DE3120312C2 - Verfahren zur Herstellung von Darm-Glucagon-Antigenen und deren Verwendung - Google Patents

Abstract

Die Erfindung beschreibt ein Verfahren zur Herstellung eines Darm-Glucagon-Antigens, welches sich aus einem Peptid-Träger-Komplex zusammensetzt, wobei als Hapten ein Peptid, entsprechend der nachstehenden allgemeinen Formel, verwendet wird: R-Lys-Arg-Asn-Lys-Asn-Asn-Ile-Ala-OH worin R ein Halogenatom, eine Aminosäuregruppe oder eine Peptidgruppe mit 2 bis 20 Aminosäuren darstellt, sowie die Umsetzung dieses Haptens mit einem Träger in Gegenwart eines geeigneten Bindungsagens, um Hapten und Träger aneinander zu binden. Durch intradermale Verabreichung des beschriebenen Peptid-Träger-Komplexes an Säugetiere wird die Bildung von Antikörpern induziert. Unter Verwendung dieses Darm-Glucagon-Antikörpers ist es möglich, mit Hilfe von Immunoassay-Methoden diverse pathologische Zustände zu diagnostizieren.

Description

H-Gly-Lys;
H-Leu-Met-Asn-Thr-;
H-Val-GIn-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-;

H-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Vai-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-;
H-SeΓ-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-AΓg-AIa-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Tφ-Leu-Met-Asn-ThΓ-;

einsetzt und dieses mit einem üblichen Träger in Gegenwart eines üblichen Bindungsagens umsetzt.

2. Verwendung der nach dem Verfahren gemäß Anspruch 1 hergestellten Darm-Glucagon-Antigene zur Gewinnung von Darm-Glucagon-Antikörpern.

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Darm-Glucagon-Antigenen und deren Verwendung.

In der nachfolgenden Beschreibung werden die Abkürzungen für Aminosäuren, Peptide, Schutzgruppen, aktive Gruppen, entsprechend den Nomenklaturregeln von IUPAC oder IUB oder durch Verwendung üblicher Symbole dargestellt, wobei entsprechende Beispiele nachfolgend aufgeführt sind. Wenn die Aminosäuren auch optische Isomere einschließen können, so sollen diese, wenn nicht anders angegeben, L-Enantiomere anzeigen.

Arg:	Arginin
Trp:	Tryptophan
Asn:	Asparagin
Asp:	Asparaginsäure
Thr:	Threonin
Ser:	Serin
GIn:	Glutamin
AIa:	Alanin
VaI:	Valin
Met:	Methionin
Leu:	Leucin
Phe:	Phenylalanin
Lys:	Lysin
Tyr:	Tyrosin
He:	Isoleucin
GIy:	Glycin
Z:	Carbobenzoxygruppe
Su:	Succinimidogruppe
Tos:	p-Toluolsulfonylgruppe
Boc:	tert.-Butoxycarbonylgruppe.

Darm-Glucagon spielt als Hormon eine wichtige Rolle im Metabolismus der Zuckerabsorption. Die Bestimmung von Darm-Glucagon macht es möglich, verschiedene pathologische Stadien, an welchen Darm-Glucägon Anteil hat, zu diagnostizieren, wie z. B. Diabetes mellitus oder uarmkrebs. Es ist auch möglich, Krankheiten, wie Darmkrankheiten (z. B. Diarrhöe, Konstipation) Duodental-Geschwür, Carcinoid, Darm-Glucagon- Noma, zu diagnostizieren. Daher wird der Bestimmung von Darm-Glucagon auf dem Gebiet der Diagnose, Pathologie, Physiologie, in zunehmendem Maße Bedeutung gechenkt. Darm-Glucagon wird z. B. mit Hilfe einer Radioimmunoassaymethode (RIA-Methode) unter Verwendung eines Antikörpers (Antiserum) bestimmt, wobei letztere mit dem Darm-Glucagon reagiert. Als Antikörper, der für die Umsetzung von Darm-Glucagon geeignet ist, war bisher der Antikörper R-64 bekannt, welcher von Ravazzola et al (Endocrinology, Band 105, Nr. 2, S. 499—508 (1979)) hergestellt wurde. Dieser Antikörper besitzt jedoch keine Spezifität gegenüber Darm-Glucagon.

In Biochem. Biophys. Acta 493 (1977), S, 452-59, und Horm. Metab. Res. 8 (1976), S. 366=317, wurde ein Schweineglycentin beschrieben, das eine Glucagon-ähnliche Immunaktivität besitzt.

Außerdem offenbart DE-OS 28 05 663 ein Verfahren zur Herstellung eines Antigens aus einem Hapten mit einem Protein als Träger, und die Gewinnung von Antikörpern unter Verwendung dieses Antigens.

Im Hinblick auf die vorstehend beschriebene gegenwärtige Situation wurden von der Anmelderin ausgedehnte Untersuchungen durchgeführt, um ein Verfahren zur Gewinnung eines Antikörpers zu entwickeln, der eine Spezifität gegenüber Darm-Glucagon aufweist und der sich bei der Bestimmung von Darm-Glucagon nach der RIA-Methode oder dergleichen als äußerst effektiv erweist. Im Verlaufe dieser Untersuchungen wurde dann von

den Erfindern festgestellt daß die Octapeptid-C-terminale Sequenz R-Lys-Arg-Asn-Lys-Asn-Asn-Ile-Ala-OH von Schweizeglicentin eine antigene Determinante eines Antikörpers mit hoher Spezifität gegenüber Darm-Glucagon darstellt Bei den weiteren Untersuchungen, welche auf den vorstehend beschriebenen neuartigen Erkenntnissen beruhen, ist es den Erfindern gelungen, mit Erfolg ein Antigen zu synthetisieren, welches als Hapten ein Peptit enthält das über die vorstehend beschriebene spezifische Peptidsequenz verfügt und das durch die allgemeine Formel (I) dargestellt wird. Es ist gelungen, mittels dieses Antigens den gewünschten aufgezeichneten Antikörper mit hoher Spezifität gegenüber Darm-Glucagon herzustellen.

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von aus einem Peptid-Träger-Komplex bestehenden Darm-GIucagon-Antigenen, das dadurch gekennzeichnet ist daß man als Hapten ein Peptid der allgemeinen Formel

R-Lys-Arg-Asn-Lys-Asn-Asn-Ile- AIa-OH

in der R ein Wasserstoffatom, eine der Aminosäuregruppen GIy, AIa, Tyr oder Lys, oder eine der folgenden Peptidsequenzen darstellt:

H-GIy-Lys;

H-Leu-Met-Asn-Thr-;

H-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-;

H-Arg-Arg-Ala-Gin-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-; H-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-,

einsetzt und dieses mit einem üblichen Trag;.? in Gegenwart eines üblichen Bindungsagens umsetzt, sowie deren Verwendung.

Die F i g. 1 bis 4 zeigen grafisch die Spezifität der erfindungsgemäßen Antikörper.

Als Träger, welcher an das Hapten gebunden wird, können eine Reihe von hochmolekularen natürlichen oder synthetischen Proteinen verwendet werden, welche üblicherweise zur Herstellung von Antigenen eingesetzt werden. So eignen sich z. B. tierische Serumalbumine (z. B. Pferdeserumalbumin, Rinderserumalbumin, Kaninchenserumalbumin, menschliches Serumalbumin, Schafserumalbumin, etc.), tierische Serumglobuline (z. B. Pferdeserumglobulin, Rinderserumglobulin, Kaninchenserumglobulin, menschlisches Serumglobulin, Serumglobulin von Schafen etc.), Thyroglobuline von Tieren (z. B. Pferdethyroglobulin, Rinderthyroglobulin, Kaninchenthyroglobulin, menschlisches Thyroglobulin, Schafthyroglobulin), Hämoglobine von Tieren (z. B. Pferdehämoglobin, Rinderhämoglobin, Kaninchenhämoglobin, menschliches Hämoglobin, Schafhämoglobin), Hämocyanine von Tieren, Proteinextrakte von Ascaris (Ascaris-Extrakt; siehe Japanische Patentanmeldung 16 414/81), Polylysin, Polyglutaminsäure, Lysin-Glutaminsäure-Copolymer, Lysin- oder Ornithin-enthaltendes Copolymer.

Der Ascaris-Extrakt wird nachstehend im Detail beschrieben. Der Ascaris-Extrakt wird durch Extraktion von gemahlenem Ascaris-Suum nach einem üblichen Protein-Extraktionsverfahren gewonnen. Als Extraktionslösungsmittel können verschiedene für die Protein-Extraktion bekannte Lösungsmittel verwendet werden, wie Wasser, physiologische Kochsalzlösung, eine 50%ige wäßrige Methanol- oder Ethanollösung, eine ungefähr neutrale Pufferlösung, wobei physiologische Kochsalzlösung bevorzugt ist. Nach einer bevorzugten Methode kann der vorstehend beschriebene Extrakt z. B. wie folgt erhalten werden: viscera-freies Ascaris-Suum wird mit physiologischer Kochsalzlösung gewaschen und vorzugsweise In feine Streifen geschnitten, um die Extraktion zu erleichtern. Diese feinen Streifen werden dann zu einem proteinextrahierenden Lösungsmittel zugegeben, wie z. B. einer physiologischen Kochsalzlösung, worauf die Extraktion erfolgt, während das Gemisch homogenisiert wird. Die Extraktion wird im allgemeinen bei niederen Temperaturen durchgeführt, vorzugsweise bei ca. 2 bis 10°C. Die auf diese Weise erhaltene Extraktionslösung wird dann zentrifugiert; der Überstand wirJ gesammelt. Nach Dialyse des Überstandes wirJ das Dialysat lyophilisiert. Nach einem anderen Verfahren wird das Dialysat wiederum zentrifugiert, der Überstand gesammelt und, nach Entfernung der suspendierten Teilchen, lyophilisiert. Auf diese Weise wird der Ascaris-Extrakt hergestellt. Dieser kann gemäß der Erfindung verwendet werden, falls erforderlich nach einer weiteren Reinigung der entsprechend üblichen Proteinreinigungsmitteln, wie z. B. der Dialyse-Methode, der Gelfiltrations-Methode, der Adsorptions-Methode, Chromatographie, etc. Gemäß der Erfindung können Ascaris-Extrakte verwendet werden, wie sie z. B. in J. Immui;., 111, 260—268 (1973). J. Immun., 122,302 -308 (1979), J. Immun, 98,893-900 (1967) und Am. J. PhysioL, 199,575-578 (1960) beschrieben werden, sowie auch solche, weiche durch weitere Reinigung der Extrakte erhalten werden.

