DE60017083T2

DE60017083T2 - Einfaches verfahren zur herstellung von markierten konjugaten

Info

Publication number: DE60017083T2
Application number: DE60017083T
Authority: DE
Inventors: P. John MORSEMAN; Xiangfei Zeng
Original assignee: Martek Biosciences Corp
Current assignee: Martek Biosciences Corp
Priority date: 1999-01-22
Filing date: 2000-01-21
Publication date: 2005-12-22
Anticipated expiration: 2020-01-22
Also published as: AU771248B2; EP1145007A1; EP1145007B1; CA2359234A1; ATE286250T1; AU2511800A; JP2002535657A; JP4731018B2; CA2359234C; DE60017083D1; WO2000043784A1

Description

Diese Erfindung bezieht sich auf die Befestigung von nachweisbaren Markern an Molekülen, die freie Aminogruppen enthalten (z.B. Proteinen, Nucleinsäuren und Aminozuckern), wobei die Moleküle spezifische Bindungsstellen haben, wodurch ein Verfahren bereitgestellt wird, um den Marker zu der Struktureinheit zu lenken, die von dem markierten Molekül spezifisch gebunden wird.
Übersicht über den Stand der Technik
N-Hydroxysulfosuccinimid-(NHS)-Ester ermöglichen eine der häufigsten Aktivierungsreaktionen zur Erzeugung von reaktiven Acylierungsmitteln. Homobifunktionelle NHS-Ester wurden in den frühen 1970er Jahren zuerst als reaktive Vernetzungsmittel eingeführt und sind verbreitet kommerziell erhältlich. [Bragg, P., & Hou, C. (1975), "Subunit composition, function and spatial arrangement on the Ca²⁺ and Mg²⁺ activated adenosine triphosphates of Escherichia coli and Salmonella typhimurium," Eur. J. Biochem., 106, 495–503, Lomant, A. & Fairbanks, G. (1976) J. Mol. Biol., 104, 243–261.] NHS-Ester werden routinemäßig verwendet, um Proteine über heterobifunktionelle Vernetzungsmittel miteinander (siehe z.B. alle "Double Agents" von Pierce Chemicals, die eine NHS-Seite aufweisen; Muramoa K., Kamiya H. (1988), "Preparation and characterization of a cleavable photoactivatable heterobifunctional fluorescent reagent for proteins.", Agric. Biol. Chem. 52, 547–554) oder mit Farbstoffen (wie Acridinium; Zomer G., Van den Berg R.H., Jansen E.H.J.M. (1988), "Optimal labelling of proteins with acridinium ester", Anal. Chim. Acta, 205, 267–271) zu konjugieren.
N-Hydroxysuccinimid-(NHS)-Chemie
Ein NHS-Ester wird durch die Reaktion eines Carboxylats mit NHS in Gegenwart eines Carbodiimids gebildet. Zur Herstellung eines stabilen Esters muss die Reaktion in nichtwässrigen Umgebungen durchgeführt werden, sonst zersetzt er sich in unproduktiven Reaktionen; wässrig hergestellte Ester sind instabil und werden unter den besten Bedingungen in Stunden abgebaut. Der NHS-Ester oder Sulfo-NHS-Ester enthaltende Reaktant reagiert mit einem Nucleophil unter Bildung eines acylierten Produkts unter Freisetzung von NHS oder Sulfo-NHS als Abgangsgruppe. Die Reaktion ist mit Imidazolyl-Ringstickstoffatomen, Sulfhydryl- oder Hydroxygruppen unproduktiv und bildet wässrig abbaubare Ester- oder Thioesterbindungen. Durch Reaktionen mit primären und sekundären Aminen entstehen stabile Amid- bzw. Imidbindungen.
In Proteinen reagieren diese Reagentien hauptsächlich mit α-Aminogruppen an den N-Termini und den ε-Aminogruppen von Lysin-Seitenketten. Es ist möglich, NHS-Ester in situ zu erzeugen, so dass sie sofort mit Zielmolekülen in wässrigen Medien reagieren (Staros, J., Wright, R. & Swingel, D. (1986), Anal. Biochem., 156, 220–222; Staros, J. (1982), Biochemistry 21, 3950–3955). NHS-Ester haben in wässrigen Umgebungen bei pH 7 eine Halbwertszeit in der Größenordnung von mehreren Stunden (4–5 Stunden bei 0°C, pH 7,0; Lomant, A. & Fairbanks, G. (1976), J. Mol. Biol., 104, 243–261).
Carbodiimide sind Vernetzer der Länge null, die die Bildung einer Amid- bzw. Phosphoramidat-Bindung zwischen einem Carboxylat und einem Amin bzw. einem Phosphat und einem Amin vermitteln. (Chu, B., Kramer, F. & Orgel, L. (1986), "Synthesis of an amplifiable reporter RNA for bioassays", Nucleic Acids Research, 14, 5591–5603, Hoare, D. & Koshland, D.E. (1966), J. Am. Chem. Soc., 88, 2057.) Sie reagieren mit Carbonsäuren unter Bildung von hochreaktiven O-Acylisoharnstoff-Verbindungen, die sehr kurzlebig sind, aber mit Nucleophilen unter Bildung einer Amidbindung reagieren. Es gibt mehrere konkurrierende und unproduktive Reaktionen, wie etwa mit Wasser unter Rückbildung der Carboxylatgruppe. Diese Reaktion arbeitet effektiv zwischen pH 4,5 und 7,5.
Moleküle mit einer Phosphatgruppe, wie die 5'-Phosphatgruppe an Oligonucleotiden, können ebenfalls mit aminhaltigen Gruppen reagieren, indem man sich die Carbodiimidreaktion zu Nutze macht.
DCCD (ein Carbodiimid) und NHS wurden verwendet, um eine Mikroplattenoberfläche zu aktivieren, die dann gewaschen wurde, und Protein wurde zu dem Napf gegeben, um die kovalente Bindung des Proteins an die Platte zu erleichtern. (Dagenais P., Desprez B., Altert J., Escher E. (1994), Anal. Biochem., 222, 149-155).
Ein Verfahren zur Verwendung von EDAC (eines Carbodiimids) und Sulfo-NHS ist zusammengefasst in Hermanson, G.T., Bioconjugate Techniques, Academic Press, New York, London, 1966.
Aus einem Protein/Marker-Komplex wurde ein NHS-Derivat gemacht, so dass es, wenn es an den Proteintransporter band, dort komplexierte und es ermöglichte, die Position des Transporters sichtbar zu machen. Dies ist im Grunde ein aktivierter Protein/Farbstoff-Komplex mit einem aktiven NHS daran. (Fan J., Pope L.E., Vitols K.S., Huennekens F.M. (1991), "Affinity labeling of folate transport protein with the N-hydroxysuccinimide ester of the g isomer of fluorescein methotrexate", Biochem., 30, 4573–4580.) NHS-aktivierte Farbstoffe werden auch kommerziell vertrieben (siehe z.B. die aktivierten Cyaninfarbstoffe, die von Amersham Pharmacia Biotech vertrieben werden, wie FluoroLink^TMCy5^TM oder FluoroLink^TMCy5.5^TM).
Ein NHS-Ester von 4-Hydroxytestosteron-4-hemiglutarat wurde durch Behandlung mit Carbodiimid und NHS hergestellt. Er wurde mit Meerrettich-Peroxidase (HRP) oder β-Galactosidase gemischt, um ein enzymmarkiertes 4HT-4-HG herzustellen. Das enzymmarkierte Hydroxytestosteron wurde für Tracerstudien verwendet (Hosada H., Karube T., Kobayashi N., Nambara T. (1985), "Enzyme labeling of steroids by the N-succinimidyl ester method. Preparation of horseradish peroxidase-labelled antigen for use in enzyme Immunoassay." Chem. Pharm. Bull., 33, 249–255).
Kurzbeschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft vereinfachte Verfahren zum Koppeln von Markern an bestimmte Ziel-Struktureinheiten. Diese Kopplung wird gewöhnlich erreicht, indem man den Marker, die Ziel-Struktureinheit oder beide mit hochreaktiven Aktivierungschemikalien aktiviert. Die üblichen Kopplungsvorschriften sind problematisch, da die Aktivierungschemikalien unkontrollierten Reaktionen unterliegen, bei denen unerwünschte Nebenprodukte entstehen, oder einer zu schnellen Reaktion unterliegen, was zur Verschwendung der Aktivierungschemikalien ohne die gewünschte Kopplung führt. Bei Kopplungsreaktionen gemäß der vorliegenden Erfindung wird anstatt des gemäß dem traditionellen Verfahren verwendeten physischen Abstands ein zeitlicher Abstand der Reaktanten durch Phasenwechsel (z.B. durch schnelles Gefrierenlassen) verwendet, um den Start und den Abbruch der Reaktion zu steuern.
Zum Beispiel ist die Technik des Erzeugens von NHS-Estern in situ (ohne Gefriertrocknen, nur Hinzufügen von Reagentien) in Bioconjugate Techniques erwähnt. Diese Erfindung verwendet dieselbe Chemie und dieselbe Idee, um die Bindung eines Markers an ein anderes Molekül zu erreichen, aber der Unterschied ist das leicht zu verwendende Format (d.h. das "Ein-Röhrchen-Format"). Bei diesem Verfahren werden alle Reaktanten getrennt hergestellt, dann so miteinander kombiniert, dass sie nicht miteinander reagieren, bis die betreffende Verbindung hinzugefügt wird, wobei die Vernetzungschemikalien aktiviert werden. Ein solches Format wird durchgeführt, indem man nacheinander wässrige Lösungen der Reaktanten schnellgefrieren lässt und sie dann zusammen als Einheit gefriertrocknet (z.B. in einem Mikrozentrifugenröhrchen). In einem anderen Format dieser Erfindung werden gefriergetrocknete oder in sonstiger Weise getrocknete Komponenten getrennt hergestellt und dann in trockener Form oder in einem räumlich getrennten Format (z.B. im Oberteil eines Mikrozentrifugenröhrchens, das in getrennte Teile unterteilt ist) miteinander kombiniert, so dass die wasserlöslichen Komponenten nicht in der Lage sind, miteinander zu reagieren, bis die zu markierende Verbindung (in wässriger Form) hinzugefügt wird.
Diese Erfindung stellt ein verbessertes Verfahren zur Verknüpfung von Markern mit spezifischen Bindungs-Struktureinheiten (z.B. Struktureinheiten, die geeignet sind, um Analyse-Zielmoleküle auszuwählen) unter Verwendung von N-Hydroxysuccinimid-(NHS)-Chemie bereit. Insbesondere sorgt die Erfindung für eine Trennung und Stabilisierung der aktiven Komponenten, die durch sequentielles oder getrenntes Gefrierenlassen in den geeigneten Puffern (im Wesentlichen räumliche oder zeitliche Trennung von Komponenten vor der Verwendung) erreicht wird.
In einem anderen Modus stellt diese Erfindung einen Kit bereit, der NHS, ein wasserlösliches Carbodiimid (z.B. EDAC) und einen Marker, der eine Amin- oder Carboxy-Struktureinheit enthält, umfasst, wobei diese Komponenten in trockener, für eine Rehydratisierung bei einem pH-Wert um 7 geeigneter Form vorliegen, wobei alle Komponenten eine ausreichende Aktivität für die Aktivierung und Vernetzung haben.
Während Phycobiliproteine als kompliziert zu konjugieren gelten, stellt diese Erfindung ein Verfahren bereit, um schnell und leicht stabile Phycobiliprotein-Konjugate an spezifischen Ziel-Bindungsproteinen herzustellen. Mit SMCC und SPDP voraktivierte Phycobiliproteine stehen in mehreren Zubereitungen zur Verfügung. Diese Erfindung stellt jedoch insofern ein einfacheres Verfahren zur Herstellung von Konjugaten bereit, als es weniger Schritte erfordert und schneller ist. Tatsächlich erlaubt es diese Erfindung einem Forscher, ein beliebiges spezifisches Bindungsmolekül leicht mit einem carboxyhaltigen Marker (z.B. Phycobiliprotein, Enzym, PBXL^TM usw.) zu markieren. Diese Erfindung stellt Kits bereit, um ein Konjugat herzustellen, so dass der Anwender des Kits kein Experte auf dem Gebiet der Proteinkonjugation zu sein braucht, um am Ende des Verfahrens brauchbare Konjugate zu erhalten.
