DE69121227T2

DE69121227T2 - Polypeptid

Info

Publication number: DE69121227T2
Application number: DE69121227T
Authority: DE
Inventors: Yoshiyuki Aoyama; Masanari Kato; Keizo Miyata; Hiroshi Shikama; Nobutoshi Yamada
Original assignee: Ishihara Sangyo Kaisha Ltd
Current assignee: Ishihara Sangyo Kaisha Ltd
Priority date: 1990-09-21
Filing date: 1991-09-20
Publication date: 1997-02-20
Anticipated expiration: 2011-09-21
Also published as: EP0477791A3; EP0477791A2; DE69121227D1; ATE141093T1; EP0477791B1

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

GEBIET DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung betrifft die Bereitstellung eines neuen Polypeptids, bei dem es sich um eine N-terminale Mutante von menschlichem TNF handelt, und betrifft das Polypeptid selbst, eine pharmazeutische Zusammensetzung, die das Polypeptid enthält, ein Verfahren zur Herstellung des Polypeptids, eine rekombinante DNA-sequenz, die für das Polypeptid kodiert, ein Plasmid, das die rekombinante DNA-Sequenz enthält, und eine transformierte Mikrobenzelle, die das Plasmid aufweist.

STAND DER TECHNIK

TNF (Tumornekrosefaktor alpha) ist eine physiologisch aktive Verbindung, von der von Carswell et al. im Jahr 1975 (Proc. Natl. Acad. anwesend ist, die zuvor mit Bacillus Calmette Guerin (BCG) transfiziert und mit Endotoxin behandelt worden war. 1984 wurde die cDNA von menschlichem TNF von Pennica et al. kloniert, und die gesamte Primärstruktur (Aminosäuresequenz) von menschlichem TNF-Protein wurde aufgeklärt (Nature, 312, 724 (1984)). TNF weist spezielle Antitumor- Wirkungen, wie eine zytotoxische Aktivität gegen Tumorzellen und hämorrhagische Nekrose, oder Wachstumshemmung gegen transplantierte Tumoren auf. Jedoch ist kürzlich berichtet worden, daß Nebenwirkungen, wie Hyperlipämie, Bluthochdruck oder Fieber, mit Wahrscheinlichkeit das Ergebnis der Verabreichung von TNF sind. Demgemäß werden viele Forschungs- und Entwicklungsbemühungen angestrengt, um ein Produkt zu erhalten, das im Vergleich zu TNF eine überlegene Aktivität aufweist, während es verringerte Nebenwirkungen besitzt. Beispielsweise offenbaren die japanischen ungeprüften Patentveröffentlichungen Nr. 40221/1986 (US-A- 4,650,674), Nr. 119692/1988 (US-A-4,990,455) und Nr. 277488/1989 (EP-A- 340,333) die Deletion eines gewissen spezifischen Aminosäurerestes in menschlichem TNF-Protein oder den Ersatz eines derartigen Aminosäurerestes durch andere Aminosäurereste oder die Addition von anderen Aminosäureresten, um eine Mutante von menschlichem TNF bereitzusteller.
Jedoch ist es bis jetzt nicht möglich gewesen, eine Mutante von menschlichem TNF zu erhalten, die voll zufriedenstellende pharmakologische Wirkungen aufweist.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Demgemäß ist es ein Ziel der vorliegenden Erfindung, eine neue N- terminale Mutante von menschlichem TNF bereitzustellen, die ähnliche Antitumor-Wirkungen aufweist wie menschliches TNF oder dessen Mutante, wobei sie frei von Nebenwirkungen ist, die mit TNF einhergehen. Es ist ein anderes Ziel der vorliegenden Erfindung, eine N-terminale Mutante von menschlichem TNF bereitzustellen, die ähnliche Antitumor- Wirkungen aufweist wie menschliches TNF oder eine Mutante desselben, die frei von der Nebenwirkung der Förderung von Metastasis ist, wie es bei menschlichem TNF oder Mutanten desselben beobachtet wird.
Es ist ein anderes Ziel der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Herstellung derartiger N-terminaler Mutanten von menschlichem TNF bereitzustellen.
Es ist ein anderes Ziel der vorliegenden Erfindung, pharmazeutische Zusammensetzungen bereitzustellen, die derartige N-terminale Mutanten von menschlichem TNF enthalten.
Es ist ein anderes Ziel der vorliegenden Erfindung, rekombinante DNA-Sequenzen bereitzustellen, die für derartige N-terminale Mutanten von menschlichem TNF kodieren.
Es ist ein anderes Ziel der vorliegenden Erfindung, Plasmide bereitzustellen, die derartige rekombinante DNA-Sequenzen enthalten.
Es ist ein anderes Ziel der vorliegenden Erfindung, transformierte Mikrobenzellen bereitzustellen, die derartige Plasmide enthalten.
Diese und andere Ziele, die während der folgenden genauen Beschreibung offensichtlich werden, sind durch eine Polypeptid erreicht worden, bei dem es sich um ein Tumornekrosefaktor-Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz handelt, die durch die Sequenz vom 1. Ser bis zum 155. Leu dargestellt wird, wie durch die SEQ ID Nr.: 1 in der Sequenzliste gezeigt, oder um eine Mutante derselben, in der die Aminosäuresequenz des 1. Ser bis zum 8. Asp der SEQ ID Nr.: 1 oder die entsprechende Aminosäuresequenz der Mutante durch eine Aminosäuresequenz ersetzt ist, die mindestens eine Aminosäuresequenz Arg-Gly-Asp enthält und 3 bis 6 Aminosäuren aufweist.
Die gegenwärtigen Erfinder haben es für möglich gefunden, ein neues N-terminales Mutantenpolypeptid von menschlichem TNF zu erhalten, daß im wesentlichen die gleiche Antitumor-Wirkung wie menschliches TNF oder eine Mutante desselben aufweist, welches jedoch nicht wesentlich eine Tumormetastasis fördert, wie es bei menschlichem TNF oder dessen Mutante beobachtet wird, indem in einem gewissen Aminosäuresequenz-Bereich der Aminosäuresequenz von menschlichem TNF oder einer Mutante desselben eine Aminosäuresequenz von Arg-Gly-Asp eingebaut wird. Die vorliegende Erfindung ist auf der Grundlage dieser Entdeckung gemacht worden.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

Ein vollständigeres Verständnis der Erfindung und vieler der sie begleitenden Vorteile wird leicht erhalten, wenn dieselbe unter Bezug auf die folgende ausführliche Beschreibung besser verstanden wird, wenn dieselbe in Verbindung mit den begleitenden Zeichnungen erwogen wird, in denen:
Figur 1 die Verfahrensschritte zum Klonieren eines menschlichen TNF- Gens durch Ligation von synthetischen Oligonukleotiden erläutert;
Figur 2 die Verfahrensschritte zum Klonieren eines menschlichen TNF- Gens durch Ligation von synthetischen Oligonukleotiden erläutert;
Figur 3 die Verfahrensschritte zum Klonieren eines Expressionsplasmid-Vektors erläutert;
Figur 4 die Verfahrensschritte zum Klonieren eines Expressionsvektors für menschliches TNF erläutert;
Figur 5 die Verfahrensschritte zur Herstellung einer Mutante von menschlichem TNF oder eines N-terminalen Mutantengens durch auf eine Position gerichtete Mutagenese erläutert;
Figur 6 die Verfahrensschritte zur Herstellung eines Mutantengens von menschlichem TNF oder N-terminalen Mutantengens durch auf eine Position gerichtete Mutagenese erläutert;
Figur 7 die Verfahrensschritte zum Klonieren eines Expressionsvektors für eine N-terminale Mutante von menschlichem TNF durch Genrekombination unter Verwendung von Restriktionsendonukleasen- Spaltungsstellen erläutert;
Figur 8 die Verfahrensschritte zum Klonieren eines Expressionsvektors für eine N-terminale Mutante von menschlichem TNF durch Genrekombination unter Verwendung von Restriktionsendonukleasen- Spaltungsstellen erläutert;
Figur 9 die Verfahrensschritte zum Klonieren eines Expressionsplasmid-Vektors erläutert;
Figur 10 die Verfahrensschritte zum Klonieren eines Expressionsplasmid-Vektors erläutert;
Figur 11 die Verfahrensschritte zum Klonieren eines Expressionsplasmid-Vektors erläutert;
Figur 12 die Verfahrensschritte zum Klonieren eines Expressionsvektors für eine N-terminale Mutante von menschlichem TNF durch Genrekombination unter Verwendung von Restriktionsendonukleasen- Spaltungsstellen erläutert;
Figur 13 die Ergebnisse der Elektrophorese der gereinigten Proben des menschlichen TNF-Polypeptids und des N-terminalen Mutantenpolypeptids von menschlichem TNF, exprimiert durch Escherichia coli, erläutert; Figur 14 die Ergebnisse der Elektrophorese der gereinigten Proben des N-terminalen Mutantenpolypeptids von menschlichem TNF, exprimiert durch Escherichia coli, erläutert;

AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN

Das Tumornekrosefaktor-Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz&sub1; die durch die Sequenz vom 1. Ser bis zum 155. Leu, wie in SEQ ID Nr.: 1 in der Sequenzliste gezeigt, dargestellt wird, stellt menschliches TNF dar.
In der vorliegenden Erfindung schließen der Ausdruck "die Mutante von menschlichem TNF" und der Ausdruck "menschlicher TNF oder eine Mutante desselben" eine Mutante ein, die durch Anwendung einer einzelnen oder kombinierten Behandlung von Modifikationen, wie Addition, Deletion und Ersatz von einer oder mehreren Aminosäuren, erhalten wurden, geeigneterweise auf die Aminosäuresequenz, wie sie in SEQ ID Nr.: 1 in der Sequenzliste gezeigt ist und mit Antitumor-Wirkungen ähnlich denen von menschlichem TNF. Derartige Mutanten können durch rekombinante DNA- Techniken erhalten werden. Dementsprechend entspricht in der vorliegenden Erfindung die Aminosäuresequenz der Mutante, welche der Aminosäuresequenz vom 1. Ser bis zum 8. Asp der SEQ ID Nr.: 1 entspricht, der Aminosäuresequenz nach Modifikation in einem Fall, in dem die obige Aminosäuresequenz in der Mutante modifiziert ist. Diese Modifikation schließt die Deletion einer oder mehrerer Aminosäuren ein und schließt demgemäß die teilweise oder vollständige Deletion der Aminosäuresequenz vom 1. Ser bis zum 8. Asp ein.
Speziell schließt die Mutante von menschlichem TNF beispielsweise das folgende ein, aber die vorliegende Erfindung ist durch derartige speziellen Beispiele nicht beschränkt.
(1) Wie in der japanischen ungeprüften Patentveröffentlichung Nr. 141999/1988 (US-A-4,948,875) offenbart:
Zum N-Terminus ist Val-Arg addiert und weiter ist ²&sup9;Arg-³&sup0;Arg zu ²&sup9;Asn- ³&sup0;Thr verändert.
(2) Wie in der japanischen ungeprüften Patentveröffentlichung Nr. 119692/1988 (US-A-4, 990,455) offenbart:
(A) ³²Asn ist verändert zu ³²Tyr, ³²His, ³²Asp oder ³²Ser.
(B) ¹¹&sup5;Pro ist verändert zu ¹¹&sup5;Leu, ¹¹&sup5;Ser, ¹¹&sup5;Asp oder ¹¹&sup5;Gly.
(C) ¹¹&sup7;Tyr ist verändert zu ¹¹&sup7;His.
(3) Wie in der japanischen ungeprüften Patentveröffentlichung Nr. 277488/1988 (EP-A-340,333) offenbart:
¹Ser bis &sup6;Asp sind deletiert, und Arg-Lys-Arg ist an den N-Terminus von &sup9;Lys addiert.
(4) Wie in der japanischen ungeprüften Patentveröffentlichung Nr. 163094/1990 (WO-90-03395) offenbart:
¹Ser bis &sup8;Asp sind deletiert, und Arg-Lys-Arg ist an den N-Terminus von &sup9;Lys addiert und ¹&sup5;&sup4;Ala ist zu ¹&sup5;&sup4;Phe abgeändert.
(5) Wie in der japanischen ungeprüften Patentveröffentlichung Nr. 142493/1990 (WO-90-03395) offenbart:
¹Ser bis &sup8;Asp sind deletiert, Arg-Lys-Arg ist an den N-Terminus von &sup9;Lys addiert und ¹&sup5;&sup4;Ala ist zu ¹&sup5;&sup4;Trp verändert.
(6) Wie in der japanischen ungeprüften Patentveröffentlichung Nr. 270697/1988 offenbart:
¹&sup0;&sup0;Gln bis ¹&sup0;&sup7;Ala sind deletiert.
Von ¹Ser aus sind 2 bis 8 Aminosäurereste deletiert.
(7) Wie in der japanischen Patentanmeldung Nr. 193935/1990 offenbart:
&sup6;&sup8;Pro ist geändert zu &sup6;&sup8;Asp, &sup6;&sup8;Met oder &sup6;&sup8;Tyr.
(8) Wie in der japanischen Patentanmeldung Nr. 311129/1990 offenbart: ¹&sup0;&sup6;Gly ist deletiert oder durch eine andere Aminosäure ersetzt.
(9) Wie in der japanischen Patentanmeldung Nr. 311130/1990 offenbart: ²&sup9;Arg ist durch eine andere Aminosäure ersetzt.
In der Beschreibung werden die Symbole in der folgenden Liste verwendet, um Aminosäuren, Polypeptide, Basen oder deren Sequenzen darzustellen. Aminosäuren: Basen:
Wenn diese Symbole in einer DNA-Sequenz verwendet werden, stellen sie Desoxyribonukleinsäurereste anstelle von freien Molekülen, wie Adenosinphosphat, oder freien Basen, wie Adenin, dar.
Weiter haben verschiedene Abkürzungen, die in der Beschreibung verwendet werden, die folgenden Bedeutungen.
dTP: Desoxyadenosintriphosphat
dGTP: Desoxyguanosintriphosphat
dCTP: Desoxycytidintriphosphat
TTP: Thymidintriphosphat
ATP: Adenosintriphosphat
SDS: Natriumdodecylsulfat
BPB: Bromphenolblau
DTT: Dithiothreitol
BSA: Rinderserumalbumin
PMSF: Phenylmethylsulfonylfluorid
EDTA: Etyhlendiamintetraessigsäure
CPG-Harz: Glasharz mit kontrollierten Poren
In der N-terminalen Polypeptidmutante der vorliegenden Erfindung wird die Aminosäuresequenz, die mindestens eine Aminosäuresequenz Arg-Gly- Asp an einer bestimmten Position und 3 bis 16 Aminosäuren enthält, durch Wahl festgelegt, wobei die Antitumor-Aktivität, der Grad von Krebsmetastasis, die Nebenwirkungen, die Anwendbarkeit auf die Genrekombinationstechnik usw. in Betracht gezogen werden. Die Aminosäuresequenz, die 3 bis 16 Aminosäuren enthält, ist vorzugsweise eine Aminosäuresequenz, die 3 bis 11 Aminosäuren enthält, die eine oder mehr Aminosäuresequenzen Arg-Gly-Asp aufweist. Speziell können Aminosäuresequenzen, die in den SEQ ID Nummern: 2 bis 9 in der Sequenzliste gezeigt sind, und Arg-Gly-Asp erwähnt werden. Unter diesen sind die SEQ ID Nummern: 2, 3, 5 und 6 und Arg-Gly-Asp besonders bevorzugt.
Die Sequenz des vorliegenden Polypeptids, die von der Aminosäuresequenz verschieden ist, welche die Sequenz entsprechend dem 1. Ser bis zum 8. Asp ersetzt, entspricht im wesentlichen der Sequenz vom 9. Lys bis zum 155. Leu in SEQ ID Nr.: 1 und kann bis zu 15 Additionen, Deletionen oder Substitutionen von Aminosäureresten oder Kombinationen davon enthalten. Die Sequenz außer der Aminosäuresequenz, die mindestens eine Aminosäuresequenz Arg-Gly-Asp und 3 bis 16 Aminosäuren enthält, der N-terminalen Polypeptidmutante der vorliegenden Erfindung ist vorzugsweise eine Aminosäuresequenz von menschlichem TNF, die durch die Sequenz vom 9. Lys bis zum 155. Leu der SEQ ID Nr.: 1 dargestellt wird oder eine derartige Aminosäuresequenz, bei der das 29. Arg, das 68. Pro oder das 106. Gly deletiert oder durch einen anderen Aminosäurerest ersetzt ist-. Bei einem derartigen anderen Aminosäurerest handelt es sich vorzugsweise um Gln, Lys, Asp, Val oder Leu für das 29. Arg; vorzugsweise um Asp oder Met für das 68. Pro; und vorzugsweise um Trp, Pro, Ala, Asp oder Arg für das 106. Gly.
Dementsprechend ist die vorliegende N-terminale Polypeptidmutante geeigneterweise 135 bis 178 Aminosäurereste lang, vorzugsweise 135 bis 173 Aminosäurereste lang.
Die DNA für ein Tumornekrosefaktor-Polypeptid mit einer Nukleotidsequenz, die durch das 1. T bis zum 465. G dargestellt wird, wie in der SEQ ID Nr.: 10 in der Sequenzliste gezeigt, ist eine Form von DNA, die für die Aminosäuresequenz von humanem TNF kodiert.
Die Mutanten-DNA einer DNA, die für die Aminosäuresequenz von menschlichem TNF kodiert, ist eine DNA, die erhältlich ist, indem man eine einzelne oder mehrere Modifikationsbehandlungen, wie Addition, Deletion und Ersatz von einem oder mehreren Sätzen von Kodons, geeigneterweise auf die Nukleotidsequenz anwendet, wie sie durch die SEQ ID Nr.: 10 in der Sequenzliste gezeigt wird und welche für die Aminosäuresequenz der oben erwähnten menschlichen TNF-Mutante kodiert. Demgemäß sind derartige Modifikationen auf die gesamte Region der Nukleotidsequenz anwendbar, die durch das 1. T bis zum 465. G dargestellt wird, wie in der SEQ ID Nr.: 10 gezeigt. Das heißt, derartige Modifikationen sind nicht nur auf die Nukleotidsequenz vom 1. T bis zum 24. C anwendbar, sondern auch auf die Nukleotidsequenz vom 25. A bis zum 465. G.
Nun wird die vorliegende Erfindung in Einzelheit mit Bezug auf Beispiele beschrieben. Für die Genmanipulation, die in der vorliegenden Erfindung eine Rolle spielt, können übliche Verfahren und Techniken, die in vielen Druckschriften offenbart sind, mit geeigneten Anpassungen verwendet werden. Einige derartige Druckschriften sind nachstehend angeführt.
T. Maniatis et al., (1982): Molecular Cloning, A Laboratory Manual (nachstehend einfach als Molecular Cloning bezeichnet), Cold Spring Harbor Laboratory, R. Wu et al., (1983): Methods in Enzymology, 100 und 101, R. Wu et al., (1987): Methods in Enzymology, 153, 154 und 155.
Das Polypeptid der vorliegenden Erfindung kann durch verschiedene Verfahren, mittels verschiedener Techniken und Ausrüstungen hergestellt werden. Ein typisches Verfahren für seine Herstellung wird nun beschrieben.

(1) Erstellen eines menschlichen TNF-Gens

Wie oben erwähnt, ist die Nukleotidsequenz eines menschlichen TNF- Gens und die Aminosäuresequenz des menschlichen TNF von Pennica et al. aufgeklärt worden, und die Nukleotidsequenz wird verändert, wie es der Fall erfordert, um das menschliche TNF-Gen zu erstellen, wie es in SEQ ID Nr.: 10 gezeigt ist. Dabei ist es vorzuziehen, Kodons zu wählen, die fur die Wirtszelle (wie zum Beispiel Escherichia coli) geeignet sind, und es wird weiter bevorzugt, an geeigneten Positionen Restriktionsendonuklease-Spaltungsstellen zu sorgen, um die Genmodifikation für die Herstellung einer Mutante zu erleichtern und das Klonieren durch Ligieren von DNA-Fragmenten zu erleichtern, wie nachstehend beschrieben. Es ist natürlich notwendig, ein Translations- Startkodon (ATG) an der 5'-Stelle bzw. ein Tranlations-Stopkodon (TAA, TGA oder TAG) an der 3'-Stelle des menschlichen TNF-Gens bereitzusteller. Weiter wird es bevorzugt, für geeignete Restriktionsendonukleasen- Spaltungsstellen stromaufwärts in bezug auf das Translations-Startkodon bzw. stromabwärts in bezug auf das Translations-Stopkodon bereitzustellen, um die Anwendbarkeit eines Vektors zu verbessern und das Klonieren zu erleichtern.
Hier beruht die Herstellung auf den oben erwähnten DNA- Doppelsträngen. Der obere (kodierende oder Sinn-) Strang enthält 474 Basen (nachstehend als kodierender 474U-Strang bezeichnet), bei dem 5'-ATG-3' in Stromaufwärtsrichtung an das 1. T in der SEQ ID Nr.: 10 angebracht ist und 5'-TAATGA-3' in Stromabwärtsrichtung in Bezug auf das 465. G in der SEQ ID Nr.: 10 angebracht ist. Dementsprechend enthält der untere Strang (nachstehend als komplementärer 474L-Strang bezeichnet) 474 Basen, beginnend bei T und endend bei T, wie es nachstehend für den oberen Straug beschrieben ist, und er ist komplementär zum kodierenden 474U-Strang.
Das menschliche TNF-Gen kann durch ein Verfahren hergestellt werden, in dem jeweils der obere und der untere Strang in eine Mehrzahl von Oligonukleotiden aufgeteilt wird, eine derartige Mehrzahl von Oligonukleotiden chemisch synthetisiert wird und Blöcke derartiger synthetisierter Oligonukleotide dann nacheinander geeignet ligiert werden. Beispielsweise wird im Fall von DNA-Doppelsträngen, die auf der Grundlage der DNA-Doppelstränge hergestellt werden, die den kodierenden 474U-Strang und den komplementären 474L-Strang umfassen, jeder der Stränge für das menschliche TNF-Gen in zehn digonukleotide geteilt, von denen jedes ungefähr 50 Basen enthält, und insgesamt zwanzig Oligonukleotide werden chemisch synthetisiert.
Als Verfahren für derartige Synthesen kann ein Diester-Verfahren (H.G. Khorana, "Some Recent Developments in Chemistry of Phosphate Esters of Biological Interest", John Wiley and Sons, Inc., New York (1961)), ein Triester-Verfahren (R.L. Letsinger et al., J. Am. Chem. Soc., 89, 4801 (1967)) oder ein Phosphit-Verfahren (M.D. Matteucci et al., Tetrahedron Lett., 21, 719 (1980)) erwähnt werden. Im Hinblick auf die Verfahrenseffizienz wird es jedoch bevorzugt, ein Phosphit-Verfahren unter Verwendung eines vollständig automatisierten DNA-Synthetisierers zu verwenden.
Synthetisierte Oligonukleotide werden dann durch ein übliches Reinigungsverfahren, wie Hochleistungschromatographie unter Verwendung einer Umkehrphasen-Chromatosäule oder Elektrophorese unter Verwendung von Polyacrylamid-Gel, gereinigt. Danach werden die Oligonukleotide mittels beispielsweise T4-Polynukleotidkinase phosphoryliert, dann hybridisiert und mittels T4-DNA-Ligase ligiert. Hier werden die Oligonukleotide in mehrere Blöcke aufgeteilt und nacheinander ligiert, so daß die menschliche TNF-Gensequenz schließlich erhalten wird, gefolgt von Verdauung mit Restriktionsendonuklease oder Polieren (stumpfe Enden herstellen) mit T4- DNA-Polymerase, und die resultierenden DNA-Fragmente werden dann durch Elektrophorese gereinigt. Die erhaltenen DNA-Fragmente werden in Plasmidvektoren insertiert, wie beispielsweise pUC8, pUC9, pUC18 und pUC19 (J. Messing et al., Gene, 19, 259 (1982)), und die insertierten Plasmidvektoren werden in kompetente Zellen für eine Klonierung gemäß einem üblichen Verfahren eingeführt. Aus den erhaltenen Klonen werden mittels eines üblichen Verfahrens Plasmid-DNAs extrahiert und gereinigt, und sie werden überprüft, um zu sehen, ob die Nukleotidsequenzen der DNA- Fragmente, die in die Vektoren insertiert wurden, mit der gewünschten Gensequenz übereinstimmen oder nicht. Die jeweiligen so erhaltenen Abschnitte des menschlichen TNF-Gens werden dann mittels Restriktionsendonukleasen aus den Plasmidvektoren ausgeschnitten, welche diese enthalten, dann ligiert und wiederum in den obigen Vektor insertiert, um einen Plasmidvektor zu erhalten, der die gewünschte volle Länge des menschlichen TNF-Gens aufweist. Der so erhaltene Plasmidvektor wird durch Restriktionsendonukleasen verdaut und durch Gelelektrophorese aufgetrennt und gereinigt, wodurch man das gewünschte menschliche TNF-Gen erhält.
Andererseits kann ein Verfahren, das die Herstellung von cDNA, die für menschliches TNF kodiert, aus MRNA, die von menschlichen, TNF exprimierenden Zellen abstammt, und die Verwendung einer derartigen cDNA umfaßt, in Kombination mit dem oben beschriebenen Verfahren verwendet werden, wie es der Fall erfordert.

(2) Klonieren eines Expressionsvektors von menschlichem TNF

Das menschliche TNF-Gen, das in dem obigen Schritt (1) erhalten wurde, wird geeignet in einen Expressionsvektor insertiert, um den Expressionsvektor für menschliches TNF zu klonieren. Es ist erforderlich, daß der Expressionsvektor einen Promotor und eine SD(Shine-Dalgano)- Sequenz stromaufwärts in bezug auf das Translations-Startkodon (ATG) und einen Terminator stromabwärts in bezug auf das Translations-Stopkoden (TAA, TGA oder TAG) aufweist. Als Promotor kann der trp-Promotor, der lac- Promotor, der tac-Promotor, der PL-Promotor, der β-Lactamase-Promotor, der α-Amylase-Promotor, der PH05-Promotor oder der ADCI-Promotor geeignet verwendet werden, und als Terminator kann der trp-Terminator, der rrnB- Terminator oder der ADCI-Terminator geeignet verwendet werden. Ein derartiger Expressionsvektor ist unter den im Handel befindlichen Produkten leicht erhältlich, wie beispielsweise pKK223-3 (Pharmacia), pPL- lambda (Pharmacia) und pDR720 (Pharmacia). Jedoch können solche kommerziellen Produkte weiter für die Verwendung verbessert werden, so daß sie bessere Expressionseigenschaften oder Handhabungseffizienz aufweisen.

(3) Klonieren des Expressionsvektors einer Mutante von menschlichem TNF oder einer N-terminalen Mutante

Die folgenden Verfahren können beispielsweise für die Herstellung von DNA verwendet werden, die für die Mutante von menschlichem TNF oder das N-terminale Mutantenpolypeptid kodiert.
(A) Auf die gleiche Weise wie im Verfahren, das in dem obigen Schritt (1) für den Entwurf des menschlichen TNF-Gens beschrieben wurde, werden chemisch synthetisierte Oligonukleotide geeignet ligiert, um eine derartige Mutanten-DNA zu erhalten. Gemäß diesem Verfahren können Modifikationen, wie der Ersatz, die Addition oder Deletion eines Kodons oder mehrerer Kodons, die für eine Aminsäure, ein Oligopeptid oder eine Polypeptid kodieren, frei durchgeführt werden.
(B) Das in dem obigen Schritt (1) hergestellte menschliche TNF-Gen wird durch geeignete Restriktionsendonukleasen geschnitten, um eine gewisse spezielle Region in dem Gen zu entfernen, und dann wird ein synthetisches Oligonukleotid mit einer Nukleotidsequenz, in die eine Mutation eingeführt worden ist (beispielsweise: ein doppelsträngiges DNA- Fragment, das durch Hybridisieren der oberen und unteren Stränge und Ligieren derselben hergestellt worden ist), oder ein geeignetes anderes Gen insertiert. Die Modifikation kann durch dieses Verfahren auf die gleiche Weise wie in dem obigen Verfahren (A) ebenfalls frei durchgeführt werden.
(C) Die Einführung einer Mutation wird durchgeführt, indem man den DNA-Strang unter Verwendung eines synthetisierten Oligonukleotids mit einer Nukleotidsequenz, in der die Mutation eingeführt worden ist [auf eine Position gerichtetes Mutagenese-Verfahren (T.A. Kunkel et al., Methods in Enzymology, 154, 367 (1987))], als Primer verwendet. Dieses Verfahren ist für die Addition oder die Insertion einer relativ langen DNA-Kette, die zehn Basenpaare überschreitet, nicht geeignet. Jedoch können andere Modifikationen frei auf die gleiche Weise wie in dem obigen Verfahren (A) durchgeführt werden. Dieses Verfahren ist insbesondere für den Ersatz irgendwelcher gewünschter Aminosäuren geeignet.
In der vorliegenden Erfindung werden das auf eine Position gerichtete Mutagenese-Verfahren (C) und das Verfahren (B) der Verwendung der Fragmente, die durch Restriktionsendonukleasen geschnitten worden sind, gewöhnlich in Kombination verwendet, wie es der Fall erfordert. Ein derartiges Verfahren wird nachstehend beschrieben.
(i) Durch das auf eine Position gerichtete Mutagenese-Verfahren wird DNA, die für ein Mutanten- oder N-terminales Mutantenpolypeptid kodiert, hergestellt und geeignet in einen Expressionsvektor insertiert.
Zuerst wird zur Durchführung des auf eine Position gerichtete Mutagenese-Verfahrens Matrizen-DNA hergestellt. Das menschliche TNF-Gen, das im obigen Schritt (1) erhalten wurde, wird an einen Plasmidvektor (wie beispielsweise pUC118 oder pUC119) für die Herstellung einer einzelsträngigen Plasmid-DNA ligiert, wie es von Messing et al. (Methods in Enzymology, 153, 3 (1987)) entwickelt wurde, und dann im Escherichia coli eingeführt. Von dem dadurch erhaltenen Transformanten wird ein Klon mit dem gewünschten Plasmid selektiert.
Dieses Plasmid wird in eine dut&supmin;- und ung&supmin;-E. coli-Mutante (beispielsweise ein CJ236-Stamm) eingeführt, so daß Uracil in das Gen aufgenommen wird, und die E. coli-Mutanten wird mit einem rekombinanten Helfer-Phagen, wie beispielsweise M13K07, infiziert, wodurch man die gewünschte einzelsträngige Plasmid-DNA erhält.
Andererseits wird ein Oligonukleotid-Primer mit ungefähr 15 bis 50 Basen, der die Mutations-Einführungsstelle und die rückwärtigen und vorwärtigen Basensequenzen davon gemäß der vorliegenden Erfindung aufweist, chemisch synthetisiert. Dieser Primer und die einzelsträngige Plasmid-DNA, in die Uracil eingeführt wurde, welche durch den vorherigen Schritt erhalten wurde, werden hybridisiert und dann mittels z.B. T4-DNA- Polyrnerase und T4-DNA-Ligase doppelsträngig gemacht. Das doppelsträngige Plasmid wird in einen ung&spplus;-E. coli-Stamm eingeführt, um den DNA-Strang, der Uracil als Matrize enthält, zu desaktivieren und dadurch die Häufigkeit für die Einführung der Mutation zu verbessern.
Unter Verwendung des obigen Primers als Sonde wird eine Kolonienhybridisierung durchgeführt, wonach ein Klon, der das Plasmid aufweist, welches DNA enthält, die für das gewünschte Mutanten- oder Nterminale Mutantenpolypeptid kodiert, aus den erhaltenen Transformanten selektiert wird.
Aus dem so erhaltenen Plasmid wird ein DNA-Fragment, das für das Mutanten- oder N-terminale Mutantenpolypeptid von menschlichem TNF kodiert, mittels Restriktionsendonukleasen ausgeschnitten und auf die gleiche Weise wie im Fall des obigen Schrittes (2) in einen Expressionsvektor insertiert, um den gewünschten Expressionsvektor für die Mutante oder N-terminalen Mutante von menschlichem TNF zu klonieren.
(ii) Ein Abschnitt, in den eine Mutation eingeführt werden soll, wird durch geeignete Restriktionsendonukleasen ausgeschnitten und durch ein DNA-Fragment, das beispielsweise mittels chemischer Synthese gemäß dem Modifikationsentwurf hergestellt worden ist, ersetzt, wodurch man einen Expressionsvektor des Mutanten- oder N-terminalen Mutantenpolypeptids erhält.
Um die Aminosäuresequenz in der Nachbarschaft des N-Terminus von menschlichem TNF zu modifizieren, wird es bevorzugt, daß eine geeignete Restriktionsendonukleasen-Spaltungsstelle in der Nachbarschaft des N- Terminus existiert. Deshalb wird eine geeignete Restriktionsendonukleasen- Spaltungsstelle durch die auf eine Position gerichtete Mutagenese in der Nähe des N-Terminus von menschlichem TNF eingeführt. Es wird weiter bevorzugt, zwei Typen von Spaltungsstellen bereitzustellen, d.h. diese Restriktionsendonukleasen-Spaltungsstelle und eine Restriktionsendonukleasen-Spaltungsstelle, die vor oder nach dem Translations- Startkodon vorgesehen wird, das stromaufwärts davon liegt.
Andererseits werden gemäß dem Modifikationsentwurf der vorliegenden Erfindung Oligonukleotide, die den oberen (kodierenden) und unteren (nicht kodierenden) Strängen entsprechen, chemisch auf die gleiche Weise wie im Fall des obigen Schrittes (1) synthetisiert. Es ist natürlich notwendig, im Hinblick auf die Insertion in einen Expressionsvektor die oben erwähnten Restriktionsendonukleasen-Spaltungsstellen an beiden Termini bereitzustellen. Derartige Oligonukleotide (die oberen und unteren Stränge) werden beispielsweise mittels T4-Polynukleotidkinase phosphoryliert, gefolgt von Hybridisierung, wodurch man ein doppelsträngiges DNA-Fragment erhält. Dieses doppelsträngige DNA-Fragment wird beispielsweise mittels T4-DNA-Ligase in den Expressionsplasmid-Vektor insertiert und ligiert, welcher den großen Teil des menschlichen TNF enthält, das durch die oben erwähnten zwei Typen von Restriktionsendonukleasen verdaut worden ist (wobei der N-terrninale Abschnitt deletiert worden ist), wodurch man den gewünschten Expressionsvektor der N-terminalen Mutante von menschlichem TNF mit der nahe dem N-Terminus modifizierten Aminosäuresequenz erhält.
Unter Verwendung geeigneter Restriktionsendonukleasen- Spaltungsstellen in dem Gen, das für das Mutanten- oder N-terminale Mutantenpolypeptid kodiert, kann eine Rekombination unter den jeweiligen Expressionsvektoren durchgeführt werden, um weitere Expressionsvektoren für neue Mutanten- oder N-terminale Mutantenpolypeptide zu erzeugen.
Die Einführung eines Expressionsvektors in Wirtszellen, wie zum Beispiel einen E. coli-Stamm, kann mittels eines üblichen Verfahrens durchgeführt werden, wie eines Verfahrens, das kompetente Zellen eines E. coli-Stammes verwendet, die durch ein Calciumchlorid-Verfahren hergestellt wurden (Molecular Cloning, T. Maniatis et al., (1982)). Als derartige Wirtszellen können Mikrobenzellen, wie Escherichia coli, Bacillus oder Hefe verwendet werden. Unter diesen können als Escherichia coli Mutanten eines E. coli K-12-Stammes, wie JM83, JM103 und HB101, erwähnt werden.

(4) Herstellung von N-terminalem Mutantenpolypeptid von menschlichem TNF

In der vorliegenden Erfindung werden die im obigen Schritt (3) offenbarten transformierten Mikrobenzellen kultiviert, wodurch das gewünschte N-terminale Mutantenpolypeptid von menschlichem TNF erzeugt und in der Kultur angereichert wird, und das angereicherte Polypeptid wird dann extrahiert und abgetrennt. Als Verfahren zur Kultivierung der Mikrobenzellen, insbesondere Zellen von Escherichia coli, kann ein herkömmliches Verfahren verwendet werden, wie ein Verfahren, in dem Escherichia coli in ein Medium eingeimpft werden, das Nährstoffe, die für Escherichia coli erforderlich sind, enthält, und in einem kurzen Zeitraum, gewöhnlich unter Schütteln oder Rühren des geimpften Mediums bei einer Temperatur von 32 bis 37ºC über 12 bis 24 Stunden, in großer Menge kultiviert werden. Als Medium kann beispielsweise L-Nährstofflösung, M9- Medium oder M9CA-Medium (siehe das oben erwähnte Molecular Cloning) verwendet werden. Falls notwendig, kann ein Antibiotikum, wie Ampicillin, zugesetzt werden, und um die Wirksamkeit des Promotors zu verbessern, ist es möglich, bei Beginn der Kultivierung oder während der Kultivierung ein Reagenz wie Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid in dem Fall zuzusetzen, in dem der lac-Promotor oder der tac-Promotor verwendet wird, oder ein Reagenz wie 3-β-Indolacrylsäure in dem Fall, in dem der trp-Promoter verwendet wird.
Das N-terminale Mutantenpolypeptid von menschlichem TNF der vorliegenden Erfindung wird gewöhnlich durch Beschallung der Mikrobenzellen nach der Kultivierung in einem suspendierten Zustand in Tris-Puffer, gefolgt von Abtrennung mittels Zentrifuge zur Entfernung der Zelltrümmer, erhalten. Das so erhaltene Produkt kann weiter durch Behandlung mit einem Nukleinsäureendotoxin-entfernenden Mittel, Filtration mittels eines Filters, Anionenaustauschchromatographie oder einem anderen üblichen Protein-Abtrennungs- und -Reinigungsverfahren gereinigt werden.
Durch geeignete Anwendung der oben beschriebenen Verfahren kann das N-terminale Mutantengen von menschlichem TNF der Erfindung direkt erzeugt werden, oder es kann nach der Herstellung des menschlichen TNF-Gens erzeugt werden oder es kann nach Herstellung des menschlichen TNF-Gens, gefolgt von der Herstellung von dessen Mutantengen, erzeugt werden.
Das N-terminale Mutantenpolypeptid von humanem TNF der vorliegenden Erfindung weist die gleiche Antitumor-Wirkung auf wie menschliches TNF oder eine Mutante davon, während es frei von der Metastasis-fördernden Nebenwirkung ist. Während es Antitumor-Wirkung im gleichen Grad wie menschliches TNF oder dessen Mutante zeigt, zeigt es keine wesentliche Wirkung zur Förderung der Metastasis von Tumoren, die bei menschlichem TNF oder dessen Mutante beobachtet wird. Deshalb ist es als aktiver Bestandteil für eine Antitumormittel oder -Pharmazeutikum wirksam. Spezielle Beispiele für das N-terminale Mutantenpolypeptid von menschlichem TNF der vorliegenden Erfindung schließen beispielsweise F4168, F4415, F4416, F4417, F4418, F4420, F4421, F4113, F4137, F4601, F4602, F4607, F4608, F4626, F4627, F4634, F4635, F4609, F4610, F4628, F4629, F4638, F4639, F4611, F4612, F4613, F4614, F4615, F4642, F4643, F4644, F4645 und F4646 ein, die nachstehend beschrieben werden Unter diesen sind F4168, F4415, F4417, F4418, F4420, F4601, F4609 und F4639 bevorzugt, und F4168 und F4418 sind besonders bevorzugt. Um seine pharmazeutischen Zusammensetzungen herzustellen, die das vorliegende Polypeptid enthalten, kann das vorliegende Polypeptid in pharmazeutische Zusammensetzungen zusammen mit pharmazeutisch annehmbaren Trägern oder Verdünnungsmitteln formuliert werden. Die Typen der pharmazeutischen Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung schließen Mittel zur äußerlichen Anwendung, Mittel zur oralen Verabreichung und Mittel zur Injektion ein. Die pharmazeutischen Zusammensetzungen werden durch Verabreichungsmethoden verabreicht, die für die jeweiligen Formulierungen geeignet sind.
Als Verabreichungsverfahren wird die Injektion bevorzugt. Die Injektion schließt systemische Injektion und lokale Injektion ein. Die systemische Injektion schließt intravenöse Injektion, subkutane Injektion, intramuskuläre Injektion und intradermale Injektion ein. Die pharmazeutische Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung kann fur irgendein Verfahren angewendet werden. Jedoch wird die systemische Injektion im Hinblick auf die Anwendbarkeit für verschiedene Krebsarten bevorzugt. Weiter wird wegen der Natur des Arzneistoffes die intravenöse Injektion besonders bevorzugt. Die Krebsarten schließen feste Tumoren, wie kolorektalen Krebs, Lungenkrebs, Magenkrebs, Pankreaskrebs und Melanom, sowie Leukämie ein. Die pharmazeutische Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung kann bei jeder Krebsart angewendet werden. Jedoch wird es besonders bevorzugt, sie bei einem festen Tumor anzuwenden.
Nachdem die Erfindung allgemein beschrieben worden ist, kann ein weiteres Verständnis durch Bezug auf gewisse spezielle Beispiele erhalten werden, die hierin allein zum Zwecke der Erläuterung gegeben werden und nicht beschränkend sein sollen, falls nicht anders angegeben.

BEISPIELE

BEISPIEL 1

Entwerfen des menschlichen TNF-Gens

Auf der Grundlage der Aminosäuresequenz des menschlichen TNF- Strukturgens, die bereits von Pennica et al., wie oben erwähnt, mitgeteilt wurde, wurden eine Nukleotidsequenz von DNA-Doppelsträngen, d.h. der kodierende 474U-Strang und der komplementäre 474L-Strang in der DNA- Strangsequenz der SEQ ID Nr.: 10 in der Sequenzliste, und eine Nukleotidsequenz derartiger DNA-Doppelstränge mit einer speziellen Modifikation für den Zweck der Genklonierung und Mutantenherstellung mit Bezug auf die Nukleotidsequenz des menschlichen TNF-Gens konstruiert. Hier wurden Restriktionsendonukleasen-Spaltungsstellen in geeigneten Zwischenräumen insertiert. Weiter wurde, um die Ligation an einen Plasmidvektor zu erleichtern, eine Spaltungsstelle durch die Restriktionsendonuklease EccoR I stromaufwärts von einem Translations- Startkodon (ATG) vorgesehen, und eine Spaltungsstelle durch die Restriktionsendonuklease Hind III wurde stromabwärts von einem Translations-Stopkodon (TAA und TGA) vorgesehen.

BEISPIEL 2

Chemische Synthese von Oligonukleotiden

Die in Beispiel 1 entworfene DNA wurde chemisch durch ein Phosphit- Verfahren mittels eine automatischen DNA-Synthetisierers (Modell 381A, hergestellt von Applied Biosystems) synthetisiert. Nach Aufteilen der entworfenen DNA in zwanzig Oligonukleotide U-1 bis U-10 und L-1 bis L-10 mit Nukleotidsequenzen, die nachstehend beschrieben werden, wurden diese synthetisiert. Die Abspaltung der synthetisierten Oligonukleotide von CPG- Harz (im Handel durch Funakoshi Company) und Entfernung der Schutzgruppen wurden gemäß dem Handbuch von Applied Biosystems, Inc. durchgeführt. Die Abtrennung und Reinigung jedes Oligonukleotids wurde mittels HPLC (Hochleistungsflüssigkeitschromatographie) unter Verwendung einer Umkehrphasen-Chromatosäule oder durch Elektrophorese auf einem Polyacrylamidgel, das 7M Harnstoff enthielt (Gelkonzentration: 10 - 20%), durchgeführt.
Die Nukleotidsequenzen U-1 bis U-10 und L-1 bis L-10 sind wie folgt.
U-1: Umfaßt 27 Basen und weist eine Sequenz vom 1. T bis zum 19. A der SEQ ID Nr.: 10 auf und weist noch eine Sequenz auf, in der 5'-ATG-3' stromaufwärts mit Bezug auf das 1. T und 5'-AATTC-3' stromaufwärts von demselben angeknüpft ist.
U-2: Umfaßt 50 Basen und weist eine Sequenz vom 20. G bis zum 69. G der SEQ ID Nr.: 10 auf.
U-3: Umfaßt 49 Basen und weist eine Sequenz vom 70. C bis zum 118. G der SEQ ID Nr.: 10 auf.
U-4: Umfaßt 50 Basen und weist eine Sequenz vom 119. A bis zum 168. C der SEQ ID Nr.: 10 auf.
U-5: Umfaßt 50 Basen und weist eine Sequenz vom 169. T bis zum 218. T der SEQ ID Nr.: 10 auf.
U-6: Umfaßt 52 Basen und weist eine Sequenz vom 219. C bis zum 270. C der SEQ ID Nr.: 10 auf.
U-7: Umfaßt 48 Basen und weist eine Sequenz vom 271. C bis zum 318. C der SEQ ID Nr.: 10 auf.
U-8: Umfaßt 49 Basen und weist eine Sequenz vom 319. G bis zum 367. C der SEQ ID Nr.: 10 auf.
U-9: Umfaßt 51 Basen und weist eine Sequenz vom 368. A bis zum 418. C der SEQ ID Nr.: 10 auf.
U-10: Umfaßt 53 Basen und weist eine Sequenz vom 419. T bis zum 465. G der SEQ ID Nr.: 10 auf und weist weiter 5'-TAATGA-3' stromabwärts davon auf.
L-1 bis L-10 sind für den unteren Strang (Komplementärsequenz), der dem DNA-Strang der SEQ ID Nr.: 10 entspricht.
L-1: Umfaßt 29 Basen und weist eine Sequenz auf, die komplementär zu der Sequenz vom 25. A bis zum 1. T der SEQ ID Nr.: 10 ist, und weist noch eine Sequenz mit 5'-CATG-3' an die 3'-Stelle von A angeknüft auf, welches komplementär zum 1. T des oberen Stranges ist.
L-2: Umfaßt 52 Basen und weist eine Sequenz auf, die komplementär zu der Sequenz vom 77. G bis zum 26. A der SEQ ID Nr.: 10 ist.
L-3: Umfaßt 50 Basen und weist eine Sequenz auf, die komplementär zu der Sequenz vom 127. G bis zum 78. G der SEQ ID Nr.: 10 ist.
L-4: Umfaßt 50 Basen und weist eine Sequenz auf, die komplementär zu der Sequenz vom 177. G bis zum 128. A der SEQ ID Nr.: 10 ist.
L-5: Umfaßt 49 Basen und weist eine Sequenz auf, die komplementär zu der Sequenz vom 226. C bis zum 178. G der SEQ ID Nr.: 10 ist.
L-6: Umfaßt 49 Basen und weist eine Sequenz auf, die komplementär zu der Sequenz vom 275. T bis zum 227. A der SEQ ID Nr.: 10 ist.
L-7: Umfaßt 51 Basen und weist eine Sequenz auf, die komplementär zu der Sequenz vom 326. C bis zum 276. C der SEQ ID Nr.: 10 ist.
L-8: Umfaßt 49 Basen und weist eine Sequenz auf, die komplementär zu der Sequenz vom 375. G bis zum 327. C der SEQ ID Nr.: 10 ist.
L-9: Umfaßt 51 Basen und weist eine Sequenz auf, die komplementär zu der Sequenz vom 426. T bis zum 376. A der SEQ ID Nr.: 10 ist.
L-10: Umfaßt 49 Basen und weist eine Sequenz auf, die komplementär zu der Sequenz vom 465. G bis zum 427. G der SEQ ID Nr.: 10 ist, und weist noch eine Sequenz auf, bei der 5'-TCATTA-3' an der 5'-Stelle von C, das komplementär zum 465. G ist, und 5'-AGCT-3' an der 5'-Stelle desselben angeknüpft ist.
Mit Bezug auf das HPLC-Verfahren wurden die Abtrennung und Reinigung durchgeführt, indem man mit einem Acetonitril-haltigen Triethylaminoessigsäurepuffer (100 mM) (pH 7,0) mittels Umkehrchromatographie unter Verwendung einer Nukleosil 5C18-Säule (φ 4,6 x 150 mm, im Handel durch Chemco Scientific Co., Ltd.) eluierte. Die Elution wurde mit einem linearen Konzentrationsgradienten von Acetonitril von 5 bis 35% (30 Minuten) durchgeführt, und ein Peak bei ungefähr 15 Minuten wurde gewonnen.
Mit Bezug auf die Polyacrylamidgel-Elektrophorese wurden die jeweiligen synthetisierten Oligonukleotid-Proben durch Elektrophorese aufgetrennt, und der Bandteil, der die gewünschte Größe hatte, wurde als Ergebnis der Beobachtung des Wanderungsmusters mittels einer UV- Schattenmethode ausgeschnitten, und das Polyacrylamidgel-Fragment wurde zu einer Größe von ungefähr 1 bis 2 mm³ geschnitten, und ungefähr 2 ml eines Eluierungspuffers (0,5 M NH&sub4;OAc und 1 mM EDTA) wurde dazugegeben, und die Mischung wurde über Nacht bei 37ºC geschüttelt. Die eluierten Pufferlösungen, die die jeweiligen Oligonukleotide enthielten, wurden gewonnen, gefolgt von Phenolextraktion (unter Verwendung einer 50%-igen Phenol-/50%-igen Chloroform-Lösung) und Isobutanol-Extraktion und einem Ethanol-Fällungsverfahren, wodurch man gereinigte Proben der jeweiligen Oligonukleotide erhielt.
Mit Bezug auf einige der so synthetisierten und gereinigten Oligonukleotide wurde durch ein Maxam-Gilbert-Verfahren (A.M. Maxam et al., Methods in Enzymology, 65, 499 (1980)) bestätigt, daß sie die gewünschten Nukleotidsequenzen aufwiesen.
Bei den folgenden Genrekombinations-Verfahren (Beispiele 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 und 12) waren die Reaktionsbedingungen usw. von Restriktionsendonukleasen und anderen verwandten Enzymen hauptsächlich gemäß dem im oben erwähnten "Molecular Cloning" offenbarten Verfahren. Weiter waren die obigen Enzyme usw. hauptsächlich von Takara Shuzo erhältlich, und das Handbuch von Takara Shuzo wurde ebenfalls als Druckschrift verwendet.

BEISPIEL 3

Klonieren eines menschlichen TNF-Gens durch Ligation von synthetisierten Oligonukleotiden

(1) Zuerst wurde die Klonierung von menschlichem TNF-Gen gemäß Figur 1 versucht. Die in Beispiel 2 erhaltenen synthetisierten Oligonukleotide wurden in drei Gruppen (U- und L-1 bis 4, U- und L-5 bis 7 und U- und L-8 bis 10) zum Klonieren aufgeteilt. Das heißt, der 5'-Terminus jedes (1 - 2 µg) der Oligonukleotide U-2, 3, 4, 6, 7, 9 und 10 und L-1, 2, 3, 5, 6, 8 und 9 wurden mittels 2 bis 5 Einheiten T4-Polynukleotidkinase (Takara Shuzo) gesondert phosphoryliert. Die Phosphorylierungsreaktion wurde eine Stunde bei 37ºC in 10 µl einer wäßrigen Lösung (50mM Tris-HCl, pH 7,6, 10 mM MgCl&sub2;, 0,1 mM Spermidin, 0,1 mM EDTA, 10 mM DTT und 1 mM ATP) durchgeführt, und nach der Reaktion wurde die T4-Polynukleotidkinase durch 10-minütige Behandlung bei 70ºC desaktiviert. Gesondert wurden 10 µl von wäßrigen Lösungen der gleichen Zusammensetzungen wie oben hergestellt, welche 1 bis 2 µg der Oligonukleotide U-1, 5 und 8 bzw. L-4, 7 und 10 enthielten. Die wäßrigen Lösungen von Oligonukleotiden mit den gleichen U- und L-Zahlen (U-1 bis 10 und L-1 bis 10) wurden jeweils gemischt (20 µl), und die jeweiligen Mischungen wurden 5 Minuten bei 100ºC erhitzt, gefolgt vom allmählichen Abkühlen zum Hybridisieren. Dann wurden die zehn erhaltenen hybridisierten Fragmente (doppelsträngige DNA-Fragmente) in die obigen Gruppen unterteilt, und die Fragmente in jeder Gruppe wurden zu einer wäßrigen Lösung für eine Ligationsreaktion (66 mM Tris-HCl, pH 7,6, 6,6 mM MgCl&sub2;, 10 mM DTT, 1 mM ATP und 100 µg/ml BSA) (Gesamtmenge: 120 - 160 µl) gegeben, und die Lösung wurde auf 40ºC erwärmt und dann allmählich zum Hybridisieren abgekühlt. Dann wurden 700 Einheiten T4-DNA-Ligase (Takara Shuzo) dazugegeben, und die Ligationsreaktion wurde 15 Stunden bei 16 ºC durchgeführt.
Nach Beendigung der Reaktion wurden die jeweiligen Reaktionslösungen durch Polyacrylamidgel-Elektrophorese (Gelkonzentration: 6%) aufgetrennt. Aus den Ergebnissen des Beobachtens der Wanderungsrnuster mittels des Ethidiumbromid-Anfärbeverfahrens wurden die Bandenteile, die die gewünschten Größen aufwiesen (176 bp, 150 bp und 153 bp), ausgeschnitten, und die gewünschten drei DNA-Fragmente wurden durch ein Elektro- Elutionsverfahren gewonnen. Weiter wurden die gewonnenen Proben einer Phenolextraktion (unter Verwendung einer 50%-igen Phenol-/50%-igen Chloroform-Lösung) und einer Isobutanol-Extraktion unterzogen, gefolgt von einem Ethanol-Fällungsverfahren, um die gewünschten DNAS zu reinigen. Die drei gemäß dem oben erwähnten Verfahren gereinigten doppelsträngigen DNA- Fragmente wurden jeweils an ihren 5'-Termini mittels T4- Polynukleotidkinase phosphoryliert, und dann wurden sie in einer wäßrigen Lösung für eine Ligationsreaktion gemischt, dann bei 40ºC hybridisiert und durch Zugabe von T4-DNA-Ligase ligiert. Die ligierte DNA wurde mittels eines Ethanol-Fällungsverfahrens gewonnen und dann in 50 µl eines Hochsalz-Puffers (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 100 mM NaCl, 10 mM MgCl&sub2;) gelöst, welcher 1 mM DTT und 100 µg/ml BSA enthielt. Dann wurde durch Zugabe von 15 Einheiten Restriktionsendonuklease EcoR I (Takara Shuzo) und 15 Einheiten Restriktionsendonuklease Hind III (Takara Shuzo) zwei Stunden bei 37ºC eine Verdauungsreaktion durchgeführt. Nach Beendigung der Reaktion wurde das gewünschte DNA-Fragment (ungefähr 480 bp) mittels Polyacrylamidgel-Elektrophorese (Gelkonzentration: 4%) gemäß dem oben erwähnten Verfahren abgetrennt und gereinigt.
Andererseits wurden 5 µg Plasmidvektor pUC9 (erhalten von Research Laboratory for Genetic Information der Kyushu University) mit der Restriktionsendonuklease EcoR I und Hind III gemäß dem obigen Verfahren verdaut, und ein DNA-Fragment von ungefähr 2,7 Kbp wurde mittels Agarosegel-Elektrophorese (Gelkonzentration: 1%) abgetrennt und gereinigt. Dieses pUC9-Fragment und das zuvor gereinigte DNA-Fragment mit ungefähr 480 bp (das das menschliche TNF-Gen enthielt) wurden in 20 µl einer Ligationsreaktions-Lösung gemischt, und eine Ligationsreaktion wurde 3 Stunden bei 16ºC durch Zugabe von 350 Einheiten von T4-DNA-Ligase durchgeführt. Kompetente Zellen des E. coli K-12 JM83-Stammes (erhalten von Research Laboratory for Genetic Information der Kyushu University), die durch ein Calciumchlorid-Verfahren hergestellt worden waren (siehe Molecular Cloning), wurden mit der oben erwähnten Ligationsreaktionsmischung gemäß einem üblichen Verfahren (siehe Molecular Cloning) transformiert.
Aus dem so erhaltenen Ampicillin-resistenten Klon wurde mittels eines üblichen Verfahrens ein Plasmid hergestellt, und dieses wurde mit Restriktionsendonukleasen (EcoR I und Hind III) gemäß dem oben erwähnten Verfahren behandelt, und dann wurde sein Wanderungsmuster mittels Agarosegel-Elektrophorese analysiert, um die Insertion des menschlichen TNF-Gens in den pUC9-Vektor zu überprüfen. Als Ergebnis wurde die Insertion des Gens mit ungefähr 250 bp bestätigt. Bezüglich des Klons wurde die Nukleotidsequenz des insertierten Gens durch ein Didesoxy- Verfahren (F. Sanger, Science, 240, 1205 (1981)) überprüft, wodurch bestätigt wurde, daß es sich um ein Genfragment handelte, das die Nukleotidsequenz des gewünschten menschlichen TNF-Gens mit einer Größe von ungefähr 130 bp stromabwärts mit Bezug auf die EcoR I-Stelle und einer Größe von ungefähr 90 bp stromaufwärts von der Hind III-Stelle aufwies. Die Klone und das Plasmid wurden als pUA41/JM83 bzw. pUA41 bezeichnet.
(2) Dann wurde das Klonieren eines menschlichen TNF-Gens gemäß Figur 2 versucht.
In der Nukleotidsequenz von menschlichem TNF-Gen wurde die Region, die nicht durch das Klonieren in dem obigen Schritt (1) bewerkstelligt wurde, in zwei Gruppen aufgeteilt (U- und L-3 bis 6 und U- und L-6 bis 9), und auf die gleiche Weise wie in dem obigen Schritt (1) wurden die Oligonukleotide U-4 bis 6 und U-7 bis 9 und L-3 bis 5 und L-6 bis 8 5'- phosphoryliert, dann wurden die zwei Gruppen hybridisiert und mittels T4- DNA-Ligase ligiert. Die Produkte wurden mittels Polyacrylamidgel- Elektrophorese (Gelkonzentration: 6%) gemäß dem oben erwähnten Verfahren abgetrennt und gereinigt, und die zwei DNA-Fragmente, die dadurch erhalten wurden (201 bp und 200 bp), wurden jeweils in 100 µl von wäßrigen Lösungen gelöst, die 67 mM Tris-HCl (pH 8,8), 6,7 mM MgCl&sub2;, 16,6 mM (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4;, 6,7 µM EDTA, 1 µM DTT, 200 µg/ml BSA und 330 µM von jedem der Desoxyribonukleotidtriphosphate (dATP, dGTP, dCTP und TTP) enthielten, und 2 bis 5 Einheiten T4-DNA-Polymerase (Takara Shuzo) wurden dazugegeben. Die Mischung wurde 30 Minuten bei 37ºC umgesetzt, um die beiden Termini der DNA-Fragmente zu polieren. Nach Beendigung der Reaktion wurde die Mischung 10 Minuten bei 68ºC behandelt, um die T4-DNA-Polymerase zu desaktivieren, und die gewünschten zwei DNA-Fragmente wurden durch Fällung mit Ethanol gewonnen.
Andererseits wurden 5 µg pUC9-Vektor in 50 µl eines Mittelsalz- Puffers (10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 50 mM NaCl und 10 mM MgCl&sub2;) gelöst, der 1 mM DTT und 100 µg/ml BSA enthielt, und 15 Einheiten Restriktionsendonuklease Hinc II (Takara Shuzo) wurden dazugegeben. Die Mischung wurde zwei Stunden bei 37ºC umgesetzt, und dann wurde der Vektor durch Fällung mit Ethanol gewonnen. In den so erhaltenen geschnittenen und ringgeöffneten pUC9-Vektor wurden jeweils die zuvor polierten und gewonnenen zwei DNA-Fragmente mittels T4-DNA-Ligase gemäß dem oben erwähnten Verfahren insertiert, wodurch der E. coli K-12 JM83-Stamm transformiert wurde. Mit Bezug auf die jeweiligen dadurch erhaltenen Klone wurden die Nukleotidsequenzen der insertierten DNA auf die gleiche Weise wie im obigen Schritt (1) überprüft, um zu bestätigen, daß sie die gewünschten Nukleotidsequenzen waren. Diese Klone wurden als pUA42/JM83 bzw. pUA43/JM83 bezeichnet, und die Plasmide wurden als pUA42 bzw. pUA43 bezeichnet.
Das im obigen Schritt (1) erhaltene pUA41 wurde gemäß dem oben erwähnten Verfahren mit Restriktionsendonuklease EcoR I (Hochsalz-Puffer) und Sac I (Niedrigsalz-Puffer, hergestellt von Takara Shuzo) und Restriktionsendonuklease Hae II (Takara Shuzo) und Hind III (Mittelsalz- Puffer) verdaut; das im obigen Schritt (2) erhaltene pUA42 wurde mit Restriktionsendonuklease Sac I (Niedrigsalz-Puffer) und Hpa I (KCl-Puffer, hergestellt von Takara Shuzo) verdaut; und das pUA43 wurde mit Restriktionsendonuklease Hpa I bzw. Hae II (KCl-Puffer) verdaut. Mit Bezug auf die Kombination des Niedrigsalz-Puffers (10 mM Tris-HCl, pH 7,5 und 10 mM MgCl&sub2;) und des Hochsalz-Puffers oder des KCl-Puffers (20 mM Tris- HCl, pH 8,5, 100 mM KCl und 10 mM MgCl&sub2;) wurde die Verdauungsreaktion zweimal gesondert durchgeführt, und das Fällungsverfahren mit Ethanol wurde zwischen diesen beiden Reaktionen durchgeführt. Das EcoR I-Sac-DNA- Fragment (127 bp) und das Hae II-Hind III-DNA-Fragment (80 bp) von pUA41, das Sac I-Hpa I-DNA-Fragment (147 bp) von pUA42 und das Hpa I-Hae II-DNA- Fragment (126 bp) von pUA43 wurden jeweils mittels Polyacrylamidge.L- Elektrophorese (Gelkonzentration: 6%) gemäß dem oben erwähnten Verfahren abgetrennt und gereinigt.
Andererseits wurden 5 µg eines pUC19-Plasmidvektors (erhalten von Research Laboratory for Genetic Information der Kyushu University) mit Restriktionsendonuklease EcoR I und Hind III gemäß dem oben erwähnten Verfahren verdaut, und ein DNA-Fragment mit ungefähr 2,7 Kbp wurde mittels Agarosegel-Elektrophorese (Gelkonzentration: 1%) abgetrennt und gereinigt. Wie erläutert (Figur 2), wurden die zuvor gereinigten vier DNA-Fragmente nacheinander dazugegeben und mittels T4-DNA-Ligase gemäß dem oben erwähnten Verfahren ligiert und schließlich in den oben gereinigten pUC19- Vektor (Fragment ungefähr 2,7 Kbp) insertiert, wodurch der JM83-Stamm transformiert wurde. Mit Bezug auf das Plasmid, das in diesem Transformanten enthalten war, wurde die Nukleotidsequenz des insertierten Gens gemäß dem oben erwähnten Verfahren überprüft, wodurch bestätigt wurde, daß es sich um einen Klon mit einem Plasmidvektor (ungefähr 3,2 Kbp) handelte, der das gewünschte menschliche TNF-Gen in voller Länge (ungefähr 480 bp) enthielt. Dieser Klon wurde als pUA44/JM83 bezeichnet, und das Plasmid wurde als pUA44 bezeichnet.

BEISPIEL 4

Klonieren eines Expressionsvektors von menschlichem TNF

(t) Die folgenden Verbesserungen wurden auf den Expressionsvektor pKK 223-3 (erhalten von Pharmacia) mit einem tac-Promotor angewendet, so daß der Vektor leichter gehandhabt werden kann.
(A) Um das Molekulargewicht des Expressionsvektors zu erniedrigen.
(B) Um die Spaltungsstelle bezüglich der Restriktionsendonuklease BamH I einzigartig zu machen.
(C) Um die Richtung des tac-Promotors umgekehrt zu der Richtung des Ampicillin-Resistenz-Gens zu machen.
Das Verfahren ist in Figur 3 erläutert.
5 µg Plasmidvektor pBR 322 (erhalten von Research Laboratory for Genetic Information der Kyushu University) wurden gemäß dem Verfahren von Beispiel 3 mit Restriktionsendonuklease EcoR I und Hind III verdaut, und beide Termini davon wurden mittels T4-DNA-Polymerase poliert. Gemäß dem Verfahren von Beispiel 3 wurde ein DNA-Fragment mit ungefähr 4,4 Kbp mittels Agarosegel-Elektrophorese abgetrennt und gereinigt (Gelkonzentration: 1%). Dann wurden 100 ng nicht-phosphorylierter Bgl II- Linker (ein doppelsträngiges DNA-Fragment mit 10 bp, das eine Bgl II- Restriktionsendonukleasen-Spaltungsstelle enthielt, erhalten von Takara Shuzo, Katalognr. 4721A, Takara Biotechnology Catalogue 1991, Band 1) mittels T4-DNA-Ligase an der ringgeöffneten Stelle davon insertiert und ligiert. Das Plasmid, das in dem Transformanten enthalten war, der auf die gleiche Weise wie in Beispiel 3 erhalten worden war, wurde durch Verdauung mit den Restriktionsendonukleasen überprüft, wodurch bestätigt wurde, daß ein Klon mit dem gewünschten Plasmid pBR 9333 (ungefähr 4,4 Kbp) erhalten wurde, bei dem die Spaltungsstellen für die Restriktionsendonukleasen EcoR I und Hind III deletiert waren und eine Spaltungsstelle für die Restriktionsendonuklease Bgl II neu insertiert war.
Dann wurden 5 µg des so erhaltenen Plasmids pBR 9333 gemäß dem Verfahren von Beispiel 3 in einem Hochsalz-Puffer gelöst und mit Restriktionsendonuklease Bgl II (Takara Shuzo) und Pvu II (Takara Shuzo) verdaut. Dann wurde ein DNA-Fragment mit ungefähr 2,3 Kbp, das einen Replikationsursprung enthielt, mittels Agarosegel-Elektrophorese abgetrennt und gereinigt (Gelkonzentration: 1%). Andererseits wurden 5 µg Expressionsvektor pKK 223-3 (ungefähr 4,6 Kbp) in einem Hochsalz-Puffer auf die gleiche Weise wie oben gelöst und mit Restriktionsendonuklease Bamh 1 (Takara Shuzo) und Sca I (Takara Shuzo) verdaut. Die Verdauungsreaktion mit der Restriktionsendonuklease BamH I wurde durch Teilverdauung über eine Reaktionszeit von 5 bis 30 Minuten mittels Verringerung der Menge des zugegebenen Enzyms auf ein Maß von ungefähr 1/2 der üblichen Menge durchgeführt. Nach der Verdauungsbehandlung wurde das erhaltene DNA-Fragment mit ungefähr 1,1 Kbp, das einen tac-Promotor und einen rrnBT&sub1;T&sub2;-Terminator enthielt, mittels Agarosegel-Elektrophorese auf die gleiche Weise wie oben abgtrennt und gereinigt. Das DNA-Fragment mit ungefähr 1,1 Kbp wurde mittels T4-DNA-Ligase auf die gleiche Weise, wie oben beschrieben, in das zuvor gereinigte DNA-Fragment mit ungefähr 2,3 Kbp, das einen Replikationsursprung enthielt, insertiert und ligiert. Die ligierte DNA wurde gemäß dem Verfahren von Beispiel 3 in kompetente Zellen eines E. coli K-12 JM103-Stammes (erhalten von Research Laboratory for Genetic Information der Kyushu University) eingeführt, welcher durch ein Calciumchlorid-Verfahren hergestellt worden war. Von den so erhaltenen Transformanten wurde ein Klon mit dem gewünschten Expressionsvektor (ungefähr 3,4 Kbp) selektiert, der den tac-Promotor enthielt, und dieser Expressionsvektor wurde als pKK 101 bezeichnet.
(2) Unter Bezug auf Figur 4 wird der folgende Schritt beschrieben.
Fünf µg des in dem obigen Schritt (1) erhaltenen Expressionsvektors pKK 101 wurden mit Restriktionsendonuklease EcoR I und Hind III gemäß dem oben erwähnten Verfahren verdaut, und ein DNA-Fragment mit ungefähr 3,4 Kbp, das einen Replikationsursprung und eine Transkriptions- Steuerungsregion enthielt, wurde durch Agarosegel-Elektrophorese abgetrennt und gereinigt (Gelkonzentration: 1%). Ähnlich wurde das Plasmid pUA44 (ungefähr 3,2 Kbp), das das in Beispiel 3 erhaltene menschliche TNF- Gen enthielt, mit Restriktionsendonuklease EcoR I und Hind III verdaut, wonach ein DNA-Fragment mit ungefähr 480 bp, das die gesamte Region eines menschlichen TNF-Gens enthielt, mittels Agarosegel-Elektrophorese abgetrennt und gereinigt wurde. Dieses DNA-Fragment, das die gesamte Region eines menschlichen TNF-Gens enthielt, wurde gemäß dem oben erwähnten Verfahren in das DNA-Fragment von ungefähr 3,4 Kbp, das zuvor aus dem Expressionsvektor pKK 3.01 gereinigt wurde, mittels T4-DNA-Ligase insertiert und ligiert. Die ligierte DNA wurde gemäß dem oben erwähnten Verfahren in einen E. coli K-12 JM103-Stamm eingeführt. Von den so erhaltenen Transformanten wurde ein Klon mit dem gewünschten Expressionsvektor von menschlichem TNF (ungefähr 3,9 Kbp) selektiert, und dieser Expressionsvektor wurde als pKF 4102 bezeichnet.

BEISPIEL 5

Klonieren des Expressionsvektors einer N-terminalen Mutante von menschlichem TNF pKF 4168

(1) Das Verfahren wird mit Bezug auf Figur 5 beschrieben.
Das in Beispiel 3 erhaltene Plasmid pUA44 wurde gemäß dem oben erwähnten Verfahren mit Restriktionsendonuklease EcoR I und Hind III verdaut, und ein DNA-Fragment des menschlichen TNF-Gens (ungefähr 480 bp, die die gesamte Region enthielten) wurde mittels Agarosegel-Elektrophorese abgetrennt und gereinigt. Andererseits wurde der Plasmidvektor pUC119 (erhalten von Takara Shuzo) für die Herstellung einer einzelsträngigen Plasmid-DNA, entwickelt von Messing et al. (Methods in Enzymology, 153, 3 (1987)), ebenfalls mit Restriktionsendonuklease EcoR I und Hind III verdaut, und ein DNA-Fragment mit ungefähr 3,2 Kbp, das eine Intergen (IG)-Region enthielt, wurde mittels Agarosegel-Elektrophorese abgetrennt und gereinigt. Durch die Anwesenheit dieser IG-Region (Intergen-Region von M13 Phagen-DNA) wird das Plasmid pUC119, nachdem es in einen Helfer-Phagen M13K07 infiziert worden ist, vorzugsweise eine einzelsträngige DNA werden und wird durch Phagenteilchen eingeschlossen und wird aus den Mikrobenzellen ausgestoßen. Das DNA-Fragment mit ungefähr 480 bp, gereinigt wie oben und die gesamte Region des menschlichen TNF-Gens enthaltend, und das pUC119-Fragment mit ungefähr 3,2 Kbp, das die IG- Region enthielt, wurden mittels T4-DNA-Ligase gemäß dem oben erwähnten Verfahren ligiert, und die ligierte DNA wurde gemäß dem Verfahren von Beispiel 3 in einen E. coli K-12 JM83-Stamm eingeführt. Von den so erhaltenen Transformanten wurde ein Klon mit dem gewünschten Plasmid (ungefähr 3,7 Kbp) selektiert. Dieser Klon wurde als pUC119-hTNF/JM83 bezeichnet, und das Plasmid wurde als pUC119-hTNF bezeichnet.
Das so erhaltene Plasmid pUC119-hTNF wurde gemäß dem Verfahren von Beispiel 3 in kompetente Zellen eines E. coli CJ236-Stammes (dut&supmin;, ung&supmin;), hergestellt durch ein Calciumchlorid-Verfahren, eingeführt, um Uracil in die DNA des Plasmids einzubauen. Der CJ236-Stamm weist eine Mutation (dut&supmin;) in dem Enzym dUTPase(Desoxyuridintriphosphat-Phosphatase)-Gen auf, und dadurch wird eine Konkurrenzreaktion verursacht, wodurch es möglich wird, eine DNA zu erzeugen, die teilweise Uracil anstelle von Thymin eingebaut aufweist. Weiter mangelt ihr auf Grund der ung&supmin;-Mutation das Enzym Uracil-N-glycosylase, wodurch es möglich wird, Uracil in der DNA zu behalten. Ein derartiger CJ236-Stamm wurde von Bio-Rad erhalten. Der Klon (pUC119-hTNF/CJ236), der durch eine solche Einführung erhalten wurde, wurde, nachdem er mit dem Helfer-Phagen M13K07 (erhalten von Takara Shuzo) infiziert worden war, in einer 2 x YT-Nährlösung (1,6% Trypton, 1% Hefeextrakt und 0,5% NaCl, pH 7,6) kultiviert, welche 100 µg/ml Ampicillin, 70 µg/ml Kanamycin und 30 µg/ml Chloramphenicol enthielt, wodurch die gewünschte einzelsträngige Plasmid-DNA (ungefähr 3,7 K-Basen) mit eingeführtem Uracil in durch Phagenteilchen eingeschlossener Form aus den Zellen ausgestoßen wurde. Die ausgestoßenen Phagenteilchen wurden aus dem Überstand der Nährlösung gewonnen, und die gewünschte einzelsträngige Plasmid-. DNA wurde gemäß einem Verfahren zur Herstellung einzelsträngiger Phagen-DNA hergestellt.
(2) Das Verfahren wird mit Bezug auf Figur 6 beschrieben.
Der Primer 4168 wurde entworfen, um unter Verwendung eines Kodierstrang-Oligonukleotids eine Mutation in das menschliche TNF-Gen einzuführen.
Der Primer 4168 ist ein Oligonukleotid, das 12 Basen mit einer Nukleotidsequenz vom 10. C bis zum 21. T umfaßt, wie in der SEQ ID Nr.: 10 gezeigt, worin das 13. - 15. 5'-ACC-3' durch 5'-GGC-3' ersetzt ist und das 16. - 18. 5'-CCG-3' durch 5'-GAT-3' ersetzt ist.
Die chemische Synthese und Reinigung dieses Oligonukleotids wurde gemäß dem Verfahren von Beispiel 2 durchgeführt.
Die auf eine Position gerichtete Mutagenese des menschlichen TNF- Gens wurde gemäß dem Bio-Rad-System (Muta-Gene in vitro-Mutagenese-Kit) durchgeführt. Das heißt, ungefähr 0,5 µg des wie oben hergestellten Primers, dessen 5'-Terminus gemäß dem oben erwähnten Verfahren mit T4- Polynukleotidkinase phosphoryliert war, und ungefähr 200 ng der zuvor hergestellten einzelsträngigen Plasmid-DNA (pUC119-hTNF), in die Uracil eingeführt war, wurden in 10 µl eines Hybridisierungspuffers (20 mM Tris- HCl, pH 7,4, 2 mM MgCl&sub2; und 50 mM NaCl) hybridisiert (d.h. bei 70ºC erwärmt, gefolgt von allmählichem Abkühlen). Nach Beendigung der Hybridisierung wurde ein 1/10 Volumen von 10 x Synthesepuffer (5 mM Desoxyribonukleotidtriphosphate (DATP, DGTP, DCTP und TTP), 10 mM ATP, 100 mM Tris-HCl, pH 7,4, 50 mM MgCl&sub2; und 20 mM DTT) dazugegeben, und eine Doppelstrang-erzeugende Reaktion (37ºC, 90 Minuten) wurde mittels 1 Einheit T4-DNA-Polymerase und 2 bis 4 Einheiten T4-DNA-Ligase durchgeführt. Ungefähr 8 Volumina TE-Puffer (10 mM Tris-HCl, pH 7,5, und 1 mM EDTA) wurden dazugegeben, und die Mischung wurde eingefroren, um die Reaktion zu stoppen. Diese Reaktionsmischung wurde gemäß dem Verfahren von Beispiel 3 auf kompetente Zellen des E. coli K-12 TG1-Stammes (ung&spplus;, erhalten von Amersham), hergestellt durch ein Calciumchlorid-Verfahren, angewendet, um die doppelsträngige DNA einzuführen.
Durch die Einführung der nunmehr doppelsträngigen DNA in den ung&spplus;- Stamm wurde der Uracil-haltige DNA-Strang als Matrize desaktiviert und nicht repliziert. (Deshalb wird die Mutationsfrequenz so hoch wie mehr als 50%.) Von den so erhaltenen Transformanten wurde ein Klon mit einem Plasmid (ungefähr 3,7 Kbp), das die gewünschte Mutanten-DNA enthielt, mittels eines Kolonienhybridisierungs-Verfahrens selektiert, welches als Sonde den für die Einführung der Mutation verwendeten Prirner verwendete. Bezüglich des selektierten Klons wurde die Nukleotidsequenz um die Stelle des Plasmids herum, an der die Mutation eingeführt worden war, mittels des Didesoxy-Verfahrens (F. Sanger, wie oben erwähnt) überprüft, um zu bestätigen, daß sie, wie entworfen, zu der Mutanten-DNA modifiziert war. Dieses Plasmid wurde als pUC119-F4168 bezeichnet.
(3) Das gewünschte N-terminale Mutantengen von menschlichem TNF, das durch Einführung der Mutation erhalten wurde, wurde gemäß dem Verfahren des Klonierens des Expressionsvektors für menschliches TNF von Beispiel 4 in den Expressionsvektor pKK 101 mit dem tac-Promotor insertiert, um einen Expressionsvektor für eine N-terminale Mutante von menschlichem TNF zu erhalten. Das N-terminale Mutantengen von menschlichem TNF (ungefähr 480 bp) wurde nach Verdauung des oben erhaltenen Plasmids pUC119-F4168 (ungefähr 3,7 Kbp) mit Restriktionsendonuklease EcoR I und Hind III gemäß dem oben erwähnten Verfahren abgetrennt und gereinigt. Der gewünschte Expressionsvektor für eine N-terminale Mutante von menschlichem TNF (pKF 4168) wurde erhalten, indem man auf die gleiche Weise wie im Fall des menschlichen TNF-Expressionsvektors (pKF 4102) als Wirt ein E. coli K-12 JM103 verwendete.
Der Expressionsvektor für die N-terminale Mutante induziert die Expression, um ein neues physiologisch aktives Polypeptid mit dem folgenden Ersatz in E. coli-Zellen zu erzeugen.
Vektor pKF 4168: kodiert für das Polypeptid F4168 mit der Aminosäuresequenz, wie in SEQ ID Nr.: 1 gezeigt, in der die 1. - 8. Aminosäuresequenz durch die in SEQ ID Nr.: 2 gezeigte Aminosäuresequenz substituiert ist.

BEISPIEL 6

Klonieren von Expressionsvektoren für eine N-terminale Mutante von menschlichem TNF pKF 4415, pKF 4416, pKF 4417 und pKF 4418

(1) Wie in Beispiel 5 (2), außer daß Primer 4415, 4416, 4417 oder 4418 anstelle von Primer 4168 verwendet wurde, um ein Plasmid (ungefähr 3,7 Kbp) zu erhalten, das die gewünschte Mutanten-DNA enthielt. Nach Bestätigung durch das Didesoxy-Verfahren, daß die DNA zu der Mutanten-DNA, wie entworfen, modifiziert war, wurde ein solches Plasmid als pUC119- F4415, pUC119-F4416, pUC119-F4417 bzw. pUC119-F4418 bezeichnet.
Die Primer 4415, 4416, 4417 und 4418, die hier verwendet wurden, waren die folgenden Oligonukleotide, und ihre chemische Synthese und Reinigung wurde gemäß dem Verfahren von Beispiel 2 durchgeführt.
Primer 4415: ein Oligonukleotid, das 24 Basen umfaßt, mit der Nukleotidsequenz vom 7. T bis zum 30. T, wie in der SEQ ID Nr.: gezeigt, in der das 16. - 18. 5'-CCG-3' durch 5'-CGT-3' ersetzt ist und das 19. - 21. 5'-AGT-3' durch 5'-GGT-3' ersetzt ist.
Primer 4416: ein Oligonukleotid, das 27 Basen umfaßt, mit der Nukleotidsequenz vom 1. T bis zum 18. G, wie in der SEQ ID Nr.: 10 gezeigt, worin 5'-CGTGGTGAT-3' zwischen das 9. T und das 10. C insertiert ist.
Primer 4417: ein Oligonukleotid, das 27 Basen umfaßt, mit der Nukleotidsequenz vom 10. C bis zum 27. G, wie in der SEQ ID Nr.: 10 gezeigt, worin 5'-CGTGGTGAT-3' zwischen das 18. G und das 19. A insertiert ist.
Primer 4418: ein Oligonukleotid, das 27 Basen umfaßt, mit der 1. - 9. Nukleotidsequenz, wie in SEQ ID Nr.: 10 gezeigt, worin 5'-CGTGGTGAT-3' an die 5'-Stelle von dem 1. T addiert ist und 5'-GAATTCATG-3' an die 5'- Stelle davon addiert ist.
(2) Das gewünschte N-terminale Mutantengen von menschlichem TNF, das durch die Einführung der Mutation erhalten wurde, wurde gemäß dem Verfahren des Klonierens eines menschlichen TNF-Expressionsvektors von Beispiel 4 in den Expressionsvektor pKK 101 mit dem tac-Promotor insertiert, um einen Expressionsvektor für eine N-terminale Mutante von menschlichem TNF zu erhalten. Das N-terminale Mutantengen von menschlichem TNF (ungefähr 480 bp) wurde nach Verdauung des oben erhaltenen Plasmids pUC119-F4415, pUC119-F4416, pUC119-F4417 oder pUC119-F4418 (ungefähr 3,7 Kbp) mit Restriktionsendonukleasen EcoR I und Hind III gemäß dem oben erwähnten Verfahren abgetrennt und gereinigt. Der gewünschte Expressionsvektor für eine N-terminale Mutante von menschlichem TNF pKF 4415, pKF 4416, pKF 4417 oder pKF 4418 wurde erhalten, indem man auf die gleiche Weise wie im Fall des menschlichen TNF-Expressionsvektors (pKF 4102) als Wirt einen E. coli K-12 JM103-Stamm verwendete.
Der obige Expressionsvektor für die N-terminale Mutante induziert die Expression eines neuen physiologisch aktiven Polypeptids mit dem folgenden Ersatz in E. coli-Zellen.
Vektor pKF 4415: kodiert für Polypeptid F4415 mit der Aminosäuresequenz, wie in SEQ ID Nr.: 1 gezeigt, in der die 1. - 8. Aminosäuresequenz durch die in SEQ ID Nr.: 3 gezeigte Aminosäuresequenz ersetzt ist.
Vektor pKF 4416: kodiert für Polypeptid F4416 mit der Aminosäuresequenz, wie in SEQ ID Nr.: 1 gezeigt, worin die 1. - 8. Aminosäuresequenz durch die in SEQ ID Nr.: 4 gezeigte Aminosäuresequenz ersetzt ist.
Vektor pKF 4417: kodiert für Polypeptid F4417 mit der Aminosäuresequenz, wie in SEQ ID Nr.: 1 gezeigt, worin die 1. - 8. Aminosäuresequenz durch die in SEQ ID Nr.: 5 gezeigte Aminosäuresequenz ersetzt ist.
Vektor pKF 4418: kodiert für Polypeptid F4418 mit der Aminosäuresequenz, wie in SEQ ID Nr.: 1 gezeigt, worin die 1. - 8. Aminosäuresequenz durch die in SEQ ID Nr.: 6 gezeigte Aminosäuresequenz ersetzt ist.

BEISPIEL 7

Klonieren des Expressionsvektors für eine N-terminale Mutante von menschlichem TNF pKF 4420

(1) Ein Oligonukleotid mit 16 Basen vom 5. C bis zum 20. G, wie in der SEQ ID Nr.: 10 gezeigt, in dem das 13. A durch G ersetzt ist, wurde entworfen und als Primer 4104 bezeichnet. Die chemische Synthese und Reinigung dieses Oligonukleotids wurde gemäß dem Verfahren von Beispiel 2 durchgeführt. Wie in Beispiel 5 (2), außer daß dieser Primer 4104 anstelle des Primers 4168 verwendet wurde, erhielt man ein Plasmid (ungefähr 3,7 Kbp), das die gewünschte Mutanten-DNA enthielt. Die Nukleotidsequenz um die Stelle herum, an der die Mutation eingeführt worden war, wurde mittels des Didesoxy-Verfahrens überprüft, um zu bestätigen, daß die DNA zu der Mutanten-DNA, wie entworfen, modifiziert war, und dieses Plasmid wurde als pUC119-F4104 bezeichnet.
(2) Wie in Beispiel 5 (1) wurde pUC119-F4104 anstelle von pUC119- HTNF verwendet, um die gewünschte einzelsträngige Plasmid-DNA zu erhalten. Weiter wurde ein Oligonukleotid mit 21 Basen vom 46. G bis zum 66. G, wie in der SEQ ID Nr.: 10 gezeigt, in dem das 56. A durch G ersetzt war, entworfen und als Primer 4226 bezeichnet. Die chemische Synthese und Reinigung dieses Oligonukleotids wurden gemäß dem Verfahren von Beispiel 2 durchgeführt.
Dann wurde unter Verwendung der einzelsträngigen Plasmid-DNA von pUC119-F4104 und des oben hergestellten Primers 4226 die auf eine Position gerichtete Mutagenese eines Mutantengens von menschlichem TNF gemäß dem Verfahren von Beispiel 5 (2) durchgeführt, um ein Plasmid (ungefähr 3,7 Kbp) zu erhalten, das die gewünschte Mutanten-DNA enthielt. Es wurde durch das Didesoxy-Verfahren bestätigt, daß die DNA zu der Mutanten-DNA, wie entworfen, modifiziert war, und dieses Plasmid wurde als pUC119-F4226 bezeichnet.
(3) Unter Verwendung des in Beispiel 7 (2) erhaltenen Plasmids pUC119-F4226 mit zwei Restriktionsendonukleasen-Xho I-Spaltungsstellen wurde ein Expressionsvektor (als pKF4420 bezeichnet) des N-terminalen substituierten Mutantenpolypeptids (als F4420 bezeichnet) kloniert, indem man ein chemisch synthetisiertes Oligonukleotid (doppelsträngig durch Hybridisieren) an die N-Stelle der gebildeten Restriktionsendonukleasen Xho I-Spaltungsstelle ligierte. Das Klonierungsverfahren wird mit Bezug auf Figur 7 beschrieben.
Fünf µg Plasmid pUC119-F4226 (ungefähr 3,7 Kbp) wurden gemäß dem Verfahren von Beispiel 3 in Hochsalz-Puffer gelöst und mit Restriktionsendonuklease Xho I (Takara Shuzo) und Hind III verdaut, wonach ein DNA-Fragment mit ungefähr 420 bp, das das F4226-Gen mit dem N- terminalen Teil deletiert enthielt, mittels Agarosegel-Elektrophorese (Gelkonzentration: 1%) abgetrennt und gereinigt wurde. Andererseits wurden ein oberer (kodierender) Strang (U-4420) und der untere (nicht kodierende) Strang (L-4420) eines Oligonukleotids, das für ein Oligopeptid kodierte, das für den Zweck der Substitution am N-terminalen Teil von F4226 entworfen worden war, gemäß dem Verfahren von Beispiel 2 chemisch synthetisiert und gereinigt. Der obere Strang U-4420 ist ein Oligonukleotid mit der Nukleotidsequenz wie in SEQ ID Nr.: 11 gezeigt. Der untere Strang L-4420 ist ein Strang mit einer Sequenz, die komplementär zu dem oberen Strang U-4420 ist, aber dieser untere Strang weist keineii Seguenzteil auf, der komplementär zu dem 1. - 4. 5'-AATT-3' des obereti Stranges U-4420 ist. Andererseits ist es ein Oligonukleotid mit einer Nukleotidsequenz, an der 5'-TCGA-3' an der 5'-Stelle des 5'-terminalen G des unteren Stranges addiert ist. Die zwei Oligonukleotide (jeweils 1 µg), die nach Reinigung erhalten wurden, wurden an ihren 5'-Termini mit T4- Polynukleotidkinase gemäß dem Verfahren von Beispiel 3 phosphoryliert, gefolgt vom Hybridisieren, um ein doppelsträngiges DNA-Fragment zu erhalten (46 bp). Andererseits wurde der Plasmidvektor pKK 101 mit Restriktionsendonuklease EcoR I und Hind III gemäß dem Verfahren vor Beispiel 4 verdaut, wonach ein DNA-Fragment mit ungefähr 3,4 Kbp, das einen Replikationsursprung und eine Transkriptions- Steuerungsregion enthielt, abgetrennt und gereinigt wurde.
Die drei durch das obigen Verfahren erhaltenen DNA-Fragmente wurden gemäß dem Verfahren von Beispiel 3 mit T4-DNA-Ligase ligiert, und die ligierte DNA wurde in kompetente Zellen des E. coli K-12 JM103-Stammes eingeführt. Von den so erhaltenen Transformanten wurde ein Klon mit dem gewünschten F4420-Expressionsvektor pKF 4420 (ungefähr 3,9 Kbp) selektiert, indem man das Verdauungsmuster mit Restriktionsendonuklease EcoR I, Xho I und Hind III bestätigte und die Nukleotidsequenz um die N- terminale substituierte Stelle des N-terminalen Mutantenpolypeptids überprüfte.
Der gemäß dem obigen Verfahren klonierte Expressionsvektor für eine N-terminale Mutante induziert die Expression eines neuen physiologisch aktiven Polypeptids mit dem folgenden Ersatz in E. coli-Zellen.
Vektor pKF 4420: kodiert für das Polypeptid F4420 mit der Aminosäuresequenz, wie in SEQ ID Nr.: 1 in der Sequenzliste gezeigt, worin die 1 - 8. Aminosäuresequenz durch die Aminosäuresequenz Arg-Gly-Asp ersetzt ist.

BEISPIEL 8

Klonieren der Expressionsvektoren für eine N-terminale Mutante von menschlichem TNF pKF 4421 und pKF 4137

Unter Verwendung des in Beispiel 7 (1) erhaltenen Plasmids pUC119- F4104 mit einer Restriktionsendonuklease-Xho I-Spaltungsstelle wurde ein chemisch synthetisiertes Oligonukleotid (doppelsträngig gemacht durch Hybridisieren) an die N-Stelle der Restriktionsendonuklease-Xho I- Spaltungsstelle ligiert, wodurch Expressionsvektoren (als pKF 4421 und pKF 4137 bezeichnet) der N-terminalen substituierten Mutantenpolypeptide (als F4421 und F4137 bezeichnet) kloniert wurden.
Fünf µg Plasmid pUC119-4104 (ungefähr 3,7 Kbp) wurden gemäß dem Verfahren von Beispiel 3 in einem Hochsalz-Puffer gelöst und mit Restriktionsendonuklease Xho I und Hind III verdaut, wonach ein DNA- Fragment mit ungefähr 460 bp, das das F4104-Gen mit dem N-terminalen Teil deletiert enthielt, mittels Agarosegel-Elektrophorese abgetrennt und gereinigt wurde (Gelkonzentration: 1%). Andererseits wurden der obere (kodierende) Strang (U-4421 oder U-4137) und der untere (nicht kodierende) Strang (L-4421 oder L-4137) eines Oligonukleotids, das für ein Oligopeptid kodierte, das für den Zweck der Substitution an dem N-terminalen Teil von F4104 entworfen worden war, gemäß dem Verfahren von Beispiel 2 chemisch synthetisiert und gereinigt. Der obere Strang U-4421 ist ein Oligonukleotid mit der Sequenz, die in der SEQ ID Nr.: 12 in der Sequenzliste gezeigt ist. Hingegen ist der untere Strang L-4421 ein Strang mit einer Sequenz, die komplementär zum oberen Strang U-4421 ist, aber keinen Sequenzteil aufweist, der komplementär zum 1. - 4. 5'-AATT-3' des oberen Stranges ist, und er ist ein Oligonukleotid mit einer Sequenz, in der 5'-TCGA-3' an die 5'-Stelle des 5'-terminalen G des unteren Stranges addiert ist. Weiter ist der untere Strang U-4137 ein Nukleotid mit der Sequenz wie in der SEQ ID Nr.: 13 in der Sequenzliste gezeigt. Der untere Strang L-4137 ist ein Strang mit einer Sequenz, die komplementär zum oberen Strang U-4137 ist, aber keinen Sequenzteil aufweist, der komplementär zum 1. - 4. 5'-AATT-3' des oberen Stranges U-4137 ist, und er ist ein Oligonukleotid mit einer Sequenz, in der 5'-TCGA-3' an die 5mi Stelle des 5'-terminalen G des unteren Stranges addiert ist. Die jeweiligen oberen und unteren zwei Oligonukleotide (jeweils 1 hug), die nach der Reinigung erhalten wurden, wurden an den 5'-Termini mittels T4-Polynukleotid-Kinase phosphoryliert, gefolgt vom Hybridisieren, um ein doppelsträngiges DNA-Fragment zu erhalten (34 bp).
Andererseits wurde der Plasmidvektor pKK 101 mit Restriktionsendonuklease EcoR I und Hind III gemäß dem Verfahren von Beispiel 4 verdaut, und ein DNA-Fragment mit ungefähr 3,4 Kbp, das einen Replikationsursprung und eine Transkriptions-Steuerungsregion enthielt, wurde abgetrennt und gereinigt.
Die drei DNA-Fragmente, die durch das obige Verfahren erhalten wurden, wurden gemäß dem Verfahren von Beispiel 3 mittels T4-DNA-Ligase ligiert, und die ligierte DNA wurde in kompetente Zellen des E. coli K-12 JM 103-Stammes eingeführt. Von den so erhaltenen Transformanten wurde ein Klon mit dem gewünschten F4421-Expressionsvektor pKF 4421 (ungefähr 3,9 Kbp) oder F4137-Expressionsvektor pKF 4137 (ungefähr 3,9 Kbp) selektiert, indem man die Verdauungsmuster mit Restriktionsendonuklease EcoR I, Xho 1 und Hind III bestätigte und die Nukleotidsequenz um die N-terminale substituierte Seite des N-terminalen Mutantenpolypeptids überprüfte.
Der so durch das obige Verfahren klonierte Expressionsvektor für eine N-terminale Mutante induziert die Expression eines neuen physiologisch aktiven Polypeptids mit dem folgenden Ersatz in E. coli- Zellen.
Vektor pKF 4421: kodiert für das Polypeptid F4421 mit der Aminosäuresequenz wie in der SEQ ID Nr.: 1 in der Sequenzliste gezeigt, worin die 1 - 8. Aminosäuresequenz durch die in SEQ ID Nr.: 7 gezeigte Aminosäuresequenz ersetzt ist.
Vektor pKF 4137: kodiert für das Polypeptid F4137 mit der Aminosäuresequenz wie in der SEQ ID Nr.: 1 in der Sequenzliste gezeigt, worin die 1 - 8. Aminosäuresequenz durch die Aminosäuresequenz, die in der SEQ ID Nr.: 8 gezeigt ist, ersetzt ist.

BEISPIEL 9

Klonieren des Expressionsvektors für eine N-terminale Mutante von menschlichem TNF pKF 4113

Ein Plasmidvektor (als pSK407 bezeichnet) mit einem trp-Promotor als Promotor, zwei Translations-Startsignalen (SD-Sequenz) im Tandem angeordnet und dem rrnBT&sub1;T&sub2;-Terminator als Terminator wurde gemäß dem in den Figuren 9 bis 11 gezeigten Verfahren kloniert. Fünf µg Plasmidvektor pGF101 (ungefähr 4,3 Kbp, erhalten von Osaka University, Faculty of Pharmaceutical Science) wurden gemäß dem oben erwähnten Verfahren in einem Mittelsalz-Puffer gelöst und durch die Zugabe von 10 Einheiten Restriktionsendonuklease Cla I (Takara Shuzo) verdaut. Das geschnittene DNA-Fragment wurde mittels T4-DNA-Polymerase gemäß dem Verfahren von Beispiel 3 poliert, und nach dem Ethanol-Fällungsverfahren wurde es in einem Hochsalz-Puffer mit zugesetztem NaCl auf eine NaCl-Konzentration von mM gelöst und durch die Zugabe von 15 Einheiten Restriktionsendonuklease Sal I (Takara Shuzo) verdaut. Ein DNA-Fragment mit ungefähr 4,0 Kbp wurde mittels Agarosegel-Elektrophorese (Gelkonzentration: 1%) gemäß dem Verfahren von Beispiel 3 abgetrennt und gereinigt.
Andererseits wurden 5 µg Plasmid PMC1403 (ungefähr 9,9 Kbp, erhalten vom Institute for Virus Research, Kyoto University), entwickelt von Casadaban et al. (J. Bacteriol., 143, 971 (1980)) gemäß dem oben erwähnten Verfahren mit Restriktionsendonuklease EcoR I verdaut, gefolgt vom Polieren und Verdauen mit Restriktionsendonuklease Sal I auf die gleiche Weise wie oben, wonach ein DNA-Fragment mit ungefähr 6,2 Kbp mittels Agarosegel-Elektrophorese abgetrennt und gereinigt wurde. Gemäß dem Verfahren von Beispiel 3 wurde dieses DNA-Fragment an das zuvor gereinigte DNA-Fragment mittels T4-DNA-Ligase ligiert, und die ligierte DNA wurde in kompetente Zellen eines E. coli K-12 HB101-Stammes (erhalten vom Institute for Virus Research, Kyoto University), hergestellt mit einem Calciumchlorid-Verfahren, eingeführt. Von den dadurch erhaltenen Transformanten wurde ein Klon mit dem gewünschten Plasmidvektor (als pSK101 bezeichnet) mit ungefähr 10,2 Kbp selektiert, der den trp-Promotor und Restriktionsendonuklease EcoR I und BamH I-Spaltungsstellen enthielt.
In jedem von zwei Röhrchen wurden 5 µg des oben erhaltenen Plasmidvektors pSK101 in einem Hochsalz-Puffer gemäß dem oben erwähnten Verfahren gelöst und durch Zugabe von Restriktionsendonuklease EcoR I und Sal I bzw. Restriktionsendonuklease BamH I und Sal I verdaut, wonach DNA- Fragmente mit ungefähr 4,0 Kbp bzw. ungefähr 6,2 Kbp mittels Agarosegel- Elektrophorese abgetrennt und gereinigt wurden. Andererseits wurden der obere (kodierende) und untere (nicht kodierende) Strang (jeweils 100 ng) eines Nukleotids mit einer transportierbaren Translations-Startstelle (welches einfach als SD-ATG-Linker bezeichnet wird und das ein Oligonukleotid ist, das 21 Basen umfaßt, die eine Translations- Startsignal-SD-Sequenz und ein Translations-Startkodon ATG umfassen, erhältlich von Pharmacia, Katalog-Nr. 27-4878-01 und 27-4898-01, Pharmacia Molecular Biologicals, Mai 1985) an ihren 5'-Termini phosphoryliert und hybridisiert, um ein doppelsträngiges DNA-Fragment (21 bp) zu erhalten.
Die drei oben erhaltenen DNA-Fragmente wurden mittels T4-DNA-Ligase gemäß dem oben erwähnten Verfahren ligiert, und die ligierte DNA wurde in kompetente Zellen eines E. coli K-12 HB101-Stammes eingeführt. Aus den dadurch erhaltenen Transformanten wurde ein Klon mit dem gewünschten Plasmidvektor (als pSK211 bezeichnet) mit ungefähr 10,2 Kbp, der den SD- ATG-Linker stromabwärts in Bezug auf den trp-Promotor und unmittelbar stromaufwärts in Bezug auf die Restriktionsendonukleasen-BamH I- Spaltungsstelle enthielt, selektiert. Dieser Plasmidvektor weist zwei SD- Sequenzen in Tandemanordnung stromabwärts in Bezug auf den trp-Promotor auf.
Das folgende Verfahren wurde für den Zweck der Beseitigung der Restriktionsendonukleasen-Sal I-Spaltungsstelle dieses Plasmidvektors und Einführen einer neuen Restriktionsendonukleasen-Hind III-Spaltungsstelle in dessen Nachbarschaft durchgeführt. Fünf µg Plasmidvektor pSK211 wurden mit Restriktionsendonuklease Sal I gemäß dem oben erwähnten Verfahren verdaut und dann mittels T4-DNA-Polymerase poliert. Das durch ein Ethanol- Fällungsverfahren gewonnene DNA-Fragment wurde mit Restriktionsendonuklease BamH I verdaut, wonach ein DNA-Fragment mit ungefähr 4,0 Kbp mittels Agarosegel-Elektrophorese abgetrennt und gereinigt wurde. Andererseits wurden 5 µg Plasmidvektor pGFK 503-1 (ungefähr 5,7 Kbp), der auf die gleiche Weise wie die oben erwähnte Klonierung von pSK211 unter Verwendung des Plasmidvektors pKK 223-3 mit dem tac-Promotor und SD-ATG-Linker usw. durch Rekombination kloniert worden war, mit Restriktionsendonuklease Hind III gemäß dem oben erwähnten Verfahren verdaut und dann mittels T4-DNA-Polymerase poliert. Das durch ein Ethanol-Fällungsverfahren gewonnene DNA-Fragment wurde mit Restriktionsendonuklease BamH I verdaut, und ein DNA-Fragment mit ungefähr 1,1 Kbp wurde mittels Agarosegel-Elektrophorese abgetrennt und gereinigt.
Die beiden oben gereinigten DNA-Fragmente wurden gemäß dem oben erwähnten Verfahren mittels T4-DNA-Ligase ligiert, und die ligierte DNA wurde in kompetente Zellen eines E. coli K-12 HB101-Stammes eingeführt. Von den dadurch erhaltenen Transformanten wurde ein Klon mit dem gewünschten Plasmidvektor (als pSK301 bezeichnet) mit ungefähr 5,1 Kbp, der den trp-Promotor enthielt und bei dem die Restriktionsendonukleasen- Sal I-Spaltungsstelle deletiert war und eine Hind III-Spaltungsstelle neu gebildet war, selektiert.
Fünf µg dieses Plasmidvektors pSK301 wurden in einem Niedrigsalz- Puffer gemäß dem oben erwähnten Verfahren gelöst, und die Verdauungsreaktion wurde zur Zugabe von 5 Einheiten Restriktionsendonuklease Bal I (Takara Shuzo) durchgeführt. Nach Beendigung der Reaktion wurde die NaCl-Konzentration auf 50 mM eingestellt, und die Verdauung mit Restriktionsendonuklease Hind III wurde durchgeführt, wonach ein DNA-Segment mit ungefähr 4,3 Kbp mittels Agarosegel-Elektrophorese abgetrennt und gereinigt wurde. Andererseits wurden 5 µg Plasmidvektor pKK 223-3 in einem Hochsalz-Puffer gemäß dem oben erwähnten Verfahren gelöst und mit Restriktionsendonuklease Hind III und Sca I verdaut, wonach ein DNA-Fragment von ungefähr 0,8 Kbp mittels Agarosegel-Elektrophorese abgetrennt und gereinigt wurde.
Die zwei oben gereinigten DNA-Fragmente wurden mittels T4-DNA-Ligase gemäß dem oben erwähnten Verfahren ligiert, und die ligierte DNA wurde in kompetente Zellen eines E. coli K-12 HB101-Stammes eingeführt. Von den dadurch erhaltenen Transformanten wurde ein Klon mit dem gewünschten Plasmidvektor pSK407 (ungefähr 5,1 Kbp) mit dem rrnBT&sub1;T&sub2;-Terminator stromabwärts in Bezug auf den trp-Promotor angeordnet selektiert.
Dann wurden zwei Oligonukleotide (U-4113 und L-4113) entworfen.
U-4113 (SEQ ID Nr.: 14 in der Sequenzliste, Anzahl der Basen: 32)
L-4113 (Anzahl der Basen: 32), der komplementär ist zu U-4113, aber keine Nukleotidsequenz aufweist, die komplementär zu der 1 - 4. 5'-GATC-3' von SEQ ID Nr.: 14 ist, und andererseits eine Nukleotidsequenz aufweist, in der 5'-TCGA-3' an die 5'-Stelle von G komplementär zum 32. C der SEQ ID Nr.: 14 addiert ist.
Die Oligonukleotide (jeweils 1 µg), die durch die chemische Synthese und Reinigung gemäß dem Verfahren von Beispiel 2 erhalten worden waren, wurden gemäß dem Verfahren von Beispiel 3 an ihren 5'-Enden mittels T4- Polynukleotidkinase phosphoryliert, gefolgt vom Hybridisieren, um ein doppelsträngiges DNA-Fragment zu erhalten (32 bp). Andererseits wurden 5 µg Plasmidvektor pSK407 (ungefähr 5,1 Kbp) mit dem trp-Promotor und rrnBT&sub1;T&sub2;-Terminator usw. in einem Hochsalz-Puffer gemäß dem Verfahren von Beispiel 3 gelöst und mit Restriktionsendonuklease BamH I und Hind III verdaut, wonach ein DNA-Fragment mit ungefähr 4,0 Kbp, das einen Replikationsursprung und eine Transkriptions-Steuerungsregion usw. enthielt, mittels Agarosegel-Elektrophorese abgetrennt und gereinigt wurde (Gelkonzentration: 1%). Andererseits wurden 5 µg Plasmid pUC119-F4104 (ungefähr 3,7 Kbp), erhalten in Beispiel 7 (1), mit Restriktionsendonuklease Xho I und Hind III auf die gleiche Weise wie in Beispiel 8 verdaut, wonach man ein DNA-Fragment mit ungefähr 460 bp, das das F4104-Gen mit dem N-terminalen Teil deletiert aufwies, abtrennte und reinigte (Figur 12).
Die drei gemäß dem obigen Verfahren erhaltenen DNA-Fragmente wurden mittels T4-DNA-Ligase gemäß dem Verfahren von Beispiel 3 ligiert, und die ligierte DNA wurde in kompetente Zellen eines E. coli K-12 HB101-Stammes eingeführt. Aus den dadurch erhaltenen Transformanten wurde ein Klon mit dem gewünschten F4113-Expressionsvektor (als pKF 4113 bezeichnet) mit ungefähr 4,5 Kbp selektiert, indem man das Verdauungsmuster mit Restriktionsendonuklease BamH I, Xho I und Hind III bestätigte und die Nukleotidsequenz um die N-terminale Additionsstelle des N-terminalen Mutantenpolypeptids herum überprüfte.
Der gemäß dem obigen Verfahren klonierte Expressionsvektor für eine N-terminale Mutante induziert die Expression eines neuen physiologisch aktiven Polypeptids mit dem folgenden Ersatz in E. coli-Zellen.
Vektor pKF 4113: kodiert für Polypeptid F4113 mit der Aminosäuresequenz wie in SEQ ID Nr.: 1 gezeigt, worin die 1 - 8. Aminosäuresequenz durch die in SEQ ID Nr.: 9 gezeigte Aminosäuresequenz ersetzt ist.

BEISPIEL 10

Klonieren der Expressionsvektoren für eine N-terminale Mutante von menschlichem TNF pKF 4601 und pKF 4602

(1) Die Primer 4291 und 4292 wurden entworfen. Diese Primer sind Oligonukleotide, die 21 Basen mit einer Nukleotidsequenz vom 193. C bis zum 213. T der SEQ ID Nr.: 10 aufweisen, worin das 202 - 204. 5'-CCA-3' durch 5'-GAT-3' im Fall von Primer 4291 und durch 5'-ATG-3' im Fall von Primer 4292 ersetzt ist.
Die chemische Synthese und Reinigung dieser Oligonukleotide wurde gemäß dem Verfahren von Beispiel 2 durchgeführt. Unter Verwendung dieses Primers 4291 oder 4292 wurde ein Plasmid (ungefähr 3,7 Kbp), das die gewünschte Mutanten-DNA enthielt, gemäß dem Verfahren von Beispiel 5 (1) und (2) erhalten. Es wurde durch das Didesoxy-Verfahren bestätigt, daß die DNA zu der Mutanten-DNA, wie entworfen, modifiziert war und dieses Plasmld wurde als pUC119-F4291 oder pUC119-F4292 bezeichnet. Das gewünschte Mutantengen von menschlichem TNF, das durch die Einführung der Mutation erhalten wurde, wurde in den Expressionsvektor pKK 101 mit dem tac- Promotor gemäß dem Klonierungsverfahren des Expressionsvektors von menschlichem TNF von Beispiel 4 eingeführt, um einen Expressionsvektor für eine Mutante von menschlichem TNF zu erhalten. Das menschliche TNF- Mutantengen (ungefähr 480 bp) wurde nach Verdauung des oben erhaltenen Plasmids pUC119-F4291 oder pUC119-F4292 mit Restriktionsendonuklease EcoR I und Hind III gemäß dem oben erwähnten Verfahren abgetrennt und gereinigt. Der gewünschte Expressionsvektor für eine Mutante von menschlichem TNF pKF 4291 oder pKF 4292 wurde erhalten, indem man als Wirt einen E. coli K-12 JM103-Stamm auf die gleiche Weise wie im Fall des menschlichen TNF-Expressionsvektors (pKF 4102) verwendete.
(2) Das Verfahren wird mit Bezug auf Figur 8 beschrieben. Fünf µg des Expressionsvektors einer N-terminalen Mutante von menschlichem TNF pKF 4168 (ungefähr 3,9 Kbp), erhalten in Beispiel 5, wurden in einem Mittelsalz-Puffer gemäß dem Verfahren von Beispiel 3 gelöst und mit Restriktionsendonuklease Sac I und Hind III verdaut, wonach ein DNA- Fragment mit ungefähr 3,5 Kbp, das einen Replikationsursprung und eine Transkriptions-Steuerungsregion enthielt, mittels Agarosegel- Elektrophorese abgetrennt und gereinigt wurde (Gelkonzentration: 1%). Andererseits wurden 5 µg des Expressionsvektors für eine Mutante von menschlichem TNF pKF 4291 oder pKF 4292 (ungefähr 3,9 Kbp), erhalten im obigen Schritt (1), mit Restriktionsendonuklease Sac I und Hind III auf die gleiche Weise wie oben verdaut, wonach ein DNA-Fragment mit ungefähr 360 bp, das das menschliche TNF-Mutantengen mit dem N-terminalen Teil desselben deletiert enthielt, abgetrennt und gereinigt wurde.
Die zwei durch die obigen Verfahren erhaltenen DNA-Fragmente wurden mittels T4-DNA-Ligase gemäß dem Verfahren von Beispiel 3 ligiert, und die ligierte DNA wurde in kompetente Zellen eines E. coli K-12 JM103-Stammes eingeführt. Aus den so erhaltenen Transformanten wurde ein Klon mit dem gewünschten F4601- oder F4602-Expressionsvektor pKF 4601 oder pKF 4602 (ungefähr 3,9 Kbp) selektiert, indem man das Verdauungsmuster mit Restriktionsendonuklease Sac I und Hind III bestätigte und die Nukleotidsequenz um die ersetzten Positionen herum, die von dem Mutantenpolypeptid stammten, überprüfte.
Der gemäß dem obigen Verfahren klonierte Expressionsvektor für eine N-terminale Mutante induziert die Expression eines neuen physiologisch aktiven Polypeptids mit dem folgenden Ersatz in E. coli-Zellen.
Vektor pKF 4601: kodiert für Polypeptid F4601 mit der Aminosäuresequenz wie in SEQ ID Nr.: 1 gezeigt, worin die 1 - 8.
Aminosäuresequenz durch die Aminosäuresequenz ersetzt ist, die in der SEQ ID Nr.: 2 gezeigt wird, und das 68. Pro durch Asp ersetzt ist.
Vektor pKF 4602: kodiert für Polypeptid F4602 mit der Aminosäuresequenz wie in SEQ ID Nr.: 1 gezeigt, worin die 1 - 3. Aminosäuresequenz durch die in SEQ ID Nr.: 2 gezeigte Aminosäuresequenz ersetzt ist und das 68. Pro durch Met ersetzt ist.
Wirts-E. coli-Zellen mit den obigen Expressionsvektoren erzeugen Polypeptide, die Antitumor-Wirkungen aufweisen. Dies wurde mittels eines Tests bestätigt, in dem eine Überstandfraktion, erhalten nach der Zentrifugationsabtrennung einer Suspension von beschallten E. coli-Zellen, gemäß dem Verfahren von Beispiel 14, das nachstehend gegeben wird, getestet wurde.

BEISPIEL 11

Klonieren der Expressionsvektoren für eine N-terminale Mutante von menschlichem TNF pKF 4607, pKF 4608, pKF 4626, pKF 4627, pKF 4634, pKF 4635, pKF 4609, pKF 4610, pKF 4628, pKF 4629, pKF 4638 und pKF 4639

(1) Die Primer 4268, 4150, 4222, 4267, 4123 und 4223 wurden entworfen. Primer 4268 ist ein Oligonukleotid, das 30 Basen umfaßt, mit einer Nukleotidsequenz vom 301. A bis zum 333. C der SEQ ID Nr.: 10, worin das 316 - 318. 5'-GGC-3' deletiert ist. Andererseits sind andere Primer Oligonukleotide mit 21 Basen mit einer Nukleotidsequenz vom 307. A bis zum 327. C von SEQ ID Nr.: 10, worin das 316 - 318. 5'-GGC-3' durch 5'-TGG-3' im Fall des Primers 4150, durch 5'-CCC-3' im Fall des Primers 4222, durch 5'-GCT-3' im Fall des Primers 4267, durch 5'-GAC-3' im Fall des Primers 4123 und durch 5'-CGC-3' im Fall des Primers 4223 ersetzt ist.
Die chemische Synthese und Reinigung dieser Oligonukleotide wurde gemäß dem Verfahren von Beispiel 2 durchgeführt. Unter Verwendung jeder dieser Primer wurde ein Plasmid (ungefähr 3,7 Kbp), das die gewünschte Mutanten-DNA enthielt, gemäß dem Verfahren von Beispiel 5 (1) und (2) erhalten. Es wurde durch das Didesoxy-Verfahren bestätigt, daß die DNA zu der Mutanten-DNA, wie entworfen, modifiziert war und dieses Plasmid wurde als pUC119-F4268, pUC119-F4150, pUC119-F4222, pUC119-F4267, pUC119-F4123 oder pUC119-F4223 bezeichnet. Das gewünschte menschliche TNF-Mutantengen, das durch die Einführung der Mutation erhalten wurde, wurde in den Expressionsvektor pKK 101 mit dem tac-Promotor gemäß dem Verfahren des Klonierens eines menschlichen TNF-Expressionsvektors von Beispiel 4 eingeführt, wodurch man einen Expressionsvektor einer Mutante von menschlichem TNF erhielt. Das menschliche TNF-Mutantengen (ungefähr 480 bp) wurde nach Verdauung des oben erhaltenen Plasmids (ungefähr 3,7 Kbp) mit Restriktionsendonuklease EcoR I und Hind III gemäß dem oben erwähnten Verfahren abgetrennt und gereinigt. Der gewünschte Expressionsvektor einer Mutante von menschlichem TNF pKF 4268, pKF 4150, pKF 4222, pKF 4267, pKF 4123 oder pKF 4223 (ungefähr 3,9 Kbp) wurde erhalten, indem man als Wirt einen E. coli K-12 JM103-Stamm auf die gleiche Weise wie im Fall des Expressionsvektors für menschlichen TNF (pKF 4102) verwendete.
(2) Gemäß dem Verfahren von Beispiel 10 (2) wurden 5 µg des Expressionsvektors einer N-terminalen Mutante von menschlichem TNF pKF 4168 (ungefähr 3,9 Kbp), erhalten in Beispiel 5, mit Restriktionsendonuklease Sac I und Hind III verdaut, wonach ein DNA- Fragment mit ungefähr 3,5 Kbp, das einen Replikationsursprung und eine Transkriptions-Steuerungsregion enthielt, abgetrennt und gereinigt wurde.
Anderereits wurden 5 µg des Expressionsvektors einer Mutante von menschlichem TNF pKF 4268, pKF 4150, pKF 4222, pKF 4267, pKF 4123 oder pKF 4223, erhalten im obigen Schritt (1), mit Restriktionsendonuklease Sac I und Hind III auf die gleiche Weise wie oben verdaut, wonach ein DNA- Fragment mit ungefähr 360 bp, das ein menschliches TNF-Mutantengen mit dem N-terminalen Teil deletiert enthielt, abgetrennt und gereinigt wurde.
Die zwei durch die obigen Verfahren erhaltenen DNA-Fragmente wurden mittels T4-DNA-Ligase gemäß dem Verfahren von Beispiel 3 ligiert, und die ligierte DNA wurde in kompetente Zellen eines E. coli K-12 JM103-Stammes eingeführt. Aus den so erhaltenen Transformanten wurde ein Klon mit dem gewünschten Expressionsvektor pKF 4607, pKF 4608, pKF 4626, pKF 4627, pKF 4634 oder pKF 4635 (ungefähr 3,9 Kbp) für F4607, F4608, F4626, F4627, F4634 oder F4635 selektiert, indem man das Verdauungsmuster mit Restriktionsendonuklease Sac I und Hind III bestätigte und die Nukleotidsequenz um die ersetzten Stellen herum, die von dem Mutantenpolypeptid stammten, überprüfte.
Der gemäß dem obigen Verfahren klonierte Expressionsvektor für die N-terminale Mutante induziert die Expression eines neuen physiologisch aktiven Polypeptids mit den folgenden Ersätzen in E. coli-Zellen.
Vektor pKF 4607: kodiert für Polypeptid F4607 mit der Aminosäuresequenz wie in SEQ ID Nr.: 1 gezeigt, worin die 1 - 8. Aminosäuresequenz durch die Aminosäuresequenz, die in SEQ ID Nr.: 2 gezeigt ist, ersetzt ist und das 106. Gly deletiert ist.
Vektor pKF 4608: kodiert für Polypeptid F4608 mit der Aminosäuresequenz wie in SEQ ID Nr.: 1 gezeigt, worin die 1 - 8. Aminosäuresequenz durch die Aminosäuresequenz, die in SEQ ID Nr.: 2 gezeigt ist, ersetzt ist und das 106. Gly durch Trp ersetzt ist.
Vektor pKF 4626: kodiert für Polypeptid F4626 mit der Aminosäuresequenz wie in SEQ ID Nr.: 1 gezeigt, worin die 1 - 8. Aminosäuresequenz durch die Aminosäuresequenz, die in SEQ ID Nr.: 2 gezeigt ist, ersetzt ist und das 106. Gly durch Pro ersetzt ist.
Vektor pKF 4627: kodiert für Polypeptid F4627 mit der Aminosäuresequenz wie in SEQ ID Nr.: 1 gezeigt, worin die 1 - 8. Aminosäuresequenz durch die Aminosäuresequenz, die in SEQ ID Nr.: 2 gezeigt ist, ersetzt ist und das 106. Gly durch Ala ersetzt ist.
Vektor pKF 4634: kodiert für Polypeptid F4634 mit der Aminosäuresequenz wie in SEQ ID Nr.: 1 gezeigt, worin die 1 - 8. Aminosäuresequenz durch die Aminosäuresequenz, die in SEQ ID Nr.: 2 gezeigt ist, ersetzt ist und das 106. Gly durch Asp ersetzt ist.
Vektor pKF 4635: kodiert für Polypeptid F4635 mit der Aminosäuresequenz wie in SEQ ID Nr.: 1 gezeigt, worin die 1 - 8. Aminosäuresequenz durch die Aminosäuresequenz, die in SEQ ID Nr.: 2 gezeigt ist, ersetzt ist und das 106. Gly durch Arg ersetzt ist.
Wirts-E. coli-Zellen mit den obigen Expressionsvektoren erzeugen Polypeptide, die Antitumor-Wirkungen zeigen. Dies wurde durch einen Test bestätigt, in dem eine Überstandfraktion, die nach der Zentrifugenabtrennung einer Suspension von beschauten E. coli-Zellen erhalten worden war, gemäß dem Verfahren von Beispiel 14, das nachstehend gegeben wird, getestet wurde.
(3) Fünf µg des Expressionsvektors für eine N-terminale Mutante von menschlichem TNF pKF 4418 (ungefähr 3,9 Kbp), erhalten in Beispiel 6, wurden in einem Mittelsalz-Puffer gemäß dem Verfahren von Beispiel 3 gelöst und mit Restriktionsendonuklease Sac I und Hind III verdaut, wonach ein DNA-Fragment mit ungefähr 3,5 Kbp, das einen Replikationsursprung und ein Transkriptions-Steuerungsregion enthielt, mittels Agarosegel- Elektrophorese (Gelkonzentration: 1%) abgetrennt und gereinigt wurde. Andererseits wurden 5 µg des Expressionsvektors für eine Mutante von menschlichem TNF pKF 4268, pKF 4150, pKF 4222, pKF 4267, pKF 4123 oder pKF 4223, erhalten in dem obigen Schritt (1), auf die gleiche Weise wie oben mit Restriktionsendonuklease Sac I und Hind III verdaut, wonach ein DNA- Fragment mit ungefähr 360 bp, das ein menschliches TNF-Mutantengen mit dem N-terminalen Teil deletiert enthielt, abgetrennt und gereinigt wurde.
Die zwei durch die obigen Verfahren erhaltenen DNA-Fragmente wurden gemäß dem Verfahren von Beispiel 3 mittels T4-DNA-Ligase ligiert, und die ligierte DNA wurde in kompetente Zellen eines E. coli K-12 JM103-Stammes eingeführt. Aus den so erhaltenen Transformanten wurde ein Klon mit dem gewünschten Expressionsvektor pKF 4609, pKF 4610, pKF 4628, pKF 4629, pKF 4638 oder pKF 4639 (ungefähr 3,9 Kbp) für F4609, F4610, F4628, F4629, F4638 oder F4639 selektiert, indem man das Verdauungsmuster mit Restriktionsendonuklease Sac I und Hind III bestätigte und die Nukleotidsequenz um die ersetzten Positionen herum, die von dem Mutantenpolypeptid stammten, überprüfte.
Der gemäß dem obigen Verfahren klonierte Expressionsvektor für eine N-terminale Mutante induziert die Expression eines neuen physiologisch aktiven Polypeptids mit den folgenden Ersätzen in E. coli-Zellen.
Vektor pKF 4609: kodiert für Polypeptid F4609 mit der Aminosäuresequenz wie in SEQ ID Nr.: 1 gezeigt, worin die 1 - 8. Aminosäuresequenz durch die Aminosäuresequenz, die in SEQ ID Nr.: 6 gezeigt ist, ersetzt ist und das 106 Gly deletiert ist.
Vektor pKF 4610: kodiert für Polypeptid F4610 mit der Aminosäuresequenz wie in SEQ ID Nr.: 1 gezeigt, worin die 1 - 8. Aminosäuresequenz durch die Aminosäuresequenz, die in SEQ ID Nr.: 6 gezeigt ist, ersetzt ist und das 106 Gly durch Trp ersetzt ist.
Vektor pKF 4628: kodiert für Polypeptid F4628 mit der Aminosäuresequenz wie in SEQ ID Nr.: 1 gezeigt, worin die 1 - Aminosäuresequenz durch die Aminosäuresequenz, die in SEQ ID Nr.: 6 gezeigt ist, ersetzt ist und das 106 Gly durch Pro ersetzt ist.
Vektor pKF 4629: kodiert für Polypeptid F4629 mit der Aminosäuresequenz wie in SEQ ID Nr.: 1 gezeigt, worin die 1 - 8. Aminosäuresequenz durch die Aminosäuresequenz&sub1; die in SEQ ID Nr.: 6 gezeigt ist, ersetzt ist und das 106 Gly durch Ala ersetzt ist.
Vektor pKF 4638: kodiert für Polypeptid F4638 mit der Aminosäuresequenz wie in SEQ ID Nr.: 1 gezeigt, worin die 1 - 8. Aminosäuresequenz durch die Aminosäuresequenz, die in SEQ ID Nr.: 6 gezeigt ist, ersetzt ist und das 106 Gly durch Asp ersetzt ist.
Vektor pKF 4639: kodiert für Polypeptid F4639 mit der Aminosäuresequenz wie in SEQ ID Nr.: 1 gezeigt, worin die 1 - 8. Aminosäuresequenz durch die Aminosäuresequenz, die in SEQ ID Nr.: 6 gezeigt ist, ersetzt ist und das 106 Gly durch Arg ersetzt ist.
Wirts-E. coli-Zellen mit den obigen Expressionsvektoren erzeugen Polypeptide, die Antitumor-Wirkungen zeigen. Dies wurde durch einen Test bestätigt, in dem eine Überstandfraktion, die nach der Zentrifugenabtrennung einer Suspension von beschallten E. coli-Zellen erhalten worden war, gemäß dem Verfahren von Beispiel 14, das nachstehend gegeben wird, getestet wurde.

BEISPIEL 12

Klonieren der Expressionsvektoren für eine N-terminale Mutante von menschlichem TNF pKF 4611, pKF 4612, pKF 4613, pKF 4614, pKF 4615, pKF 4642, pKF 4643, pKF 4644, pKF 4645 und pKF 4646

(1) Die Primer 4134, 4391, 4392, 4409 und 4410 wurden entworfen. Diese Prirner sind Oligonukleotide, die 21 Basen mit einer Nukleotidsequenz vom 76. T bis zum 96. T der SEQ ID Nr.: 10 umfassen, in der das 85 - 87. 5'-CGC-3' durch 5'-CAA-3' im Fall des Primers 4134, durch 5'-AAG-3' im Fall des Primers 4391, durch 5'-GAC-3' im Fall des Primers 4392, durch 5,- GTC-3' im Fall des Primers 4409 und durch 5'-CTC-3' im Fall des Primers 4410 ersetzt ist.
Die chemische Synthese und Reinigung dieser Oligonukleotide wurde gemäß dem Verfahren von Beispiel 2 durchgeführt.
(2) Eine gewünschte einzelsträngige Plasmid-DNA wurde hergestellt, indem man das in Beispiel 5 erhaltene pUC119-F4168 anstelle von pUC119- HTNF in Beispiel 5 (1) verwendete. Dann wurde unter Verwendung dieser Uracil-haltigen einzelsträngigen Plasmid-DNA von pUC119-F4168 und Primer 4134, 4391, 4392, 4409 oder 4410, gereinigt in dem obigen Schritt (1), die auf eine Position gerichtete Mutagenese gemäß dem Verfahren von Beispiel 5 (2) durchgeführt, um ein Plasmid (ungefähr 3,7 Kbp) zu erhalten, das DNA mit der gewünschten Mutation eingeführt enthielt. Es wurde durch das Didesoxy-Verfahren bestätigt, daß die Mutation wie entworfen eingeführt worden war, und dieses Plasmid wurde als pUC119-F4611, pUC119-F4612, pUC119-F4613, pUC119-F4614 oder pUC119-F4615 bezeichnet. Das gewünschte N-terminale Mutantengen von menschlichem TNF, das durch die Einführung der Mutation erhalten wurde, wurde in den Expressionsvektor pKK 101 mit tac- Promotor gemäß dem Verfahren des Klonierens eines menschlichen TNF- Expressionsvektors von Beispiel 4 insertiert, um einen Expressionsvektor einer N-terminalen Mutante von menschlichem TNF zu erhalten. Das N- terminale Mutantengen von menschlichem TNF (ungefähr 480 bp) wurde nach Verdauung des oben erhaltenen Plasmids pUC119-F4611, pUC119-F4612, pUC119- F4613, pUC119-F4614 oder pUC119-F4615 (ungefähr 3,7 Kbp) mit Restriktionsendonuklease EcoR I und Hind III gemäß dem oben erwähnten Verfahren abgetrennt und gereinigt. Der gewünschte Expressionsvektor einer N-terminalen Mutante von menschlichem TNF pKF 4611, pKF 4612, pKF 461, pKF 4614 oder pKF 4615 wurde erhalten, indem man als Wirt einen E. coli K-12 JM103-Stamm auf die gleiche Weise wie im Fall des menschlichen TNF- Expressionsvektors (pKF 4102) verwendete.
Der gemäß dem obigen Verfahren klonierte Expressionsvektor für die N-terminale Mutante induziert die Expression eines neuen physiologisch aktiven Polypeptids mit den folgenden Ersätzen in E. coli-Zellen.
Vektor pKF 4611: kodiert für Polypeptid F4611 mit der Aminosäuresequenz wie in SEQ ID Nr.: 1 gezeigt, worin die 1 - 8.
Aminosäuresequenz durch die Aminosäuresequenz, die in SEQ ID Nr.: 2 gezeigt ist, ersetzt ist und das 29. Arg durch Gln ersetzt ist.
Vektor pKF 4612: kodiert für Polypeptid F4612 mit der Aminosäuresequenz wie in SEQ ID Nr.: 1 gezeigt, worin die 1 - 8.
Aminosäuresequenz durch die Aminosäuresequenz, die in SEQ ID Nr.: 2 gezeigt ist, ersetzt ist und das 29. Arg durch Lys ersetzt ist.
Vektor pKF 4613: kodiert für Polypeptid F4613 mit der Aminosäuresequenz wie in SEQ ID Nr.: 1 gezeigt, worin die 1 - 8.
Aminosäuresequenz durch die Aminosäuresequenz, die in SEQ ID Nr.: 2 gezeigt ist, ersetzt ist und das 29. Arg durch Asp ersetzt ist.
Vektor pKF 4614: kodiert für Polypeptid F4614 mit der Aminosäuresequenz wie in SEQ ID Nr.: 1 gezeigt, worin die 1 - 8.
Aminosäuresequenz durch die Aminosäuresequenz, die in SEQ ID Nr.: 2 gezeigt ist, ersetzt ist und das 29. Arg durch Val ersetzt ist.
Vektor pKF 4615: kodiert für Polypeptid F4615 mit der Aminosäuresequenz wie in SEQ ID Nr.: 1 gezeigt, worin die 1 - 8.
Aminosäuresequenz durch die Aminosäuresequenz, die in SEQ ID Nr.: 2 gezeigt ist, ersetzt ist und das 29. Arg durch Leu ersetzt ist.
Wirts-E. coli-Zellen mit den obigen Expressionsvektoren erzeugen Polypeptide, die Antitumor-Wirkungen zeigen. Dies wurde durch einen Test bestätigt, in dem eine Überstandfraktion, die nach der Zentrifugenabtrennung einer Suspension von beschallten E. coli-Zellen erhalten worden war, gemäß dem Verfahren von Beispiel 14, das nachstehend gegeben wird, getestet wurde.
(3) Eine Uracil-haltige einzelsträngige Plasmid-DNA wurde unter Verwendung des in Beispiel 6 erhaltenen pUCILg-F4418 anstelle des pUC119- F4168 im obigen Schritt (2) hergestellt, und die auf eine Position gerichtete Mutagenese wurde auf die gleiche Weise wie im obigen Schritt (2) durchgeführt, um ein Plasmid zu erhalten, das DNA enthielt, die die gewünschte Mutation eingeführt aufwies, d.h. pUC119-F4642, pUC119-F4643, pUC119-F4644, pUC119-F4645 oder pUC119-F4646 (ungefähr 3,7 Kbp). Unter Verwendung des Plasmids, das das gewünschte N-terminale Mutantengen für menschliches TNF enthielt (ungefähr 480 bp), erhalten wie oben, wurde der gewünschte Expressionsvektor für eine N-terminale Mutante von menschlichem TNF pKF 4642, pKF 4643, pKF 4644, pKF 4645 oder pKF 4646 (ungefähr 3,9 Kbp) auf die gleiche Weise wie im obigen Schritt (2) kloniert. In diesem Verfahren wurde ein E. coli K-12 JM103-Stamm als Wirt verwendet.
Der gemäß dem obigen Verfahren klonierte Expressionsvektor für eine N-terminale Mutante induziert die Expression eines neuen physiologisch aktiven Polypeptids mit den folgenden Ersätzen in E. coli-Zellen.
Vektor pKF 4642: kodiert für Polypeptid F4642 mit der Aminosäuresequenz wie in SEQ ID Nr.: 1 gezeigt, worin die 1 - 8. Aminosäuresequenz durch die Aminosäuresequenz, die in der SEQ ID Nr.: 6 gezeigt ist, ersetzt ist und das 29. Arg durch Gln ersetzt ist.
Vektor pKF 4643: kodiert für Polypeptid F4643 mit der Aminosäuresequenz wie in SEQ ID Nr.: 1 gezeigt, worin die 1 - 8.
Aminosäuresequenz durch die Aminosäuresequenz, die in der SEQ ID Nr.: 6 gezeigt ist, ersetzt ist und das 29. Arg durch Lys ersetzt ist.
Vektor pKF 4644: kodiert für Polypeptid F4644 mit der Aminosäuresequenz wie in SEQ ID Nr.: 1 gezeigt, worin die 1 - 8.
Aminosäuresequenz durch die Aminosäuresequenz, die in der SEQ ID Nr.: 6 gezeigt ist, ersetzt ist und das 29. Arg durch Asp ersetzt ist.
Vektor pKF 4645: kodiert für Polypeptid F4645 mit der Aminosäuresequenz wie in SEQ ID Nr.: 1 gezeigt, worin die 1 - 8. Aminosäuresequenz durch die Aminosäuresequenz, die in der SEQ ID Nr.: 6 gezeigt ist, ersetzt ist und das 29. Arg durch Val ersetzt ist.
Vektor pKF 4646: kodiert für Polypeptid F4646 mit der Aminosäuresequenz wie in SEQ ID Nr.: 1 gezeigt, worin die 1 - 8. Aminosäuresequenz durch die Aminosäuresequenz, die in der SEQ ID Nr.: 6 gezeigt ist, ersetzt ist und das 29. Arg durch Leu ersetzt ist.
Wirts-E. coli-Zellen mit den obigen Expressionsvektoren erzeugen Polypeptide, die Antitumor-Wirkungen zeigen. Dies wurde durch einen Test bestätigt, in dem eine Überstandfraktion, die nach der Zentrifugenabtrennung einer Suspension von beschallten E. coli-Zellen erhalten worden war, gemäß dem Verfahren von Beispiel 14, das nachstehend gegeben wird, getestet wurde.

BEISPIEL 13

Expression von menschlichem TNF-Polypeptid und menschlichem TNF-N- terminalen Mutantenpolypeptid durch E. coli und Reinigung

E. coli K-12 JM103-Stämme mit dem menschlichen TNF-Expressionsvektor (pKF 4102), erhalten in Beispiel 4, und die Expressionsvektoren für eine N-terminale Mutante von menschlichem TNF (pKF 4168, pKF 4415, pKF 4416, pKF 4417, pKF 4418, pKF 4220, pKF 4421, pKF 4137, pKF 4601, pKF 4609 und pKF 4639), erhalten in den Beispielen 5, 6, 7, 8, 10 und 11, wurden jeweils in 20 ml eines M9-Kulturmediums (0,6% Na&sub2;HPO&sub4;, 0,3% KH&sub2;PO&sub4;, 0,05% NaCl, 0,1% NH&sub4;Cl, 2 mM MGSO&sub4;, 0,2% Glucose und 0,1 mM CaCl&sub2;) inokuliert, das 25 bis 50 µg/ml Ampicillin und 0,001% Vitamin B1 enthielt, und unter Schütteln 18 Stunden bei 37ºC kultiviert. Zwanzig ml jeder Kulturlösung wurden zu 1 l des obigen Kulturmediums gegeben, gefolgt vom Kultivieren unter Schütteln bei 37ºC über 2 bis 3 Stunden. Dann wurde Isopropyl-β-r) thiogalactopyranosid (IPTG) dazugegeben, so daß die Endkonzentration 1 mM betrug, und das Kultivieren wurde weitere 18 Stunden bei 37ºC unter Schütteln fortgesetzt.
Ein im Beispiel 9 erhaltener E. coli K-12 HB101-Stamm mit dem Expressionsvektor einer N-terminalen Mutante von menschlichem TNF (pKF 4113) wurde in 20 ml MgCA-Kulturmedium (0,6% Na&sub2;HPO&sub4;, 0,3% KH&sub2;PO&sub4;, 0,05% NaCl, 0,1% NH&sub4;Cl, 2 mM MGSO&sub4;, 0,2% Glucose, 0,1 mM CaCl&sub2; und 0,2% Casaminosäure) angeimpft, das 25 bis 50 µg/ml Ampicillin, 0,001% Vitamin B1 und 5 µg/ml Tryptophan enthielt, und 18 Stunden bei 37ºC kultiviert.
Zwanzig ml dieser kultivierten Lösung wurden zu 1 l des obigen Kulturmediums gegeben, das keine 5 µg/ml Tryptophan enthielt, und das Kultivieren wurde 18 Stunden unter Schütteln bei 37ºC durchgeführt.
Die E. coli-Zellen wurden durch Zentrifugenabtrennung gewonnen, dann wurden die Zellen mittels eines TP-Puffers (10 mM Tris-HCl, pH 8,0, und 100 µM PMSF) gewaschen. Nach dem Waschen wurden die Zellen in dem TP- Puffer in einer Menge von 10 Volumina (ml) pro Naßgewicht (g) der Zellen suspendiert, und die Suspension wurde mittels eines Schallgerätes (Ultrasonic Processor, Modell W-225 (Heat Systems, Ultrasonics, Inc.)) beschallt. Die erhaltene Suspension wurde einer Zentrifugenabtrennung unterzogen, und die Zelltrümmer wurden entfernt und die Überstandfraktion wurde gewonnen. Das Reinigungsverfahren nach dieser Beschallungsbehandlung wurde hauptsächlich bei niedriger Temperatur (0 bis 4ºC) durchgeführt.
Der Überstand wurde mit einem 0,45 µm-Filter filtriert und dann durch Anionenaustauschchromatographie (Säulengröße: φ 2,5 x 1,5 cm, Durchsatz: 0,5 ml/Min.) unter Verwendung von Sepabeads FP-DA13 (Mitsubishi Chemical Industries, Ltd.) fraktioniert, wonach eine aktive Fraktion durch Identifikation mittels SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese, die nachstehend beschrieben wird, und durch Bestimmen der Anwesenheit oder Abwesenheit der Aktivität gemäß dem Verfahren von Beispiel 14 unter Verwendung von L929-Zellen gewonnen wurde. Zur Elution wurde TP-Puffer, der NaCl enthielt, verwendet, und die NaCl-Konzentration wurde schrittweise von 0,05M bis 0,1M, 0,2M und 0,5M angehoben. Die N-terminale Mutante F4639 von menschlichem TNF wurde mit 0,05M NaCl eluiert. Das menschliche TNF (1) wurde mit 0,1M NaCl eluiert, das menschliche TNF (2) und die N-terminalen Mutanten von menschlichem TNF F4415, F4417, F4418, F4420, F4601 und F4609 wurden mit 0,2M NaCl eluiert und die N-terminale Mutante von menschlichem TNF F4168 wurde mit 0,5M NaCl eluiert. Um Endotoxin usw., das von E. coli-Zellen abstammte, zu entfernen, wurde weiter eine Behandlung mit Nukleinsäureendotoxin-Entfernungsmittei C-9 (hergestellt von Kurita Water Industry, Ltd. und vertrieben von Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.) gemäß dem beigefügten Handbuch durchgeführt. So wurden teilweise gereinigte Proben der menschlichen TNF-Polypeptide und der N-terminalen Mutantenpolypeptide von menschlichem TNF erhalten.
Unter Verwendung dieser Proben wurden die Bewertung der Antitumor- Wirkungen und die Bewertung der Auswirkungen auf experimentelle Lungenmetastasen in den Beispielen 14, 15 und 16 durchgeführt. Bezüglich der N-terminalen Mutantenpolypeptide F4416, F4421 und F4137 wurde keine aktive Fraktion erhalten, wahrscheinlich weil sie in dem verwendeten Wirtsstamm E. coli K-12 JM103 instabil waren, und gleichermaßen wurde mit Bezug auf F4113 keine aktive Fraktion erhalten, wahrscheinlich weil es in dem verwendeten Wirtsstamm E. coli K-12 HB101 instabil ist. Jedoch kann es möglich sein, die aktiven Fraktionen unter Verwendung anderer Wirtszellen zu erhalten.
Die obigen Proben wurden mit einem 0,20 µm-Filter filtriert und dann einer Anionenaustauschchromatographie unter Verwendung von Mono Q (eingetragenes Warenzeichen) (HR 10/10 und HR 5/5) vorgepackter Säule (hergestellt von Pharmacia LKB Biotechnology) unter der Steuerung durch ein FPLC-System unterzogen und mit TPQ-Puffer (20 mM Tris-HCl, pH 8,0, und 10 µM PMSF) eluiert, der NaCl enthielt, wonach eine aktive Fraktion durch Identifikation mittels SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese, die nachstehend beschrieben wird, und indem man die Anwesenheit oder Abwesenheit der Aktivität gemäß dem Verfahren von Beispiel 14 unter Verwendung von L929-Zellen bestimmte, gewonnen wurde. Das Elutionsverfahren wurde gemäß dem folgenden Programm unter der Steuerung durch ein FPLC-System durchgeführt. Der dritte Schritt wurde einige Male wiederholt, bis eine einzige Bande mittels SDS-Polyacrylamidgel- Elektrophorese erhalten wurde, um die Reinheit zu steigern.
Erster Schritt: Mono Q (eingetragene Marke) (HR 10/10)-Säule wurde verwendet (Durchsatz: 4 ml/Min.)
0 - 5 Minuten: 0-0,2M NaCl linearer Gradient in der Konzentration
5 - 16 Minuten: 0,2M NaCl
16 - 20 Minuten: 0,2 - 0,5M NaCl linearer Gradient in der Konzentration
20 - 24 Minuten: 0,5M NaCl
Die Fraktionierungsergebnisse (NaCl-Konzentration und Retentionszeit) der aktiven Fraktionen gemäß dem obigen Verfahren waren wie folgt: 0,2M, 6,6 Minuten im Fall von menschlichem TNF (1); 0,2M, 5,6 Minuten im Fall von menschlichem TNF (2); 0,2M, 6,4 Minuten im Fall der N-terminalen Mutante von menschlichem TNF F4168; 0,2M, 7,8 Minuten im Fall der N-terminalen Mutante von menschlichem TNF F4415; 0,2M, 5,4 Minuten im Fall der N-terminalen Mutante von menschlichem TNF F4417; 0,2M, 5,4 Minuten im Fall der N-terminalen Mutante von menschlichem TNF F4418; 0,18M, 4,1 Minuten im Fall der N-terminalen Mutante von menschlichem TNF F4420; 0,2M, 7,0 Minuten im Fall der N-terminalen Mutante von menschlichem TNF F4601; 0,2M, 5,0 Minuten im Fall der N-terminalen Mutante von menschlichem TNF F4609; und 0,14M, 3,1 Minuten im Fall der N-terminälen Mutante von menschlichem TNF F4639.
Zweiter Schritt: Mono Q (eingetragene Marke) (HR 5/5)-Säule wurde verwendet (Durchsatz: 1 ml/Min.)
0 - 2,5 Minuten: 0 - 0,2M NaCl linearer Gradient in der Konzentration
2,5 - 8 Minuten: 0,2M NaCl
8 - 10 Minuten: 0,2 - 0,5M NaCl linearer Gradient in der Konzentration
10 - 12 Minuten: 0,5M NaCl
Die Fraktionierungsergebnisse (NaCl-Konzentration und Retentionszeit) der aktiven Fraktionen gemäß dem obigen Verfahren waren wie folgt: 0,2M, 3,7 Minuten im Fall von menschlichem TNF (1); 0,2M, 4,1 Minuten im Fall von menschlichem TNF (2); 0,2M, 3,9 Minuten im Fall der N-terminalen Mutante von menschlichem TNF F4168; 0,2M, 6,0 Minuten im Fall der N-terminalen Mutante von menschlichem TNF F4415; 0,2M, 3,9 Minuten im Fall der N-terminalen Mutante von menschlichem TNF F4417; 0,2M, 3,3 Minuten im Fall der N-terminalen Mutante von menschlichem TNF F4418; 0,2M, 3,2 Minuten im Fall der N-terminalen Mutante von menschlichem TNF F4420; 0,2M, 4,9 Minuten im Fall der N-terminalen Mutante von menschlichem TNF F4601; 0,2M, 3,2 Minuten im Fall der N-terminalen Mutante von menschlichem TNF F4609; und Durchfluß im Fall der N-terminalen Mutante von menschlichem TNF F4639.
Dritter Schritt: Mono Q (eingetragene Marke) (HR 5/5)-Säule wurde verwendet (Durchsatz: 1 ml/Min.)
0 - 6 Minuten: 0 - 0,15M NaCl linearer Gradient in der Konzentration
6 - 11 Minuten: 0,15 - 0,2M NaCl linearer Gradient in der Konzentration
11 - 13 Minuten: 0,2 - 0,5M NaCl linearer Gradient in der Konzentration
13 - 15 Minuten: 0,5M NaCl
Die Fraktionierungsergebnisse (NaCl-Konzentration und Retentionszeit) der aktiven Fraktionen gemäß dem obigen Verfahren waren wie folgt: 0,16M, 6,5 Minuten im Fall von menschlichem TNF (1); 0,16M, 6,5 Minuten im Fall von menschlichem TNF (2); 0,17M, 6,7 Minuten im Fall der N-terminalen Mutante von menschlichem TNF F4168; 0,16M, 6,4 Minuten im Fall der N-terminalen Mutante von menschlichem TNF F4415; 0,16M, 6,5 Minuten im Fall der N-terminalen Mutante von menschlichem TNF F4417; 0,16M, 6,2 Minuten im Fall der N-terminalen Mutante von menschlichem TNF F4418; 0,15M, 5,6 Minuten im Fall der N-terminalen Mutante von menschlichem TNF F4420; 0,19M, 9,8 Minuten im Fall der N-terminalen Mutante von menschlichem TNF F4601; 0,15M, 5,7 Minuten im Fall der N- terminalen Mutante von menschlichem TNF F4609; und Durchfluß im Fall der N-terminalen Mutante von menschlichem TNF F4639.
Auf diese Weise wurden gereinigte Proben von menschlichen TNF- Polypeptiden und N-terminalen Mutantenpolypeptiden von menschlichem TNF erhalten. Unter Verwendung dieser Proben wurde die Bewertung der Antitumor-Aktivitäten in dem folgenden Beispiel 14 durchgeführt.
Während der obigen Reinigung und mit Bezug auf die gereinigten Proben wurde eine SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese durchgeführt, um die Expression und Reinigung der menschlichen TNF-Folypeptide und der N- terminalen Mutantenpolypeptide von menschlichem TNF zu bestätigen. Jede Probe wurde zu einem Laemmli-Probenpuffer (62,5 mM Tris-HCl, pH 6,8, 2% SDS, 0,01% BPB und 10% Glycerin) gegeben, der 10 mM DTT enthielt, und die Elektrophorese wurde gemäß dem Verfahren von Laemmli (Nature, 227, 680 (1970)) unter Verwendung eines 15%-igen Auftrennungsgels durchgeführt. Nach Beendigung der Elektrophorese wurde das Protein im Auftrennungsgel durch Anfärben desselben mit Coomassie-Brilliantblau bestätigt. Einige der Ergebnisse sind in den Figuren 13 und 14 gezeigt. Die Expressionsmengen durch die jeweiligen Expressionsvektoren für die menschlichen TNF- Polypeptide und die N-terminalen Mutantenpolypeptide von menschlichem TNF, für die aktive Fraktionen gewonnen wurden, waren im wesentlichen gleich, und als die Expressionswirksamkeit berechnet wurde, indem man die erhaltenen gefärbten Gele einem Chromatoscanner (Modell CS-920, hergestellt von Shimadzu Corporation) unterzog, wurde gefunden, daß sie ungefähr 20% der gesamten Zellproteine von E. coli betrug. Weiter zeigte jede der endgültig gereinigten Proben eine einzige Bande in dem erhaltenen gefärbten Gel. Aus den Wanderungspositionen wurden die Molekulargewichte der menschlichen TNF-Polypeptide und der N-terrninalen Mutantenpolypeptide von menschlichem TNF berechnet und sind in Tabelle 1 aufgeführt. Als eine der physikalischen Eigenschaften von Proteinen wurden die isoelektrischen Punkte der menschlichen TNF-Polypeptide und der N-terminalen Mutantenpolypeptide von menschlichem TNF durch ein isoelektrisches Fokusierungsverfahren unter Verwendung von Ampholine (hergestellt von LKB) gemessen, und die dadurch erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle 1 aufgeführt. Tabelle 1 Tabelle 1 (1) Isoelektrische Punkte und Molekulargewichte von menschlichem TNF-Polypeptid und N-terminalem Mutantenpolypeptid von menschlichem TNF Tabelle 1 (2) Isoelektrische Punkte und Molekulargewichte von menschlichem TNF-Polypeptid und N-terminalen Mutantenpolypeptiden von menschlichem TNF

BEISPIEL 14

Bewertung der Antitumor-Aktivitäten in vitro

Mit Bezug auf die teilweise gereinigten Proben und endgültig gereinigten Proben der menschlichen TNF-Polypeptide und der N-terminalen Mutantenpolypeptide von menschlichem TNF, die in Beispiel 13 erhalten worden waren, wurden zell-Lyseaktivitäten gegen Fibroplastenzellen (L929 (ATCC CCL1), die von Maus-Bindegewebe abstammten) gemäß dem Verfahren von Aggarwal et al. (J. Biol. Chem., 260, 2345 (1985)) bestimmt. Das heißt, L929-Zellen wurden auf eine Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen für Gewebekultur (hergestellt von Corning) in einer Menge von 3 x 10&sup4; Zellen/0,1 ml/Vertiefung gesät und über Nacht bei 37ºC in Anwesenheit von 5% Kohlendioxidgas kultiviert. Als Kulturmedium wurde Dulbeccos modifiziertes Eagle-Minimum Essential Medium (DME-Medium, hergestellt von Sigma) verwendet, das 10% Kälberfötenserum enthielt. Am nächsten Tag wurde das Medium in das obige Kulturmedium, mit Actinomycin D auf eine Konzentration von 1 µg/ml versetzt, geändert. Jede Probe, die schrittweise durch dieses Kulturmedium verdünnt wurde, wurde in die entsprechenden Vertiefungen eingebracht (Gesamtmenge des Mediums: 0,1 ml). Nach Kultivieren über weitere 20 Stunden wurden lebende Zellen, die an der Platte anhafteten, mit 0,5%-iger Kristallviolett-Lösung (0,5% Kristallviolett/20% Methanol) angefärbt (bei Raumtemperatur über 15 Minuten). Die Platten mit gefärbten Zellen wurden sorgfältig mit einem Phosphatpuffer PBS (10 mM Na K Phosphate, pH 7,4, 0,8% NaCl und 0,02% KCl) gewaschen, der 1 mM CaCl&sub2; und 1 mM MgCl&sub2; enthielt, und dann wurde auf der Platte verbliebenes Kristallviolett mit 0,1 ml einer 0,01N HCl-Lösung extrahiert, die 30% Ethanol enthielt, und dann wurde die Absorbanz (492 nm) mit einem EIA-Ablesegerät (Modell 2550, hergestellt von Bio-Rad) gemessen. Diese Absorbanz entspricht der Anzahl der lebenden Zellen. Deshalb wurde das End-Verdünnungsverhältnis einer Probe in einer Vertiefung erhalten, die die Absorbanz zeigte, die einem 50%-Wert der Absorbanz der nicht mit Probe behandelten Vertiefung entsprach, und die reziproke Zahl dieses Verdünnungsverhältnisses der Probe wird als Zahl der Einheiten pro 1 ml der Probe (Einheiten/ml) definiert.
Um die spezifischen Aktivitäten (Einheiten/ml.Protein) der entsprechenden Proben aus den Zell-Lyseaktivitäten (Einheiten/ml) gegen L929, die gemäß dem obigen Verfahren erhalten wurden, zu messen, wurde die quantitative Analyse der Proteine der entsprechenden Proben durchgeführt. Die quantitative Analyse wurde gemäß einem Bradford-Verfahren (Anal. Biochem., 72, 248 (1976)) durchgeführt, wobei die Proteinkonzentration (mg/ml) unter Verwendung von Rinderserumalbumin (BSA) als Standardprobe erhalten wurde. Aus diesen Ergebnissen wurden die spezifischen Aktivitäten mit Bezug auf die menschlichen TNF-Polypeptidproben und die Proben von N- terminalem Mutantenpolypeptid von menschlichem TNF berechnet und sind in Tabelle 2 aufgeführt. Tabelle 2 Tabelle 2 (1) Zell-Lyseaktivitäten gegen L929 von menschlichem TNF- Polypeptid und N-terminalem Mutantenpolypeptid von menschlichem TNF Tabelle 2 (2) Zell-Lyseaktivitäten gegen L929 von menschlichem TNF- Polypeptid und N-terminalen Mutantenpolypeptiden von menschlichem TNF
Aus der vorstehenden Tabelle 2 ist ersichtlich, daß die N-terminalen Mutantenpolypeptide von menschlichem TNF der vorliegenden Erfindung Zell- Lysewirkungen gegen Fibroplastzellen L929, welche von Maus-Bindegewebe abstammen, ähnlich derjenigen von menschlichem TNF aufweisen.

BEISPIEL 15

Bewertung von Antitumor-Aktivitäten in vivo

Mit Bezug auf die teilweise gereinigten Proben der menschlichen TNF- Polypeptide und der N-terminalen Mutantenpolypeptide von menschlichem TNF, die in Beispiel 13 erhalten worden waren, wurden die Antitumor-Aktivitäten gegen Meth-A-Fibrosarcom bestimmt. Der Test wurde auf solche Weise durchgeführt, daß 1 x 10&sup6; Zellen/0,2 ml Meth-A-Fibrosarcomzellen (erhalten von Sasaki Institutes, Sasaki Foundation) in einer Kochsalzlösung suspendiert subkutan auf den Seitenteil des Rückens einer BALB/C-Maus (männlich, fünf Wochen alt, Charles River) transplantiert wurden und acht Tage später, nachdem man bestätigt hatte, daß der Tumordurchmesser eine Größe von 6 bis 10 mm erreicht hatte, eine Probe (0,2 ml/Maus), die schrittweise mit einer Kochsalzlösung verdünnt worden war, intravenös in die Schwanzvene verabreicht wurde. Die lethale Dosis wurde als maximale Dosis genommen, und die Proben von verschiedenen Dosen wurden durch schrittweise Verdünnung hergestellt.
Über ungefähr zwei Wochen nach Verabreichung wurde die Beobachtung von Tumorwachstum usw. fortgesetzt. Mit Bezug auf das Tumorwachstum wurde das Tumorvolumen
ab²/2:
a = langer Durchmesser des Tumors
b = kurzer Durchmesser des Tumors gemessen, und das Tumorvolumenverhältnis des Tumorvolumens nach Verabreichung zum Tumorvolumen am Tag der Verabreichung der Probe (Tag 0) wurde erhalten, wodurch die Zahl der Tage vom Tag 0 bis zu dem Tag, an dem das Tumorverhältnis 2 oder 5 wurde (D2 oder D5), berechnet wurde. Dann wurde das Verhältnis der Kontrollgruppe (der eine Kochsalzlösung verabreicht wurde) berechnet, und der D2%-Kontrollwert und der D5% Kontrollwert wurden erhalten. Je größer die Werte, desto geringer ist die Tumorwachstumsfähigkeit, d.h. desto höher sind die Antitumor-Aktivitäten.
Die auf die obige Weise erhaltenen Ergebnisse sind in den Tabellen 3 und 4 aufgeführt. Tabelle 3 Antitumor-Aktivitäten des menschlichen TNF-Polypeptids und des N-terminalen Mutantenpolypeptids von menschlichem TNF gegen Meth-A-Fibrosarcom Tabelle 4 Antitumor-Aktivitäten des menschlichen TNF-Polypeptids und des N-terminalen Mutantenpolypeptids von menschlichem TNF gegen Meth-A-Fibrosarcom
Aus den Tabellen 3 und 4 ist ersichtlich, daß die N-terminalen Mutantenpolypeptide von menschlichem TNF der vorliegenden Erfindung Antitumor-Aktivitäten gegen auf Maus transplantiertes Meth-A-Fibrosarcom ähnlich derjenigen des menschlichen TNF aufweisen.

BEISPIEL 16

Wirkungen gegen Lungenmetastase von Tumor

Indem man B16F10-Maus-Melanomzellen (erhalten von der School of Medicine, Chiba University) mit dem folgenden Verfahren klonierte, wurde ein Klon erzeugt, der einen hohen Grad an Metastasis in der Lunge zeigte. Das heißt, 2 x 10&sup4; Zellen/0,2 ml BL6F10-Zellen, die in Eagle-Minimum Essential Medium (MEM-Medium, hergestellt von Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.) suspendiert waren, wurden in die Schwanzvene einer C57BL/6 NCrj-Maus (weiblich, sechs Wochen alt, Charles River) injiziert, und 14 Tage später wurde die Lunge herausgenommen. Nachdem die Lunge mit einem DME- Kulturmedium gewaschen worden war, wurde einer der Metastasenknoten mit einem Durchmesser von ungefähr 1 mm, der auf der Oberfläche der Lunge gebildet worden war, mit einer Spritze, an der eine 26 G-Injektionsnadel befestigt war (hergestellt von Termo) aufgesaugt und in 1 ml des DME- Mediums suspendiert und auf einem DME-Medium-haltigen weichen Agar, der 10% Kälberfötenserum enthielt, in Anwesenheit von 5% Kohlendioxidgas bei 37ºC kultiviert, um eine Kolonie zu bilden. Dieses Koloniebildungsverfahren wurde gemäß dem Verfahren, das in "Tissue Culturing Techniques" (S. 35 - 36, 1984, zusammengestellt von der Japan Tissue Culture Association, Asakura Shoten) offenbart ist, durchgeführt. Zehn oder zwölf Tage später, als der Koloniedurchrnesser eine Größe von 1 bis 2 mm erreicht hatte, wurde die Kolonie durch eine Pasteur-Pipette aufgesaugt und in einem DME-Medium kultiviert, das 10% Kälberfötenserum enthielt. Nach dem Kultivieren wurden die proliferierten Zellen auf eine Zellkonzentration von 2 x 10&sup4; Zellen/0,2 ml wieder unter Verwendung des MEM-Mediums eingestellt und in die Schwanzvene einer C57BL/6 NCrj-Maus auf die gleiche Weise wie oben injiziert. Vierzehn Tage später wurde die Lunge herausgenommen, und einer der Metastasenknoten wurde isoliert und auf die gleiche Weise wie oben kultiviert. Dieses Vorgehen wurde fünfmal wiederholt, um einen Klon (als B16F10/L5 bezeichnet) zu erhalten, der ein hohes Maß an Lungenmetastasis zur Folge hatte.
Die B16F10/L5-Zellen in logarithmischer Phase, welche in dem 10% Kälberfötenserum enthaltenden DME-Medium mittels einer Schale für Gewebekultur mit einem Durchmesser von 10 cm (Coning (eingetragene Marke), hergestellt von Iwaki Glass Co., Ltd.) kultiviert wurden, wurden einmal mit einem Phosphatpuffer PBS in einem an die Schale anhaftenden Zustand gewaschen, und 5 ml MEM-Medium wurden zugesetzt, gefolgt von Pipettieren, um eine Zellsuspension zu erhalten. Die Zellen wurden durch Zentrifugenabtrennung gesammelt und wieder in 2 ml des MEM-Mediums suspendiert. Andererseits wurden die teilweise gereinigten Proben der menschlichen TNF-Polypeptide und der N-terminalen Mutantenpolypeptide von menschlichem TNF, welche in Beispiel 13 erhalten worden waren, mit dem MEM-Medium auf vorgeschriebene Konzentrationen verdünnt (die Dosen, bei denen die Antitumor-Wirkungen in dem Antitumor-Test in Beispiel 15 beobachtet wurden, wurden als Dosen für diesen Test verwendet).
Zu dieser Lösung wurde die zuvor hergestellte B16F10/L5- Zellsuspension gegeben, um eine Zellsuspension herzustellen, die 2 x 10&sup4; Zellen/0,2 ml jeder teilweise gereinigten Probenlösung enthielt. Diese Zellsuspension (0,2 ml/Maus) wurde in die Schwanzvene einer C57BL/6 NCrj- Maus (weiblich, sechs Wochen alt) injiziert. Der Kontrolle wurden lediglich B16F10/LS-Zellen injiziert. Vierzehn Tage nach der Injektion wurde die Lunge herausgenommen, und die Anzahl der Metastasenknoten auf der Lungenoberfläche wurde gezählt.
Die auf die obige Weise erhaltenen Ergebnisse sind in den Tabellen 5 und 6 aufgeführt. Tabelle 5 Wirkungen von N-terminalem Mutantenpolypeptid von menschlichem TNF gegen Lungenmetastasis von B16F10/L5-Melanom Tabelle 6 Wirkungen von N-terminalem Mutantenpolypeptid von menschlichem TNF gegen Lungenmetastasis von B16F10/L5-Melanom
(Fußnote 1): *F4291 ist ein Mutantenpolypeptid, bei dem das 68. Pro von menschlichem TNF durch Asp ersetzt ist.
(Fußnote 2): Die in diesem Test verwendete Dosis war die Dosis, die die Antitumor-Wirkungen in dem Antitumor-Test in Beispiel 15 ergab.
(Fußnote 3): X Signifikanter Unterschied beobachtet bei p < 0,01 im Vergleich mit der Kontrollgruppe.
Aus den Tabellen 5 und 6 ist ersichtlich, daß, während das menschliche TNF-Polypeptid und das menschliche TNF-Mutantenpolypeptid Wirkungen aufweisen, die die experimentelle Lungenmetastasis fördern, das N-terminale Mutantenpolypeptid von menschlichem TNF der vorliegenden Erfindung, bei dem eine Arg-Gly-Asp-Sequenz in der Nähe des N-Terminus eingeführt ist, die experimentelle Lungenmetastasis nicht fördert.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird eine neue N-terminale Mutante von menschlichem TNF bereitgestellt, die im wesentlichen die gleichen Antitumor-Wirkungen wie der menschliche TNF oder eine Mutante davon aufweist und welche andererseits keine Aktivität aufweist, Tumormetastasis zu fördern, welche bei menschlichem TNF oder dessen Mutante beobachtet wird, indem man beim menschlichen TNF oder dessen Mutante die Aminosäuresequenz vom 1. Ser bis zum 8. Asp der SEQ ID Nr.: 1 in der Sequenzliste oder die entsprechende Aminosäuresequenz der menschlichen TNF-Mutante durch eine Aminosäuresequenz, die mindestens eine Aminosäuresequenz Arg-Gly-Asp enthält und 3 bis 16 Aminosäuren aufweist, ersetzt.
Offensichtlich sind zahlreiche Abwandlungen und Variationen der vorliegenden Erfindung im Licht der obigen Lehren möglich. Man muß sich deshalb darüber im klaren sein, daß innerhalb des Bereiches der angefügten Ansprüche die Erfindung anders als speziell hierin beschrieben durchgeführt werden kann.

Claims

1. Polypeptid, das die Antitumor-Aktivität von TNF aufweist und das die Aminosäuresequenz aufweist, die durch die Sequenz vom 9. Lys bis zum 155. Leu in der SEQ ID-NR: 1 dargestellt wird, und zusätzlich an seinem N-terminalen Ende eine Sequenz von 3 bis 16 Aminosäuren aufweist, wobei die N-terminale Sequenz mindestens eine Aminosäuresequenz Arg-Gly-Asp einschließt.

2. Mutante des Proteins von Anspruch 1, die die Antitumor Aktivität von TNF und eine Länge von 135 bis 178 Aminosäureresten aufweist und die in der Region, die der Sequenz vom 9. Lys bis zum 155. Leu in der SEQ ID-NR: 1 entspricht, bis zu 15 Additionen, Deletionen, Substitutionen oder [deren] Kombinationen von Aminosäureresten aufweist.

3. Polypeptid nach Anspruch 1 oder 2, in dem die N-terminale Sequenz wie in der SEQ ID-NR: 2,3,4,5,6,7,8 oder 9 in der Sequenzuste gezeigt oder Arg-Gly-Asp ist.

4. Polypeptid nach Anspruch 1 oder 2, in dem die N-terminale Sequenz wie in der SEQ ID-NR: 2,3,5 oder 6 in der Sequenzliste gezeigt oder Arg-Gly-Asp ist.

5. Polypeptid nach Anspruch 2, 3 oder 4, in dem in der Region, die der Sequenz vom 9. Lys bis zum 155. Leu, wie in der SEQ ID-NR: 1 gezeigt, entspricht, das 29. Arg, das 68. Pro oder das 106. Gly deletiert oder durch einen anderen Aminosäurerest ersetzt ist.

6. Polypeptid nach Anspruch 5, in dem das 29. Arg deletiert oder durch Gin, Lys, Asp, Val oder Leu ersetzt ist; das 68. Pro deletiert oder durch Asp oder Met ersetzt ist; oder das 106. Gly deletiert oder durch Trp, Pro, Ala, Asp oder Arg ersetzt ist.

7. Rekombinantes Plasmid, das eine DNA-Sequenz enthält, die für das Polypeptid nach Anspruch 1 oder 2 kodiert.

8. Rekombinante Mikrobenzelle, die durch ein rekombinantes Plasmid transformiert ist, das eine DNA-sequenz enthält, die für ein Polypeptid nach Anspruch 1 oder 2 kodiert.

9. Rekombinante Mikrobenzelle nach Anspruch 8, in der die rekombinante Mikrobenzelle Escherichia coli ist.

10. Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids, umfassend das Kultivieren in einem Medium einer rekombinanten Mikrobenzelle, die durch ein rekombinantes Plasmid transformiert ist, das eine DNA-Sequenz enthält, die für das Polypeptid nach Anspruch 1 oder 2 kodiert, um ein Polypeptid zu erzeugen, das eine derartige Aminosäuresequenz aufweist, und anschließendes Abtrennen des gebildeten Polypeptids.

11. Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend als aktiven Bestandteil das Polypeptid nach Anspruch 1 oder 2 und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger oder ein pharmazeutisch annehmbares Verdünnungsmittel.

12. Pharmazeutische zusammensetzung nach Anspruch 11, in der die N-terminale Sequenz wie in der SEQ ID-NR: 2,3,4,5,6,7,8 oder 9 in der sequenzliste gezeigt oder Arg-Gly-Asp ist.

13. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 11, in der die N-terminale Sequenz wie in der SEQ ID-NR: 2,3,5 oder 6 in der Sequenzliste gezeigt oder Arg-Gly-Asp ist.

14. Pharmazeutische zusammensetzung nach Anspruch 11, 12 oder 13, in der die Aminosäuresequenz des Polypeptids, die von der N-terminalen Sequenz verschieden ist, eine Aminosäuresequenz vom 9. Lys bis zum 155. Leu, wie in der SEQ ID-NR: 1 gezeigt, oder die gleiche Aminosäuresequenz als solche aufweist, außer daß das 29. Arg, das 68. Pro oder das 106. Gly deletiert oder durch einen anderen Aminosäurerest ersetzt ist.

15. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 14, in der das 29. Arg deletiert oder durch Gln, Lys, Asp, Val oder Leu ersetzt ist; das 68. Pro deletiert oder durch Asp oder Met ersetzt ist; oder das 106. Gly deletiert oder durch Trp, Pro, Ala, Asp oder Arg ersetzt ist.

16. Polypeptid nach Anspruch 1 oder 2, das am N-Terminus Met aufweist.

17. DNA-Sequenz, die für ein Tumornekrosefaktor-Polypeptid nach Anspruch 1 oder 2 kodiert, wobei die DNA-Sequenz eine Nukleotid-Sequenz aufweist, die dargestellt wird durch die Sequenz vom 1. T bis zum 465. G, wie in der SEQ ID-NR: 10 in der Sequenzuste gezeigt; oder eine Mutanten-DNA derselben, in der die Nukleotidsequenz vom 1. bis 3. TCA (1. Codon) bis zum 22. bis 24. GAC (8. Codon) oder die entsprechende Nukleotidsequenz der Mutanten-DNA durch eine Nukleotidsequenz ersetzt ist, die für eine Aminosäuresequenz kodiert, die mindestens eine Aminosäuresequenz Arg-Gly-Asp und 3 bis 16 Aminosäuren enthält, worin das Polypeptid 135 bis 178 Aminosäurereste lang ist und die Antitumor-Aktivität vom humanen Tumornekrosefaktor aufweist und die Aminosäuresequenz des Polypeptids, außer der Sequenz, welche die dem 1. Ser bis 8. Asp entsprechende Sequenz ersetzt, der Sequenz des 9. Lys bis zum 155. Leu in der SEQ ID-NR: 1 entspricht, in der bis zu 15 Additionen, Deletionen, Substitutionen oder deren Kombinationen von Aminosäureresten vorgenommen worden sind.