ITMI941916A1 - Antagonisti recettoriali di il-1 ad aumentata attivita' inibitoria - Google Patents
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Description
Descrizione dell ' invenzione industriale avente per titolo: "ANTAGONISTI RECETTORI ALI DI IL-1 AD AUMENTATA ATTIVITÀ' INIBITORIA"
La presente invenzione riguarda mutanti dell ' antagonista recettoriale di IL-1 (IL- lra) , con una attività inibitoria migliorata rispetto all'antagonista wild type, mezzi e metodi per la loro preparazione e loro inpiego nel settore terapeutico in tutte le patologie in cui si ipotizzi un coinvolgimento di IL-1.
Background dell'invenzione
Si definisce IL-1 (interleuchina 1) quella citcchina che l'organismo produce, in seguito a infezioni, insulti di varia natura, o stimolazione antigenica, per iniziare la reazione di difesa di tipo infi armatori o e immunitario. IL-1 è un polipeptide di circa 17,5 kDa in forma matura, prodotta principalmente dai macrofagi ma anche da cellule epidermiche, linfoidi, vascolari, epiteliali. IL-1 è uno dei principali fattori stimolanti della risposta sia infiammatoria che immunitaria e, in forma circolante è in grado di agire come un ormone inducendo un largo spettro di alterazioni sistemiche a livello metabolico, neurologico, ematologico e endocrinologioo. Infatti IL-1 influenza il rimodellamento tissutale mesenchimale, contribuendo sia ai processi distruttivi che a quelli di riparo. Inoltre IL-1 è un attivatore dei linfociti e gioca un ruolo basilare nell 'inizio e nell'amplificazione della risposta immunitaria . IL-1 possiede inoltre forti attività di tipo infiammatorio, acme per esempio la stimolazione della produzione di prostanoidi e di proteasi in cellule diverse, inclusi condrociti, fibroblasti, sinoviociti, cellule cerebrali. IL-1 è infatti coinvolta in diverse componenti della risposta di fase acuta ed è il mediatore endogeno della febbre (endogenous pyrogen). IL-1 può agire in sinergismo con altre citochine, in particolare TNFα, amplificando significativamente la sua attività infiammatoria.
Il clonaggio di IL-1 ha portato all’identificazione di due forme attive. La forma predominante è IL-1B, sintetizzata come un precursore inattivo di 269 aminoacidi (31 kDa), che viene poi tagliato da una proteasi per dare origine alla forma matura attiva (Corrispondente agli aminoacidi 117-269 del precursore). Una forma circa cento volte meno frequente, e in genere associata alle cellule, è IL-1α , che ha un'omologia con IL-10 di circa il 26%, e che pure viene sintetizzata come un precursore di 271 aminoacidi (che tuttavia possiede attività biologica) che dà poi origine alla forma matura dopo proteolisi del precursore. IL-1 rappresenta un caso particolare fra le citochine (insieme a FGF) in quanto manca di peptide segnale e perciò non viene secreta attraverso le vie normali. La forma extracellulare più abbondante è dunque costituita dalla forma matura di IL-lB, che è perciò responsabile della maggioranza delle attività biologiche di IL-1, sia imnunostimolanti che infiammatorie.
A causa di tali attività, si è ipotizzato che IL-1 potesse avere un ruolo nella patogenesi di malattie infianmatorie e autoinrauni. Infatti, nella grande maggioranza delle patologie di infiammazione acuta e cronica e in molte patologie autoimmuni l’aumentata produzione di IL-1β è stata individuata come uno dei principali fattori responsabili della patologia .
