EP0996631A1 - Modifizierte nukleinsäureanaloga - Google Patents

Modifizierte nukleinsäureanaloga

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Publication number
EP0996631A1
EP0996631A1 EP98966833A EP98966833A EP0996631A1 EP 0996631 A1 EP0996631 A1 EP 0996631A1 EP 98966833 A EP98966833 A EP 98966833A EP 98966833 A EP98966833 A EP 98966833A EP 0996631 A1 EP0996631 A1 EP 0996631A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
group
probe
nucleic acid
nucleic acids
acid
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP98966833A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Frank Bergmann
Herbert Von Der Eltz
Rupert Herrmann
Stefanie KÖHLER
Volker SCHLÜTER
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Dako Denmark ApS
Original Assignee
Roche Diagnostics GmbH
Dako AS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Roche Diagnostics GmbH, Dako AS filed Critical Roche Diagnostics GmbH
Publication of EP0996631A1 publication Critical patent/EP0996631A1/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/001—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof by chemical synthesis
    • C07K14/003—Peptide-nucleic acids (PNAs)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6832—Enhancement of hybridisation reaction
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
    • Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
    • Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
    • Y02P20/55—Design of synthesis routes, e.g. reducing the use of auxiliary or protecting groups

Definitions

  • the invention relates to a method for the detection of a target containing base sequence in a sample using one or more special hybridization probes, a solid support to which this hybridization probe is bound, and the use of negative charges in partially charged hybridization probes to avoid non-specific binding and to increase the selectivity in binding reactions.
  • nucleic acids in samples has gained considerable importance in analytics in recent years. The validity of such tests has proven to be particularly useful in healthcare, where the detection of pathogens, such as viruses and bacteria, in and outside the body, as well as physical conditions, such as genetic predispositions to diseases, is required. This is all the more true since it has been possible to specifically amplify base sequences from the nucleic acids to be detected, for example with the polymerase chain reaction (PCR, US-A-4,683,202).
  • PCR polymerase chain reaction
  • the samples in which the presence of the nucleic acid to be detected are suspected are brought into contact with a hybridization probe, the probe being selected so that it has a base sequence which is essentially complementary to a base sequence of the nucleic acid to be detected. The fact that the probe hybridizes with the nucleic acid is taken as an indication of the presence of the nucleic acid.
  • hybridization probes were used as hybridization probes.
  • the introduction of automated nucleotide syntheses made it possible to produce short nucleic acids (oligonucleotides) in high purity and with a defined, freely selectable base sequence.
  • the introduction of chemically labeled mononucleoside phosphoramidites made it easy to introduce labein for non-hazardous, non-radioactive detection.
  • hybridization probes have also been found which surprisingly bind very tightly to nucleic acids, although they do not or do not mix the sugar-phosphate backbone that is typical for nucleic acids together with contain other basic units (e.g.
  • the object of the present invention is to partially or completely avoid the disadvantages of the prior art, in particular to utilize the higher affinity of PNA probes while avoiding non-specific bindings and high blank value signals. Additional suppression of amplicon re-hybridization is also an advantage of the present invention (use of low salt conditions).
  • the present invention therefore relates to a molecule which can be hybridized with nucleic acids and has a backbone of monomer units linked linearly to one another, at least one of the monomer units being a non-nucleoside unit. which contains an acid function with a pK a of less than 3.0.
  • the invention also relates to monomers for the production of these molecules. Methods for the detection of nucleic acids using these molecules and the use of acid functions, preferably with a pK_ of less than 3.0, in probes to avoid non-specific binding of the probes to non-complementary base sequences and to solid supports, to increase the selectivity in binding reactions, in primers as well as in molecules for transfection.
  • molecules which hybridize with nucleic acids and which contain non-nucleoside units are known. In principle, they can be divided into molecules that contain only (non-natural) non-nucleoside units and molecules that contain both non-nucleoside and (naturally occurring) nucleoside units. - All these molecules have in common that they are composed of monomer units. These are linearly linked with one another in such a way that an oligomer with a continuous backbone results, to which ligands are bound at substantially uniform intervals.
  • these ligands In order for the oligomer to be able to hybridize with nucleic acids, some of these ligands (generally more than 6 ligands) must be able to recognize and bind nucleobases of the nucleic acid via hydrogen bonding.
  • Such ligands are, for example, the naturally occurring nucleobases, such as A, G, C, T and U, but also artificial heterocycles. such as 7-deazapurine or pseudopyrimidine.
  • these molecules can contain other ligands that do not necessarily contribute to binding with the nucleic acid.
  • Such ligands are, for example, groups which can be used to detect or separate the molecules in methods for the detection of the nucleic acid.
  • Such ligands can attach to the nucleobases.
  • ligands are described, for example, in WO 92/20703, WO 95/14708 (metal complexes), DE 197 12 530.1 and WO 95/16202 (peptides).
  • the subject matter of the present invention differs from that described therein in that at least one of the monomer units used there contains a function with a pK a of less than 3.0.
  • EP-A-0 672 677 describes a synthesis of nucleic acid analogs in which nucleosidic and non-nucleosidic monomer units are mixed with one another.
  • the subject matter of the present invention differs from the molecules described therein in that one of the non-nucleoside monomer units contains an acid function with a pK of less than 3.0.
  • a monomer unit is preferably understood to mean a unit which is part of the above-mentioned oligomer and which contains at most one nucleobase. These units preferably contain only those parts of the molecule which were already present in the monomers used for the synthesis of the oligomers. As a rule, the oligomer is between 6 and 100, preferably 8 and 30, monomer units long.
  • the calculation of the length of the basic unit of each monomer is based on the fact that the geometric length between the connection points of the individual monomers is essentially the same and preferably with the connection points of the monomers. from which the oligomer is made coincides.
  • the length of a backbone unit extends from the carbonyl group of one end of the monomer unit to the amino end of the same monomer unit which is bonded to the subsequent carbonyl group of the next monomer unit.
  • the length of a basic framework unit defined in this way is preferably between 4 and 8. particularly preferably 6 atoms.
  • the modified monomer unit can in principle be any, ie also the last, nucleobase-containing monomer unit of the molecule. However, the modified monomer unit is particularly preferably not the last base-containing monomer unit of the oligomer. The modified monomer unit is particularly preferably within the inner third of the total length of the molecule.
  • the molecule hybridizing with nucleic acids can in principle contain as many modified monomer units as there are monomer units. However, it is preferred that less than half of the monomer units represent a modified monomer unit. The remaining monomer units are preferably not negatively charged; they are preferably neutral.
  • the discrimination between nucleic acids with a different base sequence in one or more positions is favored by the fact that the molecule is selected so that the modified monomer unit is installed approximately in the middle of the molecule, specifically to the nucleic acid to be detected, but not with a nucleic acid to be discriminated therefrom is complementary in this position (mismatch).
  • an acid function is understood to mean a chemical group which is covalently bound to the non-nucleoside unit. In the form bound to the non-nucleoside unit, this group preferably has a pK of less than 3.0.
  • 2- or polybasic acids are preferred.
  • Preferred acid functions are selected from the group of inorganic acids, in particular the groups of sulfonic acids, phosphonic acids or phosphoric acids or their salts.
  • a sulfonic acid residue is preferably a group of the formula -SO 3 H.
  • a phosphonic acid residue is preferably understood to mean a residue of the formula -PO 3 H 2 .
  • Phosphoric acids contain the group -OP (OH) 2 O.
  • the acid function is preferably not involved in the covalent bond between two monomer units.
  • the acid function is preferably bound to a carbon atom of the backbone, which is not the first in addition to a hetero atom (O, P, S or N) used for the linkage with the next monomer.
  • the acid function can either directly or via a spacer A 'with the basic unit of the monomer unit, preferably one atom of the continuous chain of atoms in the backbone, e.g. B. a C atom. be connected.
  • the acid function together with the spacer A ' is also referred to below as a group R containing an acid function with a pK a of less than 3.0.
  • the spacer A ' connects an atom of a series of linearly consecutive atoms of the basic structure with an atom of the acid function. In principle, these spacers can be between 1 and 20 atoms long.
  • a 2 is a substituted or unsubstituted alkylene, alkynylene or alkenylene
  • R 6 is independently hydrogen. Acyl or alkyl,
  • a and c independently of one another a number from 0 to 2
  • b is a number from 1 to 10
  • d is a number from 1 to 4
  • the spacer can be installed in either of the two possible orientations.
  • Alkyl Acyl, alkylene. Alkinylene and alkenylene radicals in the definition of A 2 and R 6 preferably have 1 to 3 carbon atoms. Substituents can be chosen, for example, from the group hydroxyl, halogen (e.g. Cl, Br or F) or amino.
  • the molecule according to the invention is preferably an oligomer hybridizing with nucleic acids and containing at least one non-nucleoside monomer unit of the formula I.
  • L is selected from the group hydrogen, hydroxyl, (C, - C 4 ) - alkanoyl, nucleobase-binding group, (C 6 -C 14 ) aromatics, heterocycles with nitrogen, oxygen or / and sulfur atoms, intercalators and reporter groups,
  • A is a spacer with a length of 1 to 3 atoms.
  • x is a number between 0 and 3
  • B is a basic unit with a length of between 4 and 8 atoms
  • R is a group containing an acid function with a pK_ of less than 3.0
  • a preferred alkanoyl group is the acetyl group.
  • Nucleobases are to be understood as the naturally occurring bases A, C, G, T and U.
  • a nucleobase-binding group is a group which can form with such a nucleobase via interactions specific to hydrogen bonds. In addition to the (complementary) natural nucleobases, this also includes unnatural nucleobases, such as. B. 7-deazaguanosine or pseudopyrimidines.
  • Aromatics can be both substituted and unsubstituted. Particularly suitable substituents are hydroxyl, C 1 -C 2 -alkoxy or amino. Preferred aromatics are the phenyl, pyrenyl and naphthyl radicals.
  • Heterocycles are cyclic compounds that contain one or more heteroatoms. selected from the group consisting of O, N and S, which can be non-aromatic or aromatic. They too can be substituted by the radicals mentioned for aromatics.
  • heterocycles are the pyridyl radical and the piperidyl radical.
  • Intercalators are molecules that can be inserted into the base-base interaction of neighboring bases, e.g. B. acridine.
  • a reporter group can be used to detect or immobilize the molecule. Immunologically active compounds and biospecific interactions from binding molecules from reporter groups are particularly suitable.
  • a particularly preferred group of reporter groups are the markings or labels.
  • the electrochemiluminescent ruthenium bispyridyl complexes are particularly preferred here.
  • L is particularly preferably bonded via a spacer A to a nitrogen atom, particularly preferably to an amine nitrogen atom, in B.
  • the group R is likewise preferably bound to the backbone unit, but not directly to the nitrogen atom to which L is bound.
  • Particularly preferred molecules have at least one monomer unit of the formula II
  • E 'and F' independently CO, CS. SO. SO 2 or NR 1 ,
  • R is selected from the group hydrogen and (C, -C 3 ) - alkyl
  • N is an amine nitrogen atom.
  • C and D are independently selected from the group (CR 2 R 3 ) n and CR 2 R 3 CR 4 R 5
  • R 2 , R ⁇ R 4 and R 5 are independently selected from the group
  • n is a number between 1 and 4.
  • At least one of the radicals R 2 -R 3 or R -R 5 is a group R.
  • the invention also relates to a molecule of the formula IV
  • E and F independently COOX, CSOX. SO 2 X. SO, X or NR 1 Y,
  • R 1 is selected from the group consisting of hydrogen and (C, -C 3 ) -alkyl
  • X is selected from the group consisting of hydrogen, the protective groups and the activation groups,
  • Y is selected from the group hydrogen and protective group
  • N is an amine nitrogen atom
  • C and D are independently selected from the group (CR 2 R 3 ) ⁇ and CR 2 R 3 CR 4 R 5
  • R 2 , R 3 , R 4 and R 5 are independently selected from the group
  • n is a number between 1 and 4.
  • these molecules can be used for the synthesis of the oligomers according to the invention.
  • Particularly preferred are those molecules in which one of the radicals E and F is a protected amino or carboxylic acid function and the other either a reactive group, such as a carboxylic acid or primary amino group, or a corresponding activated derivative, e.g. B. an active ester.
  • An activation group is, for example, 1-oxybenzotriazole.
  • the acid function is preferably protected with the aid of a protective group, preferably in the form of an ester which can be cleaved without the oligomer being fragmented.
  • Such protective groups are, for example, benzyl and ⁇ -cyanoethyl.
  • synthesis methods known, for example, from chemical oligonucleotide synthesis or the synthesis of peptide nucleic acids can be used analogously to the synthesis of the oligomers according to the invention or those used according to the invention.
  • a particularly suitable monomer is shown in Figure 1 (compound 3). It is a derivative of the amino acid homoserine. This compound is at the amino end of the backbone monomer unit with a t-butyloxycarbonyl (Boc) protective group on any exocyclic amino groups of the base with a benzyloxycarbonyl (Z) group and at the hydroxyl group of the homoserine by replacing the hydrogen with a di- Benzyl ester protected phosphate group.
  • Boc t-butyloxycarbonyl
  • FIG. 1 also shows a compound (4) in which the amino group of the basic unit is protected with a monomethoxytrityl protective group and the exocyclic amino functions of the base are protected with an acyl protective group (benzoyl, isobutyryl).
  • the homoserine hydroxyl group is esterified with a di- ⁇ -cyanoethyl-protected phosphate residue.
  • Compound 5 shows the corresponding deprotected monomer unit built into the oligomer.
  • FIG. 1 also shows the corresponding monomer 1 based on serine as the amino acid and the deprotected monomer unit 2.
  • compounds 6. 7, 8 and 9 the phosphonates and sulfonates based on homoserine are shown.
  • the spacers between the acid function (PO 4 2 “ , PO 3 2 ' and SO 3 " ) and the carbon atom of the linear backbone chain preferably follow the formula (CH 2 ) n , n taking values from 1 to 6, preferably 2 to 4.
  • the invention also relates to a method for detecting the presence or absence of a nucleic acid in a sample, which is suspected. that it contains one or more non-detectable nucleic acids (nucleic acid (s) to be discriminated), the base sequence of which differs from the base sequence of the nucleic acid in one or more positions, comprising the steps of contacting a probe which contains a base sequence which is to be detected , but is not complementary to the other nucleic acids, and determining whether binding of the probe to a base sequence complementary to the base sequence has taken place, characterized in that the probe is a nucleic acid hybridizable molecule with a backbone of linearly linked monomer units, at least one of the monomer units is a non-nucleoside unit. which contains an acid function with a pK a of less than 3.0 is used.
  • the method according to the invention is a special embodiment of the so-called hybridization tests.
  • the basic features of the specialist on the Are known in the field of nucleic acid diagnostics. Insofar as experimental details are not set out below, the entire content is "nucleic acid hybridization". Edited by BD Harnes and SJ Higgins, IRL Press, 1986. B. in Chapters 1 (Hybridization Strategy), 3 (Quantitative Analysis of Solution Hybridization) and 4 (Quantitative Filter Hybridization), Current Protocols in Molecular Biology, Ed. FM Ausubel et al. J. Wiley and Son. 1987, and Molecular Cloning, Ed. J. Sambrook et al. CSH, 1989.
  • a probe is generally understood to mean a nucleic acid-binding molecule which has been made distinguishable from natural nucleic acids by attaching a chemical group.
  • the chemical group can be an immobilizable group, on the one hand, or a label.
  • This probe contains a base sequence which contains a base sequence which is complementary to a sequence of the nucleic acid to be detected, but not to a sequence of the other nucleic acids which are not to be detected.
  • This sequence is preferably longer than 10 bases.
  • the sequence is preferably continuous and uninterrupted.
  • the length of the sequence is preferably 10 or more bases, particularly preferably 15 or more bases.
  • the probe can also contain further bases which do not influence the discriminatory properties of the probe, since they do not lead to a stronger binding of the probe to a non-detectable nucleic acid than to the one to be detected. In general, this is ensured if these bases are not complementary to a base sequence which is located directly next to a potential binding sequence for the probe on a non-detectable nucleic acid.
  • additional bases can be used, for example, to specifically recognize the probe itself via a nucleotide sequence, e.g. B. for use as a universal detection probe.
  • a label in the sense of the present invention consists of a directly or indirectly detectable group L.
  • Directly detectable groups are, for example, radioactive ( 32 P), colored or fluorescent groups.
  • Indirectly detectable groups are, for example, immunologically or enzymatically active compounds, such as antibodies, antigens. Haptens or enzymes or enzymatically active partial enzymes. These are detected in a subsequent reaction or reaction sequence. Haptens are particularly preferred. because the oligomers marked with them Detection via a subsequent reaction with a labeled antibody against the hapten can easily be made.
  • the invention is particularly effective for lipophilic labels such as biotin. Fluorescein. Pyrenyl or ruthenium organic complexes.
  • An immobilizable group is understood to be a chemical residue which can be used to bind the probe to a solid phase. Suitable for this are therefore both activatable residues (e.g. photoactivatable), but also partners of a specific binding pair, such as receptors and associated ligands, partners of an immunological reaction, such as. B. Haptens. Antigens or antibodies, or vitamins or receptors for these vitamins. Haptens or biotin and its derivatives are particularly preferred as the immobilizable group. Biotin is particularly preferred.
  • the solid phase, to which the probe can be bound by means of the immobilizable group has a corresponding binding partner or a corresponding reactivity. In the case of biotin, the solid phase can therefore have a coating of streptavidin.
  • An analyte nucleic acid is understood to mean the nucleic acid which is the aim of the detection. These are to be understood as meaning nucleic acids of any origin, for example viroid nucleic acids. viral. bacterial or cellular origin. They can be in solution, suspension, but also fixed to solids or in cell-containing media. Cell smears, fixed cells, tissue sections or fixed organisms are present. The nucleic acids are preferably in solution (in vitro).
  • the reaction sequence is usually started by making the analyte nucleic acid available with appropriate reagents. Changes in the pH (alkaline), heat, repetition of extreme temperature changes (freezing / thawing), changes in the physiological growth conditions (osmotic pressure), exposure to detergents, chaotropic salts or enzymes (e.g. proteases, lipases), contribute alone or in combination to the release of the nucleic acids.
  • Denaturation of nucleic acids means separation of nucleic acid double strands into single strands.
  • a specific detection is understood to mean a method by which, if desired, certain nucleic acids can also be selectively discriminated in the presence of others.
  • Nucleic acids can be detected. However, it is also possible to detect a group of nucleic acids with a partially identical or similar nucleotide sequence. To detect double-stranded nucleic acids, either of the two complementary strands can be included.
  • the specific sequence of the probe is preferred to a length of more than 10, preferably more than 15 bases to more than 90, preferably more than 95 and particularly preferably 100% complementary to a sequence of the same number of continuously successive bases of the nucleic acid to be detected.
  • the present invention has particularly good effects for sequences which are particularly rich in purine, ie contain more than 50% purines. It is particularly preferred for sequences which contain 4 or more purines in a continuous row. z. B. G included.
  • the monomer unit modified according to the invention is preferably within this homopurine range.
  • a nucleic acid or nucleic acid sequence that is essentially complementary to a nucleic acid means nucleic acids or sequences that can hybridize with the corresponding nucleic acid, the nucleotide sequence of which in the hybridizing region is either exactly complementary to the other nucleic acid or differs in a few bases from the exactly complementary nucleic acid.
  • the specificity depends on both the degree of complementarity and the hybridization conditions.
  • Two bases are usually complementary to one another if they can form base pairings with one another, which preferably follow the Watson-Crick rule or the Hoogsteen base pairing.
  • the complementarity condition refers to two or more base sequences with directly adjacent bases with a length of 10 or more bases.
  • Exactly complementary means 100% complementary: if there are differences, these should be less than 10%, preferably less than 5%, of the bases within the hybridizing region. The differences must of course be chosen so that they do not significantly impair the specificity of the test for the nucleic acid to be detected.
  • the nucleic acid to be detected can be the analyte nucleic acid itself. However, it can also be a nucleic acid which was prepared from the analyte nucleic acid by pretreatment in the sample liquid.
  • nucleic acid to be detected has a size of at least 40 bp.
  • the nucleic acid to be detected is preferably the product of an upstream specific or non-specific nucleic acid amplification.
  • nucleic acid amplification methods are known for example from EP-A-0 201 184, EP-A-0 237 362, EP-A-0 329 822, EP-A-0 320 308 or WO 88/10315.
  • the analyte nucleic acid serves as a template nucleic acid for the production of the nucleic acid that is ultimately to be detected.
  • the nucleic acid can also be a nucleic acid produced by cloning and in vivo propagation.
  • a method for detecting a specific virus, e.g. B. HGV, in a body fluid (z. B. serum) contain as a first step the lysis of the virus envelope.
  • Methods for the lysis of cell walls are known to the person skilled in the art.
  • the lysis can be carried out by treatment with alkali hydroxide solutions.
  • auxiliary substances e.g. B. detergents is possible.
  • viruses which are only present in low concentrations in body fluids eg hepatitis C virus
  • in vitro nucleic acid amplification eg via the polymerase chain reaction or the other amplification methods mentioned above ).
  • a large number of nucleic acids are formed with the analyte nucleic acid as template nucleic acid, which are then detected in the method according to the invention.
  • the method according to the invention could also be preceded by several steps.
  • bacterial samples are disrupted if necessary after in vivo multiplication of the bacteria under conditions which bring about the lysis of the bacterial cell wall (eg proteinases. Alkali).
  • an in vitro amplification of the bacterial analyte nucleic acids can follow.
  • the result of the various pretreatments is a sample liquid which contains nucleic acids in solution and which may contain the reagents used in the preparatory steps and possibly destroyed cell components.
  • the probes according to the invention show an inverted image compared to DNA probes.
  • DNA probes With DNA probes, the signal dynamics and sensitivity increase with increasing salt concentration.
  • PNA probes modified according to the invention it has been shown that the preferred concentration of salt (NaCl) is between 0 and 150 mM.
  • FIG. 2 A comparison of probes according to the invention against DNA probes is shown in FIG. 2.
  • the first diagram shows the influence of sodium chloride concentration on the sensitivity of an HGV test using a ruthenium complex-labeled DNA probe at different salt concentrations.
  • the second diagram shows the same experiment with a PNA probe according to the invention with the same sequence, the ruthenium complex being bound to the PNA backbone via two glutamine residues. and the backbone also contains two glutamine residues. It can be seen that the salt dependency for the DNA probe is different compared to the PNA probe, even though the probe contains negative charges. Especially at low salt concentrations, at which the renaturation of the amplicon double strand is suppressed. the signal dynamics and sensitivity are optimal when using partially negatively charged PNA probes in contrast to DNA probes.
  • the third diagram shows the salt dependency of a probe that contains two lysine residues (positive charges) in the backbone.
  • the signal dynamics and sensitivity are hardly dependent on salt, but the blank value signals are greatly increased, especially at low salt concentrations.
  • the salt dependence is an unmodified one. shown in the backbone neutral PNA probe with two glutamic acid residues as a linker to the ruthenium complex.
  • the optimal NaCl concentration is 50 mM.
  • the blank signal is significantly increased.
  • the label on the probe is used, whose presence in the complex of nucleic acid to be detected and the probe is used to indicate the presence of the nucleic acid to be detected. This is preferably done after having separated any excess probe from the hybrid. This can be done, for example, by trapping the hybrid with the help of a solid-phase capture probe.
  • the liquid phase is removed from the solid phase (e.g. from the vessel, the porous material or the pelleted beads). The solid phase can then be washed with a suitable buffer.
  • the amount of the hybrid bound to the solid phase from the nucleic acid, detection probe and capture probe to be detected can be determined in a manner known in principle, e.g. B. in the manner of a sandwich hybridization process.
  • the hybrid is implemented with the detection probe according to the invention, which is complementary to a different nucleotide sequence of the nucleic acid to be detected than the capture probe, and hybridizes with it.
  • This forms a hybrid of the detection probe, the nucleic acid to be detected and the capture probe on the solid phase.
  • the detection probe is preferably added to the sample together with the capture probe with the hybridization solution.
  • the amount of label is determined fluorometrically.
  • the detectable group is indirectly detectable z.
  • the hybrid is preferably reacted with a labeled antibody against the hapten, as described analogously in EP-A-0 324 474.
  • the label on the antibody can be, for example, a color or fluorescent label or, preferably, an enzyme label, such as ⁇ -galactosidase, alkaline phosphatase or peroxidase.
  • enzyme labeling the amount of nucleic acid is monitored via the mostly photometric chemiluminometric or fluorometric monitoring of a reaction of the enzyme with a chromogenic. chemiluminogenic or fluorogenic substrate measured.
  • the measurement signal is a measure of the amount of originally present nucleic acid to be detected and thus possibly of organisms to be detected.
  • the non-nucleosidic differs particularly preferably. modified basic scaffold unit at a position in which the nucleic acid to be detected differs from one of the non-detectable nucleic acid present in the sample, from at least one of the two adjacent basic scaffold units, which is not intended to mean the base.
  • modified basic scaffold unit at a position in which the nucleic acid to be detected differs from one of the non-detectable nucleic acid present in the sample, from at least one of the two adjacent basic scaffold units, which is not intended to mean the base.
  • This can be realized, for example, in that the adjacent basic unit does not have a negative charge or does not have the acid function, or that it is based on another monomer unit. e.g. another amino acid, based in the linear part of the backbone.
  • the sample which contains the nucleic acid to be detected in addition to other nucleic acids is treated in such a way that the nucleic acid to be detected is released from cells which may be present and any proteins adhering to it are denatured. This can be followed by isolation of the nucleic acids from this mixture.
  • the nucleic acids freed from any inhibitors of the amplification can then be amplified, e.g. B. be subjected to a PCR. It is preferred to use one of the primers labeled with an immobilizable group. After completion of the amplification, the amplificates are detected by hybridization with a probe according to the invention.
  • the probe is preferably selected such that it hybridizes with the amplificates in a region between the hybridization positions of the primers.
  • the detection takes place after immobilization of the amplificates and hybridization with the probe.
  • magnetic particles can preferably be used which recognize the immobilizable group of the amplificates.
  • the reagent solution with the excess probes is preferably removed before the detection. l ⁇
  • the oligomers according to the invention are particularly suitable for the detection of mutations, alleles or polymorphisms as well as for the typing or subtyping of microorganisms.
  • the oligomers preferably contain both such an acid function within the binding region of the oligomer with the nucleic acid to be detected and also a negative charge outside the binding region. e.g. at the end (s) or in the linker between the binding area and the marking.
  • oligomers in which less than 80. preferably less than 50 and particularly preferably less than 40%, but at least one of the bases is attached to a negatively charged basic unit, e.g. B. one by an acid function with a pK a of less than 5.0, preferably less than 3.0. modified, bound, bind significantly less non-specifically to nucleic acids (e.g. length markers) that are relatively unrelated in their sequence. You therefore avoid unspecific binding in reactions to bind the probe to complementary base sequences (Table 1).
  • a negatively charged basic unit e.g. B. one by an acid function with a pK a of less than 5.0, preferably less than 3.0. modified
  • relatively unrelated nucleic acids nucleic acids which do not contain a continuous and uninterrupted sequence of more than 10, preferably more than 15 bases, which are more than 50% complementary to an equally long uninterrupted and continuous sequence of bases of the probe. Blank values, especially for electrochemiluminescence measurements. are reduced.
  • the oligomers according to the invention are distinguished by an increased selectivity in binding reactions. In contrast to oligomers. where a positive charge was attached to the backbone (e.g. T-Lys-containing PNAs) and neutral PNAs, significantly lower blank value signals were obtained, especially with decreasing salt concentration (Table 1).
  • the oligomers according to the invention are also less prone to non-specific binding to solid phases, e.g.
  • hydrophilic surfaces such as particles or vessels coated with streptavidin.
  • non-specific binding is understood to mean a binding that is not based on base-base interaction.
  • Neutral and very particularly negatively charged surfaces are particularly suitable for the use of the oligomers according to the invention.
  • PNAs with a glutamic acid-containing backbone are described. Such oligomers can also be used to avoid unspecific binding non-complementary nucleic acids or solid phases can be used. 18mers and 14mers were used as probes in comparative experiments. The probes differ as shown in Table 2.
  • the amplificate of an HBV test is used. This amplificate has no complementarity to the probe used.
  • no nucleic acids are added, so that only the non-specific binding of the probe to the surface of the magnetic particle is measured.
  • Cases 1 and 2 also show. that unspecific binding to nucleic acids, which are not similar to the sequence complementary to the probe sequence, also contribute to the blank signal. This applies both to the primers that are inevitably contained in the reaction mixture and to controls, such as standards. Here, too, a reduction in the blank value is determined by using negatively charged probes. This contribution was even completely eliminated in the present experiment.
  • Case 4 shows that in the presence of amplicons. which, for example, can be attributed to the simultaneous amplification of a further analyte in the reaction mixture, a considerable blank value signal is found which can be practically eliminated by using negatively charged probes.
  • the reaction preferably takes place in a plastic vessel.
  • vessels which are normally used as sample storage vessels in conventional automatic analyzers. Examples are vessels made of polystyrene, polyethylene or luran.
  • the vessel in which the treatment takes place is preferably already in an automatic analyzer, particularly preferably on a sample rotor, which allows a sampling device to access individual sample vessels located on the rotor.
  • an automatic analyzer is described for example in EP-A-0 361 830.
  • These oligomers are also suitable. in which less than 80%, preferably less than 50%, but at least one of the bases are bound to negatively charged basic framework units, particularly preferably the oligomers according to the invention. excellent as a primer.
  • Oligomers according to the invention are particularly suitable as primers. which has an extendable hydroxyl group, e.g. B. Nucleosides. and the next monomer unit is a non-nucleoside unit which has an acid function with a pK a of less than 5.0. preferably contains less than 3.0.
  • primers which has an extendable hydroxyl group, e.g. B. Nucleosides. and the next monomer unit is a non-nucleoside unit which has an acid function with a pK a of less than 5.0. preferably contains less than 3.0.
  • oligomers can. in which less than 80%, preferably less than 50%, but at least one of the bases are bound to negatively charged basic framework units, particularly preferably the oligomers according to the invention compared to unmodified, neutral PNAs, e.g. B. with so-called transfection reagents, for. B. DOSPER or DOTAP. are better introduced into cells.
  • transfection reagents are for nucleic acids from Bio Forum 6/96. Page 264.
  • the oligomers according to the invention can therefore be used well in antisense technology or as gene probes.
  • the negative charges can in principle be distributed in the molecule.
  • the negative charges in the form of a group described above with a pK a of less than 5.0 (3.0) to a base-bearing basic unit, but it is also possible to bind them outside the sequence of base-containing basic units, e.g. . B. at one or both ends of the oligomers or to the nucleobase itself (eg DE-19712530). It has been found that in this case the negative charges advantageously have additional, non-base-bearing bases. scaffolding units.
  • the label or the immobilizable group also being located on one or more of these additional basic unit units.
  • the additional basic framework units also act as a linker between the label and the base sequence specific for the nucleic acid to be detected. Those probes in which both negative charges are present within the base sequence and in the linker appear to be particularly advantageous.
  • the aqueous phase is extracted three times with 200 ml of ethyl acetate.
  • the combined organic phases are then dried over Na : SO. It is filtered off and rotated in.
  • the residue is dissolved in 100 ml of benzene and mixed with 5.80 g (30.5 mmol) of p-toluenesulfonic acid.
  • the mixture is boiled under reflux for 1 hour, then the solution is concentrated to a volume of about 20 ml and the product is crystallized by slowly adding diethyl ether.
  • the solid is filtered off and recrystallized from methanol / diethyl ether. After drying under high vacuum 1 1.1 g (77%) of the product are obtained as p-toluenesulfonic acid salt in the form of colorless crystals.
  • the organic phase is then washed successively with 150 ml of saturated sodium bicarbonate solution, semi-saturated potassium hydrogen sulfate solution and and saturated sodium chloride solution, then over Na ; SO 4 dried. It is filtered off and rotated in. The residue is purified on a silica gel column using ethyl acetate / hexane 2: 1 as the elution system. The product is then crystallized using ethyl acetate / diethyl ether. Yield: 3.6 g (57%).
  • the synthesis was carried out on an ABI 433 A peptide synthesizer from Applied Biosystems with modified software (T. Koch et al., J. Peptide Res. 1997, 49, 80-88). The syntheses were carried out on a 5 ⁇ mol scale in a 3 ml reaction vessel, a smaller measuring loop (150 ⁇ l) was used.
  • the monomer components (PNA components: Boc-T-OH, Boc-A (Z) -OH, Boc-C (Z) -OH and Boc-G (Z) -OH, available from Perseptive Biosystems, Boc-T-Glu (Bzl) -OH prepared according to Example 1; amino acid derivatives: Boc-Glu (OBzl) -OH, available from Novabiochem AG; Ru (ruthenium) (bpy) 3 -COOH from Boehringer Mannheim) were in NMP dissolved and injected into individual cartridges (140 ⁇ l, 0.26M).
  • the MBHA carrier material (Novabiochem AG) derivatized with Boc-Gly (Novabiochem AG) is filled into the 3 ml reaction vessel and attached to the synthesizer.
  • Trifluoroacetic acid / m-cresol 95 5 (2 x 180 sec); Bottle position 2) is used to split off the Boc protecting group.
  • the PNA is split off from the resin and the protective groups in a manual step outside the device in a special, lockable glass frit.
  • the resin is first washed with trifluoroacetic acid, then shaken for 2 hours with 2 ml of trifluoromethanesulfonic acid / trifluoroacetic acid / m-cresol 2: 8: 1.
  • the separation solution is sucked into a centrifuge glass. It is washed with 1 ml of trifluoroacetic acid and the PNA is precipitated with diethyl ether (approx. 10 ml). The precipitate is separated from the supernatant solution after centrifugation. Then it is washed twice with diethyl ether.
  • the PNA was analyzed by means of an analytical RP18-HPLC (DeltaPak. Waters, 5 ⁇ , 125 ⁇ 4 mm) with a water / acetonitrile / 0.1% trifluoroacetic acid gradient at 60 ° C.
  • the PNA was purified by preparative RP18-HPLC (Polygosil C-18 / Macherey-Nagel, 5 ⁇ , 250 x 20 mm) with a water / acetonitrile / 0.1% trifluoroacetic acid gradient at 60 ° C. until chromatographic uniformity.
  • the analysis of the purified PNA is carried out with MALDITOF-MS.
  • a comparison of a detection probe according to the invention with unmodified or otherwise modified PNA-Ru probes using an identical sequence illustrates the advantages of the invention.
  • a DNA probe was used as a reference; the experiment was carried out using the example of HGV. a) amplification
  • plasmids were used which were amplified by means of PCR.
  • the following primers were used to prepare the specific amplificates:
  • HGV primer sequences coding-strand:
  • HBV primer sequences coding-strand:
  • HBV 10 ng plasmid pJCP (HGV: nucleotides 1-550 cloned in pGEM3z; Stratagene: HBV:
  • the amplification was carried out with the following temperature profile on a Perkin Elmer Cycler 9600:
  • the PCR product was purified after the end of the reaction using the High pure PCR template purification kit (BM Order No. 1 796 828).
  • the PCR product in the specified dilutions was used to evaluate the various PNA-Ru probes.
  • the detection was carried out with the aid of electrochemilinescence (ECL) on an Elecsys® 1010 (Boehringer Mannheim GmbH).
  • ECL electrochemilinescence
  • the reaction temperature for all steps is 37 ° C.
  • 10 ⁇ l of sample are first mixed with 35 ⁇ l of denaturing reagent and incubated for 5 minutes.
  • 120 ⁇ l of the probe solution 50 ng / ml in hybridization buffer
  • 35 ⁇ l of streptavidin-coated magnetic microparticles are added to the reaction mixture and incubated again for 10 minutes.
  • the hybrids bio-labeled HGV strand with Ru-labeled detection probe
  • the samples are transferred to the measuring cell and the microparticles are bound there by a magnet.
  • the chemiluminescence then takes place in the measuring cell.
  • the Ru complex When catalysed by TPA, the Ru complex emits flashes of light. the number of which are determined in the measuring cell.
  • the chemistry for electrocheminoluminescence is in J. Electrochem. Soc. 137: 3127-3131.
  • A. DNA probe A. DNA probe:
  • the probes were tested in the experiment described above, the result is shown in Table 4.
  • the first part (4a) shows the mean value of the signals from a double determination
  • the second (4b) shows the ratio of the signal to the background signal.
  • the sensitivity does not deteriorate when the salt concentration in the hybridization buffer is low.
  • the competition reaction between unlabeled strand from the PCR reaction with the detection probe becomes lower Salt concentration shifted towards the probe, which enables a large dynamic measuring range with very good sensitivity.
  • the modified probe according to the invention allows a particularly large dynamic measuring range to be covered, which is particularly important for quantitative detection
  • HGV PCR product 1 5 424834 666051 1184377 332695 1570831 945988 1084935 247646 1687111 463255
  • HGV PCR product 1 5 483.31 748.37 841.18 268.52 16.72 65.95 18.27 9.91 101.76 111.04
  • Example 3 A length standard marked with biotin (corresponding to Cat.No. 1062590, only 5 'biotin marked) was used as sample material.
  • the concentration of the stock solution: 1 ⁇ l corresponds to 250 ng DNA.
  • A. DNA probe A. DNA probe:
  • HGV PCR product 1 5 246843 424834 666051 1211085 1184377 332695 1331089 823696 2802342 1274087
  • Length marker VI 1 100 739 743 900 1075 1266 1836 9225 10845 25825 7712
  • HBV PCR product 1 5 834 856 904 921 1123 1225
  • HGV PCR product 1 5 280.5 483.3 748.4 1005.9 841.2 268.5 431.2 185.9 499.8 661.9
  • Length marker VI 1 100 0.8 0.8 1.0 0.9 0.9 1.5 3.0 2.4 4.6 4.0
  • HBV PCR product 1 5 0.9 1.0 1.0 0.8 0.8 1.0
  • HGV was determined with the aid of a DNA probe (diagram 1), a positively charged PNA probe (diagram 3) and two negatively charged probes (diagrams 2 and 4).
  • the salt content (0; 50; 150; 200; 300; 625 mM) was varied. The measurement results are shown graphically in FIG. The results are discussed in the description.

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Abstract

Oligomere mit mindestens einer nicht-nukleosidischen Einheit, die eine Säurefunktion mit einem pKa von weniger als 3.0 enthält, eignen sich besonders als Nachweissonden für Nukleinsäuren, da die unspezifischen Wechselwirkungen verglichen mit unmodifizierten Oligomeren herabgesetzt sind und gerade bei niedrigen Salzkonzentrationen des Hybridisierungspuffers eine hohe Signaldynamik und Sensitivität bei niedrigem Leerwertsignal erreicht werden kann. Darüber hinaus eignen sie sich auch als Primer für Verlängerungsreaktionen mit Hilfe von Polymerasen und zur Transfektion.

Description

Modifizierte Nukleinsäureanaloga
Gegenstand der Erfindung sind ein Verfahren zum Nachweis eines basensequenzhaltigen Targets in einer Probe unter Verwendung einer oder mehrerer spezieller Hybridisierungssonden, ein fester Träger, an den diese Hybridisierungssonde gebunden ist sowie die Verwendung negativer Ladungen in partiell geladenen Hybridisierungssonden zur Vermeidimg unspezifischer Bindungen und zur Erhöhung der Selektivität bei Bindereaktionen.
Nachweise von Nukleinsäuren in Proben haben in den letzten Jahren in der Analytik beträchtlich an Bedeutung gewonnen. Insbesondere im Gesundheitswesen, wo der Nachweis von Krankheitserregern, wie Viren und Bakterien, in und außerhalb des Körper, sowie von körperlichen Zuständen, wie genetischen Veranlagungen für Krankheiten erforderlich ist, hat sich die Aussagekraft solcher Tests als nützlich erwiesen. Dies gilt umso mehr, seit es möglich ist, Basensequenzen aus den nachzuweisenden Nukleinsäuren spezifisch zu ampli- fizieren, beispielsweise mit der Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR, US-A-4,683,202). Im Allgemeinen werden die Proben, in denen die Anwesenheit der nachzuweisenden Nuklein- säure vermutet wird, mit einer Hybridisierungssonde in Kontakt gebracht, wobei die Sonde so gewählt wird, daß sie eine Basensequenz aufweist, die im wesentlichen komplementär zu einer Basensequenz der nachzuweisenden Nukleinsäure ist. Die Tatsache der Hybridisierung der Sonde mit der Nukleinsäure wird als Hinweis für die Anwesenheit der Nukleinsäure gewertet.
Als Hybridisierungssonden wurden zunächst fragmentierte, radioaktiv markierte Nukleinsäuren verwendet. Diese hatten jedoch den Nachteil, daß sie umständlich herzustellen und recht unrein waren. Durch Einfuhrung automatisierter Nukleotidsynthesen wurde die Herstellung kurzer Nukleinsäuren (Oligonukleotide) in hoher Reinheit und mit definierter, frei wählbarer Basensequenz möglich. Die Einführung chemisch markierter Mononukleo- sidphosphoramidite ermöglichte die einfache Einführung von Labein zum ungefährlichen, nicht-radioaktiven Nachweis. In jüngerer Zeit wurden auch Hybridisierungssonden gefunden, die überraschenderweise sehr fest an Nukleinsäuren binden, obwohl sie das für Nukleinsäuren typische Zucker-Phosphat-Grundgerüst nicht oder gemischt zusammen mit anderen Grundgerüsteinheiten enthalten (z. B. WO 92/20703. EP-0 672 677 und EP-0 700 928). Diese Sonden sind einerseits hochaffin zu natürlichen Nukleinsäuren mit komplementärer Sequenz, sind andererseits aber auch hochselektiv. Aus Angew. Chem. 1996, 108. 17, 2068-2070), sind PNA bekannt, in deren Rückgrat eine Glycin-Einheit durch eine Glutaminsäure-Einheit ersetzt ist. Dadurch wird die Löslichkeit der Sonde erhöht. Es wurde auch festgestellt, daß ein Ersatz von Glutaminsäure durch Lysin keine wesentliche Änderung der Schmelzpunkterniedrigung (ΔTm) des vollständig komplementären PNA/DNA-Hybrids verglichen mit einem PNA/DNA-Hybrid mit einem mismatch mit sich bringt. Nachteile der bekannten PNA-Sonden sind die starke Tendenz zu unspezifischen Bindungen, zu hohen Leerwertsignalen und mangelnder Löslichkeit. DNA-Sonden haben den Nachteil, daß die Renaturierung eines Amplicon-Doppelstranges mit der Hybridisierung der (D)NA-Sonde in Konkurrenz tritt.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, die Nachteile des Standes der Technik teilweise oder vollständig zu vermeiden, insbesondere die Ausnutzung der höheren Affinität von PNA-Sonden unter Vermeidung von unspezifischen Bindungen und hohen Leerwertsignalen. Auch die zusätzliche Unterdrückung der Rehybridisierung des Amplicons ist ein Vorteil der vorliegenden Erfindung (Verwendung von Niedrigsalzbedingungen).
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher ein mit Nukleinsäuren hybridisierbares Molekül mit einem Grundgerüst aus linear miteinander verknüpften Monomereinheiten, wobei mindestens eine der Monomereinheiten eine nicht-nukleosidische Einheit ist. die eine Säurefunktion mit einem pKa von weniger als 3.0 enthält. Ebenfalls Gegenstand der Erfindung sind Monomere für die Herstellung dieser Moleküle. Verfahren zum Nachweis von Nukleinsäuren mit Hilfe dieser Moleküle sowie die Verwendung von Säurefunktionen, bevorzugt mit einem pK_ von weniger 3.0, in Sonden zur Vermeidung unspezifischer Bindungen der Sonden an nicht-komplementäre Basensequenzen sowie an feste Träger, zur Erhöhung der Selektivität in Bindereaktionen, in Primern sowie in Molekülen zur Trans- fektion.
Mit Nukleinsäuren hybridisierende Moleküle, die nicht-nukleosidische Einheiten enthalten, sind prinzipiell bekannt. Sie lassen sich prinzipiell einteilen in Moleküle, die nur (nichtnatürliche) nicht-nukleosidische Einheiten enthalten, und Moleküle, die sowohl nicht- nukleosidische als auch (natürlich vorkommende) nukleosidische Einheiten enthalten. Ge- meinsam ist all diesen Molekülen, daß sie aus Monomereinheiten aufgebaut sind. Diese sind so miteinander linear verknüpft, daß sich ein Oligomer mit einem fortlaufenden Grundgerüst (Backbone) ergibt, an welchem in im wesentlichen gleichmäßigen Abständen Liganden gebunden sind. Damit das Oligomer die Fähigkeit zur Hybridisierung mit Nukleinsäuren erhält, müssen einige dieser Liganden (im allgemeinen mehr als 6 Liganden) Nukleobasen der Nukleinsäure über Wasserstoffbrückenbindung erkennen und binden können. Solche Liganden sind beispielsweise die natürlich vorkommenden Nukleobasen, wie A, G, C, T und U, aber auch künstliche Heterozyklen. wie 7-Deazapurine oder Pseudopyrimidine. Darüber hinaus können diese Moleküle noch weitere Liganden enthalten, die nicht unbedingt zur Bindung mit der Nukleinsäure beitragen. Solche Liganden sind beispielsweise Gruppen, die dem Nachweis oder der Abtrennung der Moleküle in Verfahren zum Nachweis der Nukleinsäure dienen können. Solche Liganden können an die Nukleobasen. aber auch anstelle der Nukleobasen oder zusätzlich zu den Nukleobasen an das Grundgerüst, gebunden sein. Beispiele für solche Liganden sind beispielsweise in WO 92/20703, WO 95/14708 (Metallkomplexe), DE 197 12 530.1 und WO 95/16202 (Peptide) beschrieben.
Die Herstellung von mit Nukleinsäure hybridisierenden Molekülen, bei denen das Grundgerüst aus einer Sequenz von über Peptidbindungen verknüpften Monomereinheiten aufgebaut sind, ist beispielsweise in WO 92/20702 beschrieben. In einem ersten Aspekt unterscheidet sich der Gegenstand der vorliegenden Erfindung von der dort beschriebenen dadurch, daß mindestens eine der dort eingesetzten Monomereinheiten eine Funktion mit einem pKa von weniger als 3.0 enthält.
In EP-A-0 672 677 ist eine Synthese von Nukleinsäureanalogen beschrieben, bei der nukleosidische und nicht-nukleosidische Monomereinheiten miteinander gemischt sind. In einer weiteren Ausführungsform unterscheidet sich der Gegenstand der vorliegenden Erfindung von den dort beschriebenen Molekülen dadurch, daß eine der nicht-nukleosidischen Monomereinheiten eine Säurefunktion mit einem pK, von weniger als 3.0 enthält.
Wenn im Folgenden von einer modifizierten Monomereinheit gesprochen wird, so ist hiermit die nicht-nukleosidische Monomereinheit gemeint, welche die Säurefunktion mit einem pK. von weniger als 3.0 bzw. die negative Ladung enthält. Als Monomereinheit wird bevorzugt eine Einheit verstanden, welche ein Teil des oben genannten Oligomers ist und welche höchstens eine Nukleobase enthält. Diese Einheiten enthalten bevorzugt nur solche Molekülteile, die bereits in den zur Synthese der Oligomeren verwendeten Monomeren enthalten waren. In der Regel ist das Oligomer zwischen 6 und 100, bevorzugt 8 und 30 Monomereinheiten lang. Bei der Berechnung der Länge der Grundgerüsteinheit jedes Monomers wird im Folgenden zugrundegelegt, daß die geometrische Länge zwischen den Verknüpfungspunkten der einzelnen Monomere im wesentlichen gleich ist und bevorzugt mit den Verknüpfungsstellen der Monomeren. aus denen das Oligomer hergestellt ist, zusammenfällt. Für den bevorzugten Fall von Peptidnukleinsäuren beispielsweise reicht die Länge einer Grundgerüsteinheit von der Carbonylgruppe des einen Endes der Monomereinheit bis zum Aminoende derselben Monomereinheit, welche an die darauffolgende Carbonylgruppe der nächsten Monomereinheit gebunden ist. Bevorzugt liegt die Länge einer so definierten Grundgerüsteinheit zwischen 4 und 8. besonders bevorzugt bei 6 Atomen.
Die modifizierte Monomereinheit kann prinzipiell jede beliebige, also auch die letzte nukleobasenhaltige Monomereinheit des Moleküls darstellen. Besonders bevorzugt jedoch ist die modifizierte Monomereinheit nicht die letzte basenhaltige Monomereinheit des Oligomers. Besonders bevorzugt liegt die modifizierte Monomereinheit innerhalb des inneren Drittels der Gesamtlänge des Moleküls.
Das mit Nukleinsäuren hybridisierende Molekül kann prinzipiell so viele modifizierte Monomereinheiten enthalten, wie Monomereinheiten vorhanden sind. Bevorzugt ist es jedoch der Fall, daß weniger als die Hälfte der Monomereinheiten eine modifizierte Monomereinheit darstellen. Die übrigen Monomereinheiten sind bevorzugt nicht negativ geladen, bevorzugt sind sie neutral. Die Diskriminierung zwischen Nukleinsäuren mit einer in einer oder mehreren Positionen unterschiedlichen Basensequenz wird dadurch begünstigt, daß das Molekül so gewählt wird, daß die modifizierte Monomereinheit ungefähr in der Mitte des Moleküls eingebaut ist und zwar zu der nachzuweisenden, nicht aber mit einer davon zu diskriminierenden Nukleinsäure gerade in dieser Position komplementär ist (mismatch).
Unter einer nukleosidischen Einheit wird eine Einheit verstanden, die sowohl einen Zuckeranteil, als auch einen Phosphatanteil enthält. Eine nicht-nukleosidische Einheit ist somit eine Monomereinheit, in welcher die Base nicht an einen Zuckeranteil, oder/und der Zuckeranteil nicht über einen Phosphatrest an eine benachbarte Monomereinheit gebunden ist.
Unter einer Säurefunktion wird im Sinne der vorliegenden Erfindung eine chemische Gruppe verstanden, die kovalent an die nicht-nukleosidische Einheit gebunden ist. Diese Gruppe hat in an die nicht-nukleosidische Einheit gebundener Form bevorzugt einen pK, von weniger als 3.0. Bevorzugt sind 2- oder mehrbasige Säuren. Bevorzugte Säurefunktionen sind ausgewählt aus der Gruppe der anorganischen Säuren, insbesondere den Gruppen der Sulfonsäuren, der Phosphonsäuren oder der Phosphorsäuren bzw. deren Salze. Ein Sulfonsäurerest ist bevorzugt eine Gruppe der Formel -SO3H. Unter einem Phosphon- säurerest wird bevorzugt ein Rest der Formel -PO3H2 verstanden. Phosphorsäuren enthalten die Gruppe -OP(OH)2O. Die Säurefunktion ist bevorzugt nicht an der kovalenten Bindung zweier Monomereinheiten miteinander beteiligt. Insbesondere ist die Säurefunktion bevorzugt an ein Kohlenstoffatom des Grundgerüsts (Backbone) gebunden, welches nicht das erste neben einem für die Verknüpfung mit dem nächsten Monomeren verwendeten Heteroatom (O, P, S oder N) ist. Die Säurefunktion kann entweder direkt oder über einen Abstandshalter A' mit der Grundgerüsteinheit der Monomereinheit, bevorzugt einem Atom der fortlaufenden Kette von Atomen im Backbone, z. B. einem C-Atom. verbunden sein. Die Säurefunktion zusammen mit dem Abstandshalter A' wird im Folgenden auch als eine Gruppe R enthaltend eine Säurefunktion mit einem pKa von weniger als 3.0 bezeichnet.
Der Abstandshalter A' verbindet ein Atom einer Reihe von linear aufeinanderfolgenden Atomen des Grundgerüsts mit einem Atom der Säurefunktion. Diese Abstandshalter können prinzipiell zwischen 1 und 20 Atomen lang sein. Besonders bevorzugt hat der Abstandshalter A' die Formel III
-(-(-A'-)a-(-A2-)b-(-A3-)c-)d- ( III ),
in der
A1 Sauerstoff. NR6 oder Schwefel,
A2 ein substituierter oder unsubstituierter Alkylen-, Alkinylen- oder Alkenylen-
Rest. A3 Sauerstoff. Schwefel oder NR6,
R6 unabhängig Wasserstoff. Acyl oder Alkyl,
a und c unabhängig voneinander eine Zahl von 0 bis 2,
b eine Zahl von 1 bis 10, und
d eine Zahl von 1 bis 4
bedeuten, wobei der Abstandshalter in jeder der beiden möglichen Orientierungen eingebaut sein kann.
Alkyl. Acyl, Alkylen-. Alkinylen- und Alkenylen-Reste in der Definition von A2 und R6 haben bevorzugt 1 bis 3 Kohlenstoffatome. Substituenten können beispielsweise gewählt werden aus der Gruppe Hydroxyl, Halogen (z. B. Cl, Br oder F) oder Amino.
Bevorzugt handelt es sich bei dem erfindungsgemäßen Molekül um ein mit Nukleinsäuren hybridisierendes Oligomer enthaltend mindestens eine nicht-nukleosidische Monomereinheit der Formel I
[1]
( I )
worin
L ausgewählt ist aus der Gruppe Wasserstoff, Hydroxyl, (C,- C4)- Alkanoyl, nukleo- basenbindende Gruppe, (C6-C14)-Aromaten, Heterocyclen mit Stickstoff-, Sauerstoff- oder/und Schwefel-Atomen, Interkalatoren und Reportergruppen,
A ein Abstandshalter mit einer Länge von 1 bis 3 Atomen.
x eine Zahl zwischen 0 und 3,
B eine Grundgerüsteinheit mit einer Länge von zwischen 4 und 8 Atomen, R eine Gruppe enthaltend eine Säurefunktion mit einem pK_ von weniger als 3.0
bedeuten. Ein bevorzugter Alkanoylrest (Acylrest) ist die Acetylgruppe. Unter Nukleobasen sollen die natürlich vorkommenden Basen A, C, G, T und U verstanden werden. Eine nukleobasenbindende Gruppe ist eine Gruppe, die mit einer solchen Nukleobase über wasserstoffbrückenspezifische Wechselwirkungen ausbilden kann. Hierzu gehören neben den (hierzu komplementären) natürlichen Nukleobasen auch unnatürliche Nukleobasen, wie z. B. 7-Deazaguanosin oder Pseudopyrimidine. Aromaten können sowohl substituiert als auch unsubstituiert sein. Als Substituenten kommen insbesondere Hydroxyl, C, - C2- Alkoxy oder Amino in Frage. Bevorzugte Aromaten sind der Phenyl-, Pyrenyl- und der Naphthylrest. Heterozyklen sind zyklische Verbindungen, welche ein oder mehrere Heteroatome. ausgewählt aus der Gruppe O, N und S enthalten, die nicht-aromatisch oder aromatisch sein können. Auch sie können durch die bei Aromaten genannten Reste substituiert sein. Beispiele für Heterozyklen sind der Pyridylrest und der Piperidylrest. Interkalatoren sind Moleküle, die sich in die Basen-Basen- Wechselwirkung benachbarter Basen einschieben können, z. B. Acridin. Eine Reportergruppe kann zum Nachweis oder zur Immobilisierung des Moleküls verwendet werden. Insbesondere eignen sich immunologisch aktive Verbindungen und biospezifϊsche Wechselwirkungen aus bindenden Molekülen aus Reportergruppen. Eine besonders bevorzugte Gruppe von Reportergruppen sind die Markierungen oder Label. Hier besonders bevorzugt sind die elektro- chemilumineszenten Rutheniumbispyridylkomplexe.
Besonders bevorzugt ist L über den Abstandshalter A an ein Stickstoffatom, besonders bevorzugt an ein Aminstickstoffatom, in B gebunden. Ebenfalls bevorzugt ist die Gruppe R an die Grundgerüsteinheit, nicht jedoch direkt an das Stickstoffatom gebunden, an welches L gebunden ist.
Besonders bevorzugte Moleküle weisen mindestens eine Monomereinheit der Formel II auf
worin L. A und x die oben genannten Bedeutungen haben und
E' und F' unabhängig voneinander CO, CS. SO. SO2 oder NR1,
wobei R, ausgewählt ist aus der Gruppe Wasserstoff und (C,-C3)- Alkyl,
N ein Aminstickstoffatom. und
C und D unabhängig voneinander ausgewählt sind aus der Gruppe (CR2R3)n und CR2R3CR4R5
wobei
R2, R\ R4 und R5 unabhängig voneinander ausgewählt sind aus der Gruppe
Wasserstoff, C,-C6-(substituiertes oder unsubstituiertes) Alkyl, Hydroxyl, Carboxyl und einer die Säurefunktion enthaltenden Gruppe R, und
n eine Zahl zwischen 1 und 4 ist.
Mindestens eine der Reste R2-R3, bzw. R -R5 ist eine Gruppe R.
Ebenfalls Gegenstand der Erfindung ist ein Molekül der Formel IV
in der
ausgewählt ist aus der Gruppe Wasserstoff, Hydroxyl, (C,-C4)- Alkanoyl, nukleobasenbindende Gruppe in geschützter oder ungeschützter Form, (C6- C )- Aromaten. Heterocyclen mit Stickstoff-, Sauerstoff- oder/und Schwefel- Atomen, Interkalatoren und Reportergruppen.
ein Abstandshalter mit einer Länge von zwischen 1 und 3 Atomen,
eine Zahl zwischen 0 und 3. E und F unabhängig voneinander COOX, CSOX. SO2X. SO,X oder NR1 Y,
wobei
R1 ausgewählt ist aus der Gruppe Wasserstoff und (C,-C3)-Alkyl,
X ausgewählt ist aus der Gruppe Wasserstoff, der Schutzgruppen und der Aktivierungsgruppen,
Y ausgewählt ist aus der Gruppe Wasserstoff und Schutzgruppe,
N ein Aminstickstoffatom und
C und D unabhängig voneinander ausgewählt sind aus der Gruppe (CR2R3)π und CR2R3CR4R5
wobei
R2, R3, R4 und R5 unabhängig voneinander ausgewählt sind aus der Gruppe
Wasserstoff, C,-C6-(substituiertes oder unsubstituiertes) Alkyl, Hydroxyl, Carboxyl und einer eine Säurefunktion mit einem pKa von weniger als 3.0 enthaltenden Gruppe R in geschützter oder ungeschützter Form, und
n eine Zahl zwischen 1 und 4 ist.
Diese Moleküle sind zur Synthese der erfindungsgemäßen Oligomeren einsetzbar. Besonders bevorzugt sind dann solche Moleküle, bei denen einer der Reste E und F eine geschützte Amino- oder Carbonsäurefunktion ist und der andere entweder eine reaktive Gruppe, wie eine Carbonsäure- oder primäre Aminogruppe oder ein entsprechendes aktiviertes Derivat, z. B. ein Aktivester, bedeutet. Eine Aktivierungsgruppe ist beispielsweise 1-Oxybenzotriazol. Während der Oligomersynthese ist die Säurefunktion bevorzugt mit Hilfe einer Schutzgruppe geschützt, bevorzugt in Form eines Esters, der gespalten werden kann, ohne daß das Oligomer fragmentiert wird. Solche Schutzgruppen sind beispielsweise Benzyl und ß-Cyanoethyl. Die z.B. aus der chemischen Oligonukleotidsynthese oder der Synthese von Peptidnukleinsäuren (WO 92/20702) bekannten Syntheseverfahren können analog zur Synthese der erfindungsgemäßen bzw. der erfindungsgemäß verwendeten Oligomeren verwendet werden. Ein besonders geeignetes Monomer ist in Figur 1 angegeben (Verbindung 3). Es handelt sich hierbei um ein Derivat der Aminosäure Homoserin. Diese Verbindung ist am Amino- Ende der Grundgerüstmonomereinheit mit einer t-Butyloxycarbonyl(Boc)-Schutzgruppe an gegebenenfalls vorhandenen exozyklischen Aminogruppen der Base mit einer Benzyl- oxycarbonyl (Z)gruppe und an der Hydroxylgruppe des Homoserins durch Ersatz des Wasserstoff durch eine als Di-Benzylester geschützte Phosphatgruppe gekennzeichnet.
In Figur 1 ist weiterhin eine Verbindung (4) gezeigt, bei der die Aminogruppe der Grundgerüsteinheit mit einer Monomethoxytrityl-Schutzgruppe und die exocyclischen Amino- funktionen der Base mit einer Acyl-Schutzgruppe (Benzoyl, Isobutyryl) geschützt ist. Die Homoserinhydroxyl-Gruppe ist mit einem di-ß-Cyanoethyl-geschützten Phosphatrest ver- estert. Als Verbindung 5 ist die entsprechende in das Oligomere eingebaute entschützte Monomereinheit gezeigt. Weiterhin sind in FIG 1 das entsprechende auf Serin als Aminosäure beruhende Monomer 1 und die entschützte Monomereinheit 2 gezeigt. Als Verbindungen 6. 7, 8 und 9 sind die auf Homoserin beruhenden Phosphonate und Sulfonate gezeigt. Die Abstandshalter zwischen der Säurefunktion (PO4 2",PO3 2' und SO3 ") und dem Kohlenstoffatom der linearen Backbonekette folgen bevorzugt der Formel (CH2)n, wobei n Werte von 1 bis 6, bevorzugt 2 bis 4 annimmt.
Ebenfalls Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zum Nachweis der Anwesenheit oder Abwesenheit einer Nukleinsäure in einer Probe, bei der zu vermuten ist. daß sie eine oder mehrere nicht-nachzuweisende Nukleinsäuren (zu diskriminierende Nukleinsäure(n)) enthält, deren Basensequenz sich von der Basensequenz der Nukleinsäure in einer oder mehreren Positionen unterscheidet, enthaltend die Schritte Inkontaktbringen einer Sonde, welche eine Basensequenz enthält, die zu der nachzuweisenden, nicht jedoch zu den anderen Nukleinsäuren komplementär ist, und Feststellung, ob eine Bindung der Sonde an eine zu der Basensequenz komplementäre Basensequenz stattgefunden hat, dadurch gekennzeichnet, daß als Sonde ein mit Nukleinsäuren hybridisierbares Molekül mit einem Grundgerüst aus linear miteinander verknüpften Monomereinheiten, wobei mindestens eine der Monomereinheiten eine nicht-nukleosidische Einheit ist. die eine Säurefunktion mit einem pKa von weniger als 3.0 enthält, verwendet wird.
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren handelt es sich um eine spezielle Ausführungsform der sogenannten Hybridisierungstests. die in ihren Grundzügen dem Fachmann auf dem Gebiet der Nukleinsäurediagnostik bekannt sind. Soweit experimentelle Details im Folgenden nicht ausgeführt sind, wird dazu vollinhaltlich auf "Nucleic acid hybridisation". Herausgeber B.D. Harnes und S.J. Higgins, IRL Press, 1986. z. B. in den Kapiteln 1 (Hybridisation Strategy), 3 (Quantitative Analysis of Solution Hybridisation) und 4 (Quantitative Filter Hybridisation), Current Protocols in Molecular Biology, Ed. F.M. Ausubel et al.. J. Wiley and Son. 1987, und Molecular Cloning, Ed. J. Sambrook et al.. CSH, 1989, Bezug genommen.
Unter einer Sonde wird allgemein ein nukleinsäurebindendes Molekül verstanden, welches von natürlichen Nukleinsäuren durch Anbringen einer chemischen Gruppe unterscheidbar gemacht wurde. Bei der chemischen Gruppe kann es sich einerseits um eine immobilisierbare Gruppe, andererseits um eine Markierung handeln. Diese Sonde enthält eine Basensequenz, die zu einer Sequenz der nachzuweisenden Nukleinsäure, nicht jedoch einer Sequenz der anderen, nicht-nachzuweisenden Nukleinsäuren komplementäre Basensequenz enthält. Diese Sequenz ist bevorzugt länger als 10 Basen. Bevorzugt ist die Sequenz fortlaufend und ununterbrochen. Die Länge der Sequenz beträgt bevorzugt 10 oder mehr Basen, besonders bevorzugt 15 oder mehr Basen. Die Sonde kann darüber hinaus noch weitere Basen enthalten, die die diskriminierenden Eigenschaften der Sonde nicht beeinflussen, da sie nicht zu einer stärkeren Bindung der Sonde an eine nicht-nachzuweisende Nukleinsäure führen als zu der nachzuweisenden. Im Allgemeinen ist dies sichergestellt, wenn diese Basen nicht zu einer Basensequenz komplementär sind, die direkt neben einer potentiellen Bindesequenz für die Sonde auf einer nicht-nachzuweisenden Nukleinsäure liegt. Solche zusätzlichen Basen können beispielsweise dazu verwendet werden, die Sonde selbst spezifisch über eine Nukleotidsequenz zu erkennen, z. B. zur Verwendung als universelle Nachweissonde.
Eine Markierung im Sinne der vorliegenden Erfindung besteht aus einer direkt oder indirekt nachweisbaren Gruppe L. Direkt nachweisbare Gruppen sind beispielsweise radioaktive (32P), farbige, oder fluoreszierende Gruppen. Metalle oder Metallkomplexe. Indirekt nachweisbare Gruppen sind beispielsweise immunologisch oder enzymatisch wirksame Verbindungen, wie Antikörper, Antigene. Haptene oder Enzyme oder enzymatisch aktive Teilenzyme. Diese werden in einer nachfolgenden Reaktion oder Reaktionssequenz de- tektiert. Besonders bevorzugt sind Haptene. da an mit ihnen markierten Oligomeren die Detektion über eine anschließende Reaktion mit einem markierten Antikörper gegen das Hapten leicht vorgenommen werden kann. Besonders gute Wirkung zeigt die Erfindung für lipophile Label, wie Biotin. Fluorescein. Pyrenyl oder Ruthenium-organische Komplexe.
Unter einer immobilisierbaren Gruppe wird ein chemischer Rest verstanden, welcher zur Bindung der Sonde an eine Festphase benutzt werden kann. Hierfür eignen sich daher sowohl aktivierbare Reste (z. B. photoaktivierbare), aber auch Partner eines spezifischen Bindepaares, wie Rezeptoren und zugehörige Liganden, Partner einer immunologischen Reaktion, wie z. B. Haptene. Antigene oder Antikörper, oder Vitamine bzw. Rezeptoren für diese Vitamine. Besonders bevorzugt als immobilisierbare Gruppe sind Haptene oder Biotin sowie dessen Derivate. Besonders bevorzugt ist Biotin. Die feste Phase, an welche die Sonde mittels der immobilisierbaren Gruppe gebunden werden kann, weist einen entsprechenden Bindungspartner oder eine entsprechende Reaktivität auf. Im Falle von Biotin kann daher die Festphase einen Überzug aus Streptavidin aufweisen.
Unter einer Analytnukleinsäure wird die Nukleinsäure verstanden, die Ziel des Nachweises ist. Darunter sind Nukleinsäuren jeglichen Ursprungs zu verstehen, beispielsweise Nukleinsäuren viroiden. viralen. bakteriellen oder zellulären Ursprungs. Sie können in Lösung, Suspension, aber auch an Festkörpern fixiert oder in zellhaltigen Medien. Zellabstrichen, fixierten Zellen, Gewebsschnitten oder fixierten Organismen vorliegen. Bevorzugt liegen die Nukleinsäuren in Lösung (in-vitro) vor.
Die Reaktionssequenz wird meist gestartet durch Verf gbarmachung der Analytnukleinsäure mit entsprechenden Reagenzien. Hierbei können sowohl Veränderungen des pHs (alkalisch), Hitze, Wiederholung extremer Temperaturveränderungen (Einfrieren/Auftauen), Veränderung der physiologischen Wachstumsbedingungen (Os- motischer Druck), Einwirkung von Detergenzien, chaotropen Salzen oder Enzymen (z. B. Proteasen, Lipasen), alleine oder in Kombination zur Freisetzung der Nukleinsäuren beitragen.
Denaturierung von Nukleinsäuren bedeutet Auftrennung von Nukleinsäuredoppelsträngen in Einzelstränge. Dem Fachmann stehen prinzipiell eine Vielzahl von Möglichkeiten zur Verfügung, z. B. Behandlung durch Alkalihydroxide, durch Hitze, oder durch Chemikalien. Unter einem spezifischen Nachweis wird ein Verfahren verstanden, durch welches ge- wünschtenfalls selektiv bestimmte Nukleinsäuren auch in Gegenwart anderer, hiervon zu diskriminierender. Nukleinsäuren nachgewiesen werden können. Es ist jedoch auch möglich, eine Gruppe von Nukleinsäuren mit teilweise übereinstimmender oder ähnlicher Nukleotidsequenz nachzuweisen. Zum Nachweis doppelsträngiger Nukleinsäuren kann jeder der beiden komplementären Stränge einbezogen werden. Bevorzugt ist daher die spezifische Sequenz der Sonde auf eine Länge von mehr als 10, bevorzugt mehr als 15 Basen zu mehr als 90, bevorzugt mehr als 95 und besonders bevorzugt zu 100 % komplementär zu einer Sequenz von gleichvielen ununterbrochen aufeinanderfolgenden Basen der nachzuweisenden Nukleinsäure. Besonders gute Wirkung zeigt die vorliegende Erfindung für Sequenzen, die besonders purinreich sind, d. h. mehr als 50 % Purine enthalten. Besonders bevorzugt ist sie für Sequenzen, die in einer ununterbrochenen Reihe 4 oder mehr Purine. z. B. G, enthalten. In diesem Falle liegt die erfindungsgemäß modifizierte Monomereinheit bevorzugt innerhalb dieses Homopurinbereiches.
Unter einer zu einer Nukleinsäure im wesentlichen komplementären Nukleinsäure oder Nukleinsäuresequenz werden Nukleinsäuren oder Sequenzen verstanden, die mit der entsprechenden Nukleinsäure hybridisieren können, deren Nukleotidsequenz im hybridisierenden Bereich entweder genau komplementär zu der anderen Nukleinsäure ist oder sich in wenigen Basen von der genau komplementären Nukleinsäure unterscheidet. Die Spezifität richtet sich dabei sowohl nach dem Grad der Komplementarität als auch nach den Hybridi- sierungsbedingungen.
Zwei Basen sind üblicherweise dann zueinander komplementär, wenn sie miteinander Basenpaarungen ausbilden können, die bevorzugt der Watson-Crick-Regel oder der Hoogsteen-Basenpaarung folgen. Die Komplementaritätsbedingung bezieht sich auf zwei oder mehr Basensequenzen mit direkt zueinander benachbarten Basen mit einer Länge von 10 oder mehr Basen. Genau komplementär heißt zu 100 % komplementär: bei Unterschieden sollten diese bei weniger als 10 %, bevorzugt weniger als 5 % der Basen innerhalb des hybridisierenden Bereiches liegen. Die Unterschiede müssen natürlich so gewählt werden, daß sie die Spezifität des Tests für die nachzuweisende Nukleinsäure nicht entscheidend verschlechtern. Die nachzuweisende Nukleinsäure kann die Analytnukleinsäure selbst sein. Sie kann aber auch eine Nukleinsäure sein, die aus der Analytnukleinsäure durch Vorbehandlung in der Probenflüssigkeit hergestellt wurde. Zu den bekannten Vorbehandlungen gehört insbesondere die Fragmentierung, beispielsweise mittels Restriktionsenzymen, oder die cDNS- Synthese aus RNS. Damit das erfindungsgemäße Verfahren seine Vorteile voll entfalten kann, hat es sich als zweckmäßig erwiesen, wenn die nachzuweisende Nukleinsäure eine Größe von mindestens 40 bp aufweist. Bevorzugt ist die nachzuweisende Nukleinsäure das Produkt einer vorgeschalteten spezifischen oder unspezifischen Nukleinsäurevermehrung. Solche Nukleinsäureamplifikationsverfahren sind beispielsweise aus EP-A-0 201 184, EP-A-0 237 362, EP-A-0 329 822, EP-A-0 320 308 oder WO 88/10315 bekannt. In diesen Verfahren dient die Analytnukleinsäure als Templatnukleinsäure für die Herstellung der letztendlich nachzuweisenden Nukleinsäure. Die Nukleinsäure kann jedoch auch eine durch Klonierung und in-vivo-Vermehrung hergestellte Nukleinsäure sein.
Beispielsweise kann ein Verfahren zum Nachweis eines speziellen Virus, z. B. HGV, in einer Körperflüssigkeit (z. B. Serum) als ersten Schritt die Lyse der Virushülle enthalten. Verfahren zur Lyse von Zellwänden sind dem Fachmann bekannt. Beispielsweise kann die Lyse durch Behandlung mit Alkalihydroxydlösungen vorgenommen werden. Auch der Zusatz von Hilfsstoffen, z. B. Detergenzien, ist möglich. Daran kann sich insbesondere bei Viren, welche nur in geringen Konzentrationen in Körperflüssigkeiten vorliegen (z. B. Hepatitis C-Virus), eine in-vitro Nukleinsäurevermehrung anschließen (z. B. über die Poly- merase Chain Reaction oder die anderen oben genannten Amplifikationsverfahren). Dabei wird mit der Analytnukleinsäure als Templatnukleinsäure eine Vielzahl von Nukleinsäuren gebildet, welche dann in dem erfindungsgemäßen Verfahren nachgewiesen werden.
Bei einem Nachweis von Bakterien, beispielsweise in Lebensmitteln, könnten dem erfin- dungsgemäßen Verfahren ebenfalls mehrere Schritte vorgeschaltet werden. Im allgemeinen werden Bakterienproben ggf. nach in vivo Vermehrung der Bakterien unter Bedingungen, welche die Lyse der Bakterienzellwand bewirken (z. B. Proteinasen. Alkali), aufgeschlossen. Bei sehr niedrig konzentrierten Proben kann sich auch hier eine in vitro Amplifi- kation der Analytnukleinsäuren des Bakteriums anschließen. Resultat der diversen Vorbehandlungen ist eine Probenflüssigkeit, welche Nukleinsäuren gelöst enthält und in der ggf. die in den vorbereitenden Schritten eingesetzten Reagenzien sowie gegebenenfalls zerstörte Zellbestandteile enthalten sind.
Für die Durchführung des spezifischen Nachweises mit Hilfe der Sonde gemäß der vorliegenden Erfindung stehen dem Fachmann bekannte Verfahren zur Verfügung. Diese beruhen im wesentlichen darauf, daß die nukleinsäurehaltige Probe mit der Sonde unter Bedingungen inkubiert wird, bei denen die Sonde spezifisch an die nachzuweisende Nukleinsäure bindet, jedoch nicht oder in untergeordnetem Ausmaß an die nicht nachzuweisenden Nukleinsäuren in der Probe. Wenngleich in den meisten Fällen die für die nicht-modifi- zierten Sonden geeigneten Reaktionsbedingungen für die Hybridisierung auch bei den erfindungsgemäßen Molekülen angewandt werden können (z. B. für PNA die in WO 92/20703 genannten Bedingungen), so hat es sich doch erwiesen, daß die Sensitivität und Dynamik mit abnehmender Salzkonzentration im Hybridisierungspuffer zunehmen. Dies ist vorteilhaft, da bei niedriger Salzkonzentration DNA-DNA-Hybridisierungen ungünstiger werden. Dies gilt insbesondere für den Fall der Renaturierung ursprünglich doppelsträngiger Analytnukleinsäuren gegenüber der Hybridisierung relativ kurzer erfindungsgemäßer Oligomere. Die erfindungsgemäßen Sonden zeigen ein gegenüber DNA- Sonden umgekehrtes Bild. Bei DNA-Sonden steigt mit zunehmender Salzkonzentration die Signaldynamik und Sensitivität. Für den bevorzugten Fall von erfindungsgemäß modifizierten PNA-Sonden hat sich gezeigt, daß die bevorzugte Konzentration von Salz (NaCl) bei zwischen 0 und 150 mM liegt. Ein Vergleich erfindungsgemäßer Sonden gegenüber DNA-Sonden ist in Figur 2 gezeigt. Im ersten Schaubild ist der Einfluß der Natriumchloridkonzentration auf die Sensitivität eines HGV -Tests unter Verwendung einer Rutheniumkomplex markierten DNA-Sonde bei verschiedenen Salzkonzentrationen gezeigt. Im zweiten Schaubild ist derselbe Versuch mit einer erfindungsgemäßen PNA-Sonde mit derselben Sequenz gezeigt, wobei der Rutheniumkomplex über zwei Glutaminreste an das PNA-Grundgerüst gebunden ist. und das Grundgerüst darüber hinaus zwei Glutaminreste enthält. Es ist erkennbar, daß die Salzabhängigkeit für die DNA-Sonde verglichen mit der PNA-Sonde unterschiedlich verläuft, obwohl die Sonde negative Ladungen enthält. Gerade bei niedriger Salzkonzentration, bei der die Renaturierung des Amplicon- Doppelstranges unterdrückt ist. ist die Signaldynamik und Sensitivität bei Verwendung partiell negativ geladener PNA-Sonden im Gegensatz zu DNA-Sonden optimal. Im dritten Schaubild ist die Salzabhängigkeit einer Sonde gezeigt, welche zwei Lysinreste (positive Ladungen) im Backbone enthält. Es ist erkennbar, daß die Signaldynamik sowie Sensitivität kaum salzabhängig sind, die Leerwertsignale aber gerade bei niedrigen Salzkonzentrationen stark erhöht sind. Im vierten Schaubild ist die Salzabhängigkeit einer unmodifizierten. im Backbone neutralen PNA-Sonde mit zwei Glutaminsäureresten als Linker zum Rutheniumkomplex gezeigt. Auch hier steigt wie bei den partiell negativ geladenen PNA-Sonden Signaldynamik und Sensitivität zu niedrigen Salzkonzentrationen hin an. die optimale NaCl-Konzentration liegt bei 50 mM. Allerdings ist das Leerwertsignal deutlich erhöht.
Nach der Inkubation wird festgestellt, ob bzw. in welchem Ausmaß sich Hybride aus der nachzuweisenden Nukleinsäure und der Sonde gebildet haben. Zum Nachweis verwendet man die an der Sonde befindliche Markierung, deren Anwesenheit im Komplex aus nachzuweisender Nukleinsäure und Sonde zum Zeichen der Anwesenheit der nachzuweisenden Nukleinsäure verwendet wird. Dies geschieht bevorzugt, nachdem man einen eventuellen Überschuß an Sonde von dem Hybrid abgetrennt hat. Dies kann beispielsweise durch Abfangen des Hybrides mit Hilfe einer festphasengebundenen Fangsonde geschehen. Nach einer Inkubationszeit, während der die Immobilisierungsreaktion stattfindet, wird die flüssige Phase von der festen Phase (z. B. aus dem Gefäß, dem porösen Material oder den pelletierten beads ) entfernt. Die Festphase kann anschließend mit einem geeigneten Puffer gewaschen werden.
Die Menge des an die Festphase gebundenen Hybrides aus nachzuweisender Nukleinsäure, Nachweissonde und Fangsonde kann auf im Prinzip bekannte Weise bestimmt werden, z. B. nach Art eines Sandwich-Hybridisierungsverfahrens. Bei diesem Verfahren wird das Hybrid mit der erfindungsgemäßen Nachweissonde umgesetzt, welche zu einer anderen Nukleotidsequenz der nachzuweisenden Nukleinsäure als die Fangsonde komplementär ist, und mit dieser hybridisiert. Dadurch bildet sich ein Hybrid aus Nachweissonde, nachzuweisender Nukleinsäure und Fangsonde an der Festphase. Ein solches Verfahren ist beispielsweise beschrieben in der EP-A-0 079 139. Bevorzugt wird die Nachweissonde der Probe zusammen mit der Fangsonde mit der Hybridisierungslösung zugegeben.
Bei direkt nachweisbaren Gruppen, beispielsweise Fluoreszenzlabeln. wird die Menge an Markierung fluorometrisch bestimmt. Ist die nachweisbare Gruppe indirekt nachweisbar z. B. ein Hapten. so wird das Hybrid bevorzugt mit einem markierten Antikörper gegen das Hapten umgesetzt, wie analog in der EP-A-0 324 474 beschrieben. Die Markierung am Antikörper kann beispielsweise eine Färb- oder Fluoreszenzmarkierung oder bevorzugt eine Enzymmarkierung, wie ß-Galactosidase, alkalische Phosphatase oder Peroxidase, sein. Im Falle der Enzymmarkierung wird die Menge an Nukleinsäure über die meist photometrische chemoluminometrische oder fluorometrische Verfolgimg einer Reaktion des Enzyms mit einem chromogenen. chemoluminogenen oder fluorogenen Substrat gemessen. Das Meßsignal ist ein Maß für die Menge ursprünglich vorhandener nachzuweisender Nukleinsäure und somit ggf. an nachzuweisenden Organismen.
Besonders bevorzugt unterscheidet sich die nicht-nukleosidische. modifizierte Grundgerüsteinheit an einer Position, in welche sich die nachzuweisende Nukleinsäure von einer der in der Probe vorhandenen nicht-nachzuweisenden Nukleinsäure unterscheidet, von mindestens einer der beiden benachbarten Grundgerüsteinheiten, womit nicht die Base gemeint sein soll. Dies kann beispielsweise dadurch realisiert werden, daß die benachbarte Grundgerüsteinheit nicht eine negative Ladung bzw. nicht die Säurefunktion aufweist, oder daß sie auf einer anderen Monomereinheit. z.B. einer anderen Aminosäure, im linearen Teil des Grundgerüsts basiert.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird die Probe, die die nachzuweisende Nukleinsäure neben anderer Nukleinsäuren enthält, so behandelt, daß die nachzuweisende Nukleinsäure aus eventuell vorhandenen Zellen freigesetzt und eventuell daran haftende Proteine denaturiert werden. Daran kann sich eine Isolierung der Nukleinsäuren aus diesem Gemisch anschließen. Die von eventuellen Inhibitoren der Amplifikation befreiten Nukleinsäuren können dann einer Amplifikation, z. B. einer PCR, unterzogen werden. Hierbei ist es bevorzugt, einen der Primer mit einer immobilisierbaren Gruppe markiert einzusetzen. Nach Durchlaufen der Amplifikation werden die Amplifikate durch Hybridisierung mit einer erfindungsgemäßen Sonde nachgewiesen. Die Sonde wird bevorzugt so gewählt, daß sie in einen Bereich zwischen den Hybridisierungspositionen der Primer mit den Amplifikaten hybridisiert. Die Detektion findet nach Immobilisierung der Amplifikate und Hybridisierung mit der Sonde statt. Hierzu können bevorzugt magnetische Partikel eingesetzt werden, welche die immobilisierbare Gruppe der Amplifikate erkennen. Die Reagenzlösung mit den überschüssigen Sonden wird vor der Detektion bevorzugt entfernt. lσ
Die er mdungsgemäßen Oligomere. insbesondere diejenigen mit einer Säurefunktion mit einem pKa von weniger als 3.0 eignen sich hervorragend zum Nachweis von Mutationen, Allelen oder Polymorphismen sowie zur Typisierung oder Subtypisierung von Mikroorganismen. Bevorzugt enthalten die Oligomere sowohl eine solche Säurefunktion innerhalb des Bindebereiches des Oligomeren mit der nachzuweisenden Nukleinsäure als auch eine negative Ladung ausserhalb des Bindebereiches. z.B. an dessen Ende(n) oder im Linker zwischen dem Bindebereich und der Markierung.
Darüber hinaus hat es sich erwiesen, daß Oligomere. bei denen weniger als 80. bevorzugt weniger als 50 und besonders bevorzugt weniger als 40 %, mindestens jedoch eine der Basen an eine negativ geladene Grundgerüsteinheit, z. B. eine durch eine Säurefunktion mit einem pKa von weniger als 5.0, bevorzugt weniger als 3.0. modifizierte, gebunden sind, deutlich weniger unspezifisch an in ihrer Sequenz relativ unverwandte Nukleinsäuren (z. B. Längenmarker) binden. Sie vermeiden daher unspezifische Bindungen in Reaktionen zur Bindung der Sonde an komplementäre Basensequenzen (Tabelle 1). Unter relativ unverwandten Nukleinsäuren werden Nukleinsäuren verstanden, die keine fortlaufende und ununterbrochene Sequenz von mehr als 10, bevorzugt mehr als 15 Basen enthalten, die zu mehr als 50 % zu einer gleichlangen ununterbrochenen und fortlaufenden Sequenz von Basen der Sonde komplementär sind. Leerwerte, insbesondere bei Elektro- chemilumineszenzmessungen. werden reduziert. Gegenüber nicht-modifizierten Peptid- nukleinsäuren zeichnen sich die erfindungsgemäßen Oligomere durch eine erhöhte Selektivität in Bindereaktionen aus. In Abgrenzung zu Oligomeren. bei denen eine positive Ladung am Backbone befestigt war (z. B. T-Lys-haltige PNAs) und zu neutralen PNAs wurden deutlich niedrigere Leerwertsignale erhalten, insbesondere bei abnehmender Salzkonzentration (Tabelle 1). Die erfindungsgemäßen Oligomere neigen auch weniger zu unspezifischen Bindungen an Festphasen, z. B. hydrophile Oberflächen, wie mit Streptavidin beschichtete Partikel oder Gefäße. In diesem Fall wird als unspezifische Bindung eine nicht auf Basen-Basen- Wechselwirkung beruhende Bindung verstanden. Für den Einsatz der erfindungsgemäßen Oligomere eignen sich insbesondere neutrale und ganz besonders negativ geladene Oberflächen.
In Angew. Chem. 1996, 108. 17, 2068 sind PNAs mit Glutaminsäure-haltigem Backbone beschrieben. Auch solche Oligomere können zur Vermeidung unspezifischer Bindungen an nicht-komplementäre Nukleinsäuren oder Festphasen verwendet werden. Als Sonden in Vergleichsversuchen wurden jeweils 18mere bzw 14mere eingesetzt. Die Sonden unterscheiden sich wie in Tabelle 2 angegeben.
Tabelle 1 :
Tabelle 2:
In Tabelle 1 ist gezeigt, daß die partiell negativ geladenen PNA-Sonden ungeladenen PNAs bezüglich unspezifischer Bindung an nicht-komplementäre DNA-Fragmente deutlich überlegen sind und ein ähnliches Verhalten wie eine vergleichbare DNA-Sonde gleicher Basensequenz zeigen. In der linken Spalte ist erläutert, welche Nukleinsäure- komponenten dem Nachweisverfahren zugrundegelegt wurden. Im ersten Fall wurden biotinmarkierte HGV-Primer in unterschiedlichen Konzentrationen eingesetzt, die keine mit der Sonde komplementäre Sequenz enthalten. Im zweiten Fall wurden biotinmarkierte Längenmarker eingesetzt, die ebenfalls keine wesentliche Komplementarität zur Sonde aufweisen. Im dritten Fall wurden HGV-Amplifikate in unterschiedlichen Verdünnungen eingesetzt. Die Amplifikate enthalten einen Bereich, der zu 100 % komplementär zu der Sondensequenz ist. Im vierten Fall wird das Amplifikat eines HBV-Tests eingesetzt. Dieses Amplifikat hat keine Komplementarität zur eingesetzten Sonde. Im fünften Fall werden keine Nukleinsäuren zugegeben, so daß nur die unspezifische Bindung der Sonde an die Oberfläche des Magnetpartikels gemessen wird.
Die Ergebnisse aus Tabelle 1 zeigen, daß selbst bei Nichtanwesenheit von Nukleinsäuren in der Reaktionsmischung ein Leerwertsignal gemessen wird (Fall 5). Dieses ist bei DNA- Sonden und bei PNA, welche sowohl im Backbone als auch im Linker negative Ladungen enthalten, ähnlich klein. Demgegenüber steigt das Leerwertsignal bei Entfernen der negativen Ladung im Linker etwas an. Besonders groß ist das Leerwertsignal bei ungeladenen PNA. Dies zeigt, daß mit negativ geladenen PNA-Sonden eine Reduzierung des Leerwertes erreicht werden kann.
Die Fälle 1 und 2 zeigen femer. daß auch unspezifische Bindungen an Nukleinsäuren, die keine Ähnlichkeit mit der zu der Sondensequenz komplementären Sequenz haben, ein Beitrag zum Leerwertsignal liefern. Dies gilt sowohl für die zwangsläufig in der Reaktionsmischung enthaltenen Primer, als auch Kontrollen, wie Standards. Auch hier wird durch Einsatz negativ geladener Sonden eine Reduktion des Leerwertes festgestellt. Dieser Beitrag konnte im vorliegenden Experiment sogar vollständig eliminiert werden.
Fall 4 zeigt, daß bei Anwesenheit von Amplifikaten. die beispielsweise auf eine simultane Amplifikation eines weiteren Analyten in der Reaktionsmischung zurückzuführen sind, ein beträchtliches Leerwertsignal gefunden wird, welches durch Einsatz negativ geladener Sonden praktisch eliminiert werden kann.
Bevorzugt findet die Reaktion in einem Kunststoffgefäß statt. Insbesondere sind dabei solche Gefäße einsetzbar, welche normalerweise in üblichen Analysenautomaten als Probenaufbewahrungsgefäße verwendet werden. Beispiele sind Gefäße aus Polystyrol, Polyethylen oder Luran. Während der Behandlung mit Alkali und Detergenz befindet sich das Gefäß, in dem die Behandlung stattfindet, bevorzugt schon in einem Analysenautomaten, besonders bevorzugt auf einem Probenrotor, welcher den Zugriff einer Probenentnahmevorrichtung auf einzelne auf dem Rotor befindliche Probengefäße zuläßt. Ein solcher Analysenautomat ist beispielsweise in EP-A- 0 361 830 beschrieben. Darüber hinaus eignen sich diese Oligomere. bei denen weniger als 80. bevorzugt weniger als 50 %, jedoch mindestens eine der Basen an negativ geladene Grundgerüsteinheiten gebunden sind, besonders bevorzugt die erfindungsgemäßen Oligomere. hervorragend als Primer. sofern sie an einem Ende eine durch eine Polymerase verlängerbare Gruppe, vorzugsweise eine Hydroxylgruppe, aufweisen. Primer. die aus konventionellen Mononukleo- tideinheiten und einem oder mehreren Nukleosideinheiten am C-Ende aufgebaut sind, sind in WO 95/08556 und EP-0 672 677 beschrieben. Überraschenderweise hat sich herausgestellt, daß bei Einbau einer oder mehrerer negativer Ladungen im Bereich des verlängerbaren Endes die Wirkung als Primer verbessert wird. Besonders geeignet als Primer haben sich erfindungsgemäße Oligomere. die an einem ihrer Enden eine verlängerbare Hydroxylgruppe, z. B. Nukleoside. und als nächste Monomereinheit eine nicht-nukleosidische Einheit, die eine Säurefunktion mit einem pKa von weniger als 5.0. bevorzugt weniger als 3.0 enthält, erwiesen. Diese Chimären können mit den erfindungsgemäßen Monomeren analog zu WO 95/08566 hergestellt werden.
Erstaunlicherweise können Oligomere. bei denen weniger als 80 %, bevorzugt weniger als 50 %, jedoch mindestens eine der Basen an negativ geladene Grundgerüsteinheiten gebunden sind, besonders bevorzugt die erfindungsgemäßen Oligomere im Vergleich zu unmodi- fizierten, neutralen PNAs, z. B. mit sogenannten Transfektionsreagenzien, z. B. DOSPER oder DOTAP. besser in Zellen eingeschleust werden. Solche Transfektionsreagenzien sind für Nukleinsäuren aus Bioforum 6/96. Seite 264, bekannt. Insbesondere in Form von Peptidnukleinsäuren, die außerdem den Vorteil der Stabilität gegenüber Enzymverdau und eine hohe Affinität der Nukleinsäuren aufweisen, können die erfindungsgemäßen Oligomere daher gut in der Antisense-Technologie oder als Gensonden verwendet werden.
Im Falle der Oligomeren. welche eine Reduzierung der unspezifischen Bindungen mit sich bringen, können die negativen Ladungen prinzipiell im Molekül verteilt sein. So ist es beispielsweise möglich, die negativen Ladungen in Form einer oben beschriebenen Gruppe mit einem pKa von weniger als 5.0 (3.0) an eine basetragende Grundgerüsteinheit zu binden, es ist jedoch auch möglich, diese außerhalb der Sequenz von basenhaltigen Grundgerüsteinheiten zu binden, z. B. an einem oder beiden Enden der Oligomeren oder an die Nukleobase selbst ( z.B. DE- 19712530). Es hat sich herausgestellt, daß in diesem Fall die negativen Ladungen vorteilhafterweise über zusätzliche, nicht-basetragende Grund- gerüsteinheiten. welche eine Gruppe mit einem pK-, von weniger als 5.0 (3.0) enthalten, an einem Ende der Basensequenz zu realisieren, wobei an einem oder mehreren dieser zusätzlichen Grundgerüsteinheiten auch die Markierung oder die immobilisierbare Gruppe lokalisiert ist. Für den Fall von Peptidnukleinsäuren hat es sich als äußerst zweckmäßig erwiesen, schon während der Synthese der PNAs weitere Grundgerüsteinheiten aus Aminosäuren mit einem pK, von weniger als 5.0 (3.0) anzukondensieren und in einem anschließenden Schritt die Markierungsgruppe an die zusätzlichen Grundgerüsteinheiten zu binden. Dadurch wirken die zusätzlichen Grundgerüsteinheiten auch als Linker zwischen der Markierung und der für die nachzuweisende Nukleinsäure spezifischen Basensequenz. Besonders vorteilhaft erscheinen solche Sonden, bei denen sowohl negative Ladungen innerhalb der Basensequenz vorliegen, als auch im Linker.
In Fig. 1 sind einige Formeln erfindungsgemäßer Monomere (1. 3, 4, 6 und 8) in geschützter Form, wie sie zur Oligomersynthese eingesetzt werden können sowie die damit erzeugten Monomereinheiten innerhalb einer PNA (2, 5, 7 und 9), gezeigt (Z: Benzyloxycarbonyl, Bn: Benzyl).
In Fig. 2 ist der Einfluß des Salzgehaltes auf das Signal für eine markierte DNA-Sonde, eine erfindungsgemäße markierte Sonde, eine positiv geladene PNA-Sonde und eine Sonde mit negativer Ladung nur im Linker (ausserhalb des Backbones) gezeigt.
Die nachfolgenden Beispiele erläutern die Erfindung näher:
Beispiel 1
Synthese der Monomeren
Synthese des Boc-T-D-Glu(Bn)-OH PNA-Monomers
1. Synthese von D-Glu(Bn)-0-Allyl
Man gibt unter Rühren zu einer Lösung von 10 g (29.6 mmol) Boc-D-Glu(Bn)-OH (erhältlich von der Fa. Novabiochem AG) in 100 ml absolutem DMF 9.64 g (29.6 mmol) Cäsiumcarbonat (Fluka) und nach einer 'Λ Stunde 7.16 g (59.2 mmol) Allylbromid (Fluka) und rührt eine % Stunde weiter. Danach filtriert man vom Feststoff ab und zieht das DMF im Vakuum ab. Der Rückstand wird in 400 ml Essigester aufgenommen und mit 400 ml gesättigter Natrium-hydrogencarbonat-Lösung gewaschen. Danach wird die wäßrige Phase noch dreimal mit je 200 ml Essigester rückextrahiert. Anschließend werden die vereinigten organischen Phasen über Na:SO getrocknet. Man filtriert ab und rotiert ein. Jetzt wird der Rückstand in 100 ml Benzol gelöst und mit 5.80 g (30.5 mmol) p-Toluolsulfonsäure versetzt. Man kocht 1 Stunde lang am Rückfluß, engt danach die Lösung auf ein Volumen von ca. 20 ml ein und kristallisiert das Produkt durch langsame Zugabe von Diethylether aus. Der Feststoff wird abfiltriert und aus Methanol/Diethylether umkristallisiert. Man erhält nach Trocknen am Hochvakuum 1 1.1 g (77%) des Produkts als p-Toluolsulfonsäure-Salz in Form farbloser Kristalle.
2. Synthese von Boc-(2-Aminoethyl)-D-Glutaminsäure-γ-Benzylester-α-Allylester
8 g (16.4 mmol) D-Glutaminsäure-γ-Benzylester-α-Allylester werden mit je 400 ml Dichlormethan und gesättigter Natriumhydrogencarbonat-Lösung in einem Scheidetrichter geschüttelt. Nach Abtrennen der organischen Phase wird die wäßrige Phase dreimal mit je 200 ml Dichlormethan rückextrahiert. Man trocknet die vereinigten organischen Phasen über Na2SO4, filtriert ab und rotiert ein. Der Rückstand wird in 60 ml Methanol gelöst und im Eisbad gekühlt. Danach gibt man unter Rühren 3.14 g (19.7 mmol) Boc-Amino- acetaldehyd (hergestellt nach K.L. Dueholm et al.. Org. Prep. Proced. Int. 1993, 25, 457- 461) zu und rührt eine 'Λ Stunde im Eisbad weiter. Danach wird mit 1.1 ml Essigsäure und 0.55 g (8.75 mmol) Natriumcyanoborhydrid versetzt. Nach lΛ Stunde wird das Methanol im Vakuum abgezogen, und der Rückstand in 300 ml Essigester aufgenommen. Die Lösung wird mit 150 ml einer gesättigten Natriumhydrogencarbonat-Lösung und 150 ml Kochsalz-Lösung gewaschen. Die organische Phase wird anschließend über Na-,S04 getrocknet, abfiltriert und einrotiert. Der Rückstand wird in 120 ml Diethylether aufgenommen, auf -20°C gekühlt und mit der äquivalenten Menge 1.5 M wasserfreier, etherischer HC1 versetzt. Danach gibt man 120 ml absolutes Hexan zu. Das ausgefallene Hydrochlorid wird abfiltriert. Nach Umkristallisation aus Methanol/Diethylether/Hexan erhält man 7.15 g (88%) farblose Kristalle.
3. Synthese von Boc-T-D-Glu(Bn)-O-Allyl
Zu einer Lösung von 3.72 g (20.2 mmol) Thymin- 1 -ylessigsäure (hergestellt nach K.L. Dueholm et al., J. Org. Chem. 1994, 59, 5767-5773) und 3.3 g (20.2 mmol) 3,4-Dihydro-3- hydroxy-4-oxo-l,2,3-benzotriazin (Fluka) in 60 ml DMF gibt man unter Rühren 4.37 g (21.2 mmol) DCC (Fluka). Nach 1 Stunde gibt man dann 5 g (10.1 mmol) Boc-(2- Aminoethyl)-D-Glutaminsäure-γ-Benzylester-α-Allylester Hydrochlorid und 1.75 ml (10.2 mmol) Hünigs Base. Man rührt über Nacht bei 40°C (ca. 15 h). Danach wird das DMF im Vakuum abgezogen und der Rückstand in 180 ml Essigester aufgenommen. Der gebildete Dicyclohexylharnstoff wird abfiltriert. Die organische Phase wird dann sukzessive mit je 150 ml gesättigter Natriumhydrogencarbonat-Lösung, halbgesättigter Kaliumhydrogensulfat-Lösung und und gesättigter Kochsalz-Lösung gewaschen, danach über Na;SO4 getrocknet. Man filtriert ab und rotiert ein. Der Rückstand wird über eine Kieselgelsäule mit Essigester/Hexan 2:1 als Elutionssystem gereinigt. Das Produkt wird dann mit Essig- ester/Diethylether zur Kristallisation gebracht. Ausbeute: 3.6 g (57%).
4. Synthese von Boc-T-D-Glu(Bn)-OH
Zu einer Lösung von 2 g (3.2 mmol) Boc-T-D-Glu(Bn)-O-Allyl und 2.8 ml (32 mmol) Morpholin in 30 ml absolutem THF gibt man 37 mg (0.032 mmol) Tetrakistriphenyl- phosphin-Palladium. Nach A Stunde wird das THF abgezogen. Der Rückstand wird in 100 ml Essigester aufgenommen und mit gesättigter Natriumhydrogencarbonat-Lösung, die mit Kaliumhydrogensulfat-Lösung auf pH 3 eingestellt wurde, gewaschen. Die wäßrige Phase wird danach 5x mit je 50 ml Essigester rückextrahiert. Danach werden die vereinigten organischen Phasen mit gesättigter Kochsalz-Lösung gewaschen und über Na SO getrocknet. Man filtriert ab und rotiert ein. Nach Kristallisation aus Essigester/Hexan erhält man 1.46 g (78%) eines fast farblosen Feststoffs. 'H-NMR (DMSO): COOH nicht sichtbar. 1 1.27 (sb. IH. NH). 7.36-7.30 (m, 6H, Ph, H- C(6)), 6.99 (sb, IH. NH), 5.10 (2s. 2H. CH2Ph), 4.61-4.49 (m. 2H. CH2Thy), 4.20-4.05 (m. IH, CH), 3.68-2.91 (t, t. m. 6H. 2x CH:N, CH2COO), 2.39-2.31 (m. 2H. CH2), 1.74 (s, 3H. CH3), 1.38, 1.35 (2s. 9H. CH3 (Boc))
Beispiel 2
Synthese der Oligomeren
Synthese der PNA der Sequenz:
Ru(bpy)3 (Glu), CCA C(T-Glu)A TAG G(T-Glu)G GGT CTT Gly
Die Synthese erfolgte auf einem ABI 433 A Peptid-Synthesizer der Firma Applied Biosystems mit modifizierter Software (T. Koch et al., J. Peptide Res. 1997, 49, 80-88). Die Synthesen wurden im 5 μmol Maßstab in einem 3 ml Reaktionsgefäß durchgeführt, ein kleineres Measuring Loop (150 μl) wurde verwendet. Die Monomerbausteine (PNA-Bau- steine: Boc-T-OH, Boc-A(Z)-OH, Boc-C(Z)-OH und Boc-G(Z)-OH, erhältlich von der Fa. Perseptive Biosystems, Boc-T-Glu(Bzl)-OH hergestellt nach Beispiel 1; Aminosäurederivate: Boc-Glu(OBzl)-OH, erhältlich von der Fa. Novabiochem AG; Ru(Ruthenium)(bpy)3-COOH von Boehringer Mannheim) wurden in NMP gelöst und in individuelle Kartuschen eingespritzt (140 μl, 0.26M). Das mit Boc-Gly (Novabiochem AG) derivatisierte MBHA-Trägermaterial (Novabiochem AG) wird in das 3 ml Reaktionsgefäß gefüllt und am Synthesizer angebracht. Trifluoressigsäure/m-Cresol 95:5 (2 x 180 sec); Flaschenposition 2) wird verwendet, um die Boc-Schutzgruppe abzuspalten. Je 2 Waschmodule (Dichlormethan- und NMP-Modul bestehend aus jeweils 5 aufeinanderfolgenden Waschschritten) befinden sich zwischen Boc-Abspaltung und dem Kupplungsmodul (Dichlormethan = Flaschenposition 9; NMP = Flaschenposition 10). 140 μl 0.26 M Monomer (36 μmol), 150 μl 0.21 M HATU (O-(7-Azabenzotriazol-l-yl)-l,l,3,3-tetra- methyluronium-hexafluorophosphat) in NMP (32 μmol) und 150 μl 0.5 M Diisopropyl- ethylamin in NMP (75 μmol) werden in jedem Kupplungsschritt gefördert (Diisopropyl- ethylamin-Lösung = Flaschenposition 7; HATU-Lösung = Flaschenposition 8). Die Monomere werden in der Synthesekartusche voraktiviert ( 1 min), dann in das Reaktionsgefäß überführt. Die Kupplungszeit beträgt 10 min. die Monomerenkonzentration während der Kupplung beträgt 0.08 M. Nach dem Kupplungsmodul erfolgt ein Capping-Modul mit Essigsäureanhydrid/NMP/Pyridin 1 :25:25 (1 min: Flaschenposition 4). Jeder Synthese- cyclus wird mit einem NMP Waschmodul abgeschlossen. Nach dem letzten Synthese- cyclus folgt ein Dichlormethan- Waschmodul, um das Harz zu trocknen. Die Kupplungen wurden regelmäßig durch einen qualitativen Kaiser-Test kontrolliert.
Die Abspaltung der PNA vom Harz und der Schutzgruppen erfolgt in einem manuellen Schritt außerhalb des Gerätes in einer speziellen, verschließbaren Glasfritte. Das Harz wird zuerst mit Trifluoressigsäure gewaschen, dann schüttelt man 2 Stunden mit 2 ml Trifluor- methansulfonsäure/Trifluoressigsäure/m-Cresol 2:8:1. Die Abspaltlösung wird in ein Zentrifugenglas gesaugt. Man wäscht mit 1 ml Trifluoressigsäure nach und präzipitiert die PNA mit Diethylether (ca. 10 ml). Das Präzipitat wird nach Zentrifugation von der überstehenden Lösung getrennt. Danach wäscht man zweimal mit Diethylether.
Die PNA wurde über eine analytische RP18-HPLC (DeltaPak. Waters, 5 μ, 125 x 4 mm) mit einem Wasser/ Acetonitril/0.1 % Trifluoressigsäure-Gradienten bei 60 °C analysiert.
Die PNA wurde über eine präparative RP18-HPLC (Polygosil C-18/Macherey-Nagel, 5 μ, 250 x 20 mm) mit einem Wasser/ Acetonitril/0,1 % Trifluoressigsäure-Gradienten bei 60 °C bis zur chromatographischen Einheitlichkeit gereinigt.
Die Analyse der gereinigten PNA wird mit MALDITOF-MS durchgeführt.
Beispiel 3
HGV-Amplifikatnachweis mit verschieden modifizierten Detektionssonden
Ein Vergleich einer erfindungsgemäßen Detektionssonde zu unmodifizierten oder anders modifizierten PNA-Ru Sonden unter Verwendung einer identischen Sequenz verdeutlicht die Vorteile der Erfindung. Als Referenz wurde eine DNA-Sonde eingesetzt, das Experiment wurde am Beispiel HGV durchgeführt. a) Amplifikation
Zur Herstellung der getesteten PCR-Produkte (HGV bzw. HBV), die als Proben in dem Beispiel dienten, wurden Plasmide verwendet, die mittels PCR amplifiziert wurden. Für die Herstellung der spezifischen Amplifikate wurden die folgenden Primer verwendet:
HGV Primer Sequenzen: coding-strand:
5 ' -CGG CC A AAA GGT GGT GGA TG-3 ' 20-mer (SEQ.ID.NO 1 ) non-coding Strand:
5'-Bi-CGA CGA GCC TGA CGT CGG G-3' 19-mer (SEQ.ID.NO. 2)
HBV Primer Sequenzen: coding-strand:
5'-GGA GTG TGG ATT CGC ACT-3' 18-mer (SEQ.ID.NO. 3) non-coding Strand:
5'-TGA GAT CTT CTG CGA CGC-3' 18-mer (SEQ.ID.NO.4)
Für die PCR wurde für beide Parameter der folgende Reaktionsansatz gewählt:
2,5 U Taq polymerase
10 mM Tris/HCl. pH 8.3
50 mM KC1 l,5 mM MgCL
0,1 mg/ml Gelatine
200 nM dCTP, dATP, dGTP, 600 mM dUTP
200 nM coding-strand primer
200 nM non-coding Strand primer. Biotin-markiert
10 ng plasmid pJCP (HGV: Nukleotide 1-550 kloniert in pGEM3z; Stratagene: HBV:
Nukleotide 50-2670 kloniert in pUC 18)
Die Amplifikation wurde mit folgendem Temperaturprofil auf einem Perkin Eimer Cycler 9600 durchgeführt:
35 Zyklen: 15 sec 94°C
30 sec 55°C
30 sec 72°C hold 4°C
Um das Amplifikat zu stabilisieren, wurde das PCR-Produkt nach Beendigung der Reaktion mittels des High pure PCR template purification kits (BM Best.No. 1 796 828) gereinigt. Zur Bewertung der verschiedenen PNA-Ru Sonden wurde das PCR-Produkt in den bezeichneten Verdünnungen eingesetzt. b) Detektion
Die Detektion erfolgte mit Hilfe von Elektrocheminumileszenz (ECL) auf einem Elecsys® 1010 (Boehringer Mannheim GmbH). Reaktionstemperatur für alle Schritte ist 37°C. 10 μl Probe werden zunächst mit 35 μl Denaturierungsreagenz versetzt und für 5 Minuten inkubiert. Anschließend werden 120 μl der Sondenlösung (50 ng/ml in Hybridisierungs- puffer) zugegeben und 20 min inkubiert. Nach Beendigung der Hybridisierung werden dem Reaktionsansatz 35 μl Streptavidin-beschichtete magnetische Mikropartikel beigemischt und dieser erneut 10 Minuten inkubiert. Die Hybride (Bio-markierter HGV Strang mit Ru- markierter Detektionssonde) werden dabei an die Festphase (Mikropartikel) gebunden. Nach Beendigung der Inkubation werden die Proben in die Meßzelle transferiert und dort die Mikropartikel über einen Magneten gebunden. Anschließend erfolgt in der Meßzelle die Chemilumineszenz. Unter Katalyse von TPA gibt der Ru-Komplex Lichtblitze ab. deren Anzahl in der Meßzelle bestimmt werden. Die Chemie zur Elektrochemino- lumineszenz ist im J. Electrochem. Soc. 137: 3127-3131 beschrieben.
Detektionsreagenzien :
1. Denaturierungsreagenz. pH > 12
Hybridisierungslösung, pH 6.5:
Als Detektionssonden wurden folgende Rutheniumbispyridkomplexe-markierten Sonden verwendet:
A. DNA-Sonde:
Ru- CCA CTA TAG GTG GGT CTT Id.Nr. 55 (SEQ.ID.NO. 5)
B: PNA-Sonden:
Ru Glu2 CCA CT(TGlu)A TAG GT(TGlu)G GGT CTT Gly Id. Nr. 506
Ru Gly3 CCA CTA TAG GTG GGT CTT Gly Id. Nr. 487
Ru Glu, CCA CTA TAG GTG GGT CTT Glu Id. Nr. 493
Ru Gly3 CCA CT(TLys)A TAG GT(TLys)G GGT CTT Gly Id. Nr. 494
Die Sonden wurden im oben beschriebenen Experiment getestet, das Ergebnis ist in Tabelle 4 wiedergegeben. Der erste Teil (4a) gibt den Mittelwert der Signale aus einer Doppelbestimmung wieder, der zweite (4b) zeigt das Verhältnis des Signals zum Hintergrundsignal.
Die wichtigsten Erkenntnisse sind:
• Die Integration von TGlu im Backbone führt zu einer deutlichen Reduktion des Hintergrundes und ist vergleichbar mit der Referenz (DNA-Sonde)
• Die Modifikation führt zu einer Verbesserung der Sensitivität der PNA-Sonde, die Sensitivität ist vergleichbar mit der Referenz. Dies ist insbesondere in Tab. 4b deutlich zu sehen.
• Im Gegensatz zur Referenz verschlechtert sich die Sensitivität nicht bei einer niedrigen Salzkonzentration im Hybridisierungspuffer. Die Konkurrenzreaktion zwischen unmarkiertem Strang aus der PCR-Reaktion mit der Detektionssonde wird bei niedriger Salzkonzentration zur Sonde hin verschoben, was einen großen dynamischen Meßbereich bei sehr guter Sensitivität ermöglicht.
• Die modifizierte Sonde gemäß der Erfindung erlaubt die Abdeckung eines besonders großen dynamischen Meßbereiches, was besonders für die quantitative Detektion wichtig ist
• Bei den unmodifizierten PNA-Sonden bzw. bei der positiv geladenen PNA-Sonde erhöht sich der Hintergrund mit sinkender Salzkonzentration
Tabelle 4
4a Ident Nr 55 506 493 494 487
Salzkonz 50 mM 625 mM 50 mM 625 mM 50 mM 625 mM 50 mM 625 mM 50 mM 625 M
Probe
HGV PCR Produkt 1:5 424834 666051 1184377 332695 1570831 945988 1084935 247646 1687111 463255
1:25 260813 728338 893928 427947 1237424 1037714 968912 355618 1325930 672337
1:125 100840 338543 327337 238796 423002 358771 324117 182561 386787 295422
1:625 5651 17490 19520 14311 115541 27823 69209 33119 39449 19414
1:3125 4609 13937 15148 12732 103158 17725 60731 26740 19343 5809
1:15625 1314 2528 3475 2784 100192 16068 58124 25929 17971 4870
H-O 879 890 1408 1239 93965 14343 59385 24997 16579 4172
Signal/Rausch-Verh (Signal/Signal H20)
4b Ident Nr 55 506 493 494 487
Probe Salzkonz 50 M 525 mM 50 mM 625 mM 50 mM 625 mM 50 mM 625 mM 50 mM 525 mM
HGV PCR Produkt 1 :5 483,31 748,37 841,18 268,52 16,72 65,95 18,27 9,91 101,76 111,04
1:25 296,72 818,36 634,89 345,40 13,17 72,35 16,32 14,23 79,98 161,15
1:125 114,72 380,38 232,48 192,73 4,50 25,01 5,46 7,30 23,33 70,81
1:625 6,43 19,65 13,86 11,55 1,23 1,94 1,17 1,32 2,38 4,65
1:3125 5,24 15,66 10,76 10,28 1,10 1,24 1,02 1,07 1,17 1,39
1:15625 1,49 2,84 2,47 2,25 1,07 1,12 0,98 1,04 1,08 1,17
H20 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00
Beispiel 4
Reduktion des Leerwertes und der unspezifischen Kreuzreaktivität bei ECL-Messungen
Die Durchführung des Experimentes ist in Beispiel 3 beschrieben. Als Probenmaterial wurde ein mit Biotin-markierter Längenstandard (entspr. Cat.No. 1062590, nur 5' Biotin- markiert) verwendet. Die Konzentration der Stocklösung: 1 μl entspr. 250 ng DNA.
Folgende Detektionssonden wurden verwendet:
A. DNA-Sonde:
Ru- CCA CTA TAG GTG GGT CTT (SEQ.ID.NO. 5) Id.Nr. 55
B: PNA-Sonden:
Ru Glu2 CCA CT(TGlu)A TAG GT(TGlu)G GGT CTT Gly Id. Nr. 506
Ru Gly3 TAT AGG TGG GTC TT Gly Id. Nr. 484
Ru Gly3 ACT ATA GGT GGG TCT T Gly Id. Nr. 486
Das Ergebnis ist in Tabelle 5 wiedergegeben. 5a gibt den Mittelwert der Signale aus einer Doppelbestimmung wieder, 5b zeigt das Verhältnis des Signals zum Hintergrundsignal. Die wichtigsten Erkenntnisse sind:
• Unspezifische Hybridisierungsreaktionen sind nur mit den beiden unmodifizierten PNA-Sonden zu beobachten, nicht jedoch mit der erfindungsgemäß modifizierten Sonde oder mit der Referenz.
• Die Stärke der unspezifischen Reaktionen nimmt mit der Läge der unmodifizierten Sonden zu (484: 14-mer; 486: 16-mer).
Tabelle 5 Sonde 55 506 484 486
5a Salz OmM 50 mM 625 mM OmM 50 mM 625 mM 50 mM 625 mM 50 mM 625 mM
Probe
HGV PCR Produkt 1:5 246843 424834 666051 1211085 1184377 332695 1331089 823696 2802342 1274087
1:25 149673 260813 728338 795203 893928 427947 787229 873993 3000544 1790686
1:125 64415 100840 338543 308401 327337 238796 293682 337931 922030 694632
1:625 3850 5651 17490 20053 19520 14311 15307 19104 37393 30758
1:3125 3028 4609 13937 13965 15148 12732 4324 6090 9437 5436
1:15625 1188 1314 2528 2844 3475 2784 3944 5204 7423 3864
H20 880 879 890 1204 1408 1239 3084 4432 5607 1925
HGV Primer 871 852 876 2186 2622 1494
Längenmarkerr VI 1:100 739 743 900 1075 1266 1836 9225 10845 25825 7712
1:20 774 782 878 1462 1865 1344 22773 29318 87218 29046
1:10 811 809 867 1307 1524 1288 38744 46311 140360
HBV PCR Produkt 1:5 834 856 904 921 1123 1225
Sonde 55 506 484 486
5b Salz OmM ! 50 mM ( 325 mM OmM ! 50 mM ( 525 mM 50 mM f 325 mM 50 mM ( 325 mM
Probe
HGV PCR Produkt 1:5 280,5 483,3 748,4 1005,9 841,2 268,5 431,2 185,9 499,8 661,9
1:25 170,1 296,7 818,4 660,5 634,9 345,4 255,0 197,2 535,1 930,2
1:125 73,2 114,7 380,4 256,1 232,5 192,7 95,1 76,2 164,4 360,8
1:625 4,4 6,4 19,7 16,7 13,9 11,6 5,0 4,3 6,7 16,0
1:3125 3,4 5,2 15,7 11,6 10,8 10,3 1,4 1,4 1J 2,8
1:15625 1,4 1,5 2,8 2,4 2,5 2,2 1,3 1,2 1,3 2,0
H20 1.0 1.0 1.0 1,0 1,0 1,0 1,0 1.0 1,0 1,0
HGV Primer 1,0 1.0 1,0 1,8 1,9 1,2
Längenmarker VI 1:100 0,8 0,8 1,0 0,9 0,9 1,5 3,0 2,4 4,6 4,0
1:20 0,9 0,9 1,0 1,2 1,3 1,1 7,4 6,6 15,6 15,1
1:10 0,9 0,9 1.0 1,1 1,1 1,0 12,6 10,4 25,0
HBV PCR Produkt 1:5 0,9 1,0 1,0 0,8 0,8 1,0
Beispiel 5
Einfluß des Salzgehaltes auf die Sensitivität des Nukleinsäurenachweises
Analog zu Beispiel 3 wurde HGV mit Hilfe einer DNA-Sonde (Schaubild 1), einer positiv geladenen PNA-Sonde (Schaubild 3) und zweier negativ geladener Sonden (Schaubilder 2 und 4) bestimmt. Dabei wurde der Salzgehalt ( 0; 50; 150; 200; 300; 625 mM) variiert. Die Messergebnisse sind in FIG 2 graphisch gezeigt. Die Ergebnisse sind in der Beschreibung diskutiert.
SEQUENZPROTOKOLL
(1) ALLGEMEINE ANGABEN:
(i) ANMELDER:
(A) NAME: Boehringer Mannheim GmbH
(B) STRASSE: Sandhoferstr. 1 16
(C) ORT: Mannheim
(E) LAND: DE
(F) POSTLEITZAHL: 68305
(G) TELEFON: 0621 759 4348 (H) TELEFAX: 0621 759 4457
(ii) BEZEICHNUNG DER ERFINDUNG: Modifizierte Nukleinaeureanaloga (iii) ANZAHL DER SEQUENZEN: 5 (iv) COMPUTER-LESBARE FASSUNG:
(A) DATENTRÄGER: Floppy disk
(B) COMPUTER: IBM PC compatible
(C) BETRIEBSSYSTEM: PC-DOS/MS-DOS
(D) SOFTWARE: Patentin Release #1.0, Version #1.30 (EPA)
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 1 :
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 20 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Sonstige Nucleinsäure
(A) BESCHREIBUNG: /desc = "Oligodesoxyribonukleotid" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 1 : CGGCCAAAAG GTGGTGGATG 20
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 2: (i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 19 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Sonstige Nucleinsäure
(A) BESCHREIBUNG: /desc = "Oligodesoxyribonukleotid" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 2: CGACGAGCCT GACGTCGGG 19
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 3:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 18 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Sonstige Nucleinsäure
(A) BESCHREIBUNG: /desc = "Oligodesoxyribonukleotid" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 3: GGAGTGTGGA TTCGCACT 18
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 4:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 18 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Sonstige Nucleinsäure
(A) BESCHREIBUNG: /desc = "Oligodesoxyribonukleotid" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 4: TGAGATCTTC TGCGACGC 18 (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 5:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 18 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Sonstige Nucleinsäure
(A) BESCHREIBUNG: /desc = "Oligodesoxyribonukleotid" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 5: CCACTATAGG TGGGTCTT 18

Claims

Ansprüche
1. Mit Nukleinsäuren hybridisierendes Molekül mit einem Grundgerüst aus lineaer miteinander verknüpften Monomereinheiten, wobei mindestens eine der Monomereinheiten eine nichtnukleosidische Einheit ist, die eine Säurefunktion mit einem pK, von weniger als 3.0 enthält.
2. Molekül gemäß Anspruch 1 enthaltend mindestens eine nicht-nukleosidische Monomereinheit der Formel I
[!]
( I )
wonn
L ausgewählt ist aus der Gruppe Wasserstoff, Hydroxyl, (C,- C4)- Alkanoyl, nukleobasenbindende Gruppe, (C6-C14)-Aromaten. Heterocyclen mit Stickstoff- , Sauerstoff- oder/und Schwefel-Atomen, Interkalatoren und Reportergruppen,
A ein Abstandshalter mit einer Länge von 1 bis 3 Atomen,
x eine Zahl zwischen 0 und 3,
B eine Grundgerüsteinheit mit einer Länge von zwischen 4 und 8 Atomen,
R eine Gruppe enthaltend eine Säurefunktion mit einem pK_ von weniger als 3.0
bedeuten.
3. Molekül gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß L über A an ein Stickstoffatom in B gebunden ist.
4. Molekül gemäß Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß R nicht an das Stickstoffatom gebunden ist.
5. Molekül gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Monomereinheit die Formel II aufweist,
wonn
E' und F' unabhängig voneinander CO, CS, SO, SO, oder NR1,
wobei Rl ausgewählt ist aus der Gruppe Wasserstoff und (C,-C3)-Alkyl
N ein Aminstickstoffatom,
C (CR2R3)n oder CR2R3CR4R5
wobei
R2, R3, R4 und R5 unabhängig voneinander ausgewählt sind aus der Gruppe Wasserstoff, C,-C6-(substituiertes oder unsubstituiertes) Alkyl, Hydroxyl, Carboxyl und einer die Säurefunktion enthaltenden Gruppe, und
n eine Zahl zwischen 1 und 4 ist, und
D (CR2R3)n oder CR2R3CR4R5
wobei
R2, R\ R4 und R5 unabhängig voneinander ausgewählt sind aus der Gruppe Wasserstoff, C,-C6-(substituiertes oder unsubstituiertes) Alkyl, Hydroxyl, Carboxyl und einer die Säurefunktion enthaltenden Gruppe, und
n eine Zahl zwischen 1 und 4 ist, bedeuten.
6. Molekül gemäß Anspruch 5. dadurch gekennzeichnet, daß D abgeleitet ist von Serin oder einem Homologen von Serin.
7. Molekül gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Säurefunktion ausgewählt ist aus den Gruppen der Sulfonsäuren, der Phosphon- säuren oder der Phosphorsäuren.
8. Molekül gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Säurefunktion über einen Abstandshalter A' von zwischen 1 und 20 Atomen Länge an linear aufeinanderfolgende Atome des Grundgerüsts gebunden ist.
9. Molekül gemäß Anspruch 8. dadurch gekennzeichnet, daß der Abstandhalter A' die Formel III
-(-(-A'-)a-(-A2-)b-(-A3-)c-)d- ( HI )
hat, in der
A1 Sauerstoff, NR6 oder Schwefel,
A2 ein substituierter oder unsubstituierter Alkylen-. Alkinylen- oder
Alkenylen-rest.
A3 Sauerstoff, Schwefel oder NR6,
R6 unabhängig H oder Alkyl oder Acetyl,
a und c unabhängig voneinander eine Zahl von 0 bis 2.
b eine Zahl von 1 bis 10, und
d eine Zahl von 1 bis 4
bedeuten.
10. Molekül der Formel IV
(IV)
in der
L ausgewählt ist aus der Gruppe Wasserstoff, Hydroxyl, (C,-C4)-
Alkanoyl, nukleobasenbindende Gruppe in geschützter oder ungeschützter Form, (C6-C, 4)- Aromaten, Heterocyclen mit Stickstoff-, Sauerstoff- oder/und Schwefel-Atomen, Interkalatoren und Reportergruppen,
A ein Abstandshalter mit einer Länge von zwischen 1 und 3 Atomen.
x eine Zahl zwischen 0 und 3,
E und F unabhängig voneinander COOX, CSOX, SO:X, SO3X oder NR1 Y,
wobei
R1 ausgewählt ist aus der Gruppe Wasserstoff und (C,-C3)- Alkyl,
X ausgewählt ist aus der Gruppe Wasserstoff, der Schutzgruppen und der Aktivierungsgruppen.
Y ausgewählt ist aus der Gruppe Wasserstoff und der Schutzgruppen,
N ein Aminstickstoffatom. und
C und D unabhängig ausgewählt sind aus der Gruppe (CR2R3)n und CR2R3CR4R5
wobei
R\ R\ R4 und R5 unabhängig voneinander ausgewählt sind aus der Gruppe Wasserstoff. C,-C6-(substituiertes oder unsubstituiertes) Alkyl, Hydroxyl, Carboxyl und einer eine Säurefunktion mit einem pK. von weniger als 3.0 enthaltenden Gruppe in geschützter oder ungeschützter Form, und n eine Zahl zwischen 1 und 4 ist.
11. Verfahren zum Nachweis der Anwesenheit oder Abwesenheit einer Nukleinsäure in einer Probe, bei der zu vermuten ist, daß sie eine oder mehrere andere Nukleinsäuren enthält, deren Basensequenz sich von der Basensequenz der nachzuweisenden Nukleinsäure in einer oder mehreren Positionen unterscheidet, enthaltend die Schritte
- Inkontaktbringen einer Sonde, welche eine zu der nachzuweisenden Basensequenz, nicht jedoch einer Basensequenz der anderen Nukleinsäuren komplementäre Basensequenz enthält und
- Feststellung, ob eine Bindung der Sonde an eine zu der Basensequenz komplementäre Basensequenz stattgefunden hat,
dadurch gekennzeichnet, daß als Sonde ein Molekül verwendet wird, bei dem weniger als 80 %, jedoch mindestens eine der Basen an negativ geladene Grundgerüsteinheiten gebunden sind.
12. Verfahren gemäß Anspruch 1 1, dadurch gekennzeichnet, daß sich die nicht-nukleosidische Grundgerüsteinheit an der unterschiedlichen Position von mindestens einer der beiden benachbarten Grundgerüsteinheiten unterscheidet.
13. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 1 und 12, dadurch gekennzeichnet, daß sich die unterschiedliche Position am Ende der Basensequenz befindet.
14. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 11 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß die Sonde eine Markierung trägt.
15. Verfahren gemäß Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß die Markierung ein Ruthenium-bispyridyl-Komplex ist.
16. Verwendung eines Verfahrens gemäß einem der Ansprüche 11 bis 13 zum Nachweis von Mutationen. Allelen oder Polymorphismen.
17. Verwendung eines Verfahrens gemäß einem der Ansprüche 1 1 bis 13 zur Typisierung oder Subtypisierung von Mikroorganismen.
18. Verwendung von negativen Ladungen in Sonden, die mindestens eine nichtnukleosidische Grundgerüsteinheit enthalten, zur Vermeidung unspezifischer Bindungen der Sonden an Basensequenzen, die zu weniger als 50 % komplementär zu der Sonde sind oder an feste Träger.
19. Verwendung von Säurefunktionen zur Erhöhung der Selektivität von Sonden in Bindereaktionen.
20. Verwendung von mit Nukleinsäuren hybridisierenden Molekülen, bei denen mindestens eine der Basen an eine nicht-nukleosidische negativ geladene Grundgerüsteinheit gebunden ist, als Primer zur Polymerase katalysierten Verlängerung mit Hilfe von Mononukleosidtriphosphaten.
21. Verwendung von nukleinsäurebindenen Molekülen, bei denen mindestens eine der Basen an eine nicht-nukleosidische negativ geladene Grundgerüsteinheit gebunden ist zur Transfektion in Zellen mit Hilfe von Transfektionsreagenzien.
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