Als Bindungsagens zur Bindung von Hapten und Träger aneinander können solche Agentien verwendet werden, welche üblicherweise bei der Herstellung von Antigenen Verwendung finden. Insbesondere eignen sich aliphatische Dialdehyde, welche geeignet sind, um Aminogruppen miteinander zu vernetzen, wie Glyoxal, Malondialdehyd, Glutaraldehyd, Succinaldehyd, Adipoaldehyd; Dimaleimide, welche sich zur Verkettung von Thiolgruppen eignen, wie N,N'-o-Phenylendimaleimid, N,N'-m-Phenylendimaleimid; Maleimidocarboxyl-N-hydroxysuccinimid-ester-Verbindungen, welche sich zur Kreuzverkettung ve .1 Aminogruppe und Thiolgruppe eignen, wie m-Maleimidobenzyol-N-hydroxysuccinimid-ester, 4-(Maleimidomethyl)-cyclohexan-1 -carboxyl-N'-hydroxysuccinimid-ester; Reagentien, welche bei Reaktionen zur Bildung von Peptidbindungen verwendet werden und geeingnet sind, eine Aminogruppe an eine Carboxylgruppe durch eine Amidobindung zu verbinden, wie Dehydrat-Kondensierungsagentien von Carbodiimiden (z. B. Ν,Ν-Dicyclohexylcarbodiimid, N-Ethyl-N'-dimethyl-aminocarbodiimid, 1 -Ethyl-3-diisopropylaminocarbodiimid, 1 -Cyclohexyl-3-(2-morpholinyl-4-ethyl)carbodiimid); und dergleichen. Außerdem kann eine Kombination einer DiazoniUiO-arylcarbonsäure (z. B. p-Diazoniumphenylessigsäure) und ein übliches Reagens zur 3ildung von Peptidbindungen (z. B. das vorstehend beschriebene Dehydrat-r.ondensierungsagens) verwendet werden.

Das Antigen gemäß der Erfindung wird hergestellt, indem das vorstehend beschriebene Hapten mit dem Träger in Gegenwart des bindungsagens zur Bindung von Hapten und Träger aneinander, umgesetzt wird. Diese Reaktion wird in wäßriger Lösung oder einer üblichen Pufferlösung von pH 7 bis 10, vorzugsweise 8 bis. 9, bei 0 bis 40°C, vorzugsweise bei Raumtemperatur, durchgeführt. Die Reaktion ist in I bis 24 h abgeschlosen. Als typische und besonders geeignete Puffer, wie sie bei dieser Reaktion verwendet werden können, sind folgende zu nennen:

0,2 M Natriumhydroxid —0,2 M Borsäure —0,2 M Kaliumchlorid-Puffer;

0,2 M Natriumcarbonat —0,2 M Borsäure—0,2 M Kaliumchlorid-Puffer;

0,05 M Natriumtetraborat—0,2 M Borsäure—0,05 M Natriumchlorid-Puffer; und

0,1 M Natriumdihydrogenphosphat—0.05 M Natriumtetraborat-Puffer.

In der vorstehend beschriebenen Reaktion kann der Anteil von Hapten, Bindungsagens und Träger genau bestimmt werden. Im allgemeinen ist es bevorzugt, einen Gewichtsanteil von Träger : Hapten von 2:1 bis 6 : 1 zu wählen, besonders bevorzugt ist das Verhältnis 3:1 bis 5:1; ein bevorzugtes molares Verhältnis von Bindungsagens : Hapten beträgt 5 : 1 bis 10 : 1. Die vorstehend beschriebene Reaktion liefert ein Darm-Gluca· gon-Antigen gemäß der Erfindung, welches sich aus einem Peptid-Träger-Komplex zusammensetzt, worin der Träger und das Hapten über ein Bindungsagens zur Bindung von Hapten und Träger aneinander gebunden sind. Das bei dieser Reaktion gebiidete Antigen kann leicht isoliert und auf üblicherweise, z. 3. durch eine Diuiyse-Methode, eine Gelfiltrations-Methode, eine fraktionierte Ausfällungs-Methode oder dergleichen, gereinigt werden. Das erhaltene Antigen kann gelagert werden, indem es auf übliche Weise lyophilisiert wird. In den auf diese Weise erhaltenen Antigenen gemäß der Erfindung sind im allgemeinen durchschnittlich 5 bis 20 Mol des Peptids an ein Mol Protein gebunden. Jedes dieser Antigene ist geeignet, einen Antikörper mit hoher Spezifität gegenüber Darm-Glucagon mit guter Reproduzierbarkeit zu bilden. Insbesondere weisen Antigene mit einem molaren Bindungsverhältnis von Protein : Peptid von 1 :8 bis 1 : 15 eine höhere Spezifität auf, und sind in der Lage, die Bildung eines Antikörpers mit hoher Aktivität und hoher Empfindlichkeit zu induzieren. Derartige Antigene sind daher bevorzugt.

Die Peptide gemäß der allgemeinen Formel (I), welche gemäß ά.ϊ/ Erfindung verwendet werden, sind neue Verbindungen, welche gemäß den nachfolgend beschriebenen Verfahren hergestellt werden können.

Peptide der allgemeinen Formel (I) können nach den bekannten Verfahren zur Synthese von Peptiden hergestellt werden. Es können sowohl Fest-Phasen-Verfahren wie auch Flüssig-Phasen-Verfaiiren angewendet werden, wobei letztere in vielen Fällen vorteilhafter sind. Derartige Verfahren zur Synthese von Peptiden werden z. B. in »The Peptides«, Band 11 (1966) von Schröder und Luhke (Acadmic Press, New York, USA) oder »Peptide Synthesis« von Izumiya et al (Maruzen Co., Ltd. (1975)) beschrieben, wobei insbesondere zu nennen sind: das Azid-Verfahren, das Chlorid-Verfahren, das Säureanhydrid-Verfahren, das gemischte Säureanhydrid-Verfahren, das DCC-Verfahren, das Aktivester-Verfahren unter Anwendung des Wood ward-Reagens K, das Carbcdiimidazol-Verfahren, eir, Oxidaticp.s-Redukticris-Yerfahrer! ein DCC/Additiv 'z. B. HQNB. HOBt, HO-Su)-Verfahren.

Die Peptide entsprechend der allgemeinen Formel (1) können auf einfache Weise nach einem Verfahren zur Synthese allgemeiner Polypeptide synthetisiert werden, z. B. nach dem sogenannten schrittweisen Verfahren zur Kondensierung von Aminosäuren, wobei eine Aminosäure nach der anderen an die therminale Aminosäure gebunden wird, oder ein Verfahren zur Kopplung verschiedener Fragmente. Insbesondere können die vorstehend beschriebenen Peptide hergestellt werden durch Kondensieren eines Carboxylgruppen enthaltenden Ausgangsmaterials, welches einem der beiden Fragmente entspricht, welche durch Trennen des Peptides an einer beliebigen Bindungsstelle erhalten wurden, mit einem anderen aktive Aminogruppen enthaltenden Ausgangsmaterial, welches dem anderen Fragment entspricht, in einer für die Synthese von Peptiden üblichen Art und Weise, wobei dann, wenn das erhaltene Kondensat eine oder mehrere Schutzgruppen enthält, diese Schutzgruppe^) auf übliche Weise entfernt werden.
Bei dem Reaktionsschritt zur Herstellung des Peptides entsprechend der allgemeinen Formel (I) ist es wünschenswert Asparaginsäure in vielen Fällen zu schützen. In einem letzten Schritt werden alle Schutzgruppen von dem geschützten Peptid entfernt, welches wenigstens einen geschützten Aminosäurerest besitzt, um das gewünschte Peptid herzustellen.

Der Schutz von funktionellen Gruppen, welche nicht an der Reaktion teilhaben sollen, Schutzgruppen, Entfernung von Schutzgruppen, und Aktivierung von funktionellen Gruppen, weiche an der Reaktion teilhaben, kann nach üblichen Methoden durchgeführt werden.

Als Schutzgruppen für die Aminogruppe des Ausgangsmaterials sind z. B. geeignet: Carbobenzoxy, terL-Butoxycarbonyl, tert-Amyloxycarbonyl, Isobomyloxycarbonyl, p-Methoxybenzyloxycarbonyl, 2-Chloro-benzyloxycarbonyl, Ädamantyioxycarbonyl, Trifluoracetyl, Phthalyl, Formly, o-Nitrophenylsulphenyl, Diphenylphosphinothioyl. Als Schutzgruppe für die Carboxylgruppe, eignen sich z. B.: eine Alkylestergruppe (z. B. Methylester, Ethylester, Propylester, Butylester, tert-Butylester), ein Benzylester, ein p-Nitrobenzylester, ein p-Methoxybenzylester, ein p-Chlorobenzylester, ein Benzhydrylester, eine Carbobenzoxyhydrazidogruppe, eine tert-Butyloxycarbonyl-hydrazidogruppe, eine Tritylhydrazidogruppe.

Als Schutzgruppe für die Guanidinogruppe des Arginins sind z. B. geeignet: eine Nitrogruppe, eine Tosylgruppe, eine p-Methoxybenzolsulfonylgruppe, eine Carbobenzoxygruppe, eine Isobornyloxycarbonylgruppe, eine Adamantyloxycarbonylgruppe. Die Guanidinogruppe kann auch in Form eines Salzes mit einer Säure geschützt werden (z. B. Benzolsulfonsäure, Toluolsulfonsäure, Salzsäure, Schwefelsäure). Die Hydroxygruppe des Threonins kann durch Veresterung oder Veretherung geschützt werden. Als geeignete Gruppe für die Veresterung sind z. B. zu nennen: Niedrigalkanoylgruppen (z. B. Acetylgruppe), Aroylgruppen (z. B. Benzoylgruppe), von

öl 20 ό\2

Carbonsäure abgeleitete Gruppen (z. B. Benzoyloxycarbonylgruppe, Ethyloxycarbonylgruppe). Als geeignete Gruppe für die Veretherung sind z. B. zu nennen: Benzylgruppe, Tetrahydropyranylgruppe, tert.-Butylgruppe. Es ist jedoch nicht unbedingt erforderlich, die Hydroxygruppe des Threonins zu schützen. Methionin kann in Form von Sulfoxid geschützt werden. '.

