NO171983B - Fremstilling av polypeptider med human-gammainterferon-aktivitet og dna-sekvens derav - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte til fremstilling av polypeptider som viser den biologiske og immunologiske aktivitet av human-gammainterferon, og DNA-sekvens som koder for en del-sekvens av human-"y-interf eron. Polypeptidene har i forhold til gammainterferon forhøyet stabilitet eller oppløselighet, og deres antivirale aktivitet varierer i spesifitet. Alle er anvendbare som antivirale, antitumorale, antineoplastiske eller imnmnomodulerende preparater.

Gammainterferon (tidligere immunointerferon eller typen II-interferon, her kort betegnet som IFN-^) ble oppdaget i året 1965 av F. Wheelock (Wheelock, Science 149 (1965), 310), som viste at IFN-t-bestemte celler kan beskytte for en virusin-feksjon. Human IFN--Y (basisviten, W.E. Stewart, II, The Interferon Systems, Springer Verlag, (2. utgave 1981)) er et polypeptid av 146 aminosyrer (Gray et al., Nature 295 (1982) 503) som er glykosylert fra naturen. Glykoproteineet har en molekylvekt på ca. 63.000-73.000 (Peska et al., J. Biol. Chem. 258 (1983), 9706) og foreligger i sin funksjonelle form, sannsynligvis som tetramer. Glykosyleringen av IFN-t er ikke nødvendig for dens funksjonalitet, således reduserer glykosidasebehandl ingen av IFN--Y ikke den antivirale aktivitet i humane fibroplast-cellekulturer (Keiker et al., J. Biol. Chem. 258 (1983), 8010).

Videre er IFN-*y i motsetning til alf ainterf eroner og betainterferoner ustabile ved pH 2, og desaktiveres også ved varme (60°C).

Utvinning av human-IFN-*Y fra cellekulturer av ønskelige cellelinjer eller fra leukocytter (blodkonserver) er bare mulig i dårlig utbytte og lav produktrenhet. Oppfinnelsen vedrører den genteknologiske fremstilling av polypeptider med gammainterferonlignende egenskaper. Human-IFN-^ har følgende peptidsekvens (Devos et al., Nucl. Acids Research 10 (1982), 2487):

Fra WO 83/04053 er et derivat av human-IFN-'Y kjent, der de første tre aminosyrene av ovennevnte sekvens er deletert og hvor det i posisjon 81 står Lys i steden for Asn i den naturlige sekvensen. Denne forbindelsen oppviser bare b0% av aktiviteten i forhold til det uforandrede molekylet.

Foreliggende oppfinnelse vedrører følgelig en genteknologisk fremgangsmåte for fremstilling av polypeptider med delsekvensen til human-gammainterferon (IFN-"y), valgt fra sekvensen som består av aminosyresekvensen 5-127, 1-127 og 5-146 i aminosyresekvensen med formel (I):

der den naturlige aminosyresekvensen ble omdannet gjennom utbytting, innføring og eventuell eliminering av aminosyrer under oppnåelse av N-terminus Asp**, kjenntegnet ved at man transformerer Escherichia coli med hybridplasmidet pKK 177,3 eller pMX 2 som inneholder et gen med et DNA med generell formel

der Pr og R står for nukleotidsekvenser som koder for følgende aminosyrer, henholdsvis aminosyresekvenser:

Pr Met,

R betyr aminosyrene 5-127, 1-127 eller 5-146 i sekvenser med

formel (I),

Z betyr én, eller fortrinnsvis to, stopp-kodoner.

Foreliggende oppfinnelse vedrører også DNA-sekvens som koder for som koder for en del-sekvens human-T-interferon, kjennetegnet ved at den har formelen

hvori (IFN-^ 5-146) betyr kodoner for aminosyrene 5-146 til IFN-7.

