,9 g (8,6 mM) 3-Mercaptopropionsäure in 10 ml Ethylacetat zugetropft und zur gleichen Zeit wurden 0,1 ml (2 Tropfen) Bortrifluoridetherat dem Reaktionsgemisch zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde 20 Stunden bei Raumtemperatur unter Rühren aufbewahrt und anschließend wurde das Reaktionsgemisch eingedampft (Büchi Rotavapor, <40°C) und der feste gelbe Rückstand wurde mit 10 ml (kaltem) (+40°C) Ethylacetat aufgeschlämmt und filtriert. Auf diese Art und Weise wurden etwa 90% 2-Thiopyridon (Schmelzpunkt 124-126°C, Lit. 128-130°C) erhalten. Die Ausbeute an 2-Carboxyethyl-(2-pyridyl)-disulfid betrug etwa 60%.
¹H-NMR δ(CDCl₃)
2,7-3,3 (4H, m, -CH₂-CH₂-),
0,68 g (5 mM) N-Hydroxysuccinimid wurden der Lösung zugesetzt, wonach innerhalb von 15 Minuten unter Rühren bei Raumtemperatur 1,03 g (5 mM) Dicyclohexylcarbodiimid, gelöst in 10 ml trockenem Ethylacetat, tropfenweise zugesetzt wurde. Die Reaktion wurde 5 Stunden bei Raumtemperatur unter Rühren fortgesetzt, wonach das Reaktionsgemisch auf +4°C gekühlt wurde und das ausgefällte Dicyclohexylcarbamid abfiltriert wurde. Die leicht gelbe Lösung wurde eingedampft und das Öl in Ethanol gelöst und bei -20°C kristallisiert. Die Ausbeute betrug 45%. Der Schmelzpunkt war 78,5-80,5°C.
¹H-NMR δ(CDCl₃)
3,12 (4H, s breit, -CH₂-CH₂-),
Analyse: C₁₂H₁₂N₂O₄S₂:
berechnet:C 46,14; H 3,83; N 8,97; S 20,53% gefunden:C 46,19; H 3,88; N 8,96; S 20,02%.
Beispiel 2 2-Thiopyridyl-3-(2-pyridyldithio)-propionat
1,9 g (8,6 mM) 2,2′-Dipyridyldisulfid wurden in 65 ml Ethylacetat gelöst. Zur gleichen Zeit, als 0,1 ml (2 Tropfen) Bortrifluoridetherat dem Reaktionsgemisch zugesetzt wurde, wurde innerhalb von 15 Minuten unter Rühren eine Lösung von 0,9 g (8,6 mM) 3-Mercaptopropionsäure in 10 ml Ethylacetat zugetropft. Nach 20stündigem Stehen bei Raumtemperatur wurde die Lösung auf -20°C gekühlt. Anschließend wurden 1.03 g (5 mM) Dicyclohexylcarbodiimid in 15 ml Ethylacetat gelöst und tropfenweise innerhalb von 15 Minuten unter starkem Rühren der Lösung zugesetzt. Die Reaktion wurde etwa 1 Stunde bei -20°C und anschließend über Nacht bei Raumtemperatur (etwa 20°C) fortgesetzt. Das redultierende Dicyclohexylcarbamid wurde abfiltriert und die Lösung wurde eingedampft (Büchi Rotavapor, <40°C). Anschließend wurden 10 ml kaltes (+4°C) Ethylacetat zugesetzt und das Gemisch erneut filriert, woraufhin das gesamte Dicyclohexylcarbamid entfernt werden konnte. Das Produkt wog 1,5 g; die Reinheit betrug etwa 90%.
¹H-NMR, δ(CDCl₃) 3,15 (4H, s breit, -CH₂-CH₂-),
Beispiel 3 Methyl-4-(2-pyridyldithio)-butyrimidat
20 mg (0,12 mM) Methyl-3-mercaptobutyrimidat-hydrochlorid, 26 mg (0,12 mM) 2,2′-Dipyridyldisulfid und 0,5 ml Eisessig wurden in 5 ml Methanol gelöst. Die Reaktion wurde durch ¹H-NMR verfolgt, und wenn das gesamte Imidat reagiert hatte (etwa 12 Stunden), wurde das Gemisch zur Trockne eingedampft. Die Analyse des Reaktionsgemisches mit Hilfe von ¹H-NMR (CD₃OD) zeigte eine Ausbeute von etwa 20%, bezogen auf Methyl-4-mercaptobutyrimidat.
Beispiel 4 N-Succinimidyl-2-(2-pyridyldithio)-propionat
Diese Verbindung wurde in der gleichen Weise wie das in Beispiel 1 beschriebene N-Succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)-propionat hergestellt, jedoch wurde die 3-Mercaptopropionsäure durch 2-Mercapto­ propionsäure ersetzt. Weiterhin wurde die Synthese in etwa 1/10-Maßstab durchgeführt. Das Produkt wurde durch ¹N-NMR analysiert:
Beispiel 5 N-Succinimidyl-3-(4-pyridyldithio)-propionat
Diese Verbindung wurde in der gleichen Art und Weise wie das in Beispiel 1 beschriebene N-Succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)-propionat hergestellt, jedoch wurde das 2,2′-Dipyridyldisulfid durch 4,4′- Dipyridyldisulfid ersetzt. Weiterhin wurde die Synthese in 1/10-Maßstab durchgeführt. Das Produkt wurde durch ¹H-NMR analysiert:
Beispiel 6 N-Succinimidyl-3-(5-nitro-2-pyridyldithio)-propionat
Diese Verbindung wurde in der gleichen Weise wie das in Beispiel 1 beschriebene N-Succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)-propionat hergestellt, wobei jedoch 2,2′-Dipyridyldisulfid durch Bis-(5-nitro- 2-pyridyl)-disulfid ersetzt wurde. Weiterhin wurde die Synthese in 1/10-Maßstab durchgeführt. Das Produkt wurde durch ¹H-NMR analysiert:
Beispiel 7 Verwendung der Verbindung von Beispiel 1 zur Thiolierung von α-Amylase
5 mg α-Amylase wurden in 0,5 ml 0,1 M Natriumphosphat-Puffer, pH 7,5 gelöst und 75 µm N-Succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)-propionat (34 mM in 99,5% Ethanol) wurden zugesetzt Nachdem das Gemisch kräftig geschüttelt worden war, wurde die Reaktion bei +23°C 40 Minuten fortgesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde an Sephadex® G-25 (Perlen aus Dextran, das mit Epichlorhydrin vernetzt ist) gelfiltriert (das verwendete Medium war 0,3 M Natriumphosphat-Puffer von pH 7,5). Das so erhaltene α-Amylase-pyridyldisulfid-Derivat wurde anschließend durch Zusatz ovn 50 µl 50 mM Dithiothreitol zu dem aus der Gelfiltration (1,5 ml) erhaltenen Material reduziert. Die Reduktion wurde 20 Minuten bei +23°C fortgesetzt. Überschüssiges Dithiothreitol und andere Komponenten mit niedrigem Molekulargewicht wurden durch Gelfiltration an Sephadex® G-25 entfernt (das verwendete Medium war 0,3 M NaCl). Die so thiolierte α-Amylase enthielt 0,75 Mol SH/Mol Protein.
Beispiel 8 Verwendung der Verbindung von Beispiel 1 zur Kupplung von Schaf-Antikaninchen-IgG-Antikörper an α-Amylase
a) Thiolierte α-Amylase wurde gemäß dem vorstehend beschriebenen Beispiel 7 hergestellt.
b) Schaf-Antikaninchen-IgG-Antikörper, die 2-Pyridyl-disulfidgruppen enthielten, wurden wie folgt hergestellt:
1,2 Schaf-Antikaninchen-IgG-Antikörper (hergestellt aus Schaf-Hyperimmunserum durch Immunosorbenzreinigung) wurden in 0,5 ml 0,1 M Natriumphosphat-Puffer vom pH 7,5 gelöst. 15 µl N-Succinimidyl-3- (2-pyridyldithio)-propionat (5,9 mM in Ehtanol) wurden zugesetzt. Nach kräftigem Schütteln der Lösung fand die Reaktion über 40 Minuten bei 23°C statt. Überschüssiges Reagenz und andere unerwünschte Komponenten mit niedrigem Molekulargewicht wurden durch Gelfiltration an Sephadex® G-25 (Perlen aus Dextran, das mit Epichlorhydrin vernetzt ist) entfernt (Medium 0,3 M Natriumchlorid).
Die so modifizierten Schaf-Antikaninchen-IgG-Antikörper enthielten, wie gefunden wurde, 2 Mol 2-Pyridyldisulfid-Gruppen pro Mol Protein
c) Schaf-Antikaninchen-IgG-Antikörper-α-Amylase-Konjugat wurde wie folgt hergestellt:
1,2 mg Schaf-Antikaninchen-IgG-Antikörper-2-pyridyldisulfid (8 mM Protein, enthaltend 17 nM 2-Pyridyldisulfid-Gruppen, das vorstehend unter b) erhalten wurde) in 1 ml 0,3 M Natriumchlorid wurden mit 5 mg thiolierter α-Amylase (100 nM, enthaltend 75 nM SH-Gruppen), die vorstehend unter a) hergestellt wurde, in 2 ml 0,3 M Natrium­ chlorid gemischt. 0,1 ml 0,1 M Natriumphosphat-Puffer vom pH 7,5 wurden zugesetzt und die Reaktion fand 18 Stunden bei +4°C statt.
Die Gelfiltration an Sephadex® G-200 des Reaktionsproduktes und die Analyse der Fraktionen zeigt, daß 80% der angewandten Antikörper konjugiert hatten. Das so gebildete Konjugat war im wesentlichen bimolekular. Geringere Mengen an tri- und tetramolekularem Material konnte ebenfalls beobachtet werden. Das Konjugat zeigte sowohl enzymatische als auch immunologische Aktivität. Fraktionen, die die Konjugate enthielten, wurden vereinigt und zu 290 µg (konjugierter Antikörper)/ml konzentriert und in 0,3 M Natriumchlorid bei +4°C gelagert.
2,5 mg Schaf-Antikaninchen-IgG-Antikörper (hergestellt aus Schafserum durch Ausfällung mit Natriumsulfat) wurden in 0,5 ml 0,1 M Natriumphosphat-Puffer vom pH 7,5 gelöst. 40 µl N-Succinimidyl-3- (2-pyridyldithio)-propionat (1,7 mM in 99,5% Ethanol) wurden zugesetzt. Nach kräftigem Schütteln des Gemisches wurde die Reaktion 40 Minuten bei +23°C fortgesetzt. Überschüssiger Reaktionsteilnehmer und andere unerwünschte Komponenten mit niedrigem Molekulargewicht wurden durch Gelfiltration an Sephadex® G-25 entfernt (das verwendete Medium war 0,1 M Natriumacetat-Puffer vom pH 5). Das so erhaltene Schaf-Antikaninchen-IgG-Antikörper-pyridyldisulfid-Derivat wurde anschließend durch Zusatz vom 50 µl 50 mM Dithiothreitol zu dem aus der Gelfiltration erhaltenen (void) Material (etwa 1,5 ml) reduziert. Die Reduktion wurde 30 Minuten bei +23°C fortgesetzt. Überschüssiges Dithiothreitol und andere Komponenten mit niedrigem Molekulargewicht wurden durch Gelfiltration an Sephadex® G-25 entfernt (das verwendete Medium war 0,3 M Natriumchlorid). Die so thiolierten Schaf-Antikaninchen-IgG- Antikörper enthielten 2 Mol SH pro Mol Protein.
Beispiel 9 Albumin, das 2-Pyridyldisulfid-Gruppen enthält
8 mg Humanserumalbumin in 1 ml 0,1 M Natriumphosphat-Puffer vom pH 7,5 wurden mit 12 µl N-Succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)-propionat (40 mM in 99,5% Ethanol) vermischt. Nach 40minütiger Reaktion bei +23°C wurde das Reaktionsgemisch an einer Säule von Sephadex® G-25 gelfiltriert (das verwendete Medium war der gleiche Phosphat-Puffer wie vorstehend beschrieben). Das erhaltene (void) Material, etwa 2 ml, enthielt das Albumin-2-pyridyldisulfid-Derivat. Eine spektrophotometrische Bestimmung der Menge an freigesetztem 2-Thiopyridon nach der Reduktion des Derivates zeigte, daß der Substitutionsgrad 2,5 Mol Thiol pro Mol Albumin betrug.