Als Beispiele für aktivierte Carboxylgruppen in dem Ausgangsmaterial sind z. B. zu nennen: Säureanhydride, Azide, aktive Ester (Ester mit Pentachlorophenol, p-Nitrophenol, N-Hydroxysuccinimid, N-Hydroxybenzotriazol, N-Hydroxy-5-norbornen-2,3-dicarboximid).

Die Reaktion zur Bildung der Peptidbindung wird in einigen Fällen in Gegenwart eines Dehydratisierungsmittcl: ,vic z. B. Carbodiimidreagens (z. B. Dicyclohexylcarbodiimid oder Carbodiimidazol) durchgeführt.

Die Reaktion zur Bildung der Peptidbindung kann in Gegenwart eines Lösungsmittels durchgeführt wer- 10 ,.'■'! den. Als ein solches Lösungsmittel kann ein geeignetes Lösungsmittel aus den bekannten ausgewählt werden, [,}

welche für die Peptid-Kondensationsreaktion geeignet sind. Beispiele solcher Lösungsmittel umfassen wasser- "

freies oder wäßriges Dimethylformamid, Dimethylsulfoxid. Pyridin, Chloroform, Dioxan, Dichloromethan, Tetrahydrofuran, Ethylacetat, N-Methylpyrrolidon, und deren Gemische. ι

Die Reaktionstemperatur wird in geeigneter Weise in dem Bereich gewählt, der im allgemeinen für die Reaktions zur Bildung der Peptidbindung angewendet wird, im allgemeinen von ca. —40 bis 60°C, vorzugsweise von ca. — 20° C bis ca. 0° C.

Nach Beendigung der vorstehend beschriebenen Kondensationsreaktion werden die Schutzgruppen (sofern welche vorhanden sind) in dem Produkt auf übliche Weise entfernt. Als Verfahren sind hierzu insbesondere gCt:i^l li:i . Ulli IM.UUMIUII3^[U/.I.Ü {£.. U. I IJUI I^Tuilg Ullll.1 r t.l nt.|iuuilg (.HlVJ l\tllul^juiCr.l Vt!w λ Ui(MGiUtI, Schwarz. Reduktion unter Verwendung von Natriummetall in flüssigem Ammoniak), Acidolyse (z. B. Acidolyse mit einer starken Säure, wie Trifluoressigsäure, Fluorwasserstoff oder Methansulfonsäure).

Das Peptid der allgemeinen, vorstehend beschriebenen Formel (I) wird aus dem Reaktionsgemisch isoliert und mit Hilfe von Peptid-Trennverfahren gereinigt, wie z. B. Extraktion, Verteilung, Säulenchromatografie.

Ein markiertes Peptid, welches ein Ausgangsmaterial für die Herstellung eines markierten Antigens darstellt, welches nach der RIA-Methode verwendet werden kann, wird hergestellt durch Einführen von radioaktivem Jod, wie z. B. 125| oder 1311 in das vorstehend hergestellte Peptid. Die Einführung des radiaktiven Jods erfolgt nach einem üblichen Jodierungsprozeß, z. B. durch einen oxidativen Jodierungsprozeß unter Verwendung von Chloramin T(siehe V/. M. Hunter & -F. C. Greenwood, Nature, 194,495(1962), Biochem. J.,89,114 (1963)). Dieses Jodierungsverfahren wird z. B. in einem geeigneten Lösungsmittel, wie 0,2 M Phosphatpufferlösung (pH 7,4) in Gegenwart 'on Chloramin T für IO bis 30 Sekunden bei ca. Raumtemperatur durchgeführt. In bezug auf die A:.»eile an Peptid, radioaktivem Jod und Chloramin T, ist es vorteilhaft, etwa 1 mc radioaktives Jod und ca. 10 bis 100 Nanomol Chloramin T pro Nanomol des in dem Peptid enthaltenen Tyrosinoleküls zu verwenden, wobei ein radioaktives Jodatom in Tyrosin eingeführt wird; oder es werden ca. 2 mc radioaktives Jod und ca. 10 bvis 100 Nanomol Chloramin T pro Nanomol des in dem Peptid enthaltenen Tyrosinmoleküls verwendet, wobei 2 Jodatome in Tyrosin eingeführt werden. Das auf diese Weise hergestellte radiojodierte Peptid wird isoliert und durch übliche Trennverfahren gereinigt, wie z. B. Extraktion, Verteilung, Säulenchromatografie, Dialyse. Das auf diese Weise hergestellte Peptid kann, falls erforderlich durch Lyophilisation, gelagert werden.

Zur Herstellung des Antikörpers unter Verwendung des erhaltenen Antigens wird das Antigen einem Säugetier auf übliche Weise verabreicht. Der in vivo produzierte Antikörper wird gesammelt. Es besteht keine besondere Limitierung hinsichtlich der Säugetiere zur Herstellung des Antikörpers. Insbesondere geeignet sind im allgemeinen Kaninchen und Meerschweinchen. Für die Bildung des Antikörpers wird eine vorausbestimmte Menge des vorstehend beschriebenen Antigens mit einer physiologischen Kochsalzlösung auf eine vorausbestimmte Konzentration verdünnt. Diese Lösung wird dann mit Freund's Complete Adjuvant gemischt unter Bildung einer Dispersion, welche dann den Säugetieren verabreicht wird. Die vorstehend beschriebene Dispersion wird z. B. Kaninchen intradermal in einer Dosis von jeweils 0,5 bis 5 mg Antigen verabreicht. Daraufhin wird die Verabreichung mit einer Dosis von 0,5 bis 5 mg wiederholt, und zwar zwei bis zehn Monate lang, vorzugsweise vier bis sechs Monate lang, einmal alle zwei Wochen, um das Kaninchen zu immunisieren.

Die Gewinnung bzw. das Sammeln des Antikörpers kann dadurch erreicht werden, indem das immunisierte ·':

Kaninchen geblutet wird, wenn eine große Menge an Antikörper nach der letzten Verabreichung der Dispersion, welche das Antigen enthält, gebildet wurde, im allgemeinen ein bis zwei Wochen nach der letzten Verabreichung. Mit Hilfe der Zentrifugation ist es möglich, aus dem auf diese Weise erhaltenen Blut das Antiserum abzutrennen.

Das erfindungsgemäße Verfahren weist den Vorteil auf, daß ein hochaktiver und hochempfindlicher Antikörper in stabiler Form mit guter Reproduzierbarkeit erhalten werden kann, wobei dieser Antikörper eine ausgesprochen gute Spezifität gegenüber menschlichen und tierischen Darm-Glucagon aufweist, was auf die Einzigartigkeit des verwendeten Antigens zurückzuführen ist.

Die auf diese Weise hergestellten Antikörper weisen, wie vorstehend beschrieben, eine ausgezeichnete Spezifität gegenüber Darm-Glucagon auf und ermöglicht es, menschliches Darm-Glucagon mit hoher Genauigkeit nach der RIA-Methode zu bestimmen. Dieser Antikörper kann auch für eine Enzym-Immuncassay (EIA)-Methode, eine Fluorescenz-ImmunoassayiFIAJ-Methode etc. verwendet werden, indem dieser mit einem Enzym oder einem fluoreszierenden Material markiert wird. Außerdem kann dieser Antikörper mit einem bekannten insolubilisierenden Material umgesetzt werden, um einen unlöslichen Antikörper herzustellen.

Die Erfindung wird in den folgenden Referenz-Beispielen und den Beispielen näher beschrieben, wobei diese jedoch die Erfindung nicht limitieren sollen.

Die in den Referenz-Beispielen angegebenen Rf-Werte wurden mit Hilfe von Dünnschichtchromatografie auf Silicagel gemessen, wobei das folgende gemischte Lösungsmittel verwendet w .'rde:

RJ 1-Butanol-Essigsäure-Wasser(4 :1 :5)
'.< 5 RJ¹ Butanol-Pyridin-Essigsäure-Wasser(31 :20 :6 : 24)

(Herstellung von Peptiden der allgemeinen Formel (I))

Referenz-Beispiel 1

1. Herstellung von Z-Ile-Ala-OH

10,87 g of Z-IIe-OSu aufgelöst in 50 ml Tetrahydrofuran wurden zu 30 ml einer wäßrigen Lösung aus 2,67 g H-AIa-OH und 4,20 ml Triethylamin unter Eiskühlung zugegeben. Die Reaktionslösung wurde bei Raumtcmperatur 20 h lang gerührt und dann das Lösungsmittel abdestilliert. Daraufhin wurde der Rückstand in 100 ml wäßriger, 2%iger Triethylaminlösung aufgelöst und dreimal mit Ethylacetat gewaschen. Nach dem Ansäuern der wäßrigen Lösung mit 3 N Zitronensäure wurde ein öliger Niederschlag erhalten, welcher dann mit Ethylacetat extrahiert wurde. Der Extrakt wurde mit 1 N Zitronensäure und gesättigter wäßriger Natriumchloridlösung gewaschen, worauf das Lösungsmittel abdestilliert wurde. Der Rückstand wurde in fester Form aus einer ^;: 20 Methanoi/Ether-Losung erhalten. Die Ausbeute an Endprodukt betrug b,i g
Schmelzpunkt 165-161°C;[«] ²S : -29,4⁰C(C: 1,0; Methanol).

^; 2. Herstellung von Z-Asn-Ile-Ala-OH

3,36 g Z-Ile-Ala-OH wurden in einem gemischten Lösungsmittel aus 20 ml Methanol und 15 ml Wasser in Gegenwart von Palladium-Schwarz katalytisch reduziert. Das erhaltene Dipeptid wurde in 20 mi Wasser, welches 1,5 ml Triethylamin und 16 ml Tetrahydrofuran enthielt, aufgelöst und auf — 10°C abgekühlt. Zu dieser Lösung wurde ein gemischtes Säureanhydrid zugegeben, welches aus 3,46 g Z-Asn-OH, 1,67 ml Isobutylchloroformiat und 1,42 ml of N-Methylmorpholin bei — 10⁰C in einer gemischten Lösung aus 15 ml Dimethylformamid und 20 ml Tetrahydrofuran erhalten wurde. Das Reaktionsgemisch wurde 5 Minuten lang bei 0⁰C gerührt, dann 30 Minuten lang bei 15°C und anschließend wurde das Lösungsmittel abdestilliert. Zu dem Rückstand wurde 1 N Zitronensäure zugegeben und die dabei gebildete Niederschlag mit Wasser gewaschen, getrocknet und aus Methanol/Etylacetat zur Reinheit rekristillisiert. Die Ausbeute an Endprodukt betrug 3,60 g.
Schmelzpunkt 240-244⁰C (Zersetzung); [λ] " : -13,8° (C: 1,0, Dimethylformamid).

3. Herstellung von Z-Asn-Asn-Ile-Ala-OH

4,74 g Z-Asn-!!e-A!a-OH wurden, in 20 rn! Eisessig aufgelöst. Daraufhin wurden 25 rnl 25%igc Brornwasscr-

stoffsäure in Essigsäure zugegeben und das Gemisch 60 Minuten bei Raumtemperatur stehen gelassen. Der sich bei Zugabe von wasserfreiem Ether gebildete Niederschlag wurde durch Filtration gesammelt, mit Ether

.; gewaschen und über Kaliumhydroxid getrocknet. Das auf diese Weise erhaltene carbobenzoxylierte Produkt

;,i wurde in 50 ml Dimethylformamid, welches 3,08 ml Triethylamin enthielt, aufgelöst und auf — 10⁰C abgekühlt.

Γ-: Zu dieser Lösung wurde em gemischtes Säureanhydrid von Z-Asn zugegeben, welches aus 4,18 g Z-Asn-OH,

1,60 ml N-Methylmorpholin und Isobutylchloroformiat hergestellt worden war. Die darauffolgenden Schritte

; i 45 wurden auf die gleiche Weise durchgeführt wie dies unter 2. beschrieben ist. Die Ausbeute an Endprodukt betrug

f! 3,60 g.

ί j Schmelzpunkt 235°C(Zersetzung);[x]l³ : -10,1° (C:0,5;80% Essigsäure).

IL 4. Herstellung von Z-Lys(Tos)-Asn-Asn-He-AIa-OH

tj 3,41 g Z-Asn-Asn-Ile-Ala-OH wurden in 15 ml Eisessig aufgelöst und 25 ml 25%igen Bromwasserstoffsäure in

Essigsäure zugegeben, um die Carbobenzoxygruppe zu entfernen, wie dies unter 3. beschrieben wurde. Das erhaltene decarbobenzoxylierte Produkt wurde in 30 ml Dimethylformamid gelöst, welches 1,70 ml Triethylamin enthielt Zu dieser Lösung wurde ein gemischtes Säureanhydrid zugegeben, welches aus 3,13 g Z— Lys(Tos)-OH, 0,73 ml N-Methylmorpholin und 0,95 g Isobutylchloroformiat erhalten worden war. Bei Durchführung der in 2.

beschriebenen Verfahrensschritte wurden 4,01 g Endprodukt erhalten.

Schmelzpunkt 229-230° C (Zersetzung); |>] f: -19,4° C (C: 1,0; Dimethylformamid).

5. Herstellung von Z-Arg-(NO₂)-Asn-Lys(Tos)-Asn-Asn-Ile-AIa-OH

2,03 g Z-Lys(Tos)-Asn-Asn-Ile-AIa-OH wurden in 20 ml Eisessig aufgelöst Dann wurden 20 ml 25%ige Bromwasserstoffsäure/Eisessig zugegeben, um die Carbobenzoxygruppe, wie in 2. beschrieben, zu entfernen.

Gleichzeitig wurden 4,19 g Z-Arg(NO₂)-ASn-N₂H₂-BoC 30 Minuten lang bei Raumtemperatur in Trifluoressigsäure stehen gelassen, um das Boc zu entfernen; dann erfolgte Auflösung in 20 ml Dimethylformamid. Zu dieser Lösung wurden sukzessive 3,61 ml 6 N Salzsäure-Dioxan und 0,96 ml Isoamylnitrit bei —15°C zugegeben; das

erhaltene Gemisch wurde 5 Sekunden lang bei — !0⁰C gerührt und anschließend der pH auf 7,5 eingestellt Diese —

Lösung wurde bei — 10⁰C zu 30 ml der Dimethylformamidlösung, welche das vorstehend beschriebene decarbobenzoxylierte Produkt und 0,64 ml Triethylamin enthielt zugegeben; das Reaktionsgemisch wurde 20 Stunden

lang txi 4°C gerührt und daraufhin das Lösungsmittel entfernt. Zu dem Rückstand wurde 10%ige Essigsäure zugegeben; das auf diese Weise in fester Form erhaltene Material wurde durch Filtration gesammelt, mit Wasser gewaschen, getrocknet und aus Methanol-Ethylacetat rekristallisiert, wobei eine Ausbeute von 2,19 g des Endproduktes erhalten wurde.
Schmelzpunkt 232-234°C;[a]²J : -14,3° (C:1,0;80% Essigsäure)

6. Herstellung von Z-LyS(ToS)-ATg-ASn-LyS(TOs)-ASn-ASn-IIe-AIa-OH

2,14 g Z-Arg(NO2)-Asn-Lys(Tos)-Asn-Asn-Ile-Ala-OH wurden in 50 ml 50%iger Essigsäure in Gegenwart von Palladium-Schwarz katalytisch reduziert, um die Carbobenzoxygruppe zu entfernen. Das erhaltene decarbobenzoxylierte Produkt wurde in 20 ml Dimethylformamid aufgelöst, welches 2,52 ml Triethylamin enthielt. Zu dieser Lösung wurde Z-Lys(Tos)-OSu zugegeben, welches durch Umsetzung von 2,40 g Z-Lys(Tos)-OH mit 0,64 g N-Hydroxysuccinimid in Gegenwart von 1,14 g Dicyclohexylcarbodiimid ohne Reinigung erhalten wurde. Das Reaktionsgemisch wurde 20 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt, daraufhin wurde das Lösungsmittel abdestilliert. Zudem Rückstand wurde 10%ige Essigsäure zugegeben, um diesen fest werden zu lassen. Auf diese Weise wurde eine Ausbeute von 1,42 g an Endprodukt erhalten.
Schmelzpunkt 200-204°C;[λ] ²i ■ -30,5° (C: 1,0;80% Essigsäure).

7. Herstellung von

1,38 g Z-L, s(Tos)-Arg-Asn-Lys(Tos)-Asn-Asn-Ile-Ala-OH wurden in 5 ml Eisescig aufgelöst und 7 ml 25%ige Bromwasserstoffsäure-Essigsäure zugegeben, um die Carbobenzoxygruppe, wie dies in 3. beschrieben wurde, zu entfernen.

1,75 g Boc-Leu-Met-Asn-ThrN2H3 wurden in 15 ml Dimethylformamid aufgelöst und mit 1,43 ml 6 N Salzsäure Dioxan und 0,38 ml Isoamylnitrit auf die gleiche Weise wie in 5 beschrieben, behandelt: dann wurden 15 ml Dimethylformamid zugegeben, welche das vorstehend beschriebene decarbobenzoxylierte Produkt und 0,28 ml Triethylamin enthielten. Das Reaktionsgemisch wurde 20 Stunden lang bei 4°C gerührt; daraufhin wurde das Lösungsmittel abdestilliert. Der Rückstand wurde einer Gegenstrom-Verteilungs-Methode in einem 1-Butanol-2% Essigsäure-System unterworfen; die 1-Butanolschicht wurde gesammelt und daraufhin das Lösungsmittel abdestilliert. Zu dem Rückstand wurde Ethylacetat zugegeben; das solidifizierte Produkt wurde mit Methanol gewaschen, wobei 1,10 g Endprodukt erhalten wurden.
R)- Wert: 0,28

8. Herstellung von Boc-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-Lys(Tos)-Arg-Asn-Lys(Tos)-Asn-Asn-lle-Ala-OH

1.05 g Boc-Leu-Met-Asn-Thr-Lys(Tos)-Arg-Asn-Lys(Tos)-Asn-Asn-Ile-Ala-OH wurden in 6 ml Trifluoressigsäure 30 Minuten lang bei Raumtemperatur stehen gelassen; trockener Ether wurde daraufhin zugegeben. Der dabei gebildete Niederschlag wurde durch Filtration gesammelt, mit Ether gewaschen und über Kaliumhydroxid im Vakuum getocknet, wobei das Boc-freie Produkt erhalten wurde.

Boc-Trp-OSu (hergestellt durch Umsetzung von 700 mg Boc-Trp-OH mit 265 mg N-Hydroxysuccinimid unter der Einwirkung von 475 mg Dicyclohexylcarbodiimid) wurden in 20 ml Dioxan aufgelöst; diese Lösung wurde zu 15 ml Dimethylformamidlösung zugegeben, welche das vorstehend beschriebene Boc-freie Produkt und 0,16 ml Triethylamin enthielt. Dieses Reaktionsgemisch wurde 24 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt, daraufhin wurde das Lösungsmittel durch Destillation entfernt. Zu dem Rückstand wurde Ethylacetat zugegeben und das auf diese Weise solidifizierte Produkt mit Ethanol gewaschen, wobei 798 mg Endprodukt erhalten wurden. Rj 9,44

9. Herstellung von Boc-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-LysfrosJ-Arg-Asn-Lysi.Tos^Asn-Asn-Ile-Ala-OH

777 g Boc-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-Lys(Tos)-Arg-Asn-Lys(Tos)-Asn-Asn-Ile-Ala-OH wurden in 4 ml Trifluoressigsäure behandelt, um den Boc-Rest, wie in 8. beschrieben, zu entfernen.

Eine Lösung von 5i3 mg Boc-VaI-GIn-OSo in 10 ml Dimethylformamid wurde zu einer Lösung des vorstehend beschriebenen Boc-freien Produktes und 0,02 ml Triethylamin in 5 ml Dimethylformamid zugegeben. Dieses Reaktionsgemisch wurde 24 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt worauf das Lösungsmittel abdestilliert wurde. Dann wurde zu dem Rückstand 10%ige Essigsäure zugegeben und das auf diese Weise soiidifizierte Produkt mit Wasser und Ethanol gewaschen, wobei 662 mg des Endproduktes erhalten wurden. RJ: 0,26

10. Herstellung von H-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-Lys(Tos)-Arg-Asn-LysCTosj-Asn-Asn-Ile-Ala-OH

645 mg Boc-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-LysiTosJ-Arg-Asn-LysiTosi-Asn-Asn-Ile-Ala-OH wurden 40 Minuten lang in Gegenwart von 4 ml Trifluoressigsäure, 0,4 ml Ethandithiol und 0,2 ml Anisol bei Raumtemperatur stehen gelassen, um die Boc-Gruppe, wie dies in 8. beschrieben ist, zu entfernen.

738 mg Boc-Arg-Arg-Ala-Gin-Asp-Asp-Phe-N₂H₃ (Schmelzpunkt 158-163°C (Zeresetzung); [λ]? : -l,0^c (C: 1,0; Dimethylsulfoxid) wurden in 10 ml Dimethylformamid aufgelöst; nachdem 035 ml 6 N-Salzsäure-Dioxai bei —15°C zugegeben worden waren, wurden im weiteren 0,09 ml Isoamylnitrit zugegeben. Nachdem di< Lösung 5 Minuten bei — 10⁰C gerührt worden war, wurde der pH-Wert der Lösung mit Triethylamin auf 7J. eingestellt Die e? haltene Lösung wurde zu einer Lösung des vorstehend beschriebenen Boc-freien Produkte: und 0,12 ml Triethylamin in 10 ml Dimethylformamid bei —10° C zugegeben. Dieses Reaktionsgemisch wurde 2( Stunden lang bei 4° C gerührt und daraufhin das Lösungsmittel abdestilliert Der Rückstand wurde dann durcl Zugabe von Ethylacetat solidifiziert, durch Filtration gesammelt und getrocknet.

Das Reaktionsprodukt wurde, ohne weitere Reinigung, einem Schritt zur Entfernung der Boc-Gruppe unter ίο worfen, wobei 5 ml Trifluoressigsäure in Gegenwart von 0,5 ml Ethandithiol zugegeben wurden. Das erhalten« Boc-freie Produkt wurde in 20 ml einer gemischten Lösung aus 1-Butanol-Methanol-Wasser (1:1:1) zugege ben; diese Lösung wurde auf eine Amberlite-IRA-410 (2 χ 4 cm)-Säule aufgeben, um das Produkt in da; entsprechende Acetat umzuwandeln. Das auf diese Weise erhaltene Acetat wurde lyophilisiert, in 1 M Essigsäure gelöst, auf eine Sephadex G 25-Säule (3 χ 190 cm) aufgegeben und einer Gelfiltration unterworfen, wöbe 1 M Essigsäure als Eluierungsmittel verwendet wurde. Die Fraktionen, welche das Endprodukt enthielten (Nr. 64 bis 80) wurden gesammelt, das Lösungsmittel wurde abdestilliert und der Rückstand lyophilisiert Dieser wurde dann in 500 ml einer unteren Schicht eines Partridge-Systems (1-Butanol: Essigsäure : Wasser = 4:1 :5) aufge löst und mittels einer Flüssigkeitstropfen-Gegenstromverteilungs-Methode unter Verwendung einer oberer Schicht des gleichen Lösungsmittelsystems gereinigt Fraktionen, welche das Endprodukt enthielten, wurder _ 20 gesammelt; das Lösungsmittel wurde abdestilliert; daraufhin wurde eine Gefriertrocknung durchgeführt wöbe

260 mg des Endproduktes erhalten wurden.

R|: 0,20; Rf¹:0,55;

Aminosäureanalyse der durch Säurespaltung erhaltenen Produkte

Lys(2)	2,11,	Arg (3)	2,60,	Asp (5)	4,74,
Thr(l)	0,87,	GIu (2)	2,08,	Ala (2)	2,17.
VaI(I)	1,18,	Met(l)	1,03,	»e(I)	0,95,
Leu(l)	1,02,	Phe(l)	1,06,

11. Herstellung von H-Ser-Lys(Tos)-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-G!n-Asp-Phe
Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-Lys(Tos)-ArgAsn-Lys(Tos)Asn-Asn-Ile-Ala-OH

485 gBoc-Ser-Lys(Tos)Tyr-Leu-Asp-Ser-N2H3(Schmelzpunkt: 174-175°C(Zersetzung);[λ]? -21,8° (C: 1,0 Dimethylformamid)) wurden mit H-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-Lys(Tos)-Arg-Asn-Lys(Tos)-Asn-Asn-iie-Aia-OH kondensiert unter Anwendung des Azid-Verfahrens, wöbe 0,15ml 6 N-Salzsäure-Dioxan und 031 mi 20%ige Isoamylnitrit-Dimethylformamid-Lösung auf die gleiche Weise wie in 10. beschrieben verwendet wurden. Nach Beendigung der Reaktion wurde das Lösungsmittel abdestil liert Nach Zugabe von Ethylacetat wurde dieses fest. Dieses Rohprodukt wurder in 5 ml einer unteren Schichi eines Patridge-Systems (1-Butanol: Essigsäure : Wasser = 4:1 :5) aufgelöst und einer Flüssigkeitstropfen-Gegenstromverteilungs-Methode zur Reinigung unterworfen. Die Fraktionen, welche das Endprodukt enthielten wurden gesammelt und das Lösungsmittel abdestilliert. Der Rückstand wurde in 7 ml einer gemischten Lösung aus 1-Butanol—Methanol—Wasser(l :1 : 1) aufgelöst und auf eine Sepahdex® LH 20(3 χ 108 cm)-Säule aufgeben, um eine Gelfiltration unter Verwendung von 1-Butanoi —Methanol—Wasser (1:1:1) als Eluierungsmitte durchzuführen. Die Fraktionen, welche das Endprodukt enthielten, wurden gesammelt und das Lösungsmittel abdestilliert. Zu dem Rückstand wurde dann Ethylacetat zugegeben, um diesen zu solidifizieren. Das auf diese Weise solidifizierte Produkt wurde in Gegenwart von 3 ml Trifluoressigsäure und 0,2 ml Ethandithiol behandelt um die Boc-Gruppe zu entfernen. Das getrocknete Boc-freie Produkt wurde in 5 ml 1 M Essigsäure aufgelöst und auf eine Sephadex® G 50 (3 χ 145cm)-Säule aufgegeben, um eine Gelfiltration mit 1 M Essigsäure als Eluierungsmittel durchzuführen. Fraktionen, welche das Endprodukt enthielten (Nr. 43—57) wurden gesammelt und das Lösungsmittel abdestilliert. Der Rückstand wurde dann lyophilisiert, wobei 93 mg des Endproduktes erhalten wurden.
RJ: 0,25; Ri': 0,54

Aminosäureanalyse der Säurespaltprodukte (6 N HCI; 110° C; 24 h)

Lys (3) 2,80, Arg (3) 2,89, Asp (6) 6,10,

Thr(1) 0.97, Ser(2) 1,79, GIu (2) 2,06,

AIa (2) 2,03, VaI(I) 0,99, Met(l) 0,87,

He (1) 1,00, Leu (2) 1,98. Thr(l) 1,00,

Phe(1) 1,00.

12. Herstellung von H-Lys-Arg-Asn-Lys-Asn-Asn-Ile-Ala-OH

25 mg Z-Lys(Tos)-Arg-Asn-Lys(Tos)-Asn-Asn-Ile-Ala-OH wurden in 30 ml flüssigen Ammoniak gelöst und metallisches Natrium in kleinen Stücken zugegeben. Sobald die Reaktionslösung blau erschien, wurden 0,5 g trockenes Ammoniumchlorid zugegeben und daraufhin der Ammoniak abdestilliert. Der Rückstand wurde in 1 M Essigsäure aufgelöst und einer Gelfiltration mittels Sephadex G 10 (4 χ 43 cm) unterworfen, wobei I M

Essigsäure als Eluierungsmittel verwendet wurde. Die Fraktionen, weiche das Endprodukt enthielten, wurden gesammelt und das Lösungsmittel abdestilliert Der Rückstand wurde lyophilisiert, wobei 10 mg des Endproduktes erhalten wurden.
R|: 0,01; RJ¹:0,27

Aminosäureanalyse der Säurespaltprodukte:

Lys(2) 1,84, Arg(l) 0,94, Asp (3) 3,08,
AIa(I) 1,08; He (1) 1,05

13. Herstellung von
H-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-Lys-Arg-Asn-Lys-Asn-Asn-Ile-Ala-OH

10 mg Boc-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-LysCTos)-Arg-Asn-Lys(Tos)Asn-Asn-Ile-AIa-OH wurden in Gegenwart von 1 ml Trifluoressigsäure und 0,1 ml Ethandithiol behandelt, um die Boc-Gruppe zu entfernen. Daraufhin erfolgte Behandlung mit metallischem Natrium in flüssigem Ammoniak auf die gleiche Weise, wie dies in 12. beschrieben wurde, um die Schutzgruppen zu entfernen. Eine Reinigung mittels Gelfiltration ergab 5 -ng des Endproduktes.
R|:0.20; RJ':0,49;[*$: -50,0(C:0,07; 1 M Essigsäure).

14. Ϊ iensteilung von I I-Arg-Arg-Ala-Gin-Asp-Phe-VaI-G in-Trp-Lcu-Met-Asn-Thr-Lys-Arg-Asn-Lys-Asn-Asn-Iie-AIa-OH

100 mg H-Arg-Arg-Ala-Gin-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-Lys(Tos)-Arg-Asn-Lys(Toi.)-Asn-Asn-Ile-Ala-OH wurden auf die gleiche Weise, wie dies in 12. beschrieben ist, behandelt um sämtliche Schutzgruppen zu entfernen. Die Reinigung mittels Gelfiltration ergab 40 mg des Endproduktes. RJ:0,20; RJ¹:0,51;[λ]? -463° (C:Q2; 1 M Essigsäure).

15. Herstellung von H-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn Thr-Lys-Arg-Asn-Lys-Asn-Ile-Ala-OH

10 mg H Ser-LysfTosJ-Typ-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-Lys(Tos)-Arg-Asn-Lys(Tos)Asn-Asn-Ile-AIa-OH wurden auf die gleiche Weise, wie dies unter 12. beschrieben wurde, behandelt, um sämtliche Schutzgruppen zu entfernen. Daraufhin wurde das Ganze einer Gelfiltration auf Sephadex G 50 (2,5 χ 135 cm) unterworfen, wobei 1 M Essigsäure als Eluierungsmittel verwendet wurde. Die Fraktionen, welche das Endprodukt enthielten., wurden gesammelt und lyophilisiert. wobei 4 mg des Endproduktes erhalten wurden.
Rf:0,20; RJ':0,49;[λ]? -60,9° (C;0,1; 1 M Essigsäure)

Herstellung von Antigenen

Beispiel 1

10 mg des im Referenzbeispiel 1 (14) erhaltenen Peptids (im folgenden der Einfachheit halber als »Peptid A« bezeichnet) und 5 mg Rinderserumalbumin (im folgenden der Einfachheit halber mit »BSA« bezeichnet) wurden in 2 ml Ammoniumacetat-Pufferlösung (0,1 M; pH 7,0); es wurden 0,11 ml einer 0,1 M Glutaraldehydlösung zugegeben und daraufhin 5 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde dann 48 Stunden lang bei 4° C dialysiert, wobei 1 I Wasser verwendet wurde, welches innerhalb des Zeitinterva"s fünfmal gewechselt wurde. Die erhaltene Lösung, welche den Peptid-Protein-Komplex enthielt, wurde dann lyophylisiert, wobei 14 mg des Darm-Glucagon-Antigens (im folgenden der Einfachheit halber mit »Antigen I« bezeichnet) erhalten wurden.

Das auf diese Weise erhaltene Antigen I wurde im weiteren einer Gelfiltration mit Hilfe von Sephadex® G-50 unterworfen (Eluierungsmittel: physiologische Kochsalzlösung; Bestimmung: optische Dichte 280 μπι; Eluierungsgeschwindigkeit: 3 ml/h; aufgeteilte Menge: 1 ml Portionen). Fraktion [IJ welche das an BSA gebundene Peptid A enthielt, wurde von Fraktion (II) abgetrennt, welche ein anderes Produkt enthielt (Dimcres von Peptid A); die Fraktion [I] wurde gegen 0,6%ige wäßrige Natriumchloridlösung bei 4°C 24 Stunden lang dialysiert und daraufhin lyophilisiert, wobei 7 mg eines weißen, pulverigen Peptid A-BSA-Komplexes erhalten wurden (im folgenden der Einfachheithalber als »Antigen Γ« bezeichnet). Dieser Komplex stellte einen Komplex aus 1 Mol BSA mit daran gekoppelt durchschnittlich 13 Mol Peptid dar. Dieses Bindungsverhältnis wurde wie folgt erhalten.

Zunächst wurde die Standardkurve für die Konzentration von Peptid A-Dimer aufgestellt, die auf der Tatsache basierte, daß es nicht möglich war, nicht-umgesetztes BSA und Peptid A festzustellen; die Menge des Peptid A-Dimers in der vorstehenden Fraktion wurde aus der Standardkurve berechnet. Daraufhin wurde die Menge von der Menge an ursprünglich aufgegebenem Peptid A abgezogen. Es wurde angenommen, daß die erhaltene Menge Peptid A mit der Menge an Peptid A übereinstimmte, welche an BSA gekoppelt war.

Beispiel 2

5 g des Peptides H-Leu-Met-Asn-Thr-Lys-Arg-Asn-Lys-Asn-Asn-He-Ala-OH, welches auf die gleiche Weise

wie in Referenzbeispiele 1 erhalten worden war (im folgenden der Einfachheit halber als »Peptid B« bezeichnet) und 5 mg BSA wurden in 2 ml Ammoniumacetatpuffer (0,1 M; pH 7,0) aufgelöst 0,11 ml einer 0,1 M Glutaraldehydlösung wurden zu dieser Lösung zugegeben und daraufhin 5 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde dann gegen 11 Wasser bei 4° C 48 Stunden lang gerührt, wobei das Wasser fünfmal gewechselt wurde. Die erhaltene Lösung, welche den Peptid-Protein-Komplex enthielt, wurde lyophilisie. t, wobei 9 mg einer Darm-Glucagon-Antigens erhalten wurden (im folgenden der Einfachheit halber als »Antigen

ίο II« bezeichnet).

Das Antigen II wurde im weiteren einer Gelfiltration unter Verwendung von Sephadex G-50 unterworfen, um die Fraktion [IJ welche das an BSA gekoppelte Peptid B enthielt, von der Fraktion [II], welche ein anderes Produkt enthielt (Peptid-B-Dimer) abzutrennen; die Fraktion [I] wurde gegen 0,6%ige Kochsalzlösung bei 4°C 24 Stunden lang dialysiert und lyophilisiert, wobei 6 mg ein^-s weißen, pulverigen Peptid B-BSA-Komplexes erhallen wurden. Dieser Komplex stellte einen Komplex aus einem Mol BSA mit im Durchschnitt darin gekoppelten 10 Mol Peptid B dar.

Beispiel 3

4 mg des im Rejerenzbeispiel 1 (12.) erhaltenen Peptides (im folgenden der Einfachheitshalber als »Peptid C« bezeichnet) und 5 mg BSA wurden in 2 ml einer Ammoniumacetatpufferlösung (0,1 M; pH 7,0) aufgelöst. Zu dieser Lösung wurden 0,11 ml einer 0,1 M Glutaraldehydlösung zugegeben und anschließend 5 Stunden bei Raumtemperatur gerührt Das Reaktionsgemisch wurde dann gegen 1 1 Wasser bei 4° C 48 Stunden lang dialysiert, wobei das Wasser fünfmal gewechselt wurde. Die erhaltene Lösung, welche den Peptid-Protein-Komplex enthielt, wurde lyophilisiert, wobei 7,5 mg eine Darm-Glucagon-Antigens (im folgenden der Einfachheit halber als »Antigen III« bezeichnet) erhalten wurden.

Dieses Antigen III wurde im weiteren einer Gelfiltration unter Verwendung von Sephadex® G-50 unterworfen, um die Fraktion [Il welche das an BSA gekoppelte Peptid C enthielt, von der Fraktion [II], welche ein anderes Produkt (Peptid C-Dimer) abzutrennen; die Fraktion [I] wurde gegen O,6°/oige Kochsalzlösung bei 4°C 24 Stunden lang dialysiert und dann lyophilisiert, wobei 5,5 mg eines weißen, pulverartigen Peptid-C-BSA-Komplexes erhalten wurden. Dieser Komplex stellte einen Komplex aus 1 Mol BSA mit daran gekoppelten, durchschnittlich 8 Mol Peptid C dv-

Beispiel 4

4 mg des Peptides H-Lys-Lys-Arg-Asn-Lys-Asn-Asn-Ile-AIa-OH, welches wie im Referenzbeispiel 1 erhalten wurde (im folgenden mit »Peptid D« abgekürzt) und 5 mg BSA wurden in 2 ml Ammoniumacetatpufferlösung (0,1 M; pH 7,0) aufgelöst. Zu dieser Lösung wurden 0,11 ml einer 0,1 M Glutaraldehydlösung zubegeben und daraufhin 5 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde dann gegen 1 I Wasser bei 4° C 48 Stunden dialysiert, wobei das Wasser fünfmal gewechselt wurde. Die erhaltene Lösung, weiche den Peptid-Protein-Komplex enthielt, wurde lyophilisiert, wobei 8 mg eines Darm-Glucagon-Antigens erhalten wurden (im folgenden mit »Antigen IV« abgekürzt).

Dieses Antigen IV wurde im weiteren einer Gelfiltration unter Verwendung von Sephadex G-50 unterworfen, um die Fraktion [I], welche das an BSA gebundene Peptid D enthielt, und die Fraktion [II], welche ein anderes Produkt (Peptid-D-Dimer) enthielt, zu trennt. Die Fraktion [I] wurde gegen O,6°/oige Kochsalzlösung bei 4°C 24 Stunden lang dialysiert und dann lyophilisiert, wobei 6 mg eines weißen pulverigen Peptid-D-BSA-Komplexes erhalten wurden. Dieser Komplex stellte einen Komplex aus 1 Mol BSA mit daran gekoppelt durchschnittlich 9 Mol Peptid D dar.

Beispiel5

4 mg des Peptides H-Tyr-Lys-Arg-Asn Lys-Asn-Asn-Ile-Ala-OH, welches wie im Referenzbeispiel 1 erhalten wurden (im folgenden abgekürzt als »Peptid E«) und 5 mg BSA wurden in 2 ml Ammoniumacetatpufferlösung (0,1 M; pH 7,0) aufgelöst. Zu dieser Lösung wurden 0,11 ml einer 0,1 M Glutaraldehydlösung zugegeben, und daraufhin 5 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde dann gegen 1 I Wasser bei 4° C 48 Stunden lang dialysiert, wobei das Wasser fünfmal gewechselt wurde. Die erhaltene Lösung, welche den Peptid-Protein-Komplex enthielt, wurde lyophilisiert, wobei 7 mg eines Darm-Glucagon-Antigens erhalten wurden (im folgenden abgekürzt als »Antigen V«).

Dieses Antigen V wurde im weiteren einer Gelfiltration unter Verwendung von Sephadex G-50 unterworfen, um die Fraktion [I], welche das an BSA gebundene Peptid E enthielt, und die Fraktion [II], welche ein anderes Produkt (Peptid E-Dimer) enthielt, aufzutrennen; die Fraktion [I] wurde bei 4°C 24 h lang gegen O,6°/oige Kochsalzlösung dialysiert und lyophilisiert, wobei 5 mg eines weißen, pulverigen Peptid E-BSA-Komplexes erhalten wurden. Dieser Komplex stellte einen Komplex aus einem Mol BSA mit durchschnittlich 6 Mol gekoppelten Peptid E dar.

Beispiele

5 mg des Peptides H-Gly-Lys-Lys-Arg-Asn-Lys-Asn-Asn-IIe-Ala-OH, welches wie im Referenzbeispiel 1 erhalten wurde (im folgenden abgekürzt als »Peptid F«) und 5 mg BSA wurden in 2 ml Ammoniumacetatpufferlösung (0,1 M; pH 7,0) aufgelöst. Zu dieser Lösung wurden 0,1 ml einer 0,1 M Glutaraldehydlösung zugegeben, und anschließend 5 Stunden bei Raumtemperatur gerührt Das Reaktionsgemisch wurde dann gegen 1 1 Wasser 48 Stunden lang bei 4° C dialysiert wobei das Wasser fünfmal gewechselt wurde. Die erhaltene Lösung, welche den Peptid-Protein-Komplex enthielt, wurde lyophilisiert wobei 9 mg eines Darm-Glucagon-Antigens erhalten wurde (im folgenden abgekürzt als »Antigen VI«).

Das Antigen VI wurde im weiteren einer Gelfiltration unter Verwendung von Sephadex G-50 unterworfen, um die Fraktion [I]₁ welche das an BSA gebundene Peptid F enthielt, und die Fraktion [II], welche ein anderes Produkt (Peptid F-Dimer) enthielt, zu trennen; die Fraktion [I] wurde gegen 0,6%ige Kochsalzlösung bei 4° C 24 Stunden lang dialysiert und dann lyophilisiert, wobei 6 mg eines weißen, pulverigen Peptid F-BSA-Komplexes erhalten wurden. Dieser Komplex stellte einen Komplex aus 1 Mol BSA mit daran im Durchschnitt 14 Mol gekoppelten Peptid F dar.

Beispiel 7

4 mg des Peptides H-Ala-Lys-Arg-Asn-Lys-Asn-Asn-IIe-Ala-OH, welches wie im Referenzbeispiel 1 erhalten wurde (im folgenden als »Peptid G« abgekürzt) und 5 mg BSA wurden in 2 ml Ammoniurnacf ►^pufferlösung (0,1 M; ρΐΐ 7,0) aufgelöst Zu dieser Losung wurden 0,11 rn! einer 0,1 M Glutaraldehydlösung zugegeben, und daraufhin 5 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt Das Reaktionsgemisch wurde dann gegen 1 [ Wasser 48 Stunden lang bei 4°C dialysiert, wobei das Wasser fünfmal gewechselt wurde. Die erhaltene Lösung, welche den Peptid-Protein-Komplex enthielt, wurde lyophilisiert, wobei 73 mg eines Darm-Glucakon-Antigens erhalten wurden (im folgenden abgekürzt als »Antigen VII).

Dieses Antigen VII wurde im weiteren einer Gelfiltration unter Verwendung von Sephadex G-50 unterworfen, um die Fraktion [I], welche das an BSA gebundene Peptid G enthielt und die Fraktion [II], welche ein anderes Produkt (Peptid G-Dimer) enthielt aufzutrennen. Die Fraktion [I] wurde gegen 0,6%ige Kochsalzlösung 24 Stunden lang bei 4° C dialysiert und dann lyophilisiert, wobei 5,5 mg eines weisen, pulverigen Peptid G-BSA-Komplexes erhalten wurden. Dieser Komplex stellte einen Komplex aus 1 MoI BSA mit im Durchschnitt

9 MoI gekoppelten Peptid G dar.

Beispiel 8

4 mg des Peptides H-GIy-Lys-Arg-Asn-Lys-Asn-Asn-Ile-Ala-OH, welches wie im Referenzbeispiel 1 erhalten wurde (im folgenden abgekürzt als »Peptid H«) und 5 mg BSA wurden in 2 ml Ammoniumacetatpufferlösung (0,1 M; pH 7,0) aufgelöst. Zu dieser Lösung wurden 0,11 ml einer 0,1 M Glutaraldehydlösung zugegeben, und daraufhin 5 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt Das Reaktionsgemisch wurde dann gegen 1 1 Wasser 48 Stunden lang bei 4°C dialysiert, wobei das Wasser fünfmal gewechselt wurde. Die erhaltene Lösung, welche den Peptid-Proiein-Komplex enthielt, wurde lyophilisiert, wobei 7,5 mg eines Darm-Glucagon-Antigens erhalten wurden (im folgenden abgekürzt als »Antigen VIII«).

Dieses Antigen VIII wurde im weiteren einer Gelfiltration unter Verwendung von Sephadex G-50 unterworfen, um die Fraktion [IJ welche das an BSA gebundene Peptid H enthielt, und die Fraktion [!I], welche ein anderes Produkt (Peptid-H-Dimer) enthielt, aufzutrennen; die Fraktion [I] wurde dann gegen 0,6%ige Kochsalzlösung 24 Stunden lang bei 4°C dialysiert und dann lyophilisiert, wobei 6 mg eines weißen, pulverigen Peptid H-BSA-Komplexes erhalten wurden. Dieser Komplex stellte einen Komplex aus 1 Mol BSA mit im Durchschnitt

10 Mol daran gebundenem Peptid H dar.

Beispiel 9

12 mg eines Peptides, welches im Referenzbeispiel 1 (15.) erhalten wurde (im folgenden abgekürzt als »Peptid I«) und 5 ing BSA wurden in 2 ml Ammoniumacetatpufferlösung (0,1 M; pH 7,0) aufgelöst. Zu dieser Lösung v/urden 0,11 ml einer 0,1 M Glutaraldehydlösung zugegeben und daraufhin 5 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt. Dieses Reaktionsgemisch wurde dann gegen 1 I Wasser 48 Stunden lang bei 4°C dialysiert, wobei das Wasser fünfmal gewechselt wurde. Die erhaltene Lösung, welche den Peptid-°rotein-Komplex enthielt, wurde lyophilisiert, wobei 15 mg eines Darm-Glucagon-Antigens erhalten wurden (im folgenden abgekürzt als »Antigen IX«).

Dieses Antigen IX wurde im weiteren einer Gelfiltration unter Verwendung von Sephadex G-50 unterworfen, um die Fraktion [I], welche das an BSA gebundene Peptid I enthielt, und die Fraktion [IJ], welche ein anderes Produkt (Peptid I-Dimer) enthielt, aufzutrennen; die Fraktion [I] wurde dann gegen 0,6%ige Kochsalzlösung 24 Stunden lang bei 4°C dialysiert und anschließend lyophilisiert, wobei 7,5 mg eines weißen, pulverigen Peptid I-BSA-Komplexes erhalten wurden. Dieser Komplex stellte einen Komplex aus 1 Mo! BSA mit durchschnittlich 10 Mol daran gekoppeltem Peptid I dar.

Gewinnung von Antikörpern
Beispiel 10

3 mg von Antigen I, welches im Beispiel 1 erhalten wurde, wurden in 1,5 ml physiologischer Kochsalzlösung aufgelöst, und 1,5 ml Freund's Complete-Adjuvant unter Bildung einer Dispersion zugegeben. Die auf diese Weise erhaltene Dispersion wurde Kaninchen (Gewicht 2,5 bis 3,0 kg) intradermal verabreicht. Im folgenden wurde fünfmal alle zwei Wochen die Verabreichung derselben Dosis wiederholt. Im folgenden wurde fünfmal, einmal pro Monat, die Hälfte der ursprünglichen Dosis verabreicht. 10 Tage nach der letzten Verabreichung wurden die immunisierten Tiere zum Bluten gebracht und das auf diese Weise erhaltene Blut wurde zentrifugiert, um das Antiserum abzutrennen. Es wurde so ein Darm-Glucagon-Antikörper gemäß der Erfindung erhalten (im folgenden abgekürzt als »Antikörper I«).

Bei Verwendung der in den Beispielen 4 bis 8 erhaltenen Antigene und Behandlung auf die in Beispiel 10 beschriebene Art und Weise wurden Antikörper mit hoher Aktivität und hoher Spezifität gegen Darm-Glucagon erhalten.

Beispiel 11

3 mg des Antikörpers Γ, welches in Beispiel 1 erhalten wurde, wurden in 1,5 ml einer physiologischen Kochsalzlösung aufgelöst und 1,5 ml Freund's Complete-Adjuvant zugegeben unter Bildung einer Dispersion. Die auf diese Weise erhaltene Dispersion wurde 3 Kaninchen (Gewicht 2,5 bis 3,0 kg) intradermal verabreicht. Daraufhin wurde die Verabreichung derselben Dosis fünfmal, einmal wöchentlich, wiederholt. Im weiteren wurde die Hälfte der ursprünglichen Dosis fünfmal, einmal monatlich, verabreicht. 10 Tage nach der letzten Verabreichung wurden die immunisierten Tiere zum Bluten gebracht und das auf diese Weise erhaltene Blut zentrifugiert, um das Antiserum abzutrennen. Es wurde so ein Darm-Glucagon-Antikörper gemäß der Erfindung erhalten (im folgenden abgekürzt als »Antikörper II«).

Beispiel 12

3 mg Antigen IX, welches in Beispiel 9 erhalten wurde, wurden in 1,5 ml physiologischer Kochsalzlösung aufgelöst und 1,5 m! Freund's Complete Adjuvant zugegeben unter Bildung einer Dispersion. Die auf diese Weise erhaltene Dispersion wurde 3 Kaninchen (Gewicht 2,5 bis 3,0 kg) interdermal verabreicht. Daraufhin wurde die Verabreichung mit derselben Dosis fünfmal, einmal alle zwei Wochen, wiederholt. Im weiteren erfolgte eine Verabreichung der Hälfte der ursprünglichen Dosis, und zwar fünfmal, einmal monatlich. 10 Tage nach der letzten Verabreichung wurden die immunisierten Tiere zum Bluten gebracht und das auf diese Weise erhaltene Blut zur Abtrennung des Antiserums zentrifugiert. Es wurde ein Darm-Glucagon-Antikörper gemäß der Erfindung erhalten (im folgenden abgekürzt als »Antikörper III«).

Beispiel 13

3 mg Antigen II, welches in Beispiel 2 erhalten wurde, wurden in 1,5 ml physiologischer Kochsalzlösung aufgelöst und 1,5 ml Freund's Complete Adjuvant unter Bildung einer Dispersion zugegeben. Die auf diese Weise erhaltene Dispersion wurde 3 Kaninchen (Gewicht 2,5 bis 3,0 kg) intradermal verabreicht. Daraufhin wurde die Verabreichung mit derselben Dosis fünfmal, einmal alle zwei Wochen, wiederholt. Im weiteren wurde die Verabreichung der Hälfte der ursprünglichen Dosis fünfmal, einmal monatlich, wiederholt. 10 Tage nach der letzten Verabreichung wurden die immunisierten Tiere zum Bluten gebracht, und das auf diese weise erhaltene Blut zur Abtrennung des Antiserums zentrifugiert. Es wurde ein Darm-Glucagon-Antikörper gemäß der Erfindung erhalten (im folgenden abgekürzt als »Antikörper IV«).

Bei s pi el 14

3 mg Antigen III, welches in Beispiel 3 erhalten wurde, wurden in 1,5 ml physiologischer Kochsalzlösung gelöst, und 1,5 ml Freund's Complete-Adjuvant unter Bildung einer Dispersion zugegeben. Die auf diese Weise erhaltene Dispersion wurde 3 Kaninchen (Gewicht 2,5 bis 3,0 kg) intradermal verabreicht. Daraufhin wurde die Verabreichung derselben Dosis fünfmal, einmal alle zwei Wochen, wiederholt. Die Verabreichung der halben Dosismenge in bezug auf die ursprüngliche wurde fünfmal, einmal monatlich, fortgesetzt 10 Tage nach der letzten Verabreichung wurden die immunisierten Tiere geblutet und das auf diese Weise erhaltene Blut zur Abtrennung des Antiserums zentrifugiert Es wurde ein Darm-Glucagon-Antikörper gemäß der Erfindung erhalten (im folgenden abgekürzt als »Antikörper V«).

Referenzbeispiel 2

Herstellung von markiertem Peptid: H-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-GIn-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-Lys-Arg-Asn-Lys-Asn-Asn-Ile-Ala-OH wurde mit Hilfe eines Verfahrens unter Verwendung von Chloramin T markiert Das heißt 10 μΐ einer wäßrigen Lösung, weiche 5 mg des vorstehend beschriebenen Peptides enthielten und 20 μΐ einer wäßrigen Lösung, weiche 1 mc [¹²⁵I]Na(MEN) enthielt, und 10 μg Chloramin T, wurden langsam zu 20 μΐ einer 1,0 M Phosphatpufferlösung (pH 7,4) zugegeben. Nach 30 Sekunden wurde die Reaktion durch Zugabe von 50 μΐ wäßriger Lösung, weiche 100 μg Natriummetadisulfat enthielt gestoppt

Das Reaktionsgemisch wurde dann auf eine Sephadex G-10-Säule (1,0 χ 30 cm) aufgegeben, wobei 0,1 M Essigsäure als Eluierungsmittel verwendet wurde. Das Eluat wurde in 1 ml Anteilen gesammelt und die Fraktionen Nr. 8 bis 11 gesammelt, wobei eine Lösung erhalten wurde, welche H-Ser-Lys-[I^lr> i..onoiodo-Tyr]-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-Lys-Arg-Asn-Lys-Asn-Asn-Ile-Ala-OH
enthielt.

Bestimmung der aktivität des Antikörpers

Die Aktivität eines jeden der erhaltenen Antikörper wurde wie folgt bestimmt:

Jeder Antikörper wurde zuerst mit einer physiologischen Kochsalzlösung auf Konzentrationen von 10-', to 10 ², 10 '. 10-⁴. 10~⁵... verdünnt. Zu 100 μΙ jeder dieser verdünnten Lösungen wurden 100 μΐ ^l25]-markiertes Peptid (hergestellt durch Verdünnen der vorstehend beschriebenen Lösung bis auf ca. lOOOOcpm) und 400ul einer 0,05 Μ Phosphatpuffers (pH = 7,0) [welcher 0,25% BSA, 0,01 M EDTA und Trasyol (500 KI V/ml) enthielt] zugegeben, und das Gemisch wurde 66 Stunden lang bei 4°C inkubiert. Der erhaltene Komplex des Antikörpers und '"!-markiertes Antigen wurde von nicht-umgesetztem oder freiem ^l25I-markiertem Peptid mittels Dextranbeschichteter Aktivkohle und 15minütiger Zentrifugation bei 4°C und einer Umdrehungsgeschwindigkeit von 3000 DpM abgetrennt. Die Radioaktivität des auf diese Weise erhaltenen Komplexes wurde bestimmt, um das Bindungsverhältnis (%) von ' "!-markiertem Peptid und Antikörper bei jeder Konzentration zu bestimmen.

Das Bindungsverhaitnis jeder Konzentration wurde aufgetragen, wobei die Ordinate das Bindungsverhaitnis und die Abszisse die ursprüngliche Verdünnung des Antikörpers darstellt. Der Grad der Verdünnung des Antikörpers, bei welcher das Bindungsverhältnis (%) 50% betrug, ist folgender:

Antikörper Aktivität

Antikörper I 20 000

Antikörper II 25 000

Antikörper III 25 000

Antikörper IV 10 000
Antikörper V 5000

Bestimmung der Darm-Glucagon-Spezifität

Als Testproben wurde pankreatisches Glucagon, die 80 bis 100 Peptidsequenz von Schweineglicentin und Darm-Glucagon (Peak I beschrieben in Kenny J., J. Clin, Endocr., 15,865 (1955)) in verschiedenen Konzentrationen verwendet. Als Standardverdünnungsmittel wurde eine 0,05 M Phosphat-physiologische Kochsalzlösung /^u 7 5\ »wgj^Ug 0 25% BSA 00! M EDTA Tras"!oi^a'500 KiV/mP und 00!% NaN- enthielt verwendet

400 al des Standardverdünnungsmittels, 100 μΐ von jeder Testprobe, 100 μΐ Antikörper I, erhalten in Beispiel 10 (Aktivität: 20 000) und 100 μΙ ¹²⁵I-markiertes Peptid (hergestellt durch Verdünnen des vorstehend erhaltenen markierten Peptides bis auf ca. 10 000 cpm) wurden in ein Reagenzglas gegeben und 66 Stunden lang bei 4° C Φ" inkubiert. Zj diesem Gemisch wurde 1 ml einer Dispersion aus 0,25% Aktivkohle, welche mit 0,025% Dextran beschichtet war, zugegeben und daraufhin 30 Minuten lang bei 4°C inkubiert. Das auf diese Weise behandelte Gemisch wurde durch Zentrifugation bei einer Geschwindigkeit von 3000 UpM und 4°C in Antikörpergebundenes '"!-markiertes Standardpeptid und nicht-umgesetztes (oder freies) markiertes Standardpeptid aufgetrennt. Die Radioaktivität eines jeden Peptides wurde gemessen. Das Bindungsverhältnis (%) von ¹²⁵I-markiertem Peptid und jeder Probe bei jeder Konzentration und Verdünnung wurde bestimmt, indem das Bindungsverhältnis (B₀) in bezug auf die Aktivität des verwendeten Antikörpers mit 100% angenommen wurde. Die erhaltenen Ergebnisse sind in F i g. 1 aufgeführt. In F i g. 1 stellt die Ordinate das Bindungsverhältnis (%) (BZB₀ χ 100) und die Abszisse die Konzentration der Testprobe (plankreatisches Glucagon und 80 bis 100 Peptidsequenz von Schweineglicentin) und den Verdünnungsgrad von Darm-Glucagon (Peak I) dar. In F i g. 1 bedeutet der Buchstabe (a) pankreatisches Glucacon, der Buchstabe (b) die 80 bis ¹00 Peptidsequenz von Schweineglicentin und der Buchstabe (c) Darm-Glucagon. Aus F i g. 1 ist ersichtlich, daß Antikörper I eine Kurve der Aktivität mit pankreatischem Glucagon ergibt, welche sich deutlich von der Kurve der Aktivität mit Glucagon unterscheidet Daraus ergibt sich, daß der Antikörper gemäß der Erfindung nicht mit pankreatischem Glucagon kreuzreagiert und eine ausgezeichnete Spezifität aufweist

Mit den Antikörpern III, IV und V wurde die Darm-Glucagon-Spezifität auf die gleiche Art und Weise wie vorstehend beschrieben, bestimmt Die erhaltenen Ergebnisse sind in F i g. 2,3 und 4 zusammengestellt

F i g. 2 ist eine Darstellung zur Spezifität des Antikörpers III, wobei die Ordinate das Bindungsverhältnis (%) (B/Bo χ 100) und die Abszisse die Konzentration der Testprobe (pankreatisches Glucagon und die 74 bis 100 Peptidsequenz von Schweineglicentin) und den Verdünnungsgrad von Darm-Glucagon (Peak I) darstellt In F i g. 2 bedeutet der Buchstabe (a) pankreatisches Glucagon, der Buchstabe (c) Darm-Glucagon und der Buchstabe (d) die 74—100 Peptidsequenz von Schweineglicentin.

F i g. 3 ist ein Diagramm zur Spezifität von Antigen IV, worin die Ordinate das Bindungsverhältnis (⁰Zo) (B/Bo x 100) und die Abszisse die Konzentration der Testprobe (pankreatisches Glucagon und die 89—100 Peptidsequenz von Schweineglicentin) und den Verdünnungsgrad von Darm-GIucagop. (Peak I) darstellt In F i g. 3 bedeutet der Buchstabe (a) pankreatisches Glucagon, der Buchstabe (c) Darm-Glucagon und der Buchstabe (e) die 89— 100 Peptidsequenz von Schweineglicentin.

F i g. 4 stellt ein Diagramm zur Spezifität des Antikörpers V dar, worin die Ordinate das Bindungsverhältnis (Vo)(BZBo χ 100) und die Abszisse die Konzentration der Testprobe (pankreatisches Glucagon und die 93—100 Peptidsequenz von Schweineglicentin) und den Verdünnungsgrad von Darm-Glucagon (Peak I) darstellt. In F i g. 4 bedeutet der Buchstabe (a) pankreatisches Glucagon, der Buchstabe (c) Darm-Glucagon und der Buchstäbe (f) die 93 bis 100 Peptidsequenz von Schweineglicentin.

Aus den F i g. 2 bis 4 ist ersichtlich, daß sämtliche der Antikörper III, IV und V hinsichtlich der Aktivität mit pankreatischerr Glucagon Kurven ergaben, welche sich deutlich von den Kurven zur Aktivität mit Darm-Glucagon unterscheiden. Daraus ergibt sich, daß die Antikörper gemäß der Erfindung nicht mit pankreatischem Glucagon kreuzreagieren und gegenüber Darm-Glucagon eine ausgezeichnete Spezifität aufweisen.

Hierzu 2 Blatt Zeichnungen

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Claims (1)

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Herstellung von aus einem Peptid-Träger-Komplex bestehenden Darm-Glucagon-Antigenen, dadurchgekennzeichnet, daß man als Hapten ein Peptid der allgemeinen Formel

R-Lys-Arg-Asn-Lys-Asn-Asn-Ile- AIa-OH

in der R ein Wasserstoffatom, eine der Aminosäuregruppen GIy, AIa, Tyr oder Lys, oder eine der folgenden Peptidsequenzen darstellt: