FI99015C - Menetelmä biologisesti aktiivisen kasvaimen nekroositekijä-proteiinin muteiinin valmistamiseksi - Google Patents

Description

- 99015

Menetelmä biologisesti aktiivisen kasvaimen nekroositekijä-proteiinin muteiinin valmistamiseksi Tämä keksintö kohdistuu yhdistelmä-DNA-tekniikkaan. Erityisemmin se kohdistuu mutaation seurauksena muuntuneisiin, biologisesti aktiivisiin kasvaimen nekroositekijä-proteiineihin, jotka eroavat luonnollisista analogeistaan kysteiinijäännösten yhdellä tai useammalla korvautumisella tai häviämisellä. Tämä hakemus liittyy julkaisuun EP 109 748, joka on julkaistu toukokuun 30. päivänä 1984.

Ihmisen kasvaimen nekroositekijä (hTNF) on tunnettu jo usean vuoden ajan syöpää vastaan vaikuttavana aineena, joka löydettiin endotoksiinilla käsiteltyjen, basilli Calmette-Guerin (BCG)-preparaatilla infektoitujen hiirten seerumeista. TNF kuvattiin ensimmäisen kerran julkaisussa Carswell, et ai.

Proc. Nat'l. Acad. Sei. (USA) (1975) 72:3666, ja sen on osoitettu olevan sytotoksisesti selektiivistä uudiskasvuisille (neoplastisille) soluille. TNF-proteiinin puhdistaminen soluviljelmistä kuvataan julkaisussa Matthews, et ai., Brit. J. Cancer (1981) 44:418 (BCG-injektoiduista kaniineista peräisin olevista yksitumaisista fagosyyteistä) sekä julkaisussa Man-nel, et ai., Infect. Immun. (1980) 30:523, ibid (1981) 33:156, jossa TNF puhdistetaan BCG-infektoiduista hiiristä saatujen, makrofageilla rikastettujen vatsakalvon tulehdusnestesolujen viljelmistä. Julkaisussa EP 131 789, joka on julkaistu tammikuun 23. päivänä 1985 nimellä Old et ai., esitetään, että hTNF voidaan puhdistaa TNF-herkistä L-M-soluista, jotka on saatu kantakokoelmaan American Type Culture Collection talletusnume-rolla L929 talletetuista, kloonatuista hiirisoluista.

Jokin aika sitten julkaistiin, että hTNF cDNA ja hTNF-geeni on kloonattu ja yhdistelmä-hTNF-proteiinia on tuotettu näitä klooneja käyttäen. Katso julkaisut Pennica, D. et ai. (1984) Nature (Lontoo) 312:724-729; Shirai et ai., (1985) Nature (Lontoo) 313:803-806: Wang, A.M. et ai. (1985) Science 228:149-154: 2 • 99015 sekä Yamada, M.r et ai, (1985) J. Biotechnology, 3^:141-153. Samankaltaisia julkaisuja on ilmaantunut patenttikirjallisuuteen, joista julkaisuista mainittakoon esimerkiksi EP 155 549, julkaistu syyskuun 29. päivänä 1985; EP 158 286, julkaistu lokakuun 16. päivänä 1985; sekä EP 168 214, julkaistu tammikuun 15. päivänä 1986. Näiden julkaisujen perusteella hTNF on proteiini, joka sisältää kaksi kysteiinijäännöstä. Olettaen, että hTNF-proteii-nissa on 157 aminohappoa (katso Pennica, D. et ai, sekä Wang, A.M. et ai., edellä), niin kysteiinijäännökset ovat asemissa 69 ja 101. Shirai et ai., sekä Yamada, M. et ai., edellä, julkaisevat 155 aminohappoa sisältävän hTNF-proteiinin kloonaamisen, josta proteiinista puuttuvat siis ensimmäiset kaksi aminohappoa, Vai ja Arg. Tämän keksinnön tavoitteita ajatellen vertailukohtana pidetään hTNF-proteiinia, jossa on 157 aminohappoa. Ohessa käytetyillä käsitteillä "hTNF", "hTNF-muteiini, joista puuttuu kysteiini" sekä "hTNF-muteiinit" tarkoitetaan proteiinia, jota sellaista proteiinia koodaavalla, ihmisen TNF DNA-ketjulla tai ihmisen TNF DNA-ketjun muunnoksella transformoidut mikro-organismit tuottavat, jonka koodautuvan proteiinin (a) aminohappoketju on vähintään olennaisesti identtinen ihmisen täysin kehittyneen, luonnollisen tuumorin nekroositekijän aminohappoket jun kanssa, ja (b) biologinen aktiivisuus vastaa ihmisen luonnollisen TNF-proteiinin biologista aktiivisuutta. Aminohappoket ju jen olennainen identtisyys tarkoittaa sitä, että ketjut ovat identtiset tai ne eroavat toisistaan yhden tai useamman aminohappomuunnoksen (häviämät, lisäykset tai korvautumiset) suhteen, jotka muunnokset eivät aiheuta huomattavaa toiminnallista erilaisuutta synteettisen proteiinin ja ihmisen luonnollisen TNF-proteiinin välille. Erityisinä esimerkkeinä mainittakoon hTNF-proteiinin N-päätteessä esiintyvät häviämät, jolloin mikä tahansa yksi tai useampi ensimmäisestä yhdestätoista (1-11) aminohaposta on hävinnyt, mieluiten aminohapot -4, -7 ja -8. Mukaan luetaan samoin hTNF-proteiinit, joissa asemissa 35-66, 110-133, 150-157 tai 67-109 sijaitsevat aminohappo-jäännökset ovat korvautuneet muilla aminohapoilla, tai hävinneet (katso EP 168 214).