Claims (4)

1. Pyridinverbindungen der allgemeinen Formel R¹-S-S-A-Z,worin R¹ einen 2-Pyridylrest, 5-Nitro-2-pyridylrest oder einen 4-Pyridylrest, A einen Kohlenwasserstoffrest mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, und Z einen Rest der Formeln oder die Säureadditionssalze des letztgenannten Restes bedeuten, worin n 2 oder 3 ist, R¹ die gleiche Bedeutung wie vorstehend für R¹ angegeben besitzt und diesem gleich ist und R² einen Methylrest oder einen Ethylrest bedeutet.
2. Verbindung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß R¹ den 2-Pyridylrest, A -CH₂-CH₂- und Z den Rest bedeuten.
3. Verbindung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß R¹ den 2-Pyridylrest, A -CH₂-CH₂- und Z den Rest der Formel bedeuten.
4. Verwendung der Verbindungen gemäß den Ansprüchen 1 bis 3 als bifunktionelle Kupplungsmittel und Thiolierungsmittel.
DE19782808523 1977-03-04 1978-02-28 Neue pyridinverbindungen sowie deren verwendung Granted DE2808523A1 (de)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
SE7702462A SE430062B (sv) 1977-03-04 1977-03-04 Kopplings- eller tioleringsreagens

Publications (2)

Publication Number Publication Date
DE2808523A1 DE2808523A1 (de) 1978-09-07
DE2808523C2 true DE2808523C2 (de) 1987-11-19

Family

ID=20330623

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DE19782808523 Granted DE2808523A1 (de) 1977-03-04 1978-02-28 Neue pyridinverbindungen sowie deren verwendung

Country Status (6)

Country Link
US (1) US4149003A (de)
JP (2) JPS53130674A (de)
DE (1) DE2808523A1 (de)
FR (1) FR2382450A1 (de)
GB (1) GB1597756A (de)
SE (1) SE430062B (de)

Families Citing this family (50)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2430943A1 (fr) * 1978-07-13 1980-02-08 Toyo Jozo Kk Nouveaux derives disulfures
SE446184B (sv) * 1979-01-12 1986-08-18 Toyo Jozo Kk Polyfunktionell disulfidforening anvendbar som tverbindande medel
SE8003732L (sv) * 1980-05-19 1981-11-20 Pharmacia Diagnostics Ab Sett vid bestemningsmetoder involverande biospecifika affinitetsreaktioner
US4563304A (en) * 1981-02-27 1986-01-07 Pharmacia Fine Chemicals Ab Pyridine compounds modifying proteins, polypeptides or polysaccharides
SE8102194L (sv) * 1981-04-06 1982-10-07 Pharmacia Ab Terapeutiskt aktiv organisk forening och farmaceutisk beredning innehallande denna
SE8102193L (sv) * 1981-04-06 1982-10-07 Pharmacia Ab Terapeutiskt aktiv organisk forening och dess anvendning
US4433059A (en) * 1981-09-08 1984-02-21 Ortho Diagnostic Systems Inc. Double antibody conjugate
FR2522269A1 (fr) * 1982-02-26 1983-09-02 Pasteur Institut Agents antitumoraux, tels que la daunorubicine, a efficacite amelioree, leur obtention et procede pour augmenter l'efficacite des agents antitumoraux
FR2523445A1 (fr) * 1982-03-17 1983-09-23 Sanofi Sa Nouveaux conjugues associant, par liaison covalente, une enzyme et un anticorps, et associations medicamenteuses utilisant lesdits conjugues
US4614712A (en) * 1983-02-25 1986-09-30 The Upjohn Company Immunoassays with luciferase labeled ligands or receptors
SE8302758L (sv) * 1983-05-17 1984-11-18 Pharmacia Ab Sett for uppspjelkning av disulfidbindningar och derigenom erhallen forening
GB8334499D0 (en) * 1983-12-24 1984-02-01 Beecham Group Plc Derivatives
ATE107031T1 (de) * 1984-12-03 1994-06-15 Hoechst Celanese Corp Verfahren zur bestimmung eines liganden.
US4797491A (en) * 1986-03-17 1989-01-10 Cetus Corporation Compound 1-(3-(2-pyridyldithio)propionamido)-12-(5-hydrazidoglutaramido)-4,9-dioxadodecane
US4880935A (en) * 1986-07-11 1989-11-14 Icrf (Patents) Limited Heterobifunctional linking agents derived from N-succinimido-dithio-alpha methyl-methylene-benzoates
JPS6391563A (ja) * 1986-10-07 1988-04-22 Nitsusui Seiyaku Kk 細菌由来蛋白特異抗原の検査法
US4709037A (en) * 1987-02-17 1987-11-24 Hoechst Celanese Corporation Biotinylating agents
US4798795A (en) * 1987-02-17 1989-01-17 Hoechst Celanese Corporation Biotinylating agents
US4794082A (en) * 1987-02-17 1988-12-27 Hoechst Celanese Corporation Biotinylating agents
JPS63189278U (de) * 1987-05-28 1988-12-05
DE3809986A1 (de) * 1988-03-24 1989-10-05 Boehringer Mannheim Gmbh Verbindungen zur einfuehrung einer sh-gruppe in tyrosin
JPH0253770U (de) * 1988-10-12 1990-04-18
JP2619549B2 (ja) * 1989-06-29 1997-06-11 日本商事株式会社 抗原の定量法およびそれに用いる固相
US5137877B1 (en) * 1990-05-14 1996-01-30 Bristol Myers Squibb Co Bifunctional linking compounds conjugates and methods for their production
WO1992001938A1 (en) * 1990-07-20 1992-02-06 City Of Hope Derivatization of c-terminal proline
US5516703A (en) * 1993-08-20 1996-05-14 The University Of Utah Coating of hydrophobic surfaces to render them protein resistant while permitting covalent attachment of specific ligands
US6284503B1 (en) 1993-08-20 2001-09-04 University Of Utah Research Foundation Composition and method for regulating the adhesion of cells and biomolecules to hydrophobic surfaces
US20030176512A1 (en) * 1998-08-11 2003-09-18 Kirkpatrick D. Lynn Asymmetric disulfides and methods of using same
US6552060B1 (en) 1997-08-11 2003-04-22 Prolx Pharmaceuticals, Inc. Asymmetric disulfides and methods of using same
AR030612A1 (es) * 2000-09-12 2003-08-27 Smithkline Beecham Corp Procedimiento e intermedios
JP2006500364A (ja) * 2002-08-16 2006-01-05 イムノージェン インコーポレーテッド 高い反応性と溶解度を有する架橋剤および小分子薬物の標的化送達用コンジュゲートの調製におけるそれらの使用
CA2503490C (en) 2002-10-21 2012-04-03 Allvivo, Inc. Medical device surface coating comprising bioactive compound
US7858108B2 (en) 2003-10-21 2010-12-28 Richard Nagler Elutable surface coating
EP1778718B1 (de) * 2004-07-02 2014-10-08 Genentech, Inc. Iap-inhibitoren
AU2005314392B2 (en) 2004-12-09 2011-04-14 Centocor, Inc. Anti-integrin immunoconjugates, methods and uses
KR20120127754A (ko) 2004-12-20 2012-11-23 제넨테크, 인크. Ｉａｐ의 피롤리딘 억제제
US20110166319A1 (en) * 2005-02-11 2011-07-07 Immunogen, Inc. Process for preparing purified drug conjugates
WO2006086733A2 (en) * 2005-02-11 2006-08-17 Immunogen, Inc. Process for preparing maytansinoid antibody conjugates
ES2390826T3 (es) * 2005-08-24 2012-11-16 Immunogen Inc Procedimiento para preparar conjugados de fármaco purificados
NZ594746A (en) * 2005-12-19 2013-03-28 Genentech Inc Inhibitors of iap
US20070260041A1 (en) * 2006-05-03 2007-11-08 David Crich Allylic disulfide rearrangement and desulfurization method for the preparation of allylic sulfides
WO2008079735A1 (en) * 2006-12-19 2008-07-03 Genentech, Inc. Imidazopyridine inhibitors of iap
CN101687787A (zh) * 2007-04-30 2010-03-31 健泰科生物技术公司 Iap的抑制剂
JP2011509938A (ja) * 2008-01-11 2011-03-31 ジェネンテック， インコーポレイテッド Ｉａｐのインヒビター
CN102171209A (zh) 2008-08-02 2011-08-31 健泰科生物技术公司 Iap抑制剂
HUE043645T2 (hu) 2009-06-03 2019-08-28 Immunogen Inc Konjugációs módszerek
PL2691155T3 (pl) 2011-03-29 2019-06-28 Immunogen, Inc. Otrzymywanie koniugatu majtansynoidu przeciwciała jednoetapowym sposobem
US10035817B2 (en) 2012-10-04 2018-07-31 Immunogen, Inc. Method of purifying cell-binding agent-cytotoxic agent conjugates with a PVDF membrane
US9518017B2 (en) 2013-06-28 2016-12-13 Immunogen, Inc. Purification of intermediates used in the preparation of heterobifunctional linkers
KR102325753B1 (ko) 2019-12-20 2021-11-11 주식회사 포스코 흑색 도금 강판 및 그 제조방법

