DE2808523A1 - Neue pyridinverbindungen sowie deren verwendung - Google Patents

Neue pyridinverbindungen sowie deren verwendung

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DE2808523A1
DE2808523A1 DE19782808523 DE2808523A DE2808523A1 DE 2808523 A1 DE2808523 A1 DE 2808523A1 DE 19782808523 DE19782808523 DE 19782808523 DE 2808523 A DE2808523 A DE 2808523A DE 2808523 A1 DE2808523 A1 DE 2808523A1
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Description

Unsere Nr. 21 777 Ka/be
Pharmacia Pine Chemicals AB Uppsala, Schweden
Neue Pyridinverbindungen sowie deren Vervrendung
Die vorliegende Erfindung betrifft neue Pyridinverbindungen der allgemeinen Formel
R1--S-S-A-Z , -
worin R den 2-Pyridylrest, 5-Nitro-2-rpyridylrest oder den 4-Pyridylrest, A einen Kohlenwasserstoff rest mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, und Z einen Rest der Formeln
0 0 0 NH
/C Λ 12
-C-O-N (CH0) , -C-S-R oder -C-O-R ■ ν , ί η
oder die Säureadditionssalze des letztgenannten Restes, wobei
1 1
η 2 oder 3 ist, R die gleiche Bedeutung wie vorstehend für R angegeben besitzt und diesem gleich ist und R einen Methyloder einen Ethylrest bedeutet.
Die neuen erfindungsgemäßen Verbindungen sind insbesondere als bifunktionelle Kupplungsmittel und als Thiolierungsmittel' nützlich,
809836/0708
Bei der Herstellung von Konjugaten aus zwei Substanzen, von
bekannt, welchen mindestens eine ein Protein oder ein Polypeptid ist,ist es bifunktionelle Mittel zu verwenden, um die Komponenten des Konjugates kovalent zu kuppeln, wobei die Aminogruppen in den konjugierten Molekülen normalerweise zur Konjugierungsreaktion verwendet werden. Ein in.diesem Zusammenhang verbreitetes Mittel ist Glutardialdehyd. Ein Protein oder ein Polypeptid enthält jedoch normalerweise mehr als eine Aminogruppe, während die Substanz, die die zweite Komponente des Konjugates ausmacht, ebenfalls mehr als eine Aminogruppe enthalten, kann. Beim Kuppeln mit Glutardialdehyd und anderen bifunktionellen Mitteln, die Aminogruppen in■den konjugierten Molekülen verwenden, werden zusätzlich , zu der gewünschten Reaktion zur Bildung eines Konjugates von bestimmter Zusammensetzung (z.B. ein· bimolekulares Konjugat, das nur ein einziges Molekül jeder Komponente enthält) ebenfalls Nebenreaktionen erhalten, welche zur intramolekularen Vernetzung im Protein oder im Polypeptid oder zur Bildung von Konjugaten mit "·■> zwei Molekülen der gleichen Komponente oder drei oder mehreren Molekülen von einer oder beiden Arten des Moleküls und in gewissen Fällen ebenfalls zur Polymex-'isation des Kupplungsmittels (z.B. wenn Glutardialdehyd verwendet wird) unter Bildung von ; Aggregaten, welche etwa die gleiche Größe wie die Konjugate besitzen, führen.Daher wird dort ein äußerst heterogenes Gemisch erhalten. Es ist lediglich durch Verwendung spezieller Reaktionsbedingungen und Reinigung des Reaktionsgemisches durch solche Abtrennmethoden, wie Affinitätschromatographie und Gelfiltration möglich, ein Konjugat mit zufriedenstellender Einheitlichkeit und Reinheit zu erhalten, jedoch fordern diese Methoden erheb- ... liehen Arbeits- und Zeitaufwand. Darüber hinaus sind die Ausbeuten häufig sehr gering. . .
