DK164940B

DK164940B - Polypeptid med human-gamma-interferonaktivitet, genteknologisk fremgangsmaade til fremstilling deraf,hybrid-plasmider indeholdende en dna-sekvens, der koder for peptidet, vaertsorganismer indeholdende hybridplasmiderne, samt laegemidler, som indeholder polypeptidet

Info

Publication number: DK164940B
Application number: DK176285A
Authority: DK
Inventors: Joachim Engels; Michael Leineweber; Eugen Uhlmann; Wolfgang Ulmer
Original assignee: Hoechst Ag
Priority date: 1984-04-19
Filing date: 1985-04-18
Publication date: 1992-09-14
Also published as: IE850995L; DK176285D0; PT80300B; IL74947A; FI851529L; NO851564L; FI90436B; EP0161504B1; PH25251A; IL74947A0; HU210111B; ZA852900B; ATE69241T1; JPH07100037B2; CA1339892C; DK164940C; JPH06153957A; NO171983B; JPH0745516B2; PT80300A

Description

i

DK 164940 B

Den foreliggende opfindelse angår et polypeptid med biologisk og immunologisk aktivitet som human-?-interferon, en genteknologisk fremgangsmåde til fremstilling af dette polypeptid, hybridplasmider indeholdende en DNA-sekvens, 5 som koder for polypeptidet, værtsorganismer indeholdende disse hybridplasmider, samt lægemidler indeholdende polypeptidet. Polypeptidet ifølge opfindelsen har i forhold til -r-interferon en forøget stabilitet eller opløselighed og er forskellig med hensyn til antiviral aktivitetsspecificitet, 10 men er lige som -r-interferon anvendeligt som antiviralt, antirumoralt, antineoplastisk eller immunmodulerende middel.

?-Interferonet (tidligere immuninterferon eller type Il-interferon, her kort betegnet IFN-ύ) blev opdaget i året 1965 af F. Wheelock [Wheelock, Science 149, 310 (1965)], 15 som viste, at IFN-ύ kan beskytte bestemte celler mod en virusinfektion. Humant IFN—r [basisviden, jf. W.E. Stewart, II, The Interferon System, Springer Verlag (2. udg.) (1981)] er et polypeptid bestående af 146 aminosyrer [Gray m.fl.,

Nature 295, 503 (1982)], som af naturen er glycosyleret.

20 Glycoproteinet har en molekylvægt på ca. 63.000-73.000 [Pestkam.fi., J. Biol. Chem. 258, 9706 (1983)] og foreligger i sin funktionelle fora sandsynligvis som tetramer. Glycosy-leringen af IFN-ύ er ikke nødvendig for dets funktionalitet; således reducerer glycosidasebehandlingen af IFN-ύ ikke den 25 antivirale aktivitet i humane fibroplast-cellekulturer [Kelker m.fl., J. Biol. Chem. 258, 8010 (1983)].

Endvidere er IFN-ύ i modsætning til a-interferonerne og jø-interferon ustabilt ved pH 2 og deaktiveres også ved varme (60'C).

30 Udvindingen af human-IFN—r ud fra cellekulturer af menneskelige cellelinier eller ud fra leucocyter (konserveret blod) er kun mulig i dårligt udbytte og med lav produktren-hed.

Fra NO-patentskrift nr. 164.177 kendes en genteknolo-35 gisk fremgangsmåde til fremstilling af humant ύ-interferon med antiviral aktivitet.

DK 164940 B

2 med antiviral aktivitet.

Human-'r - interferon har følgende peptidsekvens [Devos m.fl., Nucl. Acids Research 10, 2487 (1982)].

Cysl - Tyr - Cys - Gin - Asp - Pro - Tyr - Val - Lys - GlulO-5

Ala - Glu - Asn - Leu - Lys - Lys - Tyr - Phe - Asn - Ala20-

Gly - His - Ser - Asp - Val - Ala - Asp - Asn - Gly - Thr30-

Leu - Phe - Leu - Gly - Ile - Leu - Lys - Asn - Trp - Lys^O-

Glu - Glu - Ser - Asp - Arg - Lys - Ile - Met - Gin - Ser50-

Gln - Ile - Val - Ser - Phe - lyr - Phe - Lys - Leu - Phe60-

Lys - Asn - Phe - Lys - Asp - Asp - Gin - Ser - Ile - Gln70-

Lys - Ser - Val - Glu - Tnr - Ile - Lys - Glu - Asp - Met^O-

Asn - Val - Lys - Phe - Phe - Asn - Ser - Asn - Lys - Lys90-

Lys - Arg - Asp - Asp - Phe - Glu - Lys - Leu - Thr - AsnlOO- 15 Tyr - Ser --Val - Ihr - Asp - Leu - Asn - Val - Gin - ArgllO-Lys - Ala - Ile - His - Glu - Leu - Ile - Gin - Val - Metl20-

Ala - Glu - Leu - Ser - Pro - Ala - Ala - Lys - Ihr - Glyl30-

Lys - Arg - Lys - Arg - Ser - Gin - Met - Leu - Phe - Argl^O-

Gly - Arg - Arg - Ala - Ser - Glnl46.

20

Den genetiske kode er som bekendt "udartet", dvs. at der kun er 2 aminosyrer, der kodes med. en enkelt nucleo-tidsekvens, medens de øvrige 18 genetisk indkodelige amino-i syrer er tilforordnet 2-6 tripletter. Af de herved givne i variationsmuligheder udnytter desuden værtscellerne af 25

forskellige arter ikke altid de samme. Til syntese af gener findes derfor en uoverskuelig mangfoldighed af co-donmuligheder. Det har nu vist sig, at nedenstående DNA-sekvens IB afledt af DNA-sekvensen I

30 35

DK 164940 B

3 DNA-Sekvens I1

Triplet' nr · 0 12 3 4 5

Aminosyre Met Cys Tyr Cys Gin Asp

Nucleotid nr. 1 10 20

Kod. streng 5’ AA TTC ATG TGC TAC TGC CAG GAC

Ikke-kod. streng 3' G TAC ACG ATG ACG GTC CTG

6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

Pro Tyr Val Lys Glu Ala Glu Asn Leu Lys 30 35 40 50

C CG TAC GTT AAA GAA GCT GAA AAC CTG AAA

GGC ATG CAA ΊΤΓ CTT CGA CTT TTG GAC ΤΓΓ 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25

Lys Tyr Phe Asn Ala Gly His Ser Asp Val

60 70 80 AAA TAC TTC AAC GCT GGT CAT TCT GAC GTT

ΤΓΓ ATG AAG TEG CGA CCA GTA AGA CTG CAA

26 27 28 29 30 31 32 33 34 35

Ala Asp Asn Gly Thr Leu Phe Leu Gly Ile 90 100 110

GCT GAC AAT GGT ACT CTG TTC CTG GGG ATC

CGA CTG ΊΤΑ CCA TGA GAC AAG GAC CCC TAG

36 37 38 39 40 41 42 43 44 45

Leu Lys Asn Trp Lys Glu Glu Ser Asp Arg 120 130 140

CTG AAA AAC TGG AAA GAA GAA TCT GAC CGT

GAC ΤΓΓ TTG ACC TIT CTT CTT AGA CTG GCA

Her vist med sekvensen svarende til Eco RI og."triplet nr. 0" i aminoendestillingen og to stop-tripletter.og sekvensen for Sal I ved carboxyendestillingen.

* e

DK 164940 B

4 46 47 48 49 ' 50 51 52 53 54 55

Lys Ile Met Gin Ser Gin Ile Val Ser - Phe 150 160 170

AM ATC ATG CM TCT CAG ATC GTT TCT TIG

TIT TAG TAC GTT AGA GTC TAG CM AGA MG

56 57 58 59 60 6l 62 63 64 65

Tyr Phe Lys Leu Phe Lys Asn Phe Lys Asp 180 190 200

TAC TTC AM CTG TTC AM MC ΤΤΓ AM GAC

ATG MG TIT GAC MG ΤΓΤ TTG AM TIT CTG

66 67 68 69 70 ' 71 72 73 74 75

Asp Gin Ser Ile Gin Lys Ser Val Glu Thr 210 . 220 230

GAC CAG TCT ATC CAG AM TCT GTT GM ACT

CTG GTC AGA TAG GTC ΤΓΓ AGA CM CTT TGA

76 77 78 79 80 81 82 83 84 85

Ile Lys Glu Asp Met Asn Val Lys Phe Fne 240 250 260

ATC MG GM GAC ATG MC GTT AM TIT TTC

TAG TTC CTT CTG TAC TIG CM W AM AAG

86 87 88 89 90 91 92 93 94 95

Asn Ser Asn Lys Lys Lys Arg Asp Asp Phe 270 280 290

MC TCT' MC AM AM AM CGT GAC GAC TTC

TTG AGA TTG TIT TIT TIT GCA CTG CTG MG

96 97 98 99 100 101 102 103 104 105

Glu Lys Leu Tnr Asn Tyr Ser Val Thr Asp 300 310 320

GM MG CTT ACT MC TAC TCT GTT ACT GAT

CTT TIC GM TGA TTG ATG AGA CM TGA CIA

DK 164940 B

5 106 107 108 109 HO 111 112 113 114 115

Leu Asn Val Gin . Arg Lys Ala Ile His Glu 330 340 350

TTA AAC GTT CAA CG'T AAA GCT ATC CAC GAG

AAT TIG CAA GTT GCA ΊΤΓ CGA TAG GIG CTC

116 117 118 119 120 121 122 123 124 125

Leu Ile Gin Val Met Ala Glu Leu Ser Pro 360 370 380

CTC ATC CAG GTT ΑΊΌ GCT GAA CIG TOT CCT

GAG TAG GTC CAA TAC CGA CIT GAC AGA GGA

126 127 128 129 130 131 132 133 134 135

Ala Ala Lys Thr Gly Lys Arg Lys Arg Ser 390 400 410

GCA GCT AAA ACT GGT AAA CGT AAA CGT ICC

CGT CGA TIT TCA CCA ΊΊΤ GCA TIT GCA AGG

136 137 138 139 140 141 142 143 144 145

Gin Met Leu Phe Arg Gly Arg Arg Ala Ser 420 430 440

CAG ATC CTC TTC OGC GGT CGT CGT GCT TOT

GTC TAC GAC AAG GCG CCA GCA GCA CGA AGA

146

Gin 450 CAG TAA TAG 3’ GTC ATT ATC AGC T 5'

DK 164940 B

6 som koder for hele amlnosyresekvensen 1-146, DNA-sekvens IB* 5 0

Met (aminosyrer 5-146) Stp Stp 5' AA TTC ATG (nucleotider 21-446) TAA TAG 3' G ATT ATC AGC T 5' 10 * her fremstillet med sekvensen for Eco RI og "triplet ten nr. 0" ved aminoendestillingen og 2 stopcodoner og sekvenserne for Sma I og Sal I ved carbocyende-stillingen 15 er særlig fordelagtig til genteknologisk syntese af et poly-peptid med IFN-nr-aktivitet.

