CN103805622A - 基因工程IFNα-2b融合蛋白质新型制备工艺 - Google Patents

Abstract

本发明提供了基因工程IFNα-2b融合蛋白质新型制备工艺，为解决无法去除错配异构体的现状，采用融合表达载体，将促进干扰素α-2b二硫键正确折叠的蛋白质及高效蛋白酶底物片段与干扰素α-2b基因融合表达，形成可溶性天然结构表达形式；目的蛋白以可溶性天然结构形式表达，活性高，无需复性处理，避免蛋白质异构体产生；蛋白质纯化工艺简洁，仅需一步金属螯合亲和层析产品纯度即可达到90%以上，去除融合蛋白片段，再利用该亲和层析获得纯度95%以上的终产品，产量高，活性明显提升，成本低；达全菌体蛋白的30%以上；获得了干扰素α-2b天然结构的表达产物，产品活性优于现有的国内和国际产品。

Description

基因工程IFN α-2b融合蛋白质新型制备工艺

技术领域

本发明属生物技术领域，涉及基因工程干扰素（IFN）α-2b融合蛋白质的新型制备工艺，更具体地说，本发明涉及基因工程IFN α-2b融合蛋白质的基因重新构建、可溶性形式表达和新型纯化制备工艺。

背景技术

干扰素是一种重要的细胞功能调节因子。干扰素具有广谱的抗病毒、抗细胞分裂、免疫调节等生物活性，是一种重要的抗病毒、抗肿瘤治疗药物。

干扰素的种类繁多，有人体干扰素、动物干扰素、昆虫干扰素、植物干扰素和细胞干扰素。人干扰素主要来自人体白细胞和类淋巴细胞株，分α、β、γ、ω四个型别，其中人α干扰素有15种亚型 (α1 、α2a 、α2b ⋯) 。人的β型干扰素(HuIFN2β)和γ 型干扰素( HuIFN2γ) 公认的只有一个亚型。白细胞干扰素的制剂化面临有两个问题：首先大量生产必须保证有足够数量的外周血白细胞，其次以数百上千人血液中采集的白细胞用仙台病毒诱生时，必须保证不混入来自人体的病毒和基因。虽然采用目前的精制技术和处理方法提纯是可靠的，但由于这种干扰素难以制备，产量有限，价格昂贵，限制了其临床应用。利用基因工程技术批量生产干扰素使之临床应用成为现实。

20世纪80年代中期：第二代基因工程IFN α-2b问世，其分子结构、功能与人IFN几乎一致，于1986年被FDA批准用于治疗慢性乙型肝炎、丙型肝炎 (1991 年2 月)，继而被批准用于毛细胞白血病(1986 年6 月)、生殖器疣(1988 年6 月)、 AIDS 相关的Kaposi′s 肉瘤 (1988 年11 月)及多种肿瘤治疗如膀胱癌, CML , 头颈部肿瘤、恶性黑素瘤、多发性骨髓瘤、非Hodgkin′s 淋巴瘤,肾细胞癌等。

目前，国内生产重组人干扰素的企业有 30 多家：其中半数以上企业生产IFN α-2b品种。其剂型主要包括注射剂、栓剂、滴眼液、乳膏等共有290多个文号。

在国内重组人干扰素市场，呈现国产药品和进口药品并存的格局。进口重组人干扰素主要有先灵葆雅、罗氏制药生产的PEG修饰的长效干扰素，价格偏高，平均单价在 1,300 元左右。国产重组人干扰素主要为普通干扰素，注射用干扰素α-2b单价（300万单位）在 30 元/支左右，普通干扰素市场竞争主要集中在国内生产企业之间。国内主要生物制药企业正在积极研制长效重组人干扰素，一旦研制成功正式投产，凭借区位及价格优势，国产重组人干扰素生产企业的市场份额将显著扩大。

近年来，我国重组人干扰素的销售额保持逐年平稳的增长，预计在未来三到五年内，重组人干扰素国内市场年增长率将保持在 10%-15%之间，预计到 2015 年我国重组人干扰素市场规模将达到 48 亿元左右。