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US2872450A (en) * 1955-12-06 1959-02-03 Bayer Ag Thio- and dithio-carboxylic acid esters and a process for their manufacture
US3950348A (en) * 1971-12-30 1976-04-13 Merck & Co., Inc. Process for preparing e-pyridyl-4-methyloxycarbonyllysine

Also Published As

Publication number Publication date
JPS61191675A (ja) 1986-08-26
US4149003A (en) 1979-04-10
JPS6121227B2 (de) 1986-05-26
SE430062B (sv) 1983-10-17
DE2808523A1 (de) 1978-09-07
JPS624368B2 (de) 1987-01-30
JPS53130674A (en) 1978-11-14
GB1597756A (en) 1981-09-09
FR2382450A1 (fr) 1978-09-29
SE7702462L (sv) 1978-09-05
FR2382450B1 (de) 1982-11-05

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DE2808523C2 (de)
EP0618231B1 (de) Immunologisch aktive Konjugate und ein Verfahren zu ihrer Herstellung
US4563304A (en) Pyridine compounds modifying proteins, polypeptides or polysaccharides
EP1386158B1 (de) Gegenstand mit einer ungeladenen, funktionalisierten hydrogeloberfläche
DE2808476A1 (de) Reagens zur verwendung in immunochemischen untersuchungsmethoden
EP0618192B1 (de) Homobidentale, trifunktionelle Maleinimid-Linker, und ihre Verwendung in immunologisch aktiven Konjugaten
EP0371262A1 (de) Neue Digoxigenin-Derivate und ihre Verwendung
EP0632810B1 (de) Neues biotinylierungsreagenz
EP0451810B1 (de) Hapten-Biotin-Konjugate und ihre Verwendung
WO1990015798A1 (de) Aminoalkylmaleimide und davon abgeleitete hapten- und antigenderivate sowie konjugate mit peptiden oder proteinen
DE3629194A1 (de) Biotinylierungsreagentien
US4794082A (en) Biotinylating agents
EP0279365A1 (de) Biotin-Überträger
DE2914842C2 (de) N-(&amp;omega;-Diphenylhydantoinyl-alkyl)-7-&amp;beta;-D-galactosyl-cumarin-3-carboxamide
EP0410280A1 (de) Heterobifunktionelle Verbindungen
EP0326074A1 (de) Neue Haptenderivate und davon abgeleitete Hapten-Protein-Konjugate
DE60017083T2 (de) Einfaches verfahren zur herstellung von markierten konjugaten
DE19529250C1 (de) Hapten-Träger-Konjugate mit hoher, definierter Kopplungsrate
EP0049860A1 (de) Verfahren zur Herstellung von reaktiven, kupplungsfähigen Derivaten der Schilddrüsenhormone T3 und T4 und deren Verwendung
EP0303062B1 (de) Stabilisiertes Peroxidasepräparat
EP0442372A1 (de) Verbesserte markierte Haptene, Verfahren zu deren Herstellung sowie Verwendung dieser markierten Haptene in Immunoassays
DE4033714C2 (de)
DE19533867C1 (de) Als Verknüpfungsreagenzien einsetzbare dimaleinimidosubstituierte Dihydroxyalkane und Verfahren zu deren Herstellung
EP0578145B1 (de) Verbindungen und Verfahren für gezieltes Photoaffinitätslabeling von Biomolekülen
EP2246342B1 (de) Triacetontriperoxid-Derivat, Verfahren zu dessen Herstellung sowie dessen Verwendung

Legal Events

Date Code Title Description
8110 Request for examination paragraph 44
D2 Grant after examination
8364 No opposition during term of opposition
8339 Ceased/non-payment of the annual fee