HU220167B - TCF-mutáns - Google Patents

TCF-mutáns Download PDF

Info

Publication number
HU220167B
HU220167B HU9602174A HU9602174A HU220167B HU 220167 B HU220167 B HU 220167B HU 9602174 A HU9602174 A HU 9602174A HU 9602174 A HU9602174 A HU 9602174A HU 220167 B HU220167 B HU 220167B
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
tcf
mutant
gly
thr
leu
Prior art date
Application number
HU9602174A
Other languages
English (en)
Other versions
HU9602174D0 (en
HUT75236A (en
Inventor
Masaaki Goto
Kanji Higashio
Masahiko Kinosaki
Fumie Kobayashi
Akihiko Murakami
Masatsugu Ueda
Kyoji Yamaguchi
Original Assignee
Snow Brand Milk Products Co. Ltd.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Snow Brand Milk Products Co. Ltd. filed Critical Snow Brand Milk Products Co. Ltd.
Publication of HU9602174D0 publication Critical patent/HU9602174D0/hu
Publication of HUT75236A publication Critical patent/HUT75236A/hu
Publication of HU220167B publication Critical patent/HU220167B/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
    • C07K14/4753—Hepatocyte growth factor; Scatter factor; Tumor cytotoxic factor II
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Description

A találmány új aminosavszekvenciát tartalmazó TCFmutánsokra vonatkozik, pontosabban olyan mutánsokra, amelyeket a natív TCF-szekvenciában az N-terminális-végtől az első kringle doménig terjedő szakaszban egy vagy több aminosav mutagenizálása révén állítunk elő és amelyek heparinnal szemben csökkent affinitást mutatnak és/vagy amelyeknek megnövekedett a biológiai aktivitásuk.
A találmány szerinti TCF-mutánsok, amelyek hepatocitákban proliferatív aktivitást és növekedést stimuláló aktivitást fejtenek ki, a különböző májbetegségek kezelésében jótékony hatásúak és tumorellenes szerként jönnek számításba.
A humán fibroblasztsejtek által termelt tumor citotoxikus faktor (TCF-Π) egy olyan új tumorellenes anyag, amely minden más eddig ismertetett antitumorproteintől különbözik. Sikerült a találmány szerinti proteint kódoló cDNS-t klónoznunk, meghatároztuk ennek a proteinnek a teljes aminosavszekvenciáját és bebizonyítottuk hasznosságát (W090/10651). SDS-elektroforézissel - nem redukáló feltételek mellett - való meghatározás szerint a TCF molekulatömege 78 000±2000 vagy 74 000±2000, míg redukáló körülmények között a következő eredményeket kaptuk: 52 000±2000 molekulatömegű A lánc, közös sáv, 30 000±2000 molekulatömegű B lánc és/vagy 26 000±2000 molekulatömegű C lánc. A TCF egy olyan protein, amely erős affinitást mutat heparinhoz és heparinszerű anyagokhoz, erős antitumoraktivitást fejt ki tumorsejtekkel szemben és proliferatív aktivitást gyakorol normál sejtekre. Ezenkívül megállapítottuk, hogy a HGF (hepatocyte growth factor) hepatocita növekedési faktor család széles változatához tartozik. Ennélfogva, mivel a TCF nemcsak antitumorfaktor, hanem a hepatociták számára növekedési faktor is, ismert, hogy hepatectomia után jó hatással van a máj regenerálódására.
Számos vizsgálatot végeztek eddig olyan szempontból, hogy kiderítsék a hepatocita növekedési faktor (HGF) szerkezete és funkciója közötti összefüggést. Eddig körülbelül 20 fajta deléciós mutánst és körülbelül 50 fajta pontmutánst ismertettek [K. Matsumoto et al., Biochem. Biophys. Rés. Comm., 181, 691-699 (1991); G. Hartmann et al., Proc. Notl. Acad. Sci., 89, 11574-11587 (1992): N. A. Lokker et al., EMBO J„ 11, 2503-2510 (1992); M. Okigaki et al., Biochemistry, 31, 9555-9561 (1992); N. A. Lokker et al., Protein Engineering, 7, 895-903 (1994)], azonban jelenleg még egy olyan mutánst sem állítottak elő, amely biztosan mutatna megnövekedett biológiai aktivitást.
Ismert, hogy a TCF felezési ideje in vivő rendkívül rövid, körülbelül 2 perc. Ezért előre látható, hogy viszonylag nagy mennyiségű proteint kell alkalmazni a különböző betegségek kezelésénél. Elképzelhető, hogy az alkalmazott TCF dózisszintjét úgy csökkentjük, hogy növeljük biológiai aktivitását vagy meghosszabbítjuk in vivő felezési idejét. Jóllehet a WO 94/14845 számon közzétett szabadalmi leírásban egy meghosszabbított felezési idővel rendelkező TCF-mutánst ismertettek, azonban a fent leírt HGF-hez hasonló, megnövelt biológiai aktivitású TCF-mutánst eddig nem állítottak elő.
Ezért kutatásaink céljául tűztük ki, hogy olyan TCFmutánst kapjunk, amely megnövekedett biológiai aktivitást vagy meghosszabbított felezési időt mutat in vivő. Pontosabban, kísérleteink arra irányultak, hogy a fent említett mutánst emelt biológiai aktivitással vagy in vivő hosszabb felezési idővel állítsuk elő, amely a natív TCF-től aminosavszekvenciáját tekintve azáltal különbözik, hogy megváltoztattuk a natív TCF aminosavszekvenciáját kódoló DNS-szekvenciát és DNS-szekvenciájának kifejeződését. Ennek értelmében a találmány célja az, hogy megnövelt biológiai aktivitást kifejtő vagy - a heparinnal szembeni csökkent affinitás következtében - in vivő hosszabb felezési idejű TCF-mutánst bocsássunk rendelkezésre.
A fenti cél elérése érdekében végzett kutatómunka során olyan új TCF-mutánsokat állítottunk elő, amelyeknek az aminosavszekvenciái különböztek attól a TCFmutánsétól, amelyet ezen találmányt megelőzően kaptunk, és ezek megnövekedett biológiai aktivitást és/vagy csökkent heparinnal szembeni aktivitást mutattak. A jelen találmány olyan TCF-mutánsokra vonatkozik, amelyeknek több mint tízszeres a specifikus aktivitása (biológiai aktivitás per egységnyi mennyiségű protein) és/vagy csökkent a heparinnal szembeni aktivitása.
Ezek az első, különösen magas biológiai aktivitású mutánsok, és ezeket a natív TCF aminosavszekvenciájának mutagenizálásával állítottuk elő.
A találmány tárgyát olyan TCF-mutáns képezi, amelynek alacsony a heparinhoz való affinitása és/vagy magas a biológiai aktivitása, és amelyet a natív TCF aminosavszekvenciájában az N-terminális-végtől az első kringle doménig terjedő szakaszban egy vagy több aminosavmaradék mutagenizálásával állítottunk elő.
Az alábbiakban az ábrák rövid leírása következik.
Az 1. ábrán a tisztított TCF és a találmány szerinti TCF-mutánsok SDS-elektroforézissel kapott profilja látható.
A 2. ábra a tisztított TCF és a találmány szerinti TCF-mutánsok proliferatív hatását mutatja hepatocitán. A függőleges tengelyre felvitt relatív aktivitás (%) az egyes minták proliferatív aktivitásának és a 10 ng/ml TCF 100%-nak vett proliferatív aktivitásának az arányát fejezi ki.
A 3. ábra a tisztított RKRR2AAAA mutáns és a TCF hepatocitákban kifejtett proliferatív hatásának összehasonlítását ábrázolja.
A 4. ábra a tisztított KJKTKK27AIATAA mutáns és a TCF hepatocitákban kifejtett prolifetatív hatásának összehasonlítását ábrázolja.
Az 5. ábra a tisztított RKRR2AAAA mutáns, a KIK.TKK27AIATAA mutáns és a TCF vese-epiteliálissejtekben kifejtett proliferatív hatásának összehasonlítását ábrázolja.
A 6. ábra a tisztított RKRR2AAAA mutáns, a KIKTKK27AIATAA mutáns és a TCF csontvelősejtekben kifejtett proliferatív hatásának összehasonlítását ábrázolja.
A 7. ábra a tisztított TCF, RKRR2AAAA mutáns és KIKTKK27AIATAA mutáns dózishatását mutatja az összprotein-szérumszintre patkányokban.
HU 220 167 Β
A 8. ábra a tisztított TCF, RKRR2AAAA mutáns és KIKTKK27AIATAA mutáns dózishatását mutatja a HDL-koleszterin-szérumszintre patkányokban.
(HDL=high density lipoprotein).
A natív protein és a protein aminosavszekvenciájának bizonyos részén végzett mutagenezissel kapott mutáns tulajdonságainak összehasonlítása révén ennek a résznek a funkciója meghatározható. Egy olyan protein esetében, amelynek a szerkezete nem teljesen ismert, gyakran szoktak olyan aminosavat - ilyen az alanin - szubsztituálni, amely nem zavaija egy olyan poláris aminosav térbeli szerkezetét, amelyről feltételezik, hogy a protein felületén helyezkedik el, abból a célból, hogy megakadályozzák a protein szerkezetének a mutagenezis okozta megváltozását. Egy protein aminosavszekvenciájának más szekvenciává való helyspecifikus megváltoztatásához PCR (polymerase chain reaction=polimeráz lánc reakció) módszenei helyspecifikus mutációkat tartalmazó cDNS-t állíthatunk elő, amikor is templátként a natív TCF-et kódoló cDNS-t használjuk és más aminosavakat kódoló szintetikus oligonukleotidokat használunk.