Monet biologisesti aktiiviset, mikrobiologisesti yhdistelmä-DNA- (rDNA)-tekniikan avulla tuotetut proteiinit, kuten ihmisen • 99015 3 tuumorin nekroositekijä, sisältävät kysteiinijäännöksiä, jotka eivät ole olennaisia proteiinin aktiivisuudelle, mutta jotka voivat muodostaa epätoivottuja, molekyylien välisiä sidoksia. Eräs tällainen proteiini on mikrobiologisesti tuotettu ihmisen tuumorin nekroositekijä. Yhdistelmä-DNA-tekniikan avulla toteutetun hTNF-valmistuksen aikana on havaittu, että mikrobiologisesti tuotetun hTNF-proteiinin dimeerejä ja oligomeerejä muodostuu runsaasti hTNF-proteiinia sisältävissä E. coli-uut-teissa. Tämä multimeerien muodostuminen tekee hTNF-proteiinin puhdistamisen ja erottamisen erittäin työlääksi ja runsaasti aikaa vieväksi, ja sen seurauksena puhdistus- ja eristystoi-menpiteissä tarvitaan useita lisävaiheita, joista mainittakoon proteiinin pelkistäminen puhdistamisen aikana.

Tämä keksintö kohdistuu mutaation seurauksena muuntuneiden, biologisesti aktiivisten tuumorin nekroositekijäproteiinien tuottamiseen ohjatuilla mutageneettisillä tekniikoilla[tällaisia proteiineja kutsutaan "muteiineiksi", Glossary of Genetics and Cytogenetics, 4. painos, s. 381, Springer-Verlag (1976)], joissa proteiineissa säilyy niiden luonnollisten analogien aktiivisuus, mutta jotka eivät kykene muodostamaan molekyylien välisiä sidoksia tai epätoivottavia molekyylin sisäisiä disul-fidisidoksia. Katso myös julkaisu EP 109 748, julkaistu toukokuun 30. päivänä 1984.

Keksinnön oleelliset tunnusmerkit on esitetty oheisissa patenttivaatimuksissa.

Ohjattuun mutageneesiin perustuvat tekniikat ovat hyvin tunnettuja, ja yleiskatsaus niistä on löydettävissä teoksesta Lather, R.F. ja Lecoq, J.P., Genetic Engineering, Academic Press (1983), sivut 31-50. Yleiskatsaus oligonukleotidillä ohjautuvaan mutageneesiin perustuvista tekniikoista on löydettävissä erityisesti teoksesta Smith, M. ja Gillam, S., Genetic Engineering: Principles and Methods, Plenum Press (1981) 3.:1- 32.

Tämän keksinnön eräänä piirteenä on biologisesti aktiivisen hTNF-proteiinin synteettinen muteiini, jossa vähintään toinen sen kahdesta kysteiinijäännöksestä on hävinnyt tai korvautunut toisella aminohapolla.

99015 4 Tämän keksinnön toinen piirre kohdistuu synteettisiin rakenne-geeneihin, joiden DNA-ketjut on suunniteltu ja muodostettu ("suunnitellut geenit") erityisesti siten, että ne koodaavat edellä kuvattuja synteettisiä hTNF-muteiineja. Tämän piirteen alapiirteenä ovat tällaisia suunniteltuja rakennegeenejä sisältävät ilmentämisvektorit, tällaisilla vektoreilla transformoidut isäntäsolut tai -organismit, sekä menetelmät synteettisen muteii-nin valmistamiseksi viljelemällä tällaisia transformantteja tai niiden jälkeläisiä, sekä muteiinin talteenotto tällaisesta viljelmästä. Lääkinnällisesti käyttökelpoisten hTNF-muteiinien tapauksessa muteiinien lääkinnällisesti tehokkaita määriä sisältävät lääkinnälliset valmisteet sekä lääkinnälliset menetelmät ovat keksinnön muita piirteitä.

Keksinnön eräänä muuna piirteenä on edelleen menetelmä edellä kuvatun synteettisen rakennegeenin valmistamiseksi oligonukleo-tidillä ohjautuvaa mutageneesiä käyttäen, joka menetelmä käsittää vaiheet, joissa: (a) yksijuosteinen DNA, joka käsittää juosteen luonnollista proteiinia koodaavasta rakennegeenistä, hybridisoidaan juosteen sitä aluetta täydentävään oligonukleotidiseen mutaatioalukkee-seen, joka alue sisältää hävitettävän tai korvattavan kysteiinin kodonin tai kodonin kanssa pariutuneen vastasuuntaisen triple-tin, mikä on mahdollista, lukuun ottamatta kodonin häviämää tai mainittua muuta aminohappoa koodaavaa triplettiä määrittävää yhteensopimattomuutta mainitun kodonin tai vastasuuntaisen tripletin, joka on mahdollinen, kanssa; (b) aluketta jatketaan DNA-polymeraasilla mutatoituneen hetero-dupleksin muodostamiseksi; ja (c) mutatoitunut heterodupleksi replikoidaan.

Tässä menetelmässä käytettävät oligonukleotidiset mutaatioaluk-keet muodostavat keksinnön erään piirteen.

Kuva 1 esittää kloonin pE4 täydellistä nukleotidiketjua, sekä siitä pääteltyä aminohappojärjestystä; 99015 5 kuva 2 esittää pE4-istutteen restriktiokarttaa; kuvat 3a ja 3b esittävät plasmidissa pAW731 täysin kehittynyttä TNF-proteiinia koodaavan istutteen täydellistä nukleotidi-ketjua, sekä siitä pääteltyä aminohappojärjestystä, vastaavasti; kuva 4 esittää yhden 17 000 daltonin proteiinivyöhykettä, joka vastaa ser 69 TNF-proteiinia, ja joka on saatu kloonien pAW711 ja pAW731 uutteilla.

Tässä keksinnössä saadaan aikaan: biologisesti aktiivisten hTNF-proteiinien muteiinit, joissa biologiselle aktiivisuudelle epäolennaisiksi todetut kysteiinijäännökset on tahallisesti hävitetty tai korvattu muilla aminohapoilla molekyylien välisiä ristisidoksia mahdollistavat kohdat tällä tavalla eliminoiden; näitä muteiineja koodaavat mutanttigeenit; sekä menetelmä näiden muteiinien tuottamiseksi.

