DE20023789U1

DE20023789U1 - Markierte Peptide und Zwischenprodukte, die sich zu deren Herstellung eignen

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Publication number: DE20023789U1
Application number: DE20023789U
Authority: DE
Original assignee: Scripps Research Institute
Current assignee: Scripps Research Institute
Priority date: 2000-09-29
Filing date: 2000-09-29
Publication date: 2006-08-24
Anticipated expiration: 2010-09-30

Abstract

Eine Verbindung der Formel (I):

wobei:
R1 Wasserstoff oder eine Amino-Schutzgruppe ist;
R² Wasserstoff oder eine Carboxy-Schutzgruppe ist, die kein (C₁-C₆)-Alkyl ist;
R ein organisches Radikal ist, welches eine oder mehrere Aminooxy-Gruppen umfasst.

Description

Finanzierung durch Mittel der Regierug
Die hier beschriebene Erfindung wurde mit Mitteln der Regierung der Vereinigten Staaten unter der Bewilligungsnummer MCB-9812248, die von der Nationalen Wissenschaftsstiftung zuerkannt wurde, und unter den Bewilligungsnummern CA58689 und GM 57464, die vom Nationalen Gesundheitsinstitut zuerkannt wurden, durchgeführt. Die Regierung der Vereinigten Staaten besitzt gewisse Rechte an dieser Erfindung.
Hintergrund der Erfindung
Modifizierte Peptide und Proteine stellen bei der Untersuchung von biologischen Prozessen, sowohl in vitro als auch in vivo, wertvolle biophysikalische Werkzeuge dar. Sie können ebenfalls in Assays zur Identifizierung neuer Wirkstoffe und therapeutischer Mittel verwendet werden. Insbesondere revolutioniert die quantitative Bildgebung von lebenden Zellen (quantitative live cell imaging) unter Verwendung von fluoreszierenden Proteinen und Peptiden die Untersuchung der Zellbiologie. Eine herausragende, kürzlich erfolgte Entwicklung auf diesem Gebiet stellt die Konstruktion von Peptid- und Protein-Biosensoren dar, die als Antwort auf Änderungen in ihrer Umgebung, ihres oligomeren Status, ihrer Konformation nach Bindung eines Liganden, ihrer Struktur oder der direkten Bindung von Liganden veränderte Fluoreszenzeigenschaften aufweisen. In geeigneter Weise markierte fluoreszierende Biomoleküle ermöglichen eine räumliche und zeitliche Bestimmung biochemischer Reaktionen innerhalb von lebenden Zellen. Siehe beispielsweise Giuliano, K.A., et al., Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 1995, 24:405-434; Day, R.N. Mol. Endocrinol. 1998, 12:1410-9; Adams, S.R., et al., Nature 1991, 349:694; Miyawaski, A., et al., Nature 1997, 388:882-7; Hahn, K., et al., Nature 1992, 359:736; Hahn, K.M., et al., J. Biol. Chem. 1990, 265:20335; und Richieri, G.V., et al., Mol. Cell., Biochem. 1999, 192:87-94.
Es wurden Verfahren zur ortsspezifischen Modifizierung von Polypeptiden beschrieben, die mit einschließen: chemisch-selektive Markierung in Lösung (Brinkley, M. Bioconjugate Chemistry 1992, 3:2-13) und auf Harz gebundene Peptide (Hackeng, T., et al., J. Biol. Chem, eingereicht); Einbringen von Keton-Aminosäuren über synthetische Verfahren (Rose, K, J. Am. Chem. Soc. 1994, 116:30-33; King, T.P., et al., Biochemistry, 1986, 25:5774-5779; Rose, K., et al., Bioconjugate Chem. 1996, 7:552-556; Marcaurelle, L.A., Bertozzi, C.R. Tett. Lett. 1998, 39:7279-7282; und Wahl, F., Mutter, M,. Tett. Lett. 1996, 37:6861-6864); sowie molekularbiologische Techniken (Cornish, V.W., et al., J. Am. Chem. Soc 1996, 118:8150).
Während jedes dieser Verfahren seine Anwendung bei der Herstellung einer bestimmten Klasse eines Biosensors oder eines markierten Polypeptids findet, haben alle ihre Grenzen, die ihre allgemeine Verwendung einschränken. Die Markierung von Seitenketten natürlicher Aminosäuren in Lösung ist aufgrund des Auftretens vieler anderer kompetierender Nukleophile oftmals nicht durchführbar. Die Verwendung nicht-natürlich auftretender Aminosäuren, wie beispielsweise solcher, die Ketone enthalten, zur selektiven Markierung, erfordert zudem die Synthese von Farbstoff-Konstrukten oder Aminosäuren, welche schwierig herzustellen und kommerziell nicht erhältlich sind.
Zur Zeit sind die wesentlichsten Hindernisse bei der Entwicklung von fluoreszierenden Biosensoren noch immer vorhanden: (1) Das Problem der ortsspezifischen Positionierung des Farbstoffs im Polypeptid und (2) die genaue Bestimmung, welcher Ort für die Anordnung des Farbstoffs optimal ist (Giuliano, K.A., et al., Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 1995, 24:405- 434). Für eine optimale Antwort auf Änderungen der Proteinstruktur ohne eine Interferenz mit der biologischen Aktivität müssen Lösungsmittelsensitive Farbstoffe und andere biophysikalische Sonden genau angeordnet werden. Weiterhin hat sich das Erfordernis des ortsspezifischen Einbaus zweier Farbstoffe ohne Beeinträchtigung der biologischen Aktivität als ernstzunehmende Limitierung der Verwendung des Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfers (FRET, fluorescence resonance energy transfer) innerhalb eines einzelnen Proteins erwiesen. Eine chemische Gesamtsynthese von Proteinen stellt eine mögliche Lösung für diese Probleme bereit (Wilken, J., Kent, S.B.H. Curr. Op. Biotechnology. 1998, 9:412; Kent, S.B.H., Ann. Rev. Biochem. 1988, 57, 957-989; Dawson, P.E., et al., Science 1994, 266:776-779; Muir, T.W., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 1998, 95:6705-6710; und Cotton, G.J., et al., J. Am. Chem. Soc. 1999, 121:1100-1101). Gleichwohl sind viele für fluoreszierende Biosensoren oder andere Zwecke geeignete biophysikalische Sonden unter den in der Peptidsynthese verwendeten unterschiedlichen Bedingungen nicht stabil und nach der Synthese kann ein ortsspezifischer Einbau nur schwer erreicht werden.
Es gibt daher gegenwärtig einen Bedarf an Peptid-Synthons, die geschützte funktionelle Gruppen aufweisen, welche selektiv so modifiziert werden können, dass sie ein oder mehrere funktionelle Moleküle (z. B. eine biophysikalische Sonde, beispielsweise einen Fluoreszenzmarker) nach der Peptidsynthese enthalten.
Zusammenfassung der Erfindung
Es wurde ein höchst effizientes Verfahren zur ortsspezifischen Anlagerung biophysikalischer Sonden oder anderer Moleküle an nicht-geschützte Peptide nach einer chemischen Synthese eingesetzt. Das Verfahren verwendet Aminosäuren, die eine oder mehrere geschützte Aminooxy-Gruppen aufweisen, welche während einer Festphasen-Peptidsynthese eingebaut werden können, oder welche durch Schritte nach Expression mit rekombinanten Peptiden kombiniert werden können. Es wurde festgestellt, dass die geschützte Aminooxy-Gruppe nach der Peptidsynthese entschützt werden kann und zur Bereitstellung eines modifizierten (z. B. eines markierten) Peptids mit einem elektrophilen Reagenz umgesetzt werden kann. Die Aminooxy-Gruppe reagiert in der Anwesenheit von anderen nukleophilen Gruppen, einschließlich Cystein, Lysin und Aminogruppen, selektiv mit Elektrophilen (z. B. einem aktivierten Carbonsäureester wie beispielsweise einem N-Hydroxysuccinimidester).
Eine selektive Peptidmodifizierung (z. B. Markierung) kann daher nach der Synthese unter Verwendung kommerziell erhältlicher und/oder chemisch sensitiver Moleküle (z. B. Sonden) durchgeführt werden.
Das eingesetzte Verfahren ist mit der Synthese von Peptiden, die C^α-Thioesters enthalten, und mit Amid-bildenden Verknüpfungen, kompatibel, erforderliche Schritte zur Synthese von Proteinen entweder über eine chemische Gesamtsynthese oder über eine Ligation von exprimiertem Protein. Über eine parallele Peptidsynthese kann eine Aminooxyenthaltende Aminosäure an verschiedenen Stellen eingeführt werden, um eine Familie aus Polypeptid-Analoga zu bilden, wobei jedes Mitglied eine einzelne, spezifisch-markierte Stelle aufweist. Die parallele Synthese ermöglicht die Entwicklung von optimierten Biosensoren oder anderen modifizierten Polypeptiden über kombinatorisches Screening unterschiedlicher Anlagerungsorte zur Erhaltung einer maximalen Antwort sowie einer minimalen Störung der gewünschten biologischen Aktivität.
Daher wurde ein einfaches und effizientes Verfahren zur ortsspezifischen Modifizierung (z. B. Markierung) von Peptiden nach der Syntheseeingesetzt, welches eine hohe Ausbeute, Selektivität und Kompatibilität sowohl mit einer Festphasen-Peptid-Synthese als auch mit einer rekombinanten C^α-Thioester-Peptidsynthese zur Verfügung stellt.
Die Erfindung stellt daher ein synthetisches Zwischenprodukt (d. h. ein Synthon) bereit, welches bei der Herstellung von modifizierten Peptiden einsetzbar ist, und welches eine Verbindung der Formel (I) darstellt:
wobei:
R¹ Wasserstoff oder eine Amino-Schutzgruppe ist;
R² Wasserstoff oder eine Carboxy-Schutzgruppe ist;
R ein organisches Radikal ist, umfassend eine oder mehrere Aminooxy-Gruppen.
Peptide, die eine oder mehrere Aminooxy-Gruppen enthalten, stellen ebenfalls nützliche synthetische Zwischenprodukte dar, die so modifiziert werden können, dass sie verwandte Peptide ergeben, welche veränderte biologische, chemische oder physikalische Eigenschaften aufweisen, beispielsweise ein mit einem Fluoreszenzmarker verknüpftes Peptid. Die Erfindung stellt folglich ebenfalls ein Peptid bereit, welches eine oder mehr (z. B. 1, 2, 3 oder 4) Aminooxy-Gruppen aufweist, vorausgesetzt, dass das Peptid nicht Glutathion ist. Die Erfindung stellt ebenfalls ein Peptid zur Verfügung, welches eine oder mehr (z. B. 1, 2, 3 oder 4) sekundäre Aminooxy-Gruppen aufweist.
Die Erfindung stellt allgemein Zwischenprodukte zur Verfügung, welche eine ortsspezifische Modifizierung von Peptiden nach deren Synthese ermöglichen. Entsprechend können funktionelle Moleküle selektiv mit einem Peptid verknüpft werden, um ein Peptidkonjugat bereitzustellen, welches veränderte biologische, chemische oder physikalische Eigenschaften aufweist. Beispielsweise können funktionelle Moleküle (z. B. biophysikalische Sonden, Peptide, Polynukleotide und therapeutische Mittel) mit einem Peptid verknüpft werden, um ein Peptidkonjugat bereitzustellen, welches davon abweichende und nützliche Eigenschaften aufweist. Die Erfindung stellt daher ebenfalls eine Verbindung der Formel (III) zur Verfügung:
wobei:
R⁶ ein Peptid ist;
X eine direkte Bindung oder eine Verknüpfungsgruppe ist;
R⁷ Wasserstoff, ein (C₁-C₆)Alkyl, eine Amino-Schutzgruppe oder ein Radikal ist, umfassend eine oder mehrere Aminooxy-Gruppen;
Y eine direkte Bindung oder eine Verknüpfungsgruppe ist; und
D ein funktionelles Molekül ist.
Das funktionelle Molekül ist bevorzugt eine biophysikalische Sonde, wie beispielsweise eine fluoreszierende Gruppe, welche für FRET-Untersuchungen oder andere Untersuchungen verwendet werden kann, die Fluoreszenzsignale verwenden, wie beispielsweise eine Excimer-Paar-Bildung.
Verfahren zur Herstellung von Synthons gemäß der vorliegenden Erfindung sowie die erfindungsgemäßen Proteinkonjugate werden als weitere Gegenstände der Erfindung bereitgestellt und durch die Prozeduren in den unten gezeigten Beispielen näher erläutert.
Die Erfindung stellt daher ein Peptidkonjugat zur Verfügung, das ein Peptid und ein funktionelles Molekül umfasst, welches durch Umsetzen eines Peptids, das eine oder mehrere Aminooxy-Gruppen aufweist, mit einem korrespondierenden funktionellen Molekül, das eine elektrophile Gruppe aufweist, hergestellt werden kann.
Kurze Beschreibung der Figuren
1 beschreibt eine allgemeine Strategie zur ortsspezifischen Markierung von Polypeptiden. Die geschützte Aminooxy-Gruppe wird während der Festphasen-Peptidsynthese (es wird die Synthese auf Thioester-Linker-Harz gezeigt) eingebaut; die Abspaltung vom Harz erzeugt ein Peptid, welches ungeschützte Seitenketten, eine Aminooxy-Gruppe und einen C-terminalen Thioester aufweist; und eine Ligation sowie eine darauf folgende ortsspezifische Markierung erzeugt das Volllängen-Peptid mit einem funktionellen Molekül, das an dem Aminooxy-Stickstoff angelagert ist.
2 stellt die Synthese von PA-Test- und SA-Test-Peptiden dar.
3 zeigt die HPLC-Analyse von aufgereinigtem SA-Test-Peptid (oben) und von Rohprodukten der Reaktion unter optimierten Markierungsbedingungen (unten).
4 zeigt die Synthese eines geschützten Zwischenprodukts der Erfindung (4).
Genaue Beschreibung
Soweit nicht anders beschrieben, werden die folgenden Definitionen verwendet: Alkylen, Alkenylen, Alkynylen, etc. bezeichnen sowohl geradkettige wie auch verzweigte Gruppen; jedoch umfasst der Bezug auf ein einzelnes Radikal, beispielsweise "Propylen", lediglich das geradkettige Radikal; auf ein Isomer mit einer verzweigten Kette, wie beispielsweise "Isopropylen" wird spezifisch Bezug genommen. Aryl bezeichnet ein Phenylradikal oder ein ortho-fusioniertes bizyklisches, carbozyklisches Radikal, welches etwa 9 bis 10 Ringatome aufweist, wobei mindestens ein Ring aromatisch ist.
Der Begriff "Aminosäure" schließt Reste der natürlich vorkommenden Aminosäuren (z. B. Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Glu, Gln, Gly, His, Hyl, Hyp, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr und Val) in D- oder L-Form mit ein, sowie nicht-natürlich vorkommende Aminosäuren (z. B. Phosphoserin, Phosphothreonin, Phosphotyrosin, Hydroxyprolin, Gamma-Carboxyglutamat; Hippursäure, Octahydroindol-2-carbonsäure, Statin, 1,2,3,4-Tetrahydroisochinolin-3-carbonsäure, Penicillamin, Ornithin, Citrullin, α-Methylalanin, para-Benzoylphenylalanin, Phenylglycin, Propargylglycin, Sarkosin, und tert-Butylglycin). Der Begriff schließt ebenfalls natürlich und nicht-natürlich vorkommende Aminosäuren mit ein, die eine konventionelle Amino-Schutzgruppe tragen (z. B. Acetyl oder Benzyloxycarbonyl), wie auch natürlich und nicht-natürlich vorkommende Aminosäuren, die am Carboxy-Ende geschützt sind (z. B. wie ein (C₁-C₆)Alkyl-, Phenyl- oder Benzylester oder -amid). Andere geeignete Amino- und Carboxy-Schutzgruppen sind Fachleuten bekannt (siehe beispielsweise T.W. Greene, Protecting Groups In Organic Synthesis, Wiley: New York, 1981, sowie dort zitierte Referenzen).
Der Begriff "Peptid" schließt jede Sequenz von 2 oder mehr Aminosäuren mit ein. Die Sequenz kann linear oder zyklisch sein. Ein zyklisches Peptid kann beispielsweise durch Bildung von Disulfidbrücken zwischen zwei Cysteinresten in einer Sequenz hergestellt werden bzw. daraus resultieren. Der Begriff schließt daher Proteine, Enzyme, Antikörper, Oligopeptide und Polypeptide mit ein. Insbesonders hier genannte Peptidsequenzen werden mit dem Amino-Ende auf der linken Seite und dem Carboxy-Ende auf der rechten Seite dargestellt.
Eine "Aminooxy-Gruppe" ist eine Gruppe, die die folgende Formel aufweist
wobei die offenen Valenzen durch jedes geeignete Radikal aufgefüllt werden. Eine "sekundäre Aminooxy-Gruppe" ist eine Aminooxy-Gruppe, bei der eine der offenen Valenzen am Stickstoff durch ein sich von Wasserstoff unterscheidendes Radikal aufgefüllt wird.
Der Begriff "funktionelles Molekül" schließt jede Verbindung mit ein, die mit einem Peptid zur Bereitstellung eines Peptidkonjugats verknüpft werden kann, welches nützliche Eigenschaften aufweist. Solche Konjugate können bei der Untersuchung der Struktur oder der Funktion des Peptids nützlich sein. Solche Konjugate können ebenfalls beim Wirkstoff-Screening, als pharmakologische Werkzeuge, als Forschungswerkzeuge oder als therapeutische Mittel einsetzbar sein. Beispielsweise schließt der Begriff funktionelles Molekül biophysikalische Sonden, Peptide, Polynukleotide, therapeutische Mittel, Cross-Linking-Gruppen (chemisch oder photochemisch), eine die biologische Aktivität des Peptids modifizierende Verbindung oder ein eingeschlossenes Molekül (z. B. ein Reportermolekül oder ein biologisch aktives Mittel, welches maskiert ist und über Photoaktivierung oder durch chemische Mittel demaskiert werden kann).
Der Begriff "biophysikalische Sonde" schließt jede Gruppe mit ein, welche in vitro oder in vivo detektiert werden kann, wie beispielsweise eine fluoreszierende Gruppe, eine phosphoreszierende Gruppe, einen Nukleinsäure-Indikator, eine ESR-Sonde, eine andere Reportergruppe, einen Rest, oder einen Farbstoff, welcher sensitiv bzw. empfindlich auf pH-Änderungen, Ligandenbindung oder andere Umgebungsaspekte reagiert.
Aminosäuren und Peptide, welche eine oder mehrere Aminooxy-Gruppen mit einschließen, sind für die Herstellung von Peptidkonjugaten verwendbare Zwischenprodukte. Die Aminooxy-Gruppe(n) kann/können typischerweise an jeder geeigneten Position auf der Aminosäure oder dem Peptid lokalisiert sein. Die Aminooxy-Gruppe(n) kann/können in geeigneter Weise in die Seitenkette der Aminosäure oder in eine oder mehr Seitenketten des Peptids eingebaut werden. Wie hier in Bezug auf die Aminosäuren und Peptide der Erfindung verwendet, schließt der Begriff "ein Radikal, umfassend eine oder mehrere Aminooxy-Gruppen" daher jede organische Gruppe mit ein, welche an die Aminosäure oder das Peptid angelagert werden kann, welches eine oder mehrere Aminooxy-Gruppen enthält. Der Begriff schließt bspw. eine Kohlenstoffkette mit ein, welche zwei bis zehn Kohlenstoffatome aufweist; welche optional teilweise ungesättigt ist (d. h. eine oder mehr Doppel- oder Dreifachbindungen enthält); wobei die Kette optional durch eine oder mehrere (z. B. 1, 2 oder 3) -NH-, -O-, oder -S- unterbrochen wird; wobei die Kette optional am Kohlenstoff mit einer oder mehreren (z. B. 1, 2 oder 3) Oxo(=O)-Gruppen substituiert ist; und wobei die Kette optional mit einer oder mehreren (z. B. 1, 2 oder 3) Aminooxy-Gruppen substituiert ist. Bevorzugt ist/sind die Aminooxy-Gruppe(n) (eine) sekundäre Aminooxy-Gruppe(n).
Der Begriff "Cross-Linking-Gruppe" bezieht sich auf jede Funktionalität, die eine Bindung mit einer anderen Funktionalität eingehen kann, beispielsweise eine Photoaffinitäts-Markierung oder ein chemisches Cross-Linking-Mittel.
Der Begriff "eingeschlossenes Molekül" schließt ein Molekül oder eine Reportergruppe mit ein, welche so maskiert ist, dass diese zu einem vorgegebenen Zeitpunkt oder an einem Ort der Wahl aktiviert (d. h. demaskiert) werden kann, beispielsweise unter Verwendung von Licht oder einem chemischen Mittel.
Die weiter unten für Radikale, Substituenten und Bereiche aufgeführten spezifischen und bevorzugten Werte dienen lediglich zur Illustration; sie schließen andere definierte Werte oder andere Werte innerhalb definierter Bereiche für die Radikale und Substituenten nicht aus.
Insbesondere kann ein (C₁-C₆)Alkylen ein Methylen, Ethylen, Propylen, Isopropylen, Butylen, iso-Butylen, sec-Butylen, Pentylen oder Hexylen sein; (C₃-C₈)Cycloalkyl kann ein Cyclopropyl, Cyclobutyl, Cyclopentyl, Cyclohexyl, Cycloheptyl, oder Cyclooctyl sein; (C₂-C₆)Alkenylen kann Vinylen, Allylen, 1-Propenylen, 2-Propenylen, 1-Butenylen, 2-Butenylen, 3-Butenylen, 1-Pentenylen, 2-Pentenylen, 3-Pentenylen, 4-Pentenylen, 1-Hexenylen, 2-Hexenylen, 3-Hexenylen, 4-Hexenylen, oder 5-Hexenylen sein; (C₂-C₆)Alkynylen kann Ethynylen, 1-Propynylen, 2-Propynylen, 1-Butynylen, 2-Butynylen, 3-Butynylen, 1-Pentynylen, 2-Pentynylen, 3-Pentynylen, 4-Pentynylen, 1-Hexynylen, 2-Hexynylen, 3-Hexynylen, 4-Hexynylen, oder 5-Hexynylen sein; und Aryl kann Phenyl, Indenyl oder Naphthyl sein;
Ein spezifischer Wert für R ist ein Radikal der Formel (V):
wobei:
R³ Wasserstoff, ein (C₁-C₆)Alkyl, eine Amino-Schutzgruppe oder ein Radikal ist, umfassend eine oder mehrere Aminooxy-Gruppen;
R⁴ Wasserstoff oder eine Amino-Schutzgruppe ist; und
R⁵ Wasserstoff oder ein (C₁-C₆)Alkyl ist.
Ein spezifischer Wert für R¹ ist Wasserstoff oder Benzyloxycarbonyl.
Ein spezifischer Wert für R² ist Wasserstoff.
Ein spezifischer Wert für R³ ist Methyl.
Ein spezifischer Wert für R⁴ ist Wasserstoff, 2-Chlorbenzyloxycarbonyl oder Benzyloxycarbonyl.
Ein spezifischer Wert für R⁵ ist Wasserstoff.
Ein spezifischer Wert für R⁶ ist ein Antikörper.
Ein spezifischer Wert für R⁶ ist ein Peptid, welches etwa 2 bis etwa 1000 Aminosäuren einschließt. Ein stärker spezifischer Wert für R⁶ ist ein Peptid, welches etwa 5 bis etwa 500 Aminosäuren einschließt. Ein noch spezifischerer Wert für R⁶ ist ein Peptid, welches etwa 10 bis etwa 100 Aminosäuren einschließt.
Insbesondere ist X eine Verknüpfungsgruppe, welche eine Länge von etwa 5 Angström bis etwa 100 Angström aufweist. Noch genauer ist X eine Verknüpfungsgruppe mit einer Länge von etwa 5 Angström bis etwa 25 Angström.
Insbesondere ist X ein -R_a-C(=O)-NH-R_b-, wobei jedes von R_a und R_b unabhängig voneinander ein (C₁-C₆)Alkylen darstellt. Bevorzugt ist jedes von R_a und R_b ein Methylen (-CH₂-).
Ein bevorzugter Wert für R⁶ ist KKKEKERPEISLPSDFEHTIHVGF DACTGEFTGMPEQWARLLQT (SEQ ID NO: 1)
Ein spezifischer Wert für R⁷ ist Wasserstoff.
Ein weiterer spezifischer Wert für R⁷ ist ein (C₁-C₆)Alkyl.
Ein bevorzugter Wert für R⁷ ist Methyl.
Insbesondere ist Y eine Verknüpfungsgruppe mit einer Länge von etwa 5 Angström bis etwa 100 Angström. Noch genauer ist Y eine Verknüpfungsgruppe mit einer Länge von etwa 5 Angström bis etwa 25 Angström.
Ein spezifischer Wert für Y ist (C₁-C₆)Alkylen.
Ein bevorzugter Wert für Y ist Methylen (-CH₂-).
Die biophysikalische Sonde kann bevorzugt ein Alexa-Farbstoff sein, ein solvatochromatischer Farbstoff, ein elektrochromatischer Farbstoff oder ein Farbstoff, welcher sensitiv bzw. empfindlich auf eine pH-Änderung, Ligandenbindung oder andere Umgebungsaspekte reagiert.
Bevorzugte fluoreszierende Gruppen schließen Moleküle ein, welche in der Lage sind, eine Strahlung bei einer Wellenlänge zu absorbieren und eine Strahlung bei einer anderen Wellenlänge zu emittieren, wie beispielsweise Alexa-532, Hydroxycumarin, Aminocumarin, Methoxycumarin, Aminomethylcumarin, Kaskaden-Blau, Luzifer-Gelb, NBD, P-Phycoerythrin, R-Phycoerythrin, (PE), PE-Cy5-Konjugate, PE-Cy7-Konjugate, Rot-613, Fluorescein, BODIPY-FL, BODIPY-TR, BODIPY-TMR, Cy3, TRITC, X-Rhodamin, Lissamin-Rhodamin-B, PerCP, Texas-Rot, Cy5, Cy7, Allophycocyanin (APC), TruRed, APC-Cy7-Konjugate, Oregon-Grün, Tetramethylrhodamin, Dansyl, Indo-1, Fura-2, FM-1-43, DilC18(3), Carboxy-SNARF-1, NBD, Indo-1, Fluo-3, DCFH, DHR, SNARF, Monochlorbiman und Calcein. Stärker bevorzugte fluoreszierende Gruppen schließen Rhodamin und Alexa-532 ein.
Bevorzugte Nukleinsäureindikatoren schließen interkalierende Mittel und Oligonukleotidstränge ein, wie beispielsweise YOYO-1, Propidiumiodid, Hoechst-33342, DAPI, Hoechst-33258, SYTOX-Blau, Chromomycin-A3, Mithramycin, SYTOX-Grün, SYTX-Orange, Ethidiumbromid, 7-AAD; Acridin-Orange, TOTO-1, TO-PRO-1, Thiazol-Orange, Propidiumiodid, TOTO-3, TO-PRO-3, LDS-751.
Die synthetischen Zwischenprodukte (d. h. Synthons) gemäß der vorliegenden Erfindung, die eine oder mehrere Aminooxy-Gruppen enthalten, können unter Verwendung einer Vielzahl von Techniken, die im Stand der Technik bekannt sind, in Peptide eingebaut werden. Wie unten diskutiert, können die Synthons beispielsweise in ein Peptid unter Verwendung einer Festphasen-Peptidsynthese, einer Peptidsynthese in löslicher Phase, einer nativen chemischen Ligation, einer Intein-vermittelten Protein-Ligation und einer chemischen Ligation, eingebaut werden.
Die Peptide können unter Verwendung einer Festphasen-Peptidsynthese (SPPS) hergestellt werden. Gemäß der SPPS-Technik können beispielsweise geschützte Aminosäuren in organischen Lösungsmitteln zu einer Harzgebundenen Peptidkette (jeweils nacheinander) zugegeben werden, was zur Anordnung eines Zielpeptids (target peptide) führt, welches eine spezifische Sequenz in vollständig geschützter, Harz-gebundener Form aufweist. Das Produkt-Peptid kann anschließend durch Entschützung und Abspaltung vom Harz-Träger freigesetzt werden (Wade, L.G., JR., Organic Chemistry 4th Ed. (1999)). Wie unten in Beispiel 2 beschrieben, können unter Verwendung von SPPS Aminosäuren, die eine Aminooxy-funktionelle Gruppe enthalten, in Peptide eingebaut werden. Die Verwendung dieser Methode ermöglicht es, eine Aminosäure, welche eine Aminooxy-funktionelle Gruppe enthält, an einer gewünschten Position innerhalb einer synthetisierten Peptidkette zu positionieren.
Aminosäuren, die eine Aminooxy-Gruppe enthalten, können ebenfalls unter Verwendung einer Peptidsynthese in löslicher Phase in ein Peptid eingebaut werden (Wade, L.G., JR. Organic Chemistry 4th Ed. (1999)). Eine Peptidsynthese in löslicher Phase umfasst das Schützen des Amino-Endes einer Peptidkette, gefolgt von einer Aktivierung des Carboxy-Endes, was die Addition einer Aminosäure oder einer Peptidkette an das Carboxy-Ende ermöglicht (Wade, L.G., JR. Organic Chemistry 4th Ed. (1999)).
Eine native chemische Ligation ist ein Verfahren, welches geeignet ist, um zwei Peptide miteinander zu verbinden und damit ein einziges Peptid zu erzeugen, welches eine native Rückgrat(„Backbone")-Struktur aufweist. Eine native chemische Ligation wird typischerweise durch Mischen eines ersten Peptids mit einem Carboxy-terminalen α-Thioester und einem zweiten Polypeptid mit einem Amino-terminalen Cystein ermöglicht (Dawson, P.E., et al., (1994) Science 266:776-779; Cotton, G.J., et al., (1999), J. Am. Chem. Soc. 121:1100-1101). Der Thioester des ersten Peptids wird einem nukleophilen Angriff durch die Seitenkette des Cysteinrestes am Amino-Ende des zweiten Peptids ausgesetzt. Das Ausgangsprodukt der Ligation des Thioesters geht anschließend aufgrund der bevorzugten geometrischen Anordnung der alpha-Aminogruppe des zweiten Peptids eine schnelle intramolekulare Reaktion ein. Dies führt zu einem Produkt mit einer nativen Peptidbindung an der Ligationsstelle. Ein mit Cystein beginnendes Polypeptid kann durch Intein-Vektoren, Proteolyse oder zelluläre Prozessierung des Start-Methionins chemisch synthetisiert oder erzeugt werden. Dieses Verfahren ermöglicht das Mischen und Zusammenbringen chemisch synthetisierter Polypeptidsegmente.
Die erfindungsgemäßen Synthons sind insbesondere in Kombination mit nativer chemischer Ligation einsetzbar, da es die native chemische Ligation ermöglicht, dass ein synthetisches Peptid, welches eine spezifisch positionierte Aminosäure (z. B. ein Synthon gemäß der Erfindung) aufweist, selektiv mit einem anderen Peptid ligiert wird. Die Fähigkeit, Aminooxymodifizierte Aminosäuren spezifisch in eine Peptidkette einzubauen, ermöglicht es, nützliche Reste an jeder Position innerhalb eines Peptids zu verknüpfen. Beispiele solcher Reste, die in ein Peptid durch ein solches Verfahren eingebaut werden können, schließen ein, ohne darauf begrenzt zu sein, phosphorylierte oder glykosylierte Aminosäuren, nicht-natürlich auftretende Aminosäuren, Tags, Markierungen (Label), Cross-Linking-Reagenzien, Biosensoren, reaktive Gruppen und Fluorophore. Ein anderer Vorteil der nativen chemischen Ligation ist, dass sie den Einbau von Peptiden in ein Peptid ermöglicht, welche nicht über eine ribosomale Biosynthese hinzugefügt werden können.
Eine Intein-vermittelte Proteinligation ist ebenfalls geeignet, um Aminosäuren, die Aminooxy-funktionelle Gruppen enthalten, selektiv in Peptiden zu positionieren. Inteine sind zwischengeschaltete Sequenzen, die aus Vorläuferproteinen über einen autokatalytischen Mechanismus ausgeschnitten werden und dabei die reaktiven Enden eines Peptids offen legen. Es wurden Intein-Vektoren entwickelt, die nicht nur die Aufreinigung von Proteinen in einem einzigen Schritt ermöglichen, sondern ebenfalls Polypeptide mit reaktiven Enden erzeugen, die für die Intein-vermittelte Proteinligation (IPL) (ebenfalls Ligation exprimierter Proteine genannt) (EPL, expressed protein ligation) erforderlich sind (Perler, F.R. und Adam, E., (2000) Curr. Opin. Biotechnol. 11(4):377-83; und Evans, T.C., et al., (1998) Protein Sci 7:2256-2264). Dieses Verfahren ermöglicht es, ein Peptid, welches eine selektiv positionierte Aminosäure aufweist, die eine Aminooxyfunktionelle Gruppe enthält, mit irgendeinem Peptid leicht zu ligieren, welches über das Ausschneiden eines Inteins erzeugte reaktive Enden aufweist.
Auch durch eine chemische Ligation können zwei Peptide miteinander verknüpft werden. Eine chemische Ligation tritt dann auf, wenn zwei Peptidsegmente jeweils mit funktionellen Gruppen verknüpft werden, die miteinander in einer solchen Weise eine Reaktion eingehen, dass sie eine kovalente Bindung unter Erzeugung einer Nicht-Peptid-Bindung an der Ligationsstelle bilden (Wilken, J. und Kent, S.B.H., (1998) Curr. Opin. Biotechnol. 9:412-426). Dieses Verfahren ist geeignet, um ein Peptid, das eine spezifisch positionierte Aminooxy-funktionelle Gruppe aufweist, mit einem anderen Peptid zu verknüpfen, um ein gewünschtes Peptid zu erzeugen, welches später mit einer detektierbaren Gruppe verknüpft werden kann.
An ein Peptid, welches eine Aminooxy-Gruppe umfasst, kann ein funktionelles Molekül ("D") über eine direkte Verknüpfung (z. B. eine Amid-Bindung -O-N-C(=O)-D) oder mittels einer Verknüpfungsgruppe angelagert werden. Die Struktur der Verknüpfungsgruppe ist nicht entscheidend, vorausgesetzt, dass diese sich nicht störend auf die Verwendung des zu erhaltenden markierten Peptids auswirkt. Bevorzugte Verknüpfungsgruppen schließen Linker ein, die den Aminooxy-Stickstoff und die detektierbare Gruppe etwa 5 Angström bis etwa 100 Angström voneinander trennen. Andere bevorzugte Verknüpfungsgruppen trennen den Aminooxy-Stickstoff und die detektierbare Gruppe voneinander um etwa 5 Angström bis etwa 25 Angström.
Die Verknüpfungsgruppe kann beispielsweise einfach mit der detektierbaren Gruppe verknüpft werden über eine: 1) Amid (-N(H)C(=O)-, -C(=O)N(H)-), 2) Ester (-OC(=O)-, -C(=O)O-)-), 3) Ether (-O-), 4) Thioether (-S-), 5) Sulfinyl (-S(O)-), oder 6) Sulfonyl (-S(O₂))-Verknüpfung. Solch eine Verknüpfung kann aus in geeigneter Weise funktionalisierten Ausgangsmaterialien unter Verwendung von synthetischen Verfahren gebildet werden, die im Stand der Technik bekannt sind.
Die Verknüpfungsgruppe kann einfach mit dem Stickstoff der Aminooxy-Gruppe zur Bildung einer Amid (-O-N(H)C(=O)-) oder einer Thioharnstoff (-O-N-C(=S)-N-)-Verknüpfung unter Verwendung von Reagenzien und Bedingungen verknüpft werden, die im Stand der Technik bekannt sind.
Die Aminooxy-Gruppe kann an ein Peptid über eine direkte Bindung (z. B. eine Kohlenstoff-Sauerstoff-Bindung) zwischen dem Aminooxy-Sauerstoff und einer Seitenkette des Peptids angelagert werden, oder die Aminooxy-Gruppe kann an das Peptid über eine Verknüpfungsgruppe angelagert werden. Die Struktur der Verknüpfungsgruppe ist nicht wesentlich, vorausgesetzt, dass sich diese nicht störend auf die Verwendung des zu erhaltenden markierten Peptids auswirkt. Bevorzugte Verknüpfungsgruppen schließen Verknüpfungsgruppen ein, die den Aminooxy-Sauerstoff und die Seitenkette des Peptids etwa 5 Angström bis etwa 100 Angström voneinander trennen. Andere bevorzugte Verknüpfungsgruppen trennen den Aminooxy-Sauerstoff und die Seitenkette des Peptids voneinander um etwa 5 Angström bis etwa 25 Angström.
Eine spezifische Verknüpfungsgruppe (z. B. X oder Y) kann eine divalente (C₁-C₆)Alkylen-, (C₂-C₆)Alkenylen- oder (C₂-C₆)Alkynylen-Kette oder ein divalentes (C₃-C₈)Cycloalkyl oder ein Arylring sein.
Es wurde daher ein einfaches und effizientes synthetisches Verfahren zur ortsspezifischen Markierung von Peptiden nach deren Synthese eingesetzt, welches eine hohe Ausbeute, Selektivität und Kompatibilität sowohl mit einer Festphasen-Peptidsynthese und C^α-Thioesterpeptiden ermöglicht. Der Ansatz und grundlegende Vorteile können wie folgt zusammengefasst werden:

(1) Es wurde eine geschützte Aminooxy-Aminosäure synthetisiert, welche in Peptide eingebaut werden kann;
(2) es wurden Verfahren optimiert, um eine höchst effiziente und spezifische Modifizierung des Aminooxy-Stickstoffs in der Anwesenheit nicht-geschützter kompetierender Nukleophile zu erzielen, welche Cystein, Lysin und Aminogruppen einschließen;
(3) ein bevorzugtes Elektrophil, welches zur Markierung verwendet werden kann, ein aktivierter Carbonsäureester, ist für die meisten der kommerziell erhältlichen Fluoreszenzfarbstoffe und -markierungen leicht erhältlich;
(4) die Markierung der Aminooxy-Gruppe erfolgt nach der Synthese und Aufreinigung, was folglich die Verwendung von chemisch sensitiven Fluorophoren und Markierungen ermöglicht, die andernfalls frühere synthetische Verfahren nicht überleben würden;
(5) das synthetische Verfahren ist mit den zur Synthese von Proteinen über eine chemische Gesamtsynthese oder über eine Ligation von exprimiertem Protein erforderlichen Schritten kompatibel, nämlich der Synthese von C^α-Peptidthioestern und Ligationen unter Bildung von Amid; und
(6) kombinatorisches Screening sowohl des funktionellen Moleküls als auch seine Positionierung wird die schnelle Synthese von optimal markierten Polypeptid-basierten Biosensoren ermöglichen.

Die Erfindung wird im folgenden durch die nicht-begrenzenden Beispiele erläutert.
Beispiel 1. Ortsspezifische Markierung einer sekundären Aminooxy-Gruppe
Unter kontrollierten pH-Bedingungen legten der niedrige pKa und die erhöhte Nukleophilie einer Aminooxy-Gruppe im Verhältnis zu anderen nukleophilen Seitenketten, die in Peptiden gefunden wurden, die Möglichkeit einer ortsspezifischen Reaktion mit Standardelektrophilen, wie beispielsweise Succinimidylestern, nahe (1). Während die selektive Markierung einer primären Aminooxy-Gruppe im Kontext eines nicht-geschützten Peptids erreicht wurde, schlugen erhebliche Anstrengungen, die primäre Aminooxy-Gruppe während der Synthese zu nutzen, fehl. Selbst bei einem Schutz als 2-Chlorbenzyloxycarbonylcarbamat ermöglichte die Deprotonierung der primären Aminooxy-Gruppe eine schnelle Acylierung, so dass diese während der Peptidsynthese nicht so leicht eingebaut werden konnte. Unter bestimmten Bedingungen kann daher eine sekundären Aminooxy-Gruppe bevorzugt sein.
Es wurde ein Testpeptid hergestellt, welches sowohl eine sekundäre Aminooxy-Gruppe als auch nukleophile Aminosäuren enthält, die höchstwahrscheinlich die selektive Markierung am Aminooxy-Stickstoff (Lysin, Cystein und das Amino-Ende) stören könnten. Wie in 2 beschrieben, wurde NH₂-AKAARAAAAK*AARACA-CO₂H (SEQ ID NO: 2), hier als SA-Testpeptid bezeichnet, durch Einbau und Entschützen von N-(2-Cl-benzyloxycarbonyl)-N-methylaminooxyessigsäure (4, 3) während einer Festphasen-Peptidsynthese synthetisiert. Die Reaktivität der geschützten sekundären Aminooxy-Gruppe wurde ausreichend abgeschwächt, um während der Boc-Festphasen-Peptidsynthese auf Harzen mit Thioester-Linkern nicht reaktiv zu bleiben. Die 2-Cl-Z-Schutzgruppe für die N-Methylaminooxy-Aminosäure wurde über Standard-HF-Abspaltungsverfahren effizient entfernt.
Durch Variation des pH-Wertes der Reaktion und der Stöchiometrie der Farbstoffe wurden die Bedingungen für die selektive Markierung der sekundären Aminooxy-Gruppe bestimmt. Für die Markierung mit dem Succinimidester von Tetramethylrhodamin (TMR-OSu) wurde festgestellt, dass diese optimal in einem Lösungsmittelsystem abläuft, das aus 50 % DMSO/50 % wässerigem Azetatpuffer besteht, bei einem pH von 4,7 mit 2 Äquivalenten an Farbstoff pro Mol an Peptid (Tabelle 1). Die Rohprodukte der Reaktion wurden vom nicht umgesetzten Farbstoff abgetrennt und über RP-HPLC und ESI-MS charakterisiert. Unter diesen Bedingungen wurde ein einzelnes Farbstoffmolekül an der Aminooxy-Gruppe mit einer Ausbeute von 78 %, auf der Basis einer HPLC-Quantifizierung, eingebaut. Gleichwohl wurden Nebenprodukte der Reaktion ebenfalls isoliert und es wurde festgestellt, dass diese entweder als SA-Testpeptid vorlagen, das mit zwei Farbstoffmolekülen markiert war (⁓13 %), oder als acetylierte Peptidprodukte (⁓5 %). Die über das Verhältnis der Peakflächen des gewünschten, einfach-markierten Produkts gegenüber zweifach-markierten Produkten definierte Selektivität betrug 6/1 (Tabelle 1).
Tabelle 1: Markierung von SA-Test-Peptid
Es wurde festgestellt, dass viele dieser Nebenreaktionen während der Größenausschluss-Chromatographie im Ammoniumbicarbonatlösungsmittel auftraten, welches verwendet wurde, um die Reaktionsprodukte aufzutrennen. Die Verwendung eines sauren Lösungsmittelsystems, 0,1 % TFA, eliminierte nahezu vollständig mehrfach-markierte Nebenprodukte, was zu bemerkenswerten Verbesserungen sowohl in der Ausbeute als auch in der Selektivität führte. Die Verwendung eines milden Reduktionsmittelns Tris(2-carboxyethyl)phosphin (TCEP) im Reaktionspuffer verringerte ebenfalls in signifikanter Weise verschiedene in geringem Maße auftretende Nebenreaktionen, die durch HPLC entdeckt wurden, insbesondere die Disulfid-Bildung. Die Markierung und Gelfiltration unter solchen optimierten Bedingungen ergab eine 70 %-ige (Wiedergewinnungs-) Ausbeute an markiertem SA-Testpeptid (90 % Ausbeute auf Basis der HPLC-Quantifizierung), von dem 90 % lediglich mit einem einzigen Farbstoff am Aminooxy-Amin markiert waren. Die Markierungs-Selektivität wurde auf 22/1 gesteigert (Tabelle 1).
Die Reinheit des Produkts wurde unter Verwendung von einer RP-HPLC bestätigt sowie durch Massenspektrometrie, durch weitere chemische Reaktion und durch Isolierung von absichtlich im Überschuß markierten Produkten. Die markierten Peptide eluierten als einzelner Peak bei allen HPLC-Bedingungen, die mit einer Masse getestet wurden, die in Übereinstimmung mit der steht, die für einfach-markiertes SA-Testpeptid vorhergesagt wurde (Masse = 1970). Um zu bestimmen, ob sich die Markierungsstelle tatsächlich an der N-Methylaminooxy-Gruppe befand, wurde ein selektives Zink/Essigsäure-Reduktionsverfahren verwendet, um die N-O-Bindung zu spalten (3). Die HPLC der Reduktionsreaktion zeigte >98 % Umwandlung des Ausgangsmaterials und einen neuen, früher eluierenden Peak. Die Masse dieses Peaks (1530 amu) stimmt mit der vorhergesagten Masse für das nicht-markierte SA-Testpeptid überein, welches an der Aminooxy-N-O-Bindung gespalten wurde. Das verbleibende Zink wurde mehrmals mit einer gesättigten Lösung aus EDTA in Wasser gewaschen, was zeigte, dass die Reduktionsreaktion vollständig abgelaufen war.
Um die unwahrscheinliche Möglichkeit zu eliminieren, dass der HPLC-Peak, der isoliertes einfach-markiertes SA-Testpeptid als Produkt enthielt, eine Mischung aus zwei markierten Spezies war, wurde SA-Testpeptid unter den Bedingungen eines höheren pH-Wertes (pH 9,0) umgesetzt, um alle reaktiven Stellen zu markieren. Das SA-Testpeptid enthielt 3 nukleophile Markierungsstellen, welche irreversibel markiert werden würden: Aminooxy, Lysin und N-terminales Amin. Eine Farbstoff-Markierung bei einem hohen pH erzeugte eine Mischung aus Peptiden, die an allen möglichen Positionskombinationen mit 1, 2 oder 3 Farbstoffen markiert waren. Eine HPLC-Analyse dieser Reaktionsmischung zeigte, dass 8 Peaks, ermittelt durch ESI-MS, die mit nicht-umgesetztem SA-Testpeptid sowie mit SA-Testpeptid, das am Aminooxy-Stickstoff einfach-markiert war, korrespondierten, und sechs weitere Peaks, die mit zwei einfach-markierten Peptiden, mit drei Peptiden, die zwei Farbstoffe aufwiesen, und mit einer einzigen dreifach-markierten Peptidspezies korrespondierten. Dieses Experiment lieferte die HPLC-Verweilzeiten all dieser Produkte, von denen keines mit dem Peak co-eluierte, der als SA-Testpeptid identifiziert worden war, welches mit einem einzigen Farbstoff am sekundären Aminooxy-Stickstoff markiert wurde.
Eine ortsspezifische Markierung der Aminooxy-Gruppe kann selbst bei basischem pH erreicht werden (Tabelle 1). Bei der Verwendung von Carbonat-Puffer mit einem pH von 9,0 in unserem Lösungssystem, ergab die Zugabe von 0,5 Äquivalenten an Farbstoff nach 3 Stunden ⁓50 Umwandlung des anfänglichen SA-Testpeptids in einen einzigen Peak mit der Elutionszeit des gewünschten einfach-markierten Produkts. Nach Zugabe von weiteren 0,5 Äquivalenten an TMR-OSu und weiteren 3 Stunden Reaktionszeit zeigte die HPLC ⁓85 % Umwandlung in einen Peak mit der Verweilzeit des gewünschten Produkts. Zwei kleinere Peaks (⁓2-3 % der Gesamtfpeakläche) traten ebenfalls auf und korrespondierten mit den zwei anderen einfach-markierten SA-Testpeptid-Spezies, die im oben beschriebenen Mehrfach-Markierungs-Experiment identifiziert wurden. Der N-Hydroxysuccinimidester von Rhodamin zeigte deutlich eine selektive Reaktivität mit der Aminooxy-Gruppe.
Die bei höherem pH beobachtete Selektivität kann durch die Nukleophilie der Aminooxy-Gruppe allein nicht erklärt werden. Tatsächlich haben andere gezeigt, dass bei einer nicht-katalysierten Reaktion mit Phenylacetat bei höherem pH Amine stärker reaktiv sind als O-Alkylaminooxy-Gruppen. Wir schlagen daher vor, dass kinetische Faktoren einen Beitrag zur selektiven Reaktivität der N-Methylaminooxy-Gruppe leisten, selbst wenn kompetierende Gruppen nicht protoniert sind. Mögliche Gründe dafür schließen ein: (1) der Aminooxy-Sauerstoff lokalisiert den Stickstoff in der Nähe des aktivierten Esters über die Bildung eines Wasserstoff-gebundenen "verbrückten" Zwischenproduktes, (2) einen Basen-katalysierten Reaktionsweg unter den Bedingungen unserer Reaktion. Diese außergewöhnliche Reaktivität hat wichtige praktische Folgen, da diese die selektive Markierung von Säure-labilen Polypeptiden und synthetischen Proteinen unter physiologischen oder basischen Bedingungen ermöglicht.
Beispiel 2. Die sekundäre Aminooxy-Gruppe ist mit C^α-Thioestern und einer Amid-bildenden Ligation kompatibel.
Die Herstellung von Proteinen über eine chemische Gesamtsynthese erfordert oftmals die Ligation großer Polypeptide, die über eine Festphasen-Peptidsynthese auf Thioester-Linker-Harzen hergestellt wurden. Die am allgemeinsten anwendbaren Verfahren, die für Ligationen verfügbar sind, sind die native chemische Ligation und die Ligation von exprimiertem Protein. Diese Verfahren nutzen die gleiche elementare Chemie zur Verknüpfung zweier Peptide, eines mit einem N-terminalen Cystein und das andere mit einem C-terminalen Thioester, über eine regiospezifische und ortsspezifische Reaktion zur Erzeugung eines größeren Polypeptids. Die Anwendung der Chemie zur Aminooxy-Markierung auf die Synthese von großen Polypeptiden und Proteinen erfordert eine Kompatibilität mit dieser Festphasen-Peptidsynthese und der Ligationschemie.
Der optimale Ansatz zur Verwendung der Chemie zur Aminooxy-Markierung bei der chemischen Synthese von Proteinen ist der direkte Einbau der Aminooxy-Gruppe als Bestandteil einer, während der Standard-Festphasen-Peptidsynthese verwendeten, Aminosäure. Zu diesem Zweck haben wir eine einfach geschützte N-Methylaminooxy-Aminosäure, α-Boc-β-[N-(2-chlorbenzyloxycarbonyl)-N-methylaminooxyacetyl]-α,β-diaminopropionsäure [Boc-2-Cl-Z-(SA)Dapa-OH], erzeugt, wie in 4 gezeigt. Diese Aminosäure, als SAOD bezeichnet, wurde in die Peptidsequenz LY-(SAOD)-AG-MPAL Thioester über eine Synthese auf dem TAMPAL-Thioester-Linker-Harz eingebaut, wie nachfolgend in den Methoden beschrieben. (MPAL ist die C-terminale Mercaptopropionylleucin-Gruppe, die durch Spaltung eines Peptids vom TAMPAL-Harz erzeugt wurde, siehe Hojo, H., et al., Bull. Chem. Soc. Jpn. 1993, 66:2700-2706; und Hackeng, T.M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA.; In Drucklegung).
Die Ligation des LY-(SAOD)-AG-MPAL (SEQ ID NO: 3)-Thioester-Peptids mit dem Peptid CRANK-NH₂ (SEQ ID NO: 4) wurde unter Verwendung von Standardverfahren unter Einsatz von Phosphatpuffer mit 6M Guanidiniumhydrochlorid bei einem neutralen pH in der Gegenwart von 2-3 % Thiophenol pro Volumen getestet. Die Ligation verlief über 24 Stunden und erzeugte das gewünschte Ligationsprodukt, LY-(SAOD)-AGCRANK-NH₂ (SEQ ID NO: 5), mit ⁓85 % Ausbeute. Das hauptsächlich anfallende Nebenprodukt war der Modifizierung von nicht-ligiertem CRANK-NH₂-Peptid unter den Ligationsbedingungen zuzurechnen (Masse=714,5, Daten nicht gezeigt), und stand nicht in Bezug zur Anwesenheit der Aminooxy-Gruppe. Es trat dort also eine einzige zeitabhängige Nebenreaktion auf, welche ein Produkt mit 14 Masseneinheiten geringer als das gewünschte Produkt erzeugte. Die Verwendung hoher Konzentrationen an reagierenden Peptiden und die Isolierung des Ligationsprodukts nach 24 Stunden reduzierte diese Nebenreaktion auf ein akzeptables Niveau (<5 %).
Die Ligation eines Peptids, das mehrfache, potentiell reaktive funktionelle Gruppen enthält, einschließlich eines für die Affinitäts-Chromatographie nützlichen Hexahistidin-Tags, wurde ebenfalls getestet. Die Kopplung von CEYRIDRVRLFVDKLDNIAQVPRVGAA-HHHHHH (SEG ID NO: 6) an den LY-(SAOD)-AG-MPAL-Thioester war innnerhalb von 5 Stunden mit minimalen Nebenreaktionen beendet. Bei beiden Ligationsreaktionen trat weniger als 1 % LY-(SAOD)-AG-MPAL-selbstkondensiertes Produkt auf, was andeutet, dass die Aminooxy-Gruppe und der Thioester unter den Ligationsbedingungen nicht bevorzugt miteinander reagieren. Diese Ergebnisse zeigen, dass die Einbeziehung einer nicht-geschützten Aminooxy-Gruppe in die Peptidkette mit der nativen chemischen Ligation kompatibel ist.
Die Markierung der zwei Ligationsprodukte unter Verwendung von Tetramethylrhodaminsuccinimidester verlief mit einer Selektivität, die ähnlich zu der des SA-Testpeptids war. Die HPLC-Integration zeigte, dass das Produkt der LY-(SAOD)-AG-MPAL-Ligation mit CRANK-NH₂ mit mehr als 95 % Effizienz und mit einer Selektivität von 34:1 markiert wurde. Eine massenspektrometrische Analyse und eine Zinkreduktion zeigten eine Markierung lediglich an der Aminooxy-Gruppe. Für das längere Hexahistidin-enthaltende Polypeptid-Ligationsprodukt betrug die Selektivität für die Aminooxy-Gruppe mehr als 10:1, jedoch war es schwierig, hohe Ausbeuten zu erreichen. Die Histidine könnten möglicherweise die Ausbeute und Selektivität durch Katalyse des nukleophilen Angriffs auf den Succinimidester des reaktiven Farbstoffs beeinträchtigt haben. Die Verwendung von Guanidiniumhydrochlorid im Lösungsmittel der Reaktion steigerte die Ausbeute auf etwa 50 %, was andeutet, dass die Faltung oder die schlechte Löslichkeit des Peptids ein Faktor bei der Verhinderung des Zugangs des reaktiven Farbstoffs zur Aminooxy-Gruppe war. Die Selektivität wurde ebenfalls verbessert, möglicherweise aufgrund der Verfügbarkeit der reaktiven sekundären Aminooxy-Gruppe. Die einfache Orts-Markierung an der Aminooxy-Gruppe wurde über eine massenspektrometrische Analyse von Verdaureaktionen des markierten Polypeptidprodukts mit Trypsin und α-Chymotrypsin nachgewiesen.
Beispiel 3: Spezifität der Markierung von Proteindomänen, die Aminooxyaminosäuren enthalten
Als Kontrolle zur Etablierung der Selektivität der Markierung mit Aminooxyaminosäure wurde die Markierung von nativem β-Lactoglobulin mit Tetramethylrhodamin-N-hydroxysuccinimidester durchgeführt. Es wurde festgestellt, dass die nicht-spezifische Markierung dieses 162 Aminosäuren langen Proteins, welches 15 Lysine und 4 Cysteine enthält, selbst nach 6 Stunden minimal war (<1 %).
Abschließend wurde die GTPase-Bindungsdomäne von p21-aktivierter Kinase (45 Aminosäuren, 4 Lys, 1 Cys) mit einer sekundären Aminooxyaminosäure hergestellt, die am Amino-Ende (SAOD-PBD) eingebaut wurde. Vorangegangene Experimente hatten gezeigt, dass PBD-Domänen, die an diesem Ende mit fluoreszierenden Reporterfarbstoffen markiert waren, als Biosensoren der GTPase-Aktivierung verwendet werden könnten. Die Markierung von PBD unter Verwendung des neuen Verfahrens wird die Herstellung ausreichender Mengen ermöglichen, um die Anwendung der Biosensorsen in vivo und in pharmakologischen Screeninganwendungen zu ermöglichen. Sie wird weiterhin den Einbau sensitiv detektierbarer Gruppen ermöglichen, die Anwendungen innerhalb lebender Zellen erlauben.
Durch Addition von Farbstoff mittels Titration bei pH 4,7 über 72 Stunden wurde SAOD-PBD einfach mit Alexa-532-N-Hydroxysuccinimidester markiert. Die Markierungseffizienz war proportional zu der, die für das längste Modell-Peptid berichtet wurde (ungefähr 50 % Ausbeute gemäß HPLC-Quantifizierung) und es gab keine Anzeichen einer mehrfachen Markierung. In diesem Fall erwies sich die Isolierung von markiertem SAOD-PBD über RP-HPLC als schwierig. Die Auftrennung bis zur Grundlinien-Auflösung wurde nicht erreicht, jedoch schließen kleine Mengen an nicht-markiertem PBD im markierten Produkt die Verwendung des markierten Materials in Biosensor-Anwendungen nicht aus. Vorhergehende Berichte geben an, dass eine Abtrennung des markierten Produkts vom Ausgangs-Polypeptid in höchstem Maße von dem spezifischen Peptid und dem angelagerten Farbstoff abhängig ist.
Diese Ergebnisse zeigen, dass die hier berichtete optimierte ortsspezifische Markierungs-Chemie mit den Schritten kompatibel ist, die für die Herstellung von Proteinen über eine chemische Gesamtsynthese erforderlich sind.
Beispiel 4: Material und Methoden.
Allgemein: Zur Säulenchromatographie wurde Silicagel (230-400er Porenweite) in Standardglassäulen unter (Einfluß von) Schwerkraft oder Luftdruck verwendet. Eine Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (RP-HPLC, reversed-phase high performance liquid chromatography) wurde auf einem Waters HPLC-System mit UV-Detektion bei 214 nm unter Verwendung entweder einer analytischen Vydac C-18-Säule (5 μm, 0,46 × 25 cm), einem Waters RCM 8 × 10-Modul, das mit einer semipräparativen Delta Pack C-18 Radial Pack-Kartuschensäule (15 μm, 8 × 100 mm) von Milipore ausgestattet war, oder einer Vydac C-18-Säule für präparativen Maßstab (15 μm, 1,0 × 25 cm) durchgeführt. Es wurden lineare Gradienten des Lösungsmittels B (0,09 TFA in 90 % Acetonitril/10 % Wasser) in Lösungsmittel A (0,1 % TFA in Wasser) für alle chromatographischen HPLC-Auftrennungen verwendet.
Die Massenspektren der Peptide wurden entweder mit einem Sciex API-III Electrospray-Ionisations-(ESI)-Triple-Quadrupol-Massenspektrometer (PE Biosystems, Foster City) oder mit Matrix-unterstützten Laser-Desorptions-Ionisations-Flugzeit (MALDI-TOF)-Instrumenten von Thermo Bioanalysis (Thermo Bioanalysis, LTD., UK) oder Kratos Analytical (Chestnut Ridge, NY) erhalten. Für ESI-MS wurden die gezeigten beobachteten Massen für alle beobachteten Ladungszustände einer molekularen Spezies aus den experimentellen m/z-Zuständen unter Verwendung des Programms MacSpec (Sciex, Version 2.4.1) für Elektrospray-Massenspektrometrie abgeleitet. Die im MALDI-MS beobachteten Massen standen in Bezug zur internen Kalibrierung unter Verwendung von α-Cyanohydroxyzinnsäure- oder Sinipinsäure-Matrizen. Die berichteten berechneten Massen wurden entweder aus MacProMass (Terry Lee und Sunil Vemuri, Beckman Research Institute, Duarte, CA) oder aus PAWS (Version 8.1.1, ProteoMetrices) abgeleitet und reflektieren die durchschnittliche Isotopenzusammensetzung des einfach geladenen Molekülions. Die Protonen-Kern-Magnetresonanzspektroskopie wurde auf einem Bruker AC-250-Massenspektrometer aufgezeichnet und die Daten wurden unter Verwendung von WinNMR (Bruker Instruments) analysiert. Die Spektroskopie im ultraviolett-sichtbaren Bereich wurde auf einem Hewlett-Packard-Photodioden-Array-Spektrophotometer durchgeführt.
Die Boc-L-Aminosäuren wurden von Novabiochem (La Jolla, CA) oder Bachem Bioscience, Inc. (King of Prussia, PA) bezogen. [[4-(Hydroxymethyl)phenyl]-acetamido]methyl] (-OCH₂-Pam)-Harz wurde von PE Biosystems (Foster City, CA) bezogen und Methylbenzylhydrylamin (MBHA)-Harz wurde von Peninsula Laboratories, Inc. (San Carlos, CA) bezogen. Die Lösungsmittel lagen in einem Synthese-Reinheitsgrad oder sauberer vor und wurden von Fisher Scientific (Tustin, CA) bezogen. Trifluoressigsäure (TFA) und wasserfreies Hydrogenfluorid wurden von Halocarbon (New Jersey) und Matheson Gas (Rancho Cucamonga, CA) bezogen. Die Farbstoffe wurden von Molecular Probes (Eugene, OR) erhalten. Alle anderen Reagenzien lagen in einem analytischen Reinheitsgrad oder sauberer vor und wurden von Aldrich (Milwaukee, WI), Lancaster (Windham, NH), Peptides International (Louisville, KY) oder Richelieu Biotechnologies (Montreal, Kanada) bezogen.
Peptidsegmentsynthese. Die Synthese von Peptiden wurde manuell unter Verwendung von optimierten stufenweisen Festphasen-Syntheseverfahren mit in situ Neutralisation und HBTU-Aktivierungsverfahren für die Boc-Chemie entweder auf -OCH₂-Pam, MBHA- oder Trt-geschützten Mercaptopropionyl-Leu (TAMPAL)-Harz (Hojo, H., et al., Bull. Chem. Soc. Jpn. 1993, 66:2700-2706; Hackeng, T.M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA.; In Drucklegung; und Schnolzer, M., et al., Int. J. Peptide Protein Res. 1992, 40:180-193) durchgeführt. Es wurden Standard Boc-Schutzgruppen-Strategien eingesetzt. Die Kopplung wurde über einen quantitativen Ninhydrin-Assay nach 15-minütigen Kopplungszyklen verfolgt. Nach Anordnung der Ketten wurde eine Standard-Entschützung und eine Abspaltung vom Harz-Träger durch Behandlung mit wasserfreiem HF bei 0 °C für 1 Stunde durchgeführt, das entweder 10 % p-Kresol oder Anisol als Radikalfänger enthält. Die Aufreinigung wurde unter Verwendung einer RP-HPLC durchgeführt.
Synthese von TAMPAL-Harz (Hojo, H., et al., Bull. Chem. Soc. Jpn. 1993, 66:2700-2706). Man ließ 2,5 Gramm MBHA-Harz (0,865 mmol/g, 2,16 mmol an Amin) in DMF aufquellen. Boc-Leu-OH (1,1 Gramm, 4,4 mmol) wurde mit HBTU (8 ml, 0,5M Lösung) und DIEA (2 ml) aktiviert, anschließend an das MBHA-Harz gekoppelt, bis über einen Ninhydrin-Assay eine vollständige Reaktion festgestellt wurde. Die N^α-Boc-Gruppe des verknüpften Leucins wurde mit reinem TFA entfernt, anschließend wurde S-Trt-β-Mercaptopropionsäure (1,5 Gramm, 4,3 mmol), welches in der gleichen Weise wie Boc-Leu-OH aktiviert wurde, zum entschützten Leu-MBHA-Harz zugegeben, und man ließ dieses bis zur vollständigen Umsetzung koppeln. Das S-Trt-β-Mercaptopropionyl-Leu-MBHA-Harz wurde ausgiebig mit DMF gewaschen, danach mit DCM/MeOH (1/1), und anschließend unter Vakuum getrocknet, um 3,39 Gramm eines Thioester-Harzes zu ergeben. Die über die Gewichtszunahme berechnete Substitution betrug 0,549 mmol/Gramm.
Entschützung von TAMPAL-Harz: Der S-Trityl-Schutz wurde über zwei 5 Minuten dauernde Behandlungen mit 95 % TFA/5 % Triisopropylsilan entfernt. Das entschützte Harz wurde ausgiebig mit DMF vor der Kopplung der ersten Aminosäure unter Verwendung des optimierten in situ Neutralisierungsprotokolls aktiviert.
Synthese von N-(2-Cl-benzyloxycarbonyl)-N-methylhydroxylamin (1) (Jencks, W.P., Carriuolo, J. J. Am. Chem. Soc. 1960, 82:675; Jencks, W.P. J. Am. Chem. Soc. 1958, 80:4581, 4585). N-Methylhydroxylaminhydrochlorid (0,95 g, 11,37 mmol) wurden in 3 ml Wasser unter schnellem Rühren aufgelöst. Der pH dieser Lösung wurde auf 6-7 durch tropfenweise Zugabe einer gesättigten Lösung an Natriumbicarbonat eingestellt. 2-Chlorbenzyloxycarbonyl-N-hydroxysuccinimidylcarbonat (1,2 g, 4,23 mmol) wurde in 4 ml THF gelöst und langsam zur schnell rührenden Lösung aus neutralisiertem N-Methylhydroxylamin zugegeben. Nach Rühren bei Raumtemperatur für 14 Stunden wurde die Reaktion mit 20 ml gesättigtem Natriumbicarbonat gestoppt (gequenched) und dreimal mit 20 ml Ethylacetat extrahiert. Die vereinigten Ethylacetatschichten wurden einmal mit gesättigtem Natriumbicarbonat gewaschen, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und das Lösungsmittel wurde unter Vakuum entfernt, um eine Ausbeute von 0,77 g (3,77 mmol, 84 %) eines cremefarbenen Feststoffes zu ergeben. TLC Rf = 0,2 (Hex/EtOAc/AcOH 80/20/1). ¹H NMR: 3,23 (s, 3H), 5,25 (s, 2H), 7,24 (m, 2H), 7,37 (m, 2H). HRMS: Erwartet = 216,0427, beobachtet = 216,0425.
Synthese von N-(2-Cl-benzyloxycarbonyl)-N-methylaminooxyessigsäuretert.-butylester (2) (Jerry March in Advanced Organic Chemistry, Third Edition. John Wiley & Sons, New York, 1989, S. 381; und Nyberg, D.D., Christensen, B.E., J. Am. Chem. Soc. 1957, 79:1222; Motorina, I.A., et al., Synlett 1996, 389). Die Verbindung 1 (0,96 g, 4,71 mmol) wurde bei Raumtemperatur in 10 ml THF unter schnellem Rühren aufgelöst. Es wurde Bromacetat-tert-butylester (1,05 g, 5,38 mmol) zugegeben, anschließend Natriumiodid (1,5 g, 10,01 mmol), gefolgt von DIEA (2,5 ml, 15,92 mmol). Die Reaktion änderte sich zu einer orange-gelben Farbe nach Zugabe von Natriumiodid. Die Reaktion wurde mit 30 ml Wasser nach der vollständigen Umsetzung (⁓3 Stunden) gestoppt (gequenched) und dreimal mit Ethylacetat extrahiert. Die vereinigten Ethylacetat-Schichten wurden über Natriumsulfat getrocknet und das Ethylacetat wurde unter Vakuum entfernt. Der erhaltene ölige Feststoff wurde über Silica-Chromatographie auf Silicagel mit 230-400er Porenweite unter Verwendung von Hexanen/Ethylacetat/Essigsäure (80/20/1) aufgereinigt, um 1,40 g (4,29 mmol, 90 %) eines reinen gelben Öls zu ergeben. TLC Rf = 0,5 (Hex/EtOAc/AcOH 80/20/1). ¹H NMR: 1,46 (s, 9H), 3,29 (s, 3H), 4,36 (s, 2H), 5,26 (s, 2H), 7,24 (m, 2H), 7,40 (m, 2H). HRMS: Erwartete Masse = 330,1108, beobachtete Masse = 330,1104.
Synthese von N-(2-Cl-benzyloxycarbonyl)-N-methylaminooxy-essigsäure (3) (Bryan, D.B., et al., J. Am. Chem. Soc. 1977, 99:2353). Verbindung 2 (1,1 g, 3,30 mmol) wurde in 4 ml DCM gelöst und unter schnellem Rühren wurde reines TFA (5 ml) tropfenweise über 2 Minuten bei Raumtemperatur zugegeben. Nach 1 Stunde wurde die Reaktion mit 20 ml Wasser gestoppt (gequenched), 3 mal mit DCM extrahiert, und die vereinigten DCM-Schichten wurden über Natriumsulfat getrocknet. Das DCM wurde unter Vakuum entfernt, um 0,9 g Ausbeute (3,28 mmol, 99 %) eines cremefarbenen Feststoffes zu ergeben. TLC Rf = 0,2 (Hex/EtOAc/AcOH 80/20/1). ¹H NMR: 3,23 (s, 3H), 4,50 (s, 2H), 5,32 (s, 2H), 7,28 (m, 2H), 7,40 (m, 2H). HRMS: Erwartete Masse = 274,0482, beobachtete Masse = 274,0479.
Synthese von N-(2-Cl-benzyloxycarbonyl)-N-methylaminooxyacetal-α-Boc-α,β-diaminopropionsäure [(SA)Dapa-OH](4) (Wahl, F., Mutter, M. Tett. Lett. 1996, 37:6861-6864; und Anderson, G.W., et al., J. Am. Chem. Soc. 1964 86:1839). N-(2-Chlorbenzyloxycarbonyl)-N-methylaminooxyessigsäure (3) (2,5 g, 9,2 mmol) wurde mit N-Hydroxysuccinimid (2,11 g, 2 Äquiv.) und DIC (1,440 ml, 1,0 Äquiv.) in 20 ml DCM aktiviert. Diese Reaktion wurde bei Raumtemperatur für 2 h vor der Zugabe von N^α-Boc-α,β-Diaminopropionsäure (2,3 g, 1,2 Äquiv.) und DIEA (3,20 ml, 2 Äquiv.) schnell gerührt. Nach 4 Stunden wurde das DCM-Lösungsmittel unter Vakuum entfernt und es wurden 50 ml Ethylacetat zugegeben. Die Ethylacetat-Schicht wurde zweimal mit 0,5M Acetatpuffer, pH = 4,0, gewaschen und anschließend zweimal mit 0,1N Schwefelsäure. Die vereinigten Säure-Waschlösungen wurden anschließend mit 50 ml Ethylacetat gewaschen. Die vereinigten Ethylacetat-Schichten wurden über Natriumsulfat getrocknet, anschließend unter Vakuum aufkonzentriert, um einen viskosen gelben öligen Feststoff zu ergeben. Dieser Feststoff wurde 3 Fällungen mit Hexan aus Diethylether unterworfen, um 2,16 g (51 Ausbeute) eines cremefarbenen Feststoffes zu ergeben. TLC Rf = 0,2-0,4 (Hex/EtOAc/AcOH 30/70/0,5). ¹H NMR: 1,45 (s, 9H), 3,16 (s, 3H), 3,54 (d- von-t, 1H, J = 14,3, 4,6 Hz), 3,93 (m, 1H, J = 14,3, 7,5, 4,6 Hz), 4,31 (s, 0,5H), 4,38 (s, 1H), 4,45 (s, 1H), 4,51 (s, 0,5H), 5,34 (s, 2H), 5,97 (breit-d, 1H, J = 7,3 Hz), 7,30 (m, 2H), 7,43 (m, 2H), 8,50 (breit-s, 1H). HRMS: Erwartete Masse = 460,1487, beobachtete Masse = 460,1480.
Synthese des sekundären Aminooxy-Test-Peptids (SA-Test-Peptid). Das SA-Testpeptid, NH-AKAARAAAAK*AARACA-CO₂H wurde mit einem Lys 10-Seitenketten-Fmoc-Schutz, wie kürzlich beschrieben (Canne, L.E., et al., J. Am. Chem. Soc. 1995, 117:2998-3007), synthetisiert. Der Einbau der sekundären Aminooxy-Gruppe wurde durch Kopplung von 2-Cl-Z-geschützter N-Methylaminooxyessigsäure (300 mg, 1,09 mmol) bewirkt, welche mit Diisopropylcarbodiimid (157 μl, 1,00 mmol) und N-Hydroxysuccinimid (140 mg, 1,22 mmol) in 2 ml DCM für 1-2 Stunden aktiviert wurde, (und) anschließend mit 2 ml DMF, direkt vor der Kopplung an die ε-Aminogruppe von Lys 10, verdünnt. Es wurden die optimierten Kopplungs-, Spaltungs- und Aufreinigungs-Protokolle verwendet. Die Aminosäureanalyse stimmte mit dem gewünschten Peptid überein. Erwartete Masse = 1560, beobachtete Masse = 1559.
Synthese von LY-(SAOD)-AG-MPAL-Thioester. LY-(SAOD)-AG-MPAL-Thioester wurde unter Verwendung von optimierten in situ Neutralisierungsprotokollen für die Boc-Chemie auf TAMPAL-Harz synthetisiert. Die Kopplung der N^α-Boc-(SA)Dapa-OH-Aminosäure wurde durch Umsetzung des in situ aktivierten N-Hydroxysuccinimidesters mit dem entschützten Amino-terminalen Stickstoff von Alanin durchgeführt (Canne, L.E., et al., J. Am. Chem. Soc 1995, 117:2998-3007). (SA)Dapa-OH (4) (230 mg, 0,5 mmol) wurde in 1 ml DCM und N-Hydroxysuccinimid (115,1 mg, 1,0 mmol) aufgelöst und es wurde DIC (74,4 μl, 0,47 mmol) zugegeben. Die Reaktionsmischung wurde kurz gemischt und man ließ diese für 1-2 Stunden bei Raumtemperatur vor der Kopplung mit dem entschützten N-Terminus der Peptidkette aktivieren. Nach dieser Kopplung waren keine weiteren Modifizierungen des Syntheseprotokolls erforderlich. Erwartete Masse = 797, beobachtete Masse = 797.
Ligation von LY-(SAOD)-AG-MPAL-Thioester mit CRANK-NH₂-Peptid. LY-(SAOD)-AG-MPAL-Thioester (3 mg, 3,8 μmol) wurde in 100 μl von 50 mM Phosphatpuffer aufgelöst, der 6M Guanidiniumhydrochlorid, pH 7,2, enthielt. Zu dieser Lösung wurde CRANK-NH₂-Peptid zugegeben, welches in 100 μl des gleichen Phosphatpuffers und 3 μl Thiophenol gelöst war. Die Reaktion wurde über analytische Umkehrphasen-HPLC beobachtet (analytical reversed-phase HPLC). Nach 24 Stunden wurde das Ligationsprodukt, LY-(SAOD)-AGCRANK-NH₂ (SEQ ID NO: 10), über semipräparative Umkehrphasen-HPLC (Gradient = 10-50 % B über 60 Minuten) isoliert und lyophilisiert, um einen flockigen weißen Feststoff zu ergeben. Die Aminosäureanalyse stimmte mit dem gewünschten Peptidprodukt überein. Erwartete Masse = 1168, beobachtete Masse = 1168.
Ligation von LY-(SAOD)-AG-MPAL-Thioester mit CEYRIDRVRLFVDKLDNIAQ-VPRVGAA-HHHHHH (SEQ ID NO: 7). LY-(SAOD)-AG-MPAL (0,3 mg, 0,37 mmol) und CEYRIDR-VRLPFVDKLDNIAQVPRVGAA-HHHHHH (1,5 mg, 3,8 mmol) wurde den gleichen Ligations- und Aufreinigungsbedingungen unterworfen, wie zuvor beschrieben, um 1,0 mg (58 % Ausbeute) eines weißen Feststoffes zu ergeben. Erwartete Masse = 4518, beobachtete Masse = 4517.
Synthese eines Peptidfragments der Amino-terminalen-P2l-Bindungs-Domäne (PBD), (SAOD)-KKKEKERPEISLPSDFEHTIHVGFDA-MPAL-Thioester (SEQ ID NO: 8): Sekundäre Aminooxy enthaltende Amino-terminale PBD-Thioester wurden wie zuvor beschrieben, unter Verwendung von TAMPAL-Harz synthetisiert. Eine HF-Spaltung unter Verwendung von p-Kresol als Radikalfänger, gefolgt von einer HPLC-Aufreinigung, ergab (SAOD)-KKKEKERPEISLPSDFEHTIHVGFDA-MPAL, enthaltend zwei DNP-Gruppen, die die Histidine schützen. Erwartete Masse = 3745, beobachtete Masse = 3 745.
Synthese des Carboxy-Endes des Peptidfragments der P21-Bindungsdomäne (PBD), CTGEFTGMPEQWARLLQT (SEQ ID NO: 9): Die native Carboxyterminale Hälfte von PBD wurde unter Verwendung eines Standard-FMOC-Syntheseprotokolls von der Scripps-Zentraleinheit für Peptide und Proteinkerne synthetisiert. Erwartete Masse = 2068, beobachtete Masse = 2068.
Synthese von SAOD-modifiziertem PBD, SAOD-KKKEKERPEISLPSDFEHTIHVGFDA-CTGEFTGMPEQWARLLQT (SEQ ID NO: 11): 1,5 mg von SAOD-KKKEKERPEISLPSDFEHTIHVG-FDA-MPAL (0,4 mmol) wurden mit 1 mg (4,8 mmol) an Carboxy-terminalem Fragment, CTGEFTGMPEQWARLLQT, wie oben beschrieben, ligiert. Nach 48 Stunden wurden die ligierten PBD-Proteine über RP-HPLC isoliert und lyophilisiert, 1,5 mg (70 % Ausbeute), erwartete Masse = 5262, beobachtete Masse = 52 62.
Selektive Markierung von SA-Test-Peptid mit Tetramethylrhodamin-N-hydroxysuccinimidylester. Eine Lösung aus SA-Testpeptid (3,396 μg/μl, 2,18 mM) in 5 % Acetatpuffer, pH = 4,7, welche 5 mM TCEP beinhaltet, wurde zur Markierung verwendet. Eine Stammlösung an Farbstoff (5 μg/μl, 9,5 mM) wurde durch Lösung von TMR-OSu in reinem DMSO hergestellt. Für jede Reaktion wurde die Stammlösung so verdünnt, dass die gewünschte Anzahl an Farbstoff-Äquivalenten in 20 μl DMSO zugegeben werden konnte. Die folgenden Äquivalente an Farbstoff wurden getestet: 1.2, 1.5, 1.8, 2.0, 2.4, 3.0 und 4.3. Unter konstantem Rühren wurden 20 μl Farbstofflösung in zwei 10 μl-Aliquots zu 20 μl Peptidlösung bei Raumtemperatur zugegeben. Das zweite Aliquot an Farbstoff in DMSO wurde 10 Minuten nach der anfänglichen Zugabe von Farbstoff hinzugegeben. Nach vollständiger Zugabe an Farbstoff wurde die Reaktion kurz gevortext, anschließend bei Raumtemperatur inkubiert. Nach 3 Stunden wurde(n) das (die) markierte(n) Reaktionsprodukte) vom nicht-umgesetzten Farbstoff über Gelfiltration auf Sephadex-G-10- oder -G-15-Säulen unter Verwendung von entweder 100 μM Ammoniumbicarbonat oder, nach Optimierung, 0,1 % TFA in Wasser, abgetrennt. Das (die) individuelle(n) Peptidprodukt(e) wurden anschließend über RP-HPLC abgetrennt und über ESI-MS analysiert. Erwartete Masse = 1971, beobachtete Masse = 1970.
Nicht-selektive Markierung von SA-Test-Peptid mit Tetramethylrhodamin-N-hydroxysuccinimidester. SA-Test-Peptid (3,396 μg/μl, 2,18 mM) wurde in 100 mM Natriumcarbonat, pH = 9,01, welches 5 mM TCEP enthielt, gelöst. 18 μl an reinem DMSO wurden zu 20 μl der Peptidlösung zugegeben. Unter schnellem Rühren wurde 1 μl Farbstoff-Stammlösung in DMSO zu dieser Mischung zugegeben. Nach Vervollständigung der Addition wurde die Reaktion kurz gevortext, anschließend bei Raumtemperatur inkubiert. Nach 3 Stunden wurde ein 15 μl Aliquot entfernt und über RP-HPLC und ESI-MS ausgewertet. Dieser Prozess wurde so lange wiederholt, bis ein signifikantes Niveau der Reaktion durch Bildung von einfach-markierten SA-Lysin-Test-Peptid-Produkten detektiert wurde.
Selektive Markierung von LY-(SAOD)-AGCRANK-NN₂ und LY-(SAOD)-AGCEYRIDRVR-LFVDKLDNIAQVPRVGAA-HHHHHH mit Tetramethylrhodamin-N-hydroxy-succinimidylester. Eine Probe mit 20 μl LY-(SAOD)-AGCRANK-NH₂ (2,5 μg/μl, 2,18 mM) in 200 mM Citratpuffer, pH = 4,7, 5 mM TCEP wurde unter Verwendung von 4,3 Äquivalenten an Farbstoff in DMSO markiert, aufgereinigt und analysiert. Erwartete Masse = 1580, beobachtete Masse = 1580. Eine 20 μl Probe von LY-(SAOD)-AGCEYRIDRVRLFVDKLDNIAQVPRVGAA-HHHHHH (SEQ ID NO: 12) (9,7 μg/μl, 2,12 mM) in 200 mM Citratpuffer, pH = 4,7, welche 5 mM TCEP und 3 M Guanidiniumhydrochlorid enthielt, wurde unter Verwendung einer modifizierten Prozedur markiert. 18 μl einer Lösung aus Tetramethylrhodamin-N-hydroxysuccinimid (10 μg/μl) in DMSO wurde zu 6 μl Aliquots über 15 Minuten unter schnellem Rühren zugegeben. Die Reaktion wurde bei Raumtemperatur für 5 Stunden vor der Gelfiltration/RPHPLC-Aufreinigung und der massenspektrokopischen Analyse inkubiert. Erwartete Masse = 4930, beobachtete Masse = 4929.
Markieren von β-Lactoglobulin mit Tetramethylrhodamin-N-hydroxysuccinimidester: 10 μl einer 10 mg/ml Lösung aus Tetramethylrhodamin-N-hydroxysuccinimidester in DMSO (9,5 Äquivalente im Vergleich zu Protein) wurden zu einer Lösung zugegeben, die 10 μl an DMSO und 20 μl einer Lösung aus β-Lactoglobulin (20,3 mg/ml oder 1,1 mM) in 2,8 M Guanidiniumhydrochlorid mit 5 mM TCEP (pH 4,7) enthielt. Nach 3 Stunden wurde das Protein vom nicht-umgesetzten Farbstoff über Gelfiltration abgetrennt und die Markierung wurde über eine Analyse des Verhältnisses von Farbstoff zu Protein bestimmt (die Proteinkonzentration wurde über das Verfahren von Waddel bestimmt und ε wurde für Tetramethylrhodamin in Phosphatpuffer, pH = 8,0, mit 81.000 bestimmt).
Markieren von PBD-Proteinen mit Alexa-532-N-Hydroxysuccinimidester: 150 μg an SAOD-modifiziertem PBD-Protein wurden in 105 μl an 200 mM Natriumcitratpuffer, pH = 4,8, welcher 5 mM TCEP (Proteinkonzentration 0,28 mM) enthielt, aufgelöst. Eine Lösung aus Alexa-532-OSu in DMSO (Farbstoffkonzentration ⁓10 mg/ml in DMSO) wurde in die Proteinlösung in 5 μl Aliquots über 72 Stunden titriert. Vier Stunden nach jeder Zugabe wurde das Ausmaß der Markierung über RP-HPLC und MS bestimmt. Die Markierung wurde solange fortgesetzt, bis Mengen an zweifach-markiertem PBD erhalten wurden (SAOD-modifiziertes PBD). Alexa-532-markiertes SAOD-modifiziertes PBD, erwartete Masse = 5871, beobachtete Masse = 5870).
Zink/Essigsäure-Reduktion der N-Methylaminooxy-N-O-Bindung in Peptiden. Unter Verwendung von Zink und wässeriger Essigsäure wurde eine reduktive Spaltung der N-O-Bindung durchgeführt. Das Sprudeln in der Reaktion war nach einigen Sekunden klar zu sehen und klang nach etwa 60-120 Minuten ab. Nach 14 Stunden wurde der Überstand der Reaktion über RP-HPLC und ESI-MS analysiert. Reduktion an markiertem SA-Test-Peptid, erwartete Masse = 1530, beobachtete Masse = 1530: Reduktion an markiertem (SAOD)-AGCRANK-NH₂: Erwartete Masse = 1139, beobachtete Masse = 1139.
Trypsin/Chymotrypsin-Spaltung von markiertem LY-(SAOD)-AGCEYRIDRVRLFVDKLDN-IAQVPRVGAA-HHHHH-Peptid. 10 μl einer 0,05 mg/ml Lösung von entweder Trypsin oder α-Chymotrypsin in 25 mM Ammoniumcarbonat (ohne Anpassung des pH) wurden zu 5 μl einer 10-20 μg/μl Lösung aus reinem Tetramethylrhodamin-markiertem Peptid in Wasser (Endkonzentration an Protease beträgt 0,033 mg/ml) zugegeben. Die Reaktion wurde bei Raumtemperatur für 24 Stunden vor der Analyse von Peptidfragmenten über MALDI-MS inkubiert.
Alle Veröffentlichungen, Patente und Patentdokumente sind hiermit (in ihrer Offenbarung) so durch Bezug aufgenommen, als ob sie einzeln über Referenz mit aufgenommen wären. Die Erfindung wurde in Bezug auf verschiedene spezifische und bevorzugte Ausführungsformen und Techniken beschrieben. Gleichwohl soll verstanden werden, dass viele Variationen und Modifizierungen unter Beibehaltung des Gedankens und Gegenstandes der vorliegenden Erfindung durchgeführt werden können.

Claims

Eine Verbindung der Formel (I):
wobei: R1 Wasserstoff oder eine Amino-Schutzgruppe ist; R² Wasserstoff oder eine Carboxy-Schutzgruppe ist, die kein (C₁-C₆)-Alkyl ist; R ein organisches Radikal ist, welches eine oder mehrere Aminooxy-Gruppen umfasst.
Verbindung gemäß Anspruch 1, wobei R ein Radikal der Formel (V) ist:
wobei: R³ Wasserstoff, ein (C₁-C₆)Alkyl, eine Amino-Schutzgruppe oder ein Radikal ist, umfassend eine oder mehrere Aminooxy-Gruppen; R⁴ Wasserstoff oder eine Amino-Schutzgruppe ist; und R⁵ Wasserstoff oder ein (C₁-C₆)Alkyl ist.
Verbindung gemäß Anspruch 2, welche eine Verbindung gemäß Formel (II) ist:
wobei: R¹ Wasserstoff oder eine Amino-Schutzgruppe ist; R² Wasserstoff oder eine Carboxy-Schutzgruppe ist; R³ ein (C₁-C₆)Alkyl ist; R⁴ Wasserstoff oder eine Amino-Schutzgruppe ist; und R⁵ Wasserstoff ist.
Verbindung gemäß Anspruch 3, wobei R⁴ ein 2-Chlorbenzyloxycarbonyl ist.
Verbindung gemäß Anspruch 1, welche eine α-Benzyloxycarbonyl-β-[N-(2-chlorbenzyloxycarbonyl)-N-methylaminooxyacetyl]-α,β-diaminopropionsäure ist.
Ein Peptid, umfassend ein Rückgrat(„Backbone") und eine oder mehrere Aminooxy-Gruppen; vorausgesetzt, dass das Peptid nicht Glutathion ist; und vorausgesetzt, dass das Peptid mindestens eine Aminooxy-Gruppe aufweist, welche nicht Bestandteil einer Gruppe H₂N-O-CH₂-C(=O)- ist, die am N-Terminus des Peptids positioniert ist, oder die nicht Bestandteil einer Gruppe -C=N-O-CH₂-C(=O)- ist, die im Backbone liegt.
Ein Peptid, umfassend ein Rückgrat(„Backbone") und eine oder mehrere sekundäre Aminooxy-Gruppen; vorausgesetzt, dass das Peptid mindestens eine Aminooxy-Gruppe aufweist, welche nicht Bestandteil eines Oxims (C=N-O-) im Rückgrat(„Backbone") ist.
Ein Peptidkonjugat der Formel (III):
wobei: R⁶ ein Peptid ist; X eine direkte Bindung oder eine Verknüpfungsgruppe ist; R⁷ Wasserstoff, ein (C₁-C₆)Alkyl, eine Amino-Schutzgruppe oder ein Radikal ist, umfassend eine oder mehrere Aminooxy-Gruppen; Y eine direkte Bindung oder eine Verknüpfungsgruppe ist; und D ein funktionelles Molekül ist.
Peptidkonjugat gemäß Anspruch 8, wobei R⁶ ein Antikörper ist.
Peptidkonjugat gemäß Anspruch 8, wobei R⁶ etwa 2 bis etwa 1000 Aminosäuren umfasst.
Peptidkonjugat gemäß Anspruch 8, wobei R⁶ etwa 5 bis etwa 500 Aminosäuren umfasst.
Peptidkonjugat gemäß Anspruch 8, wobei R⁶ etwa 10 bis etwa 100 Aminosäuren umfasst.
Peptidkonjugat gemäß Anspruch 8, wobei X etwa 5 Angström bis etwa 100 Angström Länge aufweist.
Peptidkonjugat gemäß Anspruch 8, wobei X etwa 5 Angström bis etwa 25 Angström Länge aufweist.
Peptidkonjugat gemäß Anspruch 8, wobei X ein -R_a-C(=O)-NH-R_b- ist, wobei jedes von R_a und R_b unabhängig voneinander ein (C₁-C₆)Alkylen ist.
Peptidkonjugat gemäß Anspruch 15, wobei jedes von R_a und R_b ein Methylen(-CH₂-) ist.
Peptidkonjugat gemäß Anspruch 8, wobei R⁷ Wasserstoff ist.
Peptidkonjugat gemäß Anspruch 8, wobei R⁷ ein (C₁-C₆)Alkyl ist.
Peptidkonjugat gemäß Anspruch 8, wobei R⁷ Methyl ist.
Peptidkonjugat gemäß Anspruch 8, wobei R⁷ ein Radikal ist, umfassend eine oder mehrere Aminooxy-Gruppen.
Peptidkonjugat gemäß Anspruch 8, wobei Y etwa 5 Angström bis etwa 100 Angström Länge aufweist.
Peptidkonjugat gemäß Anspruch 8, wobei Y etwa 5 Angström bis etwa 25 Angström Länge aufweist.
Peptidkonjugat gemäß Anspruch 8, wobei Y ein (C₁-C₆)Alkylen ist.
Peptidkonjugat gemäß Anspruch 8, wobei Y ein Methylen (-CH₂-) ist.
Peptidkonjugat gemäß Anspruch 8, wobei D eine biophysikalische Sonde, ein Peptid, ein Polynukleotid oder ein therapeutisches Mittel ist.
Peptidkonjugat gemäß Anspruch 8, wobei D eine Cross-Linking-Gruppe oder eine eingeschlossene Verbindung zur Modifizierung einer Antwort („caged response modifier") ist.
Peptidkonjugat gemäß Anspruch 8, wobei D eine biophysikalische Sonde ist.
Peptid gemäß Anspruch 27, wobei die biophysikalische Sonde eine fluoreszierende Gruppe, eine phosphoreszierende Gruppe, ein Nukleinsäure-Indikator, eine ESR-Sonde, ein responsiver Sensor, ein eingeschlossener Sensor oder ein Farbstoff ist, welcher sensitiv auf pH-Änderung, Ligandenbindung, oder andere Umgebungsaspekte reagiert.
Peptid gemäß Anspruch 8, wobei D ein Peptid ist.
Peptid gemäß Anspruch 8, wobei D ein Polynukleotid ist.
Peptid gemäß Anspruch 30, wobei das Polynukleotid DNA ist.
Peptid gemäß Anspruch 30, wobei das Polynukleotid RNA ist.
Peptid gemäß Anspruch 8, wobei D ein therapeutisches Mittel ist.
Peptid gemäß Anspruch 8, wobei D ein Alexa-Farbstoff, ein solvatochromatischer Farbstoff, ein elektrochromatischer Farbstoff oder ein Farbstoff ist, welcher sensitiv auf pH-Änderung, Ligandenbindung oder andere Umgebungsaspekte reagiert.
Peptid gemäß Anspruch 8, wobei D Alexa-532, Hydroxycumarin, Aminocumarin, Methoxycumarin, Aminomethylcumarin, Kaskaden-Blau, Luzifer-Gelb, NBD, P-Phycoerythrin, R-Phycoerythrin, (PE), PE-Cy5-Konjugate, PE-Cy7-Konjugate, Rot-613, Fluorescein, BODIPY-FL, BODIPY-TR, BODIPY-TMR, Cy3, TRITC, X-Rhodamin, Lissamin-Rhodamin-B, PerCP, Texas-Rot, Cy5, Cy7, Allophycocyanin (APC), TruRed, APC-Cy7-Konjugate, Oregon-Grün, Tetramethylrhodamin, Dansyl, Indo-1, Fura-2, FM-1-43, DilC18(3), Carboxy-SNARF-1, NBD, Indo-1, Fluo-3, DCFH, DHR, SNARF oder Monochlorbiman, Calcein ist.
Peptid gemäß Anspruch 8, wobei D YOYO-1, Propidiumiodid, Hoechst-33342, DAPI, Hoechst-33258, SYTOX-Blau, Chromomycin-A3, Mithramycin, SYTOX-Grün, SYTX-Orange, Ethidiumbromid, 7-AAD; Acridin-Orange, TOTO-1, TO-PRO-1, Thiazol-Orange, Propidiumiodid, TOTO-3, TO-PRO-3 oder LDS-751 ist.
Peptid gemäß Anspruch 8, wobei: R⁶ (SEQ ID NO: 1) ist; X R_a-C(=O)CH(NH₂)CH₂N(H)C(=O)CH₂-R_b ist; wobei R_a eine direkte Bindung zum Amino-Ende von R⁶ ist und wobei R_b eine direkte Bindung zum Sauerstoff der Aminooxy-Gruppe von Formel (III) ist; R⁷ Methyl ist; Y eine direkte Bindung ist; und D Alexa-532 ist.
Peptidkonjugat gemäß Formel (IV):
wobei: R⁶ ein Peptid ist; X eine direkte Bindung oder eine Verknüpfungsgruppe ist; R⁷ Wasserstoff, ein (C₁-C₆)Alkyl, eine Amino-Schutzgruppe oder ein Radikal ist, welches eine oder mehrere Aminooxy-Gruppen umfasst; Z eine Verknüpfungsgruppe ist, oder Z eine direkte Einfachbindung oder eine Doppelbindung zwischen N und D ist; und D ein funktionelles Molekül ist; vorausgesetzt, dass, falls D ein Peptid ist, N und D nicht über eine -C=N-O-CH₂-C(=O)-Verknüpfung im Rückgrat(„Backbone") des Peptidkonjugats miteinander verknüpft sind.
Verbindung der Formel (I):
wobei: R¹ Wasserstoff oder eine Amino-Schutzgruppe ist; R² Wasserstoff oder eine Carboxy-Schutzgruppe ist; R ein Radikal der Formel (V) ist:
wobei: R³ Wasserstoff, ein (C₁-C₆)Alkyl, eine Amino-Schutzgruppe oder ein Radikal ist, umfassend eine oder mehrere Aminooxy-Gruppen; R⁴ Wasserstoff oder eine Amino-Schutzgruppe ist; und R⁵ Wasserstoff oder ein (C₁-C₆)Alkyl ist.