I overensstemmelse er popeptidet ifølge opfindelsen ejendommeligt ved, at det består af aminosyresekvensen 5-146 i human—r-interferon (IFN-ύ) .

20 Fremgangsmåden ifølge opfindelsen er ejendommelig ved, at der i en værtsorganisme, fortrinsvis E.coli, bringes et gen med DNA med den almene formel

Pr-R-Z

25 til ekspression, hvor Pr og R er nucleotidsekvenser, som koder for følgende aminosyrer eller aminosyresekvenser:

Pr for et præpeptid, der fraspaltes i værtsorganismen 30 eller in vitro, eller Met R for aminosyrerne 5-146 eller modifikationer af denne aminosyresekvens, og Z betyder en eller fortrinsvis to stop-codoner.

Ved 5'-enden af den indkodende streng i DNA-sekvensen 35 I sidder codonet for methionin (triplet nr. 0) og foran en "overhængende" DNA-sekvens svarende til en restriktionsen-

DK 164940 B

7 donuclease , f.eks. Eco RI. Ved 3'-enden i den indkodende streng sidder derimod i tilslutning til et stop-codon eller fortrinsvis 2 stop-codoner - umiddelbart eller over en mellemliggende DNA-sekvens - den sekvens, der svarer til et 5 restriktionsenzym, f.eks. Sal I. Ved indsættelse af DNA i plasmider fås den ønskede orientering ved hjælp af genkendelsessekvenser.

Ved den indkodende strengs 5'-ende kan der alternativt til codonet for aminosyren methionin findes en 10 præsekvens (også kaldet signal- eller ledersekvens) for et bakterielt eller på anden måde for værten særegnet protein [oversigtsartikel: Perlman og Halvorson, J. Mol. Biol.

167, 391 (1983)], som forårsager sekretion af det ønskede polypeptid ud fra cytoplasmaen og ved denne ekskre-15 tionsproces fraspaltes fra en i værtscellen naturligt forekommende signal-peptidase.

To interne særegne snitsteder for restriktionsenzymerne Barn HI og Hind III (i codon 34 og 94 i den indkodende streng eller i codon 35 og 98 i den ikke-indkoden-20 de streng) tillader subkloning af tre genfragmenter IFN-I, IFN-II og IFN-III (jfr. DNA-sekvens II)j 0

DK 164940 B

8 DNA-Sekvens II : Ia ^ IFN_I; Met Cys Tyr* Cys Gin Asp

5' AA TTC ATG TGC TAG TGC CAG GAC

3' G TAC ACG ATG ACG GTC CTG

5

Eco RI *=*-Ib- •a-Ic--► -*a-

Pro Tyr Val * Lys Glu Ala Glu Asn Leu Lys

CCG TAG GTT AAA GAA GCT GAA AAC CTG AAA

GGC ATG CAA TIT CTT CGA CTT TTG GAC ΊΤΓ 10 -m- -Id - -:je -«*- -Ig-

Lys Tyr Fhe Asn Ala Gly His Ser Asp Val

AAA TAC TTC AAC GCT GGT CAT TCT GAC GTT

ΊΤΓ ATG AAG TTG CGA CCA GTA AGA CTG CAA

-If-► -S-Ih-- -► -li-—

Ala Asp Asn Gly Thr Leu Phe Leu (Gly)

20 GCT GAC AAT GGT ACT CTG TTC CTG GG

CGA CTG ΤΓΑ CCA T3A GAC AAG GAC CCC TAG

-^ ^---;-

Barn HI

25 30 35

DK 164940 B

9 DNA-Seguens. II IFN-II: -=---Ila -:-*- (Gly) Ile Leu Lys Asn Trp Lys Glu Glu Ser Asp Arg

G ATC CTG AAA AAC IGG AAA GAA GAA TCT GAC CGT

EaraHI GAC HT TTG ACC ΊΤΓ CTT CIT AGA CTG GCA

--Ilb - -Ile-

Lys He Met Gin Ser Gin Ile Val Ser Phe A AA ATC ATG CAA TCT CAG ATC GTT TCT TTC

ΤΓΓ TAG TAC GTT AGA GTC TAG CAA AGA AAG

--s--Ud - —e-Ile-►

Tyr Phe Lys Leu Phe Lys Asn Fhe Lys Asp

TAC TTC AAA CTG TTC AAA AAC ΊΤΓ AAA GAC

ATG AAG TIT GAC AAG ITT TIG AAA TIT CTG

-^ -Ilf- --:-:-ng-

Asp Gin Ser Ile Gin Lys Ser Val Glu Thr

GAC CAG TCT ATC CAG AAA TCT GTT GAA ACT

CTG GTC AGA TAG GTC TIT AGA CAA CTT TGA

--Uh- -*► -Hi-

Ile Lys Glu Asp Met Asn Val Lys Phe Phe

' ATC AAG GAA GAC ATG AAC GTT AAA ΊΤΓ TIC

TAG TTC CTT CTG TAC TIG CAA TIT AAA AAG

--II j- -^ ^-:-Ilk-

Asn Ser Asn Lys Lys Lys Arg Asp Asp Phe

AAC TCT AAC AAA. AAA AAA CGT GAC GAC TTC

TTG AGA TTG TIT TIT TIT GCA CTG CTG AAG

.....— " — 1 k*· ·*&———————————————— in .......... »

Glu (Lys)

GAA A

CTT TTC GA Hind III

.......- .......

DK 164940 B

10 DNA-Sequens II IFN-III: ---Illa-:-»- - (Lys) Leu Thr Asn Tyr Ser Val Thr Asp

AG CTT ACT AAC TAC TCT GTT ACT GAT

Hind III A TGA TTG ATG AGA CAA T3A CIA

«s-IHb- - IIIc -►- --

Leu Asn Val Gin Arg Lys Ala Ile His Glu

ΊΤΑ AAC GTT CAA CGT AAA GCT ATC CAC GAG

AAT TTG CAA GTT GCA ΤΓΓ CGA TAG GTG CTC

-^ -tf-Uld -► -Ille-►!--

Leu Ile Gin Val Met Ala Glu Leu Ser Pro

CTC ATC CAG GTT ATG GOT GAA CTG TCT CCT

GAG TAG GTG CAA TAC CGA CTT . GAC AGA GGA

-s---Ulf-=---► ->- - Hig--Illi-

Ala Ala Lys Thr Gly Lys Arg Lys Arg Ser

GCA GCT AAA ACT GOT AAA CGT AAA CGT TCC

CGT CGA TH TGA CCA ΤΤΓ GCA ΊΊΤ GCA AGG

-HXh--- -Illi-;--Illk-

Gin Met Leu Phe Arg Gly Arg Arg Ala Ser

CAG ATG CTG TTC CGC GGT CGT CGT GCT TCT

GTC TAG GAC AAG GCG CCA GCA GCA CGA AGA

-m j-► -«-mi — -tJ~

Gin Stp Stp CAG TAA TAG 3' GTC ATT ATC AGC T 5' -tor

Sal I

o

DK 164940 B

11 som kan indbygges i godt undersøgte kloningsvektorer, såsom pBR 322 eller pUC 8. Desuden indbygges inden for strukturgenet en række af yderligere særlige genkendelsessekvenser for restriktionsenzymer, som på den 5 ene side giver adgang for delsekvenser af IFN-γ og på den anden side tillader gennemførelse af variationer: Restriktionsenzym Snit eft. nucleotid nr.

(indkodende streng)

Ava Ila) 20 10 Alu Ib) 39

Hinf ia) 134

Dde ic) 159

Aha Ilie) 199

Taq ic) 294 15 Aha Hid) 327

Sst ia) 357

Bst Nid) 362

Pst ia) 388

Bbv ia) 398 20

Sst Iia) 430

Dde Id) 444

a) speciel med hensyn til den samlede DNA-sekvens I 25 b) speciel med hensyn til delsekvensen IFN-I

c) speciel med hensyn til delsekvensen IFN-II

d) speciel med hensyn til delsekvensen IFN-III

DNA-Sekvensen I og de sekvenser, der findes 30 ved dens ender, kan opbygges af 34 oligonucleotider med en længde på 18-33 nucleotider (jfr. DNA-sekvens II), idet disse først syntetiseres kemisk og derpå via klæbrige ender på 4-6 nucleotider forbindes enzymatisk.

Ved DNA-sekvensen I er der endvidere taget 35 hensyn til, at sådanne aminosyrer, der kan tilforordnes flere codoner, ikke er ligeværdige, men tværtimod i de 0

DK 164940 B

12 pågældende værtsceller såsom E.coli udviser forskellige præferencer. Desuden reduceres palindromiske sekvenser til et minimum.

DNA-Sekvens I's genstruktur er derfor let til-5 gængelig ud fra relativt små byggesten, muliggør subklo-ning af tre genfragmenter i velkendte vektorer og tillader kombination heraf til et samlet gen samt ændringer af dette. Således kan man efter kloning af genet med DNA-sekvens I herudfra ved spaltning med bestemte restrik-10 tionsenzymer få DNA-delsekvenser, især delsekvenserne IA, IB og IC, som koder for interferon-delsekvenserne svarende til aminosyrerne 1-127, 5-146 og 5-127.

Som eksempel på en delsekvens kan tages DNA--sekvensen IA, som fører til et polypeptid med de første 15 127 aminosyrer i IFN-γ, hvorved DNA-sekvensen I er såle des ændret, at der til triplet nr. 127 umiddelbart føjes en stop-triplet eller fortrinsvis to stop-tripletter samt den udragende ende for et restriktionsenzym, f.eks.

Sal I.

20 Ved at skære i DNA-sekvensen I med restrik- tionsendonuclease AVA II og ligatering af det herved opnåede store fragment med en adaptorsekvens fås derimod en DNA-sekvens IB, hvori codonerne for de første fire aminosyrer i RFN-γ er udeladt, dvs. før aminosyre nr. 5 25 (asparaginsyre) findes direkte methionin. Ud fra denne DNA-sekvens IB kan der via Pst I-snitstedet dannes en DNA-sekvens IC, som koder for et polypeptid med aminosyrerne 5-127 i IFN-γ.

Indbygningen af de syntetiske gener eller gen-30 fragmenter i klonings vektorer, f.eks. de i handelen værende plasmider pUC 8 og pBR 322 eller andre alment tilgængelige plasmider såsom ptac 11 og pKK 177.3, sker på i og for sig kendt måde. De kemisk syntetiserede gener kan også først forsynes med egnede kemisk syntetiserede 35 kontrolregioner, som muliggør ekspression af proteinerne.

I denne forbindelse kan der henvises til Maniatis1 lære- 0

DK 164940 B

13 bog (Molecular Cloning, Maniatis m.fl., Cold Spring Harbor, 1982). Transformationen af de således opnåede hy-bridplasmider i egnede værtsorganismer, fortrinsvis E.

coli, er ligeledes i og for sig kendt og detaljeret be-5 skrevet i den ovennævnte lærebog. Udvindingen af det eksprimerede protein og dettes rensning er også beskrevet [J.A. Georgiades, Texas Reports in Biology and Medi-dine 41, 179 (19821), Came & Carter (udg.), "Interferons and Their Applications", Springer-Verlag 1984].

Hybridplasmiderne ifølge opfindelsen er ejendommelige ved, at de indeholder en DNA-sekvens IB.

Værtsorganismen ifølge opfindelsen er ejendommelig ved, at den indeholder et hybridpiasmid ifølge opfindelsen.

15 Lægemidlet ifølge opfindelsen er ejendommeligt ved, at det indeholder et polypeptid ifølge opfindelsen.

Opfindelsen forklares nærmere i de følgende ; eksempler, hvori nogle udføreIsesformer for opfindelsen 2o er detaljeret forklaret. Procentangivelser er i eksemplerne efter vægt, når andet ikke er anført.

Eksempel 1 25 Kemisk syntese af et enkelstrenget oligonucleotid

Med eksempel i genbyggestenen la, som omfatter nucleotiderne 1-23 i den indkodende streng, forklares syntesen af genbyggestenene. Ved hjælp af kendte metoder [M.J. Gait m.fl., Nucleic Acids Res. 8, 1081-1096 30 (1980)] bindes det ved 3'-enden værende nucleosid, i det foreligende tilfælde altså cytidin (nucleotid nr. 23) til kieselgel, "Fractosil"® fra firma Merck, covalent via 3'-hydroxyfunktionen. Hertil omsættes først kieselgelen 35

DK 164940 B

14 0 under fraspaltning af ethanol med 3-(triethoxysilyl)pro-pylamin, idet der opstår i Si-O-Si-binding. Cytidinet 4 omsættes som N -benzoyl-B'-O-succinoyl-S'-dimethoxytri-tylether i nærvær af paranitrophenol og N, N1-dicyclohex-5 ylcarbodiimid med den modificerede bærer, hvorved den frie carboxygruppe i succinylgruppen acylerer aminoresten i propylaminogruppen.

I de følgende syntesetrin anvendes basekomponenter som 5'-0-dimethoxytrityl-nucleosid-3'-phosphorsy-10 remonomethylester-dialkylamid eller -chlorid, idet adeni- net foreligger som N^-benzoyl-forbindelse, cytosinet som 4 2 N -benzoyl-forbindelse, guaninet som N -isobutyryl-forbindelse og thyminet, der ikke indeholder aminogrupper, uden beskyttelsegruppe.

15 50 mg af den polymere bærer, som indeholder 2^umol cytosin bundet, behandles efter hinaden med følgende stoffer: (a) Nitromethan, (b) mættet zinkbromidopløsning i nitromethan med 20 1% vand, (c) methanol, (d) tetrahydrofuran, (e) acetonitril, (f) 40^umol af det tilsvarende nucleosidphosphit 25 og 200^umol tetrazol i 0,5 ml vandfri acetoni tril (5 minutter), (g) 20% acetanhydrid i tetrahydrofuran med 40% lu-tidin og 10% dimethylaminopyridin (2 minutter), (h) tetrahydrofuran, 30 (i) tetrahydrofuran med 20% vand og 40% lutidin, (j) 3% jod i collidin/vand/tetrahydrofuran i volumenforholdet 5:4:1, (k) tetrahydrofuran og (l) methanol.

35 Ved "phosphit" forstås her desoxyribose-31-mo- nophosphorsyre-monomethylester, idet den tredje valens er

DK 164940B

o 15 mættet med chlor eller en tertiær aminogruppe, f.eks. en morpholinorest. Udbytterne i de enkelte syntestrin kan efter detrityleringsreaktionen (b) bestemmes spektro-fotometrisk ved måling af dimethoxytritylkationens ab-5 sorption ved en bølgelængde på 496 run.

Efter afsluttet syntese af olignucleotidet fraspaltes methylphosphatbeskyttelsesgrupperne for oli-gomeren ved hjælp af p-thiocresol og triethylamin.

Derefter fraskilles oligonucleotidet fra den 1° faste bærer ved hjælp af en 3 timer lang behandling med ammoniak. En behandling af oligomererne i 2-3 dage med koncentreret ammoniak fraspalter basernes aminobeskyt-telsesgrupper kvantitativt. Det således opnåede råprodukt renses ved højtryksvæskechromatografi (HPLC) eller 15 ved polyacrylamid-gelelektrophorese.

Helt tilsvarende syntetiseres også de øvrige genbyggesten Ib-IIIl, hvis nucleotidrækkefølge fremgår af DNA-sekvens II.