Proteiinit, joita voidaan muuntaa mutaation avulla tämän keksinnön mukaisesti, ovat tunnistettavissa saatavilla olevan, biologisesti aktiivisten proteiinien kysteiinipitoisuutta, sekä ksyteiinijäännösten merkitystä aktiivisuudelle sekä tertiääri-selle rakenteelle, käsittelevän tietouden perusteella. Niille proteiineille, joille tällaista tietoutta ei ole saatavana kirjallisuudesta, tämä informaatio on määritettävissä muuntamalla systemaattisesti ohessa kuvattua menetelmää käyttäen proteiinin kukin kysteiinijäännös ja testaamalla sitten tuloksena olevien muteiinien biologinen aktiivisuus sekä niiden taipumus muodostaa epätoivottuja, molekyylien välisiä disulfidisidoksia. Näin ollen, vaikka tätä keksintöä kuvataankin ja havainnoi1istetaankin seuraavassa erityisesti ihmisen tuumorin nekroositekijän muteiinien avulla, niin tulee ymmärtää, että seuraavassa esitetty pätee yhtä hyvin myös muihin biologisesti aktiivisiin hTNF-pro-teiineihin, jotka sisältävät toiminnan suhteen epäolennaisia aminohappojäännöksiä, eli jotka sisältävät muunlaisia proteiiniin tehtyjä muunnoksia.

Kysteiinijäännökset joko hävitetään tai ne korvataan aminohapolla, jotka eivät vaikuta tuloksena olevan hTNF-muteiinin biologiseen aktiivisuuteen. Sopivat aminohappojäännökset valitaan 99015 6 ryhmästä, joka koostuu seriinistä, treoniinistä, glysiinistä, alaniinistä, valiinista, leusiinista, isoleusiinista, histi-diinistä, tyrosiinistä, fenyylialaniinista, tryptofäänistä ja metioniinista. Tästä ryhmästä käytetään mieluiten seriini-, troniini-, alaniini- ja väliinijäännöksiä. Erityisen edullista on korvaaminen seriini- ja alaniinijäännöksellä.

Kuten edellä esitetään, täysin kehittynyt ihmisen TNF on 157 aminohaposta muodostuva proteiini, joka sisältää kaksi kysteiini-jäännöstä, toinen asemassa 69 ja toinen asemassa 101. Ihmisen promyelosyyttisten leukemiasolujen linjan (HL-60, ATCC n:o CCL240) tuottamaa TNF-proteiinia koodaava ketju on kloonattu ja ilmennetty E. coli-bakteerissa, ja sen ketju on osoitettu samaksi kuin kuvassa 1 esitetty ketju. Katso myös julkaisu Wang, M.A. et ai., edellä, joka liitetään oheen tällä viittauksella.

Kuten seuraavassa esitetään, kumpikaan TNF-ketjun käsittävä kysteiinijäännös ei vaikuta osallistuvan disulfidisidosten muodostumiseen, ja kumpikin niistä voidaan korvata tai hävittää tämän keksinnön mukaisella menetelmällä, jolloin saadaan stabiili ja biologisesti aktiivinen muteiini. Tämä on yllättävää, koska hTNF-proteiinissa on vain kaksi kysteiinijäännöstä, jotka tavallisesti oletettaisiin välttämättömiksi biologisen aktiivisuuden säilymiselle.

Suunniteltu geeni, joka johtaa cys 69-jäännöksen korvautumiseen jollakin muulla valitulla aminohapolla, voidaan muodostaa käyttämällä oligonukleotidillä ohjautuvaan mutageneesiin perustuvaa toimenpidettä, jossa käytettävä synteettinen oligonukleotidinen aluke täydentää hTNF-geenin aluetta cys 69-jäännöksen kodonin kohdalta, mutta joka aluke sisältää tässä kodonissa yhden tai useampia emäsmuutoksia. Kun häviämän aikaansaaminen on toivottavaa, niin oligonukleotidisestä alukkeesta puuttuu cys 69-jäännöksen kodoni. Edullisempi muunnos on cys 69-jäännöksen muuntaminen neutraaliksi aminohapoksi, kuten glysiini, väliini, ala-niini, leusiini, isoleusiini, tyrosiini, fenyylialaniini, his-tidiini,tryptofaani, seriini, treoniini ja metioniini. Seriini, . 99015 7 freoniini ja alaniini ovat edullisimmat korvaavat aminohapot, koska ne ovat kysteiinin kemiallisia analogeja. Kun kysteiini hävitetään, niin täysin kehittynyt muteiini on yhtä aminohappoa lyhyempi kuin luonnollista vastaava proteiini tai mikrobiologisesti tuotettu hTNF.

Edellytykset alukkeen stabiilille hybridisoitumiselle geenin siihen alueeseen, johon mutaatio pyritään indusoimaan, sekä oligonukleotidien syntetoimiseksi nykyään käytettävissä olevien menetelmien rajoitukset määräävät käytettävän oligonukleotidisen alukkeen koon. 01igonukleotidin avulla ohjautuvassa mutagenee-sissä käytettävien oligonukleotidien sunnittelussa huomioon otettavia tekijöitä (esimerkiksi yleiskoko, mutaatiokohtaa reunustavien osien koko) esitetään edellä mainitussa julkaisussa Smith, M. ja Gillam, S. Yleisesti, oligonukleotidin kokonaipituus on sellainen, että sillä saadaan optimoiduksi pysyvä, yksiselitteinen hybridisaatio mutaatiokohtaan siten, että mutaatiokohdasta alkavien 5'- ja 3'-jatkeiden pituus riittää estämään mutaation muuttumisen DNA-polymeraasin eksonukleaasiaktiivisuuden seurauksena. Tämän keksinnön mukaisessa mutageneesissä käytettävät oligonukleotidit sisältävät tavallisesti noin 12-24 emästä, mielellään noin 14-20 emästä, ja mieluiten noin 15-18 emästä. Ne sisältävät tavallisesti vähintään noin kolme emästä muunnetun tai puuttuvan kodonin 3'-puolella.

