FI90436C - Ihmisen gammainterferonin kaltaisesti vaikuttavien polypeptidien valmistus - Google Patents
Ihmisen gammainterferonin kaltaisesti vaikuttavien polypeptidien valmistus Download PDFInfo
- Publication number
- FI90436C FI90436C FI851529A FI851529A FI90436C FI 90436 C FI90436 C FI 90436C FI 851529 A FI851529 A FI 851529A FI 851529 A FI851529 A FI 851529A FI 90436 C FI90436 C FI 90436C
- Authority
- FI
- Finland
- Prior art keywords
- lys
- asp
- ser
- leu
- asn
- Prior art date
Links
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims abstract description 20
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 title claims abstract description 18
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 title claims abstract description 17
- 230000000694 effects Effects 0.000 title description 8
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title description 6
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims abstract description 37
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 claims abstract description 20
- 102000008070 Interferon-gamma Human genes 0.000 claims abstract description 15
- 229940044627 gamma-interferon Drugs 0.000 claims abstract description 11
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 7
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 36
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 claims description 27
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 claims description 14
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 9
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 7
- -1 Met amino acid Chemical class 0.000 claims description 6
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 5
- FADYJNXDPBKVCA-UHFFFAOYSA-N L-Phenylalanyl-L-lysin Natural products NCCCCC(C(O)=O)NC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 FADYJNXDPBKVCA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- MEQLGHAMAUPOSJ-DCAQKATOSA-N Lys-Ser-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O MEQLGHAMAUPOSJ-DCAQKATOSA-N 0.000 claims description 4
- 108010034529 leucyl-lysine Proteins 0.000 claims description 4
- 108010044348 lysyl-glutamyl-aspartic acid Proteins 0.000 claims description 4
- 108700023046 methionyl-leucyl-phenylalanine Proteins 0.000 claims description 4
- 108090000467 Interferon-beta Proteins 0.000 claims description 3
- 108010073969 valyllysine Proteins 0.000 claims description 3
- HXNNRBHASOSVPG-GUBZILKMSA-N Ala-Glu-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O HXNNRBHASOSVPG-GUBZILKMSA-N 0.000 claims description 2
- LMIWYCWRJVMAIQ-NHCYSSNCSA-N Asn-Val-Lys Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)N LMIWYCWRJVMAIQ-NHCYSSNCSA-N 0.000 claims description 2
- LPCKHUXOGVNZRS-YUMQZZPRSA-N Gly-His-Ser Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O LPCKHUXOGVNZRS-YUMQZZPRSA-N 0.000 claims description 2
- 102100026720 Interferon beta Human genes 0.000 claims description 2
- 108010056243 alanylalanine Proteins 0.000 claims description 2
- 108010041407 alanylaspartic acid Proteins 0.000 claims description 2
- 108010028188 glycyl-histidyl-serine Proteins 0.000 claims description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims 1
- 108010054155 lysyllysine Proteins 0.000 claims 1
- 108010012581 phenylalanylglutamate Proteins 0.000 claims 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 abstract description 50
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 abstract description 4
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 abstract description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 2
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 abstract 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 32
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 24
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 19
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 19
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 19
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 description 14
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 12
- WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N Tetrahydrofuran Chemical compound C1CCOC1 WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 10
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 10
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 10
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 9
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 9
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 7
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 7
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 6
- 125000001360 methionine group Chemical group N[C@@H](CCSC)C(=O)* 0.000 description 6
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 6
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 6
- YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N tetrahydrofuran Natural products C=1C=COC=1 YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 102100037850 Interferon gamma Human genes 0.000 description 5
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 5
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 5
- 239000000047 product Substances 0.000 description 5
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 5
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 5
- OISVCGZHLKNMSJ-UHFFFAOYSA-N 2,6-dimethylpyridine Chemical compound CC1=CC=CC(C)=N1 OISVCGZHLKNMSJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108091033380 Coding strand Proteins 0.000 description 4
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 4
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 4
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- WFDIJRYMOXRFFG-UHFFFAOYSA-N Acetic anhydride Chemical compound CC(=O)OC(C)=O WFDIJRYMOXRFFG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 3
- ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N Triethylamine Chemical compound CCN(CC)CC ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 3
- 108010005233 alanylglutamic acid Proteins 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 3
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 3
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 3
- UHDGCWIWMRVCDJ-UHFFFAOYSA-N 1-beta-D-Xylofuranosyl-NH-Cytosine Natural products O=C1N=C(N)C=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 UHDGCWIWMRVCDJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FJVAQLJNTSUQPY-CIUDSAMLSA-N Ala-Ala-Lys Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCCN FJVAQLJNTSUQPY-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 2
- GSCLWXDNIMNIJE-ZLUOBGJFSA-N Ala-Asp-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O GSCLWXDNIMNIJE-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 2
- GIVATXIGCXFQQA-FXQIFTODSA-N Arg-Ala-Ser Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N GIVATXIGCXFQQA-FXQIFTODSA-N 0.000 description 2
- NTAZNGWBXRVEDJ-FXQIFTODSA-N Arg-Asp-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O NTAZNGWBXRVEDJ-FXQIFTODSA-N 0.000 description 2
- HQIZDMIGUJOSNI-IUCAKERBSA-N Arg-Gly-Arg Chemical compound N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O HQIZDMIGUJOSNI-IUCAKERBSA-N 0.000 description 2
- YVTHEZNOKSAWRW-DCAQKATOSA-N Arg-Lys-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O YVTHEZNOKSAWRW-DCAQKATOSA-N 0.000 description 2
- FSNVAJOPUDVQAR-AVGNSLFASA-N Arg-Lys-Arg Chemical compound NC(=N)NCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O FSNVAJOPUDVQAR-AVGNSLFASA-N 0.000 description 2
- HZPSDHRYYIORKR-WHFBIAKZSA-N Asn-Ala-Gly Chemical compound OC(=O)CNC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O HZPSDHRYYIORKR-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 2
- RVHGJNGNKGDCPX-KKUMJFAQSA-N Asn-Phe-Lys Chemical compound C1=CC=C(C=C1)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)N RVHGJNGNKGDCPX-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 2
- REQUGIWGOGSOEZ-ZLUOBGJFSA-N Asn-Ser-Asn Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)O)N)C(=O)N REQUGIWGOGSOEZ-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 2
- VMVUDJUXJKDGNR-FXQIFTODSA-N Asp-Met-Asn Chemical compound CSCC[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)N VMVUDJUXJKDGNR-FXQIFTODSA-N 0.000 description 2
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M Chloride anion Chemical compound [Cl-] VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- UHDGCWIWMRVCDJ-PSQAKQOGSA-N Cytidine Natural products O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O1 UHDGCWIWMRVCDJ-PSQAKQOGSA-N 0.000 description 2
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 2
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 2
- QOSSAOTZNIDXMA-UHFFFAOYSA-N Dicylcohexylcarbodiimide Chemical compound C1CCCCC1N=C=NC1CCCCC1 QOSSAOTZNIDXMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- ZOXBSICWUDAOHX-GUBZILKMSA-N Glu-Asn-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O ZOXBSICWUDAOHX-GUBZILKMSA-N 0.000 description 2
- IQACOVZVOMVILH-FXQIFTODSA-N Glu-Glu-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O IQACOVZVOMVILH-FXQIFTODSA-N 0.000 description 2
- FBEJIDRSQCGFJI-GUBZILKMSA-N Glu-Leu-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O FBEJIDRSQCGFJI-GUBZILKMSA-N 0.000 description 2
- STGQSBKUYSPPIG-CIUDSAMLSA-N His-Ser-Asp Chemical compound OC(=O)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 STGQSBKUYSPPIG-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 2
- YKLOMBNBQUTJDT-HVTMNAMFSA-N Ile-His-Glu Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CN=CN1)C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)O)N YKLOMBNBQUTJDT-HVTMNAMFSA-N 0.000 description 2
- ADDYYRVQQZFIMW-MNXVOIDGSA-N Ile-Lys-Glu Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)O)N ADDYYRVQQZFIMW-MNXVOIDGSA-N 0.000 description 2
- JZBVBOKASHNXAD-NAKRPEOUSA-N Ile-Val-Ser Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)O)N JZBVBOKASHNXAD-NAKRPEOUSA-N 0.000 description 2
- AZLASBBHHSLQDB-GUBZILKMSA-N Leu-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC(C)C AZLASBBHHSLQDB-GUBZILKMSA-N 0.000 description 2
- DRWMRVFCKKXHCH-BZSNNMDCSA-N Leu-Phe-Leu Chemical compound CC(C)C[C@H]([NH3+])C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C([O-])=O)CC1=CC=CC=C1 DRWMRVFCKKXHCH-BZSNNMDCSA-N 0.000 description 2
- PJWOOBTYQNNRBF-BZSNNMDCSA-N Leu-Phe-Lys Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)N PJWOOBTYQNNRBF-BZSNNMDCSA-N 0.000 description 2
- GJJQCBVRWDGLMQ-GUBZILKMSA-N Lys-Glu-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O GJJQCBVRWDGLMQ-GUBZILKMSA-N 0.000 description 2
- CBNMHRCLYBJIIZ-XUXIUFHCSA-N Lys-Ile-Met Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCCN)N CBNMHRCLYBJIIZ-XUXIUFHCSA-N 0.000 description 2
- WBSCNDJQPKSPII-KKUMJFAQSA-N Lys-Lys-Lys Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O WBSCNDJQPKSPII-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 2
- CHDYFPCQVUOJEB-ULQDDVLXSA-N Met-Leu-Phe Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 CHDYFPCQVUOJEB-ULQDDVLXSA-N 0.000 description 2
- FIDNSJUXESUDOV-JYJNAYRXSA-N Pro-Tyr-Val Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O FIDNSJUXESUDOV-JYJNAYRXSA-N 0.000 description 2
- BXLYSRPHVMCOPS-ACZMJKKPSA-N Ser-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CO BXLYSRPHVMCOPS-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108700005078 Synthetic Genes Proteins 0.000 description 2
- MPUMPERGHHJGRP-WEDXCCLWSA-N Thr-Gly-Lys Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)N)O MPUMPERGHHJGRP-WEDXCCLWSA-N 0.000 description 2
- PSALWJCUIAQKFW-ACRUOGEOSA-N Tyr-Phe-Lys Chemical compound C1=CC=C(C=C1)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC2=CC=C(C=C2)O)N PSALWJCUIAQKFW-ACRUOGEOSA-N 0.000 description 2
- TYFLVOUZHQUBGM-IHRRRGAJSA-N Tyr-Ser-Val Chemical compound CC(C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 TYFLVOUZHQUBGM-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 2
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HPANGHISDXDUQY-ULQDDVLXSA-N Val-Lys-Phe Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)O)N HPANGHISDXDUQY-ULQDDVLXSA-N 0.000 description 2
- MBGFDZDWMDLXHQ-GUBZILKMSA-N Val-Met-Ala Chemical compound C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](C(C)C)N MBGFDZDWMDLXHQ-GUBZILKMSA-N 0.000 description 2