Kurzbeschreibung der Figuren
1 ist eine schematische Darstellung, die die Schritte zeigt, die bei einer Ausführungsform des Verfahrens dieser Erfindung beteiligt sind.
2 ist eine Balkengraphik, die ein Beispiel für einen Zeitverlauf zeigt, der verwendet wird, um den Zeitpunkt für die Zugabe des Konjugatpartners zu optimieren.
3 zeigt Biotin-Dosis-Wirkungs-Kurven, die zu drei Zeitpunkten mit aktivierten Farbstoffen erzeugt wurden.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Das Verfahren dieser Erfindung erlaubt es einer Person, eine zu markierende Ziel-Struktureinheit (z.B. ein in einer gepufferten Lösung bereitgestelltes Protein) zu einem trockenen Pulver zu geben, das einen nachweisbaren Marker (wie ein Phycobiliprotein, Enzym, Protein oder PBXL^TM-Phycobilisom-Farbstoff), Puffer, NHS und Carbodiimid enthält, so dass beim Hydratisieren des trockenen Pulvers ein reaktiver NHS-Ester entsteht, der den nachweisbaren Marker in einem einzigen Schritt mit dem Zielprotein verknüpft. Die markierte Ziel-Struktureinheit kann entweder direkt als Tracer verwendet (vor oder nach dem Löschen) oder weiter gereinigt werden, um ungebundenen Farbstoff und Löschreagens zu entfernen, wobei man eine hochgereinigte markierte Verbindung erhält.
In einer Ausführungsform stellt die Erfindung einen Kit bereit, der ein Reaktionsgefäß (z.B. ein Mikrozentrifugenröhrchen) beinhaltet, das gefriergetrocknetes EDAC (das Carbodiimid), eine Marker-Struktureinheit (z.B. Phycobiliprotein, Phycobilisom oder eine andere) und NHS enthält. Diese Komponenten werden noch nicht miteinander umgesetzt, sondern nacheinander in ihren eigenen optimalen Puffern hinzugefügt und gefrieren gelassen, um die Stabilität jeder Komponente aufrechtzuerhalten (da EDAC und NHS bei verschiedenen pH-Werten stabil sind). Bei der Rehydratisierung bei einem pH-Wert, der einen Kompromiss zwischen den Optima dieser Reagentien darstellt, wird eine Umgebung geschaffen, die dem Abschluss der Reaktion förderlich ist, so dass ein brauchbares Konjugat hergestellt wird (obwohl die Umgebung weder für das Carbodiimid noch für das NHS optimal ist).
Dasselbe Format kann auch für andere Typen von Vernetzungsmitteln verwendet werden, die erfordern, dass die Zielmoleküle vor der Verwendung zuerst modifiziert werden, wenn geeignete Reaktionsbedingungen einschließlich geeigneter pH-Bereiche für die besonderen chemischen Reaktionen, die angewendet werden, verwendet werden. Zum Beispiel kann eine einfache Vernetzung eines interessierenden Proteins mit einem Marker unter Verwendung von SMCC (Succinimidyl-4-(N-maleimidomethyl)cyclohexan-1-carboxylat) oder eines seiner Derivate und von Reduktionsmitteln, wie Dithiothreit (DTT) oder β-Mercaptoethanol, erreicht werden. Diese Chemikalien werden nacheinander gefrieren gelassen und dann gefriergetrocknet. Dann werden die gefriergetrockneten Materialien mit dem zu konjugierenden Protein, das in Puffer gelost ist, rehydratisiert. Dadurch werden die Materialien aktiviert, und nach Entfernung des Reduktionsmittels durch Entsalzen oder Dialyse können sie miteinander vernetzt werden. Eine sorgfältige Koordination der Proteinverhältnisse ist für optimale Konjugate notwendig. Durch sequentielle Zugabe von Puffer und Zielverbindung konnte das resultierende Produkt verbessert werden. Diese Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst auch einen Kit, bei dem Materialien (Protein, Oligonucleotidsonden usw.) nacheinander innerhalb einer Matrix gefrieren gelassen werden, zu der der gewünschte Bindungspartner (Ziel-Struktureinheit) hinzugefügt und anschließend reduziert wird, während das Reduktionsmittel langsam entfernt wird, wodurch die Konjugationsreaktion angetrieben wird, was zu definierten Konjugaten mit gewünschten und spezifischen Stoffmengenverhältnissen führt. Eine solche Matrix könnte so einfach wie eine Hochmolekulargewichts-Dialyseröhre, die das Reduktionsmittel und das aktivierte Protein enthält, oder so komplex wie ein Reaktionsgefäß, das die langsame räumliche Trennung von Reduktionsmitteln durch Gelfiltration (d.h. Entsalzen) oder chemische/thermische Inaktivierung ermöglicht, sein.
Vorteile dieses Verfahrens sind seine Einfachheit, und dass es einem Forscher, der in Bezug auf die Durchführung seiner eigenen Konjugation skeptisch sein mag, eine Methode an die Hand gibt, um schnell erfolgreich zu sein. Zum logischen Schluss geführt, ist es möglich, die Verhältnisse so abzustimmen, dass wenig oder kein Löschreagens notwendig ist und man den Marker mischen, inkubieren und dann direkt verwenden kann.
Alternativ dazu kann das umgesetzte Konjugat über eine Gelpermeationssäule oder mit einer anderen Art von Trennschritt gereinigt werden, so dass man ein hochgereinigtes Konjugat erhält.
Zusammenfassung der experimentellen Arbeiten
Die vorliegende Erfindung wurde aus experimentellen Arbeiten entwickelt, die in einem Versuch durchgeführt wurden, einen stabilen NHS-Ester oder ein anderes funktionelles reaktives Vernetzungsmittel zur Bindung von Proteinen, insbesondere Markern, an andere Proteine und Nucleinsäuren zu finden, um es so anwenderfreundlich wie möglich zu machen. Insbesondere wurde gewünscht, ein leichtes einstufiges Verfahren für die Konjugation von zwei Proteinen bereitzustellen. Mehrere experimentelle Ansätze wurden unternommen.
Zuerst wurden flüssige NHS-Ester-Konjugate zwischen Streptavidin (SA) und verschiedenen nachweisbaren Markern, Allophycocyanin (APC), stabilisierten Phycobilisomen (PBXL-3) oder Phycoerythrin (PE) hergestellt, um die geeigneten Bedingungen und Verhältnisse für eine ausreichende Kopplung zu bestimmen. Da der NHS-Ester unter fast neutralen Bedingungen aufgrund der Hydrolyse des Esters eine relativ kurze Halbwertszeit hat, zeigte sich, dass die langfristige Stabilität des aktiven NHS-Esters, der mit Protein vernetzt war, nicht zu einem Produkt führt, das eine Lagerbeständigkeit von wenigstens 6 Monaten benötigen könnte.
Der nächste Ansatz bestand darin, denselben aktiven NHS-Ester-Protein-Komplex herzustellen, wobei man im Grunde dieselbe Vorschrift mit Zugabe von Trehalose verwendete, um die Stabilität des Phycobiliproteins gegenüber Gefrieren und dann Eintauchen des gesamten Komplexes in flüssigen Stickstoff, bis er gründlich gefroren ist, und anschließendes Gefriertrocknen des gesamten Komplexes zu erhöhen. Dann wurde der gefriergetrocknete Komplex in einer Streptavidinlösung resuspendiert, und das resultierende Konjugat wurde mit einem Konjugat, das in einem flüssigen Format hergestellt wurde, verglichen. Die Ergebnisse zeigen eindeutig einen erheblichen Verlust der absoluten Bindungskapazität durch den gefriergetrockneten Komplex. Der gefriergetrocknete aktive NHS-Ester-Protein-Komplex zeigte nie eine bessere Leistung als der flüssige Komplex.
Als Alternative zu dem Versuch, einen stabilen Komplex über eine lange Zeit aufrechtzuerhalten, untersuchten die Erfinder eine Vorschrift, bei der der Komplex erst dann gebildet wurde, als sie bereit waren, den nachweisbaren Marker und SA aneinander zu koppeln. Materialien wurden nacheinander hinzugefügt und bei jeder Zugabe gefrieren gelassen, zuerst der Marker, dann das EDAC und schließlich das Sulfo-NHS. Die Reihenfolge dieser Zugabe ist jedoch nicht so wichtig, da die Reagentien durch Gefrieren voneinander getrennt werden. Durch fast momentanes Gefrieren der Schichten und eine äußerst tiefe Temperatur wurden die Materialien im Wesentlichen inert gegeneinander. Dann wurde die gefrorenen Zusammensetzungen gefriergetrocknet. Als wässrige Proteinlösungen zu dem gefriergetrockneten Pulver gegeben wurden, wurden Konjugate gebildet. Die resultierenden Konjugate wirken sehr ähnlich wie ihre flüssig gebildeten Gegenstücke, mit der Fähigkeit, ein ähnliches Signal zu erzeugen, wenn ein BSA-Biotin-Mikroplattenassay damit durchgeführt wurde.
Herstellung von NHS-aktivierten Pigmenten
Die Erfindung stellt diese Vorteile bereit, indem sie die drei Bestandteile (Marker-Struktureinheit, NHS und Carbodiimid) zusammengibt, ohne sie miteinander reagieren zu lassen, bis es gewünscht wird. Typischerweise wird dies durch eine sequentielle Zugabe von Reagentien und schnelles Gefrierenlassen mit anschließendem Schritt des Gefriertrocknens, wie es in 1 gezeigt ist, bewerkstelligt. Dies könnte auch dadurch erreicht werden, dass man jede Komponente getrennt gefriertrocknete (oder in anderer Weise trocknete) und jeweils zu einem homogenen Pulver verarbeitete, die in den richtigen Verhältnissen als Schüttgutreagens unter feuchtigkeitsfreien Bedingungen miteinander gemischt werden könnten.
Arten von Markern
Geeignete Marker sind nachweisbare Struktureinheiten, die freie Carboxygruppen aufweisen. Vorzugsweise hat die Marker-Struktureinheit keine freien Amingruppen, aber die Konzentration des Markers muss so eingestellt werden, dass eine Vernetzung zwischen den Markern in allen Fällen (mit oder ohne Amine) minimiert wird. Um eine mögliche Brückenbildung zwischen Pigmentmolekülen zu verhindern, können Acylierungsreagentien, wie Essigsäureanhydrid, verwendet werden, um Amingruppen in Carboxygruppen (im Falle von Essigsäureanhydrid) oder andere Gruppen, die gegenüber dem NHS unreaktiv sind, wie Thiole (z.B. SATA), umzuwandeln. Der Marker muss eine Eigenschaft haben, die es ermöglicht, dass er überwacht wird, sobald er an eine Hälfte eines spezifischen Bindungspaars gekoppelt ist. Dabei könnte es sich um Fluoreszenz, Chromogenität, Radioaktivität, Enzymaktivität, physikalische Dichte usw. handeln. Der Zweckmäßigkeit halber können aktivierte Marker als "Pigmente" bezeichnet werden, aber es kann unabhängig von der Lichtabsorption jede nachweisbare Struktureinheit verwendet werden, die über NHS-Chemie gekoppelt werden kann. Zu den typischen Markern gehören unter anderem die unten aufgeführten:

