WO1992012995A1 - Verfahren zum koppeln von kohlenhydraten an träger - Google Patents

Verfahren zum koppeln von kohlenhydraten an träger Download PDF

Info

Publication number
WO1992012995A1
WO1992012995A1 PCT/EP1991/001916 EP9101916W WO9212995A1 WO 1992012995 A1 WO1992012995 A1 WO 1992012995A1 EP 9101916 W EP9101916 W EP 9101916W WO 9212995 A1 WO9212995 A1 WO 9212995A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
group
carbohydrate
conjugate
thiol
alk
Prior art date
Application number
PCT/EP1991/001916
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Reinhard Geiger
Maxmilian Schneller
Original Assignee
Medor Laboratorien Für Biochemie Und Klinische Chemie Gmbh
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Medor Laboratorien Für Biochemie Und Klinische Chemie Gmbh filed Critical Medor Laboratorien Für Biochemie Und Klinische Chemie Gmbh
Publication of WO1992012995A1 publication Critical patent/WO1992012995A1/de

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54353—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals with ligand attached to the carrier via a chemical coupling agent
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A61K47/643—Albumins, e.g. HSA, BSA, ovalbumin or a Keyhole Limpet Hemocyanin [KHL]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/107—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides
    • C07K1/1072—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides by covalent attachment of residues or functional groups
    • C07K1/1077—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides by covalent attachment of residues or functional groups by covalent attachment of residues other than amino acids or peptide residues, e.g. sugars, polyols, fatty acids

Definitions

  • the invention relates to a method for coupling carbohydrates, which have a free or semi-acetally bound aldehyde group, to carriers, in particular proteins.
  • This carrier is, for example, proteins.
  • the object of the present invention is to provide a simple coupling method for connecting carbohydrates or carbohydrate structures to proteins and other carriers.
  • the carbonyl group is reduced to a -CH 2 -NH 2 group (reductive amination) in the first step.
  • the reductive amination is preferably carried out in the presence of a source of ammonium ions, for example ammonium salts or aqueous ammonia.
  • Ammonium salts are preferably used here, which react slightly acidic (pH 4-7), for example ammonium chloride and acetate.
  • Reductive amination is preferably carried out in a slightly acidic environment (pH 4-7).
  • Alk 1 and Alk 2 independently of one another for a direct bond or for a straight or branched alkylene group with 1 to 20 C - Atoms, in particular 1 to 6 carbon atoms and furthermore in particular 1 to 4 carbon atoms, are available, the sum of the carbon atoms in the alkylene groups being 20 20 and the alkylene groups being mono- or polysubstituted independently of one another by halogen and -NO 2
  • Ph stands for a direct bond or a phenylene group, where the phenylene group can be mono- or poly-substituted by halogen, -NO 2 or a C 1 -C 6 alkyl group.
  • This amidation can be carried out, for example, according to the method described by J.
  • SPDP N-succinimidyl-3- (2-pyridyldithio) propionate
  • SPDP N-succinimidyl-3- (2-pyridyldithio) propionate
  • the -CH 2 -NH 2 group is converted into a CH 2 -NH-C (O) -CH 2 -CH 2 -SH group.
  • the -CH 2 -CH 2 unit (the formula of SPDP is shown in the examples) is replaced by one described above
  • a mild reducing agent for example mercaptoethanol or DTT (dithioerythritol) is also used in the amidation in order to maintain or keep the sulfhydryl group introduced in the amidation in the reduced form.
  • the residues R 1 to R 2 listed in the reaction scheme shown above can be any residues and residues customary for carbohydrates or carbohydrate units.
  • a Kohienhydrat-Koppiungsgiied conjugate is then obtained.
  • the carbohydrate can then, as explained in more detail below, be bound to a carrier via the inserted coupling member.
  • Such a carbohydrate coupling member conjugate can also be obtained in a one-step reaction.
  • the carbohydrate or the compound containing a carbohydrate is reacted with an organic compound which acts as a coupling member and carries both a thiol group and an amino group, with reductive amination of the aldehyde group by this amino group.
  • a reductive amination of the aldehyde group of the carbohydrate or of the carbohydrate unit therefore also takes place in this case.
  • this muscle unit is simultaneously introduced into the carbohydrate.
  • a compound of the following general formula I is preferably used:
  • B is a divalent organic cooling unit which bears both the amino group and the thiol group mentioned and serves as a spacer unit.
  • a dimer of this compound of the general formula I can also be used.
  • cysteamine is used, especially in the form of a hydrochloride.
  • This one step conversion is illustrated in the reaction scheme below using cysteamine.
  • the presentation based on the implementation with cysteamine is only for the purpose of easier presentation and is not intended to be a limitation.
  • the carbonyl group is reductively aminated by an amino group.
  • the aniino group can be introduced as a free amino group or as a group bonded to an organic molecular unit. In the case of the free amino group, this is amidated by introducing a group having a thiol group.
  • This group or molecular unit serves as a spacer unit and carries a thiol group, via which the carbohydrate coupling member conjugate obtained (to be explained below) is coupled to a carrier.
  • This spacer unit thus serves as a coupling member of the carbohydrate to a carrier.
  • the introduction of a basic center into the carbohydrate or into the kohien avoided hydrate unit on the anomeric carbon atom.
  • the reductively aminated carbohydrates obtained in the first step can be isolated by gel chromatography.
  • a thiol group can be introduced not only into "normal" carbohydrates, for example monosaccharides, disaccharides and oligosaccharides, but into all those compounds which have a carbohydrate structure, provided that the carbohydrate or the carbohydrate structure or unit has a free or has semi-acetal bound aldehyde group.
  • This aldehyde group can also be located in a side chain of the carbohydrate.
  • This aldehyde group can also be introduced, for example by oxidation. The only decisive factor is that this aldehyde group is capable of being reductively aminated by the amino group of the compound used as the coupling member, a -CH 2 -NH bond being formed.
  • a wide variety of compounds can be used as compounds for the reaction in one step, which can act as a coupling member and carry both a thiol group and an amino group.
  • the reason for this is that the organic molecular unit between the amino group and the thiol group only serves as a spacer unit or as a "spacer unit".
  • a spacer unit which is as inert as possible (for example an alkylene group having 1 to 20, in particular 2 to 6, carbon atoms).
  • the spacer unit can also carry one or more functional groups. Of course, these should not interfere with the reactions taking place in the process according to the invention.
  • the first stage of the process according to the invention is advantageously carried out in a solvent in which the carbohydrate is soluble.
  • carbohydrate provided that it is used alone in the context of the general statements, is not only a “correct” carbohydrate, but also the one above
  • the reductive amination can be carried out using
  • the carbohydrate coupling member conjugate obtained in the first stage is combined with a via the introduced thiol group, which can be a free thiol group (SH group) or an activated thiol group (explained below) coupling-capable carrier implemented and thereby coupled to it.
  • the carrier must be able to form a disulfide bridge or a thioether bridge with the thiol group of the carbohydrate coupling member conjugate, so that a covalent bond is formed.
  • the residues R 1 - R 4 in the above scheme can be of any nature and are customary for carbohydrates.
  • a carrier can also be used which contains a maleimide unit or into which such a unit has been inserted.
  • the carbohydrate coupling member conjugate containing a thiol group When reacting with the carbohydrate coupling member conjugate containing a thiol group, the following reaction takes place, which is a kind of Michael addition:
  • a thioether bridge is thus formed.
  • a thioether bridge also forms when you do that
  • the second stage of the process according to the invention is also preferably carried out in a solvent, for example an aqueous buffer solution.
  • the method according to the invention thus makes it possible, on the one hand, to modify carbohydrates in such a way that they have a thiol group capable of coupling, and on the other hand to couple such a modified carbohydrate to a carrier.
  • the carriers can be proteins, for example. These proteins with a carbohydrate coupled to them can be used for immunization purposes.
  • Antibodies against the carbohydrates are formed, which can be isolated if desired.
  • the corresponding immunization methods and methods for obtaining and isolating antibodies are of a conventional nature.
  • Carriers to which a carbohydrate has been coupled with the aid of the method according to the invention can also be used for affinity chromatography, for example for the isolation and purification of proteins which bind to carbohydrates.
  • Another possible application is then to use, according to the invention, labeled carriers coupled with a carbohydrate for the localization of carbohydrate-binding molecules.
  • a conjugate that is obtainable according to the invention can be coupled with a maleimide-biotin conjugate and in this way carbohydrate-binding proteins can be detected with the aid of avidin-enzyme conjugates.
  • biotin conjugates can also be used in biochemical analysis (lectin detection) and in patho-biocnemics (search for tumor cells via tumor-specific lectins). Instead of biotin, other markers can also be used.
  • carbohydrates can thus be coupled to a wide variety of proteins and for a wide variety of purposes.
  • the process according to the invention can also be used to introduce carbon hydrate chains into recombinantly produced protein molecules.
  • the neuraminyl-lactose-cysteamine conjugate obtained in this way is then purified by means of silica gel chromatography. To do this, suspend silica gel 60 in solvent 1 (chloroform:
  • the DC detection is carried out by first spraying the DC plates with a thiol-specific detection agent after the chromatography (8 mg Ellmans reagent / 10 ml 0.1 mol / l sodium phosphate buffer, pH 8), then briefly heating and
  • the first fraction is eluted cysteamine
  • Sialic acid and with the help of Ellmans reagent determined the number of thiol groups. The result is a value of 1.53 ⁇ mol for sialic acid and 1.45 ⁇ mol for thiol; Overall yield 40% based on thiol.
  • Lactose (corresponds to 27.8 ⁇ mol), 142 mg cysteamine (corresponds to 1270 ⁇ mol), 10 mg NaCNBH 3 (corresponds to 160 ⁇ mol).
  • the reaction is carried out in 3 ml of H 2 O at a pH of approx. 5.
  • the mixture is heated under reflux for 4 h to approx.
  • the working up is carried out as in the working up of the neuraminyllactose described in the second stage in the example above.
  • the yield is approximately 50%.
  • the coupling to the carrier then takes place as described above for neuraminyl lactose.
  • Resorcinol spray reagent for N-acetyl-neuraminyilactosyl-cysteamine is tested. Under these conditions NLC is visible as a purple spot at the start, while the starting compound, ie N-acetyl-neuraminyllactose, has an Rf value of about 0.5. The fractions are then checked with the aid of the ninhydrin reagent for unreacted cysteamine, which is visible with a purple spot at an Rf value of 0.1.
  • the fractions containing NLC are combined, the pH is adjusted to about 7.5 with NaH 2 PO 4 and concentrated in a rotary evaporator at about 30 ° C. to about 4 ml.
  • the total amount of NLC is determined using Ellman's reagent (yield 60%).
  • the solution can be used in this form for coupling to a suitable carrier, as described in Example 1.
  • Ganglioside GM1 obtained by ozonolysis of GM1; Schwarzmann et al. Methods of Enzymol. 1987, 138, pp. 319-314).
  • the 1-deoxy-1-amino-monosialogangliotetraose-containing fractions are combined, adjusted to a pH of about 7.5 with NaH 2 PO 4 and concentrated to about 2 ml at a maximum of 30 ° C. using a rotary evaporator.
  • SPDP dissolved in ethanol
  • the reaction mixture is left to stand at room temperature for 1 h.
  • a little DTT is added and the solution is again subjected to gel filtration on Sephadex G-10 (see above).
  • Fractions of 2 ml are collected and examined by means of thin layer chromatography in eluent system 1 and resorcinol reagent for the reaction product which has an Rf value of approx. 0.2.
  • the appropriate fractions are combined and concentrated using a rotary evaporator at a maximum of 30 ° C. to a volume of approx. 2 ml.
  • the solution can be used in this form for coupling to a suitable carrier.
  • Bovinus serum albumin (BSA) was treated with SPDP in a manner known per se, so that about 12 pyridyl disulfide groups were bound to 1 BSA molecule.
  • Cysteamine conjugate takes place in a 0.1 molar phosphate buffer, pH 7.5 + 0.1 NaCl, in a molar ratio of 1.25: 1 (neuraminyllactose-cysteamine: pyridyl disulfide groups).
  • the amount of pyridylthione molecules released in the reaction is equivalent to the amount of coupled carbohydrate
  • Neoglycoprotein When quantifying neuraminic acid (using a resorcino assay) and protein (using a Pierce BCA assay), the value is 12 neuraminic acids per BSA molecule. All the pyridyl disulfide groups present have thus been converted. The coupling described here is explained in more detail using the reaction scheme shown below.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)

Abstract

Es wird ein Verfahren zum Koppeln von Kohlenhydraten oder Verbindungen, die eine Kohlenhydrateinheit enthalten, an Träger, insbesondere Proteine, bereitgestellt. Bei diesem Verfahren wird in der ersten Stufe ein Kohlenhydrat, das über eine freie oder halbacetalisch gebundene Aldehydgruppe verfügt, oder eine Verbindung eingesetzt, deren Kohlenhydrateinheit eine derartige Aldehydgruppe besitzt. Diese Aldehydgruppe wird reduktiv aminiert. Über die dabei in das Kohlenhydrat oder die Kohlenhydrateinheit eingeführte Aminogruppe wird ein eine Thiolgruppe tragendes organisches Kopplungsglied daran gebunden, wobei ein Kohlenhydrat-Kopplungsglied-Konjugat gebildet wird. Das so entstandene Kohlenhydrat-Kopplungsglied-Konjugat wird über die Thiolgruppe in einer zweiten Stufe an einen Kopplungsfähigen Träger gekoppelt, so daß das Konjugat über eine Disulfidgruppe oder eine Thioetherbrücke kovalent an den Träger gebunden wird. Die erfindungsgemäß modifizierten Träger, an die ein Kohlenhydrat gekoppelt wurde, können für immunologische Zwecke, in der biochemischen Analytik und in der Pathobiochemie eingesetzt werden.

Description

Verfahren zum Koppeln von Kohlenhydraten an Träger
BESCHREIBUNG
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Koppeln von Kohlenhydraten, die über eine freie oder halbacetalisch gebundene Aldehydgruppe verfügen, an Träger, insbesondere Proteine.
Häufig besteht der Wunsch danach, Kohlenhydrate oder Kohlenhydratstrukturen an einen Träger koppeln zu können. Bei diesem Träger handelt es sich beispielsweise um Proteine.
Bei den bisher bekannten Verfahren sind die Ausbeuten jedoch gering. Zudem ist die Auftrennung der erhaltenen Komponenten häufig schwierig. Es besteht daher derzeit noch kein effizientes und einfach durchzuführendes Verfahren zur Anbindung von Kohlenhydraten oder von eine Kohlenhydrateinheit aufweisenden Verbindungen an Proteine und andere Träger.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein einfaches Kopplungsverfahren zur Anbindung von Kohlenhydraten oder Kohlenhydratstrukturen an Proteine und andere Träger bereitzustellen.
Gelöst wird diese Aufgabe durch die Lehre des Anspruchs 1.
Beim erfindungsgemäßen Verfahrens setzt man somit ein Kohlenhydrat, das über eine freie oder halbacetalisch gebundene Aldehydgruppe verfügt, oder eine Verbindung ein, die eine Kohlenhydrateinheit mit einer derartigen Aldehydgruppe
besitzt. Der Kern des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht darin, daß man diese Aldehydgruppe reduktiv aminiert und die dabei in das Kohlenhydrat oder in die Kohlenhydrateinheit eingeführte Aminogruppe an ein eine Thiol-Gruppe tragendes, organisches Kopplungsglied bindet., wobei ein Kohlenhydrat-KopplungsgliedKonjugat gebildet wird. Diese Umsetzung kann man in einem oder zwei Schritten durchführen.
Bei der Umsetzung in zwei Schritten reduziert man im ersten Schritt die Carbonylgruppe zu einer -CH2 -NH2 -Gruppe (reduktive Aminierung). Die reduktive Aminierung führt man vorzugsweise in Anwesenheit einer Quelle für Ammoniumionen durch, beispielsweise Ammoniumsalzen oder wässrigem Ammoniak. Als
Ammoniumsalze setzt man dabei vorzugsweise solche ein, die leicht sauer (pH 4 - 7) reagieren, beispielsweise Ammoniumchlorid und -acetat.
Bei der reduktiven Aminierung arbeitet man vorzugsweise im leicht saurem Milieu (pH 4-7).
Im Anschluß an die reduktive Aminierung amidiert man dann die so erhaltene -CH2 -NH2 -Gruppe unter Einführung einer eine
Thiol-Gruppe tragenden Gruppe der folgenden Formel:
- CH2 - NH - C(O) - CH2 - Alk1 - Ph - Alk2 - SH worin Alk1 und Alk2 unabhängig voneinander für eine direkte 3indung oder für eine gerade oder verzweigte Alkyien-Gruppe mit 1 bis 20 C-Atomen, insbesondere 1 bis 6 C-Atomen und weiterhin insbesondere 1 bis 4 C-Atomen, stehen, wobei die Summe der C-Atome in den Alkylen-Gruppen ≤ 20 ist und die AlkylenGruppen unabhängig voneinander durch Halogen und -NO2 monooder polysubstituiert sein können, Ph für eine direkte Bindung oder ein Phenylen-Gruppe steht, wobei die Phenylen-Gruppe durch Halogen, -NO2 oder eine C1-C6 Alkyl-Gruppe mono- oder polysubstituiert sein kann.
Diese Amidierung kann man beispielsweise gemäß der von J.
Carlson et al im Biochemical Journal 1978, 173, S. 723 - 737 beschriebenen Arbeitsweise durchführen. Vorzugsweise setzt man dabei SPDP (N-Succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)propionat) ein. Bei Verwendung von SPDP überführt man die -CH2 -NH2-Gruppe in eine CH2 -NH-C(O)-CH2-CH2-SH-Gruppe. Ersetzt man im SPDP- Molekül die -CH2 -CH2 -Einheit (die Formel von SPDP ist in den Beispielen gezeigt) durch eine oben beschriebene
- CH2 - Alk1 - Ph - Alk2 - Einheit, dann kann man mit dem so modifizierten Molekül die -CH2-NH2-Gruppe in die anderen oben näher erläuterten, eine Thiol-Gruppe tragenden Gruppen der folgenden Formel
- CH2 - NH - C(O) - CH2 - Alk1 - Ph - Alk2 - SH überführen.
Die mit Hilfe von SPDP durchgeführte Umsetzung ist im nachstehenden Reaktionsschema näher erläutert.
Figure imgf000005_0001
Wie aus obigem Reaktionsschema ersichtlich ist, setzt man bei der Amidierung auch ein mildes Reduktionsmittel, beispielsweise Mercaptoethanol oder DTT (Dithioerythrit), ein, um die bei der Amidierung eingeführte Sulfhydrylgruppe in der reduzierten Form zu erhalten bzw. zu halten.
Bei den im oben gezeigten Reaktionsschema aufgeführten Resten R1 bis R2 kann es sich um beliebige Reste und um für Kohlenhvdrate bzw. Kohlenhydrateinheiten übliche Reste handeln. Bei der oben beschriebenen, aus zwei Schritten bestehenden Umsetzung erhält man dann ein Kohienhydrat-Koppiungsgiied-Konjugat. Das Kohlenhydrat kann dann, wie weiter unten näher erläutert ist, über das eingeführte Kopplungsglied an einen Träger gebunden werden.
Ein derartiges Kohlenhydrat-Kopplungsgiied-Konjugat kann man auch in einer einstufigen Umsetzung erhalten. Dazu setzt man das Kohlenhydrat bzw. die ein Kohlenhydrat enthaltende Verbindung mit einer sowohl eine Thiol-Gruppe als auch eine AminoGruppe tragenden, organischen, als Kopplungsglied fungierenden Verbindung unter reduktiver Aminierung der Aldehyd-Gruppe durch diese Aminogruppe um. Somit findet auch in diesem Fall eine reduktive Aminierung der Aldehyd-Gruppe des Kohienhydrats bzw. der Kohlenhydrateinheit statt. Da die Aminogruppe jedoch an eine organische Moleküleinheit -gebunden ist, wird diese Mcleküleinheit gleichzeitig mit in das Kohlenhydrat eingeführt. Vorzugsweise setzt man dabei eine Verbindung der folgenden allgemeinen Formel I ein:
H2N-B-SH (I) worin B eine divalente organische Moieküleinheit bedeutet, die sowohl die genannte Aminogruppe als auch die genannte ThiolGruppe trägt und als- Spacer-Einheit dient. Man kann auch ein Dimeres dieser Verbindung der allgemeinen Formel I zur Anwendung bringen. Am meisten bevorzugt setzt man Cysteamin, insbesondere in Form eines Hydrochlorids, ein.
Diese aus einem Schritt bestehende Umsetzung ist im nachstehenden Reaktionsschema unter Verwendung von Cysteamin erläutert. Die Darstellung anhand der Umsetzung mit Cysteamin geschieht lediglich aus Zwecken der einfacheren Darstellbarkeit und soll keine Beschränkung darstellen.
Figure imgf000007_0001
In der ersten Stufe des erfindungsgemäßen Verfahrens und somit sowohl in der oben beschriebenen Umsetzung in einem Schritt als auch in der Umsetzung in zwei Schritten wird die CarbonylGruppe durch eine Amino-Gruppe reduktiv aminiert. Die AniinoGruppe kann dabei als freie Amino-Gruppe oder als eine an eine organische Moleküleinheit gebundene Gruppe eingeführt werden. Im Falle der freien Amino-Gruppe amidiert man diese unter Einführung einer eine Thiol-Gruppe aufweisenden Gruppe. Diese Gruppe bzw. Moleküleinheit dient als Spacer-Einheit und trägt eine Thiol-Gruppe, über die das erhaltene KohlenhydratKopplungsglied-Konjugat (wird nachstehend erläutert) an einen Träger gekoppelt wird. Diese Spacer-Einheit dient somit als Kopplungsglied des Kohlenhydrats an einen Träger. Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren wird somit in der ersten Stufe eine freie -SH-Gruppe in das Kohlenhydrat bzw. in die Kohlenhydrateinheit eingeführt.
Wird die erste Stufe des erfindungsgemäßen Verfahrens in zwei Schritten durchgeführt, dann wird die Einführung eines basisehen Zentrums in das Kohlenhydrat bzw. in die Kohien hydrateinheit am anomeren Kohlenstoffatom vermieden. Die im ersten Schritt erhaltenen reduktiv aminierten Kohlenhydrate können durch Gelchromatographie isoliert werden.
Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren kann eine Thiol-Gruppe nicht nur in "normale" Kohlenhydrate, beispielsweise Monosaccharide, Disaccharide und Oligosaccharide, sondern in alle solche Verbindungen eingeführt werden, die eine Kohlenhydratstruktur besitzen, sofern das Kohlenhydrat oder die Kohlenhydratstruktur bzw. -einheit eine freie oder halbacetalisch gebundene Aldehydgruppe besitzt. Diese Aldehydgruppe kann sich im übrigen auch in einer Seitenkette des Kohlenhydrats befinden. Auch kann diese Aldehydgruppe eingeführt sein, beispielsweise durch Oxidation. Entscheidend ist lediglich, daß diese Aldehydgruppe in der Lage ist, durch die Amino-Gruppe der als Kopplungsglied eingesetzten Verbindung reduktiv aminiert zu werden, wobei sich eine -CH2-NH-Bindung bildet.
Als Verbindungen für die Umsetzung in einem Schritt, die als Kopplungsglied fungieren können und sowohl eine Thiol-Gruppe als auch eine Amino-Gruppe tragen, können die vielfältigsten Verbindungen eingesetzt werden. Dies hat seine Ursache darin, daß die organische Moleküleinheit zwischen der Amino-Gruppe und der Thiol-Gruppe lediglich als Spacereinheit oder als "Abstandseinheit" dient. Zweckmäßigerweise setzt man eine möglichst inerte Spacereinheit (beispielsweise eine Alkylengruppe mit 1 bis 20, insbesondere 2 bis 6 Kohlenstoffatomen) ein. Die Spacereinheit kann jedoch auch eine oder mehrere funktioneile Gruppen tragen, Diese sollten natürlich die bei dem erfindungsgemäßen Verfahren stattfindenden Reaktionen nicht stören.
Es ist im übrigen auch möglich, ein Dimeres der als Kopplungsglied dienenden Verbindung zur Anwendung zu bringen. In diesem Fall haben die beiden Thiol-Gruppen von zwei derartigen
Verbindungen eine Disulfidbrücke gebildet, die im Anschluß an die reduktive Aminierung aufgespalten wird.
Die erste Stufe des erfindungsgemäßen Verfahrens führt man zweckmäßigerweise in einem Lösungsmittel durch, in dem das Kohlenhydrat löslich ist. Es darf an dieser Stelle darauf hingewiesen werden, daß der Ausdruck "Kohlenhydrat" sofern er im Rahmen der allgemeinen Ausführungen in Alleinstellung verwendet wird, nicht nur ein "richtiges" Kohlenhydrat, sondern auch die oben näher
erläuterten kohlenhydrathaltigen Strukturen etc. bezeichnet.
Als Lösungsmittel finden zweckmäßigerweise Wasser und Methanol sowie Gemische daraus Anwendung.
Die reduktive Aminierung kann man unter Verwendung von
Natriumborhydrid und bevorzugt von Natriumcyanborhydrid durchführen.
In der zweiten Stufe des erfindungsgemäßen Verfahrens wird das in der ersten Stufe erhaltene Kohlenhydrat-KopplungsgliedKonjugat über die eingeführte Thiol-Gruppe, die eine freie Thiol-Gruppe (SH-Gruppe) oder eine aktivierte Thiolgruppe (wird weiter unten erläutert) sein kann, mit einem kopplungsfähigen Träger umgesetzt und dadurch daran gekoppelt. Der Träger muß dabei in der Lage sein, mit der Thiol-Gruppe des Kohlenhydrat-Kopplungsglied-Konjugates eine Disulfidbrücke oder eine Thioetherbrücke auszubilden, so daß eine kovalente Bindung gebildet wird. Dies wird in dem nachfolgenden Schema exemplarisch dargestellt:
Figure imgf000010_0001
Die Reste R1 - R4 im obigen Schema können beliebiger Natur und für Kohlenhydrate übliche Reste sein. Die Kopplung von Trägern über Thiol-Gruppen und auch die
Modifizierung von Trägermolekülen, so daß sie mit Thiol-Gruppen koppeln können, ist im übrigen bekannt. Eine Übersicht über derartige Kopplungsreaktionen findet sich beispielsweise in Methods in Enzymolpgy, Vol. 91 (Academic Press 1983),
Seiten 580 bis 609.
In dem oben gezeigten Schema entstand durch die Kopplung aus der Thiol-Gruppe des Kohlenhydrat-Koppplungslieds-Konjugats und der Thiol-Gruppe des Trägers eine Disulfidbrücke. Es gibt nun zahlreiche Möglichkeiten, eine derartige Kopplung unter Ausbildung einer Disulfidbrücke vorzunehmen.
So ist es beispielsweise möglich, Träger mit N-Succinimιdyl-3- (2-Pyridyldithio)propionat (SPDP) zu aktivieren. Die aktivierte Verbindung wird dann mit einem erfindungsgemäß erhältlich, eine Thiol-Gruppe aufweisenden Kohlenhydrat-Koppiungsglied-Konjugat umgesetzt. Dies ist im nachstehenden Schema erläutert:
Figure imgf000011_0001
KH = Kohlenhydrat Die oben beschriebene Aktivierung eines Trägers mit SPDP ist im übrigen in der in den nachstehenden Beispielen angeführten Literaturstelle von J. Carlsson (1978) näher erläutert.
Auch ist es möglich, die Thiol-Gruppe des Kohlenhydrat-Kopplungsglied-Konjugats mit 2-Dipyridyl-disulfid oder 4- Dipyridyl-disulfid zu aktivieren und dann mit einem eine
Thiol-Gruppe tragenden Träger umzusetzen gemäß dem nachstehenden Schema:
Figure imgf000011_0002
Man kann auch einen Träger einsetzen, der eine Maleinimideinheit enthält bzw. in den eine derartige Einheit eingeführt worden ist. Bei der Umsetzung mit dem eine Thiol-Gruppe enthaltenden Kohlenhydrat-Kopplungsglied-Konjugat findet dabei folgende Reak-tion statt, die eine Art Michael-Addition darstellt:
Figure imgf000012_0001
In diesem Fall wird somit eine Thioetherbrücke ausgebildet. Eine Thioetherbrücke bildet sich auch, wenn man das
erfindungsgemäß erhältliche Kohlenhydrat-Kopplungsglied-Konjugat mit einem Träger umsetzt, der durch die Thiol-Gruppe substituiert wird. Das nachfolgende Schema zeigt diesen
Reaktionstyp anhand eines eine Jodacetylgruppe tragenden
Trägers:
KH-NH-CH2-CH2-SH + I-CH2-C(O)-Träger
→ KH-NH-CH2-CH2-S-CH2-C(O)-Träger + HI
Auch die zweite Stufe des erfindungsgemäßen Verfahrens wird vorzugsweise in einem Lösungsmittel, beispielsweise einer wäßrigen Pufferlösung, durchgeführt.
Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht es somit, einerseits Kohlenhydrate derart zu modifizieren, daß sie eine zur Kopplung fähige Thiol-Gruppe aufweisen, und andererseits ein derart modifiziertes Kohlenhydrat an Träger zu koppeln. Bei den Trägern kann es sich beispielsweise um Proteine handeln. Diese Proteine mit einem darauf gekoppelten Kohlenhydrat können für Immunisierungszwecke eingesetzt werden.
Dabei werden Antikörper unter anderem gegen die Kohlenhydrate gebildet, die man gewünschtenfalls isolieren kann. Die entsprechenden Immunisierungsverfahren und Verfahren zur Gewinnung und Isolierung von Antikörpern sind üblicher Natur. Trager, auf die mit Hilfe des erfinäungsgemaßen Verfanrens ein Kohlenhydrat gekoppelt wurαe , können auch für αie Affinitatschromatographie eingesetzt werden, beispielsweise zur Isolierung und Reinigung von an Kohlenhydrate bindenden Proteinen. Eine andere Anwendungsmoglichkeit besteht dann, erfinαungsgemäß mit einem Kohlenhydrat gekoppelte, markierte Trager zur Lokalisierung von Kohlenhydrat-bindenden Molekülen einzusetzen. So kann man beispielsweise ein erfindungsgemäß ernältliches Konjugat mit einem Maleinimid-Biotin-Konjugat koppeln und auf diese Weise kohlenhydratbindende Proteine mit Hilfe von Avidin-Enzym-Konjugaten detektieren. Diese Biotin-Konjugate können ferner in der biochemischen Analytik (LektinDetektion) und in der Patho-biocnemie (Suche von Tumorzellen über tumorspezifische Lecthine) Anwendung finden. Statt Biotin können auch andere Marker verwen-det werden.
Erfindungsgemäß können somit Kohlenhydrate an die verschiedensten Proteine und für die verschiedensten Zwecke gekoppelt werden.
Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren können auch Kohlennydratketten in rekombinant hergestellte Protein-Moleküle eingeführt werden.
Erfindungsgemäß ist es auch möglich, eine eine Thiol-Gruppe aufweisende und als Kopplungsglied dienende Verbindung in Ganglioside einzuführen und diese so modifizierten Ganglioside an Tragerproteine gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren zu koppeln.
Beispiele
Beispiel 1
1. Stufe
Reαuktive Aminierung von Kohlenhydraten mit Cysteamin
(beschrieben am Beispiel von Neurammyl-Lactose).
Man löst 2,38 mg Neuraminyl-Lactose-Ammoinumsalz (3,66 μmol), 64 mg Cysteamin-HCl (571 μmol) und 9 mg NaCNBH3 (144 μmol) in 3 ml absolutem Methanol und erhitzt am Rückfluß. Man hält, den pH-Wert der Lösung während der Reaktion bei 4 bis 5, wobei man den pH-Wert erforderlichenfalls mit 100%-iger Essigsäure (Kontrolle mit Indikatorpapier) einstellt. Nach 1,5 h gibt man weitere 7 mg NaCNBH3 (112 μmol) in 0,5 ml Methanol gelöst zu. Nach 4 h engt man den Ansatz im Rotationsverdamper im Vakuum zur Trockne ein.
Das so erhaltene Neuraminyl-Lactose-Cysteamin-Konjugat reinigt man anschließend mittels Kieselgelchromatographie. Dazu suspendiert man Kieselgel 60 im Laufmittel 1 (Chloroform :
Methanol : Wasser = 25:20:4 ml) und füllt es in eine Glassäule mit Glasfritte (Durchmesser 0,8 cm) bis zu einer Gelhöhe von ca. 18 cm. Den zur Trockne eingedampften Reaktionsansatz löst man in 0,2 ml Wasser und gibt ihn auf die Säule. Man eluiert die Säule mit Laufmittel 1 und sammelt Fraktionen zu 1 ml. Die erhaltenen Fraktionen untersucht man dünnschichtchromatographisch (DC-System - DC-Platten: Kieselgei 60-HPTLC; Laufmittel: 32%-ige Ammoniaklösung : Ethanol = 40:60). Die DC- Detektion führt man durch, indem man die DC-Platten nach der Chromatographie zunächst mit einem thiolspezifischen Detektionsmittel besprüht (8 mg Ellmans-Reagens/10 ml 0,1 mol/l Natriumphosphatpuffer, pH 8), danach kurz erhitzt und
anschließend mit Resorcinol-Lösung besprüht.
Als erste Fraktion eluiert man Cysteamin, dann
Natriumcyanborhydrid und schließlich nicht umgesetzte Neuraminyl-Lactose. Sobald man diese Komponenten dünnschichtchromatographisch im Eluat nicht mehr nachweisen kann (nach einem Elutionsvolumen von ca. 20 ml), stellt man auf Laufmittel 2 (32%-ige Ammoniaklösung : Methanol = 40:60) um und eluiert die Säule damit. Unter diesen Elutionsbedingungen eluiert man reines Neuraminyl-Lactose-Cysteamin-Konjugat von der Säule. Man vereint die betreffenden Fraktionen und engt mit Hilfe eines Rotationsverdampfers im Vakuum ein. Den Rückstand löst man zur Abtrennung störender Ionen in 1 ml 0,1 mol/l Natriumphosphatpuffer, pH 8, und versetzt mit etwas
Dithiothreit (um die Cysteaminkonjugate im reduzierten Zustand zu erhalten). Anschließend eluiert man mit Wasser über eine Sephadex G-10 Säule (Durchmesser: 1 cm; Länge: 18 cm). Die Fraktionen untersucht man ebenfalls dünnschichtchromatographisch (DC-System wie oben beschrieben) und vereint die entsprechenden Fraktionen und lyophilisiert. Zur Ausbeutebestimmung quantifiziert man das Lyophilisat, indem man mit Hilfe des Resorcinol-Tests die Anzahl von
Sialinsäure und mit Hilfe von Ellmans-Reagens die Anzahl von Thiol-Gruppen bestimmt. Es ergibt sich ein Wert von 1,53 μmol für Sialinsäure und 1,45 μmol für Thiol; Gesamtausbeute 40% bezogen auf Thiol.
2. Stufe
Kopplung des in der ersten Stufe erhaltenen KohlenhydratCysteamin-Konjugats an Träger (dargestellt am Beispiel von Neuraminyllactose-Cysteamin und bovinem Serumalbumin). Man setzt bovines Serumalbumin (BSA) mit SPDP (J. Carlsson et al. (1978) Biochem. J. 173. 723 - 737; Protein Thiolation and Reversible Protein-Protein Conjugation, N-Succinimidyl 3-(2-Pyridyldithio) propionate, a new heterobiofunctional reagent; SPDP) um, so daß etwa 20 SPDP-Moleküle an 1 BSA-Molekül gebunden werden.
Zur Kopplung des Kohlenhydrat-Cysteamin-Konjugats an BSA verfährt man wie folgt: man löst 0,43 mg Neuraminyl-LactoseCysteamin-Konjugat und 1 mg BSA-SPDP in 0,7 ml Puffer (0,1 mol/l Phosphatpuffer; pH 7,5; enthält 0,1 mol/1 NaCl; molares Verhältnis von Neuraminyl-Lactose-Cysteamin-Konjugat zu BSA = 40:1) und inkubiert 18 h bei 37º C. Danach gibt man den
Reaktionsansatz auf eine Sephadex G-100 Säule (2 cm × 17 cm) und eluiert mit Wasser. Man sammelt Fraktionen von 1 ml. Die Elution verfolgt man dünnschichtchromatographisch und über die Extinktion bei 280 nm. Man eluiert das Kohlenhydrat-CysteaminBSA-Konjugat im Ausschlußvolumen der Säule, gut abgetrennt vom restlichen nicht umgesetzten Kohlenhydrat-Cysteamin-Konjugat, das man für eine weitere Kopplung je nach Bedarf verwenden kann. Das Produkt wurde anschließend hinsichtlich des molaren
Verhältnisses von Sialinsäure zu Albumin mit Hilfe des Resorcinol-Tests bzw. durch Messung der Absorption bei 280 nm .unter Berücksichtigung von nicht umgesetzten SPDP-Gruppen) analysiert. Es ergab sich ein Wert von 16 Sialinsäure-Resten pro BSA-Molekül sowie von 4 am BSA-Molekül noch verbleibenden, nicht umgesetzten SPDP-Gruppen.
Gemäß dem oben beschriebenen Beispiel ist es auch möglich, Lactose an den Träger zu koppeln. Dabei setzt man 10 mg
Lactose (entspricht 27,8 μMol), 142 mg Cysteamin (entspricht 1270 μMol), 10 mg NaCNBH3 (entspricht 160 μMol ) ein. Man arbeitet dabei in 3 ml H2 O bei pH ca. 5. Man erhitzt dabei 4 h bis ca. 80ºC am Rückfluß, wobei man den pH-Wert bei 4 bis 5 hält. Die Aufarbeitung erfolgt wie bei der in der zweiten Stufe im obigen Beispiel beschriebenen Aufarbeitung der Neuraminyllactose. Die Ausbeute beträgt ca. 50 %. Die Kopplung an den Träger erfolgt dann wie oben für Neuraminyl-Lactose beschrieben.
Beispiel 2 Reduktive Aminierung von Kohlenhydraten mit Cysteamin erläutert am Beispiel von N-Acetyl-Neuraminyllactose:
Man löst 2,4 mg N-Acetyl-Neuraminyllactose (3,7 μMol), 64 mg Cysteamin-HCl (571 μMol) und 9 mg NaCNBH3 (140 μMol) in 3 ml absolutem Ethanol und erhitzt am Rückflußkühler auf 70º C. Der pH-Wert der Lösung beträgt etwa 5 (Kontrolle mit Indikatorpapier). Nach 2,5 h engt man die Reaktionslösung im Rotationsverdampfer unter Vakuum ein und löst den Rückstand in 2 ml Wasser. Man gibt etwas DTT zur Lösung, um die Sulfhydryl-Gruppen in der reduzierten Form zu halten. Die Lösung gibt man anschließend über eine mit 0,02 M Na2CO3, pH 11, äquilibrierte Sephadex G-10-Säule (2 cm × 20 cm), um das überschüssige
Cysteamin abzutrennen. Man sammelt Fraktionen von 2 ml, die einer Dünnschichtchromatographie im Laufmittelsystem 1
(CHCI3:CH3OH:H2O = 60:40:9 ml) unterworfen werden und mit
Hilfe des Resorcinol-Sprühreagenz auf N-Acetyl-Neuraminyilactosyl-Cysteamin ( NLC ) geprüft wird. Unter diesen Bedingun gen ist NLC als lila Fleck am Start sichtbar, während die Ausgangsverbindung, d.h. N-Acetyl-Neuraminyllactose, etwa einen Rf-Wert von 0,5 besitzt. Man prüft die Fraktionen anschließend mit Hilfe des Ninhydrin-Reagenz auf unreagiertes Cysteamin, das mit einem violetten Fleck bei einem Rf-Wert von 0,1 sichtbar wird.
Man vereint die NLC-haltigen Fraktionen, stellt den pH-Wert mit NaH2PO4 auf ca. 7,5 ein und konzentriert in einem Rotationsverdampfer bei maximal 30º C auf etwa 4 ml. Die Gesamtmenge an NLC bestimmt man mittels Ellmans Reagens (Ausbeute 60%). Die Lösung kann in dieser Form zur Kupplung an einen geeigneten Träger verwendet werden, wie dies im Beispiel 1 beschrieben ist.
Beispiel 3 Reduktive Aminierung von Kohlenhydraten mit einer Quelle für Ammoniumionen und anschließende Amidierung mit N-succinimidyl 3-(2-pyridyldithio)propionat (SPDP), erläutert am Beispiel von Monosialogangliotetraose, der KohlenhydratStruktur von
Gangliosid GM1 ( erhalten durch Ozonolyse von GM1; Schwarzmann et al. Methods of Enzymol. 1987, 138, S. 319 - 314).
Man löst 1 mg Monosialogangliotetraose (1 μl), 56 mg Ammoniumacetat (727 μmol) und 10 mg NaCNBH3 (156 μmol) in 3 ml absolutem Methanol und erhitzt am Rückflußkühler auf 70º C. Der pH-Wert der Lösung beträgt etwa 5 (Kontrolle mit Indikatorpapier). Nach 2h stellt man die Reaktionslösung mit einer 0,1 ml NaOH-Lösung auf einen pH-Wert von 11 ein, engt im
Vakuum ein und löst den Rückstand in 2 ml Wasser. Man gibt die Lösung anschließend über eine mit 0,02 M Na2CO3, pH 11, äqulibrierte Sephadex G-10 Säule (2 cm × 20 cm) und sammelt Fraktionen von 2 ml. Diese unterwirft man einer Dünnschichtchromatographie im Laufmittelsystem 1 (man vergleiche Beispiel 2) und prüft mit Hilfe des Resorcinol-Sprühreagenz auf 1-Desoxy-1-amino-monosialogangliotetraose. Unter diesen Bedingungen ist das Reaktionsprodukt als lila Fleck am Start sichtbar, während die Ausgangsverbindungen, Monosialogangliotetraose, etwa einen Rf-Wert von ca. 0,4 besitzen. Die Frak tionen prüft man anschließend mit Hilfe des Ninhydrin-Reagenz auf noch vorhandenes Ammoniumacetat, das mit einem violetten Fleck bei einem Rf-Wert von ca. 0,1 sichtbar wird.
Man vereint die 1-Desoxy-1-amino-monosialogangliotetraosehaltigen Fraktionen, stellt mit NaH2PO4 auf einen pH-Wert von ca. 7,5 ein und konzentriert mittels eines Rotationsverdampfers bei maximal 30º C auf etwa 2 ml . Zu dieser Lösung gibt man SPDP (in Ethanol gelöst) im zweifach molaren Überschuß zu und läßt das Reaktionsgemisch 1 h bei Raumtemperatur stehen. Dann versetzt man mit etwas DTT und unterzieht die Lösung wiederum einer Gelfiltration an Sephadex G-10 (siehe oben). Man sammelt Fraktionen von 2 ml und untersucht mittels Dünnschichtchromatographi im Laufmittelsystem 1 und Resorcinol-Reagenz auf das Reaktionsprodukt, das einen Rf-Wert von ca. 0,2 besitzt. Man vereint die entsprechenden Fraktionen und engt mit Hilfe eines Rotationsverdampfers bei maximal 30º C auf ein Volumen von ca. 2 ml ein. Die Lösung kann in dieser Form zur Kopplung an einen geeigneten Träger verwendet werden.
Beispiel 4 Kopplung von Kohlehydrat-Cysteamin-Konjugaten an Proteine, erläutert am Beispiel von Neuraminyllactose-Cysteamin und Bovinem Serumalbumin
Bovinus Serumalbumin (BSA) wurde auf per se bekannte Weise mit SPDP versetzt, so daß etwa 12 Pyridyldisulfidgruppen an 1 BSA- Molekül gebunden wurden. Die Kopplung des Kohlehydrat¬
Cysteamin-Konjugats erfolgt in einem 0,1 molaren Phosphatpuffer, pH 7,5 + 0,1 NaCl, im molaren Verhältnis von 1,25 : 1 (Neuraminyllactose-Cysteamin : Pyridyldisulfidgruppen). Die Menge der bei der Reaktion freigesetzten Pyridylthionmoleküle ist äquivalent der Menge an gekoppeltem Kohlenhydrat¬
Cysteamin-Konjugat, so daß der Reaktionsverlauf durch Beobachtung des Absorptionsverlaufes bei 343 nm mitverfolgt werden kann (erfolgt in Aliquoten). Nach etwa 4 h entspricht die Absorption bei 343 nm der Gesamtmenge an theoretisch freisetzbaren Pyridylthionmolekülen (ε = 8,08 × 103 M-1 × cm-1). Der Reaktionsansatz wird über eine Sephadex G-75 Säule (1 cm × 20 cm, im Reaktionspuffer äquilibriert) in Neoglycoprotein und niedermolekulare Bestandteile aufgetrennt. Man vereinigt die proteinhaltigen Fraktionen und analysiert das erhaltene
Neoglycoprotein. Bei der Quantifizierung von Neuraminsäure (mittels Resorcinoassay) und Protein (mittels Pierce BCA-Assay) ergibt sich ein Wert von 12 Neuraminsäuren je BSA-Molekül. Somit sind alle vorhandenen Pyridyldisulfid-gruppen umgesetzt. Die hier beschriebene Kopplung ist anhand des nachstehend gezeigten Reaktionsschemas näher erläutert.
Figure imgf000020_0001

Claims

PATENTANSPRÜCHE
Verfahren zum Koppeln von Kohlenhydraten oder von Verbindungen, die eine Kohlennydrateinheit enthalten, an
Trager, insbesondere Proteine,
dadurcn g e k e n n z e i c h n e t,
daß man
ein Kohlenhydrat, das über eine freie oαer halbacetalisch gebundene Aldehydgruppe verfügt, oder eine Verbindung, deren Kohlenhydrateinheit eine derartige Aldehyαgruppe besitzt, einsetzt,
a) in einer ersten Stufe diese Aldehydgruppe reduktiv aminiert und das Kohlenhydrat oder die Kohlenhydrateinheit über die dabei eingeführte Aminogruppe an ein eine Thiol-Gruppe tragendes, organisches Kopplungsglied bindet, wobei ein Kohlenhydrat-Kopplungsglied-Konjugat gebildet wird, und
b) in einer zweiten Stufe dieses so gebildete Konjugat mit einem kopplungsfähigen Träger derart zur Reaktion bringt, daß das Konjugat über seine Thiol-Gruppe unter Ausbildung einer Disulfidbrücke oder einer Thioethersrücke kovalent an den Träger gebunden wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1.
dadurcr- g e k e n n z e i c h n e t .
daß man in der ersten Stufe a) die Aldehydgruppe
a1) mit einer Quelle für Ammoniumionen in die
-CH2-NH2-Gruppe
überführt und dann die erhaltene -CH2-NH2-Gruppe zu einer eine Thiol-Gruppe tragenden Gruppe der folgenden Formel:
- CH2 - NH - C(O) - CH2 - Alk1 - Ph - Alk2 - SH worin
Alk1 und Alk2 unabhängig voneinander für eine direkte
Bindung oder für eine gerade oder verzweigte Alkylen- Gruppe mit 1 bis 20 C-Atomen. insbeondere 1 bis 6
C-Atomen, stehen, wobei die Summe der C-Atome in den Alkylen-Grupppe ≤ 20 ist und die Alkylen-Gruppen
unabhängig voneinander durch Halogen und -NO2 mono- oder polysubstituiert sein können,
Ph für eine direkte Bindung oder ein Phenylen-Gruppe steht, wobei die Phenylen-Gruppe durch Halogen, -NO2 oder eine C1-C6 Alkyl-Gruppe mono- oder polysubstituiert sein kann, amidiert oder
a2) mit einer Verbindung der allgemeinen Formel I:
H2N - B - SH (I) worin B eine divalente organische Molküleinheit bedeutet, die als Spacereinheit dient, oder einem Dimeren dieser Verbindung, umsetzt.
3. Verfahren nach Anspruch 2 ,
dadurch g e k e n n z e i c h n e t ,
daß man eine Verbindung der allgemeinen Formel I einsetzt, worin B eine gerade oder verzweigte Alkylen-Gruppe mit 1 bis 20 C-Atomen bedeutet oder für folgende aligemeine Formel steht:
- Alk3 - X - Alk4 - worin
X für eine Phenylen-Gruppe, -NH-NH-, -S-S-, -C(O)-O-, -C(O)-N-, -S(O)-, -S(O)2-, -C(OH, H)- , oder -C(NH2,H)- steht. Alk3 und Alk4 unabhängig voneinanαer für eine seraαe oder verzweigte Alkylen-Gruppe mit 1 DIS 20 C-Atomen, insbesondere 1 DIS 6 C-Atomen, stenen, wobei die Summe der C-Atome in αen Alkylen-Gruppen < 20 ist, und
Alk3 unα Alk4 unabhängig voneinanαer auch für eine direkte Bindung stehen können, falls X für eine Phenvlen- Gruppe stent.
Verfahren nach Ansprucn 3,
dadurch g e k e n n z e i c n n e t,
daß man als Verbindung der allgemeinen Formel I
Cysteamin, insbesondere in Form seines Hydrochlorids, einsetzt.
5. Verfanren nach Anspruch 2,
dadurcn g e k e n n z e i c n n e t,
daß man als Quelle für Ammoniumionen ein Ammoniumsalz oαer Ammoniak einsetzt und daß man die Amidierung mit Hilfe von N-Succιnιmιdyl-3-(2-pyridyldithio)propionat (SPDP) durchführt und so die Carbonylgruppe in eine
-CH2-NH-C(O)-(CH2)2-SH-Gruppe überführt. 6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5,
dadurcn g e k e n n z e i c h n e t,
daß man die reduktive Aminierung in Stufe a) in Gegenwart von Natriumcyanbornydrid ( NaCNBH3) durcnführt. 7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6,
dadurcn g e k e n n z e i c h n e t,
daß man in der Stufe b) einen Träger einsetzt, der i) mindestens eine Thiol- oder Disulfid-Gruppe trägt oder in den mindestens eine derartige Gruppe zuvor eingeführt worden ist, so daß die Thiol-Gruppe des Konjugats zusammen mit der Thiol- oder Disulfid-Gruppe des Trägers eine DisulfldbrücKe bildet,
ii) eine Maleinimideinheit enthält und mit αer Thiol- Gruppe des Konjugats in einer Art Michaeladdition eine Thioetnerbrücke bildete, oder iii) eine funktioneile Gruppe, insbesondere eine lodacetylgruppe, trägt, die durch die Thiolgruppe αes Konjugats unter Bildung einer Thioethergruppe substituiert wird, wodurch das Konjugat kovalent an den Träger gekoppelt wird.
Verfahren nach Anspruch 7,
dadurch g e k e n n z e i c h n e t ,
daß man in Schritt i) entweder den Träger mit N-Succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)propionat (SPDP) aktiviert und dann mit dem eine Thiol-Gruppe tragenden Konjugat umsetzt oder
daß man das eine Thiol-Gruppe tragende Konjugat mit 2- (oder 4-)Dipyridyl-disulfid aktiviert und dann mit dem eine Thiol-Gruppe tragenden Träger umsetzt.
Verfahren zum Einführen eines eine Thiol-Gruppe tragenden Kopplungsgliedes in Kohlenhydrate oder in eine Kohlenhydrateinheit enthaltende Verbindungen unter Bildung eines Kohlenhydrat-Koppungsglied-Konjugates
dadurch g e k e n n z e i c h n e t,
daß man ein Kohlenhydrat, das über eine freie oder halbacetalisch gebundene Aldehydgruppe verfügt, oder eine Verbindung, deren Kohlenhydrateinheit eine derartige Aldehydgruppe besitzt, einsetzt und diese Aldehydgruppe gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6 reduktiv aminiert und das Kohlenhydrat oder die Kohlenhydrateinheit über die dabei eingeführte Aminogruppe an ein eine Thiol-Gruppe tragendes, organisches Kopplungsglied bindet.
PCT/EP1991/001916 1991-01-18 1991-10-08 Verfahren zum koppeln von kohlenhydraten an träger WO1992012995A1 (de)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DEP4101394.8 1991-01-18
DE4101394A DE4101394A1 (de) 1991-01-18 1991-01-18 Verfahren zum koppeln von kohlenhydraten an traeger, insbesondere proteine

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO1992012995A1 true WO1992012995A1 (de) 1992-08-06

Family

ID=6423272

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/EP1991/001916 WO1992012995A1 (de) 1991-01-18 1991-10-08 Verfahren zum koppeln von kohlenhydraten an träger

Country Status (2)

Country Link
DE (1) DE4101394A1 (de)
WO (1) WO1992012995A1 (de)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1994024561A1 (en) * 1993-04-19 1994-10-27 Kurt Nilsson Immobilized carbohydrate biosensor
WO1997049425A1 (en) * 1996-06-25 1997-12-31 Stichting Instituut Voor Dierhouderij En Diergezondheid Vaccine comprising antigens bound to carriers through labile bonds

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4529712A (en) * 1981-09-18 1985-07-16 Research Corporation Coated cells and their use
US4587044A (en) * 1983-09-01 1986-05-06 The Johns Hopkins University Linkage of proteins to nucleic acids
EP0240200A2 (de) * 1986-03-17 1987-10-07 Cetus Corporation Vernetzende Agenzien, deren Verwendung und Herstellung
WO1990006774A1 (en) * 1988-12-22 1990-06-28 Xoma Corporation Hindered linking agents and methods

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4529712A (en) * 1981-09-18 1985-07-16 Research Corporation Coated cells and their use
US4587044A (en) * 1983-09-01 1986-05-06 The Johns Hopkins University Linkage of proteins to nucleic acids
EP0240200A2 (de) * 1986-03-17 1987-10-07 Cetus Corporation Vernetzende Agenzien, deren Verwendung und Herstellung
WO1990006774A1 (en) * 1988-12-22 1990-06-28 Xoma Corporation Hindered linking agents and methods

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
SPDP Heterobifunctional reagent, Pharmacia Fine Chemicals AB, 1978. *

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6231733B1 (en) 1993-04-17 2001-05-15 Kurt Nilsson Immobilized carbohydrate biosensor
WO1994024561A1 (en) * 1993-04-19 1994-10-27 Kurt Nilsson Immobilized carbohydrate biosensor
US6887689B2 (en) 1993-04-19 2005-05-03 Kurt Nilsson Immobilized carbohydrate biosensor
US7244582B1 (en) 1993-04-19 2007-07-17 Kurt Nilsson Immobilized carbohydrate biosensor
US7625722B2 (en) 1993-04-19 2009-12-01 Kurt Nilsson Immobilized carbohydrate biosensor
WO1997049425A1 (en) * 1996-06-25 1997-12-31 Stichting Instituut Voor Dierhouderij En Diergezondheid Vaccine comprising antigens bound to carriers through labile bonds

Also Published As

Publication number Publication date
DE4101394A1 (de) 1992-07-23

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP0618231B1 (de) Immunologisch aktive Konjugate und ein Verfahren zu ihrer Herstellung
DE2754086C3 (de) Spezifisches Bindungsverfahren zum Nachweis und zur Bestimmung eines Liganden in einem flüssigen Medium
EP0429611B1 (de) Aminoalkylmaleimide und davon abgeleitete hapten- und antigenderivate sowie konjugate mit peptiden oder proteinen
DE2808476C2 (de) Reagens zur Verwendung in immunochemischen Untersuchungsmethoden
EP0618192B1 (de) Homobidentale, trifunktionelle Maleinimid-Linker, und ihre Verwendung in immunologisch aktiven Konjugaten
EP0371262A1 (de) Neue Digoxigenin-Derivate und ihre Verwendung
EP0451810B1 (de) Hapten-Biotin-Konjugate und ihre Verwendung
DE3045786A1 (de) Stabile s-adenosyl-l-methionin-formulierung und verfahren zu ihrer herstellung
DE69434810T2 (de) Immobilisiertes markierungsverfahren
DE3000879C2 (de)
DE3629194A1 (de) Biotinylierungsreagentien
DE3821809C2 (de)
WO1998016536A1 (de) Saccharid-bibliothek
EP0326074B1 (de) Neue Haptenderivate und davon abgeleitete Hapten-Protein-Konjugate
DE3129705A1 (de) Mit dichlortriazinylaminofluorescein markierte verbindungen von biologischem interesse
WO1992012995A1 (de) Verfahren zum koppeln von kohlenhydraten an träger
CH659713A5 (de) Spezifisches bindungs-testverfahren und reagenszusammensetzung zur durchfuehrung dieses verfahrens.
DE3802060A1 (de) Hapten-protein-konjugate und ihre verwendung
EP0769490B1 (de) Reagenz zum Nachweis und zur Isolierung von Kohlehydraten oder Glycanrezeptoren
EP0599325B1 (de) Verbesserte B12-Konjugate
DE2924332C2 (de)
EP0055869B1 (de) Verfahren zur Bestimmung von Liganden, Test-Kit zur Durchführung des Verfahrens und seine Verwendung
DE4033714C2 (de)
DE3900639A1 (de) Verfahren zum nachweis von kohlenhydrathaltigen verbindungen und dazu geeignetes reagenz
EP0578145B1 (de) Verbindungen und Verfahren für gezieltes Photoaffinitätslabeling von Biomolekülen

Legal Events

Date Code Title Description
AK Designated states

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): CA JP US

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AT BE CH DE DK ES FR GB GR IT LU NL SE

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: CA

122 Ep: pct application non-entry in european phase