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 2
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 2
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- UHDGCWIWMRVCDJ-ZAKLUEHWSA-N cytidine Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O1 UHDGCWIWMRVCDJ-ZAKLUEHWSA-N 0.000 description 2
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HPYNZHMRTTWQTB-UHFFFAOYSA-N dimethylpyridine Natural products CC1=CC=CN=C1C HPYNZHMRTTWQTB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 2
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 2
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 2
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 2
- 125000000291 glutamic acid group Chemical group N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)* 0.000 description 2
- 108010050848 glycylleucine Proteins 0.000 description 2
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 2
- 229960003130 interferon gamma Drugs 0.000 description 2
- 108010003700 lysyl aspartic acid Proteins 0.000 description 2
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 2
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 2
- 150000003833 nucleoside derivatives Chemical class 0.000 description 2
- 108010073025 phenylalanylphenylalanine Proteins 0.000 description 2
- OJMIONKXNSYLSR-UHFFFAOYSA-N phosphorous acid Chemical compound OP(O)O OJMIONKXNSYLSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 2
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 108010026333 seryl-proline Proteins 0.000 description 2
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 2
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 2
- WYTZZXDRDKSJID-UHFFFAOYSA-N (3-aminopropyl)triethoxysilane Chemical compound CCO[Si](OCC)(OCC)CCCN WYTZZXDRDKSJID-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QTWJRLJHJPIABL-UHFFFAOYSA-N 2-methylphenol;3-methylphenol;4-methylphenol Chemical compound CC1=CC=C(O)C=C1.CC1=CC=CC(O)=C1.CC1=CC=CC=C1O QTWJRLJHJPIABL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940082584 3-(triethoxysilyl)propylamine Drugs 0.000 description 1
- WLHCBQAPPJAULW-UHFFFAOYSA-N 4-methylbenzenethiol Chemical compound CC1=CC=C(S)C=C1 WLHCBQAPPJAULW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BTJIUGUIPKRLHP-UHFFFAOYSA-N 4-nitrophenol Chemical compound OC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 BTJIUGUIPKRLHP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 7553-56-2 Chemical compound [I] ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZKHQWZAMYRWXGA-KQYNXXCUSA-J ATP(4-) Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)[C@H]1O ZKHQWZAMYRWXGA-KQYNXXCUSA-J 0.000 description 1
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 1
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZKHQWZAMYRWXGA-UHFFFAOYSA-N Adenosine triphosphate Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1OC(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)C(O)C1O ZKHQWZAMYRWXGA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- ATHZHGQSAIJHQU-XIRDDKMYSA-N Asn-Trp-Lys Chemical compound C1=CC=C2C(=C1)C(=CN2)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)N ATHZHGQSAIJHQU-XIRDDKMYSA-N 0.000 description 1
- DPWDPEVGACCWTC-SRVKXCTJSA-N Asn-Tyr-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O DPWDPEVGACCWTC-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- ZAMOUSCENKQFHK-UHFFFAOYSA-N Chlorine atom Chemical compound [Cl] ZAMOUSCENKQFHK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JIZRUFJGHPIYPS-SRVKXCTJSA-N Cys-Tyr-Cys Chemical compound C1=CC(=CC=C1C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CS)N)O JIZRUFJGHPIYPS-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- 108010005054 Deoxyribonuclease BamHI Proteins 0.000 description 1
- 108010054576 Deoxyribonuclease EcoRI Proteins 0.000 description 1
- 101100289061 Drosophila melanogaster lili gene Proteins 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000034454 F12-related hereditary angioedema with normal C1Inh Diseases 0.000 description 1
- ILWHFUZZCFYSKT-AVGNSLFASA-N Glu-Lys-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O ILWHFUZZCFYSKT-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- MRWYPDWDZSLWJM-ACZMJKKPSA-N Glu-Ser-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O MRWYPDWDZSLWJM-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 1
- ZZWUYQXMIFTIIY-WEDXCCLWSA-N Gly-Thr-Leu Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O ZZWUYQXMIFTIIY-WEDXCCLWSA-N 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000005744 Glycoside Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 108010031186 Glycoside Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- 101001054334 Homo sapiens Interferon beta Proteins 0.000 description 1
- 101000599940 Homo sapiens Interferon gamma Proteins 0.000 description 1
- TVYWVSJGSHQWMT-AJNGGQMLSA-N Ile-Leu-Lys Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)N TVYWVSJGSHQWMT-AJNGGQMLSA-N 0.000 description 1
- 102000006992 Interferon-alpha Human genes 0.000 description 1
- 108010047761 Interferon-alpha Proteins 0.000 description 1
- 102000003996 Interferon-beta Human genes 0.000 description 1
- VHJLVAABSRFDPM-IMJSIDKUSA-N L-1,4-dithiothreitol Chemical compound SC[C@H](O)[C@@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- KFKWRHQBZQICHA-STQMWFEESA-N L-leucyl-L-phenylalanine Natural products CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 KFKWRHQBZQICHA-STQMWFEESA-N 0.000 description 1
- 241000880493 Leptailurus serval Species 0.000 description 1
- TWQIYNGNYNJUFM-NHCYSSNCSA-N Leu-Asn-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O TWQIYNGNYNJUFM-NHCYSSNCSA-N 0.000 description 1
- WXUOJXIGOPMDJM-SRVKXCTJSA-N Leu-Lys-Asn Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O WXUOJXIGOPMDJM-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- AEDWWMMHUGYIFD-HJGDQZAQSA-N Leu-Thr-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O AEDWWMMHUGYIFD-HJGDQZAQSA-N 0.000 description 1
- GQUDMNDPQTXZRV-DCAQKATOSA-N Lys-Arg-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O GQUDMNDPQTXZRV-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- SJNZALDHDUYDBU-IHRRRGAJSA-N Lys-Arg-Lys Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O SJNZALDHDUYDBU-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- MYTOTTSMVMWVJN-STQMWFEESA-N Lys-Tyr Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 MYTOTTSMVMWVJN-STQMWFEESA-N 0.000 description 1
- LMMBAXJRYSXCOQ-ACRUOGEOSA-N Lys-Tyr-Phe Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](Cc1ccc(O)cc1)C(=O)N[C@@H](Cc1ccccc1)C(O)=O LMMBAXJRYSXCOQ-ACRUOGEOSA-N 0.000 description 1
- XBYKTPZCWQQSGB-IHRRRGAJSA-N Met-Cys-Tyr Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 XBYKTPZCWQQSGB-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- YNAVUWVOSKDBBP-UHFFFAOYSA-N Morpholine Chemical group C1COCCN1 YNAVUWVOSKDBBP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010021757 Polynucleotide 5'-Hydroxyl-Kinase Proteins 0.000 description 1
- 102000008422 Polynucleotide 5'-hydroxyl-kinase Human genes 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 229910002808 Si–O–Si Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- HJXOFWKCWLHYIJ-SZMVWBNQSA-N Trp-Lys-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC2=C1C=CC=C2)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O HJXOFWKCWLHYIJ-SZMVWBNQSA-N 0.000 description 1
- DLRZGNXCXUGIDG-KKHAAJSZSA-N Val-Thr-Asp Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)O)NC(=O)[C@H](C(C)C)N)O DLRZGNXCXUGIDG-KKHAAJSZSA-N 0.000 description 1
- 241000711975 Vesicular stomatitis virus Species 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- KOSRFJWDECSPRO-UHFFFAOYSA-N alpha-L-glutamyl-L-glutamic acid Natural products OC(=O)CCC(N)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(O)=O KOSRFJWDECSPRO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- HOPRXXXSABQWAV-UHFFFAOYSA-N anhydrous collidine Natural products CC1=CC=NC(C)=C1C HOPRXXXSABQWAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- 108010040443 aspartyl-aspartic acid Proteins 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000000460 chlorine Substances 0.000 description 1
- 229910052801 chlorine Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 1
- UTBIMNXEDGNJFE-UHFFFAOYSA-N collidine Natural products CC1=CC=C(C)C(C)=N1 UTBIMNXEDGNJFE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 229930003836 cresol Natural products 0.000 description 1
- 239000012043 crude product Substances 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 1
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 108010092809 exonuclease Bal 31 Proteins 0.000 description 1
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 230000005021 gait Effects 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 1
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 208000016861 hereditary angioedema type 3 Diseases 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 229960001388 interferon-beta Drugs 0.000 description 1
- 229940047124 interferons Drugs 0.000 description 1
- 229910052740 iodine Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011630 iodine Substances 0.000 description 1
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 108010044056 leucyl-phenylalanine Proteins 0.000 description 1
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 1
- 108010009298 lysylglutamic acid Proteins 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 125000002073 methionyl group Chemical group 0.000 description 1
- CAAULPUQFIIOTL-UHFFFAOYSA-N methyl dihydrogen phosphate Chemical group COP(O)(O)=O CAAULPUQFIIOTL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- PSHKMPUSSFXUIA-UHFFFAOYSA-N n,n-dimethylpyridin-2-amine Chemical compound CN(C)C1=CC=CC=N1 PSHKMPUSSFXUIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PGSADBUBUOPOJS-UHFFFAOYSA-N neutral red Chemical compound Cl.C1=C(C)C(N)=CC2=NC3=CC(N(C)C)=CC=C3N=C21 PGSADBUBUOPOJS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LYGJENNIWJXYER-UHFFFAOYSA-N nitromethane Chemical compound C[N+]([O-])=O LYGJENNIWJXYER-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000002515 oligonucleotide synthesis Methods 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N phosphoric acid Substances OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 238000002203 pretreatment Methods 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 125000006308 propyl amino group Chemical class 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- GFYHSKONPJXCDE-UHFFFAOYSA-N sym-collidine Natural products CC1=CN=C(C)C(C)=C1 GFYHSKONPJXCDE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 125000001302 tertiary amino group Chemical group 0.000 description 1
- 150000003536 tetrazoles Chemical class 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 1
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000003501 vero cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/555—Interferons [IFN]
- C07K14/57—IFN-gamma
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/811—Interferon
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S930/00—Peptide or protein sequence
- Y10S930/01—Peptide or protein sequence
- Y10S930/14—Lymphokine; related peptides
- Y10S930/142—Interferon
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
Description
1 90436
Ihmisen gammainterferonin kaltaisesti vaikuttavien poly-peptidien valmistus
Tama keksintO koskee menetelmaa polypeptidien val-5 mistamiseksi, joilla on ihmisen gammainterferonin biologi-nen ja immunologinen vaikutus, kemiallisesti syntetisoi-tuja geeneja, jotka koodittavat nåitå peptideja seka nai-den polypeptidien erittamiseen soveltuvia vektoriraken-teita ja isantaorganismeja. Keksintb koskee lisaksi uusia 10 polypeptideja, joista puuttuu gammainterferoniin verrat-tuna jaksoja, jotka eivat ole vaittamattOmiå biologisen aktiivisuuden kannalta. Nama uudet polypeptidit ovat gammainterferoniin verrattuna stabiilimpia tai liukenevampia ja vaihtelevia virusten vastaisen spesifisyytensa suhteen, 15 mutta ovat kuitenkin kaikki - kuten gammainterferonikin -kayttOkelpoisia virusten tai kasvainten vastaisina tai immuunijarjestelmaan vaikuttavina valmisteina.
Gammainterferonin (aiemmin immuuni-interferoni tai tyypin II interferon!; téssa kaytetaan lyhennetta IFN-Y) 20 lttysi vuonna 1965 F. Wheelock [F. Wheelock, Science 149 (1965) 310], joka osoitti, etta IFN-Y voi suojata tiettyja soluja virusinfektiolta. Ihmisen IFN-T [perustiedot W.E. Stewart, II, The Interferon System, Springer Verlag, 2. p. (1981)] on 146 aminohaposta koostuva polypeptidi [Gray et '25 al., Nature 295 (1982) 503], joka on luonnostaan glykosy-loitunut. Glykoproteiinin molekyylipaino on noin 63 000 -73 000 [Petska et al., J. Biol. Chem. 258 (1983) 9706], ja se esiintyy toimivassa muodossaan todennakOisesti tetra-meerina. IFN-Y:n glykosyloituminen ei ole sen toimivuuden 30 kannalta vaittamatOnta; IFN-Y: n kasitteleminen glykosidaa-silla ei siis alenna sen virusten vastaista aktiivisuutta ihmisen fibroblastisoluviljelmissa [Kelker et al., J. Biol. Chem. 258 (1983) 8010].
Lisaksi IFN-Y on, toisin kuin alfainterferonit ja 35 beetainterferoni, epastabiili pH 2:ssa ja menettaa aktii- 2 1.90436 visuutensa myOs kuumennettaessa (60°C).
Ihmisen IFN-'V':n eristaminen ihmissolulinjojen solu-viljelmista tai leukosyyteista (sailtttysta veresta) on mahdollista vain huonolla saannolla, ja tuotteen puhtaus-5 aste on heikko. Tama keksintiJ koskee ominaisuuksiltaan gammainterferonin kaltaisten polypeptidien valmistusta geeniteknologisin menetelmin. Ihmisen IFN-Γιη peptidijak-so on seuraava [Devos et al., Nucl. Acids Research 10 (1982) 2487]: 10 Cys1 - Tyr - Cys - Gin - Asp - Pro - Tyr - Val - Lys - Glu10 -Ala - Glu - Asn - Leu - Lys - Lys - Tyr - Phe - Asn - Ala20 -
Gly - His - Ser - Asp - Val - Ala - Asp - Asn - Gly - Thr30 -
Leu - Phe - Leu - Gly - Ile - Leu - Lys - Asn - Trp - Lys40 -
Glu - Glu - Ser - Asp - Arg - Lys - Ile - Met - Gin - Ser50 - 15 Gin - Ile - Val - Ser - Phe - Tyr - Phe - Lys - Leu - Phe60 -Lys - Asn - Phe - Lys - Asp - Asp - Gin - Ser - Ile - Gin70 -
Lys - Ser - Val - Glu - Thr - Ile - Lys - Glu - Asp - Met80 -
Asn - Val - Lys - Phe - Phe - Asn - Ser - Asn - Lys - Lys90 -
Lys - Arg - Asp - Asp - Phe - Glu - Lys - Leu - Thr - Asn100 -20 Tyr - Ser - Val - Thr - Asp - Leu - Asn - Val - Gin - Arg110 -Lys - Ala - Ile - His - Glu - Leu - Ile - Gin - Val - Met120 -
Ala - Glu - Leu - Ser - Pro - Ala - Ala - Lys - Thr - Gly130 -
Lys - Arg - Lys - Arg - Ser - Gin - Met - Leu - Phe - Arg140 -
Gly - Arg - Arg - Ala - Ser - Gin146.
25
Taman keksinnOn eraana puolena on biologisesti ak-tiivisten ihmisen IFN-T-osajaksojen, erityisesti edelia esitetyn jakson osajaksojen 1-127, 5-146 ja 5-127, valmis-tus.
: 30 Geneettinen koodi on tunnetusti "degeneroitunut", so. vain kahta aminohappoa koodittaa yksi ainoa nukleoti-dijakso, kun taas muita 18 kooditettavissa olevaa aminohappoa vastaa 2-6 triplettia. Sita paitsi eri lajia olevat isantasolut eivat aina kayta nain tarjoutuvia vaihtelumah-35 dollisuuksia samalla tavalla. Geenien synteesiin on siten olemassa valtava valikoima kodonimahdollisuuksia. Nyt on 3 90436 olemassa valtava valikoima kodonimahdollisuuksia. Nyt on havaittu, etta DNA-jaksot IA, IB ja IC ovat erityisen edullisia syntetisoitaessa geeniteknisin menetelmin poly-peptideja, joilla on iFN-T-aktiivisuus. DNA-jakson I koo-5 dittavan saikeen 5'-paassa on metioniinia vastaava kodoni ("tripletti nro 0") ja sen edelia "ylimaarainen" DNA-jak-so, joka vastaa restriktioendonukleaasia, esimerkiksi EcoRI:a. Koodittavan saikeen 3'-paassa on sita vastoln lopetuskodonin tai edullisesti kahden lopetuskodonin jai-10 keen - joko vaiittttmasti tai vaiissa olevan DNA-jakson erottamana - restriktioentsyymia, esimerkiksi Sail:3, vastaava jakso. Erilaiset tunnistusjaksot tekevat mahdolli-seksi DNA:n sijoittamisen plasmidiin toivotulla tavalla orientoituneena.
15 Koodittavan saikeen 5'-paassa voi vaihtoehtoisesti metioniinikodonin kanssa olla esijakso (josta kaytetaan myOs nimitysta signaalijakso), joka vastaa bakteerille tai muulle isannaile ominaista proteiinia [katsausartikkeli: Perlman ja Halvorson, J. Mol. Biol. 167 (1983) 391], ja 20 joka saa aikaan halutun polypeptidin erittymisen sytoplas-masta ja jonka isantasolussa luonnostaan esiintyva signaa-lipeptidaasi pilkkoo taman erittymisen yhteydessa.
Kaksi sisaista yksittaista pilkkoutumiskohtaa, jot-ka vastaavat restriktioentsyymeja BamHI ja Hindlll (koo-25 dittavan saikeen kodoneissa 34 ja 97 tai koodittamattoman saikeen kodoneissa 35 ja 98), tekevat mahdolliseksi kolmen geenifragmentin, IFN-I:n, IFN-II:n ja IFN-III:n (katso DNA-jakso II), osakloonauksen, jotka jaksot voidaan si-joittaa tarkoin tunnettuihin kloonausvektoreihin, kuten 30 esimerkiksi pBR322:een tai pUC8:een. Lisåksi muodostettiin rakennegeenin sisaan joukko muita yksittaisia restriktio-entsyymien tunnistusjaksoja, jotka toisaalta tekevat mahdolliseksi IFN-7:n osajaksojen sijoittamisen ja toisaalta muunnosten tekemisen: 35 4 90436
Restriktioent- Pilkkoutuminen nukleotidin syymi n:o jaikeen (koodittava siåie) 5 AvaIIa) 20
Alulb) 39
Hinfla) 134
Ddelc) 159
AhaIIIc) 199 10 Taqlc) 294
AhaIIId) 327
Sstla) 357
BstNId) 362
Pstla) 388 15 Bbvla) 398
SstIIa) 430
Ddeld| 444
a) yksin esiintyvana vastaa koko DNA-jaksoa I
b) yksin esiintyvana vastaa osajaksoa IFN-I 20 c) yksin esiintyvana vastaa osajaksoa IFN-II
d) yksin esiintyvana vastaa osajaksoa IFN-III
DNA-jakso I ja sen péihin liittyvat jaksot voidaan rakentaa 34 oligonukleotidista, joiden pituus on 18-33 nukleotidiS, (katso DNA-jakso II) syntetisoimalla ensin 25 nama oligonukleotidit kemiallisesti ja liittamaiia ne sit-ten yhteen 4-6 nukleotidin pituisten "tarttuvien paiden" avulla.
DNA-jakson I yhteydessa otettiin lisaksi huomioon se, etta kunkin aminohapon yhteydessa, jota voivat vastata 30 useammat kodonit, eivat nama kodonit ole samanarvoisia, vaan kussakin isantasolussa, kuten E. colissa, erilaisessa suosituimmuusjarjestyksessa. Lisaksi vahennettiin palind-romisten jaksojen maara mahdollisimman pieneksi.
DNA-jakson I geenirakenne on siten muodostettavissa 35 helposti suhteellisen pienista rakenneosista, se tekee mahdolliseksi kolmen geenifragmentin osakloonauksen hyvin 5 90436 tunnetuissa vektoreissa, niiden yhdistamisen kokonaiseksi geeniksi sekå niiden muuttamisen. Siten voidaan DNA-jakson I sisMltSvan geenin kloonauksen jaikeen saada tietyilia restriktioentsyymeilia pilkkomalla DNA-osajaksoja, erityi-5 sesti osajaksot IA, IB ja IC, jotka koodittavat interfero-niosajaksoja, jotka vastaavat aminohappoja 1-127, 5-146 ja 5-127.
Esimerkkina osajaksosta on DNA-jakso IA, joka joh-taa IFN-T":n 127 ensimmaista aminohappoa sisaitavaan poly-10 peptidiin, jolloin DNA-jaksoa I on muutettu siten, etta triplettia nro 127 seuraa vaiittOmasti lopetustripletti tai edullisesti kaksi lopetustriplettia seka ylimaaråinen restriktioentsyymia, esimerkiksi Sall:tå, vastaava paa.
Pilkkomalla DNA-jakso I restriktioendonukleaasilla 15 Avail ja liittamålia taten saadut suuret fragmentit liit-tamisjaksolla saadaan puolestaan DNA-jakso IB, josta puuttuvat IFN-V:n neljaa ensimmaista aminohappoa vastaavat kodonit, so. heti aminohapon nro 5 (asparagiinihappo) edella on metioniini. Tåsta DNA-jaksosta IB voidaan muo-20 dostaa Pstl-pilkkoutumiskohdan kautta DNA-jakso IC, joka koodittaa IFN-^:n aminohapot 5-127 sisaitavaa polypep-tidia.
Synteettisen geenin tai geenifragmentin sijoitta-minen kloonausvektoreihin, esimerkiksi kaupallisesti 25 saataviin plasmideihin pUC8 ja pBR322 tai muihin yleisesti saatavilla oleviin plasmideihin, kuten pTACllreen ja pKK177.3:een, tapahtuu sinansa tunnetulla tavalla. Kemial-lisesti syntetisoidut geenit voidaan myOs ennalta varustaa soveltuvilla kemiallisesti syntetisoiduilla saatelyalueil-'30 la, jotka tekevat mahdolliseksi proteiinien erittymisen.
Viittaamme tassa yhteydessa Maniatisin oppikirjaan (Molecular Cloning, Maniatis et al., Cold Spring Harbor, 1982). Soveltuvien isantMorganismien, edullisesti E. colin, transformointi siten saaduilla hybridiplasmideilla on sa-35 moin sinansa tunnettua, ja sita kuvataan perusteellisesti 6 90436 edelia mainitussa teoksessa. Erittyneen proteiinin tal-teenottoa ja puhdistusta kuvataan samoin kirjallisuudessa [J.A. Georgiades, Texas Reports in Biology and Medicine 41 (1981) 179; Came ja Carter (toim), "Interferons and Their 5 Applications", Springer-Verlag 1984].
Keksinndn mukaisesti saadut, DNA-jaksoja IA, IB ja IC vastaavat polypeptidit, joilla on gammainterferoniak-tiivisuus, ovat uusia ja keksinndn kohteena. Tama patee myiis uudesta DNA-j aksosta I johdettuihin DNA-j aksoihin, 10 niista saataviin gammainterferonianalogeihin, geenifrag- mentteihin IFN-I, IFN-II ja IFN-III seka niiden muunnok-siin, niiden avulla saatuihin hybridiplasmideihin ja transformoituihin isantaorganismeihin. KeksinnOn muut suo-ritusmuodot kayvat ilmi patenttivaatimuksista.
15 Seuraavissa esimerkeissa valaistaan lahemmin viela keksinnttn joitakin suoritusmuotoja, joista asiantuntijan on helppo havaita lukuisia mahdollisia tnuunnoksia ja yh-distelmia. Tassa hakemuksessa annetut prosenttiluvut ovat painoprosentteja, ellei toisin mainita.
20 Eslmerkit 1. Yksisaikelsen ollgonukleotidin kemi al linen synteesi
Kayttamana esimerkkina rakenneosaa la, joka kasit-taa koodittavan saikeen nukleotidit 1-23, valaistaan gee-nin rakenneosien synteesia. Tunnetuin menetelmin [M.J.
; 25 Gait et al., Nucleic Acids Res. 8 (1980) 1081-1096] kiin-nitetaan 3'-paassa oleva nukleosidi, tassa tapauksessa siis sytidiini (nukleotidi nro 23), piigeelille (^RAC-TOSIL, Firma Merck) funktionaalisen 3'-hydroksyyliryhman kautta. Taman jaikeen annetaan piigeelin ensin reagoida 3-V 30 (trietoksisilyyli)-propyyliamiinin kanssa, jolloin loh- keaa etanolia ja muodostuu Si-O-Si-sidos. Sytidiinin annetaan reagoida N4-bentsoyyli-3'-sukkinoyyli-5'-dimetoksi-trityylieetterina paranitrofenolin ja N,N'-disykloheksyy-likarbodi-imidin lasna ollessa muunnetun kantajan kanssa, 35 jolloin sukkinoyyliryhman vapaa karboksyyliryhma asyloi 7 90436 propyyliaminoryhman aminoryhm&n.
Seuraavissa synteesivaiheissa kaytetaan emaskompo-nentteja 5'-O-dimetoksitrityylinukleosidi-3'-fosforihapo-kemonometyyliesteridialkyyliamidina tai -kloridina, jol-5 loin adeniini on N6-bentsoyyliyhdisteena, sytosiini N4-bentsoyyliyhdisteena, guaniini N2-isobutyryyliyhdisteenå ja aminoryhmia sisaitamatOn tymiini ilman suojausryhmia.
50 mg polymeerista kantajaa, joka sisaitaa 2 pmol sitoutunutta sytosiinia, kasiteliaan perakkain seuraavilla 10 aineilla: a) nitrometaani, b) kyliainen sinkkibromidinitrometaaniliuos, joka sisaitaa 1 % vetta, c) metanoli, 15 d) tetrahydrofuraani, e) asetonitriili, f) 40 pmol vastaavaa nukleosidifosfiittia ja 200 pmol tet-ratsolia 0,5 ml:ssa vedetOnta asetonitriilia (5 min), g) 20 % asetanhydridia tetrahydrofuraanissa, joka sisaitaa 20 40 % lutidiinia ja 10 % dimetyyliaminopyridiinia (2 min), h) tetrahydrofuraani, i) tetrahydrofuraani, joka sisaitaa 20 % vetta ja 40 % lutidiinia, 25 j) 3 % jodia seoksessa, joka sisaitaa kollidiinia, vetta ja tetrahydrofuraania tilavuussuhteessa 5:4:1, k) tetrahydrofuraani ja l) metanoli.
"Fosfiitilla" ymmarretaan tassa yhteydessa deoksi-30 riboosi-3'-monofosforihapokemonometyyliesteria, jolloin kolmas valenssi on taytetty kloorilla tai tertiaarisella aminoryhmaiia, esimerkiksi morfoliiniryhmaiia. Yksittais-ten synteesivaiheiden saannot voidaan kussakin tapaukses-sa maarittaa detritylointireaktion b) jaikeen spektrofoto-35 metrisesti mittaamalla dimetoksitrityylikationin absorptio 8 90436 aallonpituudella 496 ran.
Oligonukleotidin loppuun saatetun synteesin jalkeen lohkaistaan oligomeerin metyylifosfaattisuojausryhmat p-tiokresolin ja trietyyliamiinin avulla.
5 Sen jaikeen irrotetaan oligonukleotidi kiintealta kantajalta kasittelemaiia 3 h ammoniakilla. Oligomeerien 2-3 paivaa kestava kasittely vakevana ammoniakllla loh-kalsee emasten amlnosuojausryhmat kvantitatiivisesti. Siten saatu raakatuote puhdistetaan suurpainenestekromato-10 grafian (HPLC) tai polyakryyliamidigeelielektroforeesin avulla.
Aivan vastaavalla tavalla syntetisoidaan myOs muut geenin rakenneosat Ib-IIII, joiden nukleotidijarjestykset kayvat ilmi DNA-jaksosta II.
15 2. Yksisaikeisten oligonukleotidlen entsymaattlnen liittamlnen geenifragmentteihln IFN-I, IFN-II ja
IFN-III
Oligonukleotidin fosforyloimiseksi 5'-paastaan ka-siteltiin aina 1 nmol oligonukleotidia la ja Ib 5 nmol:11a 20 adenosiinitrifosfaattia ja neljaiia yksikOlia T4-polynuk- leotidikinaasia 20 pl:ssa 50 nM Tris-HCl-puskuria (pH 7,6), joka sisalsi 10 mmol/1 magnesiumkloridia ja 10 mmol/1 ditiotreitolia (DTT), 30 min 37°C:ssa [C.C. Richardson, Progress in Nuel. Acids Res. 2 (1972) 825], 25 Entsyymi inaktivoidaan pitamaiia 5 min 95°C:ssa. Sen jSl-keen oligonukleotidi la ja Ib hybridisoidaan kuumentamalla niita vesiliuoksessa 2 min 95°C:ssa ja jaahdyttamaila hi-taasti 5°C:een.
Samalla tavalla fosforyloidaan ja hybridisoidaan 30 pareittain oligonukleotidit Ic ja Id, le ja If, Ig ja Ih sekS li ja Ij . Osafragmenttia IFN-II vårten fosforyloidaan ja hybridisoidaan pareittain oligonukleotidi Ila IIb:n kanssa, Hk III:n kanssa ja osafragmenttia IFN-III vårten oligomeeri Illa IIlb:n kanssa, Ulk llll:n kanssa.
35 Siten saaduille, geenifragmenttia IFN-I vårten val- 9 90436 mistetuille viidelle oligonukleotidiparille ja geenifrag-mentteja IFN-II ja IFN-III vårten valmistetuille kuudelle oligonukleotidiparille tehdSMn ligaatio seuraavasti:
KaksisSikeiset nukleotidit yhdistetaan ja niille 5 tehdaån ligaatio kasittelemaiia kulloinkin 40 pl:ssa 50 nM Tris-HCl-puskuria, joka sisaitaa 20 mmol/1 magnesiumklori-dia ja 10 mmol/1 DTT:a, 100 yksikdlia T4-DNA-ligaasia 15 C:ssa 16 h.
Geenifragmenttien IFN-I - IFN-III puhdistus tapah-10 tuu geelielektroforeesilla 10-%:isella polyakryyliamidi- geelilia (ei urealisaysta, 20 x 40 cm, paksuus 1 mm) kåyt-tamana markkeriaineena ØX 174 DNA (Fa. BRL), joka on pil-kottu Hinfl:lla, tai HaeIII:lla pilkottua pBR322.
3. Geenifragmentit IFN-I, IFN-II ja IFN-III sisaita- 15 vien hybridiplasmidien valmistus a) Geenifragmentin IFN-I sijoittaminen pBR322:een Kaupallisesti saatava plasmidi pBR322 pilkotaan tunnetulla tavalla restriktioendonukleaasilla EcoRI ja BamHI valmistajan ohjeiden mukaisesti. Pilkkomistuotteet 20 erotetaan tunnetulla tavalla 5-%:isella polyakryyliamidi- geelilia elektroforeettisesti, ja palasista tehdSSn ha-vaittavissa olevia vårjåamålia etidiumbromidilla tai lei-maamalla radionuklideilla ("Nick-Translation", Maniatis, supra). Plasmidivydhykkeet leikataan irti akryyliamidi-25 geelista ja erotetaan elektroforeettisesti polyakryyli-. . amidista. Pilkkomistuotteet voidaan erottaa toisistaan myiJs 2-%:isella matalassa lampOtilassa sulavalla agaroosi-geelilia (esimerkissa 6a) kuvatulla tavalla. Plasmidille (1 pg) tehdaan sitten ligaatio geenifragmentin IFN-I (10 30 ng) kanssa y6n yli 16°C:ssa. Saadaan hybridiplasmidi, joka esitetåSn kuviossa 1.
b) Geenifragmentin IFN-II sijoittaminen pUC8:een Kohdan a) mukaisesti pilkotaan kaupallisesti saatava plasmidi pUC8 BamHI:11a ja HindIII:lla ja tehdaan 35 ίο 90436 ligaatio geenifragmentin IFN-II kanssa. Saadaan kuvion 2 mukainen hybridiplasmidi.
c) Geenifragmentin IFN-III sijoittaminen pUC8:een Kohdan a) mukaisesti pilkotaan plasmidi pUC8 5 Hindlllrlla ja Sail:11a ja tehdaan ligaatio geenifragmentin IFN-III kanssa. Saadaan kuvion 3 mukainen hybridiplasmidi .
4. Koko geenin synteesi a) Transformaatio ja lisaaminen 10 Taten saadulla hybridiplasmidilla transformoidaan E. coli. Tata vårten tehdaan E. coli-kannasta K 12 kom-petentti kasittelemaiia 70 mM kalsiumkloridiliuoksella ja siihen lisataan hybridiplasmidi suspendoituna 10 mM Tris-HCl-puskuriin (pH 7,5), joka sisaitaa 70 mmol/1 kalsium-15 kloridia. Transformoidut kannat lajitellaan tavanomaisesti kayttamaiia hyvaksi plasmidin aikaansaamia antibiootti-resistensseja tai -herkkyyksia, ja hybridivektoreita lisataan. Solut tapetaan ja hybridiplasmidit erotetaan, pilkotaan alunperin kaytetyilia restriktioentsyymeilia ja gee-20 nifragmentit IFN-I, IFN-II ja IFN-III eristetaan geeli-elektroforeesilla.
b) Geenifragmenttien liittaminen
Amplifikaatiolla saadut osafragmentit IFN-I, IFN-II ja IFN-III liitetaan esimerkin 2 mukaisesti entsymaat-25 tisesti ja sijoitetaan siten saatu, DNA-jakson I sisaita-va synteettinen geeni kloonausvektoriin pUC8. Saadaan kuvion 4 mukainen hybridiplasmidi.
5. DNA-jakson IA, IB ja IC sisaitavien hybridiplasmi-dien synteesi 30 a) Jakson IB sisaitava hybridiplasmidi
Kuvion 4 mukainen hybridiplasmidi, joka sisaitaa DNA-jakson I, pilkotaan tunnetulla tavalla restriktioent-syymilia EcoRI ja Sail, erotetaan pieni EcoRI- ja Sall-fragmentti polyakryyliamidigeelielektroforeesilla ja pil-35 11 90436 kotaan viela entsyymilia Avail. Adaptorin 5' AA TTC ACC ATG 3' 3' G TGG TAC CTG 5'
EcoRI Avail 5 avulla saadaan aiemmin valmistetun suuren DNA-fragmentin kanssa tehdyn ligaation jaikeen hybridiplasmidi, joka si-saitaa siihen sijoitetun DNA-jakson IB (kuvio 5).
b) Jakson IA sisaitava hybridiplasmidi DNA-jakso I pilkotaan restriktioentsyymilia PstI 10 valmistajan ohjeiden mukaan ja eristetaan fragmentti EcoRI-Pstl. Lisaksi pilkotaan kaupallisesti saatava plas-midi pUC8 restriktioentsyymeilia EcoRI ja Smal, ja sijoi-tetaan siihen aiemmin eristetty fragmentti adapterin 5' GCT TAG TAA CCC 3' 15 3' A CGT CGA ATC ATT GGG 5’
PstI Smal avulla, jolloin saadaan kuvion 6 mukainen hybridiplasmidi.
c) Jakson IC sisaitava hybridiplasmidi Esimerkin 5a mukaisesti saatu hybridiplasmidi pil- 20 kotaan EcoRI:11a ja PstI:11a. Eristetty fragmentti EcoRI-Pstl liitetaan kohdan 5b) mukaisesti uuteen hybridiplas-midiin, jolloin saadaan DNA-jakson IC sisaitava plasmidi (kuvio 7).
6. DNA-jaksoja IA, IB ja IC ilmentSvien hybridi- 25 plasmidien muodostaminen . . a) Sijoittaminen pKK177.3:een
IlmentSmisplasmidi pKKl77.3 [Plasmidi pTACll, Amman et al., Gene 25 (1983) 167, johon on EcoRI-tunnistuskoh-taan sijoitettu synteettisesti jakso, joka sisaitaa Sall-. 30 pilkkoutumiskohdan] pilkotaan restriktioentsyymeilia EcoRI ja Sall. Kuvion 5 mukaisesta plasmidista irrotetaan siihen sijoitettu jakso IB restriktioentsyymeilia EcoRI ja Sall. Samalla tavalla eristetaan myos (vain vahan piden-tyneet) sijoitetut jaksot IA* ja IC*, silia vain muutaman 35 nukleotidin paassa kummankin geenifragmentin varsinaisesta 12 90 436 paasta, jolle on luonteenomaista restriktioentsyymia Smal vastaava pilkkoutumiskohta, on plasmldissa pUC8 Sall-pilk-koutumiskohta (kuviot 6 ja 7).
Fragmentit IA*( IB ja IC* laitetaan 2-%:iselle, ma-5 talassa lampdtilassa sulavalle agaroosigeelille, erote-taan plasmidi-DNA:sta ja otetaan talteen sijoitetut jaksot liuottamalla geeli korotetussa lampOtilassa (valmistajan ohjeen mukaan). Tekemaiia pllkotun plasmidin pKK177.3 ligaat io fragmenttien IA*, IB tai IC* kanssa saadaan hyb-10 ridiplasmidi, johon on kussakin tapauksessa sijoitettu ilmentamis- tai saatelyalue. Soveltuvan induktorin, kuten isopropyyli-6-tiogalaktopyranosidin (IPTG), lisaåmisen jaikeen muodostetaan mRNA, joka johtaa DNA-jaksoa IA, IB tai IC vastaavan metionyylipolypeptidin erittymiseen.
15 b) Sijoittaminen pMX2:een
Ilmentamisplasmidi pMX2 koostuu 21 nukleotidilla lyhennetysta plasmidista pUC8, ja se valmistetaan seuraa-vasti: pUC8 pilkotaan restriktioendonukleaasi EcoRI:11a ja 20 kasiteliaan sitten eksonukleaasi Bal31:lia sellaisissa olosuhteissa, jotka tekevat mahdolliseksi noin 20 nukleo-tidin lohkeamisen EcoRI-pilkkoutumiskohdan molemmilta puo-lilta (Maniatis, supra). Sen jaikeen taytetaan taten kasi-tellyn plasmidin mahdolliset ylimaaraiset paat Klenow-- 25 DNA-polymeraasilla, pilkotaan plasmidi restriktioendonuk-leaasilla Hindlll, ja puhdistetaan plasmidi l-%:isella, alhaisessa lampOtilassa sulavalla agaroosigeelilia valmistajan ohjeiden mukaan. Plasmidiin sijoitetaan takaisin pUC8:ssa alunperin ollut restriktioentsyymikohtien EcoRI '30 ja HindiII rajoittama polymeerinen liittaja, joka pilkkou-tui edelia kuvatuissa kasittelyissa. Sen jaikeen pUC8 pilkotaan restriktioentsyymilia EcoRI ja paat taytetaan Kle-now-DNA-polymeraasilla kayttaen 32P-leimattuja nukleosidi-trifosfaatteja. Polymeerinen liittaja poistetaan sitten 35 plasmidista restriktioentsyymilia Hindlll ja erotetaan 13 90 436 plasmidista tekemaiia elektroforeesi 10-%:isella akryyli-amidigeelillS. Kun polyliittajavyiihyke on identifioitu autoradiografisesti, erotetaan polyliittaja elektroeluu-tiolla akryyliamidijaamista ja liitetaan lyhennettyyn 5 plasmidiin pUC8. Siten muodostettu plasmidi pMX2 pilko-taan sitten restriktioendonukleaaseilla EcoRI ja Sall ja liitetaan yhteen X-inferferonigeenifragmentin IA*, IB tai IC*, joiden paissa on EcoRI- ja Sall-tunnistusjaksot, kanssa ilmentamisplasmidiksi pMX2 (kuviot 8-10). Kloonit, 10 joissa interferonipitoisuus on suuri, identifioidaan sitten maarittamaiia biologinen aktiivisuus.
7. Transformointi hybridiplasmideilla
Kompetentit E. coli -solut transformoidaan hybridi-plasmidilla, joka sisåltaa jakson la, Ib tai IC, (0,1 - 1 15 pg), ja siirrostetaan ampisilliinia sisaitaville agarmal-joille. Sen jalkeen voidaan kloonit, jotka sisaitavat oi-kein asettuneita X-interferonijaksoja vastaavissa plas-mideissa, identifioida DNA-pikakasittelylia [Maniatis, supra].
20 8. Polypeptidien, joilla on T-interferoniaktiivlsuus, erittyminen
Kun E. coli on transformoitu mainituilla hybridiplasmideilla, erittyy polypeptideja, joissa on vastaavien y-interferoniaminohappojaksojen lisaksi aminopaassa yli-25 maarainen metionyyliryhma, nimittain rakenteen IA ollessa kyseessa Met-(IFN-Y~, aminohapot 1-127), rakenteen IB ollessa kyseessa Met-(IFN-T, aminohapot 5-146) ja rakenteen IC ollessa kyseessa, Met-(IFN-V, aminohapot 5-127).
9. Jaikikasittely ja puhdistus • 30 Haluttuun optiseen tiheyteen kasvatettuja bakteeri- kantoja inkuboidaan soveltuvan induktorin, esimerkiksi IPTG:n, kanssa riittavan pitkaan, esimerkiksi 2 h. Sen jalkeen solut tapetaan 0,l-%:isella kresolilla ja 0,1 mM bentsyylisulfonyylifluoridilla. Sentrifugoinnin tai suoda-·. 35 tuksen jalkeen solumassa sekoitetaan puskuriliuokseen (50 “ 90436 mM Tris, 50 mM EDTA, pH 7,5) ja rikotaan mekaanisesti, esimerkiksi French-puristimella tai (^JYNO-myllylia (Fa. Willy Bachofer, Basel), minka jaikeen liukenemattomat osat erotetaan sentrifugoimalla. Supernatantista erotetaan Y-5 interferoniaktiivisuutta sisaitavat proteiinit tavanomai- sesti. Soveltuvia ovat ioninvaihto-, adsorptio- ja geeli-suodatuspylvaat tai vasta-ainepylvaissa tehtava affini-teettikromatografia. Natriumdodekyylisulfaattiakryyliami-digeeli- tai HPLC-analyysein seurataan tuotteen rikastu-10 misastetta ja puhtautta. Tuotteen Y'-interferoniaktiivisuu- den karakterisoimiseksi biologisesti kSytetaan tunnetulla tavalla indikaattorisolulinjoja, kuten esimerkiksi Vero-soluja, joita inkuboidaan eri suhteissa laimennettujen interferonipitoisten bakteeriuutteiden kanssa. Sen jaikeen 15 tutkitaan infektoimalla viruksella, kuten VSVrlia (Vesicular Stomatitit Virus), mihin laimennusasteeseen asti Vero-solujen esikSsittely bakteeriuutteella saa aikaan virusten vastaisuuden. Tulosten arviointi voidaan tehda mikroskoop-pisesti tai maarittåmaiia neutraalipunakulutus. Y-inter-20 feroniaktiivisuus voidaan maarittaa mybs tavanomaisella RIA-menettelylia (Celltech Ltd).), jossa kaytetaan Y-in-terferonin monoklonaalista vasta-ainetta.
10. DNA-jakson muuntamiset a) Jotta saataisiin valmistetuksi Y-interferoni-: 25 analogi, jossa asemassa 102 on seriinin sijasta glutamii-nihappo, syntetisoidaan esimerkkien 1 ja 2 mukaisesti seu-raava nukleotidi:
Glu
5’ AG CTT ACT AAC TAC GAA GTT ACT GAT TT •30 3' A TGA TTG ATG CTT CAA TGA CTA AA
Hindlll Ahalll
Geenifragmentti IFN-III pilkotaan restriktio-entsyymilia Ahalll, erotetaan suurempi fragmentti ja lii-tetéSn se edellS mainittuun nukleotidiin. Sijoittaminen .35 pUC8:een tapahtuu esimerkin 3c) mukaisesti. TehdéSn trans- is 90436 formointi ja lisaaminen esimerkin 4a) mukaisesti ja muunnettu jakso IFN-III tarkistetaan Maxam-Gilbert-sekvenoin-nilla. Liittamaiia tama muunnettu osafragmentti geenifrag-mentteihin IFN-I ja IFN-II esimerkin 4 mukaisesti ja ka-5 sittelenrålia edelleen esimerkkien 5-9 mukaisesti saadaan muunnettu Y-IFN, jossa on asemassa 102 glutamiinihappo se-riinin sijasta. TSlia tuotteella on virusten vastainen aktiivisuus.
b) Y"-interferonianalogit, jotka sisaitavat amino-10 happojakson 1-136 ja sen jaikeen kysteiinin.
Syntetisoidaan nukleotidi
5' GCT AAA ACT GGT AAA CGT AAA
3' A CGT CGA TTT TGA CCA TTT GCA TTT 15 PstI
Cys
5' CGT TCC CAG TGC TAA TAG
3' GCA AGG GTC ACG ATT ATC AGC T
Sall 20 esimerkkien 1 ja 2 mukaisesti. Fragmentti IFN-III pilko-taan restriktioentsyymilia PstI ja erotetaan isompi fragmentti. Tama liitetaan edelia mainittuun nukleotidiin ja tuote kasiteliaan edelleen edelia mainitulla tavalla. Saa- . 25 daan muunnettu Y-interferoni, joka sisaitaa aminohapot 1-136 seka karboksyylipaassa olevan kysteiinin. Tama T-in-terferoni on sisaisesti stabiloitunut ja on helpompi jai-r kikasitelia kromatografisesti kuin luonnon Y-interferoni.
16 90436 DNA-jakso I*
Tripletti nro 0 1 2 3 4 5
Aminohappo Me t Cys Tyr Cys Gin Asp 5 Nukleotidi nro 1 10 20
Koodittava saie 5' AA TTC ATG TCC TAC TGC CAG GAC
Koodittamaton 3' G TAC ACG ATG ACG GTC CT3 saie 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 10 Pro Tyr Val Lys Glu Ala Glu Asn Leu Lys 30 35 40 50
C CG TAC GTT AAA G AA GCT G AA AAC CTG AAA
GGC ATG C AA ΤΓΓ CTT CGA CTT TTC GAC ΤΓΤ 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25
Lys Tyr Phe Asn Ala Gly His Ser Asp Val 60 70 80
AAA TAC TTC AAC GCT GGT CAT TCT GAC GTT
ΊΤΓ ATG AAG 1TG CGA CCA GTA AGA CTG C AA
20 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35
Ala Asp Asn Gly Ihr Leu Phe Leu Gly Ile : : 90 100 110
GCT GAC AAT GGT ACT CTG TTC CTG GGG ATC
25 CGA CTG ΊΤΑ CCA T3A GAC AAG GAC CCC TAG
36 37 38 39 40 41 42 43 44 45
Leu Lys Asn Trp Lys Glu Glu Ser Asp Arg 120 130 140
30 CTG AAA AAC TGG AAA GAA G AA TCT GAC CGT
V GAC TIT TTG ACC ΊΤΓ CTT CTT AGA CIO GCA
* esitetty tassa muodossa, joka sisaltaa EcoRI:a vastaavan .· jakson ja "tripletin nro 0" aminopåassa seka kaksi lope- tustriplettia ja Sall:a vastaavan jakson karboksyyli-35 paassa.
17 90436 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55
Lys Ile Met Gin Ser Gin Ile Val Ser Phe 150 160 170
AM ATC ATC CM TCT CAG ATC GTT TCT TIC
5 ΤΤΓ TAG TAC GTT AGA GTC TAG CM AGA MG
56 57 58 59 60 6l 62 63 64 65
Tyr Phe Lys Leu Phe Lys Asn Phe Lys Asp 180 190 200
10 TAC TTC AM CTC TTC AM MC ΊΤΤ AM GAC
ATG MG TIT GAC MG ΊΤΓ TTG AM ΤΓΤ CTG
66 67 68 69 70 71 72 73 74 75
Asp Gin Ser Ile Gin Lys Ser Val Glu Thr 15 210 220 230
GAC CAG TCT ATC CAG AM TCT GTT GM ACT
CTG GTC AGA TAG GTC ΤΡΓ AGA CM CTT TCA
76 77 78 79 80 8l 82 83 84 85 20 Ile Lys Glu Asp Met Asn Val Lys Phe Phe 240 250 260
ATC MG GM GAC ATG MC GTT AM TIT TTC
TAG TTC CTT CTG TAC TTG CM ΊΤΓ AM MG
25 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95
Asn Ser Asn Lys Lys Lys Arg Asp Asp Phe 270 280 290
:Y: MC TCT’ MC AM AM AM CGT GAC GAC TTC
TIG AGA TIG TIT ΊΤΓ TIT GCA CTG CTG MG
: . . 30 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105
Glu Lys Leu 1hr Asn Tyr Ser Val Thr Asp 300 310 320
GM MG CTT ACT MC TAC TCT GTT ACT GAT
35 CTT TTC GM TCA TIG ATC AGA CM TCA CTA
is 90436 106 107 108 109 110 111 112 113 lili 115
Leu Asn Val Gin . Arg Lys Ala Ile His Glu 330 3^0 350
ΊΤΑ AAC GTT CAA CGT AAA GCT ATC CAC GAG
5 AAT TIG CAA GTT GCA TIT CGA TAG GTG CTC
116 117 118 119 120 121 122 123 124 125
Leu Ile Gin Val Met Ala Glu Leu Ser Pro 360 370 380
10 CTC ATC CAG GTT ATC GCT G AA CTC TCT CCT
GAG TAG GTC CAA TAC CGA CTT GAC AGA GGA
126 127 128 129 130 131 132 133 134 135
Ala Ala Lys Thr Gly Lys Arg Lys Arg Ser 390 400 410
GCA GCT AAA ACT GGT AAA CGT AAA CGT TCC
CGT CGA ΤΓΤ TCA CCA ΤΓΓ GCA ΤΓΤ GCA AGG
136 137 138 139 140 141 142 143 144 145
Gin Met Leu Phe Arg Gly Arg Arg Ala Ser 420 430 440
CAG ATC CTC TTC CGC GGT CGT OGT GCT TCT
GTC TAC GAC AAG GCG CCA GCA GCA CGA AGA
^ : 25 146
Gin . : 450 CAG TAA TAG 3' GTC ATT ATC AGC T 5' 0 19 90436 DNA-jakso I A*
Met (aminohapot 1-127) Stp Stp 5 1 5 5« aa TIC ATG (nukleotidit 9-389) TAG TAA CCC 3'
G TAC (komplement aar i set ATC ATT GGG
nukleotidit) DNA-jakso I B* 10 0
Met (aminohapot 5-146) Stp Stp 5’ AA m ATG (nukleotidit 21-446) TAA TAG 3' G TAC ATT ATC AG C T 5' 15 DNA-jakso I C* 0
Met (aminohapot 5-127) Stp Stp 2q 5' AA TTC ATG (nukleotidit) TAG TAA CCC 3'
G TAC ATC ATT GGG
* esitetty tassa muodossa, joka sisaltaa EcoRI:a vastaavan jakson ja "tripletin nro 0" aminopaassa ja kaksi lopetus-kodonia ja Smal:a tai SALI:a vastaavan jakson karboksyy-25 lipaassa
DNft- jakso IJ
IFN-I: 20 90436 -«--- la-- 5 Met Cys Tyr Cys Gin Asp
5’ AA TIC ATG TGC TAC TGC CAG GAC
3' G TAC ACG ATG ACG GTC CTG
Eco RI -=*--Ib-— -«*-Ic--► -*s- 10 Pro Tyr Val · Lys Glu Ala Glu Asn Leu Lys
CCG TAC GTT AAA GAA GCT G AA AAC CTG AAA
GGC ATG CAA ΤΓΓ CTT CGA CTT TTG GAC ΪΊΤ --Id -o- -Ie -► **-Ig - 15 Lys Tyr Fhe Asn Ala Gly His Ser Asp Val
AAA TAC TTC AAC GCT GGT CAT TCT GAC GTT
TTT ATG AAG TTG CGA CCA GTA AGA CTG CAA
^-If-to- -a-Ih- 2 0 ---li-—
Ala Asp Asn Gly Thr Leu Phe Leu (Gly)
GCT GAC AAT GGT ACT CTG TTC CTG GG
CGA CTG ΊΤΑ CCA TGA GAC AAG GAC CCC TAG
-to-
25 Ban HI
2i 90436
DNA-jakso II
IFN-II: -*-;-Ila -«- -*»-
5 (Gly) Ile Leu Lys Asn Trp Lys Glu Glu Ser Asp Arg G ATC GIG AAA AAC TGG AAA GAA G AA TOT GAC CGT
EamHI GAC ΊΤΓ TIG ACC TIT ΟΓΓ CTT AGA OTG GCA
-Hb----- -Ile - 10 Lys Ile Met Gin Ser Gin Ile Val Ser Phe
A AA ATC ATG CAA TOT CAG ATC GTT TCT TTC
TTT TAG TAC GTT AGA GTC TAG CAA AGA AAG
--3---Ild - —- Ile -► 15 Tyr Phe Lys Leu Phe Lys Asn Phe Lys Asp
TAC TTC AAA CTC TTC AAA AAC TTT AAA GAC
ATG AAG TTT GAC AAG ΊΤΤ TIG AAA ΊΤΓ CTG
--a-Hf- --Ils- 2 0 Asp Gin Ser Ile Gin Lys Ser Val Glu Thr
GAC CAG TCT ATC CAG AAA TCT GTT GAA ACT
CTG GTC AGA TAG GTC TTT AGA CAA CTT TGA
--5-Uh - •-> -Ili- ; 25 Ile Lys Glu Asp Met Asn Val Lys Phe Phe
ATC AAG GAA GAC ATG AAC GTT AAA ΊΤΓ TIC
; TAG TTC CTT CTG TAC TTG CAA ΊΊΤ ΑΛΑ AAG
--XIj - -1»- -Ilk — -- 30 Asn Ser Asn Lys Lys Lys Arg Asp Asp Phe
AAC TCT AAC AAA AAA AAA CGT GAC GAC TTC
TTG AGA TTG TTT TTT TTT GCA CIG CTG AAG
-k- -»-—-III -
Glu (Lys)
. 35 GAA A
CTT TIC GA Hind III
DNA-j akso II
IFN-III: 22 90436 --Ilia --·»- - 5 (Lys) Leu Thr Asn Tyr Ser Val Thr Asp
AG CTT ACT AAC TAC TCT GTT ACT GAT
Hind III A TGA TIG ATG AGA CAA TGA CIA
-Hib - - IIIc -^ -- 10 Leu Asn Val Gin Arg Lys Ala Ile His Glu
ΤΓΑ AAC GTT CAA CGT AAA GCT ATC CAC GAG
AAT TIG CAA GIT GCA TIT CGA TAG GTG CTC
-^ -Uld -- -IIIe-- -- 15 Leu Ile Gin Val Met Ala Glu Leu Ser Pro
CTC ATC CAG GTT ATG GCT G AA CIG TCT CCT
GAG TAG GTC CAA TAC CGA CTT GAC AGA GGA
-s----Illf--- - IUg --Illi- 20 Ala Ala Lys Thr Gly Lys Arg Lys Arg Ser
GCA GCT AAA ACT GC-T AAA CGT AAA CGT ICC
CGT CGA TIT TGA CCA ΤΓΤ GCA ΊΤΓ GCA AGG
: -Illh-► -- -mi-►- -nik- .2 5 Gin Met Leu Phe Arg Gly Arg Arg Ala Ser
CAG ATG CTG TTC CGC GGT CGT CGT GCT TCT
GTC TAC GAC AAG GCG CCA GCA GCA CGA AGA
-XXI j---XUx- -1>— :30 Gin Stp Stp " CAG ΤΑΛ TAG 3' GTC ATT ATC AGC T 5' —-tor-
Sal I
; -35
Claims (3)
1. Menetelmé terapeuttisesti kayttOkelpoisten poly-' peptidien valmistamiseksi, joilla on ihmisen gammainterfe- 5 ronin (IFN-γ1) aminohapposekvenssin Cys1 - Tyr - Cys - Gin - Asp - Pro - Tyr - Val - Lys - Glu10 -Ala - Glu - Asn - Leu - Lys - Lys - Tyr - Phe - Asn - Ala20 - Gly - His - Ser - Asp - Val - Ala - Asp - Asn - Gly - Thr30 -
10 Leu - Phe - Leu - Gly - Ile - Leu - Lys - Asn - Trp - Lys40 -Glu - Glu - Ser - Asp - Arg - Lys - Ile - Met - Gin - Ser50 - Gin - Ile - Val - Ser - Phe - Tyr - Phe - Lys - Leu - Phe60 - Lys - Asn - Phe - Lys - Asp - Asp - Gin - Ser - Ile - Gin70 - Lys - Ser - Val - Glu - Thr - Ile - Lys - Glu - Asp - Met80 -
15 Asn - Val - Lys - Phe - Phe - Asn - Ser - Asn - Lys - Lys90 -Lys - Arg - Asp - Asp - Phe - Glu - Lys - Leu - Thr - Asn100 - Tyr - Ser - Val - Thr - Asp - Leu - Asn - Val - Gin - Arg110 - Lys - Ala - Ile - His - Glu - Leu - Ile - Gin - Val - Met120 - Ala - Glu - Leu - Ser - Pro - Ala - Ala - Lys - Thr - Gly130 -
20 Lys - Arg - Lys - Arg - Ser - Gin - Met - Leu - Phe - Arg140 -Gly - Arg - Arg - Ala - Ser - Gin146 osasekvenssi, joka muodostuu aminohapposekvenssistå 5 -127, 1 - 127 tai 5 - 146, tunnettu siita, ettft 25 bakteeri-isantåorganismissa saatetaan ilmentymaan geeni, joka sisaitaa DNA:ta, jolla on yleinen kaava Pr - Xv - R - Y - Z : 30 jossa y ja z ovat toisistaan riippumatta 0 tai 1, silia rajoituksella, etta y ja z eivat molemmat ole 1, ja Pr, X, R ja Y ovat nukleotidisekvensseja, jotka koodaavat seu-raavia aminohappoja tai aminohappojaksoja: 35 24 90 436 Pr koodaa esipeptidia, joka pilkkoutuu isåntSorga-nismissa tai in vitro, tai Met-aminohappoa, X koodaa aminohappojaksoa Cys-Tyr-Cys-Gln, R koodaa aminohappoja 5 - 127, 5. koodaa aminohappoja 128 - 146 ja Z yhta tai edullisesti kahta lopetuskodonia.
2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelma, tunnettu siita, etta Z merkitsee kahta lopetuskodonia.
3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelma, tunnettu siita, etta bakteeri-isantaorganismi on E. coli. 25 90436
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE3414831 | 1984-04-19 | ||
| DE19843414831 DE3414831A1 (de) | 1984-04-19 | 1984-04-19 | Herstellung von polypeptiden mit human-gammainterferon-aktivitaet |
Publications (4)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FI851529A0 FI851529A0 (fi) | 1985-04-17 |
| FI851529L FI851529L (fi) | 1985-10-20 |
| FI90436B FI90436B (fi) | 1993-10-29 |
| FI90436C true FI90436C (fi) | 1994-02-10 |
Family
ID=6234006
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FI851529A FI90436C (fi) | 1984-04-19 | 1985-04-17 | Ihmisen gammainterferonin kaltaisesti vaikuttavien polypeptidien valmistus |
Country Status (20)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4832959A (fi) |
| EP (1) | EP0161504B1 (fi) |
| JP (2) | JPH0745516B2 (fi) |
| KR (1) | KR920009505B1 (fi) |
| AT (1) | ATE69241T1 (fi) |
| CA (1) | CA1339892C (fi) |
| DE (2) | DE3414831A1 (fi) |
| DK (1) | DK164940C (fi) |
| ES (1) | ES542337A0 (fi) |
| FI (1) | FI90436C (fi) |
| GR (1) | GR850941B (fi) |
| HU (1) | HU210111B (fi) |
| IE (1) | IE59460B1 (fi) |
| IL (1) | IL74947A (fi) |
| MA (1) | MA20411A1 (fi) |
| NO (1) | NO171983C (fi) |
| NZ (1) | NZ211827A (fi) |
| PH (1) | PH25251A (fi) |
| PT (1) | PT80300B (fi) |
| ZA (1) | ZA852900B (fi) |
Families Citing this family (23)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3409966A1 (de) * | 1984-03-19 | 1985-09-26 | Hoechst Ag, 6230 Frankfurt | Gentechnologisches verfahren zur herstellung von human-gammainterferon und mittel zur durchfuehrung dieses verfahrens |
| DE3536939A1 (de) * | 1985-10-17 | 1987-04-23 | Hoechst Ag | Biologisch aktive derivate des human-(gamma)-interferons, ihre herstellung und arzneimittel, die solche derivate enthalten |
| GB8619725D0 (en) * | 1986-08-13 | 1986-09-24 | Hoffmann La Roche | Homogenous interferon fragments |
| DE3642096A1 (de) * | 1986-12-10 | 1988-06-16 | Boehringer Ingelheim Int | Pferde-(gamma)-interferon |
| US5157004A (en) * | 1986-12-27 | 1992-10-20 | Takeda Chemical Industries, Ltd. | Polypeptides and production thereof |
| JP2653061B2 (ja) * | 1986-12-27 | 1997-09-10 | 武田薬品工業株式会社 | 新規ポリペプチドおよびその製造法 |
| CA2390292A1 (en) | 1999-11-12 | 2001-05-25 | Maxygen Holdings Ltd. | Interferon gamma conjugates |
| CN1309423C (zh) | 1999-11-12 | 2007-04-11 | 马克西根控股公司 | 干扰素γ偶联物 |
| US6958388B2 (en) | 2001-04-06 | 2005-10-25 | Maxygen, Aps | Interferon gamma polypeptide variants |
| US7038015B2 (en) * | 2001-04-06 | 2006-05-02 | Maxygen Holdings, Ltd. | Interferon gamma polypeptide variants |
| AU2003239774A1 (en) * | 2002-07-03 | 2004-01-23 | Maxygen Holdings Ltd. | Full-length interferon gamma polypeptide variants |
| US20050003533A1 (en) | 2003-05-08 | 2005-01-06 | Pawel Kalinski | Mature type-1 polarized dendritic cells with enhanced IL-12 production and methods of serum-free production and use |
| BG66458B1 (bg) | 2005-03-21 | 2014-10-31 | Иван Иванов | Средство за конкурентно инхибиране на ендогенен гама интерферон |
| CA2607806A1 (en) * | 2005-05-04 | 2006-11-16 | Nautilus Biotech, S.A. | Modified interferon-gamma polypeptides and methods for using modified interferon-gamma polypeptides |
| WO2008121461A2 (en) * | 2007-02-26 | 2008-10-09 | University Of Pittsburgh - Of The Commonwealth System Of Higher Education | Vaccine for activating helper function of cd8+ tcells |
| US9359421B2 (en) | 2008-04-08 | 2016-06-07 | Tigo Gmbh | Suppressor of the endogenous interferon-gamma |
| BG66517B1 (bg) * | 2008-04-08 | 2016-02-29 | Tigo Gmbh | Супресор на ендогенния човешки гама - интерферон |
| JP4821891B2 (ja) * | 2009-07-01 | 2011-11-24 | トヨタ自動車株式会社 | 電池制御システム及び車両 |
| BG67190B1 (bg) | 2017-03-29 | 2020-11-16 | Tigo Gmbh | Анти-гама мутантен протеин срещу ендогенния човешки гама интерферон |
| WO2020076970A1 (en) | 2018-10-11 | 2020-04-16 | Inhibrx, Inc. | B7h3 single domain antibodies and therapeutic compositions thereof |
| US20210380679A1 (en) | 2018-10-11 | 2021-12-09 | Inhibrx, Inc. | Dll3 single domain antibodies and therapeutic compositions thereof |
| WO2020077257A1 (en) | 2018-10-11 | 2020-04-16 | Inhibrx, Inc. | Pd-1 single domain antibodies and therapeutic compositions thereof |
| US20210340273A1 (en) | 2018-10-11 | 2021-11-04 | Inhlbrx, inc. | 5t4 single domain antibodies and therapeutic compositions thereof |
Family Cites Families (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU561343B2 (en) * | 1981-10-19 | 1987-05-07 | Genentech Inc. | Human immune interferon by recombinant dna |
| JPS58110548A (ja) * | 1981-12-24 | 1983-07-01 | Asahi Chem Ind Co Ltd | 新規な生理活性ペプチド |
| ZA831094B (en) * | 1982-02-22 | 1983-11-30 | Biogen Nv | Dna sequences,recombinant dna molecules and processes for producing human immune interferon-like polypeptides |
| IL68100A0 (en) * | 1982-03-24 | 1983-06-15 | Takeda Chemical Industries Ltd | Novel dna and use thereof |
| US6936694B1 (en) * | 1982-05-06 | 2005-08-30 | Intermune, Inc. | Manufacture and expression of large structural genes |
| JPH0787797B2 (ja) * | 1982-05-20 | 1995-09-27 | サントリー株式会社 | ヒト・ガンマ・インタ−フエロン様ポリペプチドの製造法 |
| US4681848A (en) * | 1982-09-22 | 1987-07-21 | Takeda Chemical Industries, Ltd. | Novel peptide and use thereof |
| US4604284A (en) * | 1983-09-20 | 1986-08-05 | Hoffmann-La Roche Inc. | Homogeneous immune interferon fragment |
| US4855238A (en) * | 1983-12-16 | 1989-08-08 | Genentech, Inc. | Recombinant gamma interferons having enhanced stability and methods therefor |
-
1984
- 1984-04-19 DE DE19843414831 patent/DE3414831A1/de not_active Withdrawn
-
1985
- 1985-03-04 US US06/707,554 patent/US4832959A/en not_active Expired - Lifetime
- 1985-04-13 EP EP85104501A patent/EP0161504B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1985-04-13 AT AT85104501T patent/ATE69241T1/de not_active IP Right Cessation
- 1985-04-13 DE DE8585104501T patent/DE3584579D1/de not_active Expired - Fee Related
- 1985-04-15 HU HU851393A patent/HU210111B/hu not_active IP Right Cessation
- 1985-04-17 IL IL7494785A patent/IL74947A/xx not_active IP Right Cessation
- 1985-04-17 ES ES542337A patent/ES542337A0/es active Granted
- 1985-04-17 PT PT80300A patent/PT80300B/pt unknown
- 1985-04-17 NZ NZ211827A patent/NZ211827A/xx unknown
- 1985-04-17 GR GR850941A patent/GR850941B/el not_active IP Right Cessation
- 1985-04-17 FI FI851529A patent/FI90436C/fi not_active IP Right Cessation
- 1985-04-18 MA MA20635A patent/MA20411A1/fr unknown
- 1985-04-18 IE IE99585A patent/IE59460B1/en not_active IP Right Cessation
- 1985-04-18 JP JP60081502A patent/JPH0745516B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1985-04-18 KR KR1019850002625A patent/KR920009505B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1985-04-18 DK DK176285A patent/DK164940C/da not_active IP Right Cessation
- 1985-04-18 ZA ZA852900A patent/ZA852900B/xx unknown
- 1985-04-18 CA CA000479511A patent/CA1339892C/en not_active Expired - Fee Related
- 1985-04-18 NO NO851564A patent/NO171983C/no not_active IP Right Cessation
- 1985-04-18 PH PH32148A patent/PH25251A/en unknown
-
1993
- 1993-09-01 JP JP5217335A patent/JPH07100037B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| FI90436C (fi) | Ihmisen gammainterferonin kaltaisesti vaikuttavien polypeptidien valmistus | |
| CA1341240C (en) | Dna encoding human tumor necrosis factor and human tumor necrosis factor polypeptide | |
| CA1341124C (en) | Genetic engineering process for the preparation of hirudins, and means for carrying out this process | |
| EP0041313B1 (en) | Dna sequences, recombinant dna molecules and processes for producing human fibroblast interferon | |
| US4582800A (en) | Novel vectors and method for controlling interferon expression | |
| EP0211148B2 (en) | Mature human leukozyte interferons, process for their bacterial production, intermediates therefor and compositions containing them | |
| EP0028033B1 (en) | Double-stranded dna which codes for a polypeptide with human fibroblast interferon activity, cloned dna, recombinant plasmid containing the dna and microorganism containing the recombinant plasmid | |
| US5288852A (en) | Human tumor necrosis factor polypeptides | |
| US5089400A (en) | Polypeptides and process for the production thereof | |
| HU196455B (en) | Process for producing transformants giving curative peptides | |
| HU209152B (en) | Method for producing human interferon protein of high purity and pharmaceutical preparative containing it | |
| EP0095350B1 (en) | A method of producing human gamma-interferon-like polipeptide | |
| IE851319L (en) | Genetically engineered interleukin 2 | |
| EP0062971B1 (en) | Genetically modified microorganisms | |
| HU196846B (en) | Process for producing biologically active derivatives of human gamma-interferon and pharmaceutical compositions comprising the same | |
| US9376478B1 (en) | DNA and recombinant plasmid | |
| JPH05320200A (ja) | 新規ヒトインターフェロン−γポリペプチド | |
| AU592062B2 (en) | Synthetic regulation region | |
| US4711847A (en) | Preparation of secretin | |
| GB2213821A (en) | Synthetic gene | |
| US6018037A (en) | DNA coding for (Leu13) motilin | |
| US5695952A (en) | Method for producing Leu13 !motilin | |
| NO851065L (no) | Genteknologisk fremgangsmaate til fremstilling av human-gammainterferon og middel til gjennomfoering av denne fremgangsmaaten |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| BB | Publication of examined application | ||
| MM | Patent lapsed |
Owner name: HOECHST AKTIENGESELLSCHAFT |