A fent leírtak szerint kapott cDNS-t egy megfelelő expressziós promotert [citomegalovírus (CMV) SRa; Mól. Cell. Bioi., 8, 466-472 (1988); 277 489 számon közzétett, nem vizsgált japán szabadalmi bejelentés (1989)] tartalmazó vektorba építhetjük be, és ezt eukarióta sejtekbe - például emlőssejtekbe - transzferálhatjuk. Ezeknek a sejteknek a tenyésztése révén a szóban forgó TCF-mutánsokat a tenyészléből állíthatjuk elő.
Számos TCF-mutánst szerkeszthetünk úgy, hogy különböző helyeken vagy csoportoknál mutációkat vezetünk be. Hat találmány szerinti mutánst állítottunk elő. Ezeket a mutánsokat úgy neveztük el, hogy megszámoztuk az aminosavszekvenciát mutagenizálás előtt, és megadtuk a mutagenizált rész N-terminális-végén lévő aminosav számát, majd mutagenizálás után a megváltoztatott aminosavszekvenciát az aminosavak egybetűs kódjával jelöltük. Például, ha a teljes Arg-Lys-Arg-Arg szekvenciát az N-terminális-végtől a második pozícióban Ala-val helyettesítjük, a mutáns jele a következő lesz: RKRR2AAAA. Egy másik példa: ha a mutánst, amelynek eredeti szekvenciája Lys-Ile-Lys-Thr-LysLys volt, az N-terminális-végtől a 27. pozícióban AlaIle-Ala-Thr-Ala-Ala szekvenciával cseréljük ki, annak jele a következő lesz: ΚΤΚΤΚΚ27ΑΙΑΤΑΑ.
A találmányt a példákkal részletesen ismertetjük. Ezek a példák azonban csak szemléltetésül szolgálnak és nem korlátozzák a találmány oltalmi körét.
1. példa
Az alább leírt módszerrel helyspecifikus mutációt vezettünk be a 6,3 kb méretű TCF expressziós plazmidba, amelyet a WO 92/01053 számon közzétett nemzetközi szabadalmi bejelentésben közölt módszerrel állítottunk elő. Az ezen plazmidot tartalmazó E. coli-t FERM BP-3479 számon helyeztük letétbe 1990. július 13-án.
I. A pcD TCF001 templát plazmid előállítása
Az alább leírt módszerrel mutációt vezetünk be a 34es számú nukleotid PstI hasítási helyénél, hogy olyan mukleotidszekvenciát kapjunk, amely nem hasítható. A PCR-t 8 ng pOCTCF plazmiddal (ezt a plazmidot úgy kaptuk, hogy a TCF cDNS Sall/Sphl fragmentumát beépítettük a pVC18 plazmidba) végeztük, amely templátként szerepelt, a mutagenizált PstOl primer (1. számú szekvencia) és a nem mutagenizált TCF415 R primer (2. számú szekvencia) kombinációja jelenlétében és a mutagenizált P002 primer (3. számú szekvencia) és a nem mutagenizált TCFSal-77 primer (4. számú szekvencia) kombinációja jelenlétében.
Miután a primereket Microson 100 (Amicon) molekulaszűrővel eltávolítottuk a reakcióelegyből, a termékeket összekevertük. Ezután egy második PCR-t végeztünk a TCFSal-77 és a TCF415 R primer használatával. A kapott terméket BsbPI és PstI restrikciós enzimmel emésztettük. A fragmentumot ligáló kit (Takarashuzo) segítségével ligáltuk az előzőleg előállított pVC TCF BstPI/PstI legnagyobb BstPI/PstI fragmentumával. A ligációs reakcióelegy egy részével E. coli DH5a sejteket transzformáltunk.
A transzformált E. coli DH5a sejteket 50 pg/ml ampicillint tartalmazó L levesben tenyésztettük, és egy megfelelő plazmidot szelektáltunk az ampicillinrezisztens telepekből. Ezt a plazmidot Sáli és Sphl restrikciós enzimmel emésztettük, összekevertük az új pcDNAI (amelyben a pcDNAI multiklónozó helyét mutagenizáltuk, és így HindlII-Sall-BamHI-SphI-NotI klónozó helyet kaptunk) előzőleg előállított Sall/Spkl nagy fragmentumával és ligációs kit segítségével inszertáltuk. A reakcióeleggyel E. coli MC1061/P3 törzset (Invitrogen) transzformáltunk. A transzformált E. coli MC1061/P3 sejteket 50 pg/ml ampicillint és 7,5 pg/ml tetraciklint tartalmazó L levesben tenyésztettük.
A kapott ampicillin-tetraciklin rezisztens telepekből plazmid-DNS-t izoláltunk, amelyek DNS-szekvenciáját DNS-szekvenátorban (Perkin-Elmer) határoztuk meg. Megfelelő szerkezetű plazmidot - pcD TCF001 - kaptunk, és a kapott plazmid használatával TCF-mutánsokat állítottunk elő.
II. TCF-mutánsokhoz alkalmas expressziós vektor szerkesztése és transzformált E. coli előállítása
i) RKRR2AAAA expressziós vektor szerkesztése és transzformált E. coli előállítása
Az RKRR2AAAA-t kódoló cDNS-hez expressziós vektort szerkesztettünk PCR-rel 2 lépésben. Az első lépésben a mutagenizált 2RKRRF primer (5. számú szekvencia) és a nem mutagenizált TCF977 R primer (6. számú szekvencia) kombinácóját, valamint a mutagenizált 2RKRR primer (7. számú szekvencia) és a nem mutagenizált TCFSal-77 primer (4. számú szekvencia) kombinációját használtuk.
Mindkét reakcióban templátként 4 ng peD TCF001et használtunk. A reakciók után mindkét reakcióelegyet összekevertük és Microcon 100 készülékben tisztítottuk. A második PCR-ben a keverék egyhuszad részét használtuk templátként. Primerek gyanánt a TCFSal-77-et és a TCF977 R-t használtuk. A reakcióelegyet Microcon 100-zal tisztítottuk és BstPI és EcoRV restrikciós enzimmel emésztettük. A fragmentumot az előzőleg BstPIgyel és EcoRV-tel hasított SRa-tartalmú TCF expresz3
HU 220 167 Β sziós vektor nagy fragmentumába építettük be egy ligációs kit használatával. A ligázos reakcióeleggyel E. coli DH5a sejteket transzformáltunk, majd a kapott ampicillin rezisztens sejtek közül egy megfelelő kiónt izoláltunk a fent leírt módszerrel azonos módon. A kapott kiónból plazmid-DNS-t izoláltunk és ennek DNS-szekvenciáját DNS-szekvenátorral (Perkin-Elmer) határoztuk meg. A plazmidot EcoRV és BstPI restrikciós enzimmel hasítottuk és beépítettük az előzőleg EcoRV és BstPI restrikciós enzimekkel emésztett pVC TCF-fragmentumba, majd ezzel E. coli DH5a sejteket transzformáltunk.
Az ezen plazmidot tartalmazó E. coli törzset 1994. november 10-én helyeztük letétbe pVC TCF2 elnevezéssel a National Institute of Bioscience and Humán Technology intézménynél FERM P-14624 letéti szám alatt.
ii) ΚΙΚΤΚΚ27ΑΙΑΤΑΑ expressziós vektor szerkesztése és transzformált E. coli előállítása
A KIKTKK27AIATAA mutánst kódoló cDNS számára expressziós plazmidot szerkesztettünk PCRrel két lépésben. Az első PCR-ben a mutagenizált 27KIKTKKF primer (8. számú szekvencia) és a nem mutagenizált TCF977 R primer (6. számú szekvencia) kombinációját, valamint a mutagenizált 27KIKTKK R primer (9. számú szekvencia) és a nem mutagenizált TCFSal-77 primer (4. számú szekvencia) kombinációját használtuk. Mindkét reakcióban 4 ng pcD TCF001et használtunk templát gyanánt. A reakciók után mindkét reakcióelegyet összekevertük és Mícroson 100-ban tisztítottuk. A második PCR-ben a keverék egyhuszad részét használtuk templátként. Primerekként a TCFSal-77-et és a TCF977 R-t használtuk.
A reakcióelegyet Microson 100 segítségével tisztítottuk, majd BstPI és EcoRV restrikciós enzimmel emésztettük. A fragmentumot az előzőleg BstPI-gyel és EcoRV-tel hasított SRa-tartalmú TCF expressziós vektor nagy fragmentumába építettük be egy ligációs kit használatával. A ligázos reakcióeleggyel E. coli DH5a sejteket transzformáltunk, majd a kapott ampicillinrezisztens sejtekből a fent leírt módszerrel azonos módon egy megfelelő kiónt izoláltunk. A kapott klónból plazmid-DNS-t izoláltunk, amelynek a DNS-szekvenciáját DNS-szekvenátorban határoztuk meg. A plazmidot EcoRV és BstPI restrikciós enzimmel hasítottuk, majd a pVC TCF egy fragmentumába építettük be, amelyet EcoRV és BstPI restrikciós enzimmel hasítottunk, ezután ezzel E. coli DH5a sejteket transzformáltunk. Az ezen plazmidot tartalmazó E. coli törzset 1994. november 10-én helyeztük letétbe a National Institute of Bioscience and Humán Technology intézménynél FERM P-14623 letéti szám alatt.
iii) A K54A expressziós vektor szerkesztése és transzformált E. coli előállítása
A K54A mutánst kódoló cDNS számára expressziós plazmidot szerkesztettünk két lépésben PCR-rel. Az első PCR-ben a mutagenizált 54K F primer (10. számú szekvencia) és a nem mutagenizált TCF977 R primer (6. számú szekvencia) kombinációját, valamint a mutagenizált 54K R primer (11. számú szekvencia) és a nem mutagenizált TCFSal-77 primer (4. számú szekvencia) kombinációját használtuk. Mindkét reakcióban templátként 4 ng pcD TCFOOl-et használtunk. A reakciók után a két reakcióelegyet összekevertük és Microcon 100 segítségével tisztítottuk.
A második PCR-ben az elegy huszadrészét használtuk templátként. Primerek gyanánt a TCFSal-77-et és a TCF977 R-t használtuk. A reakcióterméket Microcon 100-zal tisztítottuk és BstPI és EcoRV restrikciós enzimmel emésztettük. A fragmentumot az előzőleg BstPI-gyel és EcoRV-tel hasított SRa-tartalmú TCF expressziós vektor nagy fragemtumába építettük be egy ligációs kit használatával. A ligázos reakcióeleggyel E. coli DH5a sejteket transzformáltunk, majd a kapott ampicillinrezisztens sejtekből a megfelelő kiónt a fent leírt módszerrel azonos módon izoláltuk. A kapott kiónból plazmid-DNS-t izoláltunk és e DNS-szekvenciát DNS-szekvenátorral határoztuk meg.
iv) Az RGKD132 AGAA expressziós vektor szerkesztése és transzformált E. coli előállítása
Az RGKD132AGAA mutánst kódoló cDNS számára expressziós plazmidot szerkesztettünk PCR-rel, 2 lépésben. Az első PCR-ben a mutagenizált 132RGKD F primer (12. számú szekvencia) és a nem mutagenizált TCF977 R primer (6. számú szekvencia) kombinációját, valamint a mutagenizált 132RGKD R primer (13. számú szekvencia) és a TCFSal-77 primer (4. számú szekvencia) kombinációját használtuk. Templátként mindkét reakcióban 4 ng pcD TCFOOl-et használtunk. Miután a reakció végbement, a két reakcióelegyet egyesítettük és Microson 100-zal tisztítottuk.
A második PCR-ben az elegy huszadrészét használtuk templát gyanánt. A reakcióterméket Microcon 100zal tisztítottuk, majd BstPI és EcoRB restrikciós enzimmel emésztettük. A fragmentumot az előzőleg BstPIgyel és EcoRV-tel hasított SRa-tartalmú TCF expressziós vektorba építettük be egy ligációs kit használatával. A ligázos reakcióeleggyel E. coli D45a sejteket transzformáltunk és a kapott ampicillinrezisztens sejtvonalakból a megfelelő kiónt izoláltuk. A kapott kiónból plazmid-DNS-t izoláltunk a fent leírtakkal azonos módon és bázisszekvenciáját DNS-szekvenátorban határoztuk meg.
v) Az RÍ 42A expressziós vektor szerkesztése és transzformált E. coli előállítása
Az RÍ42A mutánst kódoló cDNS számára expreszsziós plazmidot szerkesztettünk PCR-rel két lépésben. Az első PCR-ben a mutagenizált 142RF primer (14. számú szekvencia) és a nem mutagenizált TCF977 R primer (6. számú szekvencia) kombinációját, valamint a mutagenizált 142R R primer (15. számú szekvencia) és a TCFSal-77 primer (4. számú szekvencia) kombinációját használtuk. Mindkét reakcióban templátként 4 ng pcD TCF-et használtunk. Miután a reakció végbement, a két reakcióelegyet egyesítettük és Microcon 100-zal tisztítottuk.
Ezután, a második PCR-ben, a keverék egyhuszad részét használtuk templátként. A reakcióelegyet Microcon 100-zal tisztítottuk és BstPI és EcoRV restrikciós enzimmel emésztettük. A fragmentumot az előzőleg
HU 220 167 Β
BstPI-gyel és EcoRV-tel hasított SRa-tartalmú TCF expressziós vektorba építettük be egy ligációs kit használatával. A ligázos reakcióeleggyel E. coli DH5a sejteket transzformáltunk és a kapott ampicillinrezisztens sejtvonalakból, az előbbiekben leírt módon, a megfelelő kiónt izoláltuk. A kapott kiónból előállítottuk a plazmid-DNS-t és ennek DNS-szekvenciáját DNS-szekvenátorral határoztuk meg.
vi) Az R42A expressziós vektor szerkesztése és transzformált E. coli előállítása
Az R42A mutánst kódoló cDNS-hez expressziós plazmidot szerkesztettünk kétlépéses PCR-rel. Az első PCR-ben a mutagenizált 42R F primer (16. számú szekvencia) és a nem mutagenizált TCF977 R primer (6. számú szekvencia) kombinációját és a mutagenizált 42R R primer (17. számú szekvencia) és a TCFSal-77 (4. számú szekvencia) kombinációját használtuk. Mindkét reakcióban templátként 4 ng pcD TCFOOl-et használtunk.
Miután a reakció végbement, a két reakcióelegyet egyesítettük és Microcon 100-zal tisztítottuk. A második PCR-ben ennek a keveréknek a huszadrészét használtuk templátként. Primerek gyanánt a TCFSal-77-et és a TCF977 R-t használtuk. A reakcióelegyet Microcon 100 segítségével tisztítottuk és BstPI/EcoRV restrikciós enzimmel emésztettük. A fragmentumot az előzőleg BstPI-gyel és EcoRV-tel hasított SRa-tartalmú TCF expressziós vektorba építettük be egy ligációs kit használatával. A ligázos reakcióeleggyel E. coli DH5a sejteket transzformáltunk és az ampicillinrezisztens sejtvonalakból - az előzőekben leírt módon - egy megfelelő kiónt izoláltunk. A kapott klónból előállítottuk a plazmid-DNS-t és ennek DNS-szekvenciáját DNS-szekvenátorral határoztuk meg.
III. Expressziós plazmidok előállítása és tisztítása TCF-mutánsokhoz
A fenti expressziós plazmidokat tartalmazó hatféle transzformált E. coli törzset 50 pg/ml ampicillint tartalmazó L levesben (400 ml) tenyésztettük 37 °C-on, rázott inkubátorban, egy éjszakán át. Amikor a tenyészet elérte az OD600=1,0 értéket, Spectinomycint (Sigma) adtunk hozzá 0,3 mg/ml végkoncentrációig. A plazmidDNS-t alkalikus SDS-módszerrel izoláltuk, Maniatis szerint [Molecular Cloning, 2. kiadás, 1.21-1.52 oldal (1989); Cold Spring Harbor Laboratory], A hatféle TCF-mutáns expressziós plazmidot cézium sűrűség-gradiens centrifugálással tisztítottuk.
IV. TCF-mutáns expressziós plazmid transzfektálása állati sejtbe
Az említett mutáns expressziós plazmidokat kínaihörcsög-petefészek- (Chinese Hamster Ovary=CHO) sejtekbe transzfektáltuk. A CHO-sejteket (2xl06) 0,8 ml 10% fetális boíjúszérumot (fetal calf serum FCS; Gibco) szuszpendáltuk, amelyben a továbbiakban 200 pg expressziós vektort tartalmazó oldatot, és 10 pg, előzőleg 25 pl TE pufferben (10 mM trisz.HCl, mM EDTA; pH 8,0) oldott, pSV2 bsr Blasticidin rezisztens gén expressziós plazmidot (Funakoshi) szuszpendáltunk. Ezt a szuszpenziót elektroporációval kezeltük 330 V és 960 pF mellett, majd 10 percig állni hagytuk szobahőmérsékleten, ezután pedig 10 ml 10% FCSt tartalmazó IMDM táptalajban szuszpendáltuk. A sejteket 2 napon át 37 °C-on, szén-dioxid-tartalmú inkubátorban (5% CO2) tenyésztettük. Két nap múlva a felülúszót összegyűjtöttük és a kifejezett TCF-mutáns mennyiségét enzim immunassay-vel (EIA) analizáltuk [N. Shima et al., Gastroenterologia Japonica, 26. 477-482 (1991)], anti-TCF monoklonális antitest használatával. Ezt mintaként használtuk a biológiai aktivitás vizsgálatához. A sejteket tripszines (Gibco) kezeléssel arattuk le a palackok aljáról, és meghatároztuk az élő sejtek számát. Nune-féle 96 tartályos lemezeken egy-egy tartályhoz körülbelül 10 000 sejtet adtunk, s a sejteket tartályonként 200 pl 10% FCS és 5 pg/ml Blasticiden-tartalmú IMDM táptalajban tenyésztettük 23 hétig. Ezután, azaz 2-3 hét múlva, minden tartályból 50 pl alikquot mennyiségeket vettünk ki, s e mintákat TCF-mutáns expresszióra vizsgáltuk EIA segítségével. A TCF-mutánsokat kifejező sejtklónokat 12 tartályos lemezeken és 25 cm2-es palackokban tenyésztettük. A TCF-mutánst termelő sejtvonalakat CHO-sejtekből képeztük, a fenti műveletekkel.
V. TCF-mutáns-termelő sejtek üzemszerű tenyésztése
A mutáns termelősejteket 75 cm2-es palackokból, tripszines kezelés segítségével arattuk le, amikor összefolytak. A learatott sejteket 10 db, egyenként 100 ml táptalajt tartalmazó 225 cm2-es palackba vittük át és egy hétig tenyésztettük. Ezután összegyűjtöttük a felülúszókat. Egyszer vagy kétszer megismételve ezt a műveletet, 1-2 liter tenyészlevet nyertünk.
VI. A TCF-mutánsok tisztítása
A TCF-mutánsok tisztítását 3 lépésben végeztük az alábbiakban leírtak szerint.
i) Heparin-Sepharose CL-6B
Az egyes TCF-mutánsokat kifejező CHO-sejtek 1-2 liternyi tenyészetéből a táptalaj centrifügálásával (2000 fordulat/perc, 10 perc) távolítjuk el a csapadékot. A felülúszót 0,45 pm-os szűrőn (Germán Science) szűrjük. A TCF-mutánst 4 ml/perc átfolyási sebesség mellett heparin-Sepharose CL-6B oszlopra (25 mm χ 120 mm; Pharmacia) adszorbeáljuk, amelyet 0,3 mólos nátrium-klorid és 0,01% Tween 20 tartalmú 10 mmólos trisz.HCl-pufferrel (pH 7,5) hoztunk egyensúlyba. Az oszlopot körülbelül 500 ml kiegyensúlyozó pufferrel mossuk és a TCF-mutánst 2 mólos nátrium-klorid és 0,01% Tween 20 tartalmú 10 mmólos trisz.HCl-pufferrel (pH 7,5) eluáljuk. Az eluált oldatot frakciószedővel szedtük 4 ml-es frakciókként, és azokat a frakciókat, amelyek 280 nm-nél abszorpciót adtak, egyesítettük.
ii) Mono S FPLC
A 2 mól nátrium-kloriddal leoldott TCF-mutánstartalmú frakciót 0,15 mól nátrium-klorid-tartalmú 10 mmólos foszfát pufferrel (pH 7,0) szemben dializáljuk, majd a csapadékot centrifugálással (12 000 fordulat/perc; 90 perc) távolítjuk el. A TCFmutánst tartalmazó felülúszót Monos S oszlopon (5 mm χ 50 mm; Pharmacia) engedjük át 1 ml/perc átfolyási sebesség mellett, hogy a TCF-mutáns az oszlopra
HU 220 167 Β adszorbeálódjon. Az oszlopot előzőleg 0,15 mól nátrium-klorid és 0,01% Tween 20 tartalmú 10 mmólos foszfátpufferrel (pH 7,0) hoztuk egyensúlyba. Miután az oszlopot körülbelül 30 ml kiegyensúlyozó pufferrel átmostuk, a TCF-mutánst nátrium-klorid lineáris gradiensével - 1,0 mol-ig - 60 percig eluáljuk 0,5 ml/percre változtatott átfolyási sebességgel. A leoldott oldatot 5 ml-es frakciókként frakciószedővel szedjük és a TCF-mutánst tartalmazó frakciókat a 280 nm-en mért abszorpció révén és EIA segítségével analizáljuk, majd összegyűjtjük.
iii) Heparin 5-PW FPLC
A Mono S oszlopkromatográfia használatával kapott TCF-mutánst tartalmazó frakcióhoz kétszeres mennyiségű 0,01% Tween 230 tartalmú 10 mmólos trisz.HCl-puffert (pH 7,5) adunk. Az oldatot Heparin 5PW oszlopon (5 mmx75 mm; TOSOH) engedjük át 1 ml/perc átfolyási sebesség mellett, hogy a TCF-mutánst az oszlopra adszorbeáljuk. Az oszlopot előzőleg 0,3 mól nátrium-klorid és 0,01% Tween 20 tartalmú 10 mmólos trisz.HCl-pufferrel (pH 7,5) hoztuk egyensúlyba. A TCF-mutánst nátrium-klorid lineáris gradiensével - 2,0 mólig - 60 percig eluáljuk 0,5 ml/perc-re változtatott átfolyási sebesség mellett.
A leoldott oldatot 5 ml-es frakciókként szedjük, frakciószedővel. A TCF-mutánst tartalmazó frakciókat a 280 nm-en mért abszorpció révén és EIA segítségével analizáljuk, majd összegyűjtjük. A kapott TCF-mutánsoldatot 0,01% Tween 20 tartalmú PBS-sel (TPBS) szemben dializáljuk, s így kapjuk a végső tisztított terméket. A végső tisztított termék proteintartalmát Lowry módszerével határozzuk meg. Az RKRR2AAAA és a KIKTKK27 TCF-mutáns aminosavszekvenciáját a 18. számú szekvencia, illetve a 19. számú szekvencia írja le.
VII. Tisztított TCF-mutáns SDS-poliakrilamid gélelektroforézise
A tisztított TCF-mutánsból 200 ng-ot elektroforetizálunk SDS-poliakrilamid gélben. Az RKRR2AAAA és ΚΙΚΤΚΚΚ27ΑΙΑΤΑΑ TCF-mutánsok - amelyek 10szeresre nőtt biológiai aktivitást mutatnak, mint alább leírjuk - és a natív TCF elektroforézisének sematikus ábrázolása az 1. ábrán látható. Mind redukáló körülmények (β-merkapto-etanol jelenlétében), mind nem redukáló körülmények (β-merkapto-etanol nélkül) mellett a kapott eredmények nem mutatnak különbséget a három TCF között. Ezenfelül csak olyan sávok jelentek meg, amelyek a két TCF-mutáns szerkezetéből várhatóak voltak.
2. példa
TCF és TCF-mutáns affinitása heparinhoz
I. Heparin-Sepharose CL-6B Az egyes TCF-mutánsokat kifejező CHO-sejtek tenyészetéből a táptalaj centrifugálásával (1200 g; 10 perc) távolítjuk el a kicsapódásokat, majd a felülúszót 0,22 pm-es szűrőn szűrjük át. A megszűrt felülúszót TPBS-sel kiegyensúlyozott Heparin-Sepharose CL-6B oszlopra (5 mmx5 mm; Pharmacia) visszük, hogy a TCF-mutánst az oszlopra adszorbeáljuk. Az oszlopot 3 ml TPBS-sel mossuk, majd a TCF-mutánst 0,2-0,3 mól nátrium-klorid-tartalmú TPBS-sel eluáljuk úgy, hogy a sókoncentrációt lépésenként növeljük. Az eluátumban EIA-val analizáltuk a TCF-mutáns kon15 centrációját, és az eluátum sókoncentrációját úgy tekintettük, mind a mutáns heparin affinitásának jellemzőjét.
II. Heparin 5-PW FPLC
Az egyes TCF-mutánsokat kifejező CHO-sejtek tenyészetét (30-60 ml) centrifugáljuk (1000 g; 10 perc)
0,22 pm-os szűrőn engedjük át a kicsapódás eltávolítására, majd 0,01% Tween 20 tartalmú 20 mmólos trisz.HCl-pufferrel kiegyensúlyozott Heparin 5-PW oszlopra visszük 1,0 ml/perc átfolyási sebességgel a TCFmutáns adszorbeálása céljából. Az oszlopot körülbe25 lül 20 ml kiegyensúlyozó pufferoldattal mossuk, majd a TCF-mutánst nátrium-klorid lineáris gradiensében - 1,5 M-ig - 45 percig eluáljuk 0,5 ml/perc átfolyási sebesség mellett.
Frakciószedővel 0,5 ml-es frakciókat szedünk és min30 den egyes frakcióban EIA használatával határozzuk meg a TCF-mutáns koncentrációját. Az elúció sókoncentrációja határozza meg a mutáns heparinhoz való affinitását.
Ezen TCF-mutánsok heparinhoz való affinitásának meghatározásánál kapott eredményeket az 1. táblázat35 bán mutatjuk be. A Heparin-Sepharose-nál a nátriumklorid elúciós koncentrációja azt a koncentrációt jelenti, amelynél a TCF-mutáns maximális mennyiségben eluálódik. Az elúciós koncentráció relatív viszonyát a következő hányados fejezi ki: a mutáns TCF-nél az
NaCl elúciós koncentrációja per a natív TCF-nél az NaCl elúciós koncentrációja. Az n.v. rövidítés jelentése „nem vizsgáltuk”. A Heparin-Sepharose-zal végzett vizsgálatban az RKRR2AAAA, KIKTKK27AIATAA és RH2A heparinhoz való affinitása szignifikánsan le45 csökkent. A Heparin I-PW-vel végzett vizsgálatban megfigyeltük, hogy a mutánsok heparinhoz való affinitása körülbelül 70%-al kisebb, mint a natív TCF-é.
1. táblázat
Heparin-Sepharose NaCl elúciós koncentrácója (mól) Heparin 5-PW NaCl elúciós koncentrációja (mól) Elúciós koncentráció relatív hányadosa
TCF 0,9 1,14 1,00
RKRR2AAAA 0,6 0,78 0,68
KIKTKK27AIATAA 0,6 0,82 0,72
R42A 0,7 0,84 0,74
K54A 0,9 1,10 0,96
RGKD132AGAA 0,9 n.v. n.v.
R142A 0,9 n.v. n.v.
HU 220 167 Β
3. példa
A TCF és a TCF-mutánsok proliferatív aktivitása hepatocitára in vitro
A proliferatív aktivitást a következő módszerrel vizsgáltuk: Segren módszere szerint [Method in Cell Biology, 13. kötet, 29. oldal; Academic Press, New York (1976)] hepatocitákat izoláltunk körülbelül 200 g-os Wistar-patkányokból. A sejteket 96 tartályos lemezekre (Falcon) mértük be: l,0x 104 sejt/50 μΐ/tartály. A sejteket 37 °C-on egy éjszakán át tenyésztettük 10% fetális borjúszérumot és 10 μΜ dexametazont tartalmazó Williams E táptalajt (a továbbiakban: alaptáptalaj; Flow Laboratory) használva. Huszonnégy óra múlva minden tartályba TCF-et vagy TCF-mutánst tartalmazó 10 μΐ alaptáptalajt mértünk be. A lemezeket 37 °C-on további 22 órán át inkubáltuk. Ekkor, azaz 22 óra múlva, 3Htimidint (Amersham) adtunk a tartályokhoz 1 pCi/tartály értékben, majd a tenyészetet további 2 órán át állni hagytuk. Ezután a sejteket kétszer mostuk PBS-sel, majd 0,5% tripszinnel való kezelés segítségével arattuk le. A sejteket sejtarató (cell harvester) segítségével üvegszűrőre gyűjtöttük össze. A beépült radioaktivitást minden tartályban Mátrix 96 (Packard) készülékkel mértük, és ezzel a DNS-szintézis mennyiségét határoztuk meg. Az eredményeket a 2. ábra mutatja be. A K54A, RGKD132AGAA és az R142A mutáns biológiai aktivitása 1,4-szer, 2,0-szer, illetve 1,6-szor magasabb volt, mint a natív TCF-é 2,5 ng/ml TCF antigén koncentráció mellett. Ezután azokat a mutánsokat, amelyek heparinnal szemben csökkent affinitást mutattak, Lowry módszerével vizsgáltuk, majd a biológiai aktivitást a maximális proliferatív aktivitást (EDS0) kifejtő proteinkoncentráció vonatkozásában hasonlítottuk össze (3. és 4. ábra).
A következő eredményeket kaptuk. Két protein, az RKRR2AAAA és a KIKTKK27AIATAA, a protein egységnyi mennyiségére vonatkoztatva, tízszer több biológiai aktivitást fejt ki, mint a natív TCF.
4. példa
A TCF és TCF-mutáns prolifeatív aktivitása veseepiteliálissejtekben
Vese-epiteliálissejtekben a proliferatív aktivitást a következő módszerrel határoztuk meg:
Amerikai oposszum vese-epiteliálissejtvonalából származó OK-sejteket mértünk be 96 tartályos lemezekre 1 χ 104/100 μΐ/tartály mennyiségben. A sejteket 10% fetális boíjúszérumot tartalmazó DMEM táptalajban tenyésztettük 37 °C-on egy éjszakán át. Ezután minden tartályt 2-3-szor mostunk szérumot nem tartalmazó DMEM táptalajjal. A tartályokban lévő táptalajt szérumot nem tartalmazó DMEM táptalajjal cseréltük ki, és a tenyészetet további 2 napon át 37 °C-on tartottuk. Ezután a tartályokban a táptalajt újból kicseréltük 50 μΐ szérummentes friss DMEM táptalajjal, és 50 μΐ 0,2% marhaszérum-albumint tartalmazó DMEM táptalajjal hígított TCF-et vagy TCF-mutánst adtunk hozzá. A tenyésztést további 24 órán át folytattuk. A 24 óra elteltével 3H-timidint mértünk a tartályokba 1 pCi/tartály mennyiségben, és a tenyészetet további 2 órán át állni hagytuk. A sejteket ezután kétszer mostuk PBS-sel és a sejteket 0,5% tripszinnel való kezelés segítségével arattuk le. A sejteket üvegszűrőn gyűjtöttük cell harvester segítségével. A beépített radioaktivitást minden tartályban Mátrix 96 készülékkel mértük, s ezzel a DNSszintézis mértékét határoztuk meg. Az eredményeket az
5. ábrán mutatjuk be.
A következő eredményeket kaptuk: az RKRR2AAAA és a KIKTKK27AIATAA biológiai aktivitása, összehasonlítva a natív TCF-ével, egységnyi mennyiségű proteinre vonatkoztatva, több mint kétszeresére nőtt.
5. példa
A TCF és TCF-mutáns proliferatív aktivitása in vitro csontvelősejtben
Csontvelősejtekben a proliferatív aktivitást a következő módszerrel határoztuk meg:
Egér-csontvelősejtvonalból származó NFS-60 sejteket 96 tartályos lemezekre mértünk be 5,0 x 104/sejt/ /50 μΐ/tartály mennyiségben. A sejteket 10% fetális borjúszérumot tartalmazó RPMI táptalajban tenyésztettük 37 °C-on 24 órán át. A táptalajhoz még hozzáadtunk 50 μΐ, táptalajjal hígított TCF-et vagy TCF-mutánst. Huszonnégy óra múlva minden tartályhoz 5 mg/ml MTT-t (Sigma) adtunk és a tenyésztést további 4 órán át folytattuk. Ezután minden tartályba 100 μΐ 10% SDS/10 mM ammónium-klorid-oldatot mértünk be, és a lemezeket egy éjszakán át szobahőmérsékleten állni hagytuk. Ezután Immunoreader NJ-2000 (Intermed) készüléken, 590 nm-en mértük az optikai abszorpciót, amely a proliferatív aktivitást jelezte.
Az eredményeket a 6. ábrán mutatjuk be. Megállapítottuk, hogy az RKRR2AAAA és a KIKTKK27AIATAA protein egységnyi mennyiségére jutó biológiai aktivitás csontvelősejtekben 1/2-1/20 részét teszi ki a natív TCF-ének.
6. példa
A TCF és a TCF-mutánsok in vivő biológiai aktivitása
Az in vivő biológiai aktivitást a következő módszerrel vizsgáltuk.
A TCF-et vagy a TCF-mutánst 0,01% Tween 20 tartalmú PBS-ben oldottuk fel. Az oldattal 6 hetes Wistarpatkányokat oltottunk intravénásán - farokvénán keresztül - 4 napon át 2 χ 2 ml/kg/nap dózissal. Az utolsó oltást követő napon vérmintát vettünk a kaudalis véna cavából étemarkózisban. A szérumot centrifugálással (3000 fordulat/perc; 10 perc) választottuk el. Plazma esetén, közvetlenül a vérvétel után nátrium-citrátot adtunk a vérhez (0,38% végkoncentrációban), majd centrifugáltuk (3000 fordulat/perc; 10 perc) és így kaptuk a plazmát. A kapott szérumot vagy plazmát -30 °C-on, fagyasztóban tartottuk, majd a következő szérummintákat határoztuk meg: összprotein, albumin telítetlen vaskötő kapacitás, összkoleszterin, szabad koleszterin, HDL-koleszterin és foszfolipid. Ezeket a vizsgálatokat szérum-autoanalizátoron (Hitachi 7150 Autoanalyzer) végeztük. A plazmában a protrombinidőt és a fibrinogént Autó blood coagulation analyzer KC40 (Ame7
HU 220 167 Β rung) segítségével mértük. Ezekhez az analízisekhez a következő kiteket (készleteket) használtuk.
Összprotein: Autóséra™ TP;
Albumin: Autóséra™ALB;
Telítetlen vaskötő kapacitás: Clinimate™ VIBC;
Összkoleszterin: Autóséra™ CHO-2;
Szabad koleszterin: Autóséra™ F-CHO-2;
HDL-koleszterin: HDL-C-2 „DAIICHI”;
Foszfolipid: Autóséra™ PL-2 (A fenti kitek a Daiichi-Pure Chemicals Co., Ltd. termékei).
Protrombinidő: Orthobrain thromboplastin (Ortho Diagnostic System Inc.)
Fibrinogen: Sun assay Fib (Nitto Boseki Co., Ltd.).
Az összprotein szérumszintjére gyakorolt dózishatások és a HDL-koleszterin szérumszintjére ható dózishatások jellemző példáit a 7., illetve a 8. ábra mutatja be.
Szekvenciajegyzék 1. számú szekvencia A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZÚSÁG:
TÍPUS:
SZÁLTÍPUS:
TOPOLÓGIA:
A MOLEKULA JELLEMZŐI:
TÍPUS:
JEL:
A SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
nukleinsav egyszálú lineáris nukleinsav, szintetikus DNS PstOl primer
A párhuzamos vizsgálatok statisztikus analízisével kapott eredmények szerint az összprotein növekedésére vonatkoztatva az RKRR2AAAA 2,12-szeres specifikus aktivitást mutatott, és a KIKTKK27AIATAA 1,37-sze5 rés specifikus aktivitást mutatott, összehasonlítva a natív TCF specifikus aktivitásával. Továbbá a HDL-koleszterin növekedésére vonatkoztatva az RKRR2AAAA 1,66-szoros specifikus aktivitást mutatott, és a KIKTKK27AIATAA 1,62-szeres specifikus aktivitást mutatott, összehasonlítva a natív TCF specifikus aktivitásával.
Ipari felhasználás
A találmány új TCF-mutánsra vonatkozik. A találmány szerinti TCF-mutáns hepatocitákban proliferatív aktivitással és növekedést stimuláló aktivitással rendelkezik. Jótékony hatású a különböző májbetegségek kezelésénél, továbbá mint tumorellenes szer.
GCCAG CCCTG CCCTG CTGCT CCAGC ATGTC CTCCT G
2. számú szekvencia A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZÚSÁG:
TÍPUS:
SZÁLTÍPUS:
TOPOLÓGIA:
A MOLEKULA JELLEMZŐU: TÍPUS:
JEL:
A SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
nukleinsav egyszálú lineáris nukleinsav, szintetikus DNS TCF415 R primer
TGCCA CTCTT AGTGA TAGAT ACTGT
3. számú szekvencia A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZÚSÁG:
TÍPUS:
SZÁLTÍPUS:
TOPOLÓGIA:
A MOLEKULA JELLEMZŐI: TÍPUS:
JEL:
A SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
nukleinsav egyszálú lineáris nukleinsav, szintetikus DNS P002 primer
TTTTA AAAGG AAGTC CTTTA TTCCT AGTAC ATCT
HU 220 167 Β
4. számú szekvencia A SZEKVENCIA JELLEMZŐI :
HOSSZÚSÁG:
TÍPUS:
SZÁLTÍPUS:
TOPOLÓGIA:
A MOLEKULA JELLEMZŐI: TÍPUS:
JEL:
A SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
nukleinsav egyszálú lineáris nukleinsav, szintetikus DSN TCFSal-77 primer
GGTCG ACTAG GCACT GACTC CGAAC AGGAT TC
5. számú szekvencia A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZÚSÁG:
TÍPUS:
SZÁLTÍPUS:
TOPOLÓGIA:
A MOLEKUKLA JELLEMZŐI: TÍPUS:
JEL:
A SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
nukleinsav egyszálú lineáris nukleinsav, szintetikus DNS 2RKKRR F primer
CCCTA TGCAG AGGGA CAAGC GGCAG CTGCC ATT
6. számú szekvencia A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZÚSÁG
TÍPUS:
SZÁLTÍPUS:
TOPOLÓGIA:
A MOLEKULA JELLEMZŐI: TÍPUS:
JEL:
A SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
nukleinsav egyszálú lineáris nukleinsav, szintetikus DNS TCF977 R primer
ATACC TGAGA ATCCC AACGC TGA
7. számú szekvencia A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZÚSÁG:
TÍPUS:
SZÁLTÍPUS:
TOPOLÓGIA:
A MOLEKUKLA JELLEMZŐI: TÍPUS:
JEL:
A SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
nukleinsav egyszálú lineáris nukleinsav, szintetikus DNS 2RKRR R primer
GAATT CATGA ATTGT ATTGG CAGCT GCCGC TTG
8. számú szekvencia A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZÚSÁG:
TÍPUS:
SZÁLTÍPUS:
TOPOLÓGIA:
nukleinsav egyszálú lineáris
HU 220 167 Β
A MOLEKULA JELLEMZŐI: TÍPUS:
JEL:
A SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
GGCAA TAGCA ACCGC AGCTG
9. számú szekvencia A SZEKVENCIA JELLEMZŐI: HOSSZÚSÁG:
TÍPUS:
SZÁLTÍPUS:
TOPOLÓGIA:
A MOLEKULA JELLEMZŐI: TÍPUS:
JEL:
A SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
CAGCT GCGGT TGCTA T nukleinsav, szintetikus DNS 27KIKTKK F primer
TGAAT ACTGC AGACC nukleinsav egyszálú lineáris nukleinsav, szintetikus DNS 27KIKTKKR primer
AGTGC TGGAT CTATT TTG
10. számú szekvencia A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZÚSÁG:
TÍPUS:
SZÁLTÍPUS:
TOPOLÓGIA:
A MOLEKULA JELLEMZŐI: TÍPUS:
JEL:
A SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
nukleinsav egyszálú lineáris nukleinsav, szintetikus DNS 54K F primer
CCATT CACTT GCGCG GCTTT TGTTT TTG
11. számú szekvencia A SZEKVENCIA JELLEMZŐI :
HOSSZÚSÁG:
TÍPUS:
SZÁLTÍPUS:
TOPOLÓGIA:
A MOLEKUKLA JELLEMZŐI: TÍPUS:
JEL:
A SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
nukleinsav egyszálú lineáris nukleinsav, szintetikus DNS 54K R primer
CAAAA ACAAA AGCCG CGCAA GTGAA TGG
12. számú szekvencia A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZÚSÁG:
TÍPUS:
SZÁLTÍPUS:
TOPOLÓGIA:
A MOLEKULA JELLEMZŐI: TÍPUS:
JEL:
A SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
nukleinsasv egyszálú lineáris nukleinsav, szintetikus DNS 132RGKD F primer
GAACA CAGCT ATGCG GGTGC AGCCC TACAG GAAAA C
HU 220 167 Β
13. számú szekvencia A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZÚSÁG:
TÍPUS:
SZÁLTÍPUS:
TOPOLÓGIA:
A MOLEKULA JELLEMZŐI: TÍPUS:
JEL:
A SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
nukleinsav egyszálú lineáris nukleinsav, szintetikus DNS 132RGKD R primer
GTTTT CCTGT AGGGC TGCAC CCGCA TAGCT GTGTT C
14. számú szekvencia A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZÚSÁG:
TÍPUS:
SZÁLTÍPUS:
TOPOLÓGIA:
A MOLEKULA JELLEMZŐI: TÍPUS:
JEL:
A SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
nukleinsav egyszálú lineáris nukleinsav, szintetikus DNS 142R F primer
GAAAA CTACT GTGCA AATCC TCGAG G
15. számú szekvencia A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZÚSÁG:
TÍPUS:
SZÁLTÍPUS:
TOPOLÓGIA:
A MOLEKULA JELLEMZŐI: TÍPUS:
JEL:
A SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
nukleinsav egyszálú lineáris nukleinsav, szintetikus DNS 142R R primer
CCTCG AGGAT TTGCA CAGTA GTTTT C
16. számú szekvencia A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZÚSÁG:
TÍPUS:
SZÁLTÍPUS:
TOPOLÓGIA:
A MOLEKULA JELLEMZŐI: TÍPUS:
JEL:
A SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
nukleinsav egyszálú lineáris nukleinsav, szintetikus DNS 42R F primer
CAATG TGCTA ATGCA TGTAC TÁGGÁ AT
17. számú szekvencia A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZÚSÁG:
TÍPUS:
SZÁLTÍPUS:
TOPOLÓGIA:
nukleinsav egyszálú linerás
HU 220 167 Β
A MOLEKULA JELLEMZŐI :
TÍPUS: nukleinsav, szintetikus DNS
JEL: 42R R primer
A SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
ATTCC TAGTA CATGC ATTAG CACAT TG
18. számú szekvencia
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZÚSÁG: TÍPUS: SZÁLTÍPUS: A MOLEKULA JELLEMZŐI: TÍPUS: JEL: 723 aminosav egyszálú protein RKRR2AAAA
Me t -31 Trp -30 Val Thr Ly s Leu Leu -25 Pro Al a Leu Leu Leu -20 Gin Hi s Val Leu
Leu -15 Hi s Leu Leu Leu Leu -10 Pro Ile Al a Ile Pro -5 Tyr Al a Glu Gly -1 Gin 1
Al a Al a Al a Al a 5 Asn Thr Ile Hi s Glu 10 Phe Ly s Lys Ser Al a 15 Ly s Thr
Thr Leu Ile 20 Ly s Ile As p Pro Al a 25 Leu Ly s Ile Lys Thr 30 Ly s Ly s Val
Asn Thr 35 Al a Asp Gin Cy s Al a 40 Asn Arg Cy s Thr Arg 45 Asn Lys Gly Leu
Pro 50 Phe Thr Cy s Ly s Al a 55 Phe Val Phe Asp Ly s 60 Al a Arg Ly s Gin Cy s 65
Leu Trp Phe Pro Phe 70 As n Ser Me t Ser Ser 75 Gly Va 1 Ly s Ly s Glu 80 Phe
Gly Hi s Glu Phe 85 As p Leu Tyr Glu Asn 90 Ly s Asp Tyr Ile Arg 95 Asn Cys
Ile Ile Gly 100 Lys Gly Arg Ser Tyr 105 Ly s Gly Thr Va 1 Ser 110 Ile Thr Lys
Ser Gly 115 Ile Lys Cy s Gin Pro 120 Trp Ser Ser Me t Ile 125 Pro Hi s Glu Hi s
Ser 130 Tyr Arg Gly Ly s Asp 135 Leu Gin Glu Asn Tyr 140 Cy s Arg Asn Pro Arg 145
Gly G1 u Glu Gly Gly 150 Pro Trp Cy s Phe Thr 155 Ser Asn Pro Glu Va 1 160 Arg
Tyr Glu Val Cys 165 Asp Ile Pro G1 n Cy s 170 Ser Glu Val Glu Cys 175 Me t Thr
Cys As n Gly 180 Glu Ser Tyr Arg Gly 185 Leu Me t Asp Hi s Thr 190 Glu Ser Gly
Lys Ile 195 Cys Gin Arg Trp As p 200 Hi s Gin Thr Pro Hi s 205 Arg Hi s Lys Phe
HU 220 167 Β
Leu Pro 210
Asn Pro
Thr Arg
Asn Asp
Gly Glu 275
Cys Gin 290
Glu Asn
Asp Gly
Val Gly
Asp Cys 355
Thr Arg 370
Leu His
Asn Tyr
Thr Gly
Glu Gly 435
Ser Cys 450
Arg Thr
I1e Cys
Gin Cys
I le His 515
Glu Arg
Asp Gly
Trp Glu 245
Thr Asp 260
Gly Tyr
Arg Trp
Phe Lys
Ser Glu 325
Tyr Cys 340
Tyr Arg
Ser Gly
Arg His
Cys Arg 405
Asn Pro 420
Asp Thr
Alá Lys
Asn 11 e
Gly Gly 485
Phe Pro 500
Asp Val
Tyr Pro 215
Gin 230 Pro
Tyr Cys
Va 1 Pro
Arg Gly
As p Ser 295
Cy s 310 Ly s
Ser Pro
Ser Gin
Gly Asn
Leu Thr 375
Ile 390 Phe
As n Pro
Leu Ile
Thr Pro
Thr Lys 455
Gly 470 Trp
Ser Leu
Ser Arg
Hi s Gly
As p
Arg
Al a
Leu
Thr 280
Gin
Asp
Trp le
Gly 360
Cys Ser
Trp Glu
Asp Asp
Pro Trp 425
Thr Ile 440
Gin
Me t
Ile
Asp
Arg 520
Lys Gly
Pro Trp
11e Lys 250
Glu Thr 265
Val Asn
Tyr Pro
Leu Arg
Cys Phe 330
Pro Asn 345
Lys Asn
Leu Arg
Val Ser
Lys Glu 490
Leu Lys 505
Gly Asp
Phe Asp 220
Cys Tyr 235
Thr Cys
Thr Glu
Thr
His Glu 300
Glu Asn 315
Thr Thr
Cys Asp
Tyr Me t
Me t Trp
Pro Asp 395
Asp Alá 410
Asp Tyr
Val Asn
Va 1 Val 460
Leu 475 Arg
Ser Trp
Asp Tyr
Glu Ly s
Asp
Thr
Al a
Cy s
Ile Trp 285
Hi s
Tyr
As p
Me t
Gly 365
Asp Lys 380
Alá Ser
His Gly
Cys Pro
Leu Asp 445
Asn
Tyr
Val
Glu
Cys 525
Asn Tyr
Leu Asp
Asp Asn 255
Ile Gin 270
Asn Gly
Asp Met
Cys Arg
Pro Asn 335
Ser His 350
Asn Leu
Asn Me t
Lys Leu
Pro Trp 415
Ile Ser 430
His Pro
Gly Ile
Arg Asn
Leu Thr 495
Alá Trp 510
Lys Gin
Cys Arg 225
Pro His 240
Th r Me t
Gly Gin
Ile Pro
Thr Pro 305
Asn Pro 320
Ile Arg
Gly Gin
Ser Gin
Glu Asp 385
Asn Glu 400
Cys Tyr
Arg Cys
Va 1 Ile
Pro Thr 465
Lys His 480
Alá Arg
Leu Gly
Val Leu
HU 220 167 Β
Asn 530 Val Ser Gin Leu Val 535 Tyr Gly Pro Glu Gly 540 Ser Asp Leu Val Leu 545
Me t Lys Leu Al a Arg 550 Pro Al a Val Leu Asp 555 Asp Phe Val Ser Thr 560 I le
Asp Leu Pro Asn 565 Tyr Gly Cys Thr Ile 570 Pro Glu Lys Thr Ser 575 Cys Ser
Val Tyr Gly 580 Trp Gly Tyr Thr Gly 585 Leu Ile Asn Tyr Asp 590 Gly Leu Leu
Arg Va 1 595 Al a Hi s Leu Tyr Ile 600 Me t Gly Asn Glu Ly s 605 Cy s Ser Gin Hi s
Hi s 610 Arg Gly Ly s Val Thr 615 Leu As n Glu Ser Glu 620 Ile Cy s Al a Gly Al a 625
Glu Lys Ile Gly Ser 630 Gly Pro Cys Glu Gly 635 Asp Tyr Gly Gly Pro 640 Leu
Val Cys Glu Gin 645 Hi s Ly s Me t Arg Me t 650 Val Leu Gly Va 1 Ile 655 Val Pro
Gly Arg Gly 660 Cys Al a Ile Pro Asn 665 Arg Pro Gly I 1 e Phe 670 Val Arg Val
Al a Tyr Tyr Al a Ly s Trp Ile Hi s Lys Ile Ile Leu Thr Tyr Ly s Val
675 680 685
19. számú szekvencia A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZÚSÁG: 723
TÍPUS: aminosav
SZÁLTÍPUS: egyszálú
TOPOLÓGIA: lineáris
A MOLEKULA JELLEMZŐI:
TÍPUS: protein
JEL: KIKTKK27 AIATAA
Met Trp Val Thr Ly s Leu Leu Pro Al a Leu Leu Leu Gin Hi s Val Leu
-31 -30 -25 -20
Leu Hi s Leu Leu Leu Leu Pro Ile Al a Ile Pro Tyr Al a Glu Gly Gin
-15 -10 -5 -1 1
Arg Lys Arg Arg Asn Thr Ile His Glu Phe Ly s Ly s Ser Al a Ly s Thr
5 10 15
Thr Leu Ile Lys Ile Asp Pro Alá Leu Al a I le Al a Thr Al a Al a Val
20 25 30
Asn Thr Alá Asp Gin Cys Alá Asn Arg Cys Thr Arg Asn Ly s Gly Leu
35 40 45
Pro Phe Thr Cys Ly s Al a Phe Val Phe Asp Ly s Al a Arg Ly s Gin Cys
50 55 60 65
Leu Trp Phe Pro Phe Asn Ser Me t Ser Ser Gly Val Ly s Ly s Glu Phe
70 75 80
HU 220 167 Β
Gly Hi s Glu Phe 85 As p Leu Tyr Glu Asn 90 Ly s As p Tyr lle Arg 95 Asn Cy s
lle lle Gly 100 Lys Gly Arg Ser Tyr 105 Ly s Gly Thr Va 1 Ser 110 lle Thr Ly s
Ser Gly 115 lle Lys Cy s Gin Pro 120 Trp Ser Ser Me t lle 125 Pro Hi s Glu Hi s
Ser 130 Tyr Arg Gly Ly s As p 135 Leu Gin Glu Asn Tyr 140 Cy s Arg As n Pro Arg 145
Gly Glu Glu Gly Gly 150 Pro Trp Cys Phe Thr 155 Ser Asn Pro Glu Val 160 Arg
Tyr Glu Va 1 Cy s 165 As p lle Pro Gin Cy s 170 Ser Glu Val Glu Cy s 175 Me t Thr
Cys Asn Gly 180 Glu Ser Tyr Arg Gly 185 Leu Me t As p Hi s Thr 190 Glu Ser Gly
Lys lle 195 Cy s Gin Arg Trp As p 200 Hi s Gin Thr Pro Hi s 205 Arg Hi s Lys Phe
Leu 210 Pro Glu Arg Tyr Pro 215 As p Ly s Gly Phe As p 220 As p Asn Tyr Cy s Arg 225
Asn Pro As p Gly Gin 230 Pro Arg Pro Trp Cys 235 Tyr Thr Leu As p Pro 240 Hi s
Thr Arg Trp Glu 245 Tyr Cys Al a lle Ly s 250 Thr Cy s Alá As p Asn 255 Thr Me t
Asn Asp Thr 260 Asp Val Pro Leu Glu 265 Thr Thr Glu Cys lle 270 Gin Gly Gin
Gly Glu 275 Gly Tyr Arg Gly Thr 280 Va 1 Asn Thr I 1 e Trp 285 Asn Gly lle Pro
Cy s 290 Gin Arg Trp As p Ser 295 Gin Tyr Pro Hi s Glu 300 Hi s Asp Me t Thr Pro 305
Glu Asn Phe Ly s Cy s 310 Lys As p Leu Arg Gl u 315 Asn Tyr Cy s Arg As n 320 Pro
As p Gly Ser Glu 325 Ser Pro TrP Cy s Phe 330 Thr Thr Asp Pro As n 335 lle Arg
Val Gly Tyr 340 Cys Ser Gin lle Pro 345 Asn Cys As p Me t Ser 350 Hi s Gly Gin
As p Cy s 355 Tyr Arg Gly Asn Gly 360 Ly s Asn Tyr Me t Gly 365 Asn Leu Ser Gin
Thr 370 Arg Ser Gly Leu Thr 375 Cy s Ser Me t Trp As p 380 Ly s Asn Me t Glu Asp 385
Leu Hi s Arg Hi s lle 390 Phe Trp Glu Pro As p 395 Al a Ser Ly s Leu Asn 400 Glu
HU 220 167 Β
Asn Tyr Cys Arg Asn 405 Pro Asp Asp Asp Alá 410 Hi s Gly Pro Trp 415 Cy s Tyr
Thr Gl y Asn Pro Leu Ile Pro Trp As p Tyr Cys Pro Ile Ser Arg Cys
420 425 430
Glu Gl y Asp Thr Thr Pro Thr Ile Val Asn Leu As p Hi s Pro Va 1 Ile
435 440 445
Ser Cys Al a Ly s Thr Lys Gin Le u Arg Va 1 Va 1 Asn Gly Ile Pro Thr
450 455 460 465
Arg Thr Asn Ile Gly Trp Me t Val Ser Leu Arg Tyr Arg As n Lys Hi s
470 475 480
Ile Cys Gly Gly Ser Leu Ile Ly s Glu Ser Trp Va 1 Leu Thr Al a Arg
485 490 495
Gin Cys Phe Pro Ser Arg Asp Leu Lys Asp Tyr Glu Al a Trp Leu Gl y
500 505 510
Ile Hi s Asp Val Hi s Gly Arg Gly As p Glu Ly s Cys Ly s Gl n Va 1 Leu
515 520 525
Asn Val Ser Gin Leu Va 1 Tyr Gly Pro Glu Gly Ser As p Leu Val Leu
530 535 540 545
Me t Ly s Leu Alá Arg Pro Al a Val Leu As p As p Phe Val Ser Thr Ile
550 555 560
As p Leu Pro Asn Tyr Gly Cys Thr Ile Pro Glu Ly s Thr Ser Cys Ser
565 570 575
Val Tyr Gly Trp Gly Tyr Thr Gly Leu Ile As n Tyr Asp Gly Leu Leu
580 585 590
Arg Val Alá Hi s Leu Tyr Ile Me t Gly Asn Glu Lys Cy s Ser Gin Hi s
595 600 605
Hi s Arg Gly Lys Val Thr Leu Asn Glu Ser Glu Ile Cys Al a Gly Al a
610 615 620 625
Glu Ly s Ile Gly Ser Gly Pro Cy s Glu Gly As p Tyr Gly Gly Pro Leu
630 635 640
Val Cy s Glu Gin Hi s Lys Me t Arg Me t Val Leu Gly Va 1 Ile Va 1 Pro
645 650 655
Gly Arg Gly Cys Al a Ile Pro Asn Arg Pro Gly Ile Phe Val Arg Val
660 665 670
Alá Tyr Tyr Al a Ly s Trp Ile Hi s Lys Ile Ile Leu Thr Tyr Ly s Va 1
675 680 685
Pro Gin Ser
690 692

Claims (10)

  1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK
    1. TCF-mutáns, amelyet a natív TCF aminosavszekvenciájában az N-terminális-végtől az első kringle doménig terjedő szakaszban egynél több aminosavcsoport 5 mutagenizálásával állítottunk elő és heparinnal szembeni affinitása csökkent és/vagy biológiai aktivitása nőtt.
  2. 2. Az 1. igénypont szerinti TCF-mutáns, amelyben a natív TCF Arg2-Lys-Arg-Arg5 szakaszát Ala-Ala-AlaAla szakasszá mutagenizáltuk.
  3. 3. Az 1. igénypont szerinti TCF-mutáns, amelyben a natív TCF Lys27-Ile-Lys-Thr-Lys-Lys32 szakaszát Ala-Ile-Ala-Thr-Ala-Ala szakasszá mutagenizáltuk.
  4. 4. A 2. vagy a 3. igénypont szerinti TCF-mutáns, azzal jellemezve, hogy proliferatív aktivitásuk hepatocitában, egységnyi mennyiségű proteinre vonatkoztatva, a natív TCF-ének több mint tízszerese.
  5. 5. A 2. vagy a 3. igénypont szerinti TCF-mutáns, amelynek a proliferatív aktivitása vese epiteliális sejtek10 ben, egységnyi mennyiségű proteinre vonatkoztatva, a natív TCF-ének több mint kétszerese.
  6. 6. A 2. vagy a 3. igénypont szerinti TCF-mutáns, amelynek a proliferatív aktivitása csontvelősejtekben felét-egyharmadát teszi ki a natív TCF proliferatív aktivitásának.
  7. 7. Az 1. igénypont szerinti TCF-mutáns, amelynek a natív TCF Lys54 csoportját Alá csoporttá mutagenizáljuk.
  8. 8. Az 1. igénypont szerinti TCF-mutáns, amelynek a natív TCF Argl32-Gly-Lys-Aspl35 szakaszát AlaGly-Ala-Ala szakasszá mutagenizáljuk.
  9. 9. Az 1. igénypont szerinti TCF-mutáns, amelynek a natív TCF Argl42 csoportját Alá csoporttá mutagenizáljuk.
  10. 10. Az 1. igénypont szerinti TCF-mutáns, amelynek a natív TCF Arg42 csoportját Alá csoporttá mutagenizáljuk.
HU9602174A 1994-12-27 1995-12-27 TCF-mutáns HU220167B (hu)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP33788594 1994-12-27
PCT/JP1995/002708 WO1996020214A1 (fr) 1994-12-27 1995-12-27 Mutant de tcf

Publications (3)

Publication Number Publication Date
HU9602174D0 HU9602174D0 (en) 1996-10-28
HUT75236A HUT75236A (en) 1997-04-28
HU220167B true HU220167B (hu) 2001-11-28

Family

ID=18312917

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU9602174A HU220167B (hu) 1994-12-27 1995-12-27 TCF-mutáns

Country Status (16)

Country Link
US (2) US6399744B1 (hu)
EP (2) EP0757994B1 (hu)
JP (1) JP3699482B2 (hu)
KR (1) KR100294328B1 (hu)
AT (1) ATE248913T1 (hu)
AU (1) AU698221B2 (hu)
CA (1) CA2183856C (hu)
DE (1) DE69531673T2 (hu)
DK (1) DK0757994T3 (hu)
ES (1) ES2206523T3 (hu)
FI (1) FI116223B (hu)
HU (1) HU220167B (hu)
NO (1) NO319022B1 (hu)
NZ (1) NZ298142A (hu)
WO (1) WO1996020214A1 (hu)
ZA (1) ZA9510982B (hu)

Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP3699482B2 (ja) * 1994-12-27 2005-09-28 第一製薬株式会社 Ｔｃｆ変異体
JP4006058B2 (ja) 1997-03-11 2007-11-14 第一三共株式会社 多臓器不全予防及び／又は治療剤
CA2253629A1 (en) 1997-03-14 1998-09-24 Snow Brand Milk Products Co., Ltd. Agent for preventing and/or treating cachexia
KR100552434B1 (ko) * 1997-03-28 2006-05-16 다이이치세이야꾸 가부시끼가이샤 신질환 예방 및/또는 치료제_
JP3961064B2 (ja) * 1997-03-28 2007-08-15 第一製薬株式会社 腎疾患予防及び／又は治療剤
GB9709453D0 (en) * 1997-05-10 1997-07-02 Imp Cancer Res Tech Polypedtides and their use in therapy
DE19909251A1 (de) 1998-02-21 1999-08-26 Max Delbrueck Centrum Mittel zur Therapie von menschlichen Erkrankungen, ausgehend von beta-Catenin, seine Herstellung und seine Verwendung

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
NZ232813A (en) * 1989-03-10 1992-08-26 Snow Brand Milk Products Co Ltd Human fibroblast glycoprotein, cell differentiation, blood vessel endothelial cell growth factor, cellular immunology inforcing factor of 78 or 74 thousand daltons plus or minus two thousand daltons
EP0539590B1 (en) * 1990-07-13 1999-03-31 Snow Brand Milk Products Co., Ltd. Plasmid containing dna which codes for the amino acid sequence of tcf-ii, transformed cell, and production of physiologically active substance by using the same
ES2181689T3 (es) * 1992-05-18 2003-03-01 Genentech Inc Variantes del factor de crecimiento de hepatocitos.
KR100260964B1 (ko) * 1992-07-16 2000-07-01 쇼노 카츄야 Tcf-ii를 유효성분으로 하는 혈액응고 정상화제
HUT68170A (en) * 1992-12-28 1995-03-21 Snow Brand Milk Products Co Ltd Modified tumor cytotoxic factor /tcf/
JP3699482B2 (ja) * 1994-12-27 2005-09-28 第一製薬株式会社 Ｔｃｆ変異体
JP3961064B2 (ja) * 1997-03-28 2007-08-15 第一製薬株式会社 腎疾患予防及び／又は治療剤
JPH1129493A (ja) * 1997-07-14 1999-02-02 Snow Brand Milk Prod Co Ltd 放射線障害予防及び／又は治療剤

Also Published As

Publication number Publication date
NO963552L (no) 1996-10-28
EP1275718A3 (en) 2003-03-19
FI116223B (fi) 2005-10-14
CA2183856A1 (en) 1996-06-28
WO1996020214A1 (fr) 1996-07-04
EP0757994A4 (en) 1998-10-21
AU698221B2 (en) 1998-10-29
ATE248913T1 (de) 2003-09-15
CA2183856C (en) 2006-11-07
DE69531673T2 (de) 2004-07-08
EP0757994A1 (en) 1997-02-12
HU9602174D0 (en) 1996-10-28
HUT75236A (en) 1997-04-28
EP0757994B1 (en) 2003-09-03
JP3699482B2 (ja) 2005-09-28
US20020165358A1 (en) 2002-11-07
DK0757994T3 (da) 2004-01-19
KR100294328B1 (ko) 2001-09-17
NO319022B1 (no) 2005-06-06
FI963313A0 (fi) 1996-08-26
KR970701206A (ko) 1997-03-17
DE69531673D1 (de) 2003-10-09
ZA9510982B (en) 1996-08-22
EP1275718A2 (en) 2003-01-15
NZ298142A (en) 1997-08-22
FI963313A (fi) 1996-08-26
US6399744B1 (en) 2002-06-04
NO963552D0 (no) 1996-08-26
ES2206523T3 (es) 2004-05-16
AU4355196A (en) 1996-07-19

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CA2055963C (en) Chimeric fibroblast growth factor
EP0412557B1 (en) Hepatic parenchymal cell growth factor, gene encoding the same, process for producing the factor, and transformants producing the factor
CA2329054A1 (en) A novel polypeptide hormone phosphatonin
JP2002515232A5 (hu)
AU620925B2 (en) New derivatives of human/bovine basic fibroblast growth factor
IE914067A1 (en) Active fragments of fibroblast growth factor
Franchini et al. Cloning and purification of the rainbow trout fifth component of complement (C5)
MXPA06012321A (es) Derivados c3 del complemento humano con funcion similar al factor de veneno de cobra.
HU220167B (hu) TCF-mutáns
EP1112285A1 (en) Human chordin-related proteins and polynucleotides encoding them
JPH06225763A (ja) ヒトベイシジンｉ遺伝子
CA2509508C (en) Tcf mutant
US6893844B1 (en) DNA encoding a new human hepatoma derived growth factor and producing method thereof
AU666689B2 (en) DNA fragment which codes for tumor cell proliferation inhibiting factor
JPH05255395A (ja) ポリペプチドおよびその製造法
US7361486B2 (en) Polynucleotide, vector, host cell and method for producing human hepatoma-derived growth factor 5 polypeptide
JP3292873B2 (ja) 組換肝実質細胞増殖因子
JP3318323B2 (ja) 組換肝実質細胞増殖因子
JP2839837B2 (ja) 顆粒球コロニー刺激因子受容体のリガンド結合領域蛋白質をコードしているｄｎａ
JP2816971B2 (ja) 組換肝実質細胞増殖因子
JP2553425B2 (ja) トロンビン結合性物質及びその製造法

Legal Events

Date Code Title Description
HPC4 Succession in title of patentee

Owner name: DAIICHI PHARMACEUTICAL CO., LTD., JP

GB9A Succession in title

Owner name: ATLAS PHARMACEUTICALS, INC., US

Free format text: FORMER OWNER(S): SNOW BRAND MILK PRODUCTS CO. LTD., JP; DAIICHI PHARMACEUTICAL CO., LTD., JP

MM4A Lapse of definitive patent protection due to non-payment of fees