然而，与市场需求不相适应的是国内几乎所有生产企业一直沿用旧的生产工艺，如大肠杆菌表达、包涵体分离纯化、尿素变性、再复性、纯化，尤其变性过程中使用高纯度尿素和复性过程中使用氧化-还原型谷胱甘肽为主要原料的复性剂，致使生产成本显著提高，复性率较低，同时产品中残存无活性的二硫键错配异构体，尽管纯度检测能够通过国家规定的95%，但无活性的二硫键错配异构体成分约占终产品的10-15%，故国内产品活性低、疗效差、副作用大，且通过传统工艺根本无法解决。近年来有人尝试利用高压液相反相色谱进行错配异构体的去除实验，通过C18层析柱+进口乙腈+进口三氟乙酸可以达到95%纯度，但工艺成本显著提高，其成本是原产品的三倍以上，尽管国家科技部新药创制重大专项将干扰素长效技术改造和提取工艺改造列为重点资助方向，但成效至今尚未显现。

发明内容

本发明目的无法去除错配异构体的现状及制造成本高的问题，而提供基因工程IFN α-2b融合蛋白质新型制备工艺。

基因工程IFN α-2b融合蛋白质基因，其碱基序列如序列表SEQ ID No.3所示。

用于制备基因工程IFN α-2b融合蛋白质的基因，其碱基序列如序列表SEQ ID No.1所示。

用于制备基因工程IFN α-2b融合蛋白质的基因，其碱基序列如序列表SEQ ID No.2所示。

一种表达载体，它是携带T7强启动子且含有多克隆位点的表达载体，并将其碱基序列如序列表SEQ ID No.3所示的基因，克隆到该表达载体的T7启动子之后；

所述的多克隆位点的表达载体为PET11a。

基因工程IFN α-2b融合蛋白质新型制备工艺，步骤如下：

1）人工合成碱基序列如序列表SEQ ID No.1和2所示的基因；

2）用NdeI、EcoRI双酶切碱基序列如序列表SEQ ID No.1所示的基因和PET11a，T₄连接酶连接，构建的PET11a-TrxA-HIS6-SUMO质粒；

3）利用NcoI、EcoRI双酶切如序列表SEQ ID No. 2所示的基因和步骤2）所构建的PET11a-TrxA-HIS6-SUMO质粒；T₄连接酶连接，构建的pET11a-TRXA-SUMO- IFN α -2b质粒；

4）将pET11a-TRXA-SUMO- IFN α -2b质粒转化至大肠杆菌BL21（DE3）中，诱导表达，纯化；

5）用SUMO酶切步骤4）纯化的融合蛋白；酶切融合蛋白去除融合蛋白分子中转硫酶A和SUMO酶切底物部分，再纯化；

步骤4）得到的纯化蛋白经过缓冲液平衡的DEAE-Sepharose Fast Flow柱，用含有0~0.5M NaCl的TE缓冲液连续梯度洗脱，并收集蛋白质各组分峰部分；目的组分峰部分经小型中空纤维超滤器作用30分钟超滤浓缩换液后，使浓缩物通过用20mM Tris-HCl, pH8.0，0.15M NaCl缓冲液平衡过的1.6×100cm IMAC柱（Pharmacia），并用含有0.15M NaCl的缓冲液洗脱。收集目的蛋白峰部分，利用SUMO酶切目的蛋白，并再次过IMAC液相色谱柱，收集蛋白质峰值部分，并在30mM PBS中彻底透析，透析后于-20℃下储存备用；

所述的0.15M NaCl的缓冲液为20mM Tris-HCl,pH8.0，200mM咪唑。

发明详述：本发明IFN α-2b大肠杆菌偏性密码子为主体，以人工体外基因合成，将有促进外源蛋白质二硫键正确形成的转硫酶A（TrxA）基因以第一顺位克隆到表达载体的T7启动子之后；将便于纯化和组氨酸标签（His6-Tag）基因以第二顺位克隆到TrxA之后；将SUMO蛋白酶识别底物序列以第三顺位克隆到组氨酸标签His6之后；将大肠杆菌偏性密码子组成的IFN α-2b基因以第四顺位克隆在SUMO蛋白酶识别底物序列之后；在咪唑存在下进行金属螯合介质纯化，一步获得90%纯度的融合蛋白。利用高特异性和高活性SUMO蛋白酶对纯化的融合蛋白进行酶切，使标签部分与IFN α-2b目的蛋白解离，并利用金属螯合介质将标签部分与IFN α-2b目的蛋白分离。从而获得纯度达95%的天然结构的目的蛋白；高度纯化的目的蛋白质在多种保护剂存在下，制备成具有药用价值的药物组合物。

本文中所使用术语“干扰素IFN α-2b”，是指能够在体内外发挥人干扰素功能的基因工程产品，根据本发明的优选实施方案，为忠实于天然IFN α-2b氨基酸序列，合成基因时特意设计将天然IFN α-2b首位氨基酸Cys的密码子TGC置于SUMO蛋白酶识别底物氨基酸序列Gly-Gly之后，所说的IFN α-2b是以不含Met为首位密码子的基因工程重组IFN α-2b。

文中所用的氨基酸符号为本领域通用的三字母缩写符号，其中为了基因连接方便在基因合成时于融合蛋白N末端添加了NcoI限制性内切酶识别位点，并利用NcoI限制性内切酶识别位点中的ATG作为首位启动密码子，翻译表达融合蛋白首位氨基酸Met。同时在融合的蛋白基因的3`端加入限制性内切酶EcoRI的识别序列GAATTC，以便使基因片段和载体连接时均形成粘性末端，利于基因连接。为使表达产物达到高效表达，将大肠杆菌偏性密码子引入到其中，以使表达产物适合在大肠杆菌中表达。

利用本发明方法制备的IFN α-2b与原工艺产物进行了活性对比，结果发现本发明专利制备的样品活性显著优于原工艺产品。

本文中所使用术语“IU”是指利用中国生物制品规程所描述的干扰素活性检定标准方法测定的活性单位数，即利用体外培养的人羊膜细胞（WISH）上抑制水泡性口炎病毒（VSV）的破坏作用（参见中国药典附录，干扰素生物活性测定法）。

用于构建本发明的融合蛋白质的IFN α-2b分子可以是缺失了N端Met的天然IFN α-2b分子，其氨基酸序列完全一致于Genbank报道的人IFN α-2b序列，同时其二硫键正确形成，其活性等同或高于人天然干扰素α-2b。其中所说的IFN α-2b是以单体分子形式存在的，也可以通过PEG修饰形成长效干扰素。

由于暂时缺乏作为本发明融合IFN α-2b分子中转硫酶A、His-Tag和SUMO酶切底物的现成序列，所以在本发明中使用通用的DNA合成仪在1000A固相载体上合成编码这些融合蛋白的核苷酸序列。为了便于与特定重组载体进行连接，可在合成的融合蛋白基因序列的5’和/或3’端引入适当的核酸内切酶（如NcoI和EcoRI）酶切位点，并造成适于连接的粘性末端。可按照本领域技术人员已知的重组技术，克隆编码这些合成的阅读框架通畅的基因（或以其cDNA或基因组DNA形式），DNA重组操作中，一般使用标准的基因克隆和亚克隆技术进行基因片段的转移和连接。使用限制性酶切法鉴定序列连接方向的正确性和可能的突变，最后以DNA测序进行序列确认。

这里应特别指出的是，由于相对于IFN α-2b分子来讲，融合表达的转硫酶A和SUMO酶切底物部分分子量偏大，所以由三者产生的融合蛋白质中很可能形成新的高级空间构象，导致前导部分对IFN α-2b的卷曲形成影响，影响IFN α-2b的活性和空间构像。然而通过技术人员计算机分析和园二色谱检测证明IFN α-2b蛋白质分子是以正确的二硫键形式进行折叠的。

重组蛋白质基因将被可操纵地连接到适当的表达控制序列上，如连接到适于在大肠杆菌中使用的T₇、trp或λ启动子、核糖体结合位点及转录终止信号上。可使用已知的转化方法，如适于原核细胞的氯化钙处理法或适于哺乳动物细胞的电穿孔法将本发明的重组质粒转化到选择的宿主细胞中。可基于质粒上所含抗生素抗性基因所赋予的抗生素抗性来选择被转化的阳性细胞。一旦表达了所需的融合蛋白质，即可按照本领域已知的方法分离并纯化该融合蛋白质。例如，可从发酵培养物中离心收集菌体细胞并用溶菌酶和超声波裂解之，然后超速离心并在低浓度磷酸盐（约20mM）溶液中加入饱和硫酸铵进行分步沉淀。依次经离子交换层析（IEC）和IMAC层析纯化所需的IFN α-2b重组蛋白质。。

一般说来，使用聚丙烯酰胺凝胶以SDS-PAGE电泳法分析各柱层析洗脱部分，并以免疫印迹法监测之。对重组融合蛋白质纯化产物进行细胞病毒抑制试验以检测重组蛋白质的生物学活性（具体操作见中国生物制品规程2010版）。

可将本发明的IFN α-2b蛋白质作为基本活性成分，并加入一种或多种医药上可接受的载体或赋形剂，制成适于临床应用的药物组合物。所说的载体或赋形剂包括但不只限于磷酸盐缓冲液、生理盐水、等渗葡萄糖溶液、葡聚糖、右旋糖苷等。根据所治疗的疾病的不同，可在本发明的药物组合物中加入一种或多种与本发明的蛋白质有辅助或协同作用的其他天然的、合成的或重组的活性化合物。另外，可在本发明的药物组合物中加入低分子量肽、甘氨酸或赖氨酸及金属阳离子（如Zn²⁺、Mn²⁺、Mg²⁺和Ca²⁺）的蛋白质保护剂，以及聚乙二醇、羧甲基纤维素、多聚甘氨酸、谷胱甘肽的稳定剂。

可以通过常规给药途径，特别是胃肠道外途径投用本发明的药物组合物，例如通过静脉内、腹腔内、肌肉内、皮内、皮下或粘膜内途径给药。本发明药物组合物的有效剂量范围可从几毫微克至几十毫克/公斤体重/天，但针对每个特定病人的具体用药剂量将根据待治疗疾病或病理状态的性质及严重程度、病人的年龄、体重、对药物的反应能力及给药方式等因素而定。

本发明提供了基因工程IFN α-2b融合蛋白质新型制备工艺，为解决无法去除错配异构体的现状，采用融合表达载体，将促进干扰素α-2b二硫键正确折叠的蛋白质及高效蛋白酶底物片段与干扰素α-2b基因融合表达，形成可溶性天然结构表达形式；目的蛋白以可溶性天然结构形式表达，活性高，无需复性处理，避免蛋白质异构体产生；蛋白质纯化工艺简洁，仅需一步金属螯合亲和层析产品纯度即可达到90%以上，去除融合蛋白片段，再利用该亲和层析获得纯度95%以上的终产品，产量高，活性明显提升，成本低；达全菌体蛋白的30%以上；获得了干扰素α-2b天然结构的表达产物，产品活性优于现有的国内和国际产品。

应特别指出的是，尽管更深入的作用机理尚不明确，但我们的实验室已证明本发明的IFN α-2b蛋白质对包括结肠癌HT-29细胞、卵巢癌OVCAR3细胞、子宫颈腺癌HeLa细胞及肝癌HepG-2细胞等肿瘤细胞系均有明显的抑制作用，同时证明本发明的IFN α-2b蛋白质对包括水泡性口炎病毒等具有显著的抑制作用。

附图说明

图1显示用于表达融合蛋白的重组质粒构建图。

具体实施方式

以下借助实施例进一步阐明本发明，但本领域技术人员可以意识到，这些实施例并不构成对本发明待批权利要求范围的限制。

实施例 1：IFN α-2b蛋白质的制备

A. 重组表达质粒的构建与鉴定

a. 基因合成：本发明中参考已经公开认知的转硫酶A和SUMO酶识别底物序列，人工体外合成如下序列：

NdeI内切酶识别序列（CATATG）+转硫酶A+HIS6+NcoI识别序列（CCATGG）+SUMO酶识别底物序列+EcoRI内切酶识别序列（GAATTC），基因序列见SEQ ID NO:1，本合成序列直接克隆入大连Takara公司提供的T 载体中，并转化大肠杆菌JM109细菌，经PCR鉴定确定阳性克隆株，阳性克隆株扩大培养，常规分子克隆技术提取质粒DNA，利用NdeI、EcoRI双酶切本质粒和PET11a质粒，回收目的片段和PET11a质粒载体粘性末端片段，以正确的阅读框架在T₄连接酶（Promega）存在下将目的片段插入到同样酶切的PET11a质粒载体中，构建融合蛋白前部双链表达基因。

b.然后人工合成NcoI识别序列（CCATGG）+SUMO酶识别底物序列+IFNα-2b +EcoRI内切酶识别序列（GAATTC）序列，基因序列见SEQ ID NO:2，使IFNα-2b的N端第一个氨基酸密码子与SUMO酶识别底物序列C端的密码子GGAGGC直接相连，合成的双链基因直接克隆入大连Takara公司提供的T 载体中，并转化大肠杆菌JM109细菌，经PCR鉴定确定阳性克隆株，阳性克隆株扩大培养，常规分子克隆技术提取质粒DNA，利用NcoI、EcoRI双酶切本质粒和步骤1所构建的PET11a-TrxA-HIS6-SUMO质粒，回收目的片段和PET11a-TrxA-HIS6-SUMO质粒载体粘性末端片段，以正确的阅读框架在T₄连接酶（Promega）存在下将目的片段插入到同样酶切的载体质粒中，构建融合蛋白全序列双链表达基因。构建的载体转化感受态大肠杆菌JM105细胞，并将被转化的细胞培养于含氨苄青霉素（50μg/ml）的LB培养基中，以扩增质粒DNA。培养完成后，破碎细胞，离心收集质粒并纯化质粒DNA测序，测序正确的质粒将被转化大肠杆菌BL21（DE3）菌株，用酶切鉴定法和琼脂糖凝胶（2%）电泳法进行鉴定，然后阳性重组质粒进行DNA序列分析。SEQ ID NO:3显示了所测得的融合蛋白重组基因的核苷酸序列。图I显示了重组质粒pET11a-TRXA-SUMO- IFNα-2b的构建。

B. TRXA-SUMO- IFNα-2b融合蛋白质的表达及产物的纯化：

将携带重组基因质粒转化的大肠杆菌BL21（DE3）（含有T₇ RNA聚合酶基因）培养在含有氨苄青霉素（50μg/ml）的LB琼脂平皿上。培养后挑选氨苄青霉素抗性菌落，于含氨苄青霉素（50μg/ml）的LB培养基中37℃培养，当A₆₀₀达到约0.4~0.6时加入1mM异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）（终浓度1mM），37℃继续培养3小时，以诱导目的产物的表达。然后离心分离细胞和培养基,并将含有目的蛋白质的菌体中加入缓冲液成分，终浓度达50mM Tris-HCl, pH8.0, 1mM EDTA， 超声破碎， 4℃离心（20，000g, 30分钟），取上清（可溶性部分）即为融合蛋白粗提物。

粗提物经过缓冲液平衡的DEAE-Sepharose Fast Flow柱（Pharmacia），用含有0~0.5M NaCl的TE缓冲液（20mM Tris-HCl, pH8.0, 1mM EDTA）连续梯度洗脱，并收集蛋白质各组分峰部分。目的组分峰部分经小型中空纤维超滤器（Milipore）作用30分钟超滤浓缩换液后，使浓缩物通过用20mM Tris-HCl, pH8.0,，0.15M NaCl缓冲液平衡过的1.6×100cm IMAC柱（Pharmacia），并用含有0.15M NaCl的缓冲液（20mM Tris-HCl,pH8.0，200mM咪唑）洗脱。收集目的蛋白峰部分，利用SUMO酶切目的蛋白，30℃，4hr，并再次过IMAC液相色谱柱，收集蛋白质峰值（A₂₈₀）部分并在30mM PBS中彻底透析，透析后于-20℃下储存备用。如此纯化的蛋白质纯度 >97%。

实施例 2 ：利用细胞病变抑制法测定新工艺制备的IFNα-2b对人羊膜细胞（WISH）免受水疱性口炎病毒破坏作用，（具体操作见中国药典2005版第三部 附录XC）。

细胞病变抑制试验：

将培养的人羊膜细胞单层细胞经胰蛋白酶消化，吹打收集细胞悬液，利用细胞计数板记数后，调整细胞数量为60000个/ml，按照80μl/孔加入到96孔培养板中（每孔5000细胞），5％CO₂，37℃条件下培养4h。调整购于中国药品生物制品检定院的IFNα-2b标准品和新工艺制备的IFNα-2b蛋白质样品浓度为1mg/ml，定量的样品经过滤除菌,按等倍稀释法将不同量的样品加入各细胞孔中,然后补足培养基，使之总体积为100μ1, 5％CO₂，37℃条件下培养24h。弃去细胞培养板中的上清液，将-70℃保存的水泡性口炎病毒（VSV）用攻毒培养液稀释至100CCID50，每孔100μ1，于5％CO₂，37℃条件下培养24h，然后弃去细胞板中上清液，每孔加入50μ1染色液，室温放置30min后，用流水冲去染色液，并吸干残留水分，每孔加入脱色液100μ1，室温放置5min,混匀后，用酶标仪以630nm为参比波长，在波长570nm处测定吸光度，记录测定结果。

实验数据采用计算机程序进行参数回归计算：

供试品生物活性（IU/mg）=Pr╳（Ds╳Es）/（Dr╳Er）

公式中：Pr为标准品生物活性，IU/mg；

Ds为供试品预稀释倍数；

Dr为标准品预稀释倍数；

Es为供试品相当于标准品半效量的稀释倍数；

Er为标准品半效量稀释倍数。

实施例 3 ：利用体外培养的肿瘤细胞测定IFNα-2b肿瘤抑制的生物学活性作用，（具体操作参考中国药典2010版第三部 附录XC）。

细胞病变抑制试验：

将培养的人肿瘤细胞（人肠癌细胞）单层细胞经胰蛋白酶消化，吹打收集细胞悬液，利用细胞计数板记数后，调整细胞数量为60000个/ml，按照80μl/孔加入到96孔培养板中（每孔5000细胞），5％CO₂，37℃条件下培养4h。调整制备的IFNα-2b蛋白质样品效价为1×10⁸IU/ml，定量的样品经过滤除菌,按等倍稀释法将不同量的样品加入各细胞孔中,然后补足培养基，使之总体积为100μ1, 5％CO₂，37℃条件下培养24h。然后弃去细胞板中上清液，每孔加入50μ1染色液，室温放置30min后，用流水冲去染色液，并吸干残留水分，每孔加入脱色液100μ1，室温放置5min,混匀后，用酶标仪以630nm为参比波长，在波长570nm出测定吸光度，记录测定结果。

实验数据采用计算机程序进行参数回归计算：对各实验样品的各实验点OD值、预稀释倍数、样本梯度等数据采用计算机程序进行处理。分别计算各实验样品的半效稀释倍数并计算肿瘤细胞抑制率（结果见表3）。

由于新型工艺样品纯化简单，操作时间短，样品活性保持好，并且纯化步骤简单，经济适用。

<110> 中国人民解放军军事医学科学院军事兽医研究所

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<160> 3

<210> 1

<211> 714

<212> DNA

<213> 人工

<400> 1

catatgagcg ataaaattat tcacctgact gacgacagtt ttgacacgga tgtactcaaa 60

gcggacgggg cgatcctcgt cgatttctgg gcagagtggt gcggtccgtg caaaatgatc 120

gccccgattc tggatgaaat cgctgacgaa tatcagggca aactgaccgt tgcaaaactg 180

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<210> 2

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<212> DNA

<213> 人工

<400> 2

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gatccagcag atcttcaacc tcttcagcac aaaagactca tctgctgctt gggatgagac 600

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aagtttaaga tctaaagagt aagaattc 868

<210> 3

<211> 1209

<212> DNA

<213> 人工

<400> 3

atgagcgata aaattattca cctgactgac gacagttttg acacggatgt actcaaagcg 60

gacggggcga tcctcgtcga tttctgggca gagtggtgcg gtccgtgcaa aatgatcgcc 120

ccgattctgg atgaaatcgc tgacgaatat cagggcaaac tgaccgttgc aaaactgaac 180

atcgatcaaa accctggcac tgcgccgaaa tatggcatcc gtggtatccc gactctgctg 240

ctgttcaaaa acggtgaagt ggcggcaacc aaagtgggtg cactgtctaa aggtcagttg 300

aaagagttcc tcgacgctaa cctggccggt tctggttctg gccatggtac cggcagcagc 360

catcatcatc atcatcatgg cagcggtctg gtgccgcgtg gcagcgcgag catgagcgat 420

agcgaggtga accaggaagc gaagccggag gtcaagccgg aggtcaagcc ggagacgcac 480

atcaacctga aggtcagcga tggcagctct gagattttct tcaagatcaa gaagaccacg 540

ccgctgcgtc gtctgatgga ggcgttcgct aagcgtcaag gcaaggagat ggacagcctt 600

cgcttcctgt acgatggcat ccgcattcaa gctgatcaga ctccggagga cctggatatg 660

gaggacaacg acatcatcga agctcatcgt gagcagatcg gaggctgcga cctaccacaa 720

acccacagcc tgggtagcag gaggaccttg atgctcctgg cgcagatgag gagaatctct 780

cttttctcct gcttgaagga cagacatgac tttggatttc cccaggagga gtttggcaac 840

cagttccaaa aggctgaaac catccctgtc ctccatgaga tgatccagca gatcttcaac 900

ctcttcagca caaaagactc atctgctgct tgggatgaga ccctcctaga caaattctac 960

actgaactct accagcagct gaatgacctg gaagcctgtg tgatacaggg ggtgggggtg 1020

Claims (8)

1.基因工程IFN α-2b融合蛋白质基因，其碱基序列如序列表SEQ ID No.3所示。

2.用于制备基因工程IFN α-2b融合蛋白质的基因，其碱基序列如序列表SEQ ID No.1所示。

3.用于制备基因工程IFN α-2b融合蛋白质的基因，其碱基序列如序列表SEQ ID No.2所示。

4.一种表达载体，它是携带T7强启动子且含有多克隆位点的表达载体，并将其碱基序列如序列表SEQ ID No.3所示的基因，克隆到该表达载体的T7启动子之后。

5.权利要求4所述的一种表达载体，其特征在于：所述的多克隆位点的表达载体为PET11a。

6.基因工程IFN α-2b融合蛋白质新型制备方法，步骤如下：

1）人工合成碱基序列如序列表SEQ ID No.1和2所示的基因；

2）用NdeI、EcoRI双酶切碱基序列如序列表SEQ ID No.1所示的基因和PET11a，T₄连接酶连接，构建的PET11a-TrxA-HIS6-SUMO质粒；

3）利用NcoI、EcoRI双酶切如序列表SEQ ID No. 2所示的基因和步骤2）所构建的PET11a-TrxA-HIS6-SUMO质粒；T₄连接酶连接，构建的pET11a-TRXA-SUMO- IFN α-2b质粒；

4）将pET11a-TRXA-SUMO- IFN α-2b质粒转化至大肠杆菌BL21（DE3）中，诱导表达，纯化；

5）用SUMO酶切步骤4）纯化的融合蛋白；酶切融合蛋白去除融合蛋白分子中转硫酶A和SUMO酶切底物部分，再纯化。

7.权利要求6所述的基因工程IFN α-2b融合蛋白质新型制备方法，其特征在于：步骤4）得到的纯化蛋白经过缓冲液平衡的DEAE-Sepharose Fast Flow柱，用含有0~0.5M NaCl的TE缓冲液连续梯度洗脱，并收集蛋白质各组分峰部分；目的组分峰部分经小型中空纤维超滤器作用30分钟超滤浓缩换液后，使浓缩物通过用20mM Tris-HCl, pH8.0，0.15M NaCl缓冲液平衡过的1.6×100cm IMAC柱，并用含有0.15M NaCl的缓冲液洗脱；收集目的蛋白峰部分，利用SUMO酶切目的蛋白，并再次过IMAC液相色谱柱，收集蛋白质峰值部分，并在30mM PBS中彻底透析，透析后于-20℃下储存备用。

8.权利要求7所述的基因工程IFN α-2b融合蛋白质新型制备方法，其特征在于：所述的0.15M NaCl的缓冲液为20mM Tris-HCl,pH8.0，200mM咪唑。

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