– Phycobiliproteine (z.B. Allophycocyanin, Phycocyanin, Phycoerythrin, Phycoerythrocyanin, CryptoFluor^TM-Farbstoffe), Untereinheiten der Phycobiliproteine (z.B. α-, β- und γ-Untereinheiten von Phycoerythrin);
– Phycobilisomen (aus Blaualgen oder Rotalgen) einschließlich Phycobilisom-Teilkomplexen (Stäbchen und Kern);
– stabilisierte Phycobilisomen einschließlich stabilisierter Phycobilisom-Teilkomplexe (Stäbchen und Kern) oder chemisch stabilisierter Phycobilisomen, wie solche, die aus Porphyridium cruentum oder Arthrospira platensis isoliert werden (z.B. PBXL-1 bzw. PBXL-3), oder Tandem-Farbstoffe, die diese chemisch stabilisierten Phycobilisomen und Cy 5.5 enthalten (z.B. PBXL-2 bzw. PBXL-4);
– Enzyme (Meerrettich-Peroxidase, Alkalische Phosphatase, DNA-Polymerase, RNA-Polymerase);
– Latexkügelchen (z.B. natürlich, gefärbt, aktiviert);
– Nucleinsäuren (z.B. RNA, DNA, PNA);
– modifizierte Nucleinsäuren (z.B. methylierte, biotinylierte, aminterminierte);
– Agarosekügelchen (z.B. Sepharose^TM, Sephadex^TM);
– aktivierte Glaskügelchen (z.B. modifizierte CPG-Kügelchen);
– magnetische Kügelchen (z.B. BioMag^TM);
– lanthanidenhaltige Chelate, wie Cryptate (z.B. Europium, Terbium), die so modifiziert sind, dass sie freie Carboxygruppen oder freie Amingruppen enthalten;
– organische Farbstoffe mit freien Amingruppen, wie aminhaltige Aminofluorescein-Derivate (z.B. Fluorescein-5-thiosemicarbazol, 5-(((2-(Carbohydrazino)methyl)thio)acetyl)aminofluorescein, Aminofluorescein) oder Rhodamin;
– rekombinante oder native fluoreszente Proteine, wie Grünes Fluoreszentes Protein, Rotes Fluoreszentes Protein, Blaues Fluoreszentes Protein und Gelbes Fluoreszentes Protein.

Arten von NHS

– N-Hydroxysuccinimid;
– Sulfo-N-hydroxysuccinimid;
– wasserlösliche NHS-Analoga.

Arten von wasserlöslichen Carbodiimiden
[EDAC] 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid
[CMC] 1-Cyclohexyl-3-(2-morpholino-4-ethyl)carbodiimid
[DCC] Dicyclohexylcarbodiimid
[DIC] Diisopropylcarbodiimid
Weitere mögliche Vernetzungsmittel:
[Woodward-Reagens K] N-Ethyl-3-phenylisoxazolium-3'-sulfonat
[CDI] N,N'-Carbonyldiimidazol.
Verfahren zur Herstellung von reaktivem Pulver
Die Reagentien werden nacheinander getrocknet, um die Reaktanten voneinander zu trennen, während die richtige Umgebung (z.B. pH) aufrechterhalten wird, die die Verbindungen in der bestmöglichen Form erhält. Zum Beispiel wird der Marker in wässriger Form hinzugefügt, in flüssigem Stickstoff gefrieren gelassen, und dann wird das NHS darübergegeben und sofort gefrieren gelassen, und dann wird das EDAC hinzugefügt und sofort gefrieren gelassen. Dieses gesamte Konstrukt wird gefriergetrocknet, und das resultierende Röhrchen wird im Exsikkator aufbewahrt, bis es benötigt wird. Zu den alternativen Verfahren zur Herstellung des Pulvers, das den Marker und andere notwendige Reaktanten enthält, gehören:

– Gefriertrocknen/zeitliche Trennung der Phasen: Die Flüssigkeiten werden nacheinander hinzugefügt und gefrieren gelassen, wobei man die verschiedenen pH- Werte und Reagentien als gefrorene Teile, die sich nicht mischen, voneinander trennt. Dann wird alles gefriergetrocknet. (gegenwärtig)
– Reagentien-Stammlösungen werden unabhängig voneinander gefrieren gelassen, gefriergetrocknet und dann in einer feuchtigkeitsfreien Umgebung zu einem feinen Pulver reduziert. Dieses wird dann entweder getrennt in Röhrchen gegeben oder in geeignetem Verhältnis mit den anderen Reagentien kombiniert, bevor man sie zur Verwendung in Röhrchen ausgibt.
– Trockene Chemikalien werden als einzelne Komponenten in Röhrchen ausgegeben und nicht nacheinander gefriergetrocknet. Dann würde man sie nach Zugabe von Wasser miteinander mischen, um die Aktivierung des Markers einzuleiten. Nach einer geeigneten Inkubationszeit würde man die Verbindung (aminhaltig) hinzufügen, damit sie mit der Carbodiimid-aktivierten Carboxygruppe reagiert. Das resultierende Material wird dann mit dem richtigen Gewicht in die Reaktionsröhrchen ausgegeben.
– Trockene Chemikalien werden miteinander gemischt, um den Puffer herzustellen, und dann in die Reaktionskammer ausgegeben. Trockenes NHS und Carbodiimid werden im richtigen Verhältnis zu dem Reaktionsgemisch gegeben. Alles wird bis zur Verwendung in einer feuchtigkeitsfreien Umgebung, vorzugsweise unter Vakuum, versiegelt. (vorausschauend)

Die Reihenfolge der Zugaben ist für das Ergebnis nicht relevant, wenn man die obige Vorschrift verwendet. Es ist wichtig, sicherzugehen, dass die Materialien schnell gefrieren und die vorangehende Schicht nicht wesentlich auftauen. Dies kann bewerkstelligt werden, indem man bei dem Röhrchen, das die Flüssigkeit aufnimmt, sehr tiefe Temperaturen (flüssiger Stickstoff oder Trockeneis) aufrechterhält und für die Zugaben sehr kalte Lösungen verwendet. Es ist am einfachsten, Materialien mit den größten Volumina zuerst und dann die kleineren Volumina zuzugeben. Die Seiten der Röhrchen können verwendet werden, um die Materialien gefrieren zu lassen, bevor man die Schichten aufeinandertreffen lässt.
Die Materialien könnten als gefriergetrocknete oder schnellgetrocknete Pulver vorgemischt werden, anstatt sie übereinander zu schichten, wie es oben beschrieben ist. In diesem Fall ist es schwieriger, die kleineren Röhrchen herzustellen, da so kleine Materialmengen in jedes Röhrchen gegeben werden. Sobald sie gemischt sind, könnte ein automatischer Spender jedoch die Materialien in einer sehr definierten Weise in Röhrchen abwiegen.
Kitform
In einem bevorzugten Modus wird das reaktive Pulver, das einen nachweisbaren Marker für die Kopplung an eine gewünschte Ziel-Struktureinheit enthält, in einem Kit bereitgestellt, der N-Hydroxysulfosuccinimid (Sulfo-NHS), ein wasserlösliches Carbodiimid (z.B. EDAC) und einen Marker, der eine Amin- oder Carboxy-Struktureinheit enthält, umfasst, wobei diese Komponenten in einer trockenen Form vorliegen, die für eine Rehydratisierung bei einem pH-Wert im Bereich von 6,0 bis 8,0 geeignet ist. Ein typischer Kit könnte Folgendes enthalten
Kit 1:

– eine oder mehrere Ampullen, die pulverisiertes NHS, Carbodiimid und Marker enthalten, vorzugsweise mit einem oder mehreren Trockenmittelpacks, die in der Packung enthalten sind;
– eine oder mehrere Ampullen, die Stopreagens enthalten;
– eine oder mehrere Säulen für die Trennung des Konjugats von nicht verwendetem Marker und Stopreagens;
– eine oder mehrere Flaschen, die trockenen pulverisierten Puffer für die Aufladung und Elution von Konjugat enthalten (je nach dem verwendeten Trennverfahren möglicherweise mehr als eine).

Kit 2:

– eine oder mehrere Ampullen, die pulverisiertes NHS, Carbodiimid und Marker enthalten, vorzugsweise mit einem oder mehreren Trockenmittelpacks, die in der Packung enthalten sind;
– eine oder mehrere Ampullen, die Stopreagens enthalten.

Kit 3:

– Ampullen, die pulverisiertes NHS, Carbodiimid und Marker enthalten, vorzugsweise mit Trockenmittelpacks, die in der Packung enthalten sind. Set für mehrfache Markierungen.

Herstellung von markierten Konjugaten
Die Trockenmischung aus nicht umgesetztem Marker, NHS und Carbodiimid wird zur Reaktion mit der Ziel-Struktureinheit (typischerweise ein Partner eines spezifischen Bindungspaars) rehydratisiert, um den Marker mit der Ziel-Struktureinheit zu konjugieren.
Arten von spezifischen Bindungspartnern
Durch das Mischen von getrennten Materialien in einer solchen Weise, dass sie nicht miteinander reagieren, bis eine endgültige "Ziel"-Komponente hinzugefügt wird, wird eine Stoffzusammensetzung gebildet, die sehr allgemein ist und auf Phycobiliproteine, PBXLTM-Farbstoffe, Enzyme oder praktisch jeden carboxyhaltigen Marker angewendet werden kann. Außerdem können viele organische Farbstoffe unter Verwendung von organischer Standardchemie so modifiziert werden, dass sie eine Carboxygruppe enthalten. Zum Beispiel kann Phosgen in Gegenwart von Friedel-Crafts-Katalysatoren verwendet werden, um eine Carboxygruppe in Arylringstrukturen einzuführen. März 1985 J. Advanced Organic Chemistry.
Zu den geeigneten Ziel-Struktureinheiten gehören unter anderem: Rezeptoren, Aptamere, Nucleinsäuren, modifizierte Nucleinsäuren, Antikörper (IgG, IgA, IgM, Fc-Fragment, Fab-Fragment, F(ab')₂-Fragment), Liganden, porenbildende Verbindungen, Lectine, Peptide, Zellextrakte, Gemische von Molekülen, synthetische Antikörper und Plastik-Antikörper sowie kombinatorisch hergestellte Materialien, die freie Carboxygruppen oder freie Aminogruppen, die reaktive Stellen ergeben könnten, enthalten.
In einem Modus der vorliegenden Erfindung wird eine gefriergetrocknete Mischung von Reagentien in einem kleinen Röhrchen bereitgestellt, und der Anwender fügt das interessierende Zielmolekül entweder direkt oder nach einer kurzen Vorinkubation hinzu, so dass man die beste Aktivierung der Proteine erhält, und diese werden zwischen 30 Minuten und über Nacht inkubiert, und dann wird ein Löschreagens hinzugefügt. Das Konjugat kann so, wie es ist, verwendet oder vorher über eine Gelpermeationssäule gereinigt werden. Die gefriergetrocknete Mischung kann in kleinen Ampullen für 1-mg-Konjugationen bereitgestellt werden.
Verfahrensparameter
Die sequentielle Zugabe von Reagentien und die Abtrennung jedes einzelnen in einem inerten Zustand ermöglicht es, Konjugate in einem Ein-Schritt-Verfahren herzustellen. Da die Reaktion bei der Rehydratisierung jedoch gleichzeitig erfolgt, gibt es bestimmte Einschränkungen für die Konjugationsbedingungen, wie Puffer (insbesondere pH-Wert), angebotenes Stoffmengenverhältnis (von verschiedenen Reaktanten, die zum Reaktionsgemisch gegeben werden) und Reaktionszeit (sowohl zwischen den beiden Partnern (d.h. Antikörper zu Enzym) als auch zwischen Sulfo-NHS und EDAC).
Experimente wurden durchgeführt, um einen geeigneten pH-Wert für die optimale Markierung zu finden. Da EDAC bei sauren pH-Werten reaktiver ist und Sulfo-NHS bei basischeren pH-Werten reaktiver ist, gibt es einen engen pH-Bereich (vorzugsweise pH 6,8–7,4) für eine effektive Konjugation. Experimente, die bei pH 6,0 durchgeführt wurden, wo EDAC sehr reaktiv ist und Sulfo-NHS unreaktiv ist, zeigen, dass zwischen APC und Streptavidin unter diesen Bedingungen kein Konjugat gebildet wird.
Das angebotene Stoffmengenverhältnis von Protein zu Bindungspartner (d.h. Marker zu Ziel) wird vorzugsweise für jede Gruppe von Konjugationspartnern experimentell optimiert. Zum Beispiel unterscheiden sich bevorzugte Verhältnisse für PBXL-Farbstoffe zu SA (1:25) von denjenigen von APC zu SA (1,2:1). Ein weiteres Beispiel ist die Konjugation von PBXL-3 an Kaninchen-IgG, bei der ein angebotenes Verhältnis von 20 IgG zu 1 PBXL-3-Molekül verwendet wurde.
Die Reaktionszeit kann optimiert werden. Eine Markierung über Nacht ist für die APC-Konjugation an SA effizienter als Markierungszeiten von 2 Stunden. Die Markierung während 2 Stunden ist jedoch für die meisten Forscher zweckmäßiger.
Die Zeit der Reaktion zwischen Sulfo-NHS und EDAC ist wichtig von der Zugabe von Bindungspartner zu dem rehydratisierten Farbstoffkomplex. Einige der Farbstoffe (Marker) rehydratisieren bekanntermaßen mit unterschiedlichen Geschwindigkeiten. Die kurzen Lebensdauern von EDAC bei fast neutralem pH erfordert jedoch, dass die Marker sofort rehydratisiert werden oder wenigstens einigermaßen homogene Lösungen ergeben, um eine gleichmäßige Aktivierung zu ermöglichen und eine Vernetzung von Markern untereinander zu verhindern.
Beispiele
Um ein vollständigeres Verständnis der Erfindung zu erleichtern, werden im Folgenden mehrere Beispiele angegeben. Der Umfang der Erfindung ist jedoch nicht auf spezielle Ausführungsformen eingeschränkt, die in diesen Beispielen offenbart werden, welche nur zur Veranschaulichung dienen.
Beispiel 1. Konjugation von Phycoerythrin an Streptavidin über 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid (EDAC)/N-Hydroxysulfosuccinimid (Sulfo-NHS) entweder direkt (Standard-Simultanverfahren) oder ausgehend von einem gefriergetrockneten Reagens (sequentielles Gefrierverfahren)
Verfahren: Zwei Verfahren zur Herstellung von Konjugaten wurden nach den im Folgenden skizzierten Vorschriften durchgeführt. Im ersten Verfahren (dem Standard-Simultanverfahren oder Standardverfahren) wurde Phycoerythrin (PE) mit Streptavidin (SA) konjugiert, indem man die beiden Proteine (PE & SA) in Puffer gleichzeitig mit EDAC und Sulfo-NHS mischt. Das Gemisch wurde 2 h lang bei Raumtemperatur inkubiert, so dass man das Konjugat erhielt. Im zweiten Verfahren (das sequentielle Gefrierverfahren oder erfindungsgemäße Verfahren) wurden Lösungen von PE + D–(+)-Trehalose, EDAC und Sulfo-NHS-Lösungen mit genau angegebenem Gehalt nacheinander schnellgefrieren gelassen, um eine Wechselwirkung der Chemikalien zu verhindern, und dann gefriergetrocknet. Nach dem Gefriertrocknen wurde das gefriergetrocknete Material in streptavidinhaltigem Phosphatpuffer resuspendiert. Man ließ die Reaktanten wenigstens 2 h lang bei Raumtemperatur reagieren. Das resultierende Konjugat wurde durch Gelfiltration gereinigt. Die Konzentration und die differentielle Bindung von Konjugaten wurden bestimmt und sind in der Datentabelle nach der folgenden detaillierten Beschreibung der Vorschrift angegeben.
Standardsimultanverfahren: B-Phycoerythrin (B-PE) wurde gegen 1 Liter 100 mM Natriumphosphat, das 0,05% Natriumazid enthielt (pH = 6,8), dialysiert. Dieser Puffer wurde 3 h lang einmal jede Stunde gewechselt, und dann wurde die Konzentration von B-PE durch Verwendung seines Extinktionskoeffizienten bestimmt. Dann wurde Streptavidin in einem Verhältnis von 2 zu 1 (B-PE/SA) zu einer ungefähr 3 mg/ml B-PE-Lösung gegeben. Dann wurde 1 M EDAC in demselben Puffer hergestellt, der auch oben verwendet wurde, und in das Reaktionsgemisch gegeben, so dass man eine endgültige Konzentration von 0,05 M EDAC erhielt. Dann wurde 0,1 M Sulfo-NHS-Lösung unter Verwendung desselben Puffers wie oben hergestellt. Sulfo-NHS wurde in das Reaktionsgemisch gegeben, so dass man eine endgültige Konzentration von 0,005 M Sulfo- NHS erhielt. Die Reaktion wurde 2 h lang bei Raumtemperatur durchgeführt. Dann wurde das Konjugat über Sephadex 300 (Amersham Pharmacia Biotech) gereinigt, wobei man 100 mM Natriumphosphat, 150 mM NaCl und 0,05% Natriumazid (pH 7,2) als Laufmittelpuffer verwendete.
Sequentielles Gefrierverfahren: B-PE wurde wie oben gegen 1 L 100 mM Natriumphosphat, das 0,05% Natriumazid enthielt (pH 6,8), dialysiert. Dieser Puffer wurde 3 h lang einmal pro Stunde ausgetauscht. Die Konzentration von B-PE wurde anhand seines Extinktionskoeffizienten bestimmt. D–(+)-Trehalose-Pulver wurde zu 1 ml einer 3 mg/ml B-PE-Lösung gegeben, so dass man eine endgültige Konzentration von 0,1 M Trehalose erhielt. Das Gemisch wurde mit dem Wirbelmischer gemischt, bis das Pulver aufgelöst war, dann in 1-ml-Aliquoten in Mikrozentrifugenröhrchen in flüssigem Stickstoff schnellgefrieren gelassen. Dann wurden 1 M EDAC- und 0,1 M Sulfo-NHS-Stammlösungen in demselben Puffer, wie er oben verwendet wurde, hergestellt. Das gefrorene Reagens, das den Farbstoff enthielt, wurde mit EDAC-Stammlösung in einem solchen Volumen, dass man eine endgültige Konzentration von 0,05 M EDAC erhielt, wenn auf 1 ml rekonstituiert wurde, überschichtet und schnellgefrieren gelassen. Das Sulfo-NHS wurde in einem solchen Volumen zu den obigen gefrorenen Reagentien gegeben, dass man eine endgültige Konzentration von 0,005 M Sulfo-NHS in 1 ml endgültigem Volumen erhielt, und schnellgefrieren gelassen. Die Reihenfolge des sequentiellen Gefrierens ist nicht entscheidend; das schnelle Gefrierenlassen von Reagentien ist jedoch entscheidend, um sowohl die Aktivität des hinzugefügten Agens aufrechtzuerhalten als auch eine Wechselwirkung der Reagentien vor dem Rehydratisierungsschritt zu verhindern. Die gefrorenen Reagentien wurden dann über Nacht gefriergetrocknet. Am nächsten Tag wurde 1 ml einer Lösung, die SA in destilliertem Wasser enthielt, hergestellt, so dass ein 2/1-Stoffmengenverhältnis von B-PE zu SA entsteht, wenn man es in das Röhrchen gibt. Das gefriergetrocknete Gemisch wurde in 1 ml SA-Lösung resuspendiert und aufgelöst. Die Reaktion wurde 2 h lang bei Raumtemperatur durchgeführt, und dann wurde über Nacht bei 4°C aufbewahrt. Das Konjugat wurde über Sephadex 300 (Amersham Pharmacia Biotech) gereinigt, wobei man 100 mM Natriumphosphat, 150 mM NaCl und 0,05% Natriumazid (pH 7,2) als Laufmittelpuffer verwendete.
Assay der differentiellen Bindung. Eine schwarze 96-Napf-Mikrotiterplatte (Dynex Laboratories) wurde 4 h lang bei 37°C passiv mit 100 μl von 100 μg/ml biotinyliertem BSA pro Napf beschichtet. Die Platten wurden fünfmal mit einfach starkem PBS-Puffer (10 mM Natriumphosphat (pH 7,0), 150 mM Natriumchlorid und 0,05% Natriumazid) in einer Menge von 200 μl pro Napf gewaschen. Dann wurde die Platten 2 h lang bei RT mit 100 μl MBB-Blockierungspuffer (1,5% BSA, 1% Casein, 0,5% Gelatine und 0,1% Tween 20), der mit PBS auf halbe Stärke verdünnt war, blockiert. Nach dem Blockieren wurden die Platten fünfmal mit 200 μl 1 × PBS pro Napf gewaschen. Die Konjugate wurden in den angegebenen Konzentrationen mit 100 ng Biotin/100 μl oder ohne Biotin in 100 mM Natriumphosphat, das 0,05% Natriumazidpuffer (pH = 6,8) enthielt, gemischt und 20 min lang bei Raumtemperatur vorinkubiert. Dann wurden 100 μl Probe (mit oder ohne hinzugefügtes konkurrierendes Biotin) in die Näpfe der mit BSA-Biotin vorbeschichteten Platten gegeben. Diese ließ man 1 h lang bei Raumtemperatur reagieren. Dann wurden die Platten dreimal mit 100 mM Natriumphosphat, 150 mM NaCl, 0,05% NaN₃ (pH 7,2) gewaschen, wobei für jeden Waschvorgang 200 μl pro Napf verwendet wurden. Die feuchten Platten wurden auf einem Fluorolite-1000-Plattenleser (Dynex Laboratories) abgelesen, wobei man einen Filtersatz für Anregung bei 550 nm und Emission bei 590 nm verwendete.
Wirkung des Verhältnisses von Zielprotein zu Farbstoff (F/P) auf die spezifische Bindung. In diesem Experiment wurde das Verhältnis von Fluoreszenzfarbstoff zu Zielprotein (F/P) für die gefriergetrockneten Proben variiert, um zu sehen, ob bessere Konjugate entstehen würden. Zu den gefriergetrockneten Proben wurde vor dem Gefriertrocknen 0,5 M Trehalose als Kryoprotektor in 100 mM Natriumphosphatpuffer (pH 6,8) gegeben. Das Gefriertrocknen wurde in den ersten Experimenten 16 h lang durchgeführt. Sowohl für die nach dem sequentiellen Gefrierverfahren als auch die nach dem Standardsimultanverfahren hergestellten Konjugate betrug die Menge an EDAC 0,05 M, und die Menge an NHS betrug 0,005 M. Die Materialien wurden unmittelbar nach der Herstellung verwendet.
Der Assay wurde 2 h lang bei Raumtemperatur durchgeführt, und dann wurden die Proben vor dem Bindungsassay über Nacht bei 4°C gelagert.
Aus den Daten geht hervor, dass die noch nicht optimierte Konjugation bei dem Konjugat des Standardsimultanverfahrens besser funktioniert, aber das sequentielle Gefrierverfahren scheint ohne weitere Optimierung von Reagentien relativ gut zu funktionieren (≥ 78% differentielle Bindung). Die Daten, bei denen ein F/P-Verhältnis von 2 verwendet wurden, ergaben für die gefriergetrockneten Materialien jedoch eine bessere differentielle Bindung als bei einem F/P-Verhältnis von 3.
Beispiel 2. Wirkung einer längeren Gefriertrocknungszeit auf die Konjugateigenschaften bei Verwendung des sequentiellen Gefrierverfahrens.
In einem Versuch, die Eigenschaften des gefriergetrockneten Formats enger mit den flüssigen Materialien zu verknüpfen, wurde in diesem Experiment ein ausgedehnteres und erschöpfenderes Gefriertrocknen durchgeführt (64 h gegenüber 16 h), um zu gewährleisten, dass die gesamte Flüssigkeit aus dem Material entfernt wurde. Nur zwei Konjugatkonzentrationen wurden verwendet (10 und 5 μg/ml), und für alle Experimente wurde ein F/P-Verhältnis von 2 verwendet. Ansonsten waren alle Bedingungen so, wie es in Beispiel 1 beschrieben ist. Zwischen einer Verwendung der Farbstoffe für die Konjugation unmittelbar nach dem Gefriertrocknen oder nach einer Woche Lagerung bei –20°C wurde kein Unterschied beobachtet. Die erreichte differentielle Bindung war gleich groß wie die, die zuvor für die Konjugationsverfahren nach dem Standardsimultanverfahren beobachtet wurde. Anscheinend ist ein vollständiges Trocknen für die richtige Leistungsfähigkeit dieser Reagentien entscheidend.
Beispiel 3. Wirkung des pH-Werts auf Konjugate, die aus sequentiell gefrierendem/gefriergetrocknetem aktiviertem R-PE-Material hergestellt werden.
Um den optimalen Wertebereich für die Konjugatproduktion aus diesem Format zu bestimmen, wurden R-PE-Konjugate an Streptavidin so hergestellt, wie es in Beispiel 2 für B-PE beschrieben ist, außer dass der 100 mM Natriumphosphatpuffer auf verschiedene pH-Werte zwischen 6,8 und 7,4 eingestellt wurde und nach 2 h Reaktion bei Raumtemperatur mit 0,1 M Lysin abgelöscht wurde.
Alle Farbstoffe wurden mit einem F/P-Verhältnis von 2 angeboten, und die Reagentien unmittelbar nach dem Gefriertrocknen für die Konjugation verwendet. Bei den drei angewendeten Konzentrationen des Konjugats gab es nur wenig Unterschied in der differentiellen Bindung, die bei diesen verschiedenen pH-Werten beobachtet wurde. Bei pH 6,8 wurden die besten Daten erreicht, aber dieser Unterschied war nicht wesentlich besser als bei pH 7,4, und tatsächlich würden alle wahrscheinlich eine ausreichende Leistungsfähigkeit als Konjugationsreagentien zeigen.
Beispiel 4. Funktionelle Stabilität von gefriergetrockneten Reagentien nach Lagerung bei –20°C.
Die Notwendigkeit eines stabilen Produkts für diese Erfindung ist offensichtlich. Eine kurzfristige Studie, um zu bestimmen, ob die Produkte sich schnell zersetzten, wurde durchgeführt, wobei man B-PE verwendete, das gemäß der Beschreibung in Beispiel 3 hergestellt und gefriergetrocknet wurde, außer dass 0,1 M Trehalose im Gefriermedium verwendet wurden. Die Reaktionen wurden bei pH 6,8 durchgeführt und nicht abgelöscht. Wenigstens bis zu drei Wochen Lagerung schienen wenig oder sogar eine günstige Wirkung auf die mit diesen Reagentien hergestellten Konjugate zu haben.
Beispiel 5. Konjugation von chemisch stabilisierten Phycobilisomen (PBXL-3; Martek Biosciences) mit Streptavidin unter Verwendung des sequentiellen Sulfo-NHS/EDAC/D–(+)-Trehalose-Gefrierverfahrens.
Das sequentielle Gefrierverfahren (Verfahren der Erfindung) wurde mit dem Standardsimultanverfahren zur Herstellung von PBXL-3-markierten Streptavidin-Konjugaten verglichen. Im Standardsimultanverfahren wurde PBXL-3 mit Streptavidin (SA), EDAC und Sulfo-NHS in Puffer kombiniert und in einer Weise, die Literaturverfahren analog war, gleichzeitig umgesetzt. Das Gemisch wurde 2 h lang bei Raumtemperatur inkubiert. Im sequentiellen Gefrierverfahren wurden die folgenden Reagentien nacheinander gefriergetrocknet: PBXL-3 in 100 mM Natriumphosphat plus D–(+)-Trehalose, 1 M EDAC und 0,1 M Sulfo-NHS in definierten Volumina. Die gefrorenen Materialien wurden über Nacht gefriergetrocknet, und dann wurde das getrocknete Pulver in streptavidinhaltigem Phosphatpuffer mit sehr geringer Konzentration resuspendiert. Man ließ 2 h lang bei Raumtemperatur reagieren. Dann wurden die Konjugate durch Gelfiltration über Sepharose 6B gereinigt. Die differentielle Bindung von Konjugaten wurde bestimmt und in Bezug auf die Leistungsfähigkeit der Konjugationsformate miteinander verglichen.
Vorschrift:
Standardsimultanverfahren: PBXL-3 wurde 3 h lang gegen 1 L 100 mM Natriumphosphat (pH 7,4) dialysiert, wobei der Puffer einmal pro Stunde gewechselt wurde. Die Konzentration von PBXL-3 wurde anhand seiner Extinktion bei 620 nm bestimmt (5 willk. Einh./mg PBXL-3). Streptavidin wurde mit einem F/P-Verhältnis von 0,4 oder 25 SA pro PBXL-3-Komplex zu der PBXL-3-Lösung gegeben. Eine 1 M Stammlösung von EDAC wurde in demselben Puffer, wie er oben verwendet wurde, hergestellt und in das Reaktionsgemisch gegeben, wobei man eine endgültige Konzentration von 0,05 M erhielt. Eine 0,1 M Sulfo-NHS-Lösung wurde hergestellt, wobei man denselben Puffer wie oben verwendete, und in das Reaktionsgemisch gegeben, wobei man eine endgültige Konzentration von 0,005 M erhielt. Dieses wurde 2 h lang bei Raumtemperatur umgesetzt. Das Konjugat wurde über Sepharose CL6B (Amersham Pharmacia Biotech) gereinigt, wobei man 100 mM Natriumphosphat, 150 mM NaCl und 0,05% Natriumazid (pH 7,2) als Laufmittelpuffer verwendete.
Sequentielles Gefrierverfahren: PBXL-3 wurde 3 h lang gegen 1 L 100 mM Natriumphosphat (pH 7,4) dialysiert, und der Puffer wurde einmal pro Stunde gewechselt. Die Konzentration von PBXL-3 wurde anhand seiner Extinktion bei 620 nm bestimmt (5 willk. Einh./mg Protein). Das Gemisch wurde (mit dem Wirbelmischer) mit D–(+)-Trehalose-Pulver bis zu einer endgültigen Konzentration von 0,5 M gemischt, dann in Aliquoten in Mikrozentrifugenröhrchen gegeben und in flüssigem Stickstoff oder auf einem Methanol/Trockeneis-Bad schnellgefrieren gelassen. Eine 1 M EDAC-Stammlösung wurde in demselben Puffer, wie er oben verwendet wurde, hergestellt und in einem solchen Volumen, dass man (beim Mischen aller Reagentien) eine endgültige Konzentration von 0,05 M erhielt, auf das gefrorene Material gegeben, während es noch unter der Temperatur des flüssigen Stickstoffs war, so dass man ein fast augenblickliches Gefrieren der hinzugefügten Materialien erreichte. Eine 0,1 M Sulfo-NHS-Lösung wurde hergestellt, wobei man denselben Puffer wie oben verwendete, und in einem solchen Volumen, dass man beim Mischen aller Reagentien eine endgültige Konzentration von 0,005 M erhielt, auf die zuvor gefrorenen Reagentien gegeben, die noch unter der Temperatur des flüssigen Stickstoffs waren, so dass man ein fast augenblickliches Gefrieren der hinzugefügten Materialien erreichte. Dies wurde über Nacht gefriergetrocknet. Eine Lösung, die SA in verschiedenen Stoffmengenverhältnissen enthielt, wurde unter Verwendung desselben Puffers wie oben hergestellt. Diese SA-Lösung wurde verwendet, um das gefriergetrocknete Gemisch auf das Lösungsvolumen vor dem Schritt des Gefriertrocknens zu resuspendieren (um alle Reagentien auf definierten Konzentrationen zu halten). Die resuspendierten Reagentien und SA wurden 2 h lang bei Raumtemperatur miteinander umgesetzt. Das resultierende Konjugat wurde über Sepharose CL6B (Amersham Pharmacia) gereinigt, wobei man 100 mM Natriumphosphat, 150 mM NaCl und 0,05% Natriumazid (pH 7,2) als Laufmittelpuffer verwendete.
Assay der differentiellen Bindung. Eine schwarze 96-Napf-Mikrotiterplatte (Dynex Laboratories) wurde 4 h lang bei 37°C passiv mit 100 μl von 100 μg/ml biotinyliertem BSA pro Napf beschichtet. Die Platten wurden fünfmal mit 1 × PBS-Puffer gewaschen und mit MBB-Blockierungspuffer blockiert, wie es oben beschrieben wurde. Die Platten wurden fünfmal mit 200 μl 1 × PBS pro Napf gewaschen. Die Konjugate wurden mit oder ohne 100 ng Biotin/100 μl, wie es in der Tabelle angegeben ist, in Assaypuffer miteinander gemischt und 20 min lang vorinkubiert, bevor man die Ansätze in Näpfe gab. Die vorinkubierten Materialien wurden in einer Menge von 100 μl/Napf hinzugefügt und 1 h lang bei Raumtemperatur reagieren gelassen. Die Platten wurden dreimal mit 200 μl pro Napf eines Puffers aus 100 mM Natriumphosphat (pH 7,2), 150 mM NaCl, 0,05% NaN₃ (pH 7,2) gewaschen. Die Platten wurden dann auf dem Fluorolite 1000 (Dynex Laboratories) abgelesen, wobei man einen 550 nm-Filter für die Anregung und einen 660-nm-Filter für die Emission verwendete, und die Spannung war auf 7,7 V eingestellt.
Beispiel 6. Vergleich des sequentiellen Gefrierverfahrens mit dem Standardsimultanverfahren für EDAC/Sulfo-NHS-Vernetzung und mit einem anderen Standardvernetzungsverfahren, SMCC/SATA.
Eine weitere Gruppe von Experimenten wurde durchgeführt, wobei man Konjugate miteinander verglich, die nach den beiden Sulfo-NHS/EDAC-Verfahren (sequentielles Gefrier- und Standardsimultanverfahren), wie sie in Beispiel 5 beschrieben sind, und nach einem Standard-SMCC/SATA-Konjugationsverfahren hergestellt wurden. Alle diese Verfahren ergaben eine ähnliche Leistungsfähigkeit.
Beispiel 7. Konjugation von Allophycocyanin (APC) an Streptavidin über das sequentielle Sulfo-NHS/EDAC-Gefrierverfahren im Vergleich zum Standardsimultanverfahren.
Verfahren: Das erfindungsgemäße Verfahren wurde in Bezug auf die Fähigkeit zur Herstellung von funktionsfähigen APC-markierten Streptavidin-Konjugaten mit einem Standardsimultanverfahren verglichen. Im Standardsimultanverfahren wurde APC gleichzeitig mit Streptavidin (SA), EDAC und Sulfo-NHS kombiniert. Dann wurde das Gemisch 2 h lang bei Raumtemperatur unter Bildung eines Konjugats inkubiert, und das Konjugat wurde durch Gelpermeation gereinigt. Im sequentiellen Gefrierverfahren wurde APC mit D–(+)-Trehalose gemischt und gefrieren gelassen. Dann wurde eine spezifische Menge EDAC-Lösung über den gefrorenen Farbstoff geschichtet und schnellgefrieren gelassen. Die unvermischten (aufgrund des Schnellgefrierens) gefrorenen Reagentien wurden über Nacht gefriergetrocknet. Die trockenen Reagentien wurden in streptavidinhaltigem Niederphosphatpuffer resuspendiert und wenigstens 2 h lang bei Raumtemperatur umgesetzt. Die resultierenden Konjugate wurden durch Gelfiltration gereinigt. Die Konzentration und die differentielle Bindung von Konjugaten wurden bestimmt und in Bezug auf ihre Fähigkeit, Biotin spezifisch zu binden, miteinander verglichen.
Vorschrift:
Standardsimultanverfahren: APC wurde 3 h lang gegen 1 L 100 mM Natriumphosphat, das 0,05% Natriumazid enthielt (pH 7,2), dialysiert, wobei der Puffer einmal pro Stunde gewechselt wurde. Die Konzentration von APC wurde anhand seines Extinktionskoeffizienten bestimmt. Streptavidin wurde mit einem F/P-Verhältnis (Fluoreszenzfarbstoff zu Zielprotein) von 1,2 zu 1 zu einer 3–5 mg/ml APC-Lösung gegeben. Eine 1 M EDAC-Lösung wurde in demselben Puffer, wie er oben verwendet wurde, hergestellt und dann zu dem Reaktionsgemisch gegeben, wobei man eine endgültige Konzentration von 0,05 M EDAC erhielt. Eine 0,1 M Stammlösung von Sulfo-NHS wurde in demselben Puffer wie oben hergestellt und dann in das Reaktionsgemisch gegeben, wobei man eine endgültige Konzentration von 0,005 M Sulfo-NHS erhielt. Das Reaktionsgemisch wurde wenigstens 2 h lang bei Raumtemperatur inkubiert. Das resultierende Konjugat wurde über einer Sephadex-300-Säule (Amersham Pharmacia) gereinigt, wobei man 100 mM Natriumphosphat, 150 mM NaCl, 0,05% Natriumazid (pH 7,2) als Laufmittelpuffer verwendete.
Sequentielles Gefrierverfahren: APC wurde wie oben dialysiert und quantifiziert. D–(+)-Trehalose-Pulver wurde zu einer 3–5 mg/ml APC-Lösung gegeben, wobei man eine endgültige Konzentration von 0,5 M Trehalose erhielt. Das Gemisch wurde mit einem Wirbelmischer gemischt, bis das Pulver aufgelöst war. Die Lösung wurde in Aliquote aufgeteilt und in flüssigem Stickstoff oder einem Trockeneis/Methanol-Bad schnellgefrieren gelassen. Dann wurden eine 1 M EDAC- und eine 0,1 M Sulfo-NHS-Stammlösung hergestellt, wie es oben beschrieben ist. Die gefrorene Pigmentlösung wurde mit Aliquoten von EDAC-Lösung in einem solchen Volumen, dass man bei der Resuspension eine endgültige Konzentration von 0,05 M erhielt, überschichtet, während sich die Röhrchen noch in der Gefrierlösung befanden, was zu einem Schnellgefrieren der EDAC-Zugabe führte. Die Sulfo-NHS-Stammlösung wurde in einem solchen Volumen, dass man eine endgültige Konzentration von 0,005 M erhielt, auf die bereits gefrorenen Reagentien in dem Röhrchen gegeben, während sich diese noch in der Gefrierlösung befanden, was zu einem Schnellgefrieren des Sulfo-NHS-Reagens führte. Die gefrorenen Reagentien wurden über Nacht gefriergetrocknet. Eine wässrige SA-Lösung, die ein F/P-Verhältnis von 1,2/1 ergibt, wurde hergestellt und dann verwendet, um die gefriergetrockneten Reagentien auf 1 ml zu resuspendieren. Diese reagierten 2 h lang bei Raumtemperatur und wurden dann über Nacht bei 4°C aufbewahrt. Das resultierende Konjugat wurde so gereinigt, wie es oben beschrieben ist.
Assay der differentiellen Bindung. So durchgeführt, wie es oben für PBXL-3 beschrieben wurde, wobei man den Filtersatz für Anregung bei 590 nm und Emission bei 660 nm verwendete.
Das sequentielle Gefrierverfahren für NHS/EDAC-vermittelte Vernetzung, das in dieser Erfindung beschrieben ist, lässt sich insofern sehr gut mit dem Simultanmischverfahren vergleichen, als es stets eine hohe differentielle Bindung mit dem APC-markierten Streptavidin an BSA-Biotin-Platten in Anwesenheit oder Abwesenheit von konkurrierendem Biotin ergibt. Für die Lagerung bei –20°C während bis zu einer Woche scheint keine Trehalose notwendig zu sein.
Beispiel 8. Konjugation von PBXL-3 (Martek Biosciences an Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG über das sequentielle Sulfo-NHS/EDAC-Gefrierverfahren (erfindungsgemäß).
Verfahren und Vorschrift: In diesem Experiment wurde PBXL-3 wie oben dialysiert und quantifiziert. D–(+)-Trehalose-Pulver wurde zu einer 3 mg/ml PBXL-3-Lösung gegeben, wobei man eine endgültige Konzentration von 0,5 M Trehalose erhielt. Das Gemisch wurde mit dem Wirbelmischer gemischt, bis das Pulver aufgelöst war. Es wurde in Aliquote aufgeteilt und in einem Bad aus flüssigem Stickstoff schnellgefrieren gelassen. Dann wurden 1 M EDAC- und 0,1 M Sulfo-NHS-Stammlösungen hergestellt, wie es oben beschrieben ist. Die gefrorene Pigmentlösung wurde mit Aliquoten von EDAC-Lösung in einem solchen Volumen, dass man bei der Resuspension (1 ml) eine endgültige Konzentration von 0,05 M erhielt, überschichtet, während sich die Röhrchen noch in der Gefrierlösung befanden, was zu einem Schnellgefrieren der EDAC-Zugabe führte. Die Sulfo-NHS-Stammlösung wurde in einem solchen Volumen, dass man eine endgültige Konzentration von 0,005 M erhielt, auf die bereits gefrorenen Reagentien in dem Röhrchen gegeben, während sich diese noch in der Gefrierlösung befanden, was zu einem Schnellgefrieren des Sulfo-NHS-Reagens führte. Die gefrorenen Reagentien wurden dann über Nacht gefriergetrocknet. Eine wässrige Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG-Lösung, die ein F/P-Verhältnis von 2/1 ergibt, wurde hergestellt und dann verwendet, um die gefriergetrockneten Reagentien auf 1 ml zu resuspendieren. Diese reagierten 2 h lang bei Raumtemperatur und wurden dann über Nacht bei 4°C aufbewahrt. Das resultierende Konjugat wurde so gereinigt, wie es oben beschrieben ist.
Assay der differentiellen Bindung. So durchgeführt, wie es oben für PBXL-3 beschrieben wurde, wobei man den Filtersatz für Anregung bei 590 nm und Emission bei 660 nm verwendete.
Obwohl dieses sequentielle Verfahren in diesem Beispiel nicht optimiert war, zeigt es, dass kommerziell erhältliche Antikörper an PBXL-Farbstoffe gebunden werden können. Diese Konjugate könnten dann in Funktionsbindungsassays verwendet werden.
Beispiel 9. Bestimmung der optimalen Zeit für die Zugabe von Zielprotein (Streptavidin) zu resuspendierten gefriergetrockneten Reagentien unter Verwendung der Sulfo-NHS/EDAC-Chemie, formatiert als sequentielles Gefrierverfahren.
Die Daten in 2 zeigen ein Beispiel für einen Zeitverlauf, der verwendet wird, um beim sequentiellen Gefrierverfahren zu bestimmen, wann der optimale Zeitpunkt ist, um den Konjugationspartner hinzuzufügen. Eine wesentliche Frage dafür, wie leicht dieses Verfahren zu verwenden ist, bestand darin, zu bestimmen, ob es in einem Schritt (das Protein in Lösung zugeben, und man ist fertig) gegenüber "Rehydratisieren und später zu einem optimalen Zeitpunkt hinzufügen" durchgeführt werden kann. Dies geschah hauptsächlich, um zu sehen, wie viel besser die Konjugate hergestellt werden konnten, da angenommen wurde, dass eine unbeschränkte Vernetzung der falschen Reagentien stattfinden könnte, wenn man nicht zuerst den Marker aktiviert, bevor man den Bindungspartner hinzufügt.
Assay der differentiellen Bindung. Der Bindungsassay wurde so durchgeführt, wie es oben für PBXL-3 beschrieben wurde, wobei man den Filtersatz für Anregung bei 590 nm und Emission bei 660 nm verwendete. 2 zeigt die Wichtigkeit des Hinzufügens des Bindungspartners innerhalb einer halben Stunde nach dem Rehydratisieren der sequentiell gefrorenen Probe. Die Konjugationseffizienz wird stark dadurch beeinflusst, dass man die chemischen Reaktanten und das PBXL-3 während ausgedehnter Zeitspannen in Lösung hat, bevor der Bindungspartner hinzugefügt wird. Interessanterweise gibt es keine starke Erhöhung der funktionellen Wirksamkeit zwischen der Zugabe des Bindungspartners nach 30 min (wenn der Farbstoff vollständig aktiviert sein würde) und der sofortigen Zugabe des Bindungspartners. Dies kommt unerwartet und liefert ein sehr einfaches Format für das sequentielle Gefrierverfahren (mit einer wässrigen Suspension des Zielproteins rehydratisieren, inkubieren, reinigen und verwenden).
Da chemische Reaktanten in Lösungsphase um so ineffektiver werden, je länger man vor der Zugabe des Bindungspartners wartet, wären Formate, bei denen flüssige Materialien aufbewahrt werden, für diese Art Reaktion nicht geeignet. Nach vierundzwanzig Stunden sind die reaktiven Gruppen nicht mehr funktionsfähig. Diese Daten veranschaulichen die Notwendigkeit einer räumlichen oder zeitlichen Trennung zwischen dem NHS, EDAC und PBXL-3, für die durch das sequentielle Gefrierverfahren gesorgt wird, indem man ein einfaches und schnelles Verfahren zur Herstellung von geeigneten Konjugaten bereitstellt.
Beispiel 10. Stabilität von PBXL-3-markiertem Streptavidin, das unter Verwendung des sequentiellen Gefrierverfahrens hergestellt wurde.
Die Stabilität eines PBXL-3-markierten Streptavidin-Konjugat wurde zu mehreren Zeitpunkten bewertet, um zu bestimmen, ob bei markierten Proteinen, die mit dem sequentiellen Gefrierverfahren hergestellt wurden, eine ausreichende Stabilität vorhanden war. Der Bindungsassay wurde so durchgeführt, wie es oben beschrieben ist, außer dass zu jedem Zeitpunkt eine Biotin-Dosis-Wirkungs-Kurve erzeugt wurde, um die Stabilität dieser Konjugate besser bewerten zu können. 3 zeigt drei Biotin-Dosis-Wirkungs-Kurven, die drei Proben entsprechen, die aus einem Durchlauf des sequentiellen Gefrierverfahrens hergestellt wurden und im Verlauf von einem Monat (1 Tag, 7 Tage, 28 Tage) rehydratisiert und am Tag der Rehydratisierung mit derselben Streptavi dincharge konjugiert wurden. Die drei virtuell überlappenden freien Biotin-Dosis-Wirkungs-Kurven weisen darauf hin, dass die Markierung des PBXL-3 an Streptavidin über die gesamte Lagerungszeit eines Monats der durch diese Erfindung beschriebenen gefriergetrockneten Reagentien ziemlich gleichbleibend ist.

Claims

Gefäß, das N-Hydroxysuccinimid (NHS), ein wasserlösliches Carbodiimid und einen Marker, der eine Amin- oder Carboxy-Struktureinheit enthält, enthält, wobei sich diese Komponenten in trockener, für eine Rehydratisierung bei pH 7 geeigneter Form in einem einzigen Gefäß befinden.
Verfahren zum Konjugieren eines Markers mit einer Zielstruktureinheit, umfassend: a) Anordnen eines Markers, NHS und eines Carbodiimids in einem Behälter, so dass die drei Komponenten in Bezug auf eine gegenseitige Reaktion voneinander abgesondert sind; b) Lagern der Komponenten in trockener Form; und c) Hydratisieren der Komponenten, so dass eine Reaktion zwischen ihnen eingeleitet wird, wobei eine Zielstruktureinheit mit dem Marker konjugiert wird.
Verfahren gemäß Anspruch 2, wobei das Target zu dem Zeitpunkt hinzugefügt wird, wenn die Komponenten hydratisiert werden.
Verfahren gemäß Anspruch 2, wobei das Target nach der Hydratisierung der Komponenten hinzugefügt wird.
Verfahren zum Konjugieren eines Markers mit einer Zielstruktureinheit, umfassend: a) Derivatisieren eines Markers durch Reaktion mit einer einzigen Funktionalität eines heterofunktionellen Reagens; b) Anordnen des derivatisierten Markers in einem Behälter mit einem Aktivierungsreagens, das für die Aktivierung der nicht umgesetzten Funktionalität des heterofunktionellen Reagens oder seines Reaktionspartners spezifisch ist, so dass der derivatisierte Marker und das Aktivierungsreagens in Bezug auf eine gegenseitige Reaktion voneinander abgesondert sind; c) Hydratisieren des Markers und des Aktivierungsreagens; d) Entfernen des Aktivierungsreagens in Gegenwart einer Zielstruktureinheit, wodurch die Zielstruktureinheit mit dem Marker konjugiert wird.
Verfahren zum Konjugieren eines Markers mit einer Zielstruktureinheit gemäß Anspruch 5, umfassend: a) Derivatisieren eines Markers, der primäre oder sekundäre Amine enthält, mit einer Maleinimid-Funktionalität; b) Anordnen des Maleinimid-derivatisierten Markers in einem Behälter mit einem Reduktionsmittel in trockener Form; c) Hydratisieren des Markers und des Reduktionsmittels; und d) Entfernen des Reduktionsmittels in Gegenwart einer Zielstruktureinheit, wodurch die Zielstruktureinheit mit dem Marker konjugiert wird.
Gefäß, das einen Marker, der mit einer einzigen Funktionalität eines heterofunktionellen Reagens derivatisiert ist, und ein Aktivierungsreagens, das für die Aktivierung der nicht umgesetzten Funktionalität des hetero funktionellen Reagens oder seines Reaktionspartners spezifisch ist, enthält, wobei sich diese Komponenten in trockener, für eine Rehydratisierung geeigneter Form in einem einzigen Gefäß befinden.