Menetelmä muunnetun hTNF-geenin muodostamiseksi käsittää laajasti ottaen kohtaspesifisen mutageneesin indusoimisen hTNF-geenis-sä kodonin 69 (TGT) kohtaan käyttäen sellaista synteettistä nukleotidialuketta, joka ei huomioi tätä kodonia tai joka muuttaa sitä siten, että se koodaa muuta aminohappoa. On huomattava, että häviämiä muodostettaessa DNA-ketjun asianmukaisen luku-kehyksen on säilyttävä toivotun proteiinin ilmentymistä varten.

Aluke hybridisoidaan yksijuosteiseen faagiin, kuten M13, fd tai 0X174, johon on kloonattu juoste hTNF-geenistä. Huomautettakoon, että faagi voi sisältää joko geenin merkittävän juosteen tai sen vastasuuntaisen juosteen. Kun faagi käsittää geenin vastasuun-taisen juosteen, niin aluke ja merkityksellisessä juosteessa 99015 8 mutatoitavan kodonin sisältämä alue ovat identtiset, lukuun ottamatta alukkeessa kodonin häviämää tai muuta aminohappoa koo-daavaa triplettiä määrittävää yhteensopimattomuutta kodonin kanssa. Kun faagi käsittää geenin merkitysellisen juosteen, niin aluke täydentää merkityksellisen juosteen sitä aluetta, joka sisältää mutatoitavan kodonin, lukuun ottamatta asianmukaista yhteensopimattomuutta hävitettävän kodonin kanssa emäs-pariutuneessa tripletissä. Olosuhteet, joita voidaan käyttää hybridisaatiossa, kuvataan edellä mainitussa julkaisussa Smith, M. ja Gillam, S. Käytettävä lämpötila on tavallisesti suurin piirtein 0-70°C, tavallisimmin noin 10-50°C. Hybridisaation jälkeen aluketta jatketaan faagi-DNA:ssa saattamalla se reagoimaan DNA-polymeraasin I, DNA-polymeraasin, käänteiskopioivan entsyymin tai muun sopivan DNA-polymeraasin kanssa. Tuloksena oleva dsDNA muunnetaan suljetuksi rengasmaiseksi dsDNA:ksi käsittelemällä DNA-ligaasilla, kuten DNA-1igaasilla. Yksijuos-teisia alueita sisältävät DNA-molekyylit voidaan tuhota Sl-endonukleaasilla käsittelemällä.

Oligonukleotidillä ohjautuvaa mutageneesiä käytetään sellaisen TNF-geenin saamiseksi, jonka geenin koodaamalla muteiinilla on TNF-aktiivisuutta, mutta jossa muteiinissa cys^-g on vaihtunut toiseksi aminohapoksi tai hävinnyt ja/tai cys^^^-jäännös on korvautunut tai hävinnyt. Esimerkkinä mainitussa muunnoksessa oysgg-jäännöksestä ser^g-jäännökseksi edullinen oligonukleoti-dinen aluke on 5'-CATGGGTGCTCGGGCTGCCTT-3'. Tämä oligonukleo-tidi käsittää muutoksen T->A siinä tripletissä, joka on emäs-pariutunut TNF-geenin kodonin 69 kanssa. Samoin, cYs^oi vo^~ daan muuttaa ser^^-jäännökseksi alukkeella CAAGAGCCCCTCTCAGAGGAG, joka sisältää vastaavan muutoksen asemassa 101 sijaitsevan kodonin kanssa emäspariutuneessa tripletissä, käyttäen ihmisen TNF cDNA-ketjusta asianmukaisen juosteen sisältävää ssM13-faagin DNA:ta.

Tuloksena oleva mutaation käsittävä heterodupleksi transformoidaan tämän jälkeen kykenevään isäntäorganismiin tai -soluun. Molemmista juosteista saadaan jälkeläisiä, kun heterodupleksi replikoituu isännässä. Replikaation jälkeen mutanttigeeni voi- 99015 9 daan eristää mutanttijuosteesta saaduista jälkeläisistä, istuttaa asianmukaiseen ilmentämis vektoriin, jota voidaan käyttää sopivan isäntäorganismin tai solun transformointiin. Edullisia vektoreita ovat plasmidit pBR322, pCRl, ja niiden muunnokset, synteettiset vektorit ja muut vastaavat. Sopivia isäntäorga-nismeja ovat E. coli, Pseudomonas, Bacillus subtilis, Bacillus thuringiensis, eri hiivakannat, Bacillus thermophilus, eläin-solut, kuten hiiristä ja rotista saadut solut, tai kiinanhamste-rin munasarjasolut (CHO-solut), kasvisolut, eläin- ja kasvi-isännät, ja muut vastaavat. Huomattakoon, että transformoitaessa valittu isäntä vektorilla siihen on myös istutettava asianmukaiset promoottori- ja operaatioketjut, jotta muteiini voisi ilmentyä. Isännät voivat olla prokarioottisia tai eukariootti-sia (menetelmiä DNA:n istuttamiseksi eukarioottisiin soluihin kuvataan PCT-hakemuksissa, numerot US81/00239 ja US81/00240, jotka on julkaistu syyskyyn 3. päivänä 1981). Isäntänä käytetään mieluiten E. coli- ja CHO-soluja. Tämän keksinnön mukaisesti saadut muteiinit voivat olla glykosyloituneita tai glyko-syloitumattomia, riippuen muteiinille toivotusta glykosylaatios-ta. Toivottaessa, E. coli- tai Bacillus-soluja isäntäorganis-mina käyttäen saatu glykosyloitumaton muteiini voidaan valinnaisesti glykosyloida in vitro alalla tunnetuilla kemiallisilla, entsymaattisilla tai muun tyyppisillä muunnostoimenpiteillä.

Seuraavassa esitettyjen esimerkkien tavoitteena on edesauttaa oheisen keksinnön ymmärtämistä sekä pelkästään havainnollistaa sitä. Esimerkit eivät pyri millään tavalla rajoittamaan keksinnön tavoitteita. Esimerkeissä 1-9 kuvataan TNF-muteiinin valmistaminen sekä sen testaaminen.

Ihmisen TNF-proteiinin valmistaminen ja puhdistus - 1. TNF-proteiinin indusoiminen

Stationäärivaiheen HL-60-soluviljelmää, jossa tiheys on suuri 6 (= 2 x 10 solua/ml) sentrifugoiti in, solut pestiin RPMI 1640-alustalla, josta seerumi puuttuu, jonka jälkeen solut suspen-doitiin uudestaan siten, että tiheydeksi saatiin 1 x 10 solua/ml. Soluja käsiteltiin tämän jälkeen suspensioviljelmässä, koko ajan sekoittaen, forbooliesterillä, 12-0-tetradekanoryyliforbooli-13-asetaatti (TPA), pitoisuutena 100 ng/ml 30 minuutin ajan 37°c:n 99015 10 lämpötilassa. Viljelmät sentrifugoitiin, supernatantti dekan-toitiin, solut suspendoitiin uudestaan tiheydeksi 1 x 10^ solua/ml RPMI-alustaan, joka sisälsi lO^ug/ml bakteeriperäistä lipopolysakkaridia (LPS) ja lO^uM Ca-ionoforia (A23817), ja in-kuboitiin 4 tuntia 37°C:n lämpötilassa koko ajan sekoittaen. Soluja lingottiin nopeudella 1200 rpm 10 minuuttia, ja super-natantteja sentrifugoitiin uudestaan nopeudella 8000 rpm 20 minuuttia. Tuloksena olevaa supernatanttia käytettiin alla esitetyssä puhdistustoimenpiteessä luonnollisen TNF-proteiinin saamiseksi .

2. TNF-proteiinin puhdistaminen

Noin 4-8 litraa edellä indusoiduista HL-60-soluista valmistettua supernatanttia väkevöitiin Amicon-merkkisellä onttokuitusuodat-timella ( hylsyn koko 1 neliöjalka/molekyylipainon erotusluku (cutoff) 10 000) suurin piirtein 300 millilitraksi. Tämä väke-vöity viljelyneste sentrifugoitiin solujätteiden poistamiseksi, ja supernatanttiin lisättiin 30 mM ammoniumbikarbonaattipusku-ria (pH 8-12) siten, että konduktanssiksi saatiin 6,2 mS. Liuosta väkevöitiin edelleen ultrasuodattamalla käyttäen PM10-kalvoa (Amicon), ja väkevöity neste kirkastettiin sentrifugoimalla (20 000 x g 10 minuuttia).

Sitten supernatantti siirrettiin DEAE-ioninvaihtokolonniin, jota oli tasapainotettu 30 mM ammoniumbikarbonaattia ja 1 mM NaCl käsittävällä liuoksella, pH 8,2, ja kolonnia pestiin samalla puskurilla. Eluaatista kerättiin fraktioita ja proteiinia seurattiin aaltopituudella 280 nm. Nämä sitoutumattomat fraktiot testattiin käyttäen L-929-sytotoksisuuskoetta, ja ne fraktiot, joissa todettiin TNF-aktiivisuutta, yhdistettiin ja väkevöitiin jälleen ultrasuodattamalla.

Tiiviste laitettiin geelillä Sephadex G75 Superfine (Pharmacia) täytettyyn kolonniin, jota oli tasapainotettu 30 mM ammonium-bikarbonaattipuskurilla (pH 7,4). Samalla puskurilla pesemällä saatuja, sitoutumattomia fraktioita seurattiin aallonpituudella 280 nm ja niistä määritettiin TNF. Ne fraktiot, jotka sisälsivät eniten TNF-bioaktiivisuutta, lyofilisoitiin.

99015 11

Lyofilisoitu proteiini suspendoitiin uudestaan Laemmli'n SDS-näytepuskuriin, ja käsiteltiin elektroforeettisesti SDS-polyakryyliamidigeelillä. Geeli paloiteltiin 2 millimetrin suikaleiksi, ja proteiini eluoitiin kustakin suikaleesta upottamalla geelisuikale 1 millilitraan 30 mM ammoniumbikarbonaat-tipuskuria (pH 7,4), jossa sitä ravisteltiin yön yli huoneen lämpötilassa.

Suikaleista saadut, TNF-bioaktiivisuutta sisältävät liuokset siirrettiin Vydac C-4-käänteisfaasilla täytettyyn HPLC-kolon-niin, jota oli tasapainotettu 0,1% trifluorietikkahapolla (TFA), ja proteiiniaktiivisuus eluoitiin käyttäen asetonitriilin lineaarista gradienttia 0% - 60% 0,1-prosenttisessa TFA-liuoksessa. Proteiinia seurattiin aallonpituuksilla 280 ja 214 nm, ja fraktiot testattiin biologisesti lyofilisoinnin jälkeen, ja ne suspendoitiin 30 mM ammoniumbikarbonaattipuskuriin, pH 7,4. TNF-aktiivisuutta sisältävät fraktiot lyofilisoitiin jälleen.

Tuloksena olevan proteiinin puhtaus oli riittävä järjestyksen selvittävään analyysiin. Järjestys määritettiin käyttäen kaasu-faasiin perustuvaa analysaattoria (Applied Biosystems Inc.). Ensimmäisestä 22 aminohaposta saatu ketju on järjestykseltään seuraava: 123456789 Vai - Arg - Ser - Arg - Thr - Pro - Ser - Asp - Lys - lO 11 12 13 14 15 16 17 18

Pro - Vai - Ala - Vai - Ser - Vai - Ala - Asn - Pro - 19 20 21 22 (Gin) - (Ala) - Glu - Gly.

Tämän lisäksi puhdistettu proteiini (G-75-geeliltä) testettiin käyttäen muunnosta L-929 sytotoksisuuskokeesta sekä substraattina vuorotellen ihmisen tuumorisolujen linjaa ja normaalia solulinjaa. G-75-fraktiot, jotka olivat tässä kokeessa syto- toksisia L-929-soluja vastaan, olivat myös sytotoksisia Hs939T (melanoomalinja), BT-20- (rintasyöpä), A427- (keuhkosyöpä), HT-1080- (paksusuolen syöpä) sekä HT-29-solulinjaa (paksusuolen syöpä) vastaan. Nämä fraktiot eivät olleet sytotoksisia Hs939sk-soluja (ihon fibroblasteja), HeLa-soluja (niskan 12 99015 syöpäsoluja), Hs27F-soluja (esinahan fibroblasteja) tai COS7-soluja (SV40-viruksella transformoituja apinan soluja) vastaan.

Esimerkki 2

Koodaavan ketjun valmistaminen

Ihmisen TNF-proteiinia koodaava, introneja käsittämätön DNA-ketju valmistettiin ohessa kuvattavalla menetelmällä. cDNA-kirjastoa varten mRNA-lähteenä käytettiin ihmisen promyelosyyt-tisten 1eukemiasolujen linjaa, joka tuottaa indusoituna suuria määriä TNF-proteiinia, ja joka on saatavilla kantakokoelmasta ATCC talletusnumerolla CCL 240. Tämä cDNA-kirjasto luodattiin proteiinin koko koodaavan ketjun selvittämiseksi käyttäen oligo-meerisiä koettimia, jotka oli muodostettu näistä soluista puhdistetusta TNF-proteiinistä määritetyn aminohappoketjun perusteella.

1. Rikastetun mRNA:n valmistaminen HL-60-solujen koko lähetti-RNA eristettiin ja puhdistettiin seuraavasti: TNF-tuotanto indusoitiin HL-60-soluissa kohdassa D.l.a esitetysti, ja 4 tunnin solususpensio sentrifugoitiin superna-tantin erottamiseksi. Koko sytoplasminen ribonukleiinihappo (RNA) eristettiin seuraavasti (kaikki vaiheet toteutetaan 4°C:n lämpötilassa): Solut pestään kahdesti PBS-liuoksessa (fosfaa tilla puskuroitu suolaliuos) ja suspendoidaan uudestaan IHB-liuokseen (140 mM NaCl, 10 mM Tris, 1,5 mM MgC^, pH 8), joka sisältää 10 mM vanadyyliadenosiini-kompleksia (Berger, S.L., et ai, Biochem ( 1979) 18:5143) .

Etyleenioksidipolymeerin tyyppistä (NP-40) ei-ionista pinta-aktiivista ainetta lisättiin pitoisuudeksi 0,3 % solukalvojen hajoittamiseksi, mutta tumakalvojen pysyessä ehjinä. Tumat poistettiin sentrifugoimalla seosta nopeudella 1000 x g 10 minuuttia. Tumien hajottamisen jälkeen saatu supernatantti lisättiin yhtä suureen tilavuuteen TE-liuoksella (10 mM Tris, 1 mM etyleenidiamiinitetraetikkahappoa (EDTA), pH 7,5) kyllästettyä fenolin ja kloroformin seosta (1:1), joka sisälsi 0,5 % • 99015 13 natriumdodekyylisulfaattia (SDS) sekä ΙΟ mM EDTA. Supernatantti uutettiin uudestaan neljästi ja faasit erotettiin sentrifugoi-malla seosta nopeudella 2000 x g 10 minuuttia. RNA saostettiin lisäämällä näytteeseen yhdistettä NaCl pitoisuudeksi 0,25 M, lisäämällä 2 tilavuutta 100 % etanolia ja seisottamalla -20°C:n lämpötilassa. RNA kasautettiin sentrifugoimalla nopeudella 5000 x g 30 minuuttia, se pestiin 70 % ja 100 % etanolilla ja kuivattiin. Polyadenyloitua (Poly A+) lähetti-RNA:ta (mRNA) saatiin koko sytoplasmisesta RNArsta kromatografisesti käsittelemällä käyttäen oligo dT-selluloosaa (Aviv, J., et ai. Proc Natl Acad Sei (1972) £9:1408-1412): RNA liuotettiin ETS- liuokseen (10 mM Tris, 1 mM EDTA, 0,5 % SDS, pH 7,5) pitoisuudeksi 2 mg/ml. tätä liuosta lämmitettiin 65°C:n lämpötilassa 5 minuuttia, ja jäähdytettiin sitten nopeasti 4°C:n lämpötilaan.

Sen jälkeen, kun RNA-liuos oli lämmennyt huoneen lämpötilaan, siihen lisättiin yhdistettä NaCl pitoisuudeksi 0,4 M, ja liuoksen annettiin kulkea hitaasti oligo dT-selluloosalla täytetyn kolonnin läpi, jota kolonnia oli tätä ennen tasapainotettu sitomis-puskurilla (500 mM NaCl, 10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7,5). Läpi-virtaama johdettiin kolonnin läpi vielä kahdesti, ja kolonni pestiin 10 tilavuudella sitomispuskuria. Poly A+-mRNA eluoitiin ETS-liuoksella, uutettiin kertaalleen TE-liuoksella kyllästetyllä fenolin ja kloroformin seoksella, ja saostettiin lisäämällä yhdistettä NaCl pitoisuudeksi 0,2 M sekä 2 tilavuutta 10O-prosenttista etanolia. RNA saostettiin uudestaan kahdesti, pestiin kertaalleen 70 % ja sitten 100 % etanolilla ennen kuivaamista .

Poly A+-mRNA jaettiin fraktioihin sakkaroosigradientilla käyttäen liuosta, joka käsittää 10 mM Tris-HCl, pH 7,4, 1 mM EDTA, 10 mM NaCl ja 0,1 % SDS. Sen jälkeen, kun mRNA:ta oli sentrifu-goitu Beckman SW40-roottorissa nopeudella 38 OOO rpm 17 tuntia, mRNA-fraktiot otettiin talteen gradientista etanolilla saos-tamalla. TNF-proteiiniin liittyvää mRNA:ta sisältävät fraktiot tunnistettiin injektoimalla mRNA varhaismunasoluihin (oosyyttei-hin), ja määrittämällä oosyyttiuutteista sytotoksinen aktiivisuus. Eniten aktiivisuutta sisältävät fraktiot yhdistettiin cDNA-kirjaston muodostamista varten.

14 99015 2. cDNA-kirjaston muodostaminen cDNA muodostettiin rikastetusta 16S-mRNA-fraktiosta käyttäen poly A-häntien oligo dT-alukkeita sekä käänteiskopioivaa AMV-entsyymiä (käänteinen transkriptaasi), menetelmällä, joka kuvataan julkaisussa Okayama, H., et ai, Mol Cell Biol (1983) 3^:280, joka liitetään oheen tällä viittauksella. Tätä menetelmää käytettäessä täysipituisten kloonien osuus on suurempi, ja siinä käytetään tehokkaasti isäntävektorina osia julkaisussa kuvatusta kahdesta vektorista, joita on saatavana julkaisun kirjoittajilta, pcDVl ja pLl. Tuloksena olevat vektorit sisältävät istutteen vektorikappaleiden, jotka käsittävät entsyymien BamHI ja Xhol restriktiokohdat istutteen läheisyydessä, välissä; vektori sisältää plasmidista pBR322 replikaation alkupisteen, sekä Amp-vastustuskyvyn geenin.

Alalla tunnetaan luonnollisestikin myös muita menetelmiä cDNA-kirjaston valmistamiseksi. Eräässä, nykyään klassisessa menetelmässä käytetään oligo dT-aluketta, käänteiskopioivaa entsyymiä, kaksijuosteisen cDNA-molekyylin hännittämistä poly-dG-ryhmillä, sekä kiinnittämistä sopivaan vektoriin, kuten pBR322 tai sen johdannaiseen, joka on avattu toivotusta restriktiokoh-dasta ja hännitetty poly dC-ryhmällä. Tämän vaihtoehtoisen menetelmän yksityiskohtainen kuvaus on löydettävissä esimerkiksi US-patenttijulkaisusta 4 578 584 ja se liitetään oheen tällä viittauksella.

Ohessa käytetyssä menetelmässä rikastettu mRNA (5 ^ug) denaturoitiin käsittelemällä sitä 10 mM metyylielohopealla 22°C:n lämpötilassa 5 minuuttia, jonka jälkeen toksisuus poistettiin lisäämällä 100 mM 2-merkaptoetanolia (Payvar, F., et ai. J Biol Chem (1979) 254:7636-7642). Plasmidi pcDVl avattiin entsyymillä Kpnl, hännitettiin dTTP-ryhmällä, ja kiinnitettiin denaturoituun mRNA:han. Tämä oligo dT-alukkeellinen mRNA käsiteltiin käänteiskopioivalla entsyymillä ja täten syntetoitunut DNA-juoste hännitettiin dCTP-ryhmällä. Lopuksi epätoivottu osa pcDVl-vektorista poistettiin entsyymillä Hindlll pilkkomalla. Tästä erillään, pLl avattiin entsyymillä PstI, hännitet- 15 99015 tiin dGTP-ryhmällä, pilkottiin entsyymillä Hindlll, ja sekoitettiin sitten pcDVl-vektorikappaleella jatkettuun,poly T-hänni-tettyyn mRNA/cDNA-kompleksiin, ligatoitiin E. coli-ligaasilla ja seosta käsiteltiin DNA-polymeraasilla I (Klenow), E. coli-ligaasilla ja RNaasilla H. Tuloksena olevat vektorit transformoi-daan ampisillimille vastustuskykyiseen (Amp ) E. coli K12-kantaan MM294.

3. Koettimen valikointi

Ensin valmistettiin oligomeerit, jotka täydentävät puhdistetun TNF-ketjun aminohappoja 8-12 koodaavaa ketjua. Kodonien toistuvuudesta johtuen yhteensä 64 14-meeriä tulee kysymykseen etsittäessä tätä osaa koodaavan lähetin täydentäjää. Kaikki 64 14-meeriä valmistettiin ja jaettiin neljään ryhmään, joista kukin käsitti 16 14-meeriä. Kukin 14 meerien ryhmä sekoitettiin sakkaroosigradientilla eri kokoisiin fraktioihin jaettuun, rikastettuun mRNA-preparaattiin, joka valmistettiin edellä, ja seos injektoitiin varhaismunasolusta muodostuvaan luentajärjestelmään. Rinnakkaisnäytteinä käytettiin käsittelemätöntä mRNA:ta.

Varhaismunasolun muodostamassa järjestelmässä muodostuneet pro- 3 5 teiinit alistettiin L-929 sytotoksisuuskokeeseen ( S:n vapautuminen), ja aktiivisiksi voitiin todeta niissä varhaismunasoluissa muodostuneet proteiinit, joihin varhaismunasoluihin oli injektoitu vertailu-RNA:ta sekä seosta, joka sisälsi mRNA:ta ja kolmea oligomeerien ryhmää. Tässä "hybridit pysäyttävässä" kokeessa vain se varhaismunasolu, johon injektoitu lähetti oli käsitelty ketjun

A T

GC(G)AC(c)GGCTTGTC T A

C G

sisältävien oligomeerien ryhmällä, oli epäaktiivinen. Tämän oligomeeriryhmän spesifisyys määritettiin edelleen käyttäen "piste täplä"-hybridisaatiota edellä esitetystä sekä indusoiduista että indusoimattomista HL-60-soluista preparoituun, rikastettuun mRNA:han, sekä vastaavaan, sellaisista soluista, joiden tiedetään tuottavan lymfotoksiinia, saatuun mRNA-frak-tioon. Tämä oligomeeriryhmä hybridisoitui hyvin indusoituun 16 • 99015 mRNA:han, mutta se ei hybridisoitunut vastaaviin, indusoimat-tomista tai lymfotoksiinia tuottavista soluista saatuihin fraktioihin. Kuitenkin Northern-täplillä, joissa koettimena käytettiin kinasoitua oligomeeriryhmää, voitiin osoittaa, että eräät sen sisältämät ketjut ristihybridisoituivat 18S-(ribosomaalinen) RNA-fraktioon sekä plasmidin pBR322 DNA:han.

Käyttökelpoinen oligomeerien ryhmä jaettiin tästä syystä edelleen pienempiin fraktioihin syntetoimalla sen jäsenet kahdeksaksi 14-meerin pariksi, joista kullakin toteutettiin edellä esite-tysti "hybridit pysäyttävä" koe. Ainoastaan ketjun

GC(£)ACAGGCTTGTC

käsittävän parin onnistui inhiboida TNF-proteiinin synteesi var-haismunasoluissa. Piste-täplä-kokeet, joissa käytettiin fraktioihin jaettua, indusoitua HL-60-mRNA-fraktiota, indusoitua koko HL-60 poly A+-RNA:ta, indusoimatonta HL-60 poly A+ RNAtta sekä pBR322 DNA:ta, varmistivat edellä kuvatun, 14-meeriparin spesifisyyden sekä muiden parien kykenemättömyyden hybridisoitua toivottuun lähettiin.

4. Koodaavan kejun talteenotto cDNA-kirjaston koettimena käytettiin edellä tunnistettua 14-meeriparia, 28 koettimeen hybridisoitunutta pesäkettä otettiin, viljeltiin ja plasmidi-DNA eristettiin. Plasmidit, joiden sisältämien istutteiden pituus riittää koko ketjun koodaamiseen, valikoitiin ja useista määritettiin oikean ketjun läsnäolo käyttäen hybridi luen taa yhdessä sytotoksisuuskokeen 35 ....

S-vapautumiseen perustuvan version kanssa, kuten jäljempänä esitetään. Hybridiluentaan perustuvissa kokeissa koeketjua käytetään oikean mRNA:n löytämiseksi fraktioihin jakamattomista preparaateista, mikä voidaan todentaa testaamalla varhaismuna-soluista muodostuvassa luentajärjestelmässä, johon on injektoitu löydettyä lähettiä, muodostunut proteiini.

Testattava plasmidi-cDNA sidotaan suodattimiin, ja suodattimia käsitellään indusoiduista HL-60-soluista eristetyllä poly A+ 99015 17 RNA:11a. Tämän jälkeen suodattimet eluoidaan, ja eluaatit injektoidaan varhaismunasolujen muodostamaan luentajärjestel-mään. Varhaismunasoluista eristetään proteiini, joka testataan sitten L-929 sytotoksisuuskokeen 35s-versiolla. Useilla hybri-5 disoituvilla klooneilla, joista käytetään nimityksiä E2-E4, E6 ja E8, saadut tulokset esitetään seuraavassa: Näyte 35S-vapautuminen, % 10 El 7 E2 23 E3 32 E4 33 E6 26 15 E8 11 pBR322 9 A+ 34 B+ 24 20 (A+ ja B+ ovat vertailuja, joissa käytetään sakkaroosigradien- tilla saatua rikastettua mRNArta; El ja pBR322 ovat negatiivisia vertailuja.)

Istutteiden restriktioanalyysi ja järjestyksen osittainen sel-25 vittäminen osoittivat, että kaksi kysymykseen tulevaa plasmi-dia, pE4 ja pBll, käsittivät todennäköisesti täydellisen TNF-proteiinia koodaavan ketjun. Tämän analyysin tulokset plasmi-din pE4 tapauksessa esitetään kuvassa 2. pE4 tallennettiin kantakokoelmaan ATCC lokakuun 15. päivänä 1984, ja sen talle-30 tusnumero on 39894.

Järjestys plasmidissa pE4 määritettiin, ja TNF-proteiinin oikea lukukehys tunnistettiin tekemällä kaikkien kolmen mahdollisen lukukehyksen luennasta päätelty aminohappoketju yhteen-35 sopivaksi luonnollisen, täysin kehittyneen TNF-proteiinin tunnetun N-päätteen ketjun kanssa, jonka ketjun järjestys on määritelty analysoimalla järjestys puhdistetun proteiinin N-päät-teestä (katso kuvat 3a ja 3b). Täysin kehittyneen proteiinin sisältämät aminohapot numeroidaan aloittamalla asemassa 1 si- 99015 18 jaitsevasta valiinista. Kuten edellä mainittiin, homologia ei ole täydellistä. Kuitenkin huomattava homologisuus osoittaa, että oikea cDNA on valittu. Kuvassa 2 esitetyt, kokeellisesti määritetyt restriktioentsyymien pilkkomiskohdat on samoin var-5 mistettu. 1,1 kiloemäsparin PstI-kappaleessa ylävirran puolella 3' Pstl-kohdasta sijaitseva Hindlll-kohta on alavirran puolella pysäytyskodonista, mikä mahdollistaa koodaavan ketjun irrottamisen Hindlll-kasettina ylävirran puoleisen alueen muokkaamisen jälkeen, kuten seuraavassa esitetään.

10 5. Ihmisen TNF-proteiinin tunnusomaiset piirteet DNA-ketjusta määritettynä_

Kuvissa 3a ja 3b esitetyn cDNA-ketjun perusteella täysin kehittynyt TNF-proteiini sisältää 157 aminohappojäännöstä, ja 15 sen molekyylipaino glykosyloitumattomana on suurin piirtein 17 354. Johtoketju sisältää ilmeisesti, karkeasti arvioiden, 76 aminohappoa, alkaen ensimmäisestä käytettävissä olevasta Met-käynