JP3699482B2 - Ｔｃｆ変異体 - Google Patents
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Description
技術分野
本発明は、新規なアミノ酸配列を有するＴＣＦ変異体に関する。
詳しくは、天然型ＴＣＦのアミノ酸配列のＮ末端から第一グリングルまでに含まれる１以上のアミノ酸を変異させることにより得られる、ヘパリン親和性の低下及び／又は生物活性の上昇したＴＣＦ変異体に関する。
本発明ＴＣＦ変異体は、肝実質細胞に対する増殖活性及び／又は増殖促進活性を有し、各種肝疾患の治療剤及び抗腫瘍剤として有用である。
背景技術
ヒト細胞由来の繊維芽細胞が産生する腫瘍細胞障害性因子ＴＣＦ（ＴＣＦ-II）は、これまで報告された抗腫瘍性蛋白質とは異なる新規な抗腫瘍性物質であり、本発明者らは、この蛋白質をコードするｃＤＮＡのクローニングに成功し、その全アミノ酸配列を確定するとともに、その有用性を確認した（ＷＯ90/10651号公報）。ＴＣＦは、非還元下のＳＤＳ電気泳動による分子量測定では78000±2000及び／又は74000±2000の分子量を示し、還元した場合52000±2000の共通のバンドであるＡ鎖と、30000±2000及び／又は26000±2000のＢ鎖及びＣ鎖とを示す。このＴＣＦはヘパリン或いはヘパリン様物質に強い親和性を持つ蛋白質であり、強い抗腫瘍活性と正常細胞の増殖活性を合わせもち、さらに肝実質細胞の増殖因子であるＨＧＦの多様なファミリーの一種であることが確認された。即ち、ＴＣＦは抗腫瘍性因子であるだけでなく、肝実質細胞の増殖因子でもあることから肝切除後の肝臓再生の促進に有用であることが知られている。
従来より、ＴＣＦのファミリーである肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）について、その構造と機能という側面から多くの研究がなされてきている。しかしながら、現在までのところ20種近い欠失変異体と50種近い点変異変異体の報告がされているにもかかわらず（K.Matsumoto他，Biochem. Biophys. Res. Comm., vol.181, pp691-699（1991）；G.Hartmann他，Proc.Natl.Acad.Sci.USA, vol.89, pp11574-11587（1992）；N.A.Lokker他，EMBO J., vol.11, pp2503-2510（1992）；M.Okigaki他，Biochemistry, vol.31, pp9555-9561（1992）；N.A.Lokker他，Protein Engineering, vol.7, pp895-903（1994））、明らかに生物活性の上昇している変異体は得られていないのが現状である。
ＴＣＦはその生体内半減期が約２分と極めて短いことが知られており、各種疾患の治療剤として用いるには比較的多量の投与が必要であることが予想される。しかし、ＴＣＦの生物活性を上昇又は生体内半減期を延長させることにより、投与量を低減できると考えられる。生体内半減期の延長したＴＣＦ変異体はＷＯ94/14845号公報に開示されているが、生物活性の上昇したＴＣＦの変異体については、上述したＨＧＦ同様得られていないのが現状である。よって、本発明者らは、ＴＣＦの生物活性の上昇あるいは生体内半減期の延長されたＴＣＦ変異体を得るべく検討を行なった。すなわち、本発明者らは、天然型ＴＣＦのアミノ酸配列をコードするＤＮＡの塩基配列を変換し、このＤＮＡを発現させて、天然型のＴＣＦと異なるアミノ酸配列を有し、かつ生物活性の上昇及び／又は生体内半減期の延長された変異体を得るべく検討を行なった。従って、本発明は、生物活性が上昇したＴＣＦ変異体またはヘパリン親和性の低下により生体内半減期の延長されたＴＣＦ変異体を提供することを課題とする。
本発明者らは上記の状況に鑑み鋭意探索の結果、従来のＴＣＦ変異体とは異なるアミノ酸配列を有し、生物活性の上昇及び／又はヘパリン親和性の低下した新規なＴＣＦの変異体を見出すに至った。本発明により、蛋白量当たりの生物活性、即ち比活性が10倍以上に上昇したもの及び／又はヘパリン親和性の低下したＴＣＦ変異体が提供される。これは天然型のＴＣＦのアミノ酸を変異させることにより、生物活性を大幅に上昇させた初めてのものである。
発明の開示
本発明の目的は、天然型ＴＣＦのアミノ酸配列における、Ｎ末端から第一クリングルまでに含まれる１以上のアミノ酸を変異させることにより得られる、ヘパリン親和性の低下及び／又は生物活性の上昇した新規なＴＣＦ変異体を提供することにある。
さらに本発明の他の目的は、肝実質細胞に対する増殖活性及び／又は増殖促進活性を有し、各種肝疾患の治療剤及び抗腫瘍剤として有用な新規なＴＣＦ変異体を提供することにある。
蛋白質のある部分のアミノ酸配列に変異を導入し、得られた変異体と天然型を比べることによりその部分の働きを推定することができる。その蛋白質の構造が明らかになっていない場合、変異を導入することにより蛋白質の立体構造が変化することを防ぐため、極性を持ち蛋白質の表面に存在すると考えられるアミノ酸をAlaなどの立体構造に影響を与えないアミノ酸に置換する方法がしばしば用いられる。ある部分のアミノ酸配列を特異的に他のアミノ酸に置換するためには、他のアミノ酸をコードする塩基配列に置き換えたオリゴヌクレオチドを合成し、天然型ＴＣＦをコードするｃＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ（ポリメラーゼチェーンリアクション）法により部位特異的変異を導入したｃＤＮＡを調製することができる。このようにして得られたｃＤＮＡは適当な発現プロモーター(サイトメガロウィルス(CMV),SRα(Mole. Cell. Biol. vol.8, No.1 pp466-472(1988年)及び特開平1-277489号公報）を有したベクターに挿入し、哺乳動物細胞などの真核細胞をトランスフェクトし、この細胞を培養することにより、培養液から目的とするＴＣＦ変異体を回収、調製することができる。
ＴＣＦ変異体は、変異の導入位置、置換するアミノ酸の種類により多数の変異体が存在する。本発明においては６種類の変異体を調製した。これら変異体は変異導入前のアミノ酸配列、変異を導入した位置のＮ末端側のアミノ酸の番号、変異導入後に変化したアミノ酸配列を１文字標記で列記して、それぞれの変異体を特定する。例えば、Ｎ末端２番目からのArg-Lys-Arg-Argという配列を全てAlaに置換した変異体はRKRR2AAAA、またＮ末端２７番目からのLys-Ile-Lys-Thr-Lys-Lysという配列をAla-Ile-Ala-Thr-Ala-Alaという配列に置換した変異体はKIKTKK27AIATAAと表す。
本発明は、このような天然型ＴＣＦのアミノ酸配列のＮ末端から第一クリングルまでに含まれる１以上のアミノ酸を他のアミノ酸で置換し、変異させて得られる、ヘパリン親和性を低下させるかあるいは生物活性の上昇したＴＣＦ変異体に関する。
このような、ＴＣＦ変異体としては次のものを例示することができる。
(1) 天然型ＴＣＦのＮ末端２番目から５番目のアミノ酸配列-Arg-Lys-Arg-Arg-を-Ala-Ala-Ala-Ala-に変異させたＴＣＦの変異体。
(2) 天然型ＴＣＦのＮ末端２７番目からち３２番目のアミノ酸配列-Lys-Ile-Lys-Thr-Lys-Lys-を-Ala-Ile-Ala-Thr-Ala-Ala-に変異させたＴＣＦ変異体。
(3) 天然型ＴＣＦのＮ末端５４番目のアミノ酸-Lys-を-Ala-に変異させたＴＣＦ変異体。
(4) 天然型ＴＣＦのＮ末端１３２番目から１３５番目のアミノ酸配列-Arg-Gly-Lys-Asp-を-Ala-Gly-Ala-Ala-に変異させたＴＣＦ変異体。
(5) 天然型ＴＣＦのＮ末端１４２番目のアミノ酸-Arg-を-Ala-に変異させたＴＣＦ変異体
(6) 天然型ＴＣＦのＮ末端４２番目のアミノ酸-Arg-を-Ala-に変異させたＴＣＦ変異体。
これらのＴＣＦ変異体は天然型ＴＣＦにくらべて肝細胞増殖活性及び腎上皮細胞増殖活性がいちじるしく高まり、骨髄細胞増殖活性がいちじるしく低下したものとなる。
具体的には、実施例に示すように蛋白量当りの肝細胞増殖活性が天然型ＴＣＦの２倍以上、腎上皮細胞増殖活性が２倍以上高くなり、骨髄細胞増殖活性が1/2-1/20に低下する。
これらのＴＣＦ変異体は、天然ＴＣＦを精製し、これを用いて前記した通常行なわれている遺伝子操作によって変異体とすることによって得ることができる。
【図面の簡単な説明】
第１図は、精製したＴＣＦ及び本発明ＴＣＦ変異体のＳＤＳ電気泳動の模式図を示す。
第２図は、精製したＴＣＦ及び本発明ＴＣＦ変異体の肝実質細胞増殖作用を示す。縦軸の相対活性（％）は、10ng/mlにおけるＴＣＦの増殖活性を100％として、それに対する各試料の増殖活性の比で表した。
第３図は、精製したＴＣＦと変異体RKRR2AAAAの肝実質細胞増殖作用の比較を表す。
第４図は、精製したＴＣＦと変異体KIKTKK27AIATAAの肝実質細胞増殖作用の比較を表す。
第５図は、精製したＴＣＦと変異体RKRR2AAAAおよびKIKTKK27AIATAAの腎上皮細胞増殖作用の比較を表す。
第６図は、精製したＴＣＦと変異体RKRR2AAAAおよびKIKTKK27AIATAAの骨髄系細胞増殖作用の比較を表す。
第７図は、精製したＴＣＦと変異体RKRR2AAAAおよびKIKTKK27AIATAAを投与したラット血清中総蛋白量の変化を表す。
第８図は、精製したＴＣＦと変異体RKRR2AAAAおよびKIKTKK27AIATAAを投与したラット血清中ＨＤＬ−コレステロール量を表す。
発明を実施するための最良の形態
以下に実施例を示し本発明を詳細に説明する。しかし、これらは単に例示するのみであり、これらにより本発明は何ら限定されるものではない。
〔実施例１〕
ＷＯ92/01053号公報に開示された方法により得られたＴＣＦ発現プラスミド6.3kbを用いて、以下に示す方法により部位特異的変異を導入した。このプラスミドを含む大腸菌はpcTCF(S)/MC1061/P3として平成２年７月１３日付で工業技術院微生物工業技術研究所（現工業技術院生命工学工業技術研究所）に受託番号FERM BP-3479（平成３年７月１０日にFERM P-11605の原寄託よりブタペスト条約に基づく寄託に移管）として寄託されている。
Ｉ．鋳型プラスミドpcD TCF001の調製
以下の方法に従い、塩基番号３４からのPstI切断部位に変異を導入し、切断できない塩基配列に置換した。変異を持つプライマーPst01（配列番号１）と変異のないプライマーＴＣＦ415 R（配列番号２）の組み合わせおよび、変異を持つプライマーP002（配列番号３）と変異のないプライマーＴＣＦSal-77（配列番号４）との組み合わせでプラスミドpUC ＴＣＦ（プラスミドpUC18にＴＣＦのSalI/SphI断片を挿入したプラスミド）8ngを鋳型としたＰＣＲ反応を行った。反応液をマイクロコン100（アミコン社製）で分子ふるいにかけプライマーを除去したのち、２つのＰＣＲ産物を混合後、プライマーＴＣＦSal-77とＴＣＦ415Rで二段階目のＰＣＲ反応を行った。得られた産物を制限酵素BstPI/PstIで切断後、あらかじめ用意しておいたpUC ＴＣＦ BstPI/PstIラージフラグメントと混合しライゲーションキット（宝酒造社製）を用いてライゲーションした。ライゲーション反応液の一部を用い大腸菌ＤＨ５αを形質転換した。形質転換された大腸菌ＤＨ５αをアンピシリン50μg/mlを含むＬ培地で培養し、得られたアンピシリン耐性株から目的の構造を持つプラスミドを選びだした。このプラスミドを制限酵素SalI/SphIで切断し、あらかじめ用意しておいたnew pcＤＮＡI（pcＤＮＡIのマルチクローニングサイトを改変し、HindIII-SalI-BamHI-SphI-NotIクローニングサイトを持つもの）SalI/SphIラージフラグメントと混合しライゲーションキットを用いて挿入した。反応液を用い大腸菌ＭＣ1061/P3（インビトローゲン社製）を形質転換した。形質転換された大腸菌ＭＣ1061/P3を、アンピシリン50μg/ml及びテトラサイクリン7.5μg/mlを含むＬ培地で培養し、得られたアンピシリン−テトラサイクリン耐性株からプラスミドＤＮＡを調製し、ＤＮＡシークエンサー（パーキン−エルマー社製）により塩基配列を決定し、目的の構造をもつプラスミドpcD ＴＣＦ001を得た。得られたプラスミドを用いて、ＴＣＦ変異体の調製を行った。
II．ＴＣＦ変異体の発現ベクターの構築及び形質転換大腸菌の作製
i．RKRR2AAAA発現ベクターの構築及び形質転換大腸菌の作製
２段階のＰＣＲ反応により、RKRR2AAAA変異体をコードするｃＤＮＡ発現プラスミドの構築を行った。１段階目のＰＣＲ反応には、変異を持つプライマー2RKRR F（配列番号５）と変異のないプライマーＴＣＦ977 R（配列番号６）を用いた反応、及び変異を持つプライマー2RKRR R（配列番号７）と変異のないプライマーＴＣＦSal-77（配列番号４）を用いた反応を行った。鋳型はどちらも4ngのpc ＴＣＦ001を使用した。反応終了後、二つの反応液を混ぜ、マイクロコン100で精製したのち、20分の１量を２段階目のＰＣＲ反応の鋳型として供した。プライマーはＴＣＦSal-77とＴＣＦ977Rを用いた。この反応液をマイクロコン100で精製したのち、制限酵素BstPI/EcoRVで切断し、ＴＣＦのｃＤＮＡをSRα発現ベクターに組み込んだプラスミドをあらかじめBstPI/EcoRVで切断しておいた断片にライゲーションキットを用いて挿入した。ライゲーション反応液を用い大腸菌ＤＨ５αを形質転換し、得られたアンピシリン耐性株から前記したと同様の方法により目的のクローンを得た。得られたクローンからプラスミドＤＮＡを調製し、ＤＮＡシークエンサー（パーキン−エルマー社製）により塩基配列を決定した。又、このプラスミドのｃＤＮＡの一部を制限酵素EcoRV/BstPIで切り出したのち、pUCＴＣＦを制限酵素EcoRV/BstPIであらかじめ切断しておいた断片に組み込み、大腸菌ＤＨ５αに形質転換した。このプラスミドを含む大腸菌は、pUC-TCF2として平成６年11月10日付で工業技術院生命工学工業技術研究所に受託番号FERM BP-5266（平成７年10月25日にFERM P-14624の原寄託よりブタペスト条約に基づく寄託に移管）として寄託されている。
ii．KIKTKK27AIATAA発現ベクターの構築及び形質転換大腸菌の作製
２段階のＰＣＲ反応により、KIKTKK27AIATAA変異体をコードするｃＤＮＡ発現プラスミドの構築を行った。１段階目のＰＣＲ反応には、変異を持つプライマー27KIKTKK F（配列番号８）と変異のないプライマーＴＣＦ977 R（配列番号６）を用いた反応、及び変異を持つプライマー27KIKTKK R（配列番号９）と変異のないプライマーＴＣＦSal-77（配列番号４）を用いた反応を行った。鋳型はどちらも4ngのpcD ＴＣＦ001を使用した。反応終了後、二つの反応液を混ぜ、マイクロコン100で精製したのち、20分の１量を２段階目のＰＣＲ反応の鋳型として供した。プライマーはＴＣＦSal-77とＴＣＦ977 Rを用いた。この反応液をマイクロコン100で精製したのち、制限酵素BstPI/EcoRVで切断し、ＴＣＦのｃＤＮＡをSRα発現ベクターに組み込んだプラスミドをあらかじめ制限酵素BstPI/EcoRVで切断しておいた断片にライゲーションキットを用いて挿入した。ライゲーション反応液を用い大腸菌ＤＨ５αに形質転換し、得られたアンピシリン耐性株から前記したと同様の方法により目的のクローンを得た。得られたクローンからプラスミドＤＮＡを調製し、ＤＮＡシークエンサーにより塩基配列を決定した。又、このプラスミドのｃＤＮＡの一部を制限酵素EcoRV/BstPIで切り出したのち、pUC ＴＣＦを制限酵素EcoRV/BstPIであらかじめ切断しておいた断片に組み込み、大腸菌ＤＨ５αに形質転換した。このプラスミドを含む大腸菌は、pUC-TCF27として平成６年11月10日付で工業技術院生命工学工業技術研究所に受託番号FERM BP-5265（平成７年10月25日にFERM P-14623の原寄託よりブタペスト条約に基づく寄託に移管）として寄託されている。
iii．K54A発現ベクターの構築及び形質転換大腸菌の作製
２段階のＰＣＲ反応により、K54A変異体をコードするｃＤＮＡ発現プラスミドの構築を行った。１段階目のＰＣＲ反応には、変異を持つプライマー54K F（配列番号１０）と変異のないプライマーＴＣＦ977 R（配列番号６）を用いた反応、及び変異を持つプライマー54K R（配列番号１１）とＴＣＦSal-77（配列番号４）を用いた反応を行った。鋳型はどちらも4ngのpcD ＴＣＦ001を使用した。反応終了後、二つの反応液を混ぜ、マイクロコン100で精製したのち、20分の１量を２段階目のＰＣＲ反応の鋳型として供した。プライマーはＴＣＦSal-77とＴＣＦ977 Rを用いた。この反応液をマイクロコン100で精製したのち、制限酵素BstPI/Eco RVで切断し、ＴＣＦのｃＤＮＡをSRα発現ベクターに組み込んだプラスミドをあらかじめ制限酵素BstPI/EcoRVで切断しておいた断片にライゲーションキットを用いて挿入した。ライゲーション反応液を用い大腸菌ＤＨ５αに形質転換し、得られたアンピシリン耐性株から前記したと同様の方法により目的のクローンを得た。得られたクローンからプラスミドＤＮＡを調製し、ＤＮＡシークエンサーにより塩基配列を決定した。
iv．RGKD132AGAA発現ベクターの構築及び形質転換大腸菌の作製
２段階のＰＣＲ反応により、RGKD132AGAA変異体をコードするｃＤＮＡ発現プラスミドの構築を行った。１段階目のＰＣＲ反応には、変異を持つプライマー132RGKD F（配列番号１２）と変異のないプライマーＴＣＦ977 R（配列番号６）を用いた反応、及び変異を持つプライマー132RGKD R（配列番号１３）とＴＣＦSal-77（配列番号４）を用いた反応を行った。鋳型はどちらも4ngのpcD ＴＣＦ001を使用した。反応終了後、二つの反応液を混ぜ、マイクロコン100で精製したのち、20分の１量を２段階目のＰＣＲ反応の鋳型として供した。プライマーはＴＣＦSal-77とＴＣＦ977 Rを用いた。この反応液をマイクロコン100で精製したのち、制限酵素BstPI/EcoRVで切断し、ＴＣＦのｃＤＮＡをSRα発現ベクターに組み込んだプラスミドをあらかじめ制限酵素BstPI/EcoRVで切断しておいた断片にライゲーションキットを用いて挿入した。ライゲーション反応液を用い大腸菌ＤＨ５αに形質転換し、得られたアンピシリン耐性株から前記したと同様の方法により目的のクローンを得た。得られたクローンからプラスミドＤＮＡを調製し、ＤＮＡシークエンサーにより塩基配列を決定した。
v．R142A発現ベクターの構築及び形質転換大腸菌の作製
２段階のＰＣＲ反応により、R142A変異体をコードするｃＤＮＡ発現プラスミドの構築を行った。１段階目のＰＣＲ反応には、変異を持つプライマー142R F（配列番号１４）と変異のないプライマーＴＣＦ977 R（配列番号６）を用いた反応、及び変異を持つプライマー142R R（配列番号１５）とＴＣＦSal-77（配列番号４）を用いた反応を行った。鋳型はどちらも4ngのpcD ＴＣＦ001を使用した。反応終了後、二つの反応液を混ぜ、マイクロコン100で精製したのち、20分の１量を２段階目のＰＣＲ反応の鋳型として供した。プライマーはＴＣＦSal-77とＴＣＦ977 Rを用いた。この反応液をマイクロコン100で精製したのち、制限酵素BstPI/EcoRVで切断し、ＴＣＦのｃＤＮＡをSRα発現ベクターに組み込んだプラスミドをあらかじめ制限酵素BstPI/EcoRVで切断しておいた断片にライゲーションキットを用いて挿入した。ライゲーション反応液を用い大腸菌ＤＨ５αに形質転換し、得られたアンピシリン耐性株から前記したと同様の方法により目的のクローンを得た。得られたクローンからプラスミドＤＮＡを調製し、ＤＮＡシークエンサーにより塩基配列を決定した。
vi．R42A発現ベクターの構築及び形質転換大腸菌の作製
２段階のＰＣＲ反応により、R42A変異体をコードするｃＤＮＡ発現プラスミドの構築を行った。１段階目のＰＣＲ反応には、変異を持つプライマー42R F（配列番号１６）と変異のないプライマーＴＣＦ977 R（配列番号６）を用いた反応、及び変異を持つプライマー42R R（配列番号１７）とＴＣＦSal-77（配列番号４）を用いた反応を行った。鋳型はどちらも4ngのpcD ＴＣＦ001を使用した。反応終了後、二つの反応液を混ぜ、マイクロコン100で精製したのち、20分の１量を２段階目のＰＣＲ反応の鋳型として供した。プライマーはＴＣＦSal-77とＴＣＦ977 Rを用いた。この反応液をマイクロコン100で精製したのち、制限酵素BstPI/EcoRVで切断し、ＴＣＦのｃＤＮＡをSRα発現ベクターに組み込んだプラスミドをあらかじめ制限酵素BstPI/EcoRVで切断しておいた断片にライゲーションキットを用いて挿入した。ライゲーション反応液を用い大腸菌ＤＨ５αに形質転換し、得られたアンピシリン耐性株から前記したと同様の方法により目的のクローンを得た。得られたクローンからプラスミドＤＮＡを調製し、ＤＮＡシークエンサーにより塩基配列を決定した。
III.ＴＣＦ変異体発現プラスミドの調製と精製
上記の発現ベクターをもつ６種類の形質転換大腸菌を、50μg/mlのアンピシリンを含むＬ培地（400ml）中37℃で振盪培養し、ＯＤ600が1.0になったところで終濃度が0.3mg/mlとなるようにスペクチノマイシン（シグマ社製）を添加し、一晩培養した。Maniatisの方法（Molecular Cloning 2nd ed. pp 1.21-1.52 (1989), Cold Spring Harbor Laboratory）に従いアルカリＳＤＳ法によりプラスミドＤＮＡを分離し、塩化セシウム密度勾配遠心法によりＴＣＦ発現プラスミド６種を精製した。
IV．ＴＣＦ変異体発現プラスミドの動物細胞への導入
すべての変異体発現プラスミドはＣＨＯ細胞に導入した。２×106個のＣＨＯ細胞を１０％牛胎児血清（ギブコ社製）を含んだＩＭＤＭ培地（ギブコ社製）0.8mlに懸濁し、あらかじめ200μgの発現プラスミドと10μgのブラストサイジン耐性遺伝子発現プラスミドpSV2 bsr（フナコシ社製）を25μlのＴＥ（10mM Tris-HCl(pH8.0)-1mM ＥＤＴＡ）に溶かしておいた溶液を、さらにその細胞溶液に懸濁した。この懸濁液を330V, 960μFの条件でエレクトロポレーションを行った。10分間室温で放置したのち、10mlの培地に懸濁し２日間炭酸ガスインキュベーター（５％CO2）中37℃で培養した。２日後培養上清を回収し、抗ＴＣＦモノクローナル抗体を用いたエンザイムアッセイ（ＥＩＡ）（N.Shima他，Gastroenterologia Japonica, Vol.26, No.4, pp 477-482(1991)）によりＴＣＦ変異体の発現量を確認したのち、生物活性測定用の試料とした。また細胞はトリプシン（ギブコ社製）処理によりフラスコ底面より剥がし、生細胞を数えたのち、10,000個／ウェルになるように96ウェルプレート（Nunc社製）にまき、５μg/mlのブラストサイジン（フナコシ社製）を含んだ選択培地200μl/ウェル中で２〜３週間培養した。２〜３週後、ウェルあたり50μlずつ取り、ＥＩＡによりＴＣＦ変異体の発現の有無を調べた。発現の確認されたクローンは、12ウェルプレート、25cm2フラスコ等を用いて順次細胞数を増やしていった。以上の操作によりＣＨＯ細胞でのＴＣＦ変異体生産細胞を樹立した。
Ｖ．ＴＣＦ変異体生産細胞の大量培養
75cm2フラスコ中でコンフルエントになった生産細胞をトリプシン処理により剥がした後、その細胞を225cm2フラスコ10枚に移し、フラスコ１枚当たり100mlの培地中で１週間培養し培養上清を回収した。この操作を１〜２回繰り返し、１〜２リットルの培養液を得た。
VI．ＴＣＦ変異体の精製
以下に示す３段階の方法で精製した。
i.ヘパリン−セファロース ＣＬ−６Ｂ
ＴＣＦ変異体を発現しているＣＨＯ細胞の培養液１〜２リットルを、2,000rpm×10分の遠心後、0.45μmのフィルター（ゲルマンサイエンス社製）を通し不溶物を除いたのち、0.3M NaClと0.01％ Tween20を含む10mM Tris-HCl(pH 7.5)で平衡化したヘパリン−セファロースＣＬ−６Ｂカラム（25mmX120mm，ファルマシア社製）に４ml／分の流速で通液し、ＴＣＦ変異体をカラムに吸着させた。約500mlの平衡化緩衝液で洗浄したのち、2M NaClと0.01％Tween 20を含む10mM Tris-HCl(pH 7.5)で溶出した。４mlずつフラクションコレクターで分画し、280nmに吸収をもつ画分を回収した。
ii．Ｍｏｎｏ Ｓ ＦＰＬＣ
2M NaClで溶出させたＴＣＦ変異体を含む画分を0.15M NaClを含む10mMリン酸緩衝液（pH 7.0）で透析し、12,000rpm×90分の遠心で不溶物を除いたのち、0.15M NaClと0.01％Tween 20を含む10mMリン酸緩衝液（pH 7.0）で平衡化させたMonoＳカラム（5mmX50mm，ファルマシア社製）に１ml／分で通液し、ＴＣＦ変異体をカラムに吸着させた。約30mlの平衡化緩衝液で洗浄したのち、流速を0.5ml／分に変え、60分間で直線的にＮａＣｌ濃度を1.0Ｍに高めることにより、ＴＣＦ変異体を溶出させた。0.5mlずつフラクションコレクターで分画し、280nmの吸収およびＥＩＡによりＴＣＦ変異体の溶出された画分を確認し、回収した。
iii.ヘパリン５−ＰＷ ＦＰＬＣ
MonoＳで得られたＴＣＦ変異体を含む画分に２倍量の0.01％Tween 20を含む10mM Tris-HCl(pH 7.5)を加え、0.3M NaClと0.01％Tween 20を含む10mM Tris-HCl(pH 7.5)で平衡化させたヘパリン５−ＰＷカラム（5mmX75mm，トーソー社製）に１ml／分の流速で通液させ、ＴＣＦ変異体をカラムに吸着させた。約30mlの平衡化緩衝液で洗浄後、流速を0.5ml／分に変え、60分間で直線的にNaCl濃度を2.0Mに高めることによりＴＣＦ変異体を溶出させた。0.5mlずつフラクションコレクターで分画し、280nmの吸収およびEIAによりＴＣＦ変異体の溶出された画分を確認し、回収した。得られたＴＣＦ変異体は0.01％Tween 20を含むＰＢＳ（ＴＰＢＳ）に対し透析し最終精製品とした。最終精製品は、ローリー法により蛋白質量を定量した。ＴＣＦ変異体RKRR2AAAAのアミノ酸配列を配列表配列番号１８、変異体KIKTKK27AIATAAのアミノ酸配列を配列番号１９にそれぞれ示す。
VII．精製ＴＣＦ変異体のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動
精製したＴＣＦ変異体200ngをＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動に供した。後述のごとく10倍以上の生物活性の上昇が見られたＴＣＦ変異体であるRKRR2AAAA,KIKTKK27AIATAAおよび天然型ＴＣＦの電気泳動パターンの模式図を第１図に示した。還元状態（β−メルカプトエタノール存在下）及び非還元状態（β−メルカプトエタノール非存在下）とも三者間に違いは見られなかった。さらに、いずれのＴＣＦ変異体とも構造から推測されるバンド以外は何も検出されなかった。
〔実施例２〕
ＴＣＦおよびＴＣＦ変異体のヘパリン親和性
I.ヘパリン−セファロースＣＬ−６Ｂ
各種ＴＣＦ変異体を発現しているＣＨＯ細胞の培養液10mlを、1,200g×10分の遠心後、0.22μmのフィルター（ミリポア社製）を通すことにより不溶物を除いたのち、ＴＰＢＳで平衡化させたヘパリン−セファロースＣＬ−６Ｂカラム（5mmX5mm；ファルマシア社製）に通してＴＣＦ変異体をカラムに吸着させた。３mlのＴＰＢＳで洗浄後、0.2〜3.0MのNaClを含んだＴＰＢＳ１mlずつで段階的塩濃度を上げることにより溶出し、その溶出液のＴＣＦ変異体濃度をＥＩＡで定量し溶出塩濃度を決定し、その変異体のヘパリン親和性とした。
II．ヘパリン５−ＰＷ ＦＰＬＣ
各種ＴＣＦ変異体を発現しているＣＨＯ細胞の培養液30〜60mlを1,000g×10分の遠心後、0.22μmのフィルターを通すことにより不溶物を除いたのち、0.01％Tween 20を含む20mM Tris-HCl緩衝液（ｐＨ7.5）で平衡化させたヘパリン５−ＰＷカラムに1.0ml／分の流速で通し、ＴＣＦ変異体をカラムに吸着させた。約20mlの平衡化緩衝液でカラムを洗浄したのち、流速を0.5ml／分に変え45分間で直線的にNaCl濃度を1.5Mに高めることによりＴＣＦ変異体を溶出した。このとき0.5mlずつフラクションコレクターで分画し、各画分のＴＣＦ変異体濃度をＥＩＡにより定量することで溶出塩濃度を決定し、その変異体のヘパリン親和性とした。
これらＴＣＦ変異体のヘパリン親和性の結果を第１表に示す。ヘパリンセファロース（heparin-Sepharose）溶出NaCl濃度値は、ＴＣＦ変異体の最も多く溶出された濃度を表している。相対溶出濃度比はヘパリン５−ＰＷ ＦＰＬＣにおける（変異体の溶出NaCl濃度）／（ＴＣＦの溶出NaCl濃度）で算出した。又、n．d．は測定していないことを表す。ヘパリン−セファロースの試験において、RKRR2AAAA,KIKTKK27AIATAA,R42Aに顕著なヘパリン親和性の低下が見られた。又、ヘパリン−５ＰＷの試験では、ヘパリン−セファロースの結果と同様にヘパリン親和性が70％前後に低下していることが観察された。
〔実施例３〕
ＴＣＦおよびＴＣＦ変異体のin vitro肝細胞増殖活性
肝細胞増殖活性は、以下の方法により測定した。セグレンの方法（Method in cell biology Vol.13, p29（1976）Academic Press, New York）に従い、ウィスター系ラット（体重約200g）より肝実質細胞を単離した。この細胞を1.0×104個／50μl/ウェルで96ウェルプレート（ファルコン社製）にまき、37℃で一晩培養した。培地は10％牛胎児血清、10μMデキサメタゾンを含むウィリアムズＥ培地（フローラボラトリー社製）を使用した（以下基礎培地と略す）。24時間後、ＴＣＦあるいはＴＣＦ変異体を含んだ基礎培地を10μl添加し、さらに22時間培養を続けた。22時間後、3Ｈ−チミジン（アマシャム社製）を１μCi／ウェルとなるように添加してさらに２時間培養した。２時間後、細胞をＰＢＳで２回洗ったのち、0.5％トリプシンで細胞を剥がし、セルハーベスターによりガラスフィルターに回収した。各ウェルに取り込まれた放射能をマトリックス96（パッカード社製）により測定しＤＮＡ合成量とした。結果を第２図に示す。
ＴＣＦ抗原量2.5ng/mlでの生物活性を比べた場合、K54Aは約1.4倍、RGKD132AGAAは約2.0倍、R142Aは約1.6倍と生物活性の上昇している変異体が得られた。
さらに、ヘパリン結合性の低下している変異体について、精製した蛋白質をローリー法で定量し生物活性を最大増殖促進活性の50％の活性を与える蛋白質（ＥＤ50）を比較した（第３図及び第４図）。
その結果、RKRR2AAA,KIKTKK27AIATAAの２種の蛋白質は、蛋白質当たりの生物活性が天然型ＴＣＦに対して２倍以上、さらに詳しくは10倍以上上昇していることが認められた。
〔実施例４〕
ＴＣＦおよびＴＣＦ変異体のin vitro腎上皮細胞増殖活性
腎上皮細胞増殖活性は、以下の方法により測定した。アメリカオポッサムの腎上皮細胞株であるＯＫ細胞を、10％牛胎児血清を含むＤＭＥＭ培地中、1.0x104個/100μl/ウェルで９６ウェルプレートにまき、37℃で一晩培養した。一晩培養後、各ウェルを血清を含まないＤＭＥＭ培地で２−３回洗浄した後、各ウェルの培地を血清を含まないＤＭＥＭ培地100μlにかえ、37℃でさらに２晩培養した。２晩培養後、各ウェルの培地を血清を含まない新たなＤＭＥＭ培地50μlに交換し、そこに0.2％牛血清アルブミンを含んだＤＭＥＭ培地で希釈したＴＣＦあるいはＴＣＦ変異体を50μl添加し、さらに24時間培養を続けた。２４時間後、3Ｈ−チミジンを１μCiウェルとなるように添加してさらに２時間培養した。２時間後、細胞をＰＢＳで２回洗ったのち、0.5％トリプシンで細胞を剥離し、セルハーベスターによりガラスフィルターに回収した。各ウェルに取り込まれた放射能をマトリックス96により測定しＤＮＡ合成量とした。結果を第５図に示す。
この結果、RKRR2AAAA、KIKTKK27AIATAAとも天然型ＴＣＦと比べて、腎上皮細胞に対する蛋白質量当たりの生物活性が２倍以上上昇していることが認められた。
〔実施例５〕
ＴＣＦおよびＴＣＦ変異体のin vitro骨髄細胞増殖活性
骨髄細胞増殖活性は、以下の方法により測定した。マウス骨髄細胞株であるＮＦＳ−６０を、１０％牛胎児血清を含むＲＰＭＩ培地中、5.0x104個/50μl/ウェルで９６ウェルプレートにまき、さらに各ウェルに培地で希釈したＴＣＦあるいはＴＣＦ変異体を50μl添加し、３７℃で24時間培養した。24時間後、各ウェルに5mg/mlＭＴＴ（シグマ社製）を10μlずつ添加しさらに４時間培養した。４時間後、各ウェルに100μlの10％ＳＤＳ／10mM塩化アンモニウムを加え室温で一晩放置した。一晩放置後、イムノリーダーＮＪ-2000（インターメッド社製）で590nmでの吸光度を測定し増殖活性とした。結果を第６図に示す。
この結果、RKRR2AAAA、KIKTKK27AIATAAとも天然型ＴＣＦと比べて、骨髄細胞に対する蛋白質量当たりの生物活性が1/2-1/20に低下していることが認められた。
〔実施例６〕
ＴＣＦおよびＴＣＦ変異体のin vivo生物活性
in vivo生物活性は以下の方法により測定した。６週齢Wistar系雄ラットに0.1％Tween 20含有ＰＢＳに溶解したＴＣＦあるいはＴＣＦ変異体を一日２回、それぞれの濃度の試料を一回当たり２ml/kg体重で尾静脈より四日間投与した。最終投与翌日、エーテル麻酔下にて後大静脈より採血を行い、血清は血液を遠心分離（3000rpm、10分）して採取し、また血漿は、採血後直ちに血液にクエン酸ナトリウム（終濃度0.38％）を加えたのち、これを遠心分離（3000rpm、10分）して得た。得られた血清及び血漿を-30℃で凍結保存した後、血清中の総蛋白量、アルブミン量、不飽和鉄結合能、総コレステロール量、遊離コレステロール量、ＨＤＬ−コレステロール量およびリン脂質量は血清自動分析機（日立7150型自動分析装置）を用い、また血漿のプロトロンビン時間およびフィブリノーゲン量は全自動血液凝固測定装置ＫＣ40（アメルング社製）を用い測定した。またこれら測定には、以下の分析キットを使用した。総蛋白質量：オートセラ▲R▼ＴＰ、アルブミン量：オートセラ▲R▼ＡＬＢ、不飽和鉄結合能：クリニメイト▲R▼ＵＩＢＣ試薬、総コレステロール量：オートセラ▲R▼ＣＨＯ−２、遊離コレステロール量：オートセラ▲R▼Ｆ−ＣＨＯ−２、ＨＤＬ−コレステロール量：ＨＤＬ−Ｃ・２「第一」、リン脂質量：オートセラ▲R▼ＰＬ−２（以上全て第一化学薬品社製）、プロトロンビン時間：オーソブレーントロンボプラスチン（オーソダイアグスティック システムズ社製）、フィブリノゲン量：サンアッセイＦｉｂ（日東紡績社製）。そのうち代表的な例として、血清中の総蛋白量の変化を第７図に、ＨＤＬ−コレステロール量の変化を第８図に示した。
この結果を平行線検定したところ、総蛋白量の増加についてはRKRR2AAAAでは2.12倍、KIKTKK27AIATAAでは1.37倍の、ＨＤＬ−コレステロールの増加についてはRKRR2AAAAでは1.66倍、KIKTKK27AIATAAでは1.62倍の比活性を有していることが確認された。
産業上の利用可能性
本発明は、新規なＴＣＦ変異体を提供するものである。本発明のＴＣＦ変異体は、肝実質細胞に対する増殖活性及び／又は増殖促進活性を有し、各種肝疾患の治療剤及び抗腫瘍剤として有用である。
微生物への言及
１．pUC-TCF27
寄託機関：通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所
住所：日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号
寄託日：平成６年１１月１０日
（平成６年１１月１０日に寄託された微工研菌寄P-14623号(FERM P-14623)の原寄託より平成７年１０月２５日にブタペスト条約に基づく寄託に移管）
受託番号：FERM BP-5265
２．pUC-TCF2
寄託機関：通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所
住所：日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号
寄託日：平成６年１１月１０日
（平成６年１１月１０日に寄託された微工研菌寄P-14624号(FERM P-14624)の原寄託より平成７年１０月２５日にブタペスト条約に基づく寄託に移管）
受託番号：FERM BP-5266
３．pcTCF(S)/MC1061/P3
寄託機関：通商産業省工業技術院微生物工学工業技術研究所
住所：日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号
寄託日：平成２年７月１３日
（平成２年７月１３日に寄託された微工研菌寄P-11605号(FERM P-11605)の原寄託より平成３年７月１０日にブタペスト条約に基づく寄託に移管）
受託番号：FERM BP-3479
配列表
配列番号：１
配列の長さ：３１
配列の型：核酸
鎖の数：１
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ
配列の特徴：プライマーＰｓｔ０１
配列：
配列番号：２
配列の長さ：２５
配列の型：核酸
鎖の数：１
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ
配列の特徴：プライマーＴＣＦ４１５ Ｒ
配列：
配列番号：３
配列の長さ：３４
配列の型：核酸
鎖の数：１
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ
配列の特徴：プライマーＰ００２
配列：
配列番号：４
配列の長さ：３２
配列の型：核酸
鎖の数：１
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ
配列の特徴：プライマーＴＣＦＳａｌ−７７
配列：
配列番号：５
配列の長さ：３３
配列の型：核酸
鎖の数：１
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ
配列の特徴：プライマー2RKRR F
配列：
配列番号：６
配列の長さ：２３
配列の型：核酸
鎖の数：１
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ
配列の特徴：プライマーＴＣＦ９７７ Ｒ
配列：
配列番号：７
配列の長さ：３３
配列の型：核酸
鎖の数：１
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ
配列の特徴：プライマー2RKRR R
配列：
配列番号：８
配列の長さ：３５
配列の型：核酸
鎖の数：１
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ
配列の特徴：プライマー27KIKTKK F
配列：
配列番号：９
配列の長さ：３８
配列の型：核酸
鎖の数：１
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ
配列の特徴：プライマー27KIKTKK R
配列：
配列番号：１０
配列の長さ：２８
配列の型：核酸
鎖の数：１
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ
配列の特徴：54K F
配列：
配列番号：１１
配列の長さ：２８
配列の型：核酸
鎖の数：１
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ
配列の特徴：54K R
配列：
配列番号：１２
配列の長さ：３６
配列の型：核酸
鎖の数：１
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ
配列の特徴：プライマー132RGKD F
配列：
配列番号：１３
配列の長さ：３６
配列の型：核酸
鎖の数：１
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ
配列の特徴：プライマー132RGKD R
配列：
配列番号：１４
配列の長さ：２６
配列の型：核酸
鎖の数：１
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ
配列の特徴：プライマー142R F
配列：
配列番号：１５
配列の長さ：２６
配列の型：核酸
鎖の数：１
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ
配列の特徴：プライマー142R R
配列：
配列番号：１６
配列の長さ：２７
配列の型：核酸
鎖の数：１
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ
配列の特徴：プライマー42R F
配列：
配列番号：１７
配列の長さ：２７
配列の型：核酸
鎖の数：１
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ
配列の特徴：プライマー42R R
配列：
配列番号：１８
配列の長さ：７２３
配列の型：アミノ酸
鎖の数：１
配列の種類：蛋白質
配列の特徴：ＲＫＲＲ２ＡＡＡＡ
配列：
配列番号：１９
配列の長さ：７２３
配列の型：アミノ酸
鎖の数：１
トポロジー：直鎖状
配列の種類：蛋白質
配列の特徴：ＫＩＫＴＫＫ２７ＡＩＡＴＡＡ
配列：
本発明は、新規なアミノ酸配列を有するＴＣＦ変異体に関する。
詳しくは、天然型ＴＣＦのアミノ酸配列のＮ末端から第一グリングルまでに含まれる１以上のアミノ酸を変異させることにより得られる、ヘパリン親和性の低下及び／又は生物活性の上昇したＴＣＦ変異体に関する。
本発明ＴＣＦ変異体は、肝実質細胞に対する増殖活性及び／又は増殖促進活性を有し、各種肝疾患の治療剤及び抗腫瘍剤として有用である。
背景技術
ヒト細胞由来の繊維芽細胞が産生する腫瘍細胞障害性因子ＴＣＦ（ＴＣＦ-II）は、これまで報告された抗腫瘍性蛋白質とは異なる新規な抗腫瘍性物質であり、本発明者らは、この蛋白質をコードするｃＤＮＡのクローニングに成功し、その全アミノ酸配列を確定するとともに、その有用性を確認した（ＷＯ90/10651号公報）。ＴＣＦは、非還元下のＳＤＳ電気泳動による分子量測定では78000±2000及び／又は74000±2000の分子量を示し、還元した場合52000±2000の共通のバンドであるＡ鎖と、30000±2000及び／又は26000±2000のＢ鎖及びＣ鎖とを示す。このＴＣＦはヘパリン或いはヘパリン様物質に強い親和性を持つ蛋白質であり、強い抗腫瘍活性と正常細胞の増殖活性を合わせもち、さらに肝実質細胞の増殖因子であるＨＧＦの多様なファミリーの一種であることが確認された。即ち、ＴＣＦは抗腫瘍性因子であるだけでなく、肝実質細胞の増殖因子でもあることから肝切除後の肝臓再生の促進に有用であることが知られている。
従来より、ＴＣＦのファミリーである肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）について、その構造と機能という側面から多くの研究がなされてきている。しかしながら、現在までのところ20種近い欠失変異体と50種近い点変異変異体の報告がされているにもかかわらず（K.Matsumoto他，Biochem. Biophys. Res. Comm., vol.181, pp691-699（1991）；G.Hartmann他，Proc.Natl.Acad.Sci.USA, vol.89, pp11574-11587（1992）；N.A.Lokker他，EMBO J., vol.11, pp2503-2510（1992）；M.Okigaki他，Biochemistry, vol.31, pp9555-9561（1992）；N.A.Lokker他，Protein Engineering, vol.7, pp895-903（1994））、明らかに生物活性の上昇している変異体は得られていないのが現状である。
ＴＣＦはその生体内半減期が約２分と極めて短いことが知られており、各種疾患の治療剤として用いるには比較的多量の投与が必要であることが予想される。しかし、ＴＣＦの生物活性を上昇又は生体内半減期を延長させることにより、投与量を低減できると考えられる。生体内半減期の延長したＴＣＦ変異体はＷＯ94/14845号公報に開示されているが、生物活性の上昇したＴＣＦの変異体については、上述したＨＧＦ同様得られていないのが現状である。よって、本発明者らは、ＴＣＦの生物活性の上昇あるいは生体内半減期の延長されたＴＣＦ変異体を得るべく検討を行なった。すなわち、本発明者らは、天然型ＴＣＦのアミノ酸配列をコードするＤＮＡの塩基配列を変換し、このＤＮＡを発現させて、天然型のＴＣＦと異なるアミノ酸配列を有し、かつ生物活性の上昇及び／又は生体内半減期の延長された変異体を得るべく検討を行なった。従って、本発明は、生物活性が上昇したＴＣＦ変異体またはヘパリン親和性の低下により生体内半減期の延長されたＴＣＦ変異体を提供することを課題とする。
本発明者らは上記の状況に鑑み鋭意探索の結果、従来のＴＣＦ変異体とは異なるアミノ酸配列を有し、生物活性の上昇及び／又はヘパリン親和性の低下した新規なＴＣＦの変異体を見出すに至った。本発明により、蛋白量当たりの生物活性、即ち比活性が10倍以上に上昇したもの及び／又はヘパリン親和性の低下したＴＣＦ変異体が提供される。これは天然型のＴＣＦのアミノ酸を変異させることにより、生物活性を大幅に上昇させた初めてのものである。
発明の開示
本発明の目的は、天然型ＴＣＦのアミノ酸配列における、Ｎ末端から第一クリングルまでに含まれる１以上のアミノ酸を変異させることにより得られる、ヘパリン親和性の低下及び／又は生物活性の上昇した新規なＴＣＦ変異体を提供することにある。
さらに本発明の他の目的は、肝実質細胞に対する増殖活性及び／又は増殖促進活性を有し、各種肝疾患の治療剤及び抗腫瘍剤として有用な新規なＴＣＦ変異体を提供することにある。
蛋白質のある部分のアミノ酸配列に変異を導入し、得られた変異体と天然型を比べることによりその部分の働きを推定することができる。その蛋白質の構造が明らかになっていない場合、変異を導入することにより蛋白質の立体構造が変化することを防ぐため、極性を持ち蛋白質の表面に存在すると考えられるアミノ酸をAlaなどの立体構造に影響を与えないアミノ酸に置換する方法がしばしば用いられる。ある部分のアミノ酸配列を特異的に他のアミノ酸に置換するためには、他のアミノ酸をコードする塩基配列に置き換えたオリゴヌクレオチドを合成し、天然型ＴＣＦをコードするｃＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ（ポリメラーゼチェーンリアクション）法により部位特異的変異を導入したｃＤＮＡを調製することができる。このようにして得られたｃＤＮＡは適当な発現プロモーター(サイトメガロウィルス(CMV),SRα(Mole. Cell. Biol. vol.8, No.1 pp466-472(1988年)及び特開平1-277489号公報）を有したベクターに挿入し、哺乳動物細胞などの真核細胞をトランスフェクトし、この細胞を培養することにより、培養液から目的とするＴＣＦ変異体を回収、調製することができる。
ＴＣＦ変異体は、変異の導入位置、置換するアミノ酸の種類により多数の変異体が存在する。本発明においては６種類の変異体を調製した。これら変異体は変異導入前のアミノ酸配列、変異を導入した位置のＮ末端側のアミノ酸の番号、変異導入後に変化したアミノ酸配列を１文字標記で列記して、それぞれの変異体を特定する。例えば、Ｎ末端２番目からのArg-Lys-Arg-Argという配列を全てAlaに置換した変異体はRKRR2AAAA、またＮ末端２７番目からのLys-Ile-Lys-Thr-Lys-Lysという配列をAla-Ile-Ala-Thr-Ala-Alaという配列に置換した変異体はKIKTKK27AIATAAと表す。
本発明は、このような天然型ＴＣＦのアミノ酸配列のＮ末端から第一クリングルまでに含まれる１以上のアミノ酸を他のアミノ酸で置換し、変異させて得られる、ヘパリン親和性を低下させるかあるいは生物活性の上昇したＴＣＦ変異体に関する。
このような、ＴＣＦ変異体としては次のものを例示することができる。
(1) 天然型ＴＣＦのＮ末端２番目から５番目のアミノ酸配列-Arg-Lys-Arg-Arg-を-Ala-Ala-Ala-Ala-に変異させたＴＣＦの変異体。
(2) 天然型ＴＣＦのＮ末端２７番目からち３２番目のアミノ酸配列-Lys-Ile-Lys-Thr-Lys-Lys-を-Ala-Ile-Ala-Thr-Ala-Ala-に変異させたＴＣＦ変異体。
(3) 天然型ＴＣＦのＮ末端５４番目のアミノ酸-Lys-を-Ala-に変異させたＴＣＦ変異体。
(4) 天然型ＴＣＦのＮ末端１３２番目から１３５番目のアミノ酸配列-Arg-Gly-Lys-Asp-を-Ala-Gly-Ala-Ala-に変異させたＴＣＦ変異体。
(5) 天然型ＴＣＦのＮ末端１４２番目のアミノ酸-Arg-を-Ala-に変異させたＴＣＦ変異体
(6) 天然型ＴＣＦのＮ末端４２番目のアミノ酸-Arg-を-Ala-に変異させたＴＣＦ変異体。
これらのＴＣＦ変異体は天然型ＴＣＦにくらべて肝細胞増殖活性及び腎上皮細胞増殖活性がいちじるしく高まり、骨髄細胞増殖活性がいちじるしく低下したものとなる。
具体的には、実施例に示すように蛋白量当りの肝細胞増殖活性が天然型ＴＣＦの２倍以上、腎上皮細胞増殖活性が２倍以上高くなり、骨髄細胞増殖活性が1/2-1/20に低下する。
これらのＴＣＦ変異体は、天然ＴＣＦを精製し、これを用いて前記した通常行なわれている遺伝子操作によって変異体とすることによって得ることができる。
【図面の簡単な説明】
第１図は、精製したＴＣＦ及び本発明ＴＣＦ変異体のＳＤＳ電気泳動の模式図を示す。
第２図は、精製したＴＣＦ及び本発明ＴＣＦ変異体の肝実質細胞増殖作用を示す。縦軸の相対活性（％）は、10ng/mlにおけるＴＣＦの増殖活性を100％として、それに対する各試料の増殖活性の比で表した。
第３図は、精製したＴＣＦと変異体RKRR2AAAAの肝実質細胞増殖作用の比較を表す。
第４図は、精製したＴＣＦと変異体KIKTKK27AIATAAの肝実質細胞増殖作用の比較を表す。
第５図は、精製したＴＣＦと変異体RKRR2AAAAおよびKIKTKK27AIATAAの腎上皮細胞増殖作用の比較を表す。
第６図は、精製したＴＣＦと変異体RKRR2AAAAおよびKIKTKK27AIATAAの骨髄系細胞増殖作用の比較を表す。
第７図は、精製したＴＣＦと変異体RKRR2AAAAおよびKIKTKK27AIATAAを投与したラット血清中総蛋白量の変化を表す。
第８図は、精製したＴＣＦと変異体RKRR2AAAAおよびKIKTKK27AIATAAを投与したラット血清中ＨＤＬ−コレステロール量を表す。
発明を実施するための最良の形態
以下に実施例を示し本発明を詳細に説明する。しかし、これらは単に例示するのみであり、これらにより本発明は何ら限定されるものではない。
〔実施例１〕
ＷＯ92/01053号公報に開示された方法により得られたＴＣＦ発現プラスミド6.3kbを用いて、以下に示す方法により部位特異的変異を導入した。このプラスミドを含む大腸菌はpcTCF(S)/MC1061/P3として平成２年７月１３日付で工業技術院微生物工業技術研究所（現工業技術院生命工学工業技術研究所）に受託番号FERM BP-3479（平成３年７月１０日にFERM P-11605の原寄託よりブタペスト条約に基づく寄託に移管）として寄託されている。
Ｉ．鋳型プラスミドpcD TCF001の調製
以下の方法に従い、塩基番号３４からのPstI切断部位に変異を導入し、切断できない塩基配列に置換した。変異を持つプライマーPst01（配列番号１）と変異のないプライマーＴＣＦ415 R（配列番号２）の組み合わせおよび、変異を持つプライマーP002（配列番号３）と変異のないプライマーＴＣＦSal-77（配列番号４）との組み合わせでプラスミドpUC ＴＣＦ（プラスミドpUC18にＴＣＦのSalI/SphI断片を挿入したプラスミド）8ngを鋳型としたＰＣＲ反応を行った。反応液をマイクロコン100（アミコン社製）で分子ふるいにかけプライマーを除去したのち、２つのＰＣＲ産物を混合後、プライマーＴＣＦSal-77とＴＣＦ415Rで二段階目のＰＣＲ反応を行った。得られた産物を制限酵素BstPI/PstIで切断後、あらかじめ用意しておいたpUC ＴＣＦ BstPI/PstIラージフラグメントと混合しライゲーションキット（宝酒造社製）を用いてライゲーションした。ライゲーション反応液の一部を用い大腸菌ＤＨ５αを形質転換した。形質転換された大腸菌ＤＨ５αをアンピシリン50μg/mlを含むＬ培地で培養し、得られたアンピシリン耐性株から目的の構造を持つプラスミドを選びだした。このプラスミドを制限酵素SalI/SphIで切断し、あらかじめ用意しておいたnew pcＤＮＡI（pcＤＮＡIのマルチクローニングサイトを改変し、HindIII-SalI-BamHI-SphI-NotIクローニングサイトを持つもの）SalI/SphIラージフラグメントと混合しライゲーションキットを用いて挿入した。反応液を用い大腸菌ＭＣ1061/P3（インビトローゲン社製）を形質転換した。形質転換された大腸菌ＭＣ1061/P3を、アンピシリン50μg/ml及びテトラサイクリン7.5μg/mlを含むＬ培地で培養し、得られたアンピシリン−テトラサイクリン耐性株からプラスミドＤＮＡを調製し、ＤＮＡシークエンサー（パーキン−エルマー社製）により塩基配列を決定し、目的の構造をもつプラスミドpcD ＴＣＦ001を得た。得られたプラスミドを用いて、ＴＣＦ変異体の調製を行った。
II．ＴＣＦ変異体の発現ベクターの構築及び形質転換大腸菌の作製
i．RKRR2AAAA発現ベクターの構築及び形質転換大腸菌の作製
２段階のＰＣＲ反応により、RKRR2AAAA変異体をコードするｃＤＮＡ発現プラスミドの構築を行った。１段階目のＰＣＲ反応には、変異を持つプライマー2RKRR F（配列番号５）と変異のないプライマーＴＣＦ977 R（配列番号６）を用いた反応、及び変異を持つプライマー2RKRR R（配列番号７）と変異のないプライマーＴＣＦSal-77（配列番号４）を用いた反応を行った。鋳型はどちらも4ngのpc ＴＣＦ001を使用した。反応終了後、二つの反応液を混ぜ、マイクロコン100で精製したのち、20分の１量を２段階目のＰＣＲ反応の鋳型として供した。プライマーはＴＣＦSal-77とＴＣＦ977Rを用いた。この反応液をマイクロコン100で精製したのち、制限酵素BstPI/EcoRVで切断し、ＴＣＦのｃＤＮＡをSRα発現ベクターに組み込んだプラスミドをあらかじめBstPI/EcoRVで切断しておいた断片にライゲーションキットを用いて挿入した。ライゲーション反応液を用い大腸菌ＤＨ５αを形質転換し、得られたアンピシリン耐性株から前記したと同様の方法により目的のクローンを得た。得られたクローンからプラスミドＤＮＡを調製し、ＤＮＡシークエンサー（パーキン−エルマー社製）により塩基配列を決定した。又、このプラスミドのｃＤＮＡの一部を制限酵素EcoRV/BstPIで切り出したのち、pUCＴＣＦを制限酵素EcoRV/BstPIであらかじめ切断しておいた断片に組み込み、大腸菌ＤＨ５αに形質転換した。このプラスミドを含む大腸菌は、pUC-TCF2として平成６年11月10日付で工業技術院生命工学工業技術研究所に受託番号FERM BP-5266（平成７年10月25日にFERM P-14624の原寄託よりブタペスト条約に基づく寄託に移管）として寄託されている。
ii．KIKTKK27AIATAA発現ベクターの構築及び形質転換大腸菌の作製
２段階のＰＣＲ反応により、KIKTKK27AIATAA変異体をコードするｃＤＮＡ発現プラスミドの構築を行った。１段階目のＰＣＲ反応には、変異を持つプライマー27KIKTKK F（配列番号８）と変異のないプライマーＴＣＦ977 R（配列番号６）を用いた反応、及び変異を持つプライマー27KIKTKK R（配列番号９）と変異のないプライマーＴＣＦSal-77（配列番号４）を用いた反応を行った。鋳型はどちらも4ngのpcD ＴＣＦ001を使用した。反応終了後、二つの反応液を混ぜ、マイクロコン100で精製したのち、20分の１量を２段階目のＰＣＲ反応の鋳型として供した。プライマーはＴＣＦSal-77とＴＣＦ977 Rを用いた。この反応液をマイクロコン100で精製したのち、制限酵素BstPI/EcoRVで切断し、ＴＣＦのｃＤＮＡをSRα発現ベクターに組み込んだプラスミドをあらかじめ制限酵素BstPI/EcoRVで切断しておいた断片にライゲーションキットを用いて挿入した。ライゲーション反応液を用い大腸菌ＤＨ５αに形質転換し、得られたアンピシリン耐性株から前記したと同様の方法により目的のクローンを得た。得られたクローンからプラスミドＤＮＡを調製し、ＤＮＡシークエンサーにより塩基配列を決定した。又、このプラスミドのｃＤＮＡの一部を制限酵素EcoRV/BstPIで切り出したのち、pUC ＴＣＦを制限酵素EcoRV/BstPIであらかじめ切断しておいた断片に組み込み、大腸菌ＤＨ５αに形質転換した。このプラスミドを含む大腸菌は、pUC-TCF27として平成６年11月10日付で工業技術院生命工学工業技術研究所に受託番号FERM BP-5265（平成７年10月25日にFERM P-14623の原寄託よりブタペスト条約に基づく寄託に移管）として寄託されている。
iii．K54A発現ベクターの構築及び形質転換大腸菌の作製
２段階のＰＣＲ反応により、K54A変異体をコードするｃＤＮＡ発現プラスミドの構築を行った。１段階目のＰＣＲ反応には、変異を持つプライマー54K F（配列番号１０）と変異のないプライマーＴＣＦ977 R（配列番号６）を用いた反応、及び変異を持つプライマー54K R（配列番号１１）とＴＣＦSal-77（配列番号４）を用いた反応を行った。鋳型はどちらも4ngのpcD ＴＣＦ001を使用した。反応終了後、二つの反応液を混ぜ、マイクロコン100で精製したのち、20分の１量を２段階目のＰＣＲ反応の鋳型として供した。プライマーはＴＣＦSal-77とＴＣＦ977 Rを用いた。この反応液をマイクロコン100で精製したのち、制限酵素BstPI/Eco RVで切断し、ＴＣＦのｃＤＮＡをSRα発現ベクターに組み込んだプラスミドをあらかじめ制限酵素BstPI/EcoRVで切断しておいた断片にライゲーションキットを用いて挿入した。ライゲーション反応液を用い大腸菌ＤＨ５αに形質転換し、得られたアンピシリン耐性株から前記したと同様の方法により目的のクローンを得た。得られたクローンからプラスミドＤＮＡを調製し、ＤＮＡシークエンサーにより塩基配列を決定した。
iv．RGKD132AGAA発現ベクターの構築及び形質転換大腸菌の作製
２段階のＰＣＲ反応により、RGKD132AGAA変異体をコードするｃＤＮＡ発現プラスミドの構築を行った。１段階目のＰＣＲ反応には、変異を持つプライマー132RGKD F（配列番号１２）と変異のないプライマーＴＣＦ977 R（配列番号６）を用いた反応、及び変異を持つプライマー132RGKD R（配列番号１３）とＴＣＦSal-77（配列番号４）を用いた反応を行った。鋳型はどちらも4ngのpcD ＴＣＦ001を使用した。反応終了後、二つの反応液を混ぜ、マイクロコン100で精製したのち、20分の１量を２段階目のＰＣＲ反応の鋳型として供した。プライマーはＴＣＦSal-77とＴＣＦ977 Rを用いた。この反応液をマイクロコン100で精製したのち、制限酵素BstPI/EcoRVで切断し、ＴＣＦのｃＤＮＡをSRα発現ベクターに組み込んだプラスミドをあらかじめ制限酵素BstPI/EcoRVで切断しておいた断片にライゲーションキットを用いて挿入した。ライゲーション反応液を用い大腸菌ＤＨ５αに形質転換し、得られたアンピシリン耐性株から前記したと同様の方法により目的のクローンを得た。得られたクローンからプラスミドＤＮＡを調製し、ＤＮＡシークエンサーにより塩基配列を決定した。
v．R142A発現ベクターの構築及び形質転換大腸菌の作製
２段階のＰＣＲ反応により、R142A変異体をコードするｃＤＮＡ発現プラスミドの構築を行った。１段階目のＰＣＲ反応には、変異を持つプライマー142R F（配列番号１４）と変異のないプライマーＴＣＦ977 R（配列番号６）を用いた反応、及び変異を持つプライマー142R R（配列番号１５）とＴＣＦSal-77（配列番号４）を用いた反応を行った。鋳型はどちらも4ngのpcD ＴＣＦ001を使用した。反応終了後、二つの反応液を混ぜ、マイクロコン100で精製したのち、20分の１量を２段階目のＰＣＲ反応の鋳型として供した。プライマーはＴＣＦSal-77とＴＣＦ977 Rを用いた。この反応液をマイクロコン100で精製したのち、制限酵素BstPI/EcoRVで切断し、ＴＣＦのｃＤＮＡをSRα発現ベクターに組み込んだプラスミドをあらかじめ制限酵素BstPI/EcoRVで切断しておいた断片にライゲーションキットを用いて挿入した。ライゲーション反応液を用い大腸菌ＤＨ５αに形質転換し、得られたアンピシリン耐性株から前記したと同様の方法により目的のクローンを得た。得られたクローンからプラスミドＤＮＡを調製し、ＤＮＡシークエンサーにより塩基配列を決定した。
vi．R42A発現ベクターの構築及び形質転換大腸菌の作製
２段階のＰＣＲ反応により、R42A変異体をコードするｃＤＮＡ発現プラスミドの構築を行った。１段階目のＰＣＲ反応には、変異を持つプライマー42R F（配列番号１６）と変異のないプライマーＴＣＦ977 R（配列番号６）を用いた反応、及び変異を持つプライマー42R R（配列番号１７）とＴＣＦSal-77（配列番号４）を用いた反応を行った。鋳型はどちらも4ngのpcD ＴＣＦ001を使用した。反応終了後、二つの反応液を混ぜ、マイクロコン100で精製したのち、20分の１量を２段階目のＰＣＲ反応の鋳型として供した。プライマーはＴＣＦSal-77とＴＣＦ977 Rを用いた。この反応液をマイクロコン100で精製したのち、制限酵素BstPI/EcoRVで切断し、ＴＣＦのｃＤＮＡをSRα発現ベクターに組み込んだプラスミドをあらかじめ制限酵素BstPI/EcoRVで切断しておいた断片にライゲーションキットを用いて挿入した。ライゲーション反応液を用い大腸菌ＤＨ５αに形質転換し、得られたアンピシリン耐性株から前記したと同様の方法により目的のクローンを得た。得られたクローンからプラスミドＤＮＡを調製し、ＤＮＡシークエンサーにより塩基配列を決定した。
III.ＴＣＦ変異体発現プラスミドの調製と精製
上記の発現ベクターをもつ６種類の形質転換大腸菌を、50μg/mlのアンピシリンを含むＬ培地（400ml）中37℃で振盪培養し、ＯＤ600が1.0になったところで終濃度が0.3mg/mlとなるようにスペクチノマイシン（シグマ社製）を添加し、一晩培養した。Maniatisの方法（Molecular Cloning 2nd ed. pp 1.21-1.52 (1989), Cold Spring Harbor Laboratory）に従いアルカリＳＤＳ法によりプラスミドＤＮＡを分離し、塩化セシウム密度勾配遠心法によりＴＣＦ発現プラスミド６種を精製した。
IV．ＴＣＦ変異体発現プラスミドの動物細胞への導入
すべての変異体発現プラスミドはＣＨＯ細胞に導入した。２×106個のＣＨＯ細胞を１０％牛胎児血清（ギブコ社製）を含んだＩＭＤＭ培地（ギブコ社製）0.8mlに懸濁し、あらかじめ200μgの発現プラスミドと10μgのブラストサイジン耐性遺伝子発現プラスミドpSV2 bsr（フナコシ社製）を25μlのＴＥ（10mM Tris-HCl(pH8.0)-1mM ＥＤＴＡ）に溶かしておいた溶液を、さらにその細胞溶液に懸濁した。この懸濁液を330V, 960μFの条件でエレクトロポレーションを行った。10分間室温で放置したのち、10mlの培地に懸濁し２日間炭酸ガスインキュベーター（５％CO2）中37℃で培養した。２日後培養上清を回収し、抗ＴＣＦモノクローナル抗体を用いたエンザイムアッセイ（ＥＩＡ）（N.Shima他，Gastroenterologia Japonica, Vol.26, No.4, pp 477-482(1991)）によりＴＣＦ変異体の発現量を確認したのち、生物活性測定用の試料とした。また細胞はトリプシン（ギブコ社製）処理によりフラスコ底面より剥がし、生細胞を数えたのち、10,000個／ウェルになるように96ウェルプレート（Nunc社製）にまき、５μg/mlのブラストサイジン（フナコシ社製）を含んだ選択培地200μl/ウェル中で２〜３週間培養した。２〜３週後、ウェルあたり50μlずつ取り、ＥＩＡによりＴＣＦ変異体の発現の有無を調べた。発現の確認されたクローンは、12ウェルプレート、25cm2フラスコ等を用いて順次細胞数を増やしていった。以上の操作によりＣＨＯ細胞でのＴＣＦ変異体生産細胞を樹立した。
Ｖ．ＴＣＦ変異体生産細胞の大量培養
75cm2フラスコ中でコンフルエントになった生産細胞をトリプシン処理により剥がした後、その細胞を225cm2フラスコ10枚に移し、フラスコ１枚当たり100mlの培地中で１週間培養し培養上清を回収した。この操作を１〜２回繰り返し、１〜２リットルの培養液を得た。
VI．ＴＣＦ変異体の精製
以下に示す３段階の方法で精製した。
i.ヘパリン−セファロース ＣＬ−６Ｂ
ＴＣＦ変異体を発現しているＣＨＯ細胞の培養液１〜２リットルを、2,000rpm×10分の遠心後、0.45μmのフィルター（ゲルマンサイエンス社製）を通し不溶物を除いたのち、0.3M NaClと0.01％ Tween20を含む10mM Tris-HCl(pH 7.5)で平衡化したヘパリン−セファロースＣＬ−６Ｂカラム（25mmX120mm，ファルマシア社製）に４ml／分の流速で通液し、ＴＣＦ変異体をカラムに吸着させた。約500mlの平衡化緩衝液で洗浄したのち、2M NaClと0.01％Tween 20を含む10mM Tris-HCl(pH 7.5)で溶出した。４mlずつフラクションコレクターで分画し、280nmに吸収をもつ画分を回収した。
ii．Ｍｏｎｏ Ｓ ＦＰＬＣ
2M NaClで溶出させたＴＣＦ変異体を含む画分を0.15M NaClを含む10mMリン酸緩衝液（pH 7.0）で透析し、12,000rpm×90分の遠心で不溶物を除いたのち、0.15M NaClと0.01％Tween 20を含む10mMリン酸緩衝液（pH 7.0）で平衡化させたMonoＳカラム（5mmX50mm，ファルマシア社製）に１ml／分で通液し、ＴＣＦ変異体をカラムに吸着させた。約30mlの平衡化緩衝液で洗浄したのち、流速を0.5ml／分に変え、60分間で直線的にＮａＣｌ濃度を1.0Ｍに高めることにより、ＴＣＦ変異体を溶出させた。0.5mlずつフラクションコレクターで分画し、280nmの吸収およびＥＩＡによりＴＣＦ変異体の溶出された画分を確認し、回収した。
iii.ヘパリン５−ＰＷ ＦＰＬＣ
MonoＳで得られたＴＣＦ変異体を含む画分に２倍量の0.01％Tween 20を含む10mM Tris-HCl(pH 7.5)を加え、0.3M NaClと0.01％Tween 20を含む10mM Tris-HCl(pH 7.5)で平衡化させたヘパリン５−ＰＷカラム（5mmX75mm，トーソー社製）に１ml／分の流速で通液させ、ＴＣＦ変異体をカラムに吸着させた。約30mlの平衡化緩衝液で洗浄後、流速を0.5ml／分に変え、60分間で直線的にNaCl濃度を2.0Mに高めることによりＴＣＦ変異体を溶出させた。0.5mlずつフラクションコレクターで分画し、280nmの吸収およびEIAによりＴＣＦ変異体の溶出された画分を確認し、回収した。得られたＴＣＦ変異体は0.01％Tween 20を含むＰＢＳ（ＴＰＢＳ）に対し透析し最終精製品とした。最終精製品は、ローリー法により蛋白質量を定量した。ＴＣＦ変異体RKRR2AAAAのアミノ酸配列を配列表配列番号１８、変異体KIKTKK27AIATAAのアミノ酸配列を配列番号１９にそれぞれ示す。
VII．精製ＴＣＦ変異体のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動
精製したＴＣＦ変異体200ngをＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動に供した。後述のごとく10倍以上の生物活性の上昇が見られたＴＣＦ変異体であるRKRR2AAAA,KIKTKK27AIATAAおよび天然型ＴＣＦの電気泳動パターンの模式図を第１図に示した。還元状態（β−メルカプトエタノール存在下）及び非還元状態（β−メルカプトエタノール非存在下）とも三者間に違いは見られなかった。さらに、いずれのＴＣＦ変異体とも構造から推測されるバンド以外は何も検出されなかった。
〔実施例２〕
ＴＣＦおよびＴＣＦ変異体のヘパリン親和性
I.ヘパリン−セファロースＣＬ−６Ｂ
各種ＴＣＦ変異体を発現しているＣＨＯ細胞の培養液10mlを、1,200g×10分の遠心後、0.22μmのフィルター（ミリポア社製）を通すことにより不溶物を除いたのち、ＴＰＢＳで平衡化させたヘパリン−セファロースＣＬ−６Ｂカラム（5mmX5mm；ファルマシア社製）に通してＴＣＦ変異体をカラムに吸着させた。３mlのＴＰＢＳで洗浄後、0.2〜3.0MのNaClを含んだＴＰＢＳ１mlずつで段階的塩濃度を上げることにより溶出し、その溶出液のＴＣＦ変異体濃度をＥＩＡで定量し溶出塩濃度を決定し、その変異体のヘパリン親和性とした。
II．ヘパリン５−ＰＷ ＦＰＬＣ
各種ＴＣＦ変異体を発現しているＣＨＯ細胞の培養液30〜60mlを1,000g×10分の遠心後、0.22μmのフィルターを通すことにより不溶物を除いたのち、0.01％Tween 20を含む20mM Tris-HCl緩衝液（ｐＨ7.5）で平衡化させたヘパリン５−ＰＷカラムに1.0ml／分の流速で通し、ＴＣＦ変異体をカラムに吸着させた。約20mlの平衡化緩衝液でカラムを洗浄したのち、流速を0.5ml／分に変え45分間で直線的にNaCl濃度を1.5Mに高めることによりＴＣＦ変異体を溶出した。このとき0.5mlずつフラクションコレクターで分画し、各画分のＴＣＦ変異体濃度をＥＩＡにより定量することで溶出塩濃度を決定し、その変異体のヘパリン親和性とした。
これらＴＣＦ変異体のヘパリン親和性の結果を第１表に示す。ヘパリンセファロース（heparin-Sepharose）溶出NaCl濃度値は、ＴＣＦ変異体の最も多く溶出された濃度を表している。相対溶出濃度比はヘパリン５−ＰＷ ＦＰＬＣにおける（変異体の溶出NaCl濃度）／（ＴＣＦの溶出NaCl濃度）で算出した。又、n．d．は測定していないことを表す。ヘパリン−セファロースの試験において、RKRR2AAAA,KIKTKK27AIATAA,R42Aに顕著なヘパリン親和性の低下が見られた。又、ヘパリン−５ＰＷの試験では、ヘパリン−セファロースの結果と同様にヘパリン親和性が70％前後に低下していることが観察された。
ＴＣＦおよびＴＣＦ変異体のin vitro肝細胞増殖活性
肝細胞増殖活性は、以下の方法により測定した。セグレンの方法（Method in cell biology Vol.13, p29（1976）Academic Press, New York）に従い、ウィスター系ラット（体重約200g）より肝実質細胞を単離した。この細胞を1.0×104個／50μl/ウェルで96ウェルプレート（ファルコン社製）にまき、37℃で一晩培養した。培地は10％牛胎児血清、10μMデキサメタゾンを含むウィリアムズＥ培地（フローラボラトリー社製）を使用した（以下基礎培地と略す）。24時間後、ＴＣＦあるいはＴＣＦ変異体を含んだ基礎培地を10μl添加し、さらに22時間培養を続けた。22時間後、3Ｈ−チミジン（アマシャム社製）を１μCi／ウェルとなるように添加してさらに２時間培養した。２時間後、細胞をＰＢＳで２回洗ったのち、0.5％トリプシンで細胞を剥がし、セルハーベスターによりガラスフィルターに回収した。各ウェルに取り込まれた放射能をマトリックス96（パッカード社製）により測定しＤＮＡ合成量とした。結果を第２図に示す。
ＴＣＦ抗原量2.5ng/mlでの生物活性を比べた場合、K54Aは約1.4倍、RGKD132AGAAは約2.0倍、R142Aは約1.6倍と生物活性の上昇している変異体が得られた。
さらに、ヘパリン結合性の低下している変異体について、精製した蛋白質をローリー法で定量し生物活性を最大増殖促進活性の50％の活性を与える蛋白質（ＥＤ50）を比較した（第３図及び第４図）。
その結果、RKRR2AAA,KIKTKK27AIATAAの２種の蛋白質は、蛋白質当たりの生物活性が天然型ＴＣＦに対して２倍以上、さらに詳しくは10倍以上上昇していることが認められた。
〔実施例４〕
ＴＣＦおよびＴＣＦ変異体のin vitro腎上皮細胞増殖活性
腎上皮細胞増殖活性は、以下の方法により測定した。アメリカオポッサムの腎上皮細胞株であるＯＫ細胞を、10％牛胎児血清を含むＤＭＥＭ培地中、1.0x104個/100μl/ウェルで９６ウェルプレートにまき、37℃で一晩培養した。一晩培養後、各ウェルを血清を含まないＤＭＥＭ培地で２−３回洗浄した後、各ウェルの培地を血清を含まないＤＭＥＭ培地100μlにかえ、37℃でさらに２晩培養した。２晩培養後、各ウェルの培地を血清を含まない新たなＤＭＥＭ培地50μlに交換し、そこに0.2％牛血清アルブミンを含んだＤＭＥＭ培地で希釈したＴＣＦあるいはＴＣＦ変異体を50μl添加し、さらに24時間培養を続けた。２４時間後、3Ｈ−チミジンを１μCiウェルとなるように添加してさらに２時間培養した。２時間後、細胞をＰＢＳで２回洗ったのち、0.5％トリプシンで細胞を剥離し、セルハーベスターによりガラスフィルターに回収した。各ウェルに取り込まれた放射能をマトリックス96により測定しＤＮＡ合成量とした。結果を第５図に示す。
この結果、RKRR2AAAA、KIKTKK27AIATAAとも天然型ＴＣＦと比べて、腎上皮細胞に対する蛋白質量当たりの生物活性が２倍以上上昇していることが認められた。
〔実施例５〕
ＴＣＦおよびＴＣＦ変異体のin vitro骨髄細胞増殖活性
骨髄細胞増殖活性は、以下の方法により測定した。マウス骨髄細胞株であるＮＦＳ−６０を、１０％牛胎児血清を含むＲＰＭＩ培地中、5.0x104個/50μl/ウェルで９６ウェルプレートにまき、さらに各ウェルに培地で希釈したＴＣＦあるいはＴＣＦ変異体を50μl添加し、３７℃で24時間培養した。24時間後、各ウェルに5mg/mlＭＴＴ（シグマ社製）を10μlずつ添加しさらに４時間培養した。４時間後、各ウェルに100μlの10％ＳＤＳ／10mM塩化アンモニウムを加え室温で一晩放置した。一晩放置後、イムノリーダーＮＪ-2000（インターメッド社製）で590nmでの吸光度を測定し増殖活性とした。結果を第６図に示す。
この結果、RKRR2AAAA、KIKTKK27AIATAAとも天然型ＴＣＦと比べて、骨髄細胞に対する蛋白質量当たりの生物活性が1/2-1/20に低下していることが認められた。
〔実施例６〕
ＴＣＦおよびＴＣＦ変異体のin vivo生物活性
in vivo生物活性は以下の方法により測定した。６週齢Wistar系雄ラットに0.1％Tween 20含有ＰＢＳに溶解したＴＣＦあるいはＴＣＦ変異体を一日２回、それぞれの濃度の試料を一回当たり２ml/kg体重で尾静脈より四日間投与した。最終投与翌日、エーテル麻酔下にて後大静脈より採血を行い、血清は血液を遠心分離（3000rpm、10分）して採取し、また血漿は、採血後直ちに血液にクエン酸ナトリウム（終濃度0.38％）を加えたのち、これを遠心分離（3000rpm、10分）して得た。得られた血清及び血漿を-30℃で凍結保存した後、血清中の総蛋白量、アルブミン量、不飽和鉄結合能、総コレステロール量、遊離コレステロール量、ＨＤＬ−コレステロール量およびリン脂質量は血清自動分析機（日立7150型自動分析装置）を用い、また血漿のプロトロンビン時間およびフィブリノーゲン量は全自動血液凝固測定装置ＫＣ40（アメルング社製）を用い測定した。またこれら測定には、以下の分析キットを使用した。総蛋白質量：オートセラ▲R▼ＴＰ、アルブミン量：オートセラ▲R▼ＡＬＢ、不飽和鉄結合能：クリニメイト▲R▼ＵＩＢＣ試薬、総コレステロール量：オートセラ▲R▼ＣＨＯ−２、遊離コレステロール量：オートセラ▲R▼Ｆ−ＣＨＯ−２、ＨＤＬ−コレステロール量：ＨＤＬ−Ｃ・２「第一」、リン脂質量：オートセラ▲R▼ＰＬ−２（以上全て第一化学薬品社製）、プロトロンビン時間：オーソブレーントロンボプラスチン（オーソダイアグスティック システムズ社製）、フィブリノゲン量：サンアッセイＦｉｂ（日東紡績社製）。そのうち代表的な例として、血清中の総蛋白量の変化を第７図に、ＨＤＬ−コレステロール量の変化を第８図に示した。
この結果を平行線検定したところ、総蛋白量の増加についてはRKRR2AAAAでは2.12倍、KIKTKK27AIATAAでは1.37倍の、ＨＤＬ−コレステロールの増加についてはRKRR2AAAAでは1.66倍、KIKTKK27AIATAAでは1.62倍の比活性を有していることが確認された。
産業上の利用可能性
本発明は、新規なＴＣＦ変異体を提供するものである。本発明のＴＣＦ変異体は、肝実質細胞に対する増殖活性及び／又は増殖促進活性を有し、各種肝疾患の治療剤及び抗腫瘍剤として有用である。
微生物への言及
１．pUC-TCF27
寄託機関：通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所
住所：日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号
寄託日：平成６年１１月１０日
（平成６年１１月１０日に寄託された微工研菌寄P-14623号(FERM P-14623)の原寄託より平成７年１０月２５日にブタペスト条約に基づく寄託に移管）
受託番号：FERM BP-5265
２．pUC-TCF2
寄託機関：通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所
住所：日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号
寄託日：平成６年１１月１０日
（平成６年１１月１０日に寄託された微工研菌寄P-14624号(FERM P-14624)の原寄託より平成７年１０月２５日にブタペスト条約に基づく寄託に移管）
受託番号：FERM BP-5266
３．pcTCF(S)/MC1061/P3
寄託機関：通商産業省工業技術院微生物工学工業技術研究所
住所：日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号
寄託日：平成２年７月１３日
（平成２年７月１３日に寄託された微工研菌寄P-11605号(FERM P-11605)の原寄託より平成３年７月１０日にブタペスト条約に基づく寄託に移管）
受託番号：FERM BP-3479
配列表
配列番号：１
配列の長さ：３１
配列の型：核酸
鎖の数：１
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ
配列の特徴：プライマーＰｓｔ０１
配列：
配列の長さ：２５
配列の型：核酸
鎖の数：１
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ
配列の特徴：プライマーＴＣＦ４１５ Ｒ
配列：
配列の長さ：３４
配列の型：核酸
鎖の数：１
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ
配列の特徴：プライマーＰ００２
配列：
配列の長さ：３２
配列の型：核酸
鎖の数：１
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ
配列の特徴：プライマーＴＣＦＳａｌ−７７
配列：
配列の長さ：３３
配列の型：核酸
鎖の数：１
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ
配列の特徴：プライマー2RKRR F
配列：
配列の長さ：２３
配列の型：核酸
鎖の数：１
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ
配列の特徴：プライマーＴＣＦ９７７ Ｒ
配列：
配列の長さ：３３
配列の型：核酸
鎖の数：１
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ
配列の特徴：プライマー2RKRR R
配列：
配列の長さ：３５
配列の型：核酸
鎖の数：１
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ
配列の特徴：プライマー27KIKTKK F
配列：
配列の長さ：３８
配列の型：核酸
鎖の数：１
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ
配列の特徴：プライマー27KIKTKK R
配列：
配列の長さ：２８
配列の型：核酸
鎖の数：１
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ
配列の特徴：54K F
配列：
配列の長さ：２８
配列の型：核酸
鎖の数：１
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ
配列の特徴：54K R
配列：
配列の長さ：３６
配列の型：核酸
鎖の数：１
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ
配列の特徴：プライマー132RGKD F
配列：
配列の長さ：３６
配列の型：核酸
鎖の数：１
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ
配列の特徴：プライマー132RGKD R
配列：
配列の長さ：２６
配列の型：核酸
鎖の数：１
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ
配列の特徴：プライマー142R F
配列：
配列の長さ：２６
配列の型：核酸
鎖の数：１
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ
配列の特徴：プライマー142R R
配列：
配列の長さ：２７
配列の型：核酸
鎖の数：１
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ
配列の特徴：プライマー42R F
配列：
配列の長さ：２７
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トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ
配列の特徴：プライマー42R R
配列：
配列の長さ：７２３
配列の型：アミノ酸
鎖の数：１
配列の種類：蛋白質
配列の特徴：ＲＫＲＲ２ＡＡＡＡ
配列：
配列の長さ：７２３
配列の型：アミノ酸
鎖の数：１
トポロジー：直鎖状
配列の種類：蛋白質
配列の特徴：ＫＩＫＴＫＫ２７ＡＩＡＴＡＡ
配列：
Claims (7)
- 配列表配列番号18に記載されるアミノ酸配列で表わされる腫瘍細胞傷害性因子TCF変異体。
- 配列表配列番号19に記載されるアミノ酸配列で表わされる腫瘍細胞傷害性因子TCF変異体。
- 蛋白量当りの肝細胞増殖活性が、天然型腫瘍細胞傷害性因子TCFの２倍以上である請求項１または２記載の腫瘍細胞傷害性因子TCF変異体。
- 蛋白量当りの腎上皮細胞増殖活性が、天然型腫瘍細胞傷害性因子TCFの２倍以上である請求項１または２記載の腫瘍細胞傷害性因子TCF変異体。
- 蛋白量当りの骨髄細胞増殖活性が、天然型腫瘍細胞傷害性因子TCFの1/2−1/20に低下している請求項１または２記載の腫瘍細胞傷害性因子TCF変異体。
- 寄託番号FERM BP-5265として寄託されている大腸菌が担持する発現プラスミドによってコードされている、腫瘍細胞障害性因子TCF変異体。
- 寄託番号FERM BP-5266として寄託されている大腸菌が担持する発現プラスミドによってコードされている、腫瘍細胞障害性因子TCF変異体。
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