JPS62501608A - 生物学的に活性なヒト腫瘍壊死因子蛋白質のシステイン除去ミュ−テイン - Google Patents

生物学的に活性なヒト腫瘍壊死因子蛋白質のシステイン除去ミュ−テイン

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JPS62501608A
JPS62501608A JP61501189A JP50118986A JPS62501608A JP S62501608 A JPS62501608 A JP S62501608A JP 61501189 A JP61501189 A JP 61501189A JP 50118986 A JP50118986 A JP 50118986A JP S62501608 A JPS62501608 A JP S62501608A
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JP61501189A
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マーク，デービツド　エフ
リン，レオ　エス
ル，シーダ　ユ
ウオング，アリス　エム
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シタス　コ−ポレイシヨン
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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ３９、ヒト組換５ｅｒｂ９腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）ミューティン。
４０、ヒト組換Ｓｅｒ　ｌｏ　ｒ腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）ミューティン。
４１、ヒト組換ｓｅｔ、、ｇ　５ｅｒｌＯ，腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）ミューティ ン。
４２、癌疾患について患者を治療する方法であって、該患者に癌抑制量の請求の 範囲第１項、第３９項、第４０項又は第４１項に記載のミューティンを投与する ことを含んで成る方法。
４３、請求の範囲第１項、第３９項、第４０項、又は第４１項に記載のミューテ ィンの有効量、及び少なくとも１種類の抗癌化合物又は抗ウィルス化合物を含ん で成る療法製剤。
４４、前記抗癌化合物又は抗ウィルス化合物がγ−インターフェロンである、請 求の範囲第４３項に記載の製剤。
明　細　書 生物学的に活性なヒト腫瘍壊死因子 蛋白質のシスティン除去ミューティン この発明は組換ＤＮＡ技法の一般的分野に属する。さらに詳しくは、これはシス ティン残基の１又は複数の置換／欠失により、それらの親類細体と異る変異的に 変えられた生物学的に活性な腫瘍壊死因子蛋白質に関する。この出願は１９８４ 年５月３０日に公開されたＥＰ　１０９，７４８に関連する。
葺址攻聞 ヒト腫瘍壊死因子（ｈＴＮＦ）は長年の間、バシルス・カルメソチーグアリン（ ｂａｃｉｌｌｕｓ　Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ　；　ＢＣＧ）で感染され た、エンドトキシンで処理されたマウスの血清中に見出される抗腫瘍物質として 知られている。ＴＮＦはまずＣａｒｓｗｅｌｌ等、Ｔ’ｒｏｃ、Ｎａｔ’　１． Ａｃ　ｄ、Ｓｃｉ、　（ＬＩＳＡ）　（１９７５）７２：３６６６により報告さ れ、そして新生物細胞に対して選択的に細胞変性的であることが示された。ＴＮ Ｆは細胞培養物から、Ｍａｔｔｈｅｗｓ等、Ｂｒ１ｔ、　Ｊ、Ｃａｎｃｅｒ（１ ９８１）４４：４１８により（ＢＣＧ注射されたラビットに由来する単核貧食細 胞から）、及びＭａｎｎｅｌ等、Ｉｎｆｅｃｔ、　Ｉｍｍｕｎ、（１９８０）３ ０：５２３、前掲（１９８１）３３：１５６により、ＢＣＧで感染されたマウス からのマクロファージ濃縮末梢滲出細胞の培養物から精製された。１９８５年１ 月２３日に公開されたＯｌｄ等のＥＰ　１３１．７８９において、寄託番号Ｌ９ ２９のもとにアメリカン・タイプ・カルチュアー・コレクション（＾ＴＣＣ）に 寄託されているクローン化マウス細胞由来のＴＮＦ感受性Ｌ−Ｍそしてこれらを 用いて組換ｈＴＮＦが生産されることが報告８０６　；　Ｗａｎｇ＋八１Ｍ、等 （１９８５）　５ｃｉｅｎｃｅ　２２８．１４９　１５４；及びＹａｍａｄａ、 Ｍ、等（１９８５）Ｊ、Ｂｉａｔｅｃｈｎｏｌｏ　、３．１４１　１５３を参照 のこと。類似の開示が特許文献、例えば１９８５年９月２９日に公開されたＥＰ 　１５５，５４９　；　１９８５年１０月１６日に公開されたＥＰ　１５Ｂ。
２８６；及び１９８６年１月１５日に公開されたＥＰ　１６８，２１４に存在す る。
これらの開示から、ｈＴＮＦは２個のシスティン残基を含有する蛋白質である。
ｈＴＮＦが１５７個のアミノ酸を有する（Ｐｅｎｎｉｃａ、Ｄ、等、及びＷａｎ ｇ＋八、？１１等、前掲を参照のこと）と仮定して、システィン残基は位置６９ 及び１０１に存在する。
５ｈｉｒａｉ等及びＹａｍａｄａ、Ｍ、等、前掲は１５５個のアミノ酸を有する り、　Ｔ　Ｎ　Ｆのクローニングを報告しており、すなわちこの場合、最近の２ 個のアミノ酸Ｖａ１．Ａｒｇ、が欠けている。この発明の目的のため、１５７個 のアミノ酸を有するｈＴＮＦに言及されよう。ここで使用する場合、ｈＴＮＦ″ 、”ｈＴＮＦのシスティン除去ミューティン”及び″ｈＴＮＦミューティン”は 、ヒ１−ＴＮＦ　ＤＮＡ配列により、又は（ａ）成熟天然ヒト腫瘍壊死因子のア ミノ酸配列に少なくとも実質的に同一なアミノ酸配列及び（ｂ）天然ヒ）ＴＮＦ に共通な生物学的活性を有する蛋白質をコードするヒ）ＴＮＦ　ＤＮＡ配列の変 形体により形質転換されている微生物により生産される蛋白質を意味する。アミ ノ酸配列の実質的同一とは、配列が同一であるか、又は合成蛋白質と天然ヒ）Ｔ ＮＦとの間の不都合な機能的差異を惹起しない１又は複数のアミノ酸の変更（欠 失、付加、又は置換）により異ることを意味する。特定の例は、ｈＴＮＦのＮ− 末端の欠失を包含し、この場合最初の１〜１１アミノ酸の１又は複数個が欠失し ており、−４，−７及び−８が最も好ましい。さらに、位置３５−６６’、１１ ０−１３３゜１５０−１５７　、又は６７−１０９のアミノ酸残基が他のアミノ 酸により置換されているか、又は除去されているｈＴＮＦ蛋白質が包含される（ ＥＰ　１６８，２１４を参照のこと）。
組換ＤＮＡ　（ｒＤＮＡ）技法を介して微生物的に生産されるヒト腫瘍壊死因子 のごとき多くの生物学的に活性な蛋白質は、それらの活性のためには必須ではな いがしかし不所望の分子間連結のために開放されているシスティン残基を含有す る。１つのこのような蛋白質は微生物的に生産されたヒト腫瘍壊死因子である。
ｈＴＮＦの調製文はｒＤＮＡ技法の過程で、ｈＴＮＦＯ高濃縮物を含有するＥ、 コリ（Ｅ、ｃｏｌｉ）抽出物中に微生物的に生産されたｈＴＮＦのダイマー及び オリゴマーが形成されることが観察された。このマルチマーの形成はｈＴＮＦの 精製及び分離と労力を要するそして時間のかかるものとしており、そして精製及 び単離手順中の追加の段階、例えば精製中の蛋白質の還元を必要とする。
この発明は、変異的に変形された生物学的に活性な腫瘍壊死因子蛋白質〔このよ うな蛋白質は“ミューティン”（ｍｕｔｅｉｎ）と称される、Ｇｌｏｓｓａｒ　 ｏｆ　Ｇｅｎｅｆｉｃｓ　ａｎｄ　Ｃｔｏ　ｅｎｅｔｉｃｓ　＋第４版、３８１ 頁、スプリンガーーフエルラーク（１９７６）　］であってそれらの親頚似体の 活性を維持しているがしかし分子間連結又は不所望の分子内ジスルフィド結合を 形成する能力を喪失しているものを、指令された変異誘発技法により製造するこ とに向けられる。さらに、１９８４年５月３０日に公開されたＥＰ　１０９，７ ４．８を参照のこと。
指令された変異誘発技法はよく知られており、そしてＬａｔｈｅｒ、Ｒ，Ｆ、及 びＬｅｃｏｑ、Ｊ、Ｐ、、　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｅｎｉｎｅｅｒｉｎアカデミツク プレス（１９８３）　３１−５０頁に総説されている。オリゴヌクレ（１９８１ ）ユニ１−３２に総説されている。
光凱■皿丞 この発明の１つの観点は、生物学的に活性なｈＴＮＦ蛋白質の合成ミューティン であり、このミューティンにおいてはその２個のシスティン残基の内掛なくとも １個が除去されているか、又は他のアミノ酸により置き換えられている。
この発明の他の観点は、上記の合成ｈＴＮＦミューティンをコードするように特 別に設計されたＤＮＡ配列を有する合成構造遺伝子（デサイナー遺伝子）に関す る。この発明の下位の観点は、このような構造デザイナ−遺伝子を含有する発現 ベクター、このようなベクターにより形質転換された宿主細胞又は生物、及びこ のような形質転換体又はその子孫を培養しそしてその培養物から前記ミューティ ンを回収することによる合成ミューティンの製造方法である。療法的用途を有す るＩｉ　Ｔ　Ｎ　Ｆミューティンの場合、療法的有効量のミュ−ティンを含有す る療法剤組成物、及び療法的方法がこの発明の他の観点である。
この発明の他の観点は、次の段階を含むオリゴヌクレオチド指令変異誘発による 上記の合成構造遺伝子の製造方法である： （ａ）紐帯白質をコードする構造遺伝子の鎖を含んで成る単鎖ＤＮＡを、事情に より除去もしくは置換されるべきシスティンのコドンか、又は該コドンと対合す るアンチセンストリブトノットかを含有する前記類の領域に相補的であるが、但 し該コドンの欠失又は前記他のアミノ酸をコードするトリプレットを定義するコ ドン又はアンチセンストリプレットがミスマツチである変異オリゴヌクレオチド プライマーとハイブリダイズせしめ； （ｂ）前記プライマーをＤＮＡポリメラーゼを用いて延長して変異へテロデュプ レックスを形成し；そして（ｃ）該変異へテロデュプレックスを複製せしめる。
この方法において使用される変異オリゴヌクレオチドプライマーがこの発明の他 の観点である。
図面の簡単な説明 第１図はｐＥ４の完全ヌクレオチド配列、及び推定されるアミノ酸配列を示す。
第２図はｐＥ４挿入部の制限地図を示す。
第３ａ図及び第３ｂ図はｐＡＷ７３１中の成熟ＴＮＦ蛋白質をコードする挿入部 の完全ヌクレオチド配列、及び推定されるアミノ酸配列をそれぞれ示す。
第４図はクローンｐＡＷ７１１及びｐＡＷ７３１の抽出物中の５ｅｒ６９ＴＮＦ に対応する単一１７，０００ダルトン蛋白質バンドを示す。
光泗略３」ルり糊φｏ　ｔｔ＋ この発明は、生物学的活性のために必須でないことが見出されているシスティン 残基が分子間架橋のための部位を除去するために意図的に除去されているか又は 他のアミノ酸により置き換えられている、生物学的に活性なｈＴＮＦ蛋白質のミ ューティン；該ミューティンのための変異体遺伝子；及び該ミューティンの製造 方法を提供する。
この発明に従って変異的に変形された蛋白質は、生物学的に活性な蛋白質のシス ティン含量、並びに活性及び三次構造に関して該システィン残基により演じられ る役割に関する入手可能な情報から同定され得る。このような情報が文献におい て入手できない蛋白質については、ここに記載する方法により蛋白質のシスティ ン残基のそれぞれを組織的に変えそして生じたミューティンの生物学的活性、及 び不所望の分子間ジスルフィド結合を形成するそれらの傾向を調べることにより 、この情報を決定することができる。従って、この発明はヒト腫瘍壊死因子のミ ューティンに関して具体的に記載しそして例示するが、下記の方法は、機能的に 必須でないアミノ酸残基を含有する、すなわち蛋白質への他の変形を含有する任 意の他の生物学的に活性なｈＴＮＦ蛋白質に適用されることが期待されるであろ う。
システィン残基が、除去されるか、又は生ずるｈ　Ｔ　Ｎ　Ｆ’ミューティンの 生物学的活性に影響を与えないアミノ酸により置き換えられる。適切なアミノ酸 残基がセリン、スレオニン、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイ シン、ヒスチジン、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン及びメチオニ ンから成る群から選択される。この群の内、セリン、スレオニン、アラニン、及 びバリンが好ましい。セリン又はアラニン残基による置換が特に好ましい。
上記のごとく、成熟ヒトＴＮＦは、１個が位置６９にありそして他方が位置１０ １にある２個のシスティン残基を含有する１５７アミノ酸から成る蛋白質である 。ヒト前骨髄細胞白血病セルライン（ＨＬ−６０，八ＴＣＣ＃　ＣＣＬ２４０） により生産されるＴＮＦをコードする配列がクローン化され、そしてＥ、コリ中 で発現され、そして第１図に示す配列を有することが示された。。さらに、Ｗａ ｎｇ、Ａ、Ｗ、等、前掲を参照のこと。これを引用によりこの明細古に組み入れ る。
後に示すように、ＴＮＦ配列中のシスティン残基はいずれもジスルフィド結合に 関与しないようであり、そして安定で且つ生物学的に活性なミューティンを得る ためにこの発明の方法に従って置換又は除去され得る。このことは驚くべきこと である。なぜなら、ｈＴＮＦは生物学的活性の維持のために必要であると通常信 じられる２個のシスティン残基を有するのみであるからである。
ｃｙｓ６９のためのコドンを含むｈＴＮＦ遺伝子の領域に相補的であるがこのコ ドン中に１又は複数の塩基変化を含有する合成オリゴヌクレオチドプライマーを 用いるオリゴヌクレオチド指令変異誘発法の使用により、ｃｙｓｂ９が選択され た他の任意のアミノ酸により置き換えられることをもたらすデザイナ−遺伝子を 調製することができる。欠失が望ましい場合、オリゴヌクレオチドプライマーは ｃｙｓｂｑのためのコドンを欠く。ＣｙＳ６．の中性アミノ酸、例えばグリシン 、バリン、アラニン、ロイシン、イソロイシン、チロシン、フェニルアラニン、 ヒスチジン、トリプトファン、セリン、スレオニン及びメチオニンへの転換が好 ましい方法である。セリン、スレオニン及びアラニンが最も好ましい置換であり 、これは、これらがシスティンに化学的に類似するからである。システィンが除 去される場合、成熟ミューティンは天然親蛋白質又は微生物的に生産されたｈＴ ＮＦよりもアミノ酸１個だけ短かい。
オリゴヌクレオチドプライマーのサイズは、変異が誘導されるべき遺伝子の領域 へのプライマーの安定なハイブリダイゼーションのための要求により、及びオリ ゴヌクレオチドを合成するために現在利用可能な方法の限界により決定される。
オリゴヌクレオチド指令変異誘発において使用するためのオリゴヌクレオチドを 設計する場合に考慮されるべき因子（例えば、全体のサイズ、変異部位を挟む部 分のサイズ）はＳｍ１ｔｈ等、前掲、に記載されている。一般に、オリゴヌクレ オチドの全体の長さは、変異部位における安定でユニークなハイブリダイゼーシ ョンを最適にし、変異部位からの５′及び３′延長部がＤＮＡポリメラーゼのエ キソヌクレアーゼ活性による変異の編集（ｅｄｉｔｉｎｇ）を回避するのに十分 なサイズである。
この発明の変異誘発のために使用されるオリゴヌクレオチドは通常、約１２〜約 ２４塩基、好ましくは約１４〜約２０塩基、そしてさらに好ましくは約１５〜約 １８塩基を含有する。
これらは通常、変化したコドン又は失われたコドンの３′に少なくとも約３塩基 を含有する。
変形されたＩＦＮ−β遺伝子を調製するための方法は広く、コドンを欠（か又は それが他のアミノ酸をコードするように変化している合成ヌクレオチドプライマ ーを用いて、ｈＴＮＦ遺伝子中コドン６９（ＴＧＴ）に部位特異的変異誘発を誘 導することを含む。欠失が導入される場合、ＤＮＡ配列のための適切なリーディ ングフレームが目的蛋白質の発現のために維持されなければならないことを認識 しなければならない。
ｈＴＮＦｌ伝子の鎖がクローン化されたＭ１３．ｆｄ、又はφ×１７４のごとき 単鎖ファージにプライマーをハイブリダイズせしめる。ファージは遺伝子のセン ス鎖又はアンチセンス鎖のいずれを担持することもできることが認識されよう。
ファージがアンチセンス鎖を担持する場合、プライマーは、コドンの欠失又は他 のアミノ酸をコードするトリプレットを定義するミスマツチを含むばか変異され るべきコドンを含むセンス鎖の領域、と同一である。ファージがセンス鎖を担持 する場合、プライマニは、除去されるべきコドンと対合するトリプレットにおけ る適切なミスマツチを含むほか変異されるべきコドンを含むセンス鎖の領域に相 補的である。ハイブリダイゼーションにおいて使用される条件はＳｍ１ｔｈ、Ｍ 　＆びＧｌｌａｍ。
Ｓ、、前掲、により記載されている。温度は通常約０℃〜７０“Ｃ１さらに普通 には約１０℃〜５０℃であろう。ハイブリダイゼーションの後、ＤＮＡポリメラ ーゼｌ５Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素又は他の適当なりＮＡポリメラー ゼを用いてプライマーをファージＤＮＡ上に延長する。生ずるｄｓＤＮＡを、Ｔ ４ＤＮＡリガーゼのごときＤＮＡリガーゼで処理することにより閉環状ｄｓＤＮ Ａに転換する。単鎖領域を含有するＤＮＡ分子を８１エンドヌクレアーゼ処理に より破壊することができる。
オリゴヌクレオチド指令変異誘発゛を用いて、ＴＮＦ活性を有するがしかしＣ） ’Ｓ６９が他のアミノ酸に変化しているかもしくは欠失しており、そして／又は Ｃ）’Ｓ＋ｏ＋残基が置き換えられているかもしくは欠失しているミューティン をコードするＴＮＦ遺伝子を得る。ｃｙｓ６ｇから５ｅｒ６９への例示的な転換 のために好ましいオリゴヌクレオチドプライマーは５′−ＣＡＴＧＧＧＴＧＣＴ ＣＧＧＧＣＴＧＣＣＴＴ　−３’である。このオリゴヌクレオチドは、ＴＮＦ遺 伝子のコドン６９に対合するトリプレット中にＴ−Ａ変化を有する。同様にして 、Ｃ）’Ｓｌ。１は、ヒトＴＮＦｃＤＮＡ配列の適切な鎖を含有する５５Ｍ１３ フアージＤＮＡを用いて、コドン１０１　と対合するトリプレットに対応する変 化を含有するプライマーＣＡＡＧＡＧＣＣＣＣＴＣＴＣＡＧＡＧＧＧＡＧにより 、５ｅｒｌＯＩ　に転換され得る。
次に、得られた変異へテロデュプレックスを用いてコンピテント宿主生物又は細 胞を形質転換する。宿主によるヘテロデュプレックスの複製が側鎖からの子孫を もたらす。複製に続き、変異した遺゛伝子を変異類の子孫から単離し、適切な発 現ベクターに挿入し、そして適当な宿主生物又は細胞を形質転換するために使用 する。好ましいベクターはプラスミド適当な宿主生物ばＥ、コリ、シュードモノ ス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、バシルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５ ｕｂｔ’１ｌｌｉｓ）、バシルス・チューリンジエンシス−建立０１Ｂ徂二匹犯 」１１±邦ユｓ）、酵母の色々な株、バシルス・サーモフィルス（Ｂａｃｉｌｌ ｕｓ　ｔｈμｍ」止月Ｊリー、動物細胞、例えばマウス細胞、ラット細胞又はチ ャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、植物細胞、動物及び植物宿主等であ る。選択された宿主がベクターにより形質転換される場合、ミューティンが発現 されるために、適切なプロモーター−オペレーター配列もＷ人されることを認識 しなければならない。宿主は原核性又は真核性である（真核細胞にＤＮＡＱｉ人 する方法は１９８１年９月３日に公開されたＰＯＴ出願猶ｕｓ８１１００２３９ 　、及びＵＳ８１１００２４０に記載されている）。Ｅ。
コリ及びＣＨＯ細胞が好ましい宿主である。この発明に従って得られるミューテ ィンはミューティンにおいて望まれるグリコジル化に依存してグリコジル化され るか又はグリコジル化されない。所望により、Ｅ、コリ又はバシルスが宿主生物 である場合に得られるグリコジル化されていないミューティンを、場合によって はインビトロで化学的修飾、酵素的修飾又は当業界において知られている他のタ イプの修飾によりグリコジル化することができる。
次の例は、この発明の一層よい理解を助けるため、そして例示のみの目的で与え られる。これらは、いかなる態様においてもこの発明の範囲を限定するものと解 してはならない。
例１〜９はＴＮＦミューティンの調製及びそのアッセイを記１．１凡ｌ■誘星 高濃度（≧２Ｘ１０’細胞／ｍβ）の定常状態のＨＬ−６０細胞を遠心し、ＲＰ Ｍ１１６４０培地により血清の不存在下で洗浄し、そして次にｌＸｌＯ７ＸｌＯ ７細胞７変ｌ再懸濁した。次に、細胞を１１００ｎ／ｍβのホルボールエステル １２−〇−テトラデカノリルホルボールー１３−アセテ−）　（ＴＰＡ）により ３７℃にて３０分間、浮遊培養において常に撹拌しながら処理した。培養物を遠 心し、上清をデカントし、そして細胞を、１０μｇ／ｍｊ！の細胞リポポリサン カライド（Ｌ　Ｐ　Ｓ）及び１０μＭＣａイオノホール（Ａ　２３８１７）を含 有するＲＰＭＩ中にｌＸ１０７細胞／ｍｌｌで、３７℃にて４時間常に撹拌しな から再Ｑ、Ｓした。次に、細胞を１２０Ｏｒｐｍにて１０分間回転沈降せしめ、 そして上清を８０００ｒｐｍにて２・０分間再遠心した。
得られた上清を下記の精製スキームにおいて使用して天然ＴＮＦを得た。
２、工ｑ距袈 前項において誘導されたＨＬ−６０から調製された約４〜８ｌの上清をアミコン 中空繊維（１平方フイートのカートリッジ／１０．ＯＯＯＭＷカットオフ）を介 して約３００ｒｒｌに濃縮した。
濃縮された培養流体を遠心して細胞破片を除去し、そして上清を３０ｍＭ炭酸水 素アンモニウム緩衝液（ｐｔ！　８．１２）により６、２　ｍ　Ｓの導電度に調 整した。この溶液をさらに、ＰＭＩＯ（アミコン）膜を用いる限外濾過により濃 縮し、そして濃縮された流体を遠心（２０，０ＯＯＸ　ｇ、１０分間）により透 明にした。
次に、上清を、３０ｍＭ炭酸水素アンモニウム／１ｍＭＮａＣ！！　（ｐＨ８， ２）中で平衡化されたＤＥＡＥイオン交換カラムに適用し、そしてカラムを同じ 緩衝液で洗浄した。両分を集めそして蛋白質を２８０ｎｍにてモニターした。こ れらの非結合画分をＬ−９２９細胞変性アツセイを用いてアッセイし、そしてＴ ＮＦ活性を有する両分をプールし、そして再度限外濾過により濃縮した。
濃縮物を、３０ｍＭ炭酸水素アンモニウム緩衝液（ｐＨ４７，４）中で平衡化し たセファデックスＧ７５スーパーフアイン（ファルマシア）に適用した。同じ緩 衝液で洗浄することにより得られた非結合画分を２８０ｎｍにてモニターし、そ してＴＮＦについてアッセイした。ピークＴＮＦ生物活性を含有する画分を凍結 乾燥した。
凍結乾燥された蛋白質をレムリー（Ｌａｅｍｍｌｉ）　Ｓ　Ｄ　Ｓサンプル緩衝 液中に再懸濁し、そして５ＤＳ−ポリアクリルアミド各細片からの蛋゛白質を、 １ｍｆの３０ｍＭ炭酸水素アンモニウム緩衝液（ｐＨ７，４）中への浸漬及び室 温での一夜の振とうにより溶出した。
ＴＮＦ生物活性を含有する細片を、０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）中で平 衡化した。Ｖｙｄａｅ　Ｃ−４逆相ＨＰＬＣカラム上に適用し、そして０．１％ ＴＦＡ中０％−６０％アセトニトリルの直線グラジェントを用いて活性を溶出し た。蛋白質を２８０ｎｍ及び２１４ｎｍにてモニターし、そして両分を凍結乾燥 後にバイオアッセイし、そして３０ｍＭ炭酸水素アンモニウム緩衝液（ｐＨ７， ４）中に懸濁した。ＴＮＦ活性を含有する両分を再び凍結乾燥した。
得られた蛋白質は、配列分析において有用であるのに十分な純度のものであった 。配列を気相配列決定機（アプライド。
バイオシステムス社）を用いて決定した。最初の２２アミノ酸から得られた配列 を次に示す。
Ｖａｌ−Ａｒｇ−５ｅｒ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−５ｅｒ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ− Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｖａｌ−５ｅｒ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ− （Ｇｌｎ）−（Ａｌａ）−Ｇｌｕ−Ｇｌｙさらに、精製された蛋白質（Ｇ−７５ ゲルから）を、基質として代りのヒト腫瘍又は正常セルラインを用いてＬ−９２ ９細胞変性アツセイの変法により試験した。このアッセイにおいてＬ−９２９細 胞に対して細胞変性的であったＧ−７５画分はＨｓ　９３９　Ｔ　（黒色腫系） 　、ＢＴ−２０（乳癌）　、Ａ４２７（肺癌）、ＨＴ　−１０８０（結腸癌）及 びＨＴ−２９（結腸癌）に対しても細胞変性的であった。これらの百分はＨｓ９ ３９ｓＫ（皮膚線維芽細胞）　、ｌ１ｅｌａ細胞（頚部癌）　、Ｈｓ　２７Ｆ　 （包皮線維芽細胞）して細胞変性的でなかった。
■−Ｌ ユニ上薙■且製 ヒトＴＮＦをコードするイントロン不含有ＤＮＡ配列をここに記載する方法によ り調製した。誘導された場合に量のＴＮＦを生産するヒト前骨髄細胞白血病セル ライン、ＡＴＣＣから階ＣＣＬ２４０として得られるＨＬ−６０系を、ｃＤＮＡ ライブラリーを得るためのｍＲＮＡ源として使用した。これらの細胞から精製さ れたＴＮＦから決定された蛋白質配列に基いて造成されたオリゴマープローブを 用いて、このｃＤＮＡライブラリーをプローブして蛋白質のための完全なコード 配列を同次のようにして、ＨＬ−６０細胞か′ら全メンセンジャーＲＮＡを抽出 し、そして精製した。Ｄ、１．ａに記載したようにして、ＨＬ−６０細胞をＴＮ Ｆ生産のためにインキュベートし、そして４時間細胞懸濁液を遠心により収得し た。全細胞リボ核酸（ＲＮＡ）を次のようにして単離した。すべての段階は４℃ にて行う。細胞を２回ＰＢＳ　（リン酸緩衝化塩溶液）中で洗浄し、そして１０ ｍＭバナジルアデノシン複合体（Ｂｅｒｇｅｒ、　Ｓ、Ｌ、等、Ｂｉｏｃｈｅｍ 、　（１９７９）１８　：　５１４３）を含有するＩ　ＨＢ（１４０ｍＭ　Ｎａ Ｃ１、１０ｍＭ　Ｔｒｉ、ｓ　、１．５　ｍ　Ｍ　ＭｇＣｌ　ｔ。
ｐＨ８）中に再懸濁した。
エチレンオキシドポリマータイプの非イオン性洗剤を０．３％になるように加え て植設ではなく細胞膜を溶解した。１　、０ＯＯＸｇにて１０分間遠心分離する ことにより核を除去した。核後の上清をＴＥ　（１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ　＋　１ｍ Ｍｘチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）　、　ｐＨ７，５）で飽和したフェノー ル／クロロホルム（１：１）（０，５％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）及び １０　ｍＭ　ＥＤＴＡを含有する〕等容量に加えた。上清を４回再抽出しそして ２０００Ｘｇにて１０分間遠心して相分離した。
サンプルを０．２５Ｍ　ＮａＣ１に調製し、２容量の１００％エタノールを添加 し、そして−２０℃に貯蔵することによりＲＮＡを沈澱せしめた。ＲＮＡを５， ０００　Ｘ　ｇにて３００分間ベレットし、７０％及び１００％のエタノールで 洗浄し、そして乾燥した。ポリアデニル化（ポリＡ”）メツセンジャーＲＮＡ（ ｍＲＮＡ）を全細胞質ＲＮＡからオリゴｄＴセルロース上でのクロマトグラフィ ーにより得た［Ａｖｔｖ＋　Ｊ、等、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ。
八ｃａｄ、Ｓｃｉ、（１９７２）　６９　：　１４０８　１４１２）　、すなわ ち、ＲＮＡをＥＴＳ　（１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ　、１ｍＭ　ＥＤＴＡ　、　Ｏ１５ ％ＳＤＳ、ｐＨ７，５）に’１ｍｇ／ｍｅの濃度で溶解した。この溶液を６５℃ にて５分間加熱し、次に迅速に４℃に冷却した。ＲＮＡ溶液を室温にした後、こ れを０．　Ｉ　Ｍ　ＮａＣ１に調整し、そして結合緩衝液（５００ｍＭ　ＮａＣ 、１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ、１ｍＭ　ＥＤＴＡ、ｐＨ７，５）によりあらかじめ平衡 化したｄＴナセルースカラムに通した。流過液をさらに２回カラムに通し、そし てカラムを１０容量の結合緩衝液で洗浄した。ポリＡ”ｍＲＮＡをＥＴＳのアリ コートにより？守山し、ＴＥを会包和したフェノール・クロロホルムにより１度 抽出し、そして０．２　ＭへのＮａＣβ及び２容量の１００％エタノールの添加 により沈澱せしめた。
ＲＮＡを２回再沈澱せしめ、７０％エタノール中で１回、そして次に１００％エ タノール中で洗浄した後に乾燥した。
ポリＡ”　ｍＲＮＡを、１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−１（（Ｊ（ｐＨ７，４）、１ｍＭ 　ＥＤＴＡ、１０ｍＭ　ＮａＣｆ及び０．１％ＳＤＳ中でのシュークロースグラ ジェントにより分画した。ベックマンＳ　Ｗ４０ローター中３８．００Ｏｒｐｍ にて１７時間遠心した後、ｍＲＮＡをグラジェントからエタノール沈澱により回 収した。ｍＲＮＡを卵母細胞に注入しそして卵母細胞抽出物を細胞毒性活性につ いてアッセイすることによりＴＮＦｍＲＮＡを含有する両分を同定した。ピーク 活性を含有する両分をプールしてｃＤＮＡライブラリーの造成のために使用した 。
２、ＣＤＮＡライブラリーの浩 ポリＡテイルのオリゴｄＴプライミング及びＡＭＵ逆転写酵素を用い、Ｏｋａｙ ａｍａ、Ｉｌ、等、Ｍｏ１．Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、（１９８３）３：２８０（引 用によりこの明細書に組み入れる）を用いて濃縮された１６５ｍＲＮＡ画分から ｃＤＮＡを調製した。この方法は高い比率の十分に長いコドンをもたら肱そして 宿主ベクター゛としてそこに記載されておりそして著者から容易に入手すること ができる２つのベクター、すなわちｐｃＤＶ１及びｐＬｌの部分を使用する。得 られたベクターは近位ＢａｍＨＩ及びＸｈｏＩ制限部位を含む゛ベクター断片間 に挿入部を含有する。このベクターはｐＢＲ３２２の複製開始点及びＡｍｐ耐性 遺伝子を含有する。
ｃＤＮＡライブラリーを調製するための他の方法は、言うまでもなく当業界にお いて良く知られている。今や古典的となった１つの方法は、オリゴｄＴプライマ ー、逆転写酵素、ポリｄＧによる２末鎖ｃＤＮＡのテイル形成、及び所望の制限 部位において開列されておりそしてポリｄＣによりテイル形成されているｐＢＲ ３２２又はその誘導体のごとき適当なベクターへのアニーリングを用いる。この 代替可能な方法の詳細な記載は例えば１９８５年５月２１日に発行された米国特 許階４．５７８，５８４中に見られる（これを引用によりこの明細書に組み入れ る）。
この発明において使用される方法においでは、濃縮されたｍＲＮＡ（５μｇ）を 、２２℃にて５分間１０ｍＭメチル水銀で処理することによって変性し、そして １００ｍＭ２−メルカプトエタノールを添加することにより解毒した［Ｐａｙｖ ａｒ。
Ｆｏ等、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、（１９７９）２５４ニア６３６−７６４２） 、プラスミドｐｃＤＶ１をＫｐｍＩで開裂せしめ、ｄＴＴＰでティル形成し、そ して変性したｍＲＮＡにアニールした。このオリゴｄＴプライムドｍＲＮＡを逆 転写酵素で処理し、そして新しく合成されたＤＮＡ鎖にｄＣＴＰによりテイル形 成した。最後に、ｐｃＤＶ１ベクターの不所望の部分をｌ１ｉｎｄｎｌによる開 裂によって除去した。
これとは別に、ｐＬｌをＰｓｔＩにより開裂せしめ、ｄＧＴＰによリテイル形成 し、旧ｎｄｎ［により開裂せしめ、そして次にｐｃＤＶ１ベクター断片により延 長されたポリＴテイル形成されたｍＲＮＡ／ｃＤＮＡコンプレックスに、Ｅ、コ リ・リガーゼを用いて連結し、そしてこの混合物をＤＮＡポリメラーゼ■（Ｋｌ ｅｎｏｕ）、Ｅ、コリ・リガーゼ、及びＲＮアーゼＨで処理した。生じたベクタ ニをＥ、コリに１２ＭＭ２９４に形質転換してＡｍｐとした。
相補的なオリゴマーを調製した。コドンの冗長性のため、合計６４種類のマーを この部分をコードするメツセンジャーに対する相補性の候補とする。合計６４種 類の１４−マーを調製し、そして１６種類ずつの４個のプールに分けた。
各プールを、上記のようにして調製したシュークロースグラジェント画分した濃 縮されたｍＲＮＡＦＩ製物と混合し、そしてこの混合物を卵母細胞翻訳系に注入 した。未処理のメツセンジャーＲＮＡを用いて対照試行を行った。卵母細胞系で 生産された蛋白質をＬ−９２９細胞毒性アフセイ（３５Ｓ放出）にかけ、対照及 びｍＲＮＡと３つのオリゴマープールとの混合物を、注射された卵母細胞由来の 蛋白質が活性を示した。この“バイブリド捕捉”アッセイにおいて、次の配列： を有するプールで処理されたメツセンジャーを注入された卵母細胞のみ不活性で あった。このオリゴマープールの特異性から上記のようにして調製した濃縮した ｍＲＮＡ％並びにリンホトキシンを生産することが知られている細胞から得られ た対応するｍＲＮＡ画分との１ドツト・プロットハイブリダイゼーション用いて さらに決定した。このプールは誘導されたｍＲＮＡには良好にハイブリダイズし たが、しかし未誘導細胞又はリンホトキシン生産細胞からの対応する両分とはハ イブリダイズしなかった。しかしながら、プローブとしてキナーゼ処理されたプ ールを用いるＮｏｒｔｈｅｒｎブドットは、これが１８８（リボゾーム）ＲＮＡ 画分及びｐＢＲ３２２ＤＮＡと交差ハイブリダイズする配列を含有することを示 した。
従って、この好結果のプールを、８対のマーとしてその構成員を合成し、その各 対を用いて上記のようにして“バイブリド捕捉”アッセイを行うことによりさら に分画した。次の配列： を有する対のみが、卵母細胞中でのＴＮＦの合成の阻害において好結果であった 。分画された誘導されたＨＬ−６０ｍＲＮＡ画分、誘導された全ＨＬ−６０ポリ ＡＲＮＡ未誘導ＨＬ−６０ポリＡＲＮＡ、及びｐＢＲ３２２ＤＮＡを用いるドツ ト・プロット実験は、目的のメツセンジャーにハイブリダイズするために前記の マ一対が特異的であること、及び他の対が不能であることを確認した。
４、旦二上筐刀勿貝双 上に調製したｃＤＮＡを上記のように同定した１４−マー対を用いて検索した。
プローブとハイブリダイズする２８個のコロニーを拾い、培養し、そしてプラス ミドＤＮＡを単離した。全配列をコードするのに十分な長さの挿入部を含有する プラスミドを選択し、そして上記したようにして、細胞毒性アッセイの３５８放 出形式と組合わせたバイブリド翻訳を用いて正しい配列について幾つかのプラス ミドをアッセイした。
バイブリド翻訳アッセイは、試験配列が未分画調製物から正しいｍＲＮＡを回収 することを利用し、これは回収されたメツセンジャーを注入した卵母細胞翻訳系 により生産された蛋白質をアッセイすることにより確認される。
試験すべきプラスミドｃＤＮＡをフィルターに結合せしめ、そして誘導されたＨ Ｌ−６０細胞から単離されたポリＡ″ＲＮＡにより前記フィルターを処理する。
次に、フィルターを溶出し、溶出物を卵母細胞翻訳系に注入する。卵母細胞を蛋 白質について抽出し、次にこれをＬ−９２９毒性アツセイの３５３形式において 試験する。Ｅ２〜Ｅ４．Ｅ６、及びＥ８と称する若干のハイブリダイズするクロ ーンについての結果を下に示す。
サンプル　３ＳＳの放出（％） Ｅ６　２６ Ｅ８　１１ ｐＢＲ３２２９ Ｂや　２４ （Ａ。及びＢ、はシュークロースグラジェントにより得られた濃縮されたｍ　Ｒ Ｎ　Ａを用いる対照であり、Ｅｌ及びｐＢＲ３２２は陰性対照である。） 挿入部の制限分析及び部分配列決定は、２つの候補プラスミドｐＥ４及びｐＢｌ ｌが完全なＴＮＦコード配列を有するらしいことを示した。ｐＥ４についてのこ の分析の結果を第１９図に示す。ｐＥ４は１９８４年１０月１５日にＡＴＣＣに 寄託されそして受託番号＆３９，８９４を有する。
ｐＥ４を配列決定し、そして３つの可能なリーディングフレームすべての翻訳か ら推定されるアミノ酸配列を、精製された蛋白質のＮ−末端配列決定により決定 された天然成熟ＴＮＦの既知のＮ−末端配列とマツチさせることにより、ＴＮＦ のための正しいリーディングフレームを同定した（第１８図を参照のこと）。成 熟蛋白質中のアミノ酸配列には、１位のバリンから出発して番号を付す。前記の ごとく、相同性は完全ではなかった。しかしながら、高度の相同性により正しい ｃＤＮＡが選択されていたことが示された。第１９図に示す実験的に決定された 制限開裂部位の証明も与えられる。
１．１ｋｂＰｓｔ！断片中の３　’　ＰｓｔＩ部位の上流のｔｌｉｎｄｌｌｌは 終止コドンの下流にあり、従って後記のごとき上流領域の変形第１８図中に示さ れるｃＤＮＡ配列から推定されるように、成熟ＴＮＦ蛋白質は１５７個のアミノ 酸残基を含有し、そしてグリコジル化を伴わないで約１７，３５４の分子量を有 する。リーダー配列は、最初の利用可能なＭｅｔ出発コドンから始まっておよそ ７６個のアミノ酸を含有する様である。６９位及び１０１位に２個のシスティン 残基が存在する。
貫−主 Ｅ４　のＮ−末端工１」＝乙悲麦形 成熟蛋白質の発現を行うために、成熟蛋白質のＮ−末端バリン（第１８図中１と して示される）をコードするＧＴＣ配列にすぐ先行してＡＴＧ開始コドンを導入 し、そして適当な宿主発現ベクターへの連結のためにＡＴＧのすぐ上流に旧ｎｄ ■部位を設けるのが便利であった。これは、米国特許嵐４．５７８．５８４の例 １，２及び５に記載されているのと同様の方法で部位特定変異誘発により達成し た。
コード配列の上流部分を含有するＤＮＡ断片をＰｓｔｌによりｐＥ４から切り出 し、アガロースゲル電気泳動により単離し、電気溶出により回収し、そしてバク テリオファージＭ　１３ｍｐ１ＢのＰｓｔ１部位に連結した。
連結されたファージを凍結されたコンピテントＥ、コリに１２株Ｄ０９Ｂ　（Ａ ＴＣＣ＃３９７６８）に形質導入し、そしてシグマ社（セントルイス）から入手 したイソプロピルチオガラクトシド（ＩＰＴＧ）　５　Ｘｌ０−’Ｍ及び４０ｐ ｇ／ｍ１２のＸ−ｇａｌを含有する培地上にプレートすることにより培養した。
非−α−補補完白色クラーク新たな培地に拾い上げた。予想される（１．１ｋｂ ）サイズの挿入部を含有する組換体単鎖ファージＤＮＡについてミニーカルチュ アーをスクリーニングした。
クローン４．１と称する目的とする組換体ファージの構造を制限酵素分析を用い て確認し７た。
次の配列： ５　′−ＧへへＧＡＴＧＡＴＣＴＧＡＣＣＡＴへへＧＣＴＴＴＧＣＣＴＧＧＧＣ Ｃ−３’を有する化学合成され精製された３３−マーオリゴデオキシリボヌクレ オチドを用いて、成熟ＴＮＦ蛋白質の第１アミノ酸（バリン）をコードするＧＴ Ｃコドンの前に旧ｎｄｌＩ［制限酵素部位及びＡＴＧ−開始コドンをＷ人した。
ｌ　Ｑ　ｐｍｏｌｅのオリゴヌクレオチドを、１０　ｍＭ　ＮａＣ１。
２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−Ｈ（Ｊ　（ｐＨ７，９）、２０ｍＭ　Ｍｇ（Ｊｚ及び２０ ｍＭβ−メルカプトエタノールを含有する混合物１５μβ中で、６７℃にて５分 間及び４２℃にて２５分間加熱することにより２．６μｇのＳＳクローン４．１ ＤＮＡとハイブリダイズせしめた。このアニールされた混合物を氷上で冷却し、 そして次に０．５ｍＭの各ｄＮＴＰ、１７ｍＭＴｒｉｓ−ＨＪ（ｐＨ７，９）。
１７ｍＭ　ＭｇＣβｚ、８３ｍＭ　ＮａＣ，１７ｍＭβ−メルカプトエタノール 、５ユニツトのＤＮＡポリメラーゼＩ　Ｋｌｅｎｏｗ断片を含有する反応混合物 ２５μβの初期容量に調製し、３７℃にて１時間インキュベートした。８０℃に 加熱することにより反応を停止し、そしてこの反応混合物を用いてコンピテント ＤＧ９８細胞を形質転換し、寒天プレート上にプレートし、そして−インキユベ ートしてファージプラークを得た。
変異したクローン４．１プラークを含有するプレート、及び変異していないクロ ーン４．１フアージブタークを含有する２枚のプレートを４℃に冷却し、そして 寒天プレート上に第１の乾燥フィルターを５分間置き、そして第２のフィルター を２５分間置くことによって、各プレートからファージプラークを２枚のニトロ セルロースに移した。次に、このフィルターを、０．２ＮＮａ（１．５ＭＮａＣ ｌ及び０．２％トリトンＸ−１００に浸漬した厚いフィルター上に５分間置き、 そして０．５Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｊｌ！　（ｐＨ７，５）及び１．５　Ｍ　Ｎａ Ｃｅに浸漬したフィルター上にさらに５分間置くことによって中和した。このフ ィルターを、ｚｘｓｓｃ浸漬したフィルター上で同様にして洗浄し、乾燥し、そ して真空オーブン中で８０℃にて２時間加熱した。２枚のフィルターを４２℃に て４時間、フィルター当り１０ｍ／のＤＮＡハイブリダイゼーション緩衝液〔５ ×Ｓ　Ｓ　Ｃ，ｐＨ７，０，４×デンハート？容液（ポリビニルピロリドン、フ ィコール及びウシ血清アルブミン、１×＝各０．０２％）、０．１％ＳＤＳ、５ ０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７，０、及び１００μｇ／ｍ／！変性サケ 精子ＤＮＡ）により前ハイブリダイブせしめた。プライマーをラベルされたＡＴ Ｐと共にキナーゼ処理することにより３２Ｐ−ラベル化プローブを調製した。フ ィルターを、フィルター当り１〜５　ｍ　ｌのＤＮＡハイブリダイゼーション緩 衝液中５　Ｘ　１０’ｃｐｍ／ｍ！の１２ｐ−ラベル化プライマーに６４℃にて ８時間ハイブリダイズせしめた。
フィルターを室温にて１０分間、０．１％ＳＤＳ、２０ｍＭリン酸ナトリウム（ 緩衝剤）及び５ｘＳＳＣ中で１回；３７℃にて２０分間、緩衝剤及びＺＸＳＳＣ 中で１回；５０℃にて２０分間、緩衝剤及びＺＸＳＳＣ中で１回；並びに最後に ６０℃にて２０分間、緩衝剤及びＩｘＳＳＣ中で洗浄した。
フィルターを空気乾燥し、そして−７０℃にて４時間オートラジオグラフ処理し た。変異した外ローン中に新たなＨｉｎｄｎ制限部位を形成するためにオリゴヌ クレオチドブライマーを選択したので、このプライマーとハイブリダイズした多 数のクローンからのＲＦ−ＤＮＡをこの制限酵素により消化した。新しい旧ｎｄ ＩＩＩ制限部位を有する変異したクローン４．１プラークの１つを拾い、そして ＤＧ９８の培養物中に接種し、ｓＤＮＡを培養上清から調製し、そしてｄｓＲＦ −ＤＮＡを細胞ペレットから調製した。正しい配列をジデオキシ配列決定法によ り確認した。
正しく合成された鎖を単離し、そしてＰｓｔｌ及びｎｄｎ（部分的）により、又 はｎｄＩのみにより開裂せしめて発現ベクターに連結した。
劃−」ユ ニ１」］礪危啜 原核性発現のため、コード配列（幾らかの３′非翻訳ヌクレオチドと共に）をｄ ｓ　Ｍ　１３−ＡＷ７’０１から２つの方法で切り出した。
第１の方法においては、ｄｓＭ１３−ＡＷ７０１をＰｓｔＩで消化し、そして次 に旧ｎｄｌｌＩで部分消化して旧ｎｄＩＩ［−ＰｓｔｌＴＮＦコード配列を得た 。（Ｍ１３−ＡＷ７０１中には幾つかの旧ｎｄｌ［Ｉ部位が存在するため旧ｎｄ ＩＩＩ部分消化が必要である。’）ＤＮＡ断片の部分消化は、ＤＮＡの完全消化 のために必要な制限酵素量の１７１０を用いることにより行うことができる。混 合物をその酵素について適当な温度においてインキュベートし、そして消化混合 物のアリコートを１０分間の間隔で１時間まで取り出した。次に、これらのアリ コートをゲルに負荷し、そしてＤＮＡ断片を分析した。必要とされるＤＮＡ断片 の最高収量をもたらした時点を制限酵素による調製的消化のために使用し、そし て適切な断片を電気溶出によりゲルから精製した。
ＴＮＦｉｇ伝子の３′−非コード配列を含有するＰｓｔｌ／ＢａｍＨＩ断片を、 ｐＨ４から、酵素Ｐｓｔｌ及び３μｍＨＩによるＤＮＡの消化の後に精製した。
ＨｉｎｄＩ［［／Ｐｓｔｌ断片及びＰｓｔ　Ｉ　／ＢａｍＨＩ断片は一緒になっ てコード配列子ＤＮＡの６００ｂｐ３　’非翻訳部分を構成する。
２つの断片を次のようにして、旧ｎｄｍ／ＢａｍＨＩ消化した宿主ベクターｐＴ ＲＰ　３に連結した。
ｐＴＲＰ３　（八ＴＣＣ３９９４６）はＥ、コリｔｒｐプロモーター及びリボゾ ーム結合部位を含有する。ｐＴＲＰ　３を旧ｎｄｎ［及びＢａｍＨＩで消化し、 そしてベクター断片をアガロースゲル上で精製した。
次に、単離された断片を上記のｔｌｉｎｄｍ／Ｐｓｔ　Ｉセグメント及びＰｓｔ Ｉ／ＢａｍＨＩセグメントと共に３方連結により連結し、そしてこの混合物を用 いてＥ、コリ聞２９４をＡｍｐＲに形質転換してｐＡ誓７０１を得た。
第２の方法においては、ｄｓＭ１３−ＡＷ７０１をＭｎｄｎｌにより消化し、そ して遺伝子を含有する断片をアガロースゲル上で単離した。この単離された断片 を、ｎｄＩｌにより開裂されＢＡＰにより処理されたｐＴＲＰ３に連結し、そし てＥ、コリＭＭ２９４に形質転換してｐＶ７０２を得た。
ＰＬプロモーター及びバシルス・ポジティブ・レトロレギュレトリー配列を含有 するｐＦＣ５４、ｔ（ＡＴＣＣ３９７８９）又はｐｐｔ、ｏｐ（ＡＴＣＣ３９４ ７）を宿主ベクターとして使用することもできる。これらのベクターをｎｄｌｌ ｌ及びＢａｍＨＩにより消化し、そして制御配列を含有する大プラスミド断片を アガロス上で精製する。
上記のようにして調製したＴＮＦ遺伝子の１ｌｉｎｄｍ／ＰｓｔＩ部分及びＰｓ ｔＩ／ＢａｍＨ部分を、３方連結により、これらのベクターのｎｄｌＩ及びＢａ ｍＨ部位に連結してそれぞれプラスミドｐＡＷ７１１及びｐＡＷ７１２を得る。
他の方法として、ｐＨ４からの精製されたｌｉｎｄｌｌ断片を、ｎｄｌで開され ＢＡＰで処理されたｐＦＣ５４，を又はｐＰＬＯＰに連結してそれぞれｐ７１３ 及びｐ７１４を得る。プラスミドｐＡＷ７１１は１９８４年１１月８日にＡＴＣ Ｃに寄託され、そして受託番号Ｎ１３９，９１８を有する。
ｐＡＷ７０１及びｐＡＷ０２をＥ、コリ聞２９４に形質転換し、そしてｔｒｐプ ロモーターを抑制する条件下で培養物を増殖せしめる。トリプトファンの涸渇に よる誘導の後、ＴＮＦの生産が開始された。同様にして、ｐＡＷ７１１を造成し 、そしてＥ、コリＭＣ１０００−３９５３１中に形質転換し、そして細胞を高温 により誘導した。誘導条件下で数時間培養した後、細胞を音波処理し、Ｌ−９２ ９細胞毒性アツセイにより音波処理物がＴＮＦを含有することを確認した。結果 は次の通りである。
プラスミド　Ｕ　／　ｍ　１ ７０１　１、３　Ｘ　１０’ ７０２　１、３　ｘ　１０’ ７１１　２　ｘｌＯ’ ＩＮＦ活性のユニットは後記例９に定義した通りである。
前記のｃＤＮＡライブラリーから単離されたベクターｐＢ１１はＴＮＦコード配 列に作用可能に連結されたＳＶ４０プロモーターを含有する。２８個の陽性にハ イブリダイズするコロニーのすべて（特にｐＥ４及びｐＢｌｌを含む）はこの連 結を含有すると予想され、そしてそれ由に適当な哺乳動物宿主中で発現すること ができる。従って、ｐＢｌｌを用いてＣＯ５−７モンキー腎細胞を形質転換し、 そしてこの細胞をＳＶ４０プロモーターの誘導を行う条件下で→音養した。シグ ナル配列がｐＢｌｌ中になお存在し、そして哺乳動物細胞系において機能するた め、ＴＮＦは培地に分泌された。単層を形成したＣ０５−７細胞上の上清中のＴ ＮＦをＬ−９２９細胞からの３ＳＳの放出によりアッセイし、次の結果を得た。
プラスミド　３５３の放出（ｃｐｍ） ８１１　２２．７６３ Ｅ９　（陰性対照）　２，７３９ −ＤＮＡ　２，５６５ ＴＮＦミユーテインのためのコード配置−び、■ベクター亘且袈 例２３に記載したようにしてｐＥ４のＰｓｔ処理により調製されたクローン４． １を、Ｄ　、４．ａ項に記載したのと実質上同様であるがしかし次のプライマー ： ５　’　−ＣＡＴＧＧＧＴＧＣＴＣＧＧＧＣＴＧＣＣＴＴ　−３’（これは６９ 位のシスティンに隣接する配列に相補的であるがしかしＴＧＣからＡＧＣへの変 化を行うコドンに相補的なヌクレオチドを含有する）を用いる部位特定変異誘発 にかけた。変異したプラークを前記のようにして同定しそして配列決定により確 認した。目的とする変異を含有する１つのプラークＭＢ−静７３１をＡｖａｌ及 びＰｓｔＩで消化し、そしてこの断片をＰｓｔ／Ａｖａｌで消化したｐＡＷ７１ １に連結した。連結混合物をＥ、コリＭＣ１０００・３９５３１に形質転換して Δｍ　ｐ　Ｒにし、そしてプライマープローブを用いて形質転換体を正しい配列 についてスクリーニングした。ｐＡＷ７３１と称する１つのコロニーを変形され た配列の発現のために用いた。ｐＡＷ７３１は１９８５年１月２５日にＡＴＣＣ に寄託され、そして受託番号１ｂ５３００７を有する。
同様にして、プライマーＣＡＡＧＡＧＣＣＣＣＴＣＴＣＡＧＡＧＧＧＡＧを用い て５ｅｒＩｏｌＩＮＦのための発現ベクターであるｐＡＷ７４１を調製した。
奥見 クローニング配りの−１びＴＮＦミューティンの活性ｐ静７３１を有するＥ、コ リＭＣ１００Ｏ−３９５３１を増殖せしめ、そして高温において、例２４に記載 したようにして誘導した。
誘導された細胞からの音波処理物をアッセイし、そしてｐＡＷ７１１形質転換体 とおよそ同じｍ１当りＴＮＦ活性を有することが見出された。しかしながら、Ｓ ＤＳ分析は、これらの抽出物中の１７ｋＤ蛋白質の量は約５缶受ないことを示し 、５ｅｒｂｑ■ＦＨの比活性が天然ＴＮＦ蛋白質又は野性型組換ＴＮＦ蛋白質の それより高いことが示された。
且−１ 組　５ｅｒａｑＳｅｒ＋ｏ＋　ヒトＴＮＦミューティンのコード配ｔｑ光−想。
プラスミドｐＡＷ７３１　（ｓｅｒ６＋）を旧ｎｄｎ［及び旧ｎｃｌｌで消化し 、そして５ｅｒｈｑ　ミューティンを含有する小冊ｎｄ　ＩＩＩ　−Ｈｌｎｃ　 ＩＩ断片をアガロースゲル上で精製する。同様にして、プラスミドｐＡＷ７３２ （ｓｅｒ＋ｏυを酵素旧ｎｃｌＩ及びＢａｍＨＩで消化し、そしてｓｅｔ、。１ ミユーテインを含有する旧ｎｃ　ｎ　−Ｂａｍ１ｌ　１画分を精製する。次に、 ｐＦＣ５４，ｔからのあらかじめ精製されたｌｌｉｎｄｎｌ−Ｂａｍｉｌ　Ｉベ クター断片をＨｉｎｄ　ｎｌ　−Ｈｉｎｃ　ＩＩ　（ｓｅｒ６ｑ）断片及びＨｉ ｎｃ　ＩＩ　−ＢａｍＨＩ　（ｓｅｔ＋　ｏ＋）断片に連結してｓｅｔ、、　ｓ ｅｔ、、、　Ｔ　Ｎ　ＦクローンｐＡＷ７３５を生じさせる。このジ−ミューテ ィン５ｅｒｂｑＳｅｒｌｏｌ　Ｔ　Ｎ　Ｆは、遊離のミスティンが全く存在しな いために、精製の際ダイマニ化しない。
保り一針 然　は１　刑ヒトＴＮＦ　のシスティン　八は生　８・ゞ　主のためにＩ゛・− でない 精製された（９５％）変化していない蛋白質を、下記の方法に従って、ＤＴＴ及 びヨード酢酸で処理することにより還元しそしてアルキル化した。未処理の蛋白 質は２．６Ｘ１０’Ｕ／ｍｌの活性を有していたが、還元された蛋白質又は還元 されアルキル化された蛋白質は４．４〜４．８　ＸＩＯ’　Ｕ／ｍｌの活性を有 していた。
処理　活性 ＤＴＴなし　２．６Ｘ１０’ ０、１　ｍＭ　ＤＴＴ　３．３　ＸＩＯ’１　ｍＭ　ＤＴＴ　４．８　ＸＩＯ’ ２　ｍＭ　ＤＴＴ　３．９　ＸＩＯ’ １０ｍＭ　ＤＴＴ　１．２Ｘ１０’ ２０　ｍＭ　ＤＴＴ　１．７　ＸＩＯ’緩衝剤＋２．４ｍＭ　ｒ　ＡＡ　１．５ 　ＸＩＯ’上記のデータは、野性型組換ヒトＴＮＦ中のシスティンは生物学的活 性のために必要でないこと、すなわち、システィンの一方又は両者を、除去し、 又はこの発明の範囲内において与えられるような他のアミノ酸により置き換える ことができることを証明している。
例９゜ Ｌ−９２９アツセイ系は、ＴＮＦ活性の迅速な測定を可能に−ｒ　ル改ａされた 便利なインビトロアッセイ法である。Ｃａｒｓｗｅ−１１（前掲）のインビボ腫 瘍壊死アッセイとの相関の程度は現在のところ知られていない。しかしながら、 これは特にネズミ腫瘍細胞を使用するので、相関性は高いと予想される。
Ｅ、　Ｉ）　Ｏ公開Ｔｈ０１００６４１においてリンホトキシンと称される蛋白 質もこのアッセイにおいて活性を与える。このアッセイ法は概念において、ネズ ミＬ−Ｍ細胞及びメチＬ／ンブルー染色を使用する米国特許Ｎ１４．４５７，９ １６に開示されているものに類似する。しかしながら、Ｌ−９２９アツセイ法は ヒト腫瘍セルライン細胞毒性と相関する（Ｈｌ、−６０山来′ｌ″ＮＦについて ）ことがここに示された。
この発明のＬ−９２９アツセイ系において、Ｌ−９２９細胞はミクロタイタープ レート中で単層として一夜調製される。試験サンプルをプレートにわたって２倍 稀釈し、ＬＪＶ照射し、そして次に調製された細胞単層上に加える。次に、ウェ ル中の培地を１μｇ／ｍＰアクチノマイシンＤにする。プレートを３７℃にて１ ８時間インキュベートし、そしてプレートを顕微鏡下で視覚的にスコアーする。
ろエル中の細胞死の程度を示す２５％、５０％、７５％及び１００％の標示を各 ウェルに与える。ＴＮＦ活性の１ユニツトを５０％の死滅を生じさせる稀釈の逆 数として定義する。
さらに、このアッセイ法の一層高域度の変法が開発された。
この方法は、試験サンプル及びアクチノマイシンＤにより処理された場合に、前 ラベルされた細胞からの３５８でラベルされたペプチドの放出をモニターする。
アッセイ法のこの変法は力価を定量するため、例えば卵母細胞により翻訳された 物質の相対力価を評価するために使用することができる。要約すれば、活発に増 殖しているＬ−９２９の培養物を、２％の透析されたウシ胎児血清が補充された メチオニン不含有培地中で３ＳＳ−メチオニン（２００μＣ１／ｍｐ）により３ 時間ラベルする。次に細胞を洗浄し、そして９６ウエルプレート中にプレートし 、そして−夜インキヱベートし、そして次の日に試験サンプルの２倍稀釈物及び １μｇ　／　ｍ　ｌのアクチノマイシンＤで処理する。次に、培養物を３７℃に て１８時間インキュベートする。次に、各ウェルからの１００μｌの上清アリコ ートを他の９６ウエルプレートに移し、酸（ＴＣＡ）沈澱せしめ、そしてガラス 繊維フィルター上に回収する。フィルターを９５％エタノールで洗浄し、乾燥し 、そして計数する。すべてのアッセイにＮＰ、０洗剤対照を含めて細胞からの放 射能の最大放出を測定する。次に、３５″Ｓ放出（％）を処理細胞と未処理対照 との間のカウントの差をＮ　Ｐ　＜。処理細胞と未処理細胞との間のカントンの 差で除した比率、すなわち、で表わされる比率により計算する。ＴＮＦＯ力価が 高くなるに従ってこの比率が高い値となる。
この発明のＴＮＦは適当な医薬製剤に便利に製剤化され、この製剤は典型的には 療法的有効量のミューティン、及びＩ　Ｌ　−２ミユーテインに関して前記した ような適当な生理的に許容されるキャリヤーを含むであろう。他の方法として、 他の細胞変性剤、抗ウィルス剤又は抗癌剤をこの発明のＴＮＦミューティン、例 えばγ−インターフェロンと組合わせて使用することができる。
１９８４年１０月１５日、出願人はアメリカン・タイプ・カルチュアー・コレク ション、ロックビル、ＭＤ、　米国（ＡＴＣＣ）に、この明細書に記載されてい るプラスミドｐ　Ｅ　４　、ＡＴＣＣｈｈ３９，８９４を寄託した。１９８４年 １１月８日、ｐＡＷ７１１が寄託されＡＴＣＣ受託番号Ｎ１１３９，９１８が与 えられた。１９８５年１月２５日、ｐ静７３１が寄託され、そしてＡＴＣＣ受託 番号Ｔｈ５３，００７が与えられた。これらの寄託は特許手続上の微生物の寄託 の国際的承認に関するブタペスト条約及びその規則（ブタペスト条約）の規定の もとになされた。これは、寄託の日から３０年間にわたる生存培養物の維持を保 証する。これらの生物は、ブタペスト条約に基き、そして該当する米国特許が発 効した後に無制限の入手可能性を保証する出願人とＡＴＣＣとの合意に従って、 ＡＴＣＣから入手可能にされるであろう。寄託された菌株の入手可能性は、いず れかの政府の権威をもとにその特許法に従って与えられた権利を侵害して発明を 実施する許諾であると解釈してはならない。
、　遺伝子工学、蛋白質化学、医薬の分野、及び関連分野の当業者にとって自明 な、この発明を実施するための上記の方法の変法は後記の請求の範囲内であるこ とが意図される。
ＦＩＧ、　２ ＦＩＧ、４ 国際調査報告 ｌａ＋四１１（１ｍ＋＾ＩＮｔＷＭＮ１ｋ　ｐｅｒ／ｌｊｓ　８６１００２３６ ＡＮＮＥＸ　Ｔｏ　”ｋｄＥ　ｒＮＴＥＲ，ＮＡＴＩＯＮＡＬ　５ＥＡＲＣ：Ｉ 　ＲＥＰＯＲＴ　ＪＮ

Claims (44)

    【特許請求の範囲】
  1. １．生物学的に活性なヒト腫瘍壊死因子蛋白質の合成ミューテインであて、該蛋 白質はジスルフィド結合を形成するように開放されており且つ前記生物学的活性 のために必須でない少なくとも１個のシステインを有し、そして前記ミューテイ ンにおいては該システインの少なくとも１個が除去されているか又は他のアミノ 酸により置き換えられている、前記合成ミューテイン。
  2. ２．前記システイン残基が１個のみ存在する、請求の範囲第１項に記載の合成ミ ューテイン。
  3. ３．前記システイン残基がセリン、スレオニン、グリシン、アラニン、バリン、 ロイシン、イソロイシン、ヒスチジン、チロシン、フェニルアラニン、トリプト ファン又はメチオニンにより置き換えられている、請求の範囲第１項に記載の合 成ミューテイン。
  4. ４．前記システイン残基がセリン、スレオニン又はアラニンにより置き換えられ ている、請求の範囲第１項に記載の合成ミューテイン。
  5. ５．前記ミューテインがグリコシル化されていない、請求の範囲第１項に記載の 合成ミューテイン。
  6. ６．位置６９のシステイン残基が置き換えられている、請求の範囲第１項に記載 の合成ミューテイン。
  7. ７．位置１０１のシステインが置き換えられている、請求の範囲第１項に記載の 合成ミューテイン。
  8. ８．位置６９及び１０１のシステインが置き換えられている、請求の範囲第１項 に記載の合成ミューテイン。
  9. ９．前記システイン残基がセリン、バリン、アラニン及びスレオニンから成る群 から選はれる残基により置き換えられている、請求の範囲第８項に記載の合成ミ ューテイン。
  10. １０．システイン残基がセリン残基により置き換えられている、請求の範囲第９ 項に記載の合成ミューテイン。
  11. １１．前記蛋白質がＴＮＦであり、位置１０１のシステイン残基がセリン残基に より置き換えられている、請求の範囲第３項に記載の合成ミューテイン。
  12. １２．前記システイン残基がセリン、バリン、アラニン及びスレオニンから成る 群から選択された残基により置き換えられている、請求の範囲第１１項に記載の 合成ミューテイン。
  13. １３．前記システイン残基がセリン残基により置き換えられている請求の範囲第 １２項に記載の合成ミューテイン。
  14. １４．前記蛋白質がＴＮＦであり、ＴＮＦの位置６９及び１０１のシステイン残 基のそれぞれが独立に置き換えられている、請求の範囲第３項に記載の合成ミュ ーテイン。
  15. １５．各シテスイン残基がセリン、バリン、アラニン及びスレオニンから成る群 から選択された残基により独立に置換されている、請求の範囲第１４項に記載の 合成ミューテイン。
  16. １６．各システイン残基がセリン残基により置き換えられている、請求の範囲第 １５項に記載の合成ミューテイン。
  17. １７．請求の範囲第１項、第２項、第３項、第４項、第５項、第６項、第７項、 第８項、第９項又は第１０項に記載の合成ミューテインをコードするＤＮＡ配列 を有する構造遺伝子。
  18. １８．請求の範囲第１７項に記載の構造遺伝子をその発現を可能にする位置に含 有する発現ベクター。
  19. １９．請求の範囲第１８項に記載の発現ベクターにより形質転換された宿主細胞 又は住物、及びその子孫。
  20. ２０．請求の範囲第１８項に記載の発現ベクターにより形質転換されたＥ．コリ 、及びその子孫。
  21. ２１．合成ミューテインの製造方法であって、請求の範囲第１９項に記載の宿主 又は子孫を培養し、そして該培養物から合成ミューテインを収得することを含ん で成る方法。
  22. ２２．ジスルフィド結合を形成するように開放されている少なくとも１個のシス テイン残基を有する蛋白質が該ジスルフィド結合を形成するのを防止する方法で あって、該システイン残基を除去するか又は該システイン残基を他のアミノ酸に より置き換えることを含んで成る方法。
  23. ２３．前記蛋白質が生物学的に活性であり、そして該システインが該生物学的活 性のために必須でない請求の範囲第２２項に記載の方法。
  24. ２４．前記システイン残基がセリン又はスレオニンにより置き換えられている、 請求の範囲第２２項に記載の方法。
  25. ２５．請求の範囲第１７項に記載の遺伝子の製造方法であって、 （ａ）前記蛋白質をコードする構造遺伝子の鎖を含んで成る単鎖ＤＮＡを、前記 システイン残基のためのコドン又は該コドンと対合するアンチセンストリプレッ トを含む前記の鎖に相補的であるが、前記コドン又はアンチセンストリプレット とのミスマッチを有し、該ミスマッチが前記コドンの欠失又は前記他のアミノ酸 をコードするトリプレットを定義する変異オリゴヌクレオチドプライマーとハイ プリダイズせしめ；（ｂ）前記プライマーをＤＮＡポリメラーゼにより延長して 変異ヘテロデュプレックスを形成せしめ；そして（ｃ）前記変異ヘテロデュプレ ックスを複製する；ことを含んで成る方法。
  26. ２６．前記ミスマッチがセリン又はスレオニンをコードするトリプレットを定義 する、請求の範囲第２５項に記載の方法。
  27. ２７．前記単鎖ＤＮＡが前記鎖を含有する単鎖ファージであり、そして段階（ｂ ）の変異ヘテロデュプレックスが閉環ヘテロデュプレックスに転換される、請求 の範囲第２５項に記載の方法。
  28. ２８．前記閉環ヘテロデュプレックスによりコンビテント細菌宿主を形質転換し 、そして生ずる形質転換体を培養することにより前記置き換えを行う、請求の範 囲第２５項に記載の方法。
  29. ２９．前記ヘテロデュプレックスの変異鎖の子孫を単離し、前記子孫からＤＮＡ を単離し、そして該子孫からのＤＮＡから前記遺伝子を単離する、請求の範囲第 ２５項に記載の方法。
  30. ３０．前記蛋白質がヒトＴＮＦであり、前記システイン残基が位置６９にあり、 そして前記ミスマッチがセリンのコドンを定義する、請求の範囲第２５項、第２ ６項、第２７項、第２８項又は第２９項に記載の方法。
  31. ３１．前記鎖がＴＮＦのセンス鎖であり、そして前記変異オリゴヌクレオチドプ ライマーが【配列があります】である、請求の範囲第３０項に記載の方法。
  32. ３２．前記蛋白質がヒトＴＮＦであり、前記システイン残基が１０１位にあり、 そして前記ミスマッチがセリンをコードするコドンを定義する、請求の範囲第２ ３項に記載の方法。
  33. ３３．オリゴヌクレオチド指令変異誘発による請求の範囲第１７項に記載の構造 遺伝子の製造において使用するためのオリゴヌクレオチドであって、前記システ イン残基のためのコドン又は該コドンと対合するアンチセンストリプレットを含 む前記の鎖に相補的であるが、前記コドン又はアンチセンストリプレットとのミ スマッチを有し、該ミスマッチが前記コドンの欠失又は前記他のアミノ酸をコー ドするトリプレットを定義するヌクレオチド配列を有する前記オリゴヌクレオチ ド。
  34. ３４．ＴＮＦ活性を有する療法組成物であって、医薬として許容されるキャリャ ー媒体と混合された療法的有効量の、請求の範囲第７項、第８項、又は第１４項 に記載の合成ミューテインを含んで成る組成物。
  35. ３５．ＴＮＦ活性を有する療法組成物であって、医薬として許容されるキャリャ ー担体と混合された療法的有効量の、請求の範囲第１４項に記載の合成ミューテ インを含んで成る組成物。
  36. ３６．ｐＡＷ７３１．，ｐＡＷ７４１及びｐＡＷ７３５から成る群から選択され たプラスミド。
  37. ３７．請求の範囲第３６項に記載のプラスミドにより形質転換された細菌及びそ の子孫。
  38. ３８．前記細菌がＥ．コリである請求の範囲第３７項に記載の細菌。
  39. ３９．ヒト組換ｓｅｒ６９腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）ミューテイン。
  40. ４０．ヒト組換ｓｅｒ１０１腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）ミューテイン。
  41. ４１．ヒト組換ｓｅｒ６９ｓｅｒ１０１腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）ミューテイン。
  42. ４２．癌疾患について患者を治療する方法であって、該患者に癌抑制量の請求の 範囲第１項、第３９項、第４０項又は第４１項に記載のミューテインを投与する ことを含んで成る方法。
  43. ４３．請求の範囲第１項、第３９項、第４０項、又は第４１項に記載のミューテ インの有効量、及び少なくとも１種類の抗癌化合物又は抗ウイルス化合物を含ん で成る療法製剤。
  44. ４４．前記抗癌化合物又は抗ウイルス化合物がγ−インターフェロンである、請 求の範囲第４３項に記載の製剤。
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