NO319022B1

NO319022B1 - Tumorcytotoksisk-faktor-II-mutanter

Info

Publication number: NO319022B1
Application number: NO19963552A
Authority: NO
Inventors: Kanji Higashio; Kyoji Yamaguchi; Akihiko Murakami; Masaaki Goto; Masatsugu Ueda; Fumie Kobayashi; Masahiko Kinosaki; Yasushi Yamashita
Original assignee: Daiichi Seiyaku Co
Priority date: 1994-12-27
Filing date: 1996-08-26
Publication date: 2005-06-06
Also published as: NO963552L; EP1275718A3; FI116223B; CA2183856A1; WO1996020214A1; EP0757994A4; AU698221B2; ATE248913T1; CA2183856C; DE69531673T2; EP0757994A1; HU9602174D0; HUT75236A; EP0757994B1; JP3699482B2; US20020165358A1; DK0757994T3; KR100294328B1; FI963313A0; KR970701206A

Description

Oppfinnelsens område

Foreliggende oppfinnelse angår TCF-mutanter omfattende en ny aminosyresekvens, nærmere bestemt TCF-mutanter erholdt ved mutagenese av én eller flere aminosyrer i sekvensen fra N-terminalen til den første kringle i nativt TCF, og som oppviser redusert affinitet overfor heparin og/eller forhøyet biologisk aktivitet.

TCF-mutantene ifølge foreliggende oppfinnelse som oppviser proliferativ aktivitet og vekststimulerende aktivitet i hepatocytter, er fordelaktige for behandling av forskjellige leversykdommer og som et antitumormiddel.

Oppfinnelsens bakgrunn

Tumorcytotoksisk faktor (TCF-II) produsert i humane fibroblastceller er et nytt antitumormiddel som er forskjellig fra alle hittil rapporterte antitumorproteiner. Ved foreliggende oppfinnelse har det lyktes å klone cDNA som koder for proteinet ifølge foreliggende oppfinnelse, den totale aminosyresekvens derav er bestemt og anvendeligheten derav er bekreftet (WO 90/10651). Molekylvekten av TCF ble bestemt til 78 000 ± 2 000, eller 74 000 ± 2 000, ifølge resultatene fra SDS-elektroforese under ikke-reduserende betingelser, mens resultatene under reduserende betingelser indikerte en A-kjede med et felles bånd med molekylvekt 52 000 ± 2 000, en B-kjede på 30 000 ± 2 000 og/eller en C-kjede på 26 000 ± 2 000. TCF er et protein som har høy.affinitet overfor heparin eller heparinlignende stoffer og oppviser høy antitumor-aktivitet mot tumorceller og proliferativ aktivitet overfor normale celler. Det ble videre bekreftet at TCF tilhører en bred familie av HGF som er hepatocyttvekstfaktorer. Fordi TCF ikke kun er en antitumorfaktor, men også en vekstfaktor for hepatocytter, er det kjent at den er fordelaktig for lever-regenerering etter hepatektomi.

Omfattende forskning er hittil utført ut fra aspektene med forholdene struktur-funksjon for hepatocytt-vekstfaktor (HGF). Ca. 20 typer delesjonsmutanter og ca. 50 typer punktmutanter er hittil rapportert

(K. Matsumoto, et al-, Biochem. Biophys. Res. Comm., vol. 181, s. 691-699 (1991); G. Hartmann, et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, vol. 89, s. 11574-11587 (1992); N. A. Lokker, et al., EMBO J. vol. 11, s. 2503-2510 (1992); M. Okigaki et al., Biochemistry, vol. 31, s. 9555-9561 (1992); N. A. Lokker, et al., Protein Engineering, vol. 7, s. 895-903

(1994)), men det foreligger i dag ikke noen mutant som klart oppviser en forhøyet biologisk aktivitet.

Halveringstiden for TCF in vivo er kjent for å være ekstremt kort, ca. 2 minutter. Det forventes derfor at en forholdsvis stor mengde av proteinet bør administreres for behandling av forskjellige sykdommer. Det er tenkelig at doseringsnivået for administrert TCF vil bli redusert ved forhøyelse av biologisk aktivitet derav eller ved forlengelse av halveringstiden derav in vivo. Selv om dette ble beskrevet for TCF-mutanter med forlenget halveringstid i patentpub-likasjon WO 94/14 845, foreligger det i dag ingen TCF-mutant med forhøyet biologisk aktivitet, slik som HGS beskrevet ovenfor.

Ved foreliggende oppfinnelse er det derfor utført undersøkelser for å erholde en TCF-mutant som oppviser for-høyet biologisk aktivitet eller forlenget halveringstid in vivo. Nærmere bestemt er det ved foreliggende oppfinnelse ut-ført forskning for å erholde den ovennevnte mutant med for-høyet biologisk aktivitet eller med forlenget halveringstid in vivo som er forskjellig fra nativ TCF med hensyn til aminosyresekvens, ved endring av DNA-sekvensen som koder for aminosyresekvensen av nativ TCF og ekspresjon av det tilsvarende DNA. Et mål for foreliggende oppfinnelse er følgelig å tilveiebringe en TCF-mutant med forhøyet biologisk aktivitet eller med forlenget halveringstid in vivo, på grunn av redusert affinitet for heparin.

Ved foreliggende oppfinnelse er det utført omfattende forskning for å oppnå det ovennevnte mål og det er erholdt nye TCF-mutanter med aminosyresekvenser forskjellige fra sekvensene av TCF-mutanter funnet før foreliggende oppfinnelse, og som oppviser forhøyet biologisk aktivitet og/eller redusert affinitet for heparin. Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer TCF-mutanter som oppviser mer enn 10 ganger høyere spesifikk aktivitet (biologisk aktivitet pr. enhetsmengde protein) og/eller redusert affinitet for heparin.

Disse er de første mutanter med ekstremt forhøyet biologisk aktivitet erholdt ved mutagenisering av aminosyresekvensen for nativ TCF.

Oppsummering av oppfinnelsen

Et mål for foreliggende oppfinnelse er å tilveiebringe en TCF-mutant med redusert affinitet for heparin og/eller med forhøyet biologisk aktivitet, erholdt ved mutagenese av én eller flere aminosyrerester i aminosyresekvensen fra N-terminalen til første kringle i nativ TCF.

Kort beskrivelse av figurene

Figur 1 viser SDS-elektroforeseprofiler for renset TCF og TCF-mutanter ifølge foreliggende oppfinnelse. Figur 2 viser proliferativ virkning av renset TCF og TCF-mutanter ifølge foreliggende oppfinnelse på hepatocytter. Den relative aktivitet {%) på den vertikale akse er representert som den forhåndsmessige proliferative aktivitet av hver prøve basert på aktiviteten av 10 ng/ml TCF som 100 %. Figur 3 viser en sammenligning av proliferativ virkning i hepatocytter mellom renset mutant RKRR2AAAA og

TCF.

Figur 4 viser en sammenligning av proliferativ virkning i hepatocytter mellom renset mutant KlKTKK27AIATAA og TCF. Figur 5 viser sammenligning av proliferativ virkning i nyreepitelceller mellom renset mutant RKRR2AAAA, mutant KIKTKK27AIATAA og TCF. Figur 6 viser sammenligning av proliferativ virkning i benmargsceller mellom renset mutant RKRR2AAAA, mutant KlKTKK27AIATAA og TCF. Figur 7 viser doseeffekter av renset TCF, mutant RKRR2AAAA og mutant Kl KTKK2 7 AI ATAA på serumniv&et av totalt

protein hos rotter.

Figur 8 viser doseeffekter av renset TCF, mutant RKRR2AAAA og mutant KIKTKK27AIATAA på serumnivået av HDL-kolesterol hos rotter.

Detaljert beskrivelse av oppfinnelsen og foretrukne utfør-elsesformer

Ved å sammenligne egenskaper for nativt protein og en mutant erholdt ved mutagenese i en del av aminosyresekvensen for proteinet, kan funksjonen av denne del vurderes. I tilfellet med protein hvis struktur ikke er klart kjent, har det ofte vært vanlig å erstatte en aminosyre, slik som Ala, som ikke vil påvirke den steriske struktur, med en polar aminosyre som antas å ligge på overflaten av et protein, for å forhindre en strukturell endring av proteinet på grunn av mutagenese. For å utføre en sete-spesifikk endring av en aminosyresekvens av et protein til en annen, kan cDNA med sete-spesifikke mutasjoner fremstilles ved hjelp av PCR(polymerasekjedereaksjon)metoden ved anvendelse av cDNA som koder for nativ TCF som templat og syntetiske oligo-nukleotider som koder for de andre aminosyrer.

cDNA erholdt som beskrevet ovenfor kan innføyes i en vektor med en passende ekspresjonspromotor (cytomegalo-virus (CMV), SRa (Mole. Cell. Biol. vol. 8, nr. 1, s. 466-472) og japansk patentsøknad 277489 (1989), og transfekteres i eukaryotiske celler, slik som pattedyrceller. Ved dyrkning av disse celler kan aktuelle TCF-mutanter isoleres fra dyrkningsløsningen.

Mange TCF-mutanter kan konstrueres ved å innføre mutasjoner ved forskjellige seter eller rester. Ved foreliggende oppfinnelse ble det fremstilt 6 mutanter. Disse mutanter spesifiseres ved nummerering av aminosyresekvensen før mutagenese, antall aminosyrer ved N-terminalen av den mutageniserte del og endret aminosyresekvens etter mutagenese, ved hjelp av en enbokstavkode for aminosyrer. Der som f.eks. hele sekvensen Arg-Lys-Arg-Arg i den andre posisjon fra N-terminalen erstattes med Ala, representeres mutanten som RKRR2AAAA. Som et annet eksempel representeres mutanten hvis opprinnelige sekvens Lys-Ile-lyB-Thr-Lys-lys ved den 27. posisjon fra N-terminalen erstattes med Ala-Ile-Ala-Thr-Ala-Ala, som KlKTKK27AIATAA.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer således en tumorcytotoksisk-faktor-II-mutant, kjennetegnet ved at Arg2-Lys-Arg-Arg5 i villtype-tumorcytotoksisk-faktor-II er mutert til Ala-Ala-Ala-Ala, en tumorcytotoksisk-faktor-11-mutant, kjennetegnet ved at Lys27-Ile-Lys-Thr-Lys-Lys32 i villtype-tumorcytotoksisk-f aktor- II er mutert til Ala-Ile-Ala-Thr-Ala-Ala, en tumorcytotoksisk-faktor-II-mutant,

kjennetegnet ved at Lys54 i vi11type-tumorcytotoksisk-faktor-II er mutert til Ala og en tumorcytotoksisk-faktor-11-mutant, kjennetegnet ved at Arg42 i vi11type-tumorcytotoksisk-faktor-II er mutert til Ala.

Foreliggende oppfinnelse forklares i detalj ved hjelp av eksemplene. Rammen for foreliggende oppfinnelse er imidlertid ikke begrenset av disse eksempler.

Eksempel 1

Sete-spesifikk mutasjon ble utført ved hjelp av metoden beskrevet nedenfor ved anvendelse av 6,3 kb TCF-ekspresjonsplasmidet erholdt ved hjelp av metoden beskrevet i WO 92/01053. E. coli omfattende dette plasmid ble deponert som FERM BP-3479.

I. Fremstilling av templatplasmid pcD TCF001

I overensstemmelse med metoden beskrevet nedenfor ble en mutasjon innført ved Pstl-spaltingssetet ved nukleotid nr. 34 for å forandre sekvensen til en nukleotidsekvens som ikke kunne spaltes. PCR ble utført ved anvendelse av 8 ng plasmid pUC TCF (plasmid hvori SalI/SphI-fragmentet av TCF cDNA ble innføyet i plasmid pUC18) som et templat i nærvær av en kombinasjon av mutagenisert primer PstOl (SEKVENS.ID.nr.: 1) og en ikke-mutagenisert primer TCF415 R (SEKVENS.ID.nr.: 2) , og i nærvær av en kombinasjon av mutagenisert primer P002 (SEKVENS.ID.nr.: 3) og en ikke-mutagenisert primer TCFSal-77 (SEKVENS.ID.nr.: 4).

Etter at primerne var fjernet fra reaksjonsblandingen ved molekylærfiltrering med mikrokon 100 (Amicon), ble produktene blandet. Den andre PCR ble utført ved anvendelse av primer TCFSal-77 og TCF415R. Det erholdte produkt ble spaltet med restriksjonsenzymer BstPI og Pstl. Ved anvendelse av et ligeringssett (Takara-shuzo) ble fragmentet ligert med det største Bst-Pstl-fragment av pUC TCF BstPI/Pstl fremstilt på forhånd. E. coli DH5a ble transformert ved anvendelse av en del av ligeringsreaksjonsblandingen.

Transformert E. coli DH5a ble dyrket i L-buljong inneholdende 50 ug/ml ampicillin og et aktuelt plasmid ble utvalgt fra ampicillinresistente kolonier. Dette plasmid ble spaltet med restriksjonsenzymer Sali og SphI, blandet med nytt pcDNAI (hvori flerkloningssetet for pcDNAI var mutagenisert og det forelå et Hindlll-Sall-BamHI-Sphl-Notl-klonings-sete) Sall/Sphl-stort fragment fremstilt på forhånd, og innføyet ved anvendelse av et ligeringssett. Ved anvendelse av reaksjonsblandingen ble E. coli MC1061/P3 (Invitrogen) transformert. Transformert E. coli MC10161/P3 ble dyrket i L-buljong inneholdende'50 ug/ml ampicillin og 7,5 ug/ml tetra-syklin.

Plasmid-DNA ble fremstilt fra erholdte ampicillin-tetrasyklinresistente kolonier og nukleotidsekvensene derav ble bestemt ved hjelp av et DNA-sekvenseringsapparat (Perkin-Elmer). Det ble erholdt plasmid pcD TCF001 med en aktuell struktur og TCF-mutanter ble fremstilt ved anvendelse av det erholdte plasmid.

II. Konstruksjon av en ekspresjonsvektor for TCF- mutanter og fremstilling av transformert E . coli

i. Konstruksjon av RKRR2AAAA- ekspresjonsvektor og fremstilling av transformert E . coli

En ekspresjonsvektor for cDNA som koder for RKRR2AAAA ble konstruert ved hjelp av to trinn med PCR. I det første trinn ble det anvendt en kombinasjon av mutagenisert primer 2RKRRF (SEKVENS.ID.nr.: 5) og ikke-mutagenisert primer TCF977 R (SEKVENS.ID.nr.: 6), og en kombinasjon av mutagenisert primer 2RKRR R (SEKVENS.ID.nr.: 7) og ikke-mutagenisert primer TCFSal-77 (SEKVENS.ID.nr.: 4). 4 ng pcD TCFOOl ble anvendt som templat i begge reaksjoner. Etter reaksjonene ble begge reaksjonsblandinger blandet og renset med mikrokon 100. 1/20 av blandingen ble anvendt som templat i den andre PCR. TCFSal-77 og TCF977 R ble anvendt som primere. Reaksjonsblandingen ble renset med mikrokon 100 og spaltet med restriksjonsenzymer BstPI og EcoRV. Ved anvendelse av ligeringssettet ble fragmentet inn-føyd i det store fragment av en SRa-inneholdende TCF-ekspresjonsvektor som på forhånd var spaltet med BstPI og EcoRV. E. coli DHSa ble transformert med ligeringsreaksjonsblåndingen og et aktuelt klon ble erholdt fra de dannede ampicillinresistente celler ved hjelp av den samme metode som beskrevet ovenfor. Plasmid-DNA ble fremstilt fra det erholdte klon og DNA-sekvensen derav ble bestemt ved hjelp av DNA-sekvenser-ingsapparatet (Perkin-Elmer). Dette plasmid ble spaltet med restriksjonsenzymer EcoRV og BstPI og innføyet i fragmentet av pUC TCF som på forhånd var spaltet med restriksjonsenzymer EcoRV og BstPI, etterfulgt av transformasjon av E. coli DH5a med dette.

E. coli omfattende dette plasmid ble deponert som pUC TCF2 ved National Institute of Bioscience and Human Technology 10. november 1994, og har deponeringsnummer FERM P-14624.

ii. Konstruksjon av KIKTKK27AIATAA- ekspresjonsvektor og fremstilling av transformert E. coli

Et ekspresjonsplasmid for cDNA som koder for KlKTKK27AIATAA-mutant ble konstruert ved hjelp av to trinn med PCR. I den første PCR ble det anvendt en kombinasjon av en mutagenisert primer 27KIKTKK F (SEKVENS.ID.nr.: 8) og en ikke-mutagenisert primer TCF977 R (SEKVENS.ID.nr.: 6), og en kombinasjon av mutagenisert primer 27KIKTKK R (SEKVENS.ID.nr'. : 9) og en ikke-mutagenisert primer TCFSal-77 (SEKVENS.ID.nr.: 4). 4 ng pcD TCFOOl ble anvendt som templat i begge reaksjoner. Etter reaksjonene ble begge reaksjonsblandinger blandet og renset med mikrokon 100. 1/20 av blandingen ble anvendt som templat i den andre PCR. TCFSal-77 og TCF977 R ble anvendt som primere.

Reaksjonsblandingen ble renset med mikrokon 100 og spaltet med restriksjonsenzymer BstPI og EcoRV. Ved anvendelse av ligeringssett ble fragmentet innføyet i det store fragment av en SRa-inneholdende TCF-ekspresjonsvektor som på forhånd var spaltet med BstPI og EcoRV. E. coli DH5a ble transformert med ligeringsreaksjonsblandingen og et aktuelt klon ble erholdt fra de ampicillinresistente celler ved anvendelse av den- samme metode som beskrevet ovenfor. Plasmid-DNA ble fremstilt fra det erholdte klon og DNA-sekvensen derav ble bestemt ved hjelp av et DNA-sekvenseringsapparat. Dette plasmid ble spaltet med restriksjonsenzymer EcoRV og BstPI og inkorporert i fragmentet av pUC TCF spaltet med restriksjonsenzymer EcoRV og BstPI, etterfulgt av transformasjon av E. coli DH5a med dette. E. coli omfattende dette plasmid ble deponert ved National Institute of Bioscience and Human Technology 10. november 1994, og har deponeringsnummer FERM P-14623.

iii. Konstruksjon av K54A- ekspresjonsvektor og fremstilling av transformert E . coli

Et ekspresjonsplasmid for cDNA som koder for K54A-mutanten ble konstruert ved hjelp av to trinn med PCR. I den første PCR ble det anvendt en kombinasjon av mutagenisert primer 54K F (SEKVENS.ID.nr.: 10) og ikke-mutagenisert primer TCF977 R (SEKVENS.ID.nr.: 6), og en kombinasjon av mutagenisert primer 54K R (SEKVENS.ID.nr.: 11) og ikke-mutagenisert primer TCFSal-77 (SEKVENS.ID.nr.: 4). 4 ng pcD TCFOOl ble anvendt som templat i begge reaksjoner. Etter reaksjonene ble begge reaksjonsblandinger blandet og renset med mikrokon 100.

1/20 av blandingen ble anvendt som templat i den andre PCR. TCFSal-77 og TCF977 R ble anvendt som primere. Reaksjonsproduktet ble renset med mikrokon 100 og spaltet med restriksjonsenzymer BstPI og EcoRV. Ved anvendelse av et ligeringssett ble fragmentet innføyet i det store fragment av en SRa-inneholdende TCF-ekspresjonsvektor som på forhånd var spaltet med BstPI og EcoRV. E. coli DH5a ble transformert med ligeringsreaksjonsblandingen og et aktuelt klon ble erholdt fra de erholdte ampicillinresistente celler ved anvendelse av

den samme metode som beskrevet ovenfor. Plasmid-DNA ble fremstilt fra det erholdte klon og DNA-sekvensen derav ble bestemt ved hjelp av et DNA-sekvenseringsapparat.

iv. Konstruksjon av RGKD132AGAA- ek3presjonsvektor og fremstilling av transformert E . coli

Et ekspresjonsplasmid for cDNA som koder for RGKD132AGAA-mutant ble konstruert ved hjelp av to trinn med PCR. I den første PCR ble det anvendt en kombinasjon av mutagenisert primer 132RGKD F (SEKVENS.ID.nr.: 12) og ikke-mutagenisert primer TCF977R (SEKVENS.ID.nr.: 6), og en kombinasjon av mutagenisert primer 132RGKD R (SEKVENS.ID.nr.: 13) og primer TCFSal-77 (SEKVENS.ID.nr.: 4). 4 ng pcD TCFOOl ble anvendt som templat i begge reaksjoner. Etter reaksjonen ble begge reaksjonsblandinger blandet og renset med mikrokon 100.

1/20 av blandingen ble anvendt som templat i den andre PCR. TCFSal-77 og TCF977 R ble anvendt som primere. Reaksjonsproduktet ble renset med mikrokon 100 og spaltet med restriksjonsenzymer BstPI og EcoRV. Ved anvendelse av et

ligeringssett ble fragmentet innføyet i det store fragment av den SRa-inneholdende TCF-ekspresjonsvektor som på forhånd var spaltet med BstPI og EcoRV. E. coli DHSa ble transformert med ligeringsreaksjonsblandingen og et aktuelt klon ble erholdt

fra de erholdte ampicillinresistente cellelinjer. Plasmid-DNA ble fremstilt fra det erholdte klon på samme måte som beskrevet ovenfor, og basesekvensen derav ble bestemt ved hjelp av et DNA-sekvenseringsapparat.

v. Konstruksjon av R142A- ekspresjonsvektor og fremstilling av transformert E . coli

Et ekspresjonsplasmid for cDNA som koder for R142A-mutanten ble konstruert ved hjelp av to trinn med PCR. I den første PCR ble det anvendt en kombinasjon av mutagenisert primer 142R F (SEKVENS.ID.nr.: 14) og ikke-mutagenisert primer TCF977 R {SEKVENS.ID.nr.: 6), og en kombinasjon av mutagenisert primer 142R R (SEKVENS.ID.nr.: 15) og TCFSal-77 (SEKVENS.ID.nr.: 4). 4 ng pcD TCF ble anvendt som templat i begge reaksjoner. Etter reaksjonene ble begge reaksjonsblandinger blandet og renset med mikrokon 100.

1/20 av blandingen ble deretter anvendt som templat i den andre PCR. Reaksjonsproduktet ble renset med mikrokon 100 og spaltet med restriksjonsenzymer BstPI og EcoRV. Ved anvendelse av et ligeringssett ble fragmentet innføyet i det store fragment av en SRa-inneholdende TCF-ekspresjonsvektor som på forhånd var spaltet med BstPI og EcoRV. E. coli DH5a ble transformert med ligeringsreaksjonsblandingen og et aktuelt klon ble erholdt fra de erholdte ampicillinresistente cellelinjer på samme måte som beskrevet ovenfor. Plasmid-DNA ble fremstilt fra det erholdte klon og DNA-sekvensen derav ble bestemt ved hjelp av et DNA-sekvenseringsapparat.

vi. Konstruksjon av R42A- ekspresjonsvektor og fremstilling av transformert E. coli

Et ekspresjonsplasmid for cDNA som koder for R42A-mutanten ble konstruert ved hjelp av to trinn med PCR. I den første PCR ble det anvendt en kombinasjon av mutagenisert primer 42R F (SEKVENS.ID.nr.: 16) og ikke-mutagenisert primer TCF977 R (SEKVENS.ID.nr.: 6), og en kombinasjon av mutagenisert primer 42R R (SEKVENS.ID.nr.: 17) og TCFSal-77 (SEKVENS.ID.nr.: 4). 4 ng pcD TCFOOl ble anvendt som templat i begge reaksjoner.

Etter reaksjonen ble begge reakBjonsblandinger blandet og renset med mikrokon 100. 1/20 av blandingen ble deretter anvendt som templat i den andre PCR. TCFSal-78 og TCF977 R ble anvendt som primere. Reaksjonsblåndingen ble renset med mikrokon 100 og spaltet med restriksjonsenzym BstPI/EcoRV. Ved anvendelse av et ligeringssett ble fragmentet innføyet i det store fragment av den SRa-inneholdende TCF-ekspresjonsvektor som på forhånd var spaltet med BstPI og EcoRV. E. coli DH5a ble transformert med ligeringsreaksjonsblandingen og et aktuelt klon ble erholdt fra ampicillinresistente cellelinjer på samme måte som beskrevet ovenfor. Plasmid-DNA ble fremstilt fra det erholdte klon og DNA-sekvensen derav ble bestemt ved hjelp av et DNA-sekvenseringsapparat.

III. Fremstilling og rensing av ekspresjonsplasmider for TCF-mutanter

Seks typer av transformert E. coli omfattende de ovenfor beskrevne ekspresjonsmidler ble dyrket i L-buljong {400 ml) inneholdende 50 ug/ml ampicillin, i en ristein-kubator ved 37 °C over natten, fordi Spectinoycin (Sigma) ble tilsatt til en sluttkonsentrasjon på 0,3 mg/ml når OD600 i dyrkningsløsningen var 1,0. I overensstemmelse med metoden Maniatis (Molecular cloning 2. utg. s. 1.21-1.52 (1989), Cold Spring Harbor Laboratory), plasmid-DNA isolert ved hjelp av den alkaliske SDS-metode, og seks typer av TCF-mutanteks-prea jonsplasmider ble renset ved hjelp av cesium-tetthets-gradientsentrifugeringsmetoden.

IV. Transfeksjon av TCF- mutantekspresjonsplasmid i dyreceller

Alle de mutante ekspresjonsplasmider ble trans-fektert i CHO-celler.- CHO-celler (2 x 10<s>) ble suspendert i 0,8 ml IMDM-medium (Gibco) inneholdende 10 % kalvefosterserum (Gibco), hvori det ytterligere ble suspendert en oppløsning av 200 ug ekspresjonsvektor og 10 ug Blasticidinresistent genekspresjonsplasmid pSV2 bsr (Funakoshi) på forhånd oppløst i 25 ul TE (10 mM tris-HCl (pH 8,0)-l mM EDTA). Denne suspen-sjon ble elektroporert under, betingelsene 330V og 960 uF. Etter henstand ved romtemperatur i 10 minutter ble suspen-sjonen suspendert i 10 ml IMDM inneholdende 10 % FCS-medium, og dyrket ved 37 °C i en C02-inkubator (5 % C02) i 2 dager. To dager etter ble supernatanten oppsamlet og mengden av den ut-trykte TCF-mutant ble analysert ved hjelp av enzymimmun-analyse (EIA) (N. Shima, et al., Gastro-enterologia Japonica, vol. 26, nr. 4, s. 477-482 (1991)) ved anvendelse av anti-TCF-monoklonalt antistoff. Dette ble anvendt som en prøve for analysering av biologisk aktivitet. Cellene ble høstet fra bunnen av flaskene ved trypsin(Gibco)behandling, og antall levedyktige celler ble tellet. Ca. 10 000 celler/brønn ble plassert i 96-brønners plater (Nunc) og dyrket i 200 ul/brønn IMDM-medium inneholdende 10 % FCS og 5 ug/ml Blastcidin i 2-3 uker. Etter 2-3 uker ble 50 ul aliquoter uttatt fra hver brønn og testet med hensyn til ekspresjon av TCF-mutant ved hjelp av EIA. Cellekloner som uttrykker TCF-mutantene ble dyrket i 12-brønners plater og 25 cm<2> flaske. Cellelinjene som produserer TCF-mutant ble tilveiebrakt fra CHO-celler ved hjelp av den ovenfor angitte operasjon.

V. Dyrkning i stor skala av TCF- mutantproduserende celler

Mutantproduserende celler ble innhøstet fra 75 cm<3 >flasker når kulturen ble sammenløpende, og cellene ble over-ført til 10 flasker 225 cm<3> inneholdende 100 ml medium og dyrket i én uke. Kultursupernatanten ble deretter innsamlet. Ved å gjenta denne operasjon 1 eller 2 ganger ble 1-2 1 av dyrkningsløsningen erholdt.

VI. Rensing av TCF- mutantene

Rensingen ble utført ved hjelp av tre trinn som beskrevet nedenfor.

i. Heparin- Sepharose CL- 6B

Bunnfall ble fjernet fra 1-2 1 dyrkningsmedium fra CHO-celler som uttrykker forskjellige TCF-mutanter, ved sentrifugering (2 000 rpm x 10 minutter) av mediet, og ved filtrering av supernatanten gjennom et 0,45 pm filter (German Science) ble TCF-mutant absorbert ved 4 ml/minutt på en heparin-Sepharose CL-6B-kolonne (25 mm x 120 mm, pharmacia) ekvilibrert med 10 mM tris-HCl (pH 7,5) inneholdende 0,3 M NaCl og 0,01 % Tween 20. Kolonnen ble vasket med ca. 500 ml ekvilibreringsbuffer og TCF-mutanten ble eluert med 10 mM tris-HCl (pH 7,5) inneholdende 2 M NaCl og 0,01 % Tween 20. Den eluerte løsning ble fraksjonert i 4 ml fraksjoner ved hjelp av en fraksjonsoppsamler, og fraksjonene med absorpsjon ved 280 nm ble oppsamlet.

ii. Mono S FPLC

Fraksjonen inneholdende TCF-mutant eluert med 2 M NaCl ble dialysert mot 10 mM fosfatbuffer (pH 7,0) inneholdende 0,15 M NaCl, etterfulgt av sentrifugering (12 000 rpm x 90 minutter) for å fjerne bunnfall. Supernatanten inneholdende TCF-mutant ble passert gjennom en mono S-kolonne (5 mm x 50 mm, Pharmacia) ekvilibrert med 10 mM fosfatbuffer (pH 7,0) inneholdende 0,15 NaCl og 0,01 % Tween 20, ved en gjennomstrømningshastighet på 1 ml/minutt for å adsorbere TCF-mutant. Etter at kolonnen var vasket med ca. 30 ml ekvilibreringsbuffer ble TCF-mutant eluert ved å endre gjennomstrømningshastigheten til 0,5 ml/minutt med en lineær gradient av NaCl opp til 1,0 M i 60 minutter. Den eluerte løsning ble fraksjonert i fraksjoner på 5 ml ved hjelp av en fraksjonsoppsamler, og fraksjoner inneholdende TCF-mutant ble analysert ved absorpsjon ved 280 nm og EIA og oppsamlet.

iii. Heparin 5- PW FPLC

Fraksjonen inneholdende TCF-mutant erholdt ved anvendelse av mono S-kolonnekromatogfi, ble tilsatt en 2-gangers mengde 10 mM tris-HCl (pH 7,5) inneholdende 0,01 Tween 20. Løsningen ble passert gjennom en heparin 5-PW-kolonne (5 mm x 75 mm TOSOH) 1 ml/minutt, ekvilibrert med 10 mM tris-HCl (pH 7,5) inneholdende 0,3 M NaCl og 0,01 % Tween 20, for å absorbere TCF-mutanten. Ved å endre gjennom-strømningshastigheten til 0,5 ml/minutt ble TCF-mutanten eluert med en lineær gradient av NaCl opp til 2,0 M i 60 minutter.

Den eluerte løsning ble fraksjonert i fraksjoner på 5 ml ved hjelp av en fraksjonsoppsamler. Fraksjonen inneholdende TCF-mutant ble analysert ved absorpsjon ved 280 nm og EIA og oppsamlet. Erholdt TCF-mutantløsning ble dialysert mot PBS-inneholdende 0,01 % Tween 20 (TPBS), for å erholde det endelig rensede produkt. Mengden protein i det endelige rensede produkt ble bestemt ved hjelp av Lowry-metoden. Aminosyresekvensen av TCF-mutant RKRR2AAAA og sekvensen av mutant KlKTKK27AIATAA ble angitt som hhv. SEKVENS.ID.nr.: 18 og SEKVENS.ID.nr.: 19.

VII. SDS- polyakrylamidgelelektroforese av renset TCF- mutant

Renset TCF-mutant (200 ng) ble underkastet et SDS-polyakrylamidgelelektroforese. En skjematisk fremstilling av elektroforesen av TCF-mutant RKRR2AAAA og KIKTKKK27AIATAA som oppviste en 10-gangers økning i biologisk aktivitet som beskrevet nedenfor, og nativt TCF, er vist i figur 1. Både resultatene under reduserende betingelser (i nærvær av {3-merkaptoetanol) og ikke-reduserende betingelser (i fravær av p-merkaptoetanol) viste ingen forskjell mellom de tre prøver. Det ble dessuten ikke observert noe bånd foruten de som var forventet ut fra strukturen av begge TCF-mutanter.

Eksempel 2

Affinitet av TCF og TCF- mutant for heparin

I. Heparin- sepharose CL- 6B

Bunnfall ble fjernet fra kulturmediet fra CHO-celler som uttrykker hver TCF-mutant, ved sentri f ugering (1 200 x g, 10 minutter) av mediet og ved filtrering av supernatanten gjennom et 0,22 um filter. Den filtrerte supernatant ble applisert på en heparin-Sepharose CL-6B-kolonne (5 mm x 5 mm; Pharmacia) ekvilibrert med TPBS, for å adsorbere TCF-mutant på kolonnen. Etter vask med 3 ml TPBS ble TCF-mutant eluert med 1 ml TPBS inneholdende 0,2-0,3 M NaCl, under trinnvis økning av saltkonsentrasjonen. Konsentrasjonen av TCF-mutant i eluatet ble analysert ved hjelp av EIA og saltkonsentrasjonen i eluatet ble definert som affinitet av mutant for heparin.

II. Heparin 5- PW FPLC

Kulturløsningen fra CHO-celler som uttrykker hver TCF-mutant (30-60 ml) ble sentrifugert (1 000 x g,

10 minutter), passert gjennom et 0,22 um filter for å fjerne bunnfall og applisert på en heparin 5-PW-kolonne ekvilibrert med 20 mM tris-HCl-bufferløsning inneholdende 0,01 Tween 20 ved en gjennomstrømningshastighet på 1,0 ml/minutt, for å adsorbere TCF-mutant. Etter vask av kolonnen med ca. 20 ml ekvilibreringsbufferløsning og endring av gjennomstrømnings-hastigheten til 0,5 ml/minutt, ble TCF-mutant eluert med en lineær gradient av NaCl opp til 1,5 i 45 minutter. Fraksjoner av 0,5 ml ble oppsamlet ved hjelp av en fraksjonsoppsamler og konsentrasjonen av TCF-mutant i hver fraksjon ble kvantifi-sert ved hjelp av EIA, og salt konsentrasjonen i eluerings-løsningen ble definert som affinitet av mutant for heparin.

Resultatene for bestemmelse av affinitet av disse TCF-mutanter for heparin er vist i tabell 1. Elueringskonsentrasjonen av NaCl fra heparin-Sepharose representerer konsentrasjonen ved hvilken TCF-mutanten elueres i maksimal mengde. Det relative forhold mellom elueringskonsentrasjonene er definert som (elueringskonsentrasjonen av NaCl for mutant TCF/den tilsvarende konsentrasjon for nativ TCF). n.d. betyr "ikke bestemt". Ved undersøkelsen med heparin-Sepharose oppviste RKRR2AAAA, KlKTKK27AIATAA og R42A betydelig redusert affinitet for heparin. Ved undersøkelsen med heparin 5-PW ble det dessuten observert at affinitet av mutantene for heparin ble redusert til ca. 70 % av affiniteten for TCF.

Eksempel 3

Proliferativ aktivitet av TCF og TCF- mutanter overfor hepatocytter in vi tro

Proliferativ aktivitet ble undersøkt ved hjelp av den følgende metode: I overensstemmelse med metoden ifølge Segren (Method in cell biology, vol. 13, s. 29 (1976) Academic Press, New York), ble hepatocytter isolert fra Wistar-rotter (ca. 200 g kroppsvekt). Cellene (1,0 x l0<4>/50 ul/brønn) ble plassert i brønnene i 96-brønners plater (Falcon) og dyret ved 37 °C over natten ved anvendelse av Williams E-medium (Flow Laboratory) inneholdende 10 % kalvefosterserum og 10 jiM deksametason (i det etterfølgende forkortet som basismedium). Etter 24 timer ble 10 ul basismedium inneholdende TCF eller TCF-mutant tilsatt til hver brønn. Platene ble inkubert ved 37 °C i ytterligere 22 timer. Etter 22 timer ble aH-tymidin (Amersham) tilsatt i en mengde av 1 uCi/brønn og kulturen ble opprettholdt i ytterligere 2 timer. Cellene ble deretter vasket to ganger med PBS og innhøstet ved behandling med 0,5 % trypsin, etterfulgt av oppsamling av cellene i et glassfilter ved hjelp av et celleinnhøstingsapparat. Radioaktiviteten inkorporert i hver brønn ble målt ved hjelp av Matrix 96 (Packard) som mengde DNA-syntese. Resultatene er vist i figur 2.

Mutant K54A, RGKD132AGAA og R142A hadde hhv. 1,4-ganger, 2,0-ganger og 1,6-ganger høyere biologisk aktivitet enn nativ TCF ved en TCF-antigenkonsentrasjon på 2,5 ng/ml. Hver mutant med redusert affinitet for heparin ble videre bestemt ved hjelp av Lowry-metoden. Den biologiske aktivitet ble deretter sammenlignet med hensyn til den proteinkonsen-trasjon som oppviste 50 % av den maksimale proliferative aktivitet (ED50) (figurene 3 og 4) .

Som resultat oppviste to typer protein, dvs. RKRR2AAAA og KlKTKK27AIATAA, mer enn 10 ganger så høy biologisk aktivitet pr. enhetsmengde protein sammenlignet med aktiviteten av nativ TCF.

Eksempel 4

Proliferativ aktivitet av TCF og TCF- mutant i nyreepitelceller

Proliferativ aktivitet i nyreepitelceller ble bestemt ved hj elp av den følgende metode: OK-celler avledet fra nyreepitelcellelinjen fra amerikansk Opossum ble plassert i hver brønn i en 96-brønners plate, slik at antall celler var 1,0 x 10<4>/100 ul/brønn, og dyrket i DMEM-medium inneholdende 10 % kalvefosterserum ved 37 °C over natten. Deretter ble hver brønn vasket 2-3 ganger med DMEM-medium uten innhold av serum. Mediet i hver brønn ble erstattet med DMEM-medium uten innhold av serum, og kulturen ble opprettholdt ved 37 °C i ytterligere 2 dager. Mediet i hver brønn ble deretter på nytt erstattet med 50 ul friskt DMEM-medium uten innhold av serum, og etter tilsetning av 50 ul TCF eller TCF-mutant fortynnet med DMED-medium inneholdende 0,2 % bovint serumalbumin, ble kulturen opprettholdt i ytterligere 24 timer. Etter 24 timer ble <3>H-tymidin tilsatt for å gi en mengde på 1 uCi/brønn, og kulturen ble opprettholdt i ytterligere 2 timer. Cellene ble deretter vasket to ganger med PBS og innhøstet ved behandling med 0,5 % trypsin, etterfulgt av oppsamling av cellene i et glassfilter ved hjelp av et celleinnhøstingsapparat. Radioaktiviteten inkorporert i hver brønn ble målt ved hjelp av Matrix 96 og bestemt som mengde DNA-syntese. Resultatene er vist i figur 5.

Som resultat ble det observert at biologiske aktiviteter pr. enhetsmengde protein RKRR2AAAA og KlKTKK27AIATAA i nyreepitelceller økte mer enn to ganger sammenlignet med aktiviteten av nativ TCF.

Eksempel 5

Proliferativ aktivitet av TCF og TCF- mutant i benmargsceller in vi tro

Proliferativ aktivitet i benmargsceller ble bestemt ved hjelp av den følgende metode: NSF-60-celler fra en musebenmargscellelinje ble plassert i hver brønn i en 96-brønners plate for å gi en mengde på 5,0 x 10<*> celler/50 pl/brønn i RPMI-medium inneholdende 10 % kalvefosterserum, og ble etter tilsetning av 50 ul TCF eller TCF-mutant fortynnet med mediet, dyrket ved 37 °C i 24 timer. Etter 24 timer ble 10 ul, 5 mg/ml MTT (Sigma) tilsatt til hver brønn og kulturen ble opprettholdt i ytterligere 24 timer. 100 pl 10 % SDS/10 mM ammoniumklorid ble deretter tilsatt til hver brønn og de ble hensatt ved romtemperatur over natten. Optisk absorbans ved 590 nm ble deretter målt ved Immunoreader NJ-2 000 (Intermed) som proliferativ aktivitet.

Resultatene er vist i figur 6. Som resultat ble det observert at biologiske aktiviteter pr. enhetsmengde protein RKRR2AAAA og KlKTKK27AIATAA i benmargsceller ble redusert til 1/2-1/20 av aktiviteten av nativ TCF.

Eksempel 6

In vivo- biologisk aktivitet av TCF og TCF- mutanter

In vivo-biologisk aktivitet ble analysert ved hjelp av den følgende metode: TCF eller TCF-mutant oppløst i PBS inneholdende 0,01 % Tween 20 ble administrert intravenøst gjennom halen (2 mg/kg x 2 ganger/dag) til 6 uker gamle Wistar-hannrotter i 4 dager. Dagen etter den siste administrering ble blodprøver uttatt fra den kaudale vana cava under eteranestesi og serum ble innsamlet ved sentrifugering (3 000 rpm x 10 minutter) og umiddelbart etter blodprøveuttak, i tilfelle med plasma, ble natriumsitrat (sluttkonsentrasjon 0,38 %) tilsatt etterfulgt av sentrifugering (3 000 rpm x 10 minutter) for å gi plasma. Etter at oppsamlet serum eller plasma ble oppbevart i en fryser ved -30 °C ble serumnivå for totalt protein, albumin, umettet jernbindingskapasitet, totalt kolesterol, fritt kolesterol, HDL-kolesterol og fosfolipid, analysert ved hjelp av en serum autoanalysator (Hitachi 7150 autoanalysator), og plasmanivå av protrombin og fibrinogen ble analysert ved hjelp av en automatisk blodkoagulasjonsanalysator KC40 (Amerung). Ved disse analyser ble de følgende analysesett anvendt: Totalt protein: "Autosera" TP, albumin: "Autosera" ALB, umettet jernbindingskapasitet: "Clinimat" UIBC, totalt kolesterol: "Autosera" CHO-2, fritt kolesterol: "Autosera" F-CHO-2, HDL-kolesterol: HDL-C-2 "DAIICHI", fosfolipid: "Autosera" PL-2 (alle de ovennevnte sett er produkter fra Daiichi-Pure Chemicals Co., Ltd.).

Protrombintid: Ortobraintromboplastin (Ortho Diagnostic Systems Inc.), fibrinogen: "Sun Assay Fib" (Nitto Bosseki Co., Ltd.). Som typiske eksempler er doseeffekter derav på serumnivå for totalt protein og på serumnivå for HDL-kolesterol vist i hhv. figur 7 og figur 8.

I overensstemmelse med resultatene fra statistisk analyse med parallellinjeundersøkelse, med hensyn til økning av totalt protein, oppviste RKRR2AAAA 2,12 ganger spesifikk aktivitet og KIKIKTKK27AIARAA oppviBte 1,37 ganger spesifikk aktivitet, sammenlignet med aktiviteten av nativt protein. Med hensyn til økning av HDL-kolesterol oppviste dessuten RKRR2AAAA 1,66 ganger spesifikk aktivitet og KlKTKK27AIATAA oppviste 1,62 ganger spesifikk aktivitet, sammenlignet med aktiviteten av nativt protein.

Industriell tilgjengelighet

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer en ny TCF-mutant. TCF-mutanten ifølge foreliggende oppfinnelse har proliferativ aktivitet og vekststimulerende aktivitet i hepatocytter og er fordelaktige for behandling av forskjellige leversykdommer og som et antitumormiddel.

Claims

1. - Tumorcytotoksisk-faktor-II-mutant, karakterisert ved at Arg2-Lys-Arg-Arg5 i villtype-tumorcytotoksisk-faktor-II er mutert til Ala-Ala-Ala-Ala.

2 . Tumorcytotoksisk-faktor-II-mutant, karakterisert ved at Lys27-Ile-Lys-Thr-Lys-Lys32 i villtype-tumorcytotoksisk-faktor-II er mutert til Ala-Ile-Ala-Thr-Ala-Ala.

3. Tumorcytotoksisk-faktor-11-mutant, karakterisert ved at Lys54 i villtype-tumorcytotoksisk-f aktor-II er mutert til Ala.

4. Tumorcytotoksisk-faktor-II-mutant, karakterisert ved at Arg42 i villtype-tumorcytotoksisk-f aktor-II er mutert til Ala.