Le attività biologiche di IL-1 sono inibite in presenza di inibitori specifici. Dato il ruolo fondamentale di IL-1 nella patogenesi di diverse malattie autoimmuni e di infiammazione cronica con distruzione tessutale, si ipotizza che l'inibizione di IL-1 possa essere utile nel trattamento di tali patologie. IL-lra (antagonista recettoriale di IL-1) è una citochina strutturalmente molto simile a IL-1 , che viene però sintetizzata con un peptide segnale e secreta come proteina matura glicosilata. E' stata altresì descritta anche una forma intracellulare non glicosilata di IL-lra, con sette aminoacidi in più e senza peptide segnale, oon attività paragonabile a quella di IL-lra secreto. IL-lra è capace di legarsi efficacemente a IL-1Ri e molto meno bene a IL-lRII IL-lRI, il recettore per IL-1 di tipo I, è un recettore che appartiene alla superiamiglia delle immunoglobuline, composto da un domain extracellulare (che presenta tre motivi immunoglobulino -simili legati da ponti disolfuro), da una sequenza transmembrana che ancora il recettore alla cellula, e da un domain intracellulare responsabile della trasmissione del segnale di attivazione all'interno della cellula. L'altro recettore di IL-1, IL-IRII è strutturalmente molto simile a IL-lRI nella parte extracellulare e transmentorana, ma praticamente non possiede domain intracellulare e non sembra dunque in grado di trasmettere il segnale di attivazione. Si ipotizza dunque che IL-lRII non abbia capacità di attivare le cellule e che IL-lRI sia responsabile di gran parte dell'attivazione cellulare in risposta a IL-1 (Arend W.P. J. Clin. Invest. 88: 1445, 1991; Today 11: 404, 1991) . IL-1RII viene naturalmente rilasciato dalla membrana cellulare, probabilmente per effetto di una proteasi specifica, e una volta libero nello spazio extracellulare è in grado di catturare IL-1β circolante e di imoedirne l'interazione oon IL-lRI di membrana, funzionando perciò da inibitore di IL-1. Tuttavia, l'effettivo ruolo biologico di IL-1RJJ , oltre a quello di catturare e inibire IL-1 quando rilasciato dalla cellula in forma solubile, non è ancora chiarito definitivamente e esistono dati in diversi sistemi suggestivi di una possibile attivazione cellulare dipendente da IL-1RII (Boraschi et al. Neuro-Inrtrunology of Fever p. 19, 1992; Luheshi G. et al. Am. J. Physiol. 265: E585, 1993; Kent S. et al. Proc. Nati. Acad. Sci. CJSA 89: 9117, 1992) . IL-lra non ha attività biologica IL-l-s invile, in quanto occupa IL-IRI. senza attivare la cellula, e occupando il recettore funziona da antagonista dell'attività di IL-1. A causa della sua attività antagonista, IL-lra è stato usato oon successo in modelli sperimentali di infiammazione indotta da IL-1, da LPS (endotossina batterica) e da batteri vivi, per inibire gli effetti patologici infiammatori , tossici e letali dei trattamenti (Ohlsscn K. et al. Nature 348: 550, 1990; Wakabayashi G. et al. FASEB J. 5: 338,1991; Alexander H.R. et al. J. Exp. Med. 173: 1029, 1991; Fischer E. et al. J. Clin. Invest. 89: 1551, 1992) . Data tuttavia l'estrema potenza di IL-1 (che può attivare le cellule occupando meno di dieci recettori/cellula) , le dosi di IL-1ra necessarie per ottenere effetti terapeutici significativi in vivo sono estremamente alte. Le sperimentazioni nell' uomo nello shock settico hanno dimostrato un'efficacia marginale di IL-1ra anche a dosaggi altissimi (Fischer C.J. et al. , J.A.M.A. 271: 1836, 1994) . Risulta perciò particolarmente utile poter modificare la struttura di IL-1ra in modo da aumentarne le capacità di interazione con IL-1RI e perciò migliorarne l'efficacia terapeutica.
Campo dell'invenzione
La presente invenzione riguarda un preparato utile cerne farmaco in campo terapeutico, consistente in una preparazione farmaceutica di una proteina ricombinante umana antagonista di IL-1, capace di inibire con aumentata efficacia le attività patogenetiche di IL-1. Il canpo dell'invenzione include;
mutanti di IL-1ra con migliorata attività inibitoria caratterizzati dal fatto che almeno uno dei due residui aminoacidici in posizione 91 e 109 della sequenza di IL-lra wild type (wt) è sostituito da un residuo differente;
sequenze di DNA codificanti detti mutanti;
- vettori di espressione conprendenti dette sequenze;
microorganismi ospite trasformati con detti vettori;
metodi per la produzione di tali mutanti mediante coltura in condizioni appropriate dei microorganismi ospite trasformati;
uso dei mutanti di IL-1ra per inibire le attività biologiche di IL-1;
composizioni farmaceutiche conprendenti una quantità terapeuticamente efficace di almeno un mutante di IL-lra, un carrier e/o un solvente farmacologicamente accettabile utili per l'inibizione delle attività di IL-1, soprattutto nelle situazioni in cui IL-1 possa risultare coinvolta nel processo patologico.