Den genetiske kode er som kjent degenerert, dvs. at bare for to aminosyrer koder en eneste nukleotid sekvens, mens de resterende 18 genetiske kodbare aminosyrer er å tilordne 2 og 6 tripletter. Av de herved gitte variasjonsmuligheter gjør dessuten vertcellen av forskjellige arter ikke alltid samme bruk. For syntesen av genene består således en uoverserbar mangfoldighet av kodonmuligheter. Det ble nå funnet at DNA-sekvensen I (bilag), som koder for den samlede aminosyrese-kvens 1-146, samt de herav avledede DNA-sekvenser IA, IB og IC er spesielt fordelaktig for den genteknologiske syntese av polypeptider med IFN-^-aktivitet. Ved 5'-enden av den kodende streng for DNA-sekvens I slutter seg kodonet for metionin ("triplett nr. 0") og da foran "overhengende" DNA-sekvens, tilsvarende en restriksjonsnuklease, eksempelvis Eco, RI. Ved 3'-enden av den kodende streng derimot, befinner det seg i tilknytning til et stoppkodon, eller fortrinnsvis to stoppkodoner umiddelbart eller over en mellomliggende DNA-sekvens den til et friksjonsenzym svarende sekvens eksempelvis Sal I. Forskjellige gjenkjenningssekvenser sikrer innskudd av DNA i plasmider i den ønskede orientering.

Ved 5'-enden av den kodende streng, kan det alternativt til kodoner for aminosyre metonin bestå av en presekvens (også kalt signal- eller ledesekvens) av et bakterielt eller forøvrig vertsegent protein (oversiktsartikkel: Perlman og Halvorson, J. Mol. Biol. 167 (1983), 391) som bevirker sekresjonen av det ønskede polypeptid fra cytoplasma og ved denne sekresjonsprosess avspaltes fra en i vertcellen naturlig forekommende signalpeptidase.

De to interne singulære snittsteder for restriksjonsenzymene Barn HI resp. Hind III (i kodon 34 resp. 97 av den kodende streng, eller i kodon 35 resp. 98 av den ikke-kodende streng) muliggjør subkloning av tre genfragmenter, IFN-I, IFN-II og IFN-III (se DNA-sekvens II) som kan innbygges i godt undersøkte kloningsvektorer som f.eks. pBR 322 eller pUC 8. I tillegg ble det innen strukturgenet bygget en rekke av ytterligere singulære gjenkjenningssekvenser for restriksjonsenzymer, som på den ene side skaffer en tilgang til delsekvensene IFN-7, og på den annen side muliggjør gjennom-føringen av variasjoner:

DNA-sekvens I og de ved enden tilkyttede sekvenser, lar seg oppbygge av 34 oligonukleotider med en lengde på 18 til 23 nukleotider, (se DNA-sekvens II), idet disse i første rekke syntetiseres kjemisk og deretter sammenknyttes enzymatisk over "sticky ends" av 4 til 6 nukleotider.

Ved DNA-sekvens I ble det videre tatt hensyn til at ved de aminosyrer hvortil det er å tilordne flere kodoner er disse ikke likeverdige, men viser heller den respektive vertcelle som E. coli forskjellige preferanser. Videre ble palindrom-iske sekvenser redusert til et minstemål.

Genstrukturen av DNA-sekvens I er således lett tilgjengelig for relativt små byggestener som muliggjør subkloning av tre genfragmenter i godt kjente vektorer som muliggjør deres kombinasjon til samlet gen, samt endring av dette. Således kan det etter kloning av genet med DNA-sekvens I av dette ved spalting med bestemte restriksjonsenzymer fåes en av delsekvensene, spesielt partialsekvenser IA, IB og IC, som koder for interferon-delsekvensene'tilsvarende aminosyrene 1-127, 5-146, 5-127.

Som eksempler for en delsekvens står DNA-sekvens IA som fører til et polypeptid med de første 127 aminosyrer av IFN--Y, idet DNA-sekvens I er modifisert således at ved tripletten nr. 127 tilknytter det seg umiddelbart en stopptriplett eller fortrinnsvis to stopptripletter, samt en overhengende ende for et restriksjonsenzym, eksempelvis Sal I.

Ved kutting av DNA-sekvens I med restriksjonsendonuklease Ava II og ligering av det derved dannede store fragment med en adaptorsekvens, får man derimot en DNA-sekvens IB, hvor kodonene for de første fire aminosyrer av IFN-^r er deletert, dvs. foran aminosyrer nr. 5 (asparaginsyre) står direkte metionin. Av denne DNA-sekvens IB, lar det seg over Pst I-snittsteder generere en DNA-sekvens IC, som koder for et polypeptid med aminosyrene 5-127 av IFN-7.