20 Eksempel 2

Enzymatisk sammenbinding af enkeltstrengede oligonucleo-tider med genfragmenterne IFN-I, IFN-II og IFN-III_

Til phosphorylering af oligonucleotiderne ved 5'-endestillingen behandles hvert 1 nmol oligonucleoti-25 der la og Ib med 5 nmol adenosintriphosphat med 4 enheder T4-polynucleotid-kinase i 20^ul 50 mmolær Tris-HCl--puffer (pH 7,6), 10 mmolær magnesiumchlorid og 10 mmolær dithiothreitol (DTT) i 30 minutter ved 37°C [C.C. Richardson, Progress in Nucl. Acids Res. 2, 825 (1972)].

30 Enzymet deaktiveres ved opvarmning i 5 minutter til 95°C.

Derpå hybridiseres oligonucleotiderne la og Ib mod hinanden, idet man opvarmer dem i vandig opløsning til 95°C og derpå afkøler langsomt til 5°C.

Analogt phosphoryleres oligonucleotiderne Ic 35 og Id, le og If, Ig og Ih samt li og Ij og hybridiseres parvis. Til underfragment IFN-II phosphoryleres oligo-

DK 164940 B

16 0 nucleotiderne Ila med Ilb osb. indtil Hk med III og til underfragmentet IFN-III oligomerene Illa med Hib osv. indtil Ulk med III1 og hybridiseres parvis.

De således opnåede 5 oligonucleotidpar til 5 genfragmentet IFN-I og de 6 oligonucleotidpar til genfragmenterne IFN-II og IFN-III ligateres hver som følger:

De dobbeltstrengede nucleotider forenes og ligateres i hver 40yUl 50 mmolær Tris-HCl-puffer, 20 mmo-lær magnesiumchlorid og 10 mmolær DTT ved hjælp af 100 10 enheder T4-DNA-ligase ved 15°C i løbet af 16 timer.

Rensningen af genfragmenterne IFN-I til IFN-III sker ved gelelektrophorese på en 10%'s polyacrylamidgel (uden urins tof tilsætning, 20 x 40 cm, 1 mm tyk) , idet "ØX 174 DNA" (firma BEL) snittet med Hinf I eller pBR 15 322 snittet med Hae III tjener som markør.

Eksempel 3

Fremstilling af hybridplasmider, som indeholder genfrag- menterne IFN-I, IFN-II og IFN-III_ 20 (a) Indbygning af genfragmentet IFN-I i pBR 322.

Det i handelen værende plasmid pBR 322 åbnes på kendt måde med restriktionsendonucleaserne Eco RI og Barn HI efter producentens anvisninger. Fordøjelsesblandingen opdeles på en 5%'s polyacrylamidgel.ved 25 hjælp af elektrophorese på kendte måde og brudstykket gøres .synligt ved hjælp af farvning med ethidiumbromid eller ved hjælp af radioaktiv markering (nick-translation ifølge Maniatis ovenfor), Plasmidbåndet udskæres derpå fra acrylamidgelen og fraskilles elektrophoretisk fra 30 polyacrylamidet. Opdeling af fordøjelsesblandingen kan også ske på 2%'s lavtsmeltende agarosegeler (som beskrevet i eksempel 6(a)).

Derpå ligateres 1 ,ug plasmid med 10 ng gen-fragment IFN-I natten over ved 16 C. Der fås det i fig.

35 1 viste hybridplasmid.

0

DK 164940 B

17 (b) Indbygning af genfragmentet IFN-II i pUC 8.

Analogt med (a) åbnes det i handelen værende plasmid pUC 8 med Bam HI og Hind III og ligateres med genfragmentet IFN-II. Der fås det i fig. 2 viste hy-5 bridplasmid.

(c) Indbygning af genfragmentet IFN-III i pUC 8.

Analogt med (a) åbnes plasmidet pUC 8 med Hind III og Sal I og ligateres med genfragmentet IFN-III.

Der fås det i fig. 3 viste hybridplasmid.

10

Eksempel 4

Syntese af det komplette gen (a) Transformation og udvikling.

De således opnåede hybridplasmider transforme-15 res i E.coli. Hertil gøres stammen E.coli K 12 egnet ved behandling med en 70 mmolær calciumchloridopløsning, og der tilsættes en suspension af hybridplasmidet i 10 mmolær Tris-HCl-puffer (pH 7,5) , der er 70 mmolær med hensyn til calciumchlorid. De transformerede stammer 20 udvælges som sædvanlig ved udnyttelse af de ved hjælp af plasmidet opnåede antibiotikaresistener eller -sensibiliteter, og hybridvektorerne udvikles. Efter at cellerne er dræbt,isoleres hybridplasmiderne, åbnes med de oprindeligt anvendte restriktionsenzymer, og genfragmen-25 terne IFN-I, IFN-II og IFN-III isoleres ved hjælp af gel-elektrophorese.

(b) Genfragmenternes sammenknytning.

De ved udvikling opnåede subfragmenter IFN-I, IFN-II og IFN-III 'forbindes enzymatisk som beskrevet i ek-30 sempel 2, og det således opnåede syntetiske gen med DNA-sekvensen I indføres i kloningsvektoren pUC 8. Der fås det i fig. 4 viste hybridplasmid.

35 0

DK 164940 B

18

Eksempel 5

Syntese af hybridplasmider, som indeholder DNA-sekvensen IA, IB og IC_ (a) Hybridplasmid med indsat IB.

5 Hybridplasmidet ifølge fig. 4, som indeholder DNA-sekvensen I, åbnes ved hjælp af kendte metoder med restriktionsenzymerne Eco RI og Sal I, det lille Eco RI-og Sal I-fragment fraskilles ved hjælp af polyacrylamid-gel-elektrophorese og åbnes derefter med enzymet Ava II.

10 Ved hjælp af følgende adaptor 5’ AA TTC ACC ATG 3’ 3' G TGG TAC CTG 5’

Eco RI Ava II

15 fås efter ligatering med det i forvejen fremstillede store DNA-fragment et hybridplasmid/ som indeholder den indsatte DNA-sekvens IB (fig. 5).

(b) Hybridplasmid med indsat IA.

DNA-Sekvensen I åbnes med restriktionsenzymet 20 Pst I efter producentens angivelser, og Eco RI-Pst I-frag-mentet isoleres. Desuden åbnes det i handelen værende plasmid pUC 8 med restriktionsenzymerne Eco RI og Sma I, og det tidligere isolerede fragment indsættes ved hjælp af følgende adaptor 25 5’ GOT TAG TAA CCC 3' 3' A CGT CGA ATC ATT GGG 5'

Pst I Sma I

hvorved man får det i fig. 6 viste hybridplasmid.

30 (c) Hybridplasmid med indsat IC.

Det ifølge eksempel 5(a) opnåede hybridplasmid underkastes fordøjelse med Eco RI og Pst I. Det i-solerede (Eco RI-Pst I)-fragment ligateres analogt med eksempel 5(b) til et nyt hybridplasmid, der nu indehol- 35 der aen indsatte DNA-sekvens IC (fig. 7).

0

DK 164940 B

19

Eksempel 6

Konstruktion af hybridplasmider til ekspression af DNA- sekvenserne IA, IB og IC_ (a) Indbygning i pKK 177.3.

5 Ekspressionsplasmidet pKK 177.3 [Plasmid ptac 11, Aman m.fl., Gene 25, 167 (1983)], hvori der i Eco RI-genkendelsesstedet syntetisk er indbyttet en sekvens, som indeholder Sal I-snitstedet), åbnes med restriktionsenzymerne Eco RI og Sal I. Ud fra plasmidet ifølge fig.

10 5 udskæres det indsatte IB med restriktionsenzymerne Eco RI og Sal I. På samme måde isoleres også de indsatte (kun lidt forlængede) IA og IC , da der kun få nucleo-tider bag ved den egentlige afslutning af de to genfragmenter, der er kendetegnet ved snitstedet for restriktions-15 enzyme. Sma I, i plasmidet pUC 8 sidder et Sal I-snit-sted (fig. 6 og 7).

Fragmenterne IA*, IB og IC* påføres på 2%'s lavtsmeltende agarose, fraskilles fra plasmid-DNA'et, og de indsatte dele genudvindes ved opløsning af gelen ved 20 forhøjet temperatur (efter producentens angivelser). Ved ligatering af det åbnede plasmid pKK 177.3 med fragmen-terne IA , og IB eller IC frembringes et hybridplasmid, hvori der forud for de indsatte fragmenter er indskudt en ekspressions- eller regulationsregion. Efter tilsæt-25 ning af en egnet induktor såsom isopropyl-8-thiogalacto-pyranosid (IPTG) dannes et mENA, som fører til ekspression af methionylpolypeptiderne svarende til DNA-sekven-serne IA, IB eller IC.

(b) Indbygning i pMX 2.

30 Ekspressionsplasmidet pMX 2 består af et med 21 nucleotlder forkortet pUC 8-plasmid og fremstilles på følgende måde: pUC 8 åbnes med res'triktionsendonuclease Eco RI og behandles derefter med exonuclase Bal 31,under sådanne

QC

betingelser, at der tillades fraspaltning på ca. 20 nu-cleotider på begge sider af Eco RI-snitstedet (Maniatis

DK 164940 B

20

O

ovenfor) .

Derefter suppleres eventuelt fremspringende ender i det således behandlede plasmid med Klenow-DNA--polymerase, plasmidet efteråbnes med restriktionsendo-5 nucleasen Hind III, og plasmidet renses over IS's lavt-smeltende agarosegeler ifølge producentens anvisninger.

I plasmidet genindsættes det oprindelige, i pUC 8 forekommende, og ved hjælp af restriktionsenzymsnit Eco RI og Hind III begrænsede po lymel lems tykke, som ved hjælp 10 af de tidligere beskrevne manipulationer blev ødelagt.

Hertil åbnes pUC 8 med restriktionsenzymet Eco RI, og de ovenstående ender suppleres med Klenow-DNA-polyme- rase under anvendelse af nucleosidtriphosphater, der er 32 mærket med P. Polymellemstykket udskæres derpå fra 15 plasmidet med restriktkonsenzymet Hind III og fraskilles ved hjælp af elektrophorese på 10%'s acrylamidgeler fra plasmidet. Efter identificering af polymellemstykkebåndet ved hjælp af et autoradiogram befries polymellemstykket ved hjælp af elektroeluering for acrylamid- 90 rester og ligateres i det forkortede pDC 8-plasmid.

Det således konstruerede plasmid pMX 2 åbnes derpå med restriktionsenzymerne Eco RI og Sal I og ligateres med γ-interferon-genfragmenterne IA*, IB eller IC*, som i deres ender har Eco RI- og Sal I-genkendelsessekvenser, 25 i ekspressionsplasmidet pMX 2 (fig. 8-10) . Kloner, der udviser en høj interferontiter, identificeres derpå ved hjælp af den biologiske aktivitetsbestemmelse.