Descrizione dettagliata dell'invenzione
La presente invenzione riguarda un preparato utile in carpo terapeutico, consistente in un preparato farmaceutico contenente come principio attivo una proteina ricombinante antagonista di IL-1 capace di inibire in vivo le attività di IL-1. Il preparato è potenzialmente utile per il trattamento di tumori, malattie infiammatorie e autoimmunitarie del polmone e delle vie aeree, SNC, rene, articolazioni, endocardio, pericardio, occhi, orecchie, pelle, tratto gastro-enterico, sistema urogenitale, nello shock settico, riassorbimento osseo e cartilagineo, artrite reumatoide, aterosclerosi e altre patologie di infiairmazione cronica con o senza coinvolgimento autoimmunitario.
La presente invenzione descrive la costruzione di mutanti di IL-1ra con sostituzione di almeno uno dei residui aminoacidici in posizione 91 e/o in posizione 109 con residui diversi, mediante tecniche molecolari di mutagenesi, per l'ottenimento di polipeptidi che contengano la sequenza di IL-1ra modificata in modo da migliorarne la capacità di interazione con IL-1R1 e perciò di aumentarne la capacità antagonista per IL-1. La Tabella 1 riporta la sequenza nucleotidica e aminoacidica di IL-1ra. La Tabella 2 riporta la sequenza aminoacidica di IL-lra con l'indicazione delle mutazioni prescelte.
Secondo la presente invenzione, dopo trasformazione di microorganismi ospite con vettori di espressione contenenti le sequenze codificanti detti mutanti e la coltura di detti organismi, vengano ottenuti e purificati polipeptidi con attività IL-Ira migliorata sostituendo il residuo in posizione 91 e/o il residuo in posizione 109 nella sequenza di IL-lra extracellulare o di altri mentori della famiglia di IL-lra con un qualsiasi altro amminoacido.
Preferibilmente, il residuo in posizione 91 viene sostituito da un residuo di arginina e il residuo in posizione 109 da un residuo di alanina.
Nell 'esenpio 2 viene descritta la preparazione dei mutanti migliorati di IL-lra secondo l'invenzione, indicati per brevità con le
Tali imitanti migliorati possiedono una aumentata capacità di legame al recettore di IL-1 di tipo I (IL-1R1) insieme a un'aumentata capacità di legame al recettore di IL-1 di tipo II (IL-1RII), in modo da consentire un'aumentata efficacia di inibizione anche in quelle situazioni patologiche in cui IL-lra funziona poco per il possibile coinvolgimento funzionale di IL-1RII (neutrofilia, riassorbimento osseo, effetti a livello del SNC, etc.).
Per costruire mutanti migliorati di IL-lra, il cDNA di IL-lra è stato clonato in un vettore appropriato che ne consentisse le opportune manipolazioni genetiche. La sequenza nucleotidica codificante IL-1ra è riportata nella Tabella 1, comprendente la sequenza che codifica per il peptide segnale di 25 aminoacidi. La sequenza aminoacidica di IL- Ira è riportata nelle Tabelle 1 e 2. IL-lra naturale è espresso come una proteina di 177 aminoacidi che, dopo rimozione della sequenza segnale, dà origine alla molecola matura di 152 aminoacidi. Il cDNA di IL-lra viene usato per produrre la proteina IL-lra sfruttando tecniche standard. Il gene può essere inserito in un vettore di espressione e il vettore di espressione può essere usato per trasformare un ospite opportuno. L'ospite trasformato può essere coltivato in condizioni che favoriscano l'espressione del gene di IL-1ra e, di conseguenza, la produzione della proteina IL-lra.
Tali sostituzioni alle posizioni 91 e/o 109 possono essere effettuate per muta genesi sito-specifica utilizzando oligonucleotidi sintetici opportuni . Il gene ricombinante viene poi inserito nel vettore di espressione per produrre il mutante migliorato.
Per i sopra citati impieghi terapeutici le proteine mutate dell'invenzione saranno somministrate sotto forma di composizioni farmaceutiche adatte alla somministrazione parenterale, orale o topica, come descritto ad esempio in "Remingtan's Pharmaceutical Sciences Handbook, Mack, Pub. Co. , NY, USA, XVII ed. I dosaggi medi potranno variare da 2 pg/kg/h a 2 mg/kg/h per l'infusione endovenosa, da 2 pg/kg/giomo a 2 mg/kg/giomo per altre vie di somministrazione.
ESEMPIO la Clonaggio del gene di IL-lra in E. coli
Il cDNA codificante la proteina IL-lra viene per esempio isolato mediante PCR da un pool di cDNA, preparato con metodiche classiche da cellule di origine monocito-macrofagica. Gli oligcnucleotidi utilizzabili per l'anplif inazione selettiva del cDNA codificante IL-1ra sono indicati:
L'oligonucleotide forward è disegnato in modo da inserire il sito di restrizione Ndel inmediatamente a monte del codone codificante il primo aminoacido della forma matura della proteina (R26) . Il sito Ndel permette l'inserimento di una meticnina non naturale che costituirà l aminoacido iniziale delle proteine ricombinanti in oggetto. Analogamente, attraverso l'oligonucleotide reverse si inserisce un sito di restrizione PstI inmediatamente a valle del codone di stop della proteina. Il frammento amplificato viene clonato nei siti Ndel e PstI del vettore di espressione pRSETA, ottenendo il plasmide pRSETA-ILlra. La mappa del pi asmi de pRSETA-IL1ra è mostrata nella Figura 1.
ESEMPIO 1b Clonaggio del gene di IL-lra in B. subtilis
Il cDNA codificante la proteina IL-lra viene per esempio isolato mediante PCR da un pool di cDNA, preparato con metodiche classiche da cellule di origine monocito-macrofagica. Gli oligcnucleotidi utilizzabili per l'amplificazione selettiva del cDNA codificante IL-1ra sono indicati :
L'oligonucleotide forward è stato disegnato in modo da inserire il sito di restrizione EcoRI immediatamente a monte del codone codificante l'aminoacido Metionina (indispensabile per dirigere l'inizio della traduzione del mRNA); seguito dal codone codificante il primo aminoacido della forma matura della proteina (R26).
Analogamente, attraverso l'oligonucleotide reverse si inserisce un sito di restrizione PstI immediatamente a valle del codone di stop della proteina .
Il frammento amplificato viene clonato nei siti EcoRI e PstI del vettore di espressione pSM671, ottenendo il plasmide pSM441. La mappa del plasmide pSM671 è mostrata nella Figura 2.
ESEMPIO 2 Mutazioni del gene di IL-Ira
Per ottenere le mutazioni volute, parte della sequenza codificante per IL-lra (aminoacidi 30-152) viene trasferita mediante d onaggio dal plasmide pSM441 nel plasmide per imitagenesi bluescript SK* tra i siti di restrizione Spel e PstI, ottenendo il plasmide BSK-ILlra. La mutagenesi viene effettuata utilizzando oligonucleotidi sintetici, ottenuti con un sintetizzatore di oligonucleotidi Applied Biosystems 392 e utilizzando la chimica dei fosforamiditi.
Per ottenere la mutagenesi al sito 91 di IL-lra è stato utilizzato il seguente oligonucleotide complementare inverso alla sequenza codificante:
La sequenza 1 può essere modificata sull'anticodone corrispondente all'aminoacido 91 in modo da codificare per qualsiasi altro aminoacido in tale posizione.
Per ottenere il plasmide BSK-MILRA-1 (contenente la mutazione in posizione 91), l'oligonucleotide sintetico viene mescolato al filamento singolo di DNA dal plasmide BSK-IL-1ra in tampone di appaiamento (5 pmol di oligonucleotide con 0,2 pmol di filamento singolo in 10 pi di tanpcne), la miscela viene scaldata a 70°C, poi raffre ddata lentamente a 30<e>C in 40 min e infine posta in ghiaccio. Si aggiungono alla miscela 1 μi di tampone di sintesi, 1 pi (3 unità) di T4 DNA ligasi e 1 pi (0,5 unità) di T7 DNA polimerasi. Dopo incubazione per 1 ora a 37°C, la miscela viene usata per trasformare le cellule competenti. L'identificazione dei cloni positivi viene effettuata mediante sequenziamento del DNA.
Analogamente, per ottenere il plasmide BSK-MILRA-2, contenente la mutazione T109->A, si sintetizza il seguente oligonucleotide:
Alternativamente possono essere usati oligonucleotidi opportuni che codifichino per qualsiasi altro aminoacido in posizione 109. Si procede poi certe per la mutazione N91->R.
ESEMPIO 3 Inserzione dei geni modificati di IL-lra in vettori di espre ssione
La sequenza mutata nei plasmidi BSK-MILRA-1 o BSK-MILRA-2 (mutazione in posizione 91 o 109) viene tagliata con Spel e PstI e clonata direttamente nel plasmide di espressione pRSETA-ILlra, fra gli stessi siti di restrizione, ottenendo i piasmidi di espressione pT7MILRA-1 e pT7MILRA-2. Il clonaggio nel vettore di espressione pSM441 delle sequenze mutate è stato effettuato in maniera analoga, ottenendo i piasmidi di espressione pSM539 e pSM540. La sequenza del doppio mutante N91->R e T109->A viene ottenuta clonando fra i siti Spel e PstI del vettore pRSETA-ILlra o del vettore pSM441, i frammenti Spel-Haell del clone BSK-MILRA-1 (aminoacidi 30-96) e Haell-PstI del clone BSK-MILRA-2 (aminoacidi 97-152), ottenendo rispettivamente il clone pT7MILRA-3 e pSMILRA3.
ESEMPIO 4 Espressione dei geni modificati di IL-Ira
I plasmidi di espressione pT7MILRA-l, pT7MILRA-2 e pT7MILRA-3 vengono indipendentemente trasferiti in cellule del ceppo di E.coli HL21 (DE3), che possiedono il gene per la T7 RNA polimerasi e che seno quindi in grado di trascrivere sequenze codificanti a valle del piasmide T7. Le cellule vengono cresciute in terreno LB contenente 100 mg/1 di anpicillina fino a raggiungere la OD590nm di 0,7. L'espressione viene a questo punto indotta con 0,4 mM IPTG per 3-4 ore. Le cellule contenenti la proteina espre ssa vengono raccolte per centrifugazione e congelate a -80 °C fino al momento della purificazione.
I plasmidi di espressione pSM539, pSM540 e pSMILRA3 vengono indipendentemente trasferiti in cellule del ceppo SMS118 di B. subtilis. Le cellule vengono cresciute in terreno LB contenente 5 mg/1 di cloramfenicolo per 16 ore a 30-37°C. Le cellule contenenti la proteina espressa vengono raccolte per centrifugazione e congelate a -80<°>C fino al momento della purificazione.
ESEMPIO 5 Purificazione delle proteine modificate espre sse Per l'ottenimento in forma essenzialmente pura delle proteine mutanti di IL-lra con attività migliorata, si procede all'estrazione dai batteri e alla purificazione dall’omogenato, per esempio secondo le procedure indicate qui di seguito.
1. Estrazione: I batteri vengono scongelati, risospesi 1:3 (peso umido:volume) in 25 mM MES pH 6,25, 1 mM EDTA (tanpone A) e scnicati in ghiaccio fondente per 5 min (E.coli) o 15 min (B.subtilis) alla potenza di 60-70 Watt a intervalli di 30 sec. L'omogenato viene centrifugato a 30.000 x g a 4<e>C (o sottoposto ad altro procedimento idoneo, es. filtrazione tangenziale). Aliquote di supernatante e di sedimento vengono analizzate in SDS-PAGE. Alternativamente, l'estrazione dai batteri può essere effettuata con altro metodo adeguato. Aliquote del supernatante e del sedimento vengono analizzate in SDS-PAGE.
2. Q-Sepharose FF: Il supernatante viene aggiustato a pH 6,0-6,5 e a una conducibilità di 3-5 mS/cm e incubato in batch, per 3 ore a 4<°>C in agitazione, con 1 ml/g cellule (peso umido) di Q-Sepharose Fast Flcw (o altra fase stazionaria a scambio ionico adeguata) equilibrato in tampone A. In alternativa, il trattamento può essere eseguito in colonna, con eluizione isocratica in tanpone A. Il non adsorbito viene poi raccolto filtrando su setto poroso. Il gel viene lavato per 20 min come sopra in 2 volumi di tanpone A; il lavaggio viene raccolto come sopra. Aliquote del non adsorbito e del lavaggio vengano analizzate in SDS-PAGE. La proteina mutante di IL-lra si trova nel non adsorbito e nel lavaggio.
Il punto 2 può essere posposto e eseguito su colonna con eluizione isocratica in tampone A al posto della gel filtrazione di cui al punto 5.
3. S-Sepharose FF: Il non adsorbito e il lavaggio del Q-Sepharose FF vengono riuniti, filtrati su 0,45 μm e caricati su colonna di S— Sepharose Fast Flow (o altra fase stazionaria a scambio ionico adeguata) equilibrata in tampone A. Si raccoglie il non adsorbito e si fa passare tanpcne A finché la linea di base (A 280 non scende a zero. Si applica quindi un gradiente lineare da 0,05 a 0,5 M NaCl in tanpcne A in 2 volumi di colonna, raccogliendo le frazioni. In alternativa, il gradiente lineare può essere sostituito da un gradiente a scalino, con intervalli di 0,1 M NaCl. Aliquote del non adsorbito, delle frazioni eluite in gradiente e del picco eluito vengono analizzate in SDS-PAGE. La proteina mutante di IL-1ra si trova nelle frazioni centrali del primo piaco eluito fra 0,2 e 0,4 M NaCl. I passaggi su Q-Sepharose FF e su S-Sepharose FF, di cui ai punti 2 e 3, possono essere invertiti.
4. Filtrazione: Il picco eluito di IL-lra viene concentrato e dializzato su filtri Millipore Centriprep 10, fino ad abbassare la concentrazione di NaCl al di sotto di 50 mM; contaminanti di alto peso molecolare vengono rimossi per filtrazione su filtri da centrifuga Millipore Centricori 100. Aliquote dei vari passaggi vengono analizzate in SDS-PAGE. A seconda dei volumi da trattare, le operazioni descritte possono essere eseguite con sistemi diversi, utilizzando lo stesso tipo di membrane.
5. Bio Gel P10: Contaminanti eventualmente presenti, sia di maggiore che di minore peso molecolare, vengono rimossi mediante gel filtrazione su colonna di Bio Gel PIO della Bio-Rad (o altra fase stazionaria per gel filtrazione equivalente) equilibrata e eluita in tanpone A. Aliquote delle frazioni eluite vengono analizzate in SDS-PAGE. La proteina mutante di IL-lra si trova nelle frazioni centrali del primo picco eluito dopo il picco del w lume escluso, in forma essenzialmente pura. ESEMPIO 6 Caratterizzazione dell'attività inibitoria con il saggio di legame a IL-1RI e IL-1RII
L'attività inibitoria dei mutanti migliorati di IL-1ra viene misurata in saggi di binding recettoriale, usando IL-1ra come standard di riferimento. Cellule che esprimono selettivamente IL-1RI (es. il clone di timone murino EL4-6.1) e cellule che esprimono selettivamente IL-IRJJ (es. il clone 1H7 del linfoma di Burkitt umano RAJT) vengono scelte oome cellule bersaglio. Il numero di recettori per cellula e l'affinità di legame (Kd) in entrambe le linee vengono calcolati da curve di saturazione ottenute incubando le cellule (10® cellule/provetta in un volume di 0,1 mi finale di terreno con NaN2) con dosi crescenti di IL-lfl radiomarcata con <125>I in presenza o assenza di un eccesso molare di 500 volte di IL-1β non marcata (per calcolare il legame non specifico, in genere sempre inferiore al 5-10%) per i tempi e alle temperature ottimali per raggiungere l'equilibrio (in genere 2 ore a temperatura ambiente) (Scapigliati et al. FEBS Lett. 243: 394,1989). Per calcolare l'attività di inibizione, l'esperimento viene condotto incubando le cellule con una concentrazione di IL-lfl radiomarcata corrispondente circa alla metà della Kd in assenza o in presenza di dosi scalari di IL-1ra (standard di riferimento) o di mutante migliorato.
L'attività inibitoria migliorata dei mutanti viene determinata calcolando lo spostamento della curva di inibizione verso le dosi più basse rispetto alla curva di IL-1ra. Un esempio dei risultati ottenuti (per MILRA-1) è riportato nella Tabella 3.
ESEMPIO 7 Caratterizzazicne dell'attività antagonista con saggi in vitro di inibizione di IL--1β
Per valutare l'attività antagonista dei mutanti migliorati di IL-lra, si usano saggi biologici in vitro di attività di IL-1. Due di tali saggi sono qui di seguito descritti.
1. Proliferazione di timociti murini: timociti normali vengono ottenuti per dissociazione da timi di topi C3H/HeJ (resistenti a endotossina batterica) di 4-8 settimane di età. I timociti (5x10<5 >cellule/pozzetto di piastre Cluster<96>) vengono incubati per 72 ore in terreno RPMI-1640 addizionato di antibiotici, L-glutamina, 2-ME, HEPES e 5% siero fetale bovino a 37<°>C in aria con 5% CO2. L'incubazione avviene in presenza di una dose subottimale del mitogeno PHA (1,5 μg/ml, che non induce proliferazione significativa dei timociti) e concentrazioni scalari di IL-18. Per determinare la proliferazione dei timociti indotta da IL-1, al termine delle 72 ore di incubazione a ogni pozzetto vengono aggiunti 25 μΐ di terre no contenente 0,5 μCi di timidina triziata. Dopo altre 18 ore, le cellule di ogni pozzetto vengono raccolte su dischetti di fibra di vetro e la radioattività incorporata (proporzionale alla proliferazione delle cellule) viene misurata con un β-counter. Per determinare la capacità inibitoria dei mutanti migliorati di IL-1ra, la proliferazione dei timociti viene misurata in risposta alla dose minima di IL-1 che induca proliferazione ottimale (in genere intorno a 0,3 μg/ml) in assenza o in presenza di dosi scalari di IL-1ra (standard di controllo) o dei mutanti migliorati. L'attività inibitoria migliorata dei mutanti viene determinata calcolando lo spostamento della curva di inibizione verso le dosi più basse rispetto alla curva di IL-lra. Un esempio dei risultati ottenuti (per MILRA-1) è riportato nella Tabella 3.
2. Induzione di IL-6: cellule della linea continua di osteosarcoma umano MG-63 vengono incubate (5x10<4 >cellule/pozzetto di Cluster<96>) per 48 ore in terreno RPMI-1640 con antibiotici, L-glutamina, HEPES e 5% siero fetale bovino in assenza o in presenza di dosi scalari di IL-1β.
La quantità di IL-6 nei supernatanti di coltura viene misurata con un saggio ELISA commerciale o titolata nel saggio biologico di proliferazione delle cellule 7TD1. Per valutare la capacità antagonista dei mutanti migliorati di IL-lra, la produzione di IL-6 viene misurata in cellule MG-63 stimolate con la dose minima di IL-1 capace di induzione ottimale di IL-6 (intorno a 0,3 ng/ml) in assenza o in presenza di dosi scalari di IL-lra (standard di controllo) o dei mutanti migliorati di IL-lra. L'attività inibitoria migliorata dei mutanti viene determinata calcolando lo spostamento della curva di inibizione verso le dosi più basse rispetto alla curva di IL-lra.
Un esempio dei risultati ottenuti (per MILRA-1) è riportato nella Tabella 3.
ESEMPIO 8 Caratterizzazione dell'attività antagonista con saggi in vivo di inibizione di IL-1B
Per valutare l'attività inibitoria dei mutanti migliorati di ILIra, si usano saggi biologici in vivo di attività di IL-1. Due di tali saggi sono qui di seguito descritti.
1. Induzione di ipoglicemia: topi C3H/HeJ o di altro ceppo (3-5 topi/gruppo sperimentale) ricevono dosi scalari di IL-1β per somministrazione intraperitcneale. Dopo due ore gli animali vengono sacrificati e il sangue viene raccolto per la preparazione del siero. Il contenuto di glucosio sierico viene determinato dopo reazione con glucosioossidasi con un saggio colorimetrico commerciale. Per valutare la capacità antagonista dei mutanti migliorati di IL- 1ra, l'induzione di ipoglicemia in vivo viene effettuata somninistrando la dose minima di IL-lB in grado di indurre l'effetto ottimale (in genere intorno a 5 pg/kg) in assenza o in presenza di dosi scalari di IL-1ra (standard di controllo) o dei mutanti migliorati di IL-lra.
L'attività inibitoria migliorata dei mutanti viene determinata calcolando lo spostamento della curva di inibizione verso le dosi più basse rispetto alla curva di IL-lra. Un esenpio dei risultati ottenuti (per MILRA-1) è riportato nella Tabella 3.
2. Induzione di neutrofilia: topi C3H/HeJ o di altro ceppo (3 topi/gruppo sprerimentale) ricevono dosi scalari di IL-1β con una singola somministrazione intraperitcneale. L'aumento di neutrofili circolanti indotto da IL-1 viene valutato in citofluorimetria dopo quattro ore dal trattamento. La capacità antagonista dei mutanti migliorati di IL-1ra viene valutata come inibizione della neutrofilia indotta dalla dose minima di IL-1 necessaria per ottenere l'amento ottimale di neutrofili circolanti (in genere intorno a 150 ng/kg). IL-lra (standard di controllo) e i mutanti migliorati vengono somministrati intraperitonealmente in tre volte, ai tempi -15 min, 0, 15 min, rispetto a IL-1β. L'attività inibitoria migliorata dei mutanti viene determinata calcolando lo spostamento della curva di inibizione verso le dosi più basse rispetto alla curva di IL- 1ra.
Un esempio dei risultati ottenuti (per MILRA-1) è riportato nella Tabella 3
Claims (13)
- RIVENDICAZIONI 1. Mutanti di IL-1ra in cui almeno uno dei residui aminoacidici in posizione 91 e 109 della sequenza di IL-1ra wt è sostituito con un residuo differente.
- 2. Mutante di IL-1ra secondo la rivendicazione 1, in cui il residuo aminoacidico in posizione 91 della sequenza di IL-1ra wt è sostituito con un residuo differente, preferibilmente arginina.
- 3. Mutante di IL-1ra secondo la rivendicazione 1, in cui il residuo aminoacidico in posizione 109 della sequenza di IL-1ra wt è sostituito con un residuo differente, preferibilmente alanina.
- 4. Mutante di IL-1ra secondo una delle rivendicazioni 1-3, in cui entrambi i residui aminoacidici in posizione 91 e 109 della sequenza di IL-lra wt siano sostituiti con residui differenti.
- 5. Mutanti di IL-1ra secondo una delle rivendicazioni 1-4, in cui la sequenza di IL-1ra appartenga a IL-1ra extracellulare o a altri membri della famiglia di IL-1ra.
- 6. Sequenze di DNA codificanti per i mutanti di IL-lra delle rivendicazioni 1-5.
- 7. Sequenze di DNA codificanti per i mutanti di IL-lra secondo la rivendicazione 6, comprendenti anche elementi regolatori che ne permettano l'inserimento in vettori di espressione.
- 8. Vettori di espressione contenenti una sequenza nucleotidica delle rivendicazioni 6 o 7.
- 9. Cellule ospiti trasformate con i vettori di espressione di cui alla rivendicazione 8.
- 10. Metodo per la produzione in forma essenzialmente pura delle proteine mutanti di IL-1ra delle rivendicazioni 1-5 che comprende la coltura delle cellule ospite della rivendicazione 9 e il recupero del prodotto di espressione dalle cellule o dal terreno di coltura.
- 11. Composizioni farmaceutiche delle rivendicazioni 1-6, contenenti come principio attivo un mutante di IL-1ra in miscela con un veicolo opportuno.
- 12. Uso dei mutanti di IL-1ra delle rivendicazioni 1-6 per la preparazione di un medicamento capace di antagonizzare in organismi viventi, incluso l'uomo, gli effetti infiamnatori, neurologici, endocrinologici, ematologici, metabolici, catabolici e immunostimolanti causati direttanente da IL-1 o causati da agenti/patologie in cui IL-1 prodotta endogenamente è coinvolta nella patologia.
- 13. Uso dei mutanti di IL-lra delle rivendicazioni 1-6 per la preparazione di un medicamento utile per il trattamento di patologie infiammatorie acute e croniche , patologie di disregolazione del sistema immunitario , quali tumori solidi e leucemie, artrite reumatoide e artralgie, malattie autoimmunitarie, iperreattività e allergie, rigetto di trapianti, malattie infianmatorie acute e croniche e autoimmunitarie del polmone e delle vie aeree, del SNC, del rene e del sistema urogenitale, della pelle, del tratto gastro-enterico, delle articolazioni, dell'occhio, dell'orecchio, del pericardio e dell'endocardio, shock endotossico e shock settico da Gram-negativi e da Gram-positivi, infezioni, riassorbimento osseo e cartilagineo, osteoporosi, aterosclerosi e altre·patologie di infiammazione cronica con o senza coinvolgimento autoimmunitario.
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