Innbygningen av de syntetiske gener, resp. genfragmenter i kloningsvektorer, eksempelvis i de handelsvanlige plasmider pUC 8 og pBR 322 resp. andre generelt tilgjengelige plasmider som ptac 11 og pKK 177.3, foregår på i og for seg kjent måte. De kjemisk syntetiserte gener kan på forhånd utstyres med egnede kjemisk syntetiserte kontrollregioner, som muliggjør en ekspresjon av proteinene. Hertil kan det henvises til læreboken av Maniatis (Molecular Cloning, Maniatis et al., Cold Spring Harbor, 1982). Transformeringen av det således dannede hybridplasmidet i egnede vertsorganismer, fortrinnsvis E. coli, er likeledes i og for seg kjent, og inngående omtalt i overnevnte lærebok. Utvinning av det eksprimerte protein og dets rensing er likeledes omtalt (J.A. Georgiades, Texas Reports in Biology and Medicine 41 (1981) 179, Came and Carter (redaktører), "Interferons and Their applications", Springer-Verlag, 1984).

De ifølge oppfinnelsen oppnådde polypeptider med gammainter-feronaktivitet ifølge DNA-sekvensene IA, IB og IC er nye.

Videre utforminger ifølge oppfinnelsen er angitt i patent-kravene.

I følgende eksempler forklares i detalj dessuten noen utforminger av oppfinnelsen, hvorav flertallet av de mulige modifikasjoner og kombinasjoner er vist for fagmannen. Prosentangivelsene refererer seg herved til vekt når ikke annet er angitt.

Eksempler

1. Kjemisk syntese av et enkeltstrenget oligonukleotid.

Som eksempel på genbyggesten Ia, som omfatter nukleotidene 1-23 av den kodende streng, forklares syntesen av genbygge-stenene. De kjente metoder (M.J. Gait et al., Nucleic Acids Res. 8 (1980) 1081-1096)) bindes kovalent med ved 3<*->endestående nukleosid i foreliggende tilfelle altså cytidin (nukleotid nr. 23), til kiselgel ("Fractosil", firma Merck), over 3'-hydroksyfunksjonen. Hertil settes i første rekke kiselgelen under avspalting av etanol med 3-(trietoksysilyl)-propylamin, idet det oppstår en Si-O-Si-binding. Cytidin omsettes som N^-benzoyl-3'-0-succinoyl-5'-dimetoksytrietyl-eter i nærvær av paranitrofenol og N,N'-dicykloheksylkarbo-diimid med den modifiserte bærer, idet den frie karboksy-gruppe av succinoylgruppen acylerer aminoresten av propyl-aminogruppen.

I de følgende syntesetrinn anordnes basekomponentene som 5'-O-dlmetoksytr i tyl-nukleosid-3 '-fosforsyrlingmonometylester-dialkylamid eller -klorid, idet adeninet foreligger som N<6->benzoylforbindelse, cytosinet som N^-benzoylforbindelse, guanin som N^-isobutyrylforbindelse og det ikke aminogruppe-holdige thymin uten beskyttelsesgruppe. 50 mg av den polymere bærer som inneholder bundet 2 pmol cytosin behandles i rekkefølge med følgende stoffer:

a) nitrometan,

b) mett sinkbromidoppløsning i nitrometan med 1% vann,

c) metanol,

d) tetrahydrofuran,

e) acetonitril,

f) 40 jimol av det tilsvarende nukleodisfosfit og 200 pmol tetrazol i 0,5 ml vannfri acetonitril (5 minutter), g) 20% acetanhydrider i tetrahydrofuran med 4056 lutidin og lOSé dimetylaminopyridin (2 minutter),

h) tetrahydrofuran,

i) tetrahydrofuran med 20$ vann og 40% lutidin,

j ) 3% jod i kollidin/vann/tetrahydrofuran i volumforhold

5:4:1,

k) tetrahydrofuran og

1) metanol.

Med "fosfit" forståes herved deoksyribose-3'-monofosfor-syrling-monometylester , idet 3. valens er avmettet med klor eller en tertiær aminogruppe, eksempelvis en morfolinorest. Utbyttene av de enkelte syntesetrinn kan bestemmes resp. etter detrityleringsreaksjon b) spektrofotometrisk med måling av absorpsjonen av dimetoksytritylkationer ved en bølgelengde på 596 nm.

Etter avsluttet syntese av oligonukleotider avspaltes metylfosfatbeskyttelsesgruppene av den oligomere ved hjelp av p-tiokresol og trietylamin.

Deretter adskilles ved tre timers behandling med ammoniakk oligomikleotidet fra den faste bærer. En 2- til 3-dagers behandling av oligomeren med konsentrert ammoniakk avspalter aminobeskyttelsesgruppen av basen kvantitativt. Det således dannede råprodukt renses ved høytrykk væskekromatografi (HPLC), eller ved polyakrylamid-gelelektroforese.

Helt tilsvarende syntetiseres også de øvrige genbyggestener Ib-IIIl, hvis nukleotidfølge fremgår av DNA-sekvensen II. 2. Enzymatisk sammenknytning av de enkeltstrengede oligonukleotider til genfragmentene IFN-I, IFN-II og IFN-III.

Til fosforylering av oligonukleotidene ved 5'-terminus med hver gang 1 mmol av oligonukleotidene Ia og Ib, behandles med 5 nmol adenosintrifosfat med fire enheter T4-polynukleotid-kinase i 20 pl 50 mM tris-HCl-buf fer (pH 7,6), 10 mM magnesiumklorid og 10 mM ditiotritol (DTT) i 30 minutter ved 37°C (CC. Richardson, Progress in Nucl. Acids Res. 2 (1972) 825). Enzymet desaktiveres ved 5 minutters oppvarming ved 95°C. Deretter hybridiseres oligonukleotidene Ia, Ib mot hverandre, idet man oppvarmer den i vandig oppløsning 2 minutter ved 95'C, og deretter avkjøler langsomt til 5°C.

Analogt fosforyleres oligonukleotidene Ic og Id, le og If, lg og Ih, samt li og Ij, og hybridiseres parvis. For subfrag-mentet IFN-II fosforyleres oligonukleotidene Ila med Ilb og så videre til Ilk med III og for subf ragmentet IFN-III oligomerene Illa med Illb osv. til Ulk med lill, og hybridiseres parvis.

De således dannede fem oligonukleotidpar for genfragment IFN-I resp. de seks oligonukleotidpar for genfragmentene IFN-II og IFN-III, ligeres resp. som følger: De dobbeltstrengede nukleotider forenes og ligeres i resp. 40 pl, 5 mM tris-HCl-buffer, 20 mM magnesiumklorid og 10 mM DTT ved hjelp av 100 enheter T4-DNA-ligase ved 15"C i løpet av 16 timer.

Rensingen av genfragmentet IFN-I til IFN-III foregår ved gelelektroforese på en 10%-ig polyakrylamidgel (uten urinstoff-tilsetning, 20 • 40 cm, 1 mm tykkelse), idet som markerings-stoff tjente ØX DNA, kuttet med Hinf I, eller pBR 322, kuttet med Hae III. 3. Fremstilling av hybridplasmider, som inneholder genfragmentene IFN-I, IFN-II og IFN-III.

a) Innhygning av genfragment IFN-I i pBR 322.

Det kommersielle plasmid pBR 322 åpnes på kjent måte med

restriks jonsendonukleasene Eco Ri og Barn HI etter fremstillerens angivelser. Fordøyelsesblandingen oppdeles på kjent måte på en 5%-ig polyakrylamidgel med elektroforese og bruddstykkene gjøres synlige ved farging med etidiumbromid eller ved radioaktiv markering ("Nick-Translation", ifølge Maniatis, a.a.o). Plasmidbåndet utsnittes deretter fra akrylamidgelen og adskilles elektroforetisk fra polyakrylamid. Separering av blandingen kan også foregå på 2%-ig lavtsmeltende agarosegeler (som beskrevet i eksemepl 6a). 1 pg plasmid ligeres deretter med 10 ng genfragment i IFN-I natten over ved 16°C. Man får hybridplasmider ifølge fig. 1.

b) Innbygning av genfragmentet IFN-II i pUC 8.

Analogt a) kuttes det kommersielle plasmid pUC 8 med Bam HI

og bind III, og ligeres med genfragment IFN-II. Man får hybridplasmider ifølge fig. 2.

c) Innbygning av genfragmentet IFN-III i pUC 8.

Analogt a) kuttes plasmid pUC 8 med Hind III og Sal I ligeres

med genfragmentet IFN-III. Man hybridplasmidet ifølge fig. 3.

4. Syntese av det komplette gen.

a) Transformering og ampiifikasjon.

De således dannede hybridplasmider transformeres i E. coli.

Hertil gjøres stammen E. coli K 12 kompetent ved behandling av hybridplasmidet i 10 mM tris-HCl-buffer (pH 7,5) som er 80 mM på kalsiumkloridet. De transformerte stammer selekteres på vanlig måte under utnyttelse av de ved plasmidet formid-lede antibiotikaresistenser resp. -følsomheter og hybridplasmid amplifiseres. Etter avlivning av cellene isoleres hybridplasmidene, kuttes med opprinnelig, anvendte restriksjonsenzymer og genfragmenter IFN-I, IFN-II og IFN-III isoleres ved gelelektroforese.

b ) Sammenknytning av genfragmentene.

De ved amplifikasjon dannede subfragmenter IFN-I, IFN-II og IFN-III sammenknyttes enzymatisk som omtalt i eksempel 2, og det således dannede syntetiske gen med DNA-sekvensen I innføres i kloningsvektor pUC 8. Man får et hybridplasmid ifølge fig. 4. 5. Syntese av hybridplasmider som inneholder DNA-sekvensen IA, IB og IC.

a) Hybridplasmid med innrykket IB.

Hybridplasmid ifølge fig. 4, som inneholder DNA-sekvensen I,

kuttes etter kjente metoder med restriksjonsenzymene i Eco R I og Sal I, det lille Eco RI- og Sal I-fragment adskilles ved polyakrylamidgelektroforese og etterkuttes med enzymet Ava II. Ved hjelp av følgende adaptorer

får man etter ligering med det på forhånd frembragte store DNA-fragment et hybridplasmid som inneholder innsatt DNA-sekvensen IB (fig. 5).

b) Hybridplasmid med innrykket IA.

DNA-sekvens I snittes med restriksjonsenzym Pst I etter

fremstillerens angivelser og Eco RI-Pst I-fragmenter Isoleres. Ved siden av åpnes det handelsvanlige plasmid pUC 8 med restriksjonsenzymene Eco RI og Sma I, og på forhånd Isolerte fragment innrykkes ved hjelp av følgende adaptor:

idet man får et hybridplasmid ifølge fig. 6.

c) Hybridplasmid med innsatt IC.

Det fra eksempel 5a resulterende hybridplasmid underkastes

fordøyelse med Eco RI og Pst I. Det isolerte (Eco RI - Pst I)-fragment ligeres analogt 5b til et hybridplasmid som nå inneholder innrykket DNA-sekvensen IC (fig. 7). 6. Konstruksjon av hybridplasmider for ekspresjon av DNA-sekvensene IA, IB og IC.

a) Innbygning i pKK 177,3.

Ekspresjonsplasmid pKK 177,3 (plasmid ptac 11, Amman et al.,

Gene 25 (1983) 167, hvor det i Eco RI-gjenkjenningsdelen syntetisk ble innbygget en sekvens som inneholdt et Sal I-snittsted) åpnes ved restriksjonsenzymene Eco RI og Sal I. Av plasmidet ifølge fig. 5 utkuttes innrykkingen IB med restriksjonsenzymene Eco RI og Sal I. På samme måte isoleres også (bare litt forlengede) innrykninger IA<*> og IC<*>, da bare få nukleotider bak den egentlige ende av de to genfragmenter karakterisert ved snittstedet av restriksjonsenzymene Sma I, i plasmidet pUC 8 sitter et Sal I-snittsted (fig. 6 og 7).

Fragmentene IA<*>, IB og IC<*>, haes på 2%-ig lavtsmeltende agarose, adskilt fra plasmid-DNA, og innrykningen gjenvinnes ved oppløsning av gelen ved forhøyet temperatur (etter fremstillerens forholdsregler). Ved ligering av det kuttede plasmid pKK 177,3 med fragmentene IA** resp. IB eller IC**, tilveiebringes et hybridplasmid hvor det hver gang foran innrykningen er koblet en ekspresjons- resp. regulasjons-region etter tilsetning av egnet induktor som isopropyl-P-tiogalaktopyranosid (IPTG) dannes en mRNA, som fører til ekspresjon av metionylpolypeptidet tilsvarende DNA-sekvensene IA resp. IB eller IC.

b) Innbygning i pMX 2.

Ekspresjonsplasmidet pMX 2 består av en rundt 21 nukleotider

forkortet pUC 8 plasmid og fremstilles på følgende måte:

pUC 8 åpnes med restriksjonsendonuklease Eco RI og behandles deretter med eksonuklease Bal 31 under betingelser som muliggjør avspalting av f.eks. 20 nukleotider på begge sider av Eco RI-snittstedet (Maniatis a.a.O.). Deretter oppfylles eventuelt overstående ender av det således behandlede plasmid med Klenow-DNA-polymerase, plasmidet etterkuttes med restriksjonsendonuklease Hind III, og plasmidet renses over 1%-ig lavtsmeltende agarosegel etter fremstillerens forholdsregler. I plasmidet gjeninnrykkes den opprinnelige i pUC 8 tilstedeværende ved restriksjonsenzymsnittene Eco RI og Hind III begrensede polylinker, som ble ødelagt med de på forhånd omtalte manipulasjoner. Dertil åpnes pUC 8 restriksjonsenzymet Eco RI og de overstående ender oppfylles ved Klenow-DNA-polymerase under anvendelse av 32P-markerte nukleosidtri-fosfater. Polylinkere utkuttes deretter fra plasmidet med restriksjonsenzymet Hind III, og adskilles ved elektroforese på 10% akrylamidgeler fra plasmidet. Etter identifikasjon av polylinkerbåndet ved hjelp av en autoradiografi befries polylinken ved elektroelusjon for akrylamidrester og ligeres i det forkortede pUC 8-plasmid. Det således konstruerte plasmid pMX 2 åpnes deretter med restriksjonsenzymet Eco RI og Sal I, og ligeres med -y-interf eron-genfragmenter IA<*> resp. IB eller IC<*>, som ved deres ender har Eco RI- og Sal I-gjenkjenningssekvenser i ekspresjonsplasmidet pMX 2 (fig. 8 til 10). Kloner som viser en høy interferontiter, identifi-seres deretter ved hjelp av den biologiske aktivitetsbestemm-else.

7. Transformering med hybridplasmider.

Kompetente E. coli-celler transformeres med 0,1 til 1 pg av hybridplasmidene pMX2 som inneholder sekvensene IA eller IB eller IC, og utplates på ampicillinholdige agarplater. Deretter lar kloner, som inneholder korrekt integrerte *y-interferongensekvenser i de tilsvarende plasmider, seg identifisere ved hjelp av DNA-hurtigopparbeidelse (Maniatis a.a.O.). 8. Ekspresjon av -y-interferon-aktivitetholdig polypeptid. Etter transformasjon av de nevnte hybridplasmider i E. coli uttrykkes polypeptider som foruten de tilsvarende -y-interferon-aminosyresekvenser ved aminoterminusen dessuten har de ekstra metoningrupper nemlig

ved konstruksjon IA met-tlFN-T, aminosyrer 1-127),

ved konstruksjon IB met-(IFN--Y, aminosyrer 5-146),

og ved konstruksjon IC met-flFN-^, aminosyrer 5-127).

9. Opparbeidelse og rensing.

De til den ønskede optiske tetthet kultiverte bakteriestam-mer, inkuberes med en egnet induktor, eksempelvis IPTG tilstrekkelig lenge, eksempelvis 2 timer. Deretter avlives cellene med 0,1% kresol og 0,1 mM benzylsulfonylfluorid. Etter sentrifugering eller filtrering, opptas cellemassen i en bufferoppløsning (50 mM tris, 50 mM EDTA, pH 7,5) oppslut-tes mekanisk, eksempelvis med en French-presse, resp. "Dyno"-mølle (fabrikk Willy Bachofer, Basel), hvorpå de oppløselige bufferbestanddeler bortsentrifugeres. Av det ovenstående renses de "y-interf eron-aktivitetholdige proteiner etter vanlige fremgangsmåter. Egnet er ioneutveksler-, adsorp-sjons-, gelfiltrasjonssøyler eller affinitetskromatografi, og antistoffsøyler. Det ved hjelp av natriumdodecylsulfat-akrylamidgel- eller HPLC-analytlkk kontrolleres anrikning på renhet av produktet.

Til biologisk karakterisering av produktene på -y-interf eronaktivitet, benyttes på kjent måte indikatorcellelinjer som eksempelvis vero-celler og inkuberes med fortynningsrekker av interferonholdige bakterieekstrakter. Deretter undersøkes ved infeksjon med en virus som VSV (vesikulær stomatitis-virus) inntil hvilket fortynningstrinn behandlingen med bakterieekstrakt med veroceller kunne oppnås en antiviral status. Vurderingen kan foregå mikroskopisk eller ved bestemmelse av nøytralrød-opptak.

Bestemmelsen av -y-interf eronaktivitet kan også foregå med en handelsvanlig radioimmunoassay (Celltech Ltd.) som er oppbygget på et monoklonalt antistoff mot "Y-interferon.

10. Modifikasjon av DNA-sekvensen.

a) Til fremstilling av en -y-interferonanalog, hvor det i stilling 102 i stedet for serin står glutaminsyre, fremstilles ifølge eksempel 1 og 2 følgende nukleotid:

Genfragmentet IFN-III spaltes med restriksjonsenzymet Aha III, større fragment adskilles og ligeres med det overnevnte nukleotid. Innbygningen i pUC 8 foregår ifølge eksempel 3c). Etter transformasjon og amplifikasjonen ifølge eksempel 4a) verifiseres den modifiserte sekvens IFN-III ved Maxam-Gilbert-sekvensering. Legeringen av dette modifiserte subfragment med genfragmentet IFN-I og IFN-II ifølge eksempel 4, og videre gå frem ifølge eksempel 5 til 9 gir et modifisert -y-IFN, hvor det i stilling 102 er innbygget glutaminsyre i stedet for serin. Dette produkt viser antiviral aktivitet. b) ■y-interferonanalog med aminosyresekvensen 1 til 136, fulgt av cystein. Man syntetiserer nukleotidet ifølge eksempel 1 og 2. Fragmentet IFN-III snittes med restriksjonsenzymet Pst I og det største fragment adskilles. Dette ligeres med overnevnte nukleotid og videre gåes det frem som angitt ovenfor. Man får et modifisert "y-interferon inneholdende aminosyrene 1 til 136 og karboksyterminal cystein. -y-interferonanalogen er internt stabilisert, og lar seg kromatografisk ved opparbeidelsen lettere håndtere enn den naturlige -y-interferon.

Claims (2)

1. Genteknologisk fremgangsmåte for fremstilling av polypeptider med delsekvensen til human-gammainterferon (IFN-t), valgt fra sekvensen som består av aminosyresekvensen 5-127, 1-127 og 5-146 i aminosyresekvensen med formel (I) der den naturlige aminosyresekvensen ble omdannet gjennom utbytting, innføring og eventuell eliminering av aminosyrer under oppnåelse av N-terminus Asp*5, karakterisert ved at man transformerer Escherichia coli med hybridplasmid pKK 177,3 eller pMX 2 som inneholder et gen med et DNA med generell formel der Pr og R står for nukleotidsekvenser som koder for følgende aminosyrer, henholdsvis aminosyresekvenser: Pr Met, R betyr aminosyrene 5-127, 1-127 eller 5-146 i sekvenser med formel (I), Z betyr én, eller fortrinnsvis to, stopp-kodoner.

2. DNA-sekvens som koder for en del-sekvens human-t-interferon, karakterisert ved at den har formelen hvori (IFN-t 5-146) betyr kodoner for aminosyrene 5-146 til IFN--Y.