Eksempel 7 30

Transformering af hybridplasmiderne

Kompetente E.coli-celler transformeres med 0,1-1 j\ig af hybridplasmiderne^ som indeholder sekvenserne IA eller IB lier IC, og udstryges på ampicillin-holdige agarpla der. Derpå kan kloner, som indeholder i de tilsvarende plas-35 mider korrekt indsatte γ-interferon-gensekvenser, identificeres ved DNA-hurtigoparbejdning (Maniatis ovenfor).

21 0

DK 164940B

Eksempel 8

Ekspression af polypeptider med γ-interferon-aktivitet

Efter transformering af de nævnte hybridplasmi-der i E.coli eksprimeres polypeptider, som foruden de 5 tilsvarende γ-interferon-aminosyresekvenser i aminoen-destillingen yderligere har en ekstra methionylgruppe, nemlig ved konstruktionen I Met-(IFN-γ-aminosyrer 1-127), ved konstruktionen IB Met-(IFN-γ, aminosyrer 5-146) , 10 og ved konstruktionen IC Met-(IFN-γ, aminosyrer 5-127).

Eksempel 9

Oparbejdning og rensning 15 Bakteriestammerne, der er dyrket til den ønske de optiske tæthed, inkuberes med en egnet induktor, f.eks.

IPTG, i tilstrækkelig lag tid, f.eks. 2 timer. Derpå dræbes cellerne med 0,1%'s cresol og 0,1 mmolær benzyl-sulfonylfluorid. Efter centrifugering eller filtrering 20 optages cellemassen i en pufferopløsning (50 mmolær Tris, 50 mmolær EDTA, pH 7,5) og oplukkes mekanisk, f.eks. med en French-presse eller "Dyno-Muhle1® (firma Willy Bach-ofer, Basel), hvorpå de uopløselige bestanddele fracentrifugeres. Ud fra den ovenfor stående væske renses de 25 proteiner, der indeholder γ-interferon-aktivitet, ved hjælp af gængse metoder. Hertil egner sig ionbytter-, adsorptions-, gelfiltreringskolonner eller affinitets-chromatografi på antistofkolonner. Ved hjælp af natri-umdodecylsulfat/acrylamidgel- eller HPLC-analyseteknik 30 kontrolleres produkternes berigelse og renhed.

For biologisk at karakterisere produkterne med hensyn til γ-interferonaktivitet anvendes på kendt måde indikatorcellelinier, som f.eks. Vero-celler, og inkuberes med række fortyndinger af interferonholdige 35 bakterieekstrakter. Derpå kontrolleres ved hjælp af infektion med et virus såsom VSV (vesicular stomatitis vi- 0

DK 164940 B

22 rus) , med hvor stærk fortynding der ved forbehandling med bakterieekstrakten hos Vero-cellerne kan opnås en antiviral status. Bedømmelsen kan ske mikroskopisk eller ved bestemmelse af neutralrødt-optagelsen.

_ Ved CPE-måling opnås følgende resultat 5

Aminosyrer Virkning i % 1 - 146 100 (standard) 5 - 146 110 5 - 127 ca. 5 1 - 127 ca. 5 10

Bestemmelsen af γ-interferon-aktiviteten kan også ske med en i handelen værende radioimmunanalyse (Celletech Ltd.) , der er baseret på et monoklonalt antistof mod γ-interferon.

16 20 25 30 35

Claims

1. Polypeptid, kendetegnet ved, at det består af aminosyresekvensen 5-146 i human—r-interferon (IFN—r). 5

2. Human—r-interferon-analog ifølge krav 1 med antiviral, antitumoral og antineoplastisk aktivitet som ύ-interferon, kendetegnet ved, at den naturlige aminosyresekvens er ændret ved ombytning, tilføjelse eller eliminering af 10 aminosyrer, idet sekvensen altid skal starte med Asp.

3. Genteknologisk fremgangsmåde til fremstilling af polypeptid ifølge krav 1 eller 2, kendetegnet ved, at der i en værtsorganisme, fortrinsvis E.coli, bringes 15 et gen med DNA med den almene formel Pr-R-Z til ekspression, 20 hvor Pr og R er nucleotidsekvenser, som koder for følgende aminosyrer eller aminosyresekvenser: Pr for et præpeptid, der fraspaltes i værtsorganismen eller in vitro, eller Met R for aminosyrerne 5-146 eller modifikationer af 25 denne aminosyresekvens, og Z betyder en eller fortrinsvis to stop-codoner.

4. DNA-Sekvens, kendetegnet ved, at den har formlen 30 (IFN-r 5-146) (IB) hvor (IFN—r 5-146) er codonerne for aminosyrerne 5-146 i IFN—r eller modifikationer af denne aminosyresekvens. 35

5. Hybridplasmider, kendetegnet ved, at de DK 164940 B 24 indeholder en DNA-sekvens IB ifølge krav 4.

6. Hybridplasmider, kendetegnet ved, at de mellem et Eco RI- og et Sal I-snitsted indeholder DNA-sekven- 5 sen (IB) ifølge krav 4.

7. Hybridplasmider ifølge krav 6, kendetegnet ved, at de mellem Eco RI-snitstedet og codonet for de første aminosyrer i interferonsekvensen indeholder en præsekvens. 10

8. Værtsorganismer, fortrinsvis E.coli, kendetegnet ved, at de indeholder hybridplasmideme ifølge krav 5-7. 15

9. Lægemiddel, kendetegnet ved et indhold af et polypeptid ifølge krav 1 eller 2.