DK159163B - Fremgangsmaade til fremstilling af et tarm-glucagon-antistof - Google Patents

Description

4 k

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til fremstilling af et tarm-glucagon-antistof.

I den foreliggende beskrivelse er forkortelser for aminosyrer, peptider, beskyttelsesgrupper, aktive 5 grupper osv. angivet i overensstemmelse med de af IUPAC eller IUB angivne regler eller ved anvendelse af konventionelle symboler, hvorpå der er anført eksempler nedenfor. Hvor aminosyrer kan omfatte optiske isomere, skal de betegne L-enantiomere, medmindre andet er anført.

10 Arg: arginin

Trp: tryptophan

Asn: asparagin

Asp: asparaginsyre

Thr: threonin 15 Ser: serin

Glu: glutaminsyre

Gin: glutamin

Ala: alanin

Val: valin 20 Met: methionin

Leu: leucin

Phe: phenylalanin

Lys: lysin

Tyr: tyrosin 25 Ile: isoleucin

Cys: cystein

Cys I cystin

Cys

Gly: glycin 30 His: histidin

Pro: prolin Z: carbobenzoxygruppe

Su: succinimidogruppe

Tos: p-toluensulfonylgruppe 35 Boc: tert-butoxycarbonylgruppe.

Tarm-glucagon er et hormon, der spiller en vigtig rolle ved sukkerabsorptionmetabolisme. Bestemmelse af tarm-glucagon gør det muligt at diagnosticere forskelli- 2

DK 159163 B

ge pathologiske tilstande, som tarm-glucagon tager del i, såsom diabetes mellitus eller tarmcancer, samt diagnosticere sygdomme, såsom tarmsygdomme (f.eks. diarré, forstoppelse osv.), duodenalulcera, carcinoid, tarm-glu-5 cagon-noma osv. Bestemmelse af tarm-glucagon noteres således i stigende grad inden for området diagnose, patho-logi, fysiologi osv. Tarm-glucagon bestemmes ved en metode, såsom radioimmunoassay-metoden (RIA-metoden) under anvendelse af et antistof (antiserum), der reagerer med 10 tarm-glucagon. Som et antistof, der er i stand til at reagere med tarm-glucagon, har man indtil nu kendt antistof R-64 fremstillet af Ravazzola et al. [se Endocrinology, vol. 105, nr. 2, pp. 499-508 .*979)]. Dette antistof udviser imidlertid ikke specificitet over for tarm-15 glucagon.

Med den ovenfor beskrevne forhåndenværende situation i erindring har opfinderne foretaget dybtgående undersøgelser til udvikling af en fremgangsmåde til opnåelse af et antistof, der har specificitet med hensyn til 20 tarm-glucagon og er yderst effektivt til bestemmelse af tarm-glucagon efter RIA-metoden eller lignende, og i løbet af undersøgelserne har opfinderne opdaget, at den peptidsekvens, der består af den 93. til 100. aminosyre fra N-enden af svine-glicentin [se Horm. Metab. Res., jS, 25 366-371 (1976)], dvs.

H-Lys-Arg-Asn-Lys-Asn-Asn-Ile-Ala-OH er et antigen, der er bestemmende for et antistof med specificitet over for tarm-glucagon. Som resultat af yderligere undersøgelser baseret på de ovenfor beskrevne 30 nye undersøgelsesresultater har opfinderne med held syntetiseret et antigen, der som hapten indeholder et peptid, som indeholder den ovenfor beskrevne specifikke peptidsekvens og har den nedenfor anførte almene formel (1), og har ud fra dette antigen fremstillet et øns-35 ket fortrinligt antistof med høj specificitet over for tarm-glucagon og er dermed nået til den foreliggende opfindelse .

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen

DK 159163B

3 er ejendommelig ved, at man til pattedyr administrerer et tarm-glucagon-antigen, der består at et peptid-bærer-kompleks og er fremstillet ved, at man som hapten anvender et peptid med den almene formel 5 R-Lys-Arg-Asn-Lys-Asn-Asn-Ile-Ala-OH (1) hvori R betegner et hydrogenatom, en aminosyregruppe eller en peptidgruppe indeholdende 2-20 aminosyre-grupper, og omsætter det med en bærer i nærværelse af et bindemiddel til binding af haptenet og bæreren til 10 hinanden, hvorefter man opsamler det således dannede antistof.

Opfindelsen belyses under henvisning til tegningen , hvorpå fig. 1-4 er grafiske afbildninger, der viser spe-15 cificiteten af antistoffer ifølge den foreliggende opfindelse.

Ved fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse er det uomgængeligt nødvendigt at anvende et tarm- glucagon-antigen, der er fremstillet ved som hapten at 20 anvende et peptid med den ovenfor beskrevne almene formel (1).

Som eksempler på den med R i den almene formel (1) betegnede aminosyregruppe kan der nævnes; Η-Arg-, H-Trp-, H-Asn-, Η-Ala-, H-Val-, Η-Met-, Η-Leu-, H-Phe-, H-Lys-, Η-Tyr-, H-Ile-, H-Cys-, ^t-Cys-, H-Gly-, H-His-, H-Pro-.

25 H'CyS

Som eksempler på peptidgruppen, der indeholder 2 til 20 aminosyregrupper, kan der nævnes H-Gly-Lys-, H-Asn-Tyr-, H-Met-Thr-, H-Met-Asn-, H-Leu-Thr-, H-Trp-Thr-, H-Phe-Val-, H-Gln-Ala-, H-Asp-Arg-, 30 H-Leu-Tyr-, H-Ser-Lys-, H-Met-Asn-Tyr-, H-Leu-Met-Asn-Thr-, H-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-, H-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-, H-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-, H-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-, H-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-, H-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-, 3 5 H-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-, H-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-, H-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-, H-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-, H-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met- 4

DK 159163 B

Asn-Thr-, H-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp~Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-, H-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-, H-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-, 5 H-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Glu-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-.

Af disse foretrækkes peptider, hvori R betegner en peptidgruppe eller aminosyregruppe dannet ved successiv fjernelse af 1 til 19 aminosyregrupper fra N-enden af 10 73-92 N-endesekvensen af svine-glicentin.

Som bæreren, der skal bindes til haptenet, kan der anvendes flere forskellige højmolekylære naturlige eller syntetiske proteiner, der konventionelt anvendes til fremstilling af antigener. Som eksempler kan der 15 nævnes dyreserumalbuminer (f.eks. hesteserumalbumin, ok-seserumalbumin, kaninserumalbumin, humant serumalbumin, fåreserumalbumin osv.), dyreserumglobuliner (f.eks. he-steserumglobulin, okseserumglobulin, kaninserumglobulin, humant serumglobulin, fåreserumglobulin osv.), thyroglo-20 buliner fra dyr (f.eks. hestethyroglobulin, oksethyro-globulin, kaninthyroglobulin, humant thyroglobulin, få-rethyroglobulin osv.), hæmoglobiner fra dyr (f.eks. hestehæmoglobin, oksehæmoglobin, kaninhæmoglobin, humant hæmoglobin, fårehæmoglobin osv.), hæmocyaniner fra dyr, 25 proteinekstrakt fra ascaris (ascaris-ekstrakt? se beskrivelsen til japansk patentansøgning (OPI) nr.

16414/81), polylysin, polyglutaminsyre, lysin-glutamin-syre-copolymer,‘ lysin- eller ornithinholdig copolymer osv.

30 Ascaris-ekstrakten beskrives i detaljer nedenfor.

Ascaris-ekstrakten opnås ved ekstraktion af Ascaris suum i formalet form ved en sædvanlig proteinekstraktionsproces. Som ekstraktionsopløsningsmiddel kan der anvendes forskellige kendte proteinekstraherende opløsningsmidler, 35 såsom vand, en fysiologisk saltopløsning, en 50%'s vandig methanol-eller ethanolopløsning, en omtrent neutral pufferopløsning osv., idet fysiologisk saltopløsning foretrækkes. Nærmere angivet opnås den ovenfor beskrevne 5

DK 159163 B

ekstrakt f.eks. som følger. Indvoldfri Ascaris suum vaskes med en fysiologisk saltopløsning og skæres fortrinsvis i fine stykker til lettelse af ekstraktionen. Derpå sættes de fine stykker til et proteinekstraherende op-5 løsningsmiddel, såsom en fysiologisk saltopløsning, hvorefter man ekstraherer under homogenisering af blandingen. Denne ekstraktion udføres sædvanligvis ved lave temperaturer, fortrinsvis ved ca. 2 til 10°C. Den således opnåede ekstraktionsopløsning centrifugeres derpå, og den 10 overliggende væske opsamles. Efter dialyse af den øver-liggende væske lyofiliseres dialysatet. Alternativt centrifugeres dialysatet igen, og den overliggende væske opsamles og lyofiliseres efter fjernelse af suspenderet stof. På denne måde fremstilles den ønskede ascaris-eks-15 trakt. Denne kan anvendes til fremstilling af tarm-gluca-gon-antigenet, om nødvendigt efter yderligere rensning ved sædvanlige proteinrensningsmetoder, såsom en dialysemetode, gel filtreringsmetode, adsorptionsmetode, chromatografi osv. De ascaris-ekstrakter, der er beskrevet i f .eks. J. Im-20 mun., m, 260-268 (1973), J. Immun., 122, 302-308 (1979), J. Immun., 9j5, 893-900 (1967) og Am. J. Physiol., 199, 575-578 (1960), eller de, der er fremstillet ved yderligere rensning af disse ekstrakter, kan også anvendes til fremstilling af tarm-glucagon-antigenet.

25 Som bindemidlet til binding af haptenet og bære ren til hinanden kan der i vid udstrækning anvendes sådanne, der almindeligvis anvendes til fremstilling af an-: tigener. Som specielle eksempler kan der nævnes alifatiske dialdehyder, der er i stand til at tværbinde amino-30 grupper til hinanden, såsom glyoxal, malondialdehyd, glu-taraldehyd, succinaldehyd, adipoaldehyd osv.; dimaleimi-der, der er i stand til at tværbinde thiolgrupper til hinanden, såsom N,N1-o-phenylendimaleimid, N,N'-m-pheny-lendimaleimid osv.; maleimidocarboxyl-N-hydroxysuccin-35 imidesterforbindelser, der er i stand til at tværbinde en aminogruppe til en thiolgruppe, såsom m-maleimidoben-zoyl-N-hydroxysuccinimidester, 4-(maleimidomethyl)-cy-clohexan-l-carboxyl-N'-hydroxysuccinimidester osv.; re-

DK 159163 B

e agenser til anvendelse ved den sædvanlige peptidbindings-dannende reaktion/ og som er i stand til at binde en a-minogruppe til en carboxylgruppe gennem en amidobinding/ såsom dehydratations-kondensationsmidler af carbodiimi-5 der (f.eks. Ν,Ν-dicyclohexylcarbodiimid, N-ethyl-N'-dime thylaminocarbodiimid, l-ethyl-3-diisopropylaminocarbo-diimid, l-cyclohexyl-3-(2-morpholinyl-4-ethyl)carbodi-imid osv.), og lignende. Endvidere kan der også anvendes en kombination af en diazoniumarylcarboxylsyre (f.eks.

10 p-diazoniumphenyleddikesyre) og et sædvanligt peptid-bindingsdannende reagens (f.eks. det ovenfor beskrevne dehydratations-kondensationsmiddel).

Antigenet til anvendelse ved fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse fremstilles ved omsæt-15 ning af det ovenfor beskrevne hapten med bæreren i nærværelse af bindemidlet til binding af haptenet og bæreren til hinanden. Denne omsætning udføres i vandig opløsning eller en sædvanlig pufferopløsning med en pH-værdi på 7 til 10, fortrinsvis 8 til 9, ved 0 til 40°C, fortrinsvis ved ca. stuetemperatur.

20 Denne omsætning er fuldendt på ca. 1 til 24 timer. Som typiske eksempler på den puffer, der skal anvendes ved denne omsætning, kan der nævnes følgende: 0,2 M natriumhydroxid-0,2 M borsyre-0,2 M kalium-chlorid-puffer; 25 0,2 M natriumcarbonat-0,2 M borsyre-0,2 M kalium- chlorid-puffer? 0,05 M natriumtetraborat-0,2 M borsyre-0,05 M natri umchlorid-puffer; og 0,1 M natriumdihydrogenphosphat-0,05 M natriumte-3 0 traborat-puf fer.

Ved den ovenfor beskrevne reaktion kan mængdeforholdet mellem hapten, bindemiddel og bærer bestemmes på rette måde. Sædvanligvis er et foretrukket vægtmængdeforhold mellem bærer og hapten imidlertid 2:1 til 6:1, 35 og mere foretrukket 3:1 til 5:1, og et foretrukket molært mængdeforhold mellem bindemiddel og hapten er 5:1 til 10:1. Den ovenfor beskrevne reaktion giver et tarm-glucagon-antigen be-

DK 159163B

7 stående af peptid-bærer-komplekset, hvori bæreren og haptenet er bundet til hinanden via bindemidlet til binding af haptenet og bæreren til hinanden. Det ved reaktionen dannede antigen kan let isoleres og renses på 5 konventionel måde, f.eks. ved en dialysemetode, en gel-filtreringsmetode, en fraktioneret udfældningsmetode eller lignende. Det opnåede antigen kan oplagres efter lyofilisering på konventionel måde. I de således opnåede antigener er i gennemsnit sædvan-10 ligvis 5 til 20 mol af peptidet bundet til 1 mol af proteinet. Hvert sådant antigen gør det muligt at fremstille et antistof med høj specificitet til tarm-glucagon med god reproducerbarhed. Navnlig har antigener med et molært bindingsforhold mellem peptid og protein på 1;8 15 til 1:15 højere specificitet og gør det muligt at fremstille et antistof med høj aktivitet og høj sensitivitet og foretrækkes således.

Peptidet med den almene formel (1), der skal anvendes til fremstilling af antigenet, indbefatter 20 kendte og hidtil ukendte forbindelser, som kan fremstilles ved de nedenfor beskrevne fremgangsmåder.

Peptidet med den almene formel (1) kan fremstilles ved en konventionel fremgangsmåde til syntetisering af peptider. En vilkårlig blandt fast-fase-fremgangsmå-25 der og flydende-fase-fremgangsmåder kan benyttes, idet de sidstnævnte er fordelagtige i mange tilfælde. Sådanne fremgangsmåder til syntetisering af peptider er beskrevet i f.eks. "The Peptides", vol. 1 (1966) skrevet af Schroder og Luhke (Academic Press, New York, USA) eller 30 "Peptide Synthesis" skrevet af Izumiya, et al. [Maruzen Co., Ltd. (1975)], og der er belyst f.eks. en azid-pro-ces, en chlorid-proces, en syr^anhydrid-proces, en blan-det-syreanhydrid-proces, en DCC-proces, en aktiv-ester-proces, en proces, ved hvilken der anvendes Woodward-35 reagens K, en carbodiimidazol-proces, en oxidations-reduktions-proces, en DCC/additiv- (f.eks. HONB, HOBt, HOSu osv.)-proces og lignende.

Peptidet med den almene formel (1) kan let synte- 8

DK 159163 B

tiseres efter en fremgangsmåde til syntetisering af po-lypeptider i almindelighed, f.eks. en såkaldt trinvis fremgangsmåde med kondensering af aminosyrer én efter én til den endestillede aminosyre eller en fremgangsmåde 5 med kobling af flere fragmenter. Nærmere angivet kan det ovenfor beskrevne peptid fremstilles ved at kondensere et reaktivt carboxylgruppeholdigt udgangsmateriale svarende til det ene af de to fragmenter, som dannes ved at dele peptidet på et vilkårligt bindingssted, med et an-10 det reaktivt aminogruppeholdigt udgangsmateriale svarende til det andet fragment på en til syntese af peptider konventionelt anvendt måde og, når det opnåede kondensat indeholder en beskyttelsesgruppe eller -grupper, fjernelse af beskyttelsesgruppen eller -grupperne på konventio-15 nel måde.

Ved reaktionstrinnene til fremstilling af peptidet med den almene formel (1) beskyttes asparaginsyren hensigtsmæssigt i mange tilfælde, og i sluttrinnet fjernes alle beskyttelsesgrupper fra det beskyttede peptid, 20 som indeholder mindst én beskyttet aminosyrerest, til fremstilling af det Ønskede peptid.

Beskyttelsen af funktionelle grupper, der ikke skal deltage i reaktionen, beskyttelsesgrupper, fjernelsen af beskyttelsesgrupperne og aktiveringen af funktio-25 nelle grupper, der deltager i reaktionen, kan passende udføres på en konventionel måde eller ved en fremgangsmåde valgt blandt kendte fremgangsmåder.

Som eksempler på beskyttelsesgruppen for amino-gruppen i et udgangsmateriale kan der nævnes carbobenz-30 oxy, tert-butoxycarbony1, tert-amyloxycarbonyl, isobor-nyloxycarbonyl, p-methoxybenzyloxycarbonyl, 2-chlor-ben-zyloxycarbony1, adamantyloxycarbonyl, trifluoracetyl, phthalyl, formyl, o-nitrophenylsulphenyl, diphenylphos-phinothioyl osv. Som eksempler på beskyttelsesgruppen 35 for carboxylgruppen kan der nævnes en alkylestergruppe (f.eks. en methylester-, ethylester-, propylester-, buty lester- eller tert-butylestergruppe osv.), en benzyl-ester- , p-nitrobenzylester-, p-methoxybenzylester-, p- 9

DK 159163 B

chlorbenzylester-, benzhydrylester-, carbobenzoxyhydra-zido-, tert-butyloxycarbonylhydrazido- eller tritylhydra-zidogruppe osv.

Som eksempler på beskyttelsesgruppen for guanidi-5 nogruppen i arginin kan der nævnes en nitrogruppe, en tosy lgruppe, en p-methoxybenzensulfonylgruppe, en carbo-benzoxygruppe, en isobornyloxycarbonylgruppe, en ada-mantyloxycarbonylgruppe osv. Guanidinogruppen kan også beskyttes i form af et salt med en syre (f.eks. benzen-10 sulfonsyre, toluensulfonsyre, saltsyre, svovlsyre osv.).

Hydroxygruppen i threonin kan beskyttes ved este-rifikation eller etherifikation. Som eksempler på til esterifikation egnede grupper kan der nævnes lavere al-kanoylgrupper (f.eks. en acetylgruppe osv.), aroylgrupper 15 (f.eks. en benzoylgruppe osv.), af kulsyre afledede grupper (f.eks. en benzoyloxycarbonylgruppe, ethyloxycarbo-nylgruppe osv.) og lignende, og som eksempler på en til etherifikation egnet gruppe kan der nævnes en benzyl-gruppe, en tetrahydropyranylgruppe, en tert-butylgruppe 20 osv. Hydroxygruppen i threonin beskyttes dog ikke nødvendigvis. Methionin kan beskyttes i form af sulfoxid.

Som eksempler på udgangsmaterialer med aktiveret carboxylgruppe kan der nævnes syreanhydrider, azider, aktive estere (estere med pentachlorphenol, p-nitrophe-25 nol, N-hydroxysuccinimid, N-hydroxybenzotriazol, N-hydro-xy-5-norbornen-2,3-dicarboximid osv.) og lignende.

Den peptidbindingsdannende reaktion udføres i nogle tilfælde i nærværelse af et dehydratiserende middel, såsom et carbodiimidreagens (f.eks. dicyclohexylcarbo-30 diimid eller carbodiimidazol).

Den peptidbindingsdannende reaktion kan udføres i nærværelse af et opløsningsmiddel. Som et sådant opløsningsmiddel kan et passende udvælges blandt dem, der vides at være anvendelige til peptidkondensationsreak-35 tioner. Som eksempler herpå kan der nævnes vandfrit el- 10

DK 159163 B

ler vandigt dimethylformamid, dimethylsulfoxid, pyridin, chloroform, dioxan, dichlormethan, tetrahydrofuran, ethylacetat, N-methylpyrrolidon og blandinger heraf.

Reaktionstemperaturen vælges passende i det om-5 råde, der vides at være anvendeligt til peptidbindings-dannende reaktioner, sædvanligvis fra ca. -40 til ca.

60°C, fortrinsvis fra ca. -20°C til ca. 0°C.

Efter afslutning af den ovenfor beskrevne kondensationsreaktion kan eventuelle beskyttelsesgrupper i pro-10 duktet fjernes ved en konventionel fremgangsmåde. Som eksempler på en sådan konventionel fremgangsmåde kan der nævnes en reduktionsproces (f.eks. hydrogenering under anvendelse af en katalysator som palladiumsort, reduktion under anvendelse af natriummetal i flydende ammo-15 niak osv.), acidolyse (f.eks. acidolyse med en stærk syre, såsom trifluoreddikesyre, hydrogenfluorid eller me-thansulfonsyre).

Peptidet med den almene formel (1) som beskrevet ovenfor isoleres fra reaktionsblandingen og renses ved 20 en peptidfraskillelsesmetode, såsom ekstraktion, fordeling, kolonnechromatografi osv.

Til fremstilling af antistoffet tander anvendelse af det opnåede antigen administreres antigenet til et pattedyr på konventionel måde, og det in vivo dannede 25 antistof opsamles. Det pattedyr, der skal anvendes til fremstilling af antistoffet, er ikke underkastet særlige begrænsninger. Dog er kaniner og marsvin sædvanligvis hensigtsmæssige. Ved fremstilling af antistoffet fortyndes en forudbestemt mængde af det som ovenfor beskrevet 50 opnåede antigen med en fysiologisk saltopløsning til en forudbestemt koncentration. Denne opløsning blandes derefter med Freund's fuldstændige adjuvans til fremstilling af en dispersion, som derefter administreres til pattedyret. F.eks. administreres den ovenfor beskrevne 1 1

DK 159163 B

dispersion intradermalt til en kanin i en dosis på 0,5 til 5 mg af antigenet på én gang. Derefter gentages administreringen i en dosis på 0,5 til 5 mg én gang hver-anden uge i 2 til 10 måneder, fortrinsvis 4 til 6 måne-5 der til immunisering af kaninen.

Opsamlingen af antistoffet kan udføres ved åreladning af den immuniserede kanin, når der er dannet en stor mængde af antistoffet efter den sidste administrering af den antigenet indeholdende dispersion, alminde-10 ligvis 1 til 2 uger efter den sidste administrering, og centrifugering af det således opnåede blod til fraskil-lelse af antiserum.

Fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse har den fordel, at der med god reproducerbarhed kan op-15 nås et i høj grad aktivt og i høj grad sensitivt antistof i stabil form, som har en yderst fortrinlig specificitet med hensyn til humant og animalskrtårm-glucagon baseret på den enestående beskaffenhed af det anvendte antigen.

20 Det således opnåede antistof har en særlig for træffelig specificitet med hensyn til tarm-glucagon som beskrevet ovenfor og gør det muligt at bestemme humant tarm-glucagon med stor nøjagtighed efter RIA-metoden.

Dette antistof kan også anvendes til en enzym-immunoas-25 saymetode (EIA-metode), en fluorescens-immunoassay-me-tode (FIA-metode) osv. ved mærkning med et enzym eller et fluorescerende materiale. Endvidere kan dette antistof omsættes med et kendt uopløseliggørende materiale til fremstilling af et uopløseligt antistof.

30 Den foreliggende opfindelse beskrives nærmere ved hjælp af de efterfølgende ikke-begrænsende referenceeksempler og eksempler.

12

DK 159163 B

R^-værdierne i referenceeksemplerne er målt ved tyndtlagschromatografi på silicagel under anvendelse af følgende opløsningsmiddelblandinger: R^ .... 1-butanol-eddikesyre-vand (4:1:5) 5 R^1.... 1-butanol-pyridin-eddikesyre-vand (31:20:6:24) [Fremstilling af peptidet med den almene formel (1)Γ· Referenceeksempel 1 ^ (1) Fremstilling af Z-Ile-Ala-OH: 10,87 g Z-Ile-OSu opløst i 50 ml tetrahydrofuran sattes til 30 ml af en vandig opløsning indeholdende 2,67 g H-Ala-OH og 4,20 ml triethylamin under iskøling.

Reaktionsopløsningen omrørtes ved stuetemperatur i 20 ti- 1 5 mer efterfulgt af afdestillation af opløsningsmidlet.Derpå opløstes remanensen i 100 ml af en 2%'s vandig tri-ethylaminopløsning og vaskedes 3 gange med ethylacetat.

Efter syrning af den vandige opløsning med 3 N citronsyre dannedes der en olieagtig udskillelse, som derefter ? n ekstraheredes med ethylacetat. Ekstrakten vaskedes derpå med 1 N citronsyre og mættet vandig natriumchloridopløs-ning efterfulgt af afdestillation af opløsningsmidlet. Remanensen blev bragt i fast form fra en methanol-ether-blanding til opnåelse af 6,5 g af slutproduktet, smp.

25 156-161°C, [a]^? -29,4° (C = 1,0, methanol).

(2) Fremstilling af Z-Asn-Ile-Ala-OH: 3,36 g Z-Ile-Ala-OH reduceredes katalytisk i en qp-løsningsmiddelblanding bestående af 20 ml methanol og 15 ml vand i nærværelse af palladiumsort. Det opnåede di-3° peptid opløstes i 20 ml vand indeholdende 1,4 ml triethylamin og 16 ml tetrahydrofuran og afkøledes til -10°C.

13

DK 159163 B

Til denne opløsning sattes et blandet syreanhydrid opnået ud fra 3,46 g Z-Asn-OH, 1,67 ml ispbutylchlorformiat og 1,42 ml N-methylmorpholin ved -10°C i en blandet opløsning af 15 ml dimethylformamid og 20 ml tetrahydrofuran.

5 Reaktionsblandingen omrørtes ved 0°C i 5 minutter og derefter ved 15°C i 30 minutter, hvorefter opløsningsmidlet afdestilleredes. Til remanensen sattes 1 N citronsyre, og et således dannet bundfald vaskedes med vand, tørredes og rensedes ved genudfældning fra methanol-ethylacetat.

10 På denne måde opnåedes der 3,60 g af slutproduktet, smp. 240-244°C (d.), [a]^: -13,8° (C: 1,0, dimethylformamid) .

(3) Fremstilling af Z-Asn-Asn-Ile-Ala-OH: 4,74 g Z-Asn-Ile-Ala-OH opløstes i 20 ml iseddike.

Derpå tilsattes der 25 ml 25%'s hydrogenbromid i eddike- 1 5 syre, og man lod blandingen henstå ved stuetemperatur i 60 minutter. Et ved tilsætning åf vandfri ether dannet bundfald opsamledes ved filtrering, vaskedes med ether og tørredes over kaliumhydroxid. Det således opnåede de-carbobenzoxylerede produkt opløstes i 50 ml dimethyl- 20 formamid indeholdende 3,08 ml triethylamin og afkøledes til -10°C. Til denne opløsning sattes et blandet syreanhydrid af Z-Asn fremstillet ud fra 4?,18g Z-Asn-OH, 1,60 ml N methylmorpholin og isobutylchlorformiat. De efterfølgende processer udførtes på samme måde som beskrevet 25 ovenfor under (2) til opnåelse af 3,60 g af slutproduktet, smp. 235°C (d.), [a]: -10,1° (C: 0,5, 80% eddikesyre) .

(4) Fremstilling af Z-Lys(Tos)-Asn-Asn-Ile-Ala-OH: 3,41 g Z-Asn-Asn-Ile-Ala-OH opløstes i 15 ml iseddike, og der tilsattes 25 ml 25%'s hydrogenbromid i eddikesyre til fjernelse af carbobenzoxygruppen som be- 14

DK 159163 B

skrevet ovenfor under (3) . Det opnåede decarbobenzoxylerede produkt opløstes i 30 ml dimethylformamid indeholdende lf70 ml triethylamin. Til denne opløsning sattes et blandet syreanhydrid opnået ud fra 3,13 g Z-Lys(Tos)-5 OH, 0,73 ml N-methylmorpholin og 0,95 g isobutylchloro-formiat. Efter de under (2) beskrevne procedurer opnåedes der 4,01 g af slutproduktet, smp. 229-230°C (d.), [а] ^: -19,4° (C: 1,0, dimethylformamid).

(5) Fremstilling af Z-Arg-(NC>2)-Asn-Lys (Tos)-Asn-Asn-10 Ile-Ala-OH: 2,03 g Z-Lys(Tos)-Asn-Asn-Ile-Ala-OH opløstes i 20 ml iseddike. Derefter tilsattes der 20 ml 25%1 s hy-drogenbromid i eddikesyre til fjernelse af carbobenzoxy-gruppen som beskrevet ovenfor under (2).

15 På den anden side henstilledes 4,19 g Z-Arg (NC>2)-

Asn-N2H2-Boc i trifluoreddikesyre i 30 minutter ved stuetemperatur til fjernelse af Boc- og opløstes derefter i 20 ml dimethylformamid. Til denne opløsning sattes der efter hinanden 3,61 ml 6 N saltsyre-dioxan og 0,96 ml 20 isoamylnitrit ved -15°C, og den opnåede blanding omrør-tes ved -10°C i 5 sekunder efterfulgt af indstilling af pH-værdien til 7,5. Denne opløsning sattes ved -10°C til 30 ml af den det ovenfor beskrevne decarbobenzoxylerede produkt indeholdende dimethylformamidopløsning og 0,64 25 ml triethylamin, og reaktionsblandingen omrørtes ved 4°C i 20 timer efterfulgt af fjernelse af opløsningsmidlet.

Til remanensen sattes 10% eddikesyre, og det således på fast form bragte materiale opsamledes ved filtrering, vaskedes med vand, tørredes og genudfældedes af metha-30 nol-ethylacetat til opnåelse af 2,19 g af slutproduktet, smp. 232-234°C, [a]^: -14,3° (C: 1,0, 80% eddikesyre) .

(б) Fremstilling af Z-Lys(Tos)-Arg-Asn-Lys(Tos)-Asn-Asn-Ile-Ala-OH: 2,14 g Z-Arg(N02)-Asn-Lys(Tos)-Asn-Asn-Ile-Ala-OH 35 reduceredes katalytisk i 50 ml 50% eddikesyre i nærværelse af palladiumsort til fjernelse af carbobenzoxygruppen.

Det opnåede decarbobenzoxylerede produkt opløstes i 20 ml 15

DK 159163 B

dimethylformamid indeholdende 2,52 ml trlethylamin. Til denne opløsning sattes Z-Lys(Tos)-OSu fremstillet ved omsætning af 2,40 g Z-Lys(Tos)-OH med 0,64 g N-hydroxy-succinimid i nærværelse af 1,14 g dicyclohexylcarbodi-5 imid uden rensning. Reaktionsblandingen omrørtes ved stuetemperatur i 20 timer, hvorefter opløsningsmidlet afdestilleredes. Til remanensen sattes 10% eddikesyre for at bringe den på fast form. På denne måde opnåedes

λ O

der 1,42 g af slutproduktet, smp. 200-204°C [a]^ : -30, fP 10 (C: 1,0, 80% eddikesyre).

(7) Fremstilling af Boc-Leu-Met-Asn-Thr-Lys(Tos)-Arg-Asn-Lys(Tos)-Asn-Asn-Ile-Ala-OH: 1,38 g Z-Lys(Tos)-Arg-Asn-Lys(Tos)-Asn-Asn-Ile-Ala-OH opløstes i 5 ml iseddike, og der tilsattes 7 ml 15 25% hydrogenbromid-eddikesyre til fjernelse af carbobenz-oxygruppen som beskrevet ovenfor under (3).

1,75 g Boc-Leu-Met-Asn-ThrN2H3 opløstes i 15 ml dimethylformamid og behandledes med 1,43 ml 6 N saltsy-re-dioxan og 0,38 ml isoamylnitrit på samme måde som un-20 der (5) og sattes derefter til 15 ml dimethylformamid indeholdende det ovenfor beskrevne decarbobenzoxylerede produkt og 0,28 ml triethylamin. Reaktionsblandingen omrørtes ved 4°C i 20 timer, hvorefter opløsningsmidlet afdestilleredes. Remanensen underkastedes en modstrøms-25 fordelingsmetode i et l-butanol-2% eddikesyre-system, og 1-butanollaget opsamledes efterfulgt af afdestillation af opløsningsmidlet. Til remanensen sattes ethylacetat, og det på fast form bragte produkt vaskedes med methanol til opnåelse af 1,10 g af slutproduktet. R^-værdi: 0,28.

30 (8) Fremstilling af Boc-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-Lys(Tos)-Arg-Asn-Lys(Tos)-Asn-Asn-Ile-Ala-OH: 1,05 g Boc-Leu-Met-Asn-Thr-Lys(Tos)-Arg-Asn-Lys (Tos) -Asn-Asn-Ile-Ala-OH henstilledes i 6 ml trifluor-eddikesyre ved stuetemperatur i 30 minutter, og der til-35 sattes tør ether. Det således dannede bundfald opsamledes ved filtrering, vaskedes med ether og tørredes over natriumhydroxid under formindsket tryk til opnåelse af 16

DK 159163 B

det Boc-fri produkt.

Boc-Trp-OSu (fremstillet ved omsætning af 700 mg Boc-Trp-OH med 265 mg N-hydroxysuccinimid under indvirkning af 475 mg dicyclohexylcarbodiimid). opløstes i 20 ml 5 dioxan, og denne opløsning sattes til 15 ml af en dimeth-ylformamidopløsning indeholdende detovenfor beskrevne Boc-fri produkt og 0,16 ml triethylamin. Denne reaktionsblanding omrørtes ved stuetemperatur i 24 timer, hvorefter opløsningsmidlet afdestilleredes. Til remanensen sat-10 tes ethylacetat, og det således på fast form bragte pro- . dukt vaskedes med ethanol til opnåelse af 798 mg af slutproduktet. R^: 0,44.

(9) Fremstilling af Boc-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-Lys(Tos)-Arg-Asn-Lys(Tos)-Asn-Asn-Ile-Ala-OH: 15 777 mg Boc-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-Lys(Tos)-Arg-Asn-

Lys (Tos)-Asn-Asn-Ile-Ala-OH behandledes i 4 ml trifluor-eddikesyre til fjernelse af Boc som under (8)-

En opløsning af 513 mg Boc-Val-Gln-OSu i 10 ml dimethylformamid sattes til en opløsning af det ovenfor 20 beskrevne Boc-fri produkt og 0,02 ml triethylamin i 5 ml dimethylformamid. Denne reaktionsblanding omrørtes ved stuetemperatur i 24 timer, hvorefter opløsningsmidlet afdestilleredes. Derpå sattes der 10% eddikesyre til remanensen, og det således på fast form bragte produkt vaske-25 des med vand og ethanol til opnåelse af 662 mg af slutproduktet . R^: 0,26.

(10) Fremstilling af H-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-Lys(Tos)-Arg-Asn-Lys(Tos)-Asn-Asn-Ile-Ala-OH: 30 645 mg Boc-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-Lys(Tos)-

Arg-Asn-Lys(Tos)-Asn-Asn-Ile-Ala-OH henstilledes Ved stuetemperatur i 40 minutter i nærværelse af 4 ml tri-fluoreddikesyre, 0,4 ml ethandithiol og 0,2 ml anisol til fjernelse af Boc som beskrevet ovenfor under (8).

35 783 mg Boc-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-^H^ (smp.

158-163°C (d.), [a]^: -1,0° (C: 1,0, dimethylsulfoxid)) opløstes i 10 ml dimethylformamid, og efter tilsætning 17

DK 159163 B

af 0,35 ml 6 N saltsyre-dioxan ved -15°C tilsattes der yderligere 0,09 ml isoamylnitrit. Efter omrøring af opløsningen ved -10°C i 5 minutter indstilledes opløsningens pH-værdi på 7,5 med triethylamin. Den opnåede op-5 løsning sattes til en opløsning af det ovenfor beskrevne Boc-fri produkt og 0,12 ml triethylamin i 10 ml dimethyl-formamid ved -10°C. Denne reaktionsblanding omrørtes ved 4°C i 20 timer, hvorefter opløsningsmidlet afdestillere des. Remanensen bragtes derefter på fast form ved til-10 sætning af ethylacetat, opsamledes ved filtrering og tørredes .

Dette reaktionsprodukt underkastedes, uden yderligere rensning, trinnet til fjernelse af Boc med 5 ml trifluoreddikesyre i nærværelse af 0,5 ml ethandithiol.

15 Det opnåede Boc-fri produkt opløstes i 20 ml af en blandet opløsning af 1-butanol-methanol-vand (1:1:1), og opløsningen hældtes på en kolonne med "Amberlite ® IRA-410" (2x4 cm) til omdannelse af produktet til et acetat.

Det således opnåede acetat lyofiliseredés, opløstes i 20 1 M eddikesyre, fyldtes på en "Sephades^ G25"-kolonne (3 x 190 cm) og underkastedes gelfiltrering under anvendelse af 1 M eddikesyre som eluent. Fraktioner indehol-» dende slutproduktet (nr. 64 til 80) opsamledes, og opløsningsmidlet afdestilleredes efterfulgt af lyofilise-25 ring af remanensen. Denne opløstes derpå i 5 ml af et nedre lag af et ©pløsningsmiddelsystem (1-butanol: eddikesyre:vand = 4:1:5) og rensedes ved en væskedråbe-modstrømsfordelingsmetode under anvendelse af et øvre lag af det samme opløsningsmiddelsystem. Fraktioner in-30 deholdende slutproduktet opsamledes, og opløsningsmidlet afdestilleredes, hvorefter der udførtes lyofilisering til opnåelse af 260 mg af slutproduktet. R^: 0,20, R^1: 0,65.

Aminosyreanalyse af syredekomponeret produkt: 35 Lys (2) 2,11, Arg (3) 2,60, Asp (5) 4,74,

Thr (1) 0,87, Glu (2) 2,08, Ala (2) 2,17,

Val (1) 1,18, Met (1) 1,03, Ile (1) 0,95,

Leu (1) 1,02, Phe (1) 1,06.

18

DK 159163 B

(11) Fremstilling af H-Ser-Lys(Tos)-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-Lys(Tos)-Arg-Asn-Lys(Tos)-Asn-Asn-Ile-Ala-OH: 485 mg Boc-Ser-Lys(Tos)-Tyr-Leu-Asp-Ser-^Hg 5 (smp. 174-175°C (d.), [a^? -21,8° (C: 1,0, dimethyl-formamid) kondenseredes med H-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-Lys(Tos)-Arg-Asn-Lys (Tos)-Asn-Asn-Ile-Ala-OH;efter en azid-metode under anvendelse af 0,15 ml 6 N saltsyre-dioxan og 0,31 ml 20% 10 isoamylnitrit-dimethylformamid-opløsning på samme måde som under (10). Efter endt reaktion afdestilleredes opløsningsmidlet. Efter tilsætning af ethylacetat størknede produktet. Dette råprodukt opløstes i 5 ml af et nedre lag af et opløsningsmiddelsystem (l-butanol:eddikesy-15 re:vand = 4:1:5) og underkastedes en væskedråbe-mod-strømsfordelingsmetode til udførelse af rensning. Fraktioner indeholdende slutproduktet opsamledes, og opløsningsmidlet afdestilleredes. Remanensen opløstes i 7 ml af en blanding af 1-butanol-methanol-vand (1:1:1) og 20 hældtes på en kolonne med "Sephades^LH 20" (3 x 108 cm) til udførelse af gelfiltrering linder anvendelse af 1-butanol-methanol-vand (1:1:1) som eluent. Fraktioner indeholdende slutproduktet opsamledes, og opløsningsmidlet afdestilleredes. Til remanensen sattes derpå ethylacetat 25 til fremkaldelse af størkning. Det således størknede produkt behandledes i nærværelse af 3 ml trifluoreddike-syre og 0,2 ml ethandithiol til fjernelse af Boc. Det tørrede Boc-fri produkt opløstes i 5 ml 1 M eddikesyre og hældtes på en kolonne med "Sephade:^ G50" (3 x 145 30 cm) til udførelse af gelfiltrering under anvendelse af 1 M eddikesyre som eluent. Fraktioner indeholdende slutproduktet (nr. 43-57) opsamledes, hvorefter opløsningsmidlet afdestilleredes. Remanensen lyofiliseredes derpå til opnåelse af 93 mg af slutproduktet. R^: 0,25, R^1: 35 0,54.

Aminosyreanalyse af syredekomponeret produkt (6 N HC1, 110°C, 24 timer) 19

DK 159163 B

Lys (3) 2,80, Arg (3) 2,89, Asp (6) 6,10,

Thr (1) 0,97, Ser (2) 1,79, Glu (2) 2,06,

Ala (2) 2,03, Val (1) 0,99, Met (1) 0,87,

Ile (1) 1,00, Leu (2) 1,98, Thr (1) 1,00, 5 Phe (1) 1,00.

(12) Fremstilling af H-Lys-Arg-Asn-Lys-Asn-Asn-Ile-Ala-OH: 25 mg Z-Lys(Tos)-Arg-Asn-Lys(Tos)-Asn-Asn-Ile-Ala-OH opløstes i 30 ml flydende ammoniak, og der tilsattes 10 metallisk natrium i små stykker.Når reaktionsopløsningen blev blå, sattes der 0,5 g tørt ammoniumchlorid til den, hvorefter ammoniakken afdestilleredes. Remanensen opløstes i 1 M eddikesyre og underkastedes gelfiltrering under anvendelse af- "Sephadex^lO" (4 x 43 cm) , idet der 15 anvendtes 1 M eddikesyre som eluent. Fraktioner indeholdende slutproduktet opsamledes, og opløsningsmidlet af-destilleredes efterfulgt af lyofilisering af remanensen til opnåelse af 10 mg af slutproduktet. R*P 0,01, rP: 0,27.

20 Aminosyreanalyse af syredekomponeret produkt.

Lys (2) 1,84, Arg (1) 0,94, Asp (3) 3,08,

Ala (1) 1,08, Ile (1) 1,05.

(13) Fremstilling af H-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-Lys-Arg-Asn-Lys-Asn-Asn-Ile-Ala-OH: 25 10 mg Boc-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-Lys(Tos)-

Arg-Asn-Lys(Tos)-Asn-Asn-Ile-Ala-OH behandledes i nærværelse af 1 ml trifluoreddikesyre og 0,1 ml ethandithiol til fjernelse af Boc og behandledes derefter med metallisk natrium i flydende ammoniak på samme måde som under 30 (12) til fjernelse af beskyttelsesgrupperne. Ved rensning ved gelfiltrering opnåedes 5 mg af slutproduktet.

R^: 0,20, R^·· 0,49, [<x]33: -50,0 (C: 0,07, 1 M eddikesyre) .

(14) Fremstilling af H-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln- 35 Trp-Leu-Met-Asn-Thr-Lys-Arg-Asn-Lys-Asn-Asn-Ile-Ala- OH: 100 mg H-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu- DK 159163 B ! 20

Met-Asn-Thr-Lys(Tos)-Arg-Asn-Lys(Tos)-Asn-Asn-Ile-Ala-OH behandledes på samme måde som under (12) til fjernelse af alle beskyttelsesgrupper. Ved rensning ved gelfil-

X TT

trering opnåedes 40 mg af slutproduktet. Rf: 0,20, : 5 0/51, [a]p3: -46,3° (C: 0,2, 1 M eddikesyre).

(15) Fremstilling af H-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-Lys-Arg-Asn-Lys-Asn-Asn-Ile-Ala-OH: 10 mg H-Ser-Lys(Tos)-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-10 Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-Lys(Tos)-Arg-Asn-Lys (Tos)-Asn-Asn-Ile-Ala-OH behandledes på samme måde som under (12) til fjernelse af alle beskyttelsesgrupper og underkastedes derpå gelfiltrering på "Sepha-dex^ G-50" (2,5 x 135 cm) under anvendelse af 1 M eddi-15 kesyre som eluent. Fraktioner indeholdende slutproduktet opsamledes og lyofiliseredes til opnåelse af 4 mg af slutproduktet. R*: 0,20, R*1: 0,49, [a]33: 60,9° (C: 0,1, 1 M eddikesyre).

[Fremstilling af antistof].

20 Eksempel 1 10 mg af det i referenceeksempel 1 (14) opnåede peptid (i det følgende for kortheds skyld betegnet simpelt hen som "peptid A") og 5 mg okseserumalbumin (i det følgende for kortheds skyld betegnet simpelthen som 25 "BSA") opløstes i 2 ml af en ammoniumacetatpufferopløs-ning (0,1 M, pH 7,0), og der tilsattes 0,11 ml af en 0,1 M glutaraldehydopløsning, hvorefter der omrørtes ved stuetemperatur i 5 timer. Reaktionsblandingen dialyseredes derpå i 48 timer ved 4°C under anvendelse af 1 liter 30 vand, hvorunder vandet udskiftedes 5 gange. Den opnåede opløsning indeholdende peptid-protein-komplekset lyofiliseredes derpå til opnåelse af 14 mg af tarm-glucagon-antigenet (i det følgende for kortheds skyld betegnet simpelthen som "antigen I").

35 Det således opnåede antigen I underkastedes end- fcj videre gelfiltrering under anvendelse af "SephadexwG-50" (eluent: fysiologisk saltopløsning, påvisning: OD 280 mm, 21

DK 159163 B

elueringshastighed: 3 ml/time, udleveret mængde: 1 ml portion). Fraktion [I] indeholdende peptid A bundet til BSA adskiltes fra fraktion [II] indeholdende andet produkt (dimer af peptid A), og fraktion [I] dialyse-5 redes mod 0,6% vandig natriumchloridopløsning ved 4°C i 24 timer og lyofiliseredes til opnåelse af 7 mg hvidt, pulverformigt peptid A-BSA-komplex (i det følgende for kortheds skyld betegnet simpelthen som "antigen 1' "). Dette komplex var et komplex bestående 10 af 1 mol BSA med i gennemsnit 13 mol peptid A koblet dertil. Det skal tilføjes, at dette bindingsforhold opnåedes som følger: Først udarbejdedes der en standardkurve for koncentrationen af peptid-A-dimeren baseret på, at der 15 viste sig ikke at være uomsat BSA og peptid A tilbage, og mængden af peptid-A-dimeræi den ovennævnte fraktion beregnedes ud fra standardkurven. Derefter udlededes mængden fra mængden af i starten tilsat peptid A.· Den fremkomne mængde peptid A antoges at svare til mængden 20 af til BSA koblet peptid A.

Eksempel 2 5 mg af peptidet H-Leu-Met-Asn-Thr-Lys-Arg-^Sh“Lys-Asn-Asn-Ile-Ala-OH, opnået på samme måde som i referenceeksempel 1 (i det følgende for kortheds skyld be-25 tegnet simpelthen som "peptid B") og 5 mg BSA opløstes i 2 ml af en ammoniumacetatpuffer (0,1 M, pH 7,0).

0,11 ml af en 0,1 M glutaraldehydopløsning sattes til denne opløsning, hvorefter der omrørtes ved stuetemperatur i 5 timer. Reaktionsblandingen dialyseredes der-30 efter mod 1 liter vand ved 4°C i 48 timer, hvorunder vandet udskiftedes 5 gange. Den opnåede opløsning indeholdende peptid-protein-komplex lyofiliseredes til opnåelse af 9 mg af et tarm-glucagon-antigen (i det følgende for kortheds skyld betegnet simpelthen som 35 "antigen II").

Dette antigen II underkastedes yderligere gelfiltrering under anvendelse af "Sephadex^ G-50" til ad- * « 22

DK 159163 B

skillelse af fraktion [I] indeholdende peptid B koblet til BSA fra fraktion [II] indeholdnede andet produkt (peptid-B-dimer), og fraktion [I] dialyseredes mod 0/6% saltopløsning ved 4°C i 24 timer og lyofiliseredes 5 til opnåelse af 6 mg hvidt,pulverformigt peptid B-BSA-komplex. Dette komplex var et komplex af 1 mol BSA med i gennemsnit 10 mol peptid B koblet dertil.

Eksempel 3 4 mg af det i referenceeksempel 1 (12) opnåede 10 peptid (i det følgende for kortheds skyld betegnet simpelthen som "peptid C") og 5 mg BSA opløstes i 2 ml af en ammoniumacetatpufferopløsning (0,1 M, pH 7,0).

Til denne opløsning sattes 0,11 ml af en 0,1 M glutar- · aldehydopløsning, hvorefter der omrørtes ved stuetempera-15 tur i 5 timer. Reaktionsblandingen dialyseredes derefter mod 1 liter vand ved 4°C i 48 timer, hvorunder vandet udskiftedes 5 gange. Den opnåede opløsning indeholdende peptid-protein-komplex lyofiliseredes til opnåelse af 7,5 mg af et tarm-glucagon-antigen (i det følgende for 20 kortheds skyld betegnet simpelthen som "antigen III").

Dette antigen III underkastedes yderligere gelfiltrering under anvendelse af "SephadeJ^ G-50" til adskillelse af fraktion [I] indeholdende peptid C koblet til BSA fra fraktion [II] indeholdende andet 25 produkt (peptid-C-dimer), og fraktion [I] dialyseredes mod 0,6% saltopløsning ved 4°C i 24 timer og lyofiliseredes til opnåelse af 5,5 mg hvidt, pulverformigt peptid C-BSA-komplex. Dette komplex var et komplex af 1 mol BSA med i gennemsnit 8 mol peptid C koblet dertil. 1 2 3 4 5 6

Eksempel 4 2 4 mg af peptidet H-Lys-Lys-Arg-Asn-Lys-Asn-Asn- 3

Ile-Ala-OH, opnået som i referenceeksempel 1 (i det føl 4 gende forkortet til "peptid D") og 5 mg BSA opløstes 5 i 2 ml af en ammoniumacetatpufferopløsning (0,1 M, 6 pH 7,0). Til denne opløsning sattes 0,11 ml af en 0,1 M glutar.aldehydopløsning, hvorefter der omrørtes 23

DK 159163 B

ved stuetemperatur i 5 timer. Reaktionsblandingen dialyseredes derefter mod 1 liter vand ved 4°C i 48 timer, hvorunder vandet udskiftedes 5 gange. Den opnåede opløsning indeholdende peptid-protein-komplex 5 lyofiliseredes til opnåelse af 8 mg af et tarm-gluca-gon-antigen (i det følgende forkortet til "antigen IV").

Dette antigen IV underkastedes yderligere gelfiltrering under anvendelse af "Sephadex® G-50" til adskillelse af fraktion [I] indeholdende peptid D bundet til 10 BSA og fraktion [II] indeholdende andet produkt (pep-tid-D-dimer), og fraktion [I] dialyseredes mod 0,6% saltopløsning ved 4°C i 24 timer og lyofiliseredes til opnåelse af 6 mg hvidt,pulverformigt peptid D-BSA-komplex. Dette komplex var et komplex af 1 mol BSA med 15 i gennemsnit 9 mol peptid D koblet dertil.

Eksempel 5 4 mg af peptidet H-Tyr-Lys-Arg-Asn-Lys-Asn-Asn-Ile-Ala-OH, opnået som i referenceeksempel 1 (i det følgende forkortet til "peptid E") og 5 mg BSA opløstes 20 i 2 ml af en ammoniumacetatpufferopløsning (0,1 M, pH 7,0). Til denne opløsning sattes 0,11 ml af en 0,1 M glutaraldehydopløsning, hvorefter der omrørtes ved stuetemperatur i 5 timer. Reaktionsblandingen dialyseredes derefter mod 1 liter vand ved 4°C i 48 25 timer, hvorunder vandet udskiftedes 5 gange. Den opnåede opløsning indeholdende peptid-protein-komplex lyofiliseredes til opnåelse af 7 mg af et tarm-glucagon-antigen (i det følgende forkortet til "antigen V").

Dette antige V underkastedes yderligere gelfiltre-30 ring under anvendelse af "Sephadex*-'G-50" til adskillelse af fraktion [I] indeholdende peptid E bundet til BSA og fraktion [II] indeholdende andet produkt (pep-tid-E-dimer), og fraktion [I] dialyseredes mod 0,6% saltopløsning ved 4°C i 24 timer og lyofiliseredes til 35 opnåelse af 5 mg af hvidt#pulverformigt peptid E-BSA-komplex. Dette komplex var et komplex af 1 mol BSA med i gennemsnit 6 mol peptid E koblet dertil.

DK 159163 B

24

Eksempel 6 5 mg af peptidet H-Gly-Lys-Lys-Arg-Asn-Lys-Asn-Asn-Ile-Ala-OH, opnået som i referenceeksempel 1 (i det følgende forkortet til "peptid F") og 5 mg BSA opløstes 5 i 2 ml af en ammoniumacetatpufferopløsning (0,1 M, pH 7,0). Til denne opløsning sattes 0,11 ml af en 0,1 M glutaraldehydopløsning, hvorefter der omrørtes ved stuetemperatur i 5 timer. Reaktionsblandingen dialyseredes derefter mod 1 liter vand ved 4°C i 48 timer, 10 hvorunder vandet udskiftedes 5 gange. Den opnåede opløsning indeholdende peptid-protein-komplex lyofiliseredes til opnåelse af 9 mg af et tarm-glucagon-antigen ( i det følgende forkortet til "antigen VI").

Dette antigen VI underkastedes yderligere gel-15 filtrering under anvendelse af "Sephade^^G-50" til adskillelse af fraktion [I] indeholdende peptid F bundet til BSA og fraktion [III indeholdende andet produkt (peptid F-dimer), og fraktion [I] dialyseredes mod 0,6% saltopløsning ved 4°C i 24 timer og lyofilise-20 redes til opnåelse af 6 mg hvidt, pulverformigt peptid F-BSA-komplex. Dette komplex var et komplex af 1 mol BSA med i gennemsnit 14 mol peptid F koblet dertil.

Eksempel 7 4 mg af peptidet H-Ala-Lys-Arg-Asn-Lys-Asn-Asn-25 Ile-Ala-OH opnået som i referenceeksempel 1 (i det følgende forkortet til "peptid G") og 5 mg BSA opløstes i 2 ml af en ammoniumacetatpufferopløsning (0,1 M, pH 7,0). Til denne opløsning sattes 0,11 ml af en 0,1 M glutaraldehydopløsning, hvorefter der omrørtes 30 ved stuetemperatur i 5 timer. Reaktionsblandingen dialyseredes derefter mod 1 liter vand ved 4°C i 48 timer, hvorunder vandet udskiftedes 5 gange. Den opnåede opløsning indeholdende peptid-protein-komplex lyofiliseredes til opnåelse af 7,5 mg af et tarm-35 glucagon-antigen (i det følgende forkortet til "antigen VII").

Dette antigen VII underkastedes yderligere gel- 25

DK 159163 B

(r) filtrering under anvendelse af "Sephadex^ G-50" til adskillelse af fraktion [I] indeholdende peptid G bundet til BSA og fraktion [II] indeholdende andet produkt (peptid-G-dimer), og fraktion [I] dialyseredes 5 mod 0,6% saltopløsning ved 4°C i 24 timer og lyofilise-redes til opnåelse af 5,5 mg hvidt, pulverformigt peptid G-BSA-komplex. Dette komplex var et komplex af 1 mol BSA med i gennemsnit 9 mol peptid G koblet dertil.

Eksempel 8 10 4 mg af peptidet H-Gly-Lys-Arg-Asn-Lys-Asn-Asn-

Ile-Ala-OH, opnået som i referenceeksempel 1 (i det følgende forkortet til "peptid H") og 5 mg BSA opløstes i 2 ml af en ammoniumacetatpufferopløsning (0,1 M, pH 7,0). Til denne opløsning sattes 0,11 ml af en 0,1 M 15 glutaraldehydopløsning, hvorefter der omrørtes ved stuetemperatur i 5 timer. Reaktionsblandingen dialyseredes derefter mod 1 liter vand ved 4°C i 48 timer, hvorunder vandet udskiftedes 5 gange. Den opnåede opløsning indeholdende peptid-protein-komplex lyofilise-20 redes til opnåelse af 7,5 mg af et tarm-glucagon-antigen (i det følgende forkortet til "antigen VIII").

Dette antigen VIII underkastedes yderligere gelfiltrering under anvendelse af "Sephadexi^ G-50" til adskillelse af fraktion [I] indeholdende peptid H bundet 25 til BSA og fraktion [II] indeholdende andet produkt (peptid-H-dimer), og fraktion [I] dialyseredes mod 0,6% saltopløsning ved 4°C i 24 timer og lyofiliseredes til opnåelse af 6 mg hvidt, pulverformigt peptid H-BSA-komplex. Dette komplex var et komplex af 1 mol BSA 30 med i gennemsnit 10 mol peptid H koblet dertil.

Eksempel 9 12 mg af det i referenceeksempel 1 (15) opnåede peptid (i det følgende forkortet til "peptid I") og 5 mg BSA opløstes i 2 ml af en ammoniumacetatpuffer-35 opløsning (0,1 M, pH 7,0). Til denne opløsning sattes 0,11 ml af en 0,1 M glutaraldehydopløsning, hvorefter 26

DK 159163 B

der omrørtes ved stuetemperatur i 5 timer. Reaktions-blandingen dialyseredes derefter mod 1 liter vand ved 4°C i 48 timer, hvorunder vandet udskiftedes 5 gange.

Den opnåede opløsning indeholdende peptid-protein-5 komplex lyofiliseredes til opnåelse af 15 mg af et tarm-glucagon-antigen (i det følgende forkortet til "antigen IX").

Dette antigen IX underkastedes yderligere gelfiltrering under anvendelse af "Sephades^ G-50" til ad-10 skillelse af fraktion [I] indeholdende peptid I bundet til BSA og fraktion '[H] indeholdende andet produkt (peptid I-dimer), og fraktion [I] dialyseredes mod 0,6% saltopløsning ved 4°C i 24 timer og lyofiliseredes til opnåelse af 7,5 mg af hvidt/pulverformigt peptid 15 K-BSA-komplex. Dette komplex var et komplex af 1 mol BSA med i gennemsnit 10 mol peptid I koblet dertil.

[Fremstilling af antistof].

Eksempel 10 3 mg af det i eksempel 1 opnåede antigen I opløs-20 tes i 1,5 ml fysiologisk saltopløsning, og der tilsattes 1.5 ml af Freund's fuldstændige adjuvans til dannelse af en dispersion. Den således opnåede dispersion administreredes intradermalt til 3 kaniner (af en vægt på 2.5 til 3,0 kg). Administrering i den samme dosis blev 25 derefter gentaget 5 gange én gang hver anden uge.

Yderligere blev administrering i en dosis på det halve af initialdosen gentaget 5 gange én gang hver måned.

10 Dage efter den sidste administrering blev de immuniserede dyr åreladet, og det således opnåede blod 30 centrifugeredes til fraskillelse af antiserum. På denne måde opnåedes der et tarm-glucagon-antistof ifølge den foreliggende opfindelse (i det følgende forkortet til "antistof I").

Eksempel 11 35 3 mg af det i eksempel 1 opnåede antigen 1' opløstes i 1,5 ml af en fysiologisk saltopløsning, og 27

DK 159163 B

der tilsattes 1,5 ml af Freund's fuldstændige adjuvans til dannelse af en dispersion. Den således opnåede dispersion administreredes intradermalt til 3 kaniner (af en vægt på 2,5 til 3,0 kg). Administrering i den 5 samme dosis blev derefter gentaget 5 gange en gang hver anden uge. Yderligere blev administrering i en dosis på det halve af initialdosen gentaget 5 gange én gang hver måned. 10 dage efter den sidste administrering blev de immuniserede dyr åreladet, og det således 10 opnåede blod centrifugeredes til adskillelse af antiserum. På denne måde opnåedes der et tarm-glucagon-antistof ifølge den foreliggende opfindelse ( i det følgende forkortet til "antistof II").

Eksempel 12 15 3 mg af det i eksempel 9 opnåede antigen IX op løstes i 1,5 ml af en fysiologisk saltopløsning, og der tilsattes 1,5 ml af Freund's fuldstændige adjQvans til dannelse af en dispersion. Den således opnåede dispersion administreredes intradermalt til 3 kaniner 20 (af en vægt på 2,5 til 3,0 kg). Administrering i den samme do~sis blev derefter gentaget 5 gange én gang hver anden uge. Yderligere blev administrering i en dosis på det halve af initialdosen gentaget 5 gange én gang hver måned. 10 dage efter den sidste administre-25 ring blev de immuniserede dyr åreladet, og det således opnåede blod centrifugeredes til fraskillelse af antiserum. På denne måde opnåedes der et tarm-glucagon-antistof ifølge den foreliggende opfindelse (i det følgende forkortet til "antistof III"). 1 2 3 4 5 6

Eksempel 13 2 3 mg af det i eksempel 2 opnåede antigen II op 3 løstes i 1,5 ml af en fysiologisk saltopløsning, og der 4 tilsattes 1,5 ml af Freund's fuldstændige adjuvans 5 til dannelse af en dispersion. Den således opnåede 6 dispersion administreredes intradermalt til 3 kaniner (af en vægt på 2,5 til 3,0 kg). Administrering i den t » 28

DK 159163 B

samme dosis blev derefter gentaget 5 gange én gang hver anden uge. Yderligere blev administrering i en dosis på det halve af initialdosen gentaget 5 gange én gang hver måned. 10 dage efter den sidste administrering 5 blev de immuniserede dyr åreladet, og det således opnåede blod centrifugeredes til fraskillelse af antiserum. På denne måde opnåedes det et tarm-glucagon-antistof ifølge den foreliggende opfindelse ( i det følgende forkortet til "antistof IV").

10 Eksempel 14 3 mg af det i eksempel 3 opnåede antigen III opløstes i 1,5 ml af en fysiologisk saltopløsning, og der tilsattes 1,5 ml af Freund's fuldstændige adjuvans til dannelse af en dispersion. Den således opnåede disper-15 sion administreredes intradermalt til 3 kaniner (af en vægt på 2,5 til 3,0 kg). Administrering i den samme dosis blev derefter gentaget 5 gange én gang hver anden uge. Yderligere blev administrering i en dosis på det halve af initialdosen gentaget 5 gange én gang hver 20 måned. 10 dage efter den sidste administrering blev de immuniserede dyr åreladet, og det således opnåede blod centrifugeredes til fraskillelse af antiserum.

På denne måde opnåedes der et tarm-glucagon-antistof ifølge den foreliggende opfindelse (i det følgende 25 forkortet til "antistof V").

Eksempel 15 Når de i eksemplerne 4 til 8 opnåede antigener anvendtes og behandlede på samme måde som i eksempel 10, opnåedes der antistoffer med høj aktivitet og 30 høj specificitet med hensyn til tarm-glucoagon.

Referenceeksempel 2 Fremstilling af mærket peptid: H-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-Lys-Arg-Asn-Lys-Asn-Asn-Ile-35 Ala-OH mærkedes ved den fremgangsmåde, ved hvilken der DK 159163 B .

29 anvendes chloramin T. Det vil sige,10 μΐ af en vandig opløsning indeholdende 5 mg af det ovenfor beskrevne peptid og 10 μΐ af en vandig opløsning indeholdende 125 1 me [ I]Na(MEN) og 20 μg chloramin T sattes lidt 5 efter lidt til 20 μΐ af en 1,0 M phosphatpufferopløsning (pH 7,4). Efter 30 sekunders forløb blev rekationen afbrudt ved tilsætning af 50 μΐ vandig opløsning indeholdende 100 μg natriummetadisulfat. Reaktionsblandingen hældtes derefter på en kolonne med "SephadesP^ G-10" 10 (1,0 x 30 cm) under anvendelse af 0,1 M eddikesyre som eluent, Eluanten opsamledes i 1 ml portioner, og fraktionerne nr. 8 til 11 hældtes sammen til opnåelse af en 125 opløsning indeholdende H-Ser-Lys-[I -monoiodo-Tyr]-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-15 Met-Asn-Thr-Lys-Arg-Asn-Lys-Asn-Asn-Ile-Ala-OH.

Bestemmelse af antistofaktivitet.

Aktiviteten af hvert af de således opnåede antistoffer bestemtes som følger. Hvert af antistofferne fortyndedes først med en fysiologisk saltopløsning til 20 koncentrationer på 10 10 10 10 10 .......

Til 100 μΐ af hver fortyndet opløsning sattes 100 μΐ 125 af I-mærket peptid (fremstillet ved fortynding af den ovenfor beskrevne opløsning til en fortyndingsgrad på ca. 10.000 cpm) og 400 μΐ af en 0,05 M phosphatpuffer 25 (pH = 7,5) [indeholdende 0,25% BSA, 0,01 M EDTA og trasylol (500 KIV/ml)], og blandingen inkuberedes ved 4°C i 66 timer. Det opnåede komplex af antistoffet og 125 det I-mærkede antigen skiltes fra uomsat eller frit 125 I-mærket peptid under anvendelse af dextranovertruk-30 ket aktivtkul og centrifugeredes ved 4°C ved en hastighed på 3000 o/m i 15 minutter. Radioaktiviteten af det således opnåede komplex taltes til bestemmelse af 125 bindingsforholdet (%) for I-mærket peptid og antistof ved hver koncentration. Bindingsforholdet ved hver 35 koncentration afsattes grafisk med bindingsforholdet som ordinat og begyndelsesfortyndingen for antistof som abscisse. Den fortyndingsgrad for antistof, ved hvilken 30

DK 159163 B

bindingsforholdet (%) er 50%, var som følger:

Antistof Aktivitet

Antistof I 20000

Antistof II 25000 5 Antistof III 25000

Antistof IV 10000

Antistof V 5000

Bestemmelse af tarm-glucagon-specificitet.

10 Pancreatisk glucagon, 80-100 peptidsekvensen i svi- neglicentin og tarm-glucagon (Peak I beskrevet i Kenny J., J. Clin. Endocr., 15, 865 (1955)) anvendtes i forskellige koncentrationer som testprøver. Som standardfortyndingsmiddel anvendtes der en 0,05 M phosphat-fysiolo-15 gisk saltopløsning (pH 7,5) indeholdende 0,25% BSA, 0,01 M EDTA, trasylol (500 KIV/ml) og 0,01% NaN3· 400 μΐ af standardfortyndingsmidlet, 100 μΐ af hver testprøve, 100 ml af det i eksempel 10 opnåede 125 antistof I (aktivitet: 20000) og 100 μΐ I-mærket 20 peptid (fremstillet ved fortynding af det ovenfor opnåede mærkede peptid til en fortyndingsgrad på ca.

10000 cpm) anbragtes i et rørglas og inkuberedes ved 4°C i 66 timer. Til blandingen sattes 1 ml af en dispersion af 0,25% aktivt kul overtrukket med 0,025% 25 dextran, hvorefter der inkuberedes ved 4°C i 30 minutter. Den således behandlede blanding adskiltes i anti-125 stof-bundet I-mærket standardpeptid og uomsat (eller frit) mærket standardpeptid ved centrifugering ved en hastighed på 3000 o/m ved 4°C. Radioaktiviteten af 125 30 hvert peptid måltes. Bindingsforholdet (%) for I-mærket peptid og hver prøve ved hver koncentration og fortynding bestemtes, idet bindingsforholdet (BQ) svarende til aktiviteten af anvendt antistof blev taget som 100%. De således opnåede resultater er vist 35 i fig. 1. I fig. 1 repræsenterer ordinaten bindings-forholdet (%) (B/Bo x 100), og abscissen repræsenterer koncentrationen af testprøven (pancreatisk glucagon og 80-100 peptidsekvensen i svineglicentin) og fortyndings- ψ 31

DK 159163 B

graden for tarm-glucagon (Peak I). I fig. 1 betegner bogstavet (a) pancreatisk glucagon, bogstavet (b) betegner 80-100 peptidsekvensen i svineglicentin, og bogstavet (c) betegner tarm-glucagon. Af fig. 1 kan det 5 ses, at antistof I viser en kurve repræsenterende reaktiviteten med pancreatisk glucagon, som er tydelig skelnelig fra kurven, der repræsenterer reaktiviteten med tarm-glucagon. Heraf følger det, at antistoffet ifølge den foreliggende opfindelse ikke krydsreagerer 10 med pancreatisk glucagon og har fortrinlig specificitet.

Med antistofferne III, IV og V bestemtes tarm-glucagon-specificiteten på samme måde som beskrevet ovenfor, og de således opnåede resultater er vist i fig. 2, 3 og 4.

15 Fig. 2 er en grafisk afbildning, der viser spe cificiteten af antistof III, og hvori ordinaten repræsenterer bindingsforholdet (%) (B/Bo x 100), og abscissen repræsenterer koncentrationen af testprøven (pancreatisk glucagon og 74-100 peptidsekvensen i 20 svineglicentin) og fortyndingsgraden for tarm-glucagon (Peak I). I fig. 2 betegner bogstavet (a) pancreatisk glucagon, bogstavet (c) betegner tarm-glucagon, og bogstavet (d) betegner 74-100 peptidsekvensen i svineglicentin.

25 Fig. 3 er en grafisk afbildning, der viser spe cificiteten af antigen IV, og hvori ordinaten repræsenterer bindingsforholdet (%) (B/Bo x 100), og abscissen repræsenterer koncentrationen af testprøven (pancreatisk glucagon og 89-100 peptidsekvensen i svi-30 neglicentin), og fortyndingsgraden for tarm-glucagon (Peak I). I fig. 3 betegner bogstavet (a) pancreatisk glucagon, bogstavet (c) betegner tarm-glucagon, og bogstavet (e) betegner 89-100 peptidsekvensen i svineglicentin.

35 Fig. 4 er en grafisk afbildning, der viser spe cificiteten af antistof V, og hvori ordinaten repræsenterer bindingsforholdet (%) (B/Bo x 100), og abscissen repræsenterer koncentrationen af testprøven (pancreatisk

Claims (1)

15 PATENTKRAV Fremgangsmåde til fremstilling af et tarm-gluca-gon-antistof, kendetegnet ved, at man til pattedyr administrerer et tarm-glucagon-antigen, der 20 består af et peptid-bærer-kompleks og er fremstillet ved, at man som hapten anvender et peptid med den almene formel R-Lys-Arg-Asn-Lys-Asn-Asn-Ile-Ala-OH (1) hvori R betegner et hydrogenatom, en aminosyregruppe 25 eller en peptidgruppe indeholdende 2-20 aminosyre-grupper, og omsætter det med en bærer i nærværelse af et bindemiddel til binding af haptenet og bæreren til hinanden, hvorefter man opsamler det således dannede antistof.