809836/0708
Erfindungsgemäß wurde eine neue Gruppe von Verbindungen gefunden, die als bifunktionelle Mittel zur Herstellung, unter milden Bedingungen,von relativ gleichförmigen sowohl Homoals auch Heterokonjugaten bimolekularer oder oligomerer Natur verwendet werden können, ohne daß, wie im Falle der bekannten Mittel, Nebenreaktionen auftreten. Daher wird bei Verwendung der neuen erfindungsgemäßen Kupplungsmittel eine höhere Ausbeute des gewünschten Konjugates erhalten.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen können ebenfalls als Thiolierungsmittel für Thiolierung von Substanzen, welche Aminogruppen enthalten, verwendet werden. Dies ist besonders vorteilhaft in Bezug auf makromolekulare Substanzen, die Aminogruppen enthalten und in wäßrigen Flüssigkeiten löslich sind, insbesondere Biopolymere und Derivate derselben, die Aminogruppen enthalten, hauptsächlich Proteine, Polypeptide und Polysaccharide oder Derivate derselben, die Aminogruppen enthalten.
Bei den erfindungsgemäßen Verbindungen bedeutet der Kohlenwasserstoff rest A vorzugsweise einen aliphatischen Rest, kann jedoch ebenfalls ein aromatischer Rest sein. A bedeutet z.B. einen gerad- oder verzweigtkettigen Alkylenrest, z.B. -(CHp) ~, worin m eine Zahl von 1 bis 10, vorzugsweise 1 bis 6,bedeutet, z.B. -CH2-CH2-.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen der Formel I können auf eine Anzahl von verschiedenen Wegen hergestellt werden. Die bevorzugten Methoden sind.folgende:
Verbindungen der Formel I, worin Z einen Rest der Formel
0 O;
It
-C-O-N'
O4
<0H2>n
109836/0701
bedeutet, werden durch Umsetzen eines Bisulfides der Formel II
R1-S-S-A-COOH .
worin R und A die vorstehend angegebene Bedeutung besitzen, mit N-Hydroxysuecinimid, wenn η = 2 (oder die analoge Verbindung mit η = 3, wenn Verbindungen mit η = 3 gewünscht werden),, in Gegenwart eines Kondensationsmittels hergestellt.
Die Reaktion wird in einem organischen Lösungsmittel bei einer Temperatur von 10 - 30°C durchgeführt. Ein geeignetes Lösungsmittel ist z.B. Methylenchlorid, Ethylenacetat und Dioxan. Die Reaktionszeit variiert mit der Wahl der Reaktionskomponenten und der Reaktionstemperatur.
Das verwendete Kondensationsmittel kann eines seins welches gewöhnlich in Veresterungsreaktionen angewandt wirds z.B. NjN'-Dicyclohexylcarbodiimid.
Die Ausgangsverbindung der Formel II kann durch Umsetzen einer Mercaptoalkyl-carbonsäure der Formel III
HS-A-COOH (III)
mit einem Dipyridyl-disulfid der Formel IV
R1--S-S-R1, (IV)
worin A und R die -vorstehend angegebene Bedeutung besitzen, hergestellt werden.
80983B/070·
Diese Reaktion wird in einem organischen Lösungsmittel bei einer Temperatur von 10 - 3O°C durchgeführt. Ein geeignetes Lösungsmittel ist a.B. Ethanol, Ethylacetat und Dioxan. Die Reaktionszeit variiert mit der Wahl der Reaktionskomponentenund der
Reaktionstemperatur.
Die Verbindungen der Formel I, worin Z einen Rest der Formel
ti
-C-S-R1
bedeutet, werden durch Umsetzen eines Disulfides der vorstehend angegebenen Formel II mit einem entsprechenden Thiopyridon in Gegenwart eines Kondensationsmittels in einem organischen Lösungsmittel bei einer anfänglich niederen Temperatur, z.B. ~20 C über etwa ein bis zwei Stunden und anschließend bei Umgebungstemperatur (etwa +200C) hergestellt. Ein geeignetes Lösungsmittel ist a.B. Methylenchlorid, Ethylacetat und Dioxan. Das verwendete Kondensationsmittel ist vorzugsweise N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid.
Das verwendete Ausgangsmaterial ist vorzugsweise ein Gemisch, das durch Umsetzen einer Verbindung der Formel III mit einer Verbindung der Formel IV erhalten wird.
Verbindungen der Formel I, worin Z einen Rest der Formel
NH
ti
-C-O-R2
809836/0703
bedeutet, werden durch Umsetzen eines Thiolimidates der Formel
NH
If
HS-A-C-O-R ,
worin R und A die vorstehend angegebene Bedeutung besitzen, mit einem Pyridyldisulfid der Formel R-S-S-R , worin R die vorstehend angegebene Bedeutung besitzt, in einem organischen Lösungsmittel'hergestellt. Das Lösungsmittel kann z.B. Methanol sein, das etwa 10 % Eisessig enthält.
Wenn.die erfindungsgemäßen Verbindungen als bifunktionelle Kupplungsmittel verwendet werden, wird die folgende Methode angewandt. Zur Erläuterung v/urden zwei Substanzen, von denen jede der Reaktion an mindestens einer Aminogruppe (z.B. Proteine und Peptide) zugänglich ist und die im allgemeinen als B^-NHp und Bp-NHp bezeichnet werden können, zur Kupplung mit Hilfe von N-Suceinimidyl-3-(2-pyridyldithio)-propionat gemäß der vorliegenden Erfindung-ausgewählt
11
Die beiden Substanzen werden zuerst jeweils mit dem Mittel gemäß folgenden Gleichungen umgesetzt.
O υ
/ W
B1-NH2 + ■
It
und
'S-S-(CH0) 3-C-0-
B1-NH-C-(CH2)2-S-S//
809836/0708
. y-S-S-
(CH2)2-C-0- N'
11
B2-NH-C-(CH2)2-
Eines dieser Produkte, z.B. das Produkt von Stufe b) wird anschließend mit z.B. Dithiothrextol (DTT) in einem saurem Medium gemäß der folgenden Gleichung
It
B2-NH-C-(CH2)2-S-S-
DTT
It
,-NH-C-(CHp)2~SH
reduziert.
Das so erhaltene Thiol wird anschließend mit dem Disulfid ausin diesem Fall-Stufe a) gemäß der Gleichung d)
ti
B2-NH-C-(CH2)2-SH + B1-NH-C-(CH2:
O ,-,—o—o— \ on,
d. t 		0
11 Il
C-(CH2) ,)2-c
809836/0701
umgesetzt.
Die Stufen a) und b) werden in einer wäßrigen Lösung bei einem pH-Wert von 5-8, die 1-10 Vol.-$ Methanol oder Ethanol enthält, bei einer Temperatur von normalerweise 20 - 25 C durchgeführt.
Stufe c) kann in einem wäßrigen Medium bei einen pH-Wert von 3 5 und einer Temperatur von normalerweise 20 - 25 C durchgeführt werden. Falls das modifizierte Molekül B„ keine nativen Disul- -: fid-Bindungen enthält, kann die Reduktion ebenfalls mit anderen Reduktionsmitteln und bei höheren pH-Werten,'z.B. bis zu pH 8 bis 8,5 durchgeführt werden.
Stufe d) wird normalerweise in einem wäßrigen Medium bei pH h bis 8 und einer Temperatur von 20 - 25°C durchgeführt.
Wenn eine der Substanzen bereits eine reaktive Thiolgruppe (z.B. eine aliphatische Thiolgruppe), die der Reaktion zugänglich ist9 enthält, können die vorstehend genannten Stufen b) und c) weggelassen werden.
Wenn ein bimolekulares Hetero-Konjugat gewünscht wird, sollten die beiden Substanzen nicht mehr als etwa monosubstituiert, sein. Gewünscht enf al Is kann ein größeres Konjugat als ein bimolekulares durch Substituieren der beiden Substanzen mit mehr als einer Substituentengruppe pro Molekül hergestellt werden. Ein Erfordernis dafür ist natürlich, daß die Substanzen eine entsprechende Anzahl von Aminogruppen, die der Reaktion zugänglich sind, ent- · halten. Bei der Synthese von Oligo-Konjugaten (z.B. Tri- und Tetra-Konjugaten) sollte eine der Substanzen im allgemeinen nicht mehr als etwa monosubstituiert sein» Es ist ebenfalls möglich s Homo-Kon jugate (d.h. B1 ' = B2) in der gleichen Art und Weise,, wie
809836/0708
vorstehend beschrieben, herzustellen.
Die Verwendung der erfindungsgemäßen Verbindungen als Thiolierungsmittel ist aus den vorstehenden Stufen b) und c) ersichtlich. Es ist besonders vorteilhaft in dieser Beziehung, daß die eingeführte Thiolgruppe in Pyridyldisulfidform geschützt ist. Auf diese Art und Weise werden während der Modifizierungsstufe und beim Lagern der modifizierten Substanz, z.B. modifiziertem Protein,unerwünschte Thiol-Disulfid-Austauschreaktionen zwischen der eingeführten Thiolgruppe und irgendwelchen Disulfid-Brücken, die in der Substanz vorliegen (z.B. wenn die Substanz ein Protein oder ein Polypeptid, die Disulfid-Brücken enthalten, ist) vermie-
den. Wenn es gewünscht wird, die R -S-S-Gruppe, die in die Substanz (z.B. Protein) eingeführt ist, in eine Thiol-Gruppe (HS-) zu überführen, kann'dies durch selektive Reduktion ohne gleichzeitige Reduktion irgendeiner nativen Disulfid-Brücke, die in der Substanz vorliegen kann, bewirkt v/erden. Dies ist möglicherweise auf den Unterschied in der chemischen Reaktivität zwischen der R -S-S-Gruppe und z.B. den nativen aliphatischen Disulfid-Brücken in den Proteinen zurückzuführen.
Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls modifizierte makromolekulare Substanzen, die in wäßrigen Flüssigkeiten löslich sind, insbesondere Biopolymere und Derivate derselben, die Aminogruppen enthalten, vorzugsweise Proteine, Polypeptide und Polysaccharide oder Derivate derselben, die Aminogruppen enthalten.
Diese modifizierten makromolekularen Substanzen sind dadurch gekennzeichnet, daß eine oder mehrere Aminogruppen (-NHp) in diesen Substanzen in eine Gruppe der Formel
Il
-NH-C-A-S-S-R1 .
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worin A und R die vorstehend angegebene Bedeutung besitzen und X O oder NH, vorzugsweise O bedeutet, überführt wurden. Vorzugsweise bedeuten diese Gruppen Reste der Formel
ti
-NH-C-CHp-CH9-S-S-R1 ,
worin R die vorstehend angegebene Bedeutung besitzt und vorzugsweise. 2-Pyridyl bedeutet.
Die Thiol-Pisulfid-Austauschreaktionen gemäß den Stufen c) und d) erfordern, daß die Gruppe R in der Verbindung der allgemeinen Formel I reduktiv zur Verbindung R -SH gespalten wird, die in die entsprechende Verbindung HR =S tautomerisiert wird. Zusätzlich dazu, daß die Bedingung durch 2-Pyridyl- und 4-Pyridylgruppen erfüllt wirds wird die Bedingung ebenfalls durch entsprechende Gruppen, die mit einem Substituenten von solcher Art und in solcher Stellung substituiert sind, daß die Thiol-Thion-Tautomere nicht gestört wird, erfüllt. Es wurde gefunden, daß die 5-Nitro-2~pyridyl-Gruppe au diesen substituierten Pyridylgruppen gehört.
Die nachfolgenden Beispiele dienen der Erläuterung der vorliegenden Erfindung.
Beispiel 1 N-Succininidyl-3(2-pyridyldithio)propionat
1,9 g (8,6 mM) 2,2'-Dipyridyldisulfid wurden in 10 ml Ethylacetat gelöst. Zu dieser Lösung wurde innerhalb von 15 Minuten
unter Rühren eine Lösung von 0,9 g (8,6 raM) 3-Mercaptopropionsäure in 10 ml Ethylacetat sugetropft und zur gleichen Zeit vmrden 0,1 ml (2 Tropfen) Bortrifluoridetherat dem Reaktionsgemisch zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde 20 Stunden bei Raumtemperatur unter Rühren aufbewahrt und anschließend wurde das Reaktionsgemisch eingedampft (Büchi Rotavapor, < 40 C) und der feste gelbe Rückstand wurde mit 10 ml (kaltem) (+4o°C) Ethylacetat aufgeschlämmt und filtriert. Auf diese Art und Weise wurden etwa 90 % 2-Thiopyridon (Schmelzpunkt 124 - 126°C, Lit. 128 130°C) erhalten. Die Ausbeute an 2-Carboxyethyl-(2-pyridyl>disulfid betrug etwa 60 %.
1H-NMR .CT(CDCl3) 2,7 - 3,3 (4H, m, -CH2-CH2-), 6,90 - 8,5
(4H, m, -S-S-(( )) ) , 12,5 (IK, s, -COOH).
0,68 g (5 mM) N-Hydroxysuccinimid wurden der Lösung augesetzt, wonach innerhalb von 15 Minuten unter Rühren bei Raumtemperatur 1*03 g (5 JnM) Dicyclohexylcarbodiimxd, gelöst in 10 ml trockenem Ethylacetat, tropfenweise zugesetzt wurde. Die Reaktion wurde 5 Stunden bei Raumtemperatur unter Rühren fortgesetzt, wonach das Reaktionsgemisch auf +40C gekühlt wurde und das ausgefällte Dicyclohexylcarbamid abfiltriert wurde. Die leicht gelbe Lösung wurde eingedampft und das öl in Ethanol gelöst und bei -200C ■kristallisiert. Die Ausbeute betrug 45 %. Der Schmelzpunkt war 78,5 - 8O,5°C. 0
1H-NMR Cf(CDCl3) 2,83 (4H, s, -N^ ),
C - CH2
Il
3,12 (4h, s breit, -CH5CH-), 6,90 - 8,82 (4H, m, -S-S
809836/0708
■28Q8523
Analyse berechnet für G 12 H12W2°4S2S C ^6*1^ H 3>83 » N 8»97i
S 2Os53 %
gefunden: C 46S19; H 3S88; N 8s96j
S 20s02 %,
Beispiel 2 2-Thiopyridyl-3-(2-pyridyldithio)propionat
!»9 g (8,6 mM) 2,2'-Dipyridyldisulfid wurden in 65 ml Ethylacetat gelöst. Zur gleichen Zeit als 0sl ml (2 Tropfen) Bortrifluoridetherat dem Reaktionsgemisch zugesetzt wurde«, wurde innerhalb von 15 Minuten unter Rühren eine Lösung von 0,9 g (8S6 mM) 3-Mercaptopropionsäure in 10 ml Ethylacetat zugetropft. Nach 20-stündigem- Stehen bei- Raumtemperatur xvurde die Lösung auf -200C gekühlt. Anschließend wurden I903 g (5 mil) Dicyclohexylcarbodiimid in 15 ml Ethylacetat gelöst und tropfenweise innerhalb von
starkem
15 Minuten unter/Rühren der Lösung zugesetzt. Die Reaktion wurde etwa 1 Stunde bei -20°C und anschließend über Nacht bei Raumtemperatur (etwa 20°C) fortgesetzt. Das resultierende Dicyclohexylcarbamid wurde abfiltriert und die Lösung wurde eingedampft (Büchi Rotavapor, < 40°C). Anschließend wurden 10 ml kaltes (+^0C) Ethylacetat zugesetzt und das Gemisch erneut filtriert, woraufhin das gesamte Dicyclohexylcarbamid entfernt werden konnte. Das Produkt wog 1,5 g; die Reinheit betrug etwa 90 *."-■■ -
1H-NMR, J-(CDCl3) 3,15 (4H, s breit, -CH2-CH3-)s
6,90 - 8,8 (8H, m, -S-S-<( )) s -S-(( ·)> )
Beispiel 3 Methyl-4-( 2-pyridyldithio )-butyrimidat
20 mg (0,12 mM) Methyl-3-mercaptobutyrimidat-hydrochlorid, 26 mg (0,12 mM) 2,2'-Dipyridyldisulfid und 0,5 ml Eisessig wurden in 5 ml Methanol gelöst. Die Reaktion wurde durch H-NMR verfolgt und wenn das gesamte Imida.t reagiert. hatte (etwa 12 Stunden) wurde das Gemisch zur Trockne eingedampft. Die Analyse des Reaktionsgemisches mit Hilfe von H-NMR (CD7-OD) zeigte eine Ausbeute von etwa 20 %, bezogen auf Methyl-4-mercaptobutyrimidat.
Beispiel 4 N-Succinimidyl-2-( 2-pyridyldithio) -propionat
Diese Verbindung wurde in der gleichen Weise wie das in Beispiel 1 beschriebene N-Succinimidyl-3"(2-pyridyldithio)-propionat hergestellt, jedoch wurde die 3-Mercaptopropionsäure durch 2-Mercaptopropionsäure ersetzt. Weiterhin wurde die Synthese in etwa 1/lQ-Maßstab durchgeführt. Das Produkt wurde durch H-NMR analysiert:
<f(ppm)
cKppm)
cf(ppm)
3 S- 6,8 - 8,7 m -CH-
1,55 d 4,12 q
2,72 s
«09836/070«
Beispiel 5 N-Sgccinimidy!->( 4-pyridyldithio)-propionat
Diese Verbindung wurde in der gleichen Art und Weise wie das in Beispiel 1 beschriebene N-Succinimidyl-j5-(2-pyridyldithio) -propionat hergestellt, jedoch wurde das 2,2'-Dipyridyldisulfid durch 4,4'-Dipyridyldisulfid ersetzt. Weiterhin wurde die Synthese in 1/10-Maßstab durchgeführt. Das Produkt wurde durch H-NMR analysiert:
cT( ppm)
A Λ ppm)
cf(ppm)
CH.
1,6 d 7,3 - 8,7 m -CH- 4,1Oq
C 0 -C-N
2,69 s
Beispiel 6 N-Succinimidyl-3-(5-nitro-2-pyridyldithio)-propionat
Diese Verbindung wurde in der gleichen Weise wie das in Beispiel 1 beschriebene N-Succiniraidyl-3'(2-pyridyldithio)-propionat hergestellt, wobei jedoch 2,2'-Dipyridyldisulfid durch Bis-(5-nitro-2-pyridyl)-disulfid ersetzt wurde. Weiterhin wurde die Synthese in 1/10-Maßstab durchgeführt. Das Produkt wurde durch H-NMR analysiert:
809838/0708
2S08523
RJ
cf(ppm)
A £( ppm)
cf (
CH
7,6 - 9,3 m -CH-
1,6 d 4,10 q
it
-C-N,
2,70 s
Beispiel 7 Thiolierung von 0^-Amylase
5 mg CC-Amylase wurden in 0,5 ml Osl M Natriumphosphat-Puffer, pH 7,5 gelöst und 75 ul N-Succinimidyl-M2-pyridyldithio)-propionat mM in 99,5 % Ethanol) wurden zugesetzt. Nachdem das Gemisch
kräftig geschüttelt worden war, wurde die Reaktion bei +23 C hO
(R) Minuten fortgesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde an Sephadex G-25 (Perlen aus Dextran, das mit Epichlorhydrin vernetzt ist, Pharmacia Pine Chemicals AB, Uppsala, Schweden) gelfiltriert (das verwendete Medium war.0,3 M Natriumphosphat-Puffer von pH 7,5). Das so erhaltene ck-Amylase-pyridyldisulfid-Derivat wurde an~ schließend durch Zusatz von 50 >il 50 mM Dithiothreitol zu dem aus der Gelfiltration (1,5 ml) erhaltenen Material reduziert. Die Reduktion wurde 20 Minuten bei +23°C fortgesetzt, überschüssiges Dithiothreitol und andere Komponenten mit niedrigem Molekularge-
(R) wicht wurden durch Gelfiltration an Sephadex v G-25 entfernt (das verwendete Medium war 0,3 M NaCl). Die so thiolierte d-Amylase enthielt 0,75 Mol SH/Mol Protein.
809836/0709
Beispiel 8
Herstellung von Schaf-Antikaninchen-IgG-Antikörper-ot-Amylase-Ko'njugat ·,
a) Thiolierte <x-Amylase wurde gemäß dem vorstehend beschriebenen Beispiel 7 hergestellt.
b) Schaf-Antikaninchen-IgG-Antikörper, die 2~Pyridyl-disulfidgrup~ pen enthalten.
chen
1,2 Schaf-Antikanin/.—IgG-Antikörper (hergestellt aus Schaf-Hyperimmunserum durch Immunosorbenzreinigung) wurden in O5,5 ml 0,1 M Natriumphosphat-Puffer vom pH 7S5 gelöst. 15 μΐ N-Succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)-propionat (599 mM in Ethanol) wurden zugesetzt. Wach kräftigem Schütteln der Lösung fand die Reaktion über 2JO Minuten bei 23°C statt, überschüssiges Reagenz und andere unerwünschte Komponenten mit niedrigem Molekulargewicht wurden durch
Gelfiltration an Sephadex ' G-25 (Perlen aus Dextran, das mit Epichlorhydrin vernetzt ists Pharmacia Pine Chemicals ABS Uppsala., Schweden) entfernt (Medium 0,3 M Natriumchlorid).
Die so modifizierten Schaf-Antikaninchen-IgG-Antikörper enthielten., wie gefunden wurde, 2 Mol 2-Pyridyldisulfid-Gruppen pro Mol Protein.
c) Schaf-Antikanincheh-IgG-Antikörper-cc-Amylase-Konjugat
1,2 mg Schaf-Antikaninchen-IgG-Antikörper=2-pyridyldisulfid (3 mM Protein, enthaltend 17 nM 2-Pyridyldisulfid-Gruppen5 das vorstehendunter b) erhalten wurde) in 1 ml O93 M Natriumchlorid wurden mit 5 mg thiolierter ci-Amylase (100 nMs enthaltend 75 nM SH-Gruppen) 9 die vorstehend unter a) hergestellt wurde s in 2 ml 0,3 M Natrium·=
Chlorid gemischt. 0,1 ml 0,1 M Natriumphosphat-Puffer vom pH 735 wurden zugesetzt und die Reaktion fand 18 Stunden bei +40C statt.
( Ri
Die Gelfiltration an Sephadex v ; G-200 des Reaktionsproduktes und die Analyse der Fraktionen zeigt, daß 80 % der angewandten Antikörper konjugiert hatten. Das so gebildete Konjugat war im v/esentlichen bimolekular. Geringere Mengen an tri- und tetramolekularera Material konnte ebenfalls beobachtet v/erden. Das Konjugat zeigte sowohl enzymatische als auch immunologische Aktivität. Fraktionen, die die Konjugate enthielten, wurden vereinigt und zu 290 xug (konjugierter Antikörper) /ml konzentriert und in 0,3.M Natriumchlorid bei +40C gelagert.
Beispiel 9 Alkalische Phosphatase, die 2-Pyridyldisulfid-Gruppen enthält
4 mg alkalische Phosphatase (aus Kalbdarm, Boehringer Mannheim AG) wurden in 2 ml 0,1 m Natriumphosphat-Puffer vom pH 7,5 gelöst. 150 μΐ N-Succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)-propionat (1,7 mM in 99,5 % Ethanol) wurden zugesetzt. Nach kräftigem Schütteln des Reaktionsgemisches wurde die Reaktion bei 23°C 40 Minuten fortgesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde anschließend an Sepha.dex v G-25 gelfiltriert (das verwendete Medium war der gleiche Phosphatpuffer wie vorstehend beschrieben).
Die so modifizierte alkalische Phosphatase enthielt 1 Mol Pyridyldisulfid-Strukturen pro Mol Protein.
Beispiel 10 Thiolierung von Schaf-Antikaninchen-IgG-Antikörpern
809836/0708
2,5 mg Schaf-Äntikaninchen-IgG-Antikörper(hergestellt aus Schafserura durch Ausfällung mit Natriumsulfat) wurden in 0,5 ml 0,1 M Natriumphosphat-Puffer vom pH 7S5 gelöst. ^O ;ul N-Suceinimidyl-3-(2-pyridyldithio)-propionat (1,7 mM in 99S5 '■% Ethanol) wurden zugesetzt. Nach kräftigem Schütteln des- Gemisches wurde die Reaktion 4o Minuten bei +23°C fortgesetzt, überschüssiges Reaktionsteilnehmer und andere unerwünschte Komponenten mit niedrigem MoIe-
(R)
kulargewicht wurdendurch Gelfiltration an Sephadex ' G-25 entfernt (das verwendete Medium war 0,1 M Natriumacetat-Puffer vom pH 5). Das so erhaltene Schaf-Antikaninchen-IgG-Antikörper-pyridyldisulfid-Derivat wurde anschließend durch Zusatz vom 50 ;ul 50 mM Dithiothreitol zu dem aus der Gelfiltration erhaltenen(void) Material (etwa 1,5 ml) reduziert« Die Reduktion wurde 30 Minuten bei +23 C fortgesetzt, überschüssiges Dithiothreitol und andere Komponenten mit niedrigem Molekulargewicht wurden durch Gelfiltration an Sephadex ^ J G-25 entfernt (das verwendete Medium war 0,3 M Natriumchlorid). Die so thiolierten Schaf-Antikaninchen-IgG-Antikörper enthielten 2 Mol SH pro Mol Protein.
Beispiel 11
Albumin, das 2-Pyridyldisulfid-Gruppen enthält
8 mg Humariserurnalbumin in 1 ml 0,1 M Natriumphosphat-Puffer vom pH 7,5 wurden mit 12 jul N-Succinimidyl-3"(2-pyridyldithio)-propionat (40 mM in 99·5 % Ethanol) vermischt. Nach iJO-minütiger Reaktion bei +23 C wurde das Reaktionsgemisch an einer Säule von Sephadex ' G-25 gelfiltriert (das verwendete Medium xvar der gleiche Phosphat-Puffer wie vorstehend beschrieben). Das erhaltene (void) Materials etwa 2 ml, enthielt das Albumin-2-pyridyldisulfid-Derivat. Eine spektr ophotometris ehe Bestimmung der Menge an freigesetztem 2-Thio·= pyridon nach der Reduktion des Derivates zeigtes daß der Substitutionsgrad 2,5 Mol Thiol pro Mol Albumin betrug.
Für: Pharmacia Fine Chemicals AB Uppsalai! Scrapeden
Dr Ä. J Wolf f
Rechtsanwalt
809836/0701 /

Claims (1)

  1. Patentansprüche
    iy Neue Pyridinverbindungen der allgemeinen Formel
    R-1^-S-S-A-Z,
    viorin R einen 2-Pyridylrest, 5-Nitro-2-pyridylrest oder einen 4-Pyridylrest, A einen Kohlenwasserstoffrest mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, und Z einen Rest der Formeln
    0 0 ο NH
    If /-Γ" "N. Il Il
    -C-O-N"" (CH0) , -C-S-R1 oder -C-O-R2,
    ViOrin η 2 oder ."5 ist5 R die gleiche Bedeutung wie vorstehend
    1 ?
    für R angegeben besitzt und diesem gleich ist und R einen Methylrest oder einen Ethylrest bedeutet, od.er die .Säure-Gxk'iitioijssalKe der letztgenannten Gruppe bedeuten,
    2, Vei^hindung nach Anspruch ls dadurch gekennzeichnet, daß R den 2-Pyridylrest, A -CHp-CHp- und Z den Rest
    It
    C-O-N 0
    09836/0708 ORIGINAL INSPECTED
    -x
    bedeuten.
    3. Verbindung nach Anspruch I3 dadurch gekennzeichnet, daß R den 2-Pyridylrest, A -CHp-CH2- und Z den Rest der Formel
    bedeuten.
    k. Modifizierte Aminogruppe enthaltende, makromolekulare, in wäßrigen Flüssigkeiten lösliche Substanz, bei der eine oder mehrere der Aminogruppen (-NHp). in Gruppen der Formel
    ■X
    !I
    -NH-C-A-S-S-R1,
    worin A und R die in Anspruch 1 angegebene Bedeutung besitzen und X O oder NH, Vorzugspreise O bedeutet, überführt worden sind.
    5. Modifizierte makromolekulare Substanz nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Substanz ein Protein oder ein PoIypeptid oder ein Derivat derselben ist. .
    6. Modifizierte makromolekulare Substanz nach einem der Ansprüche 4 und 5, dadurch gekennzeichnet, daß eine oder mehrere Aminogruppen in der Substanz in Gruppen der Formel
    Il
    -NH-C-CH2-CH2-S-S-R1,
    809836/0708
    worin R" die in Anspruch 1 angegebene Bedeutung besitzt, vorzugsweise den 2-Pyridylrest bedeutet, überführt worden sind.
    SO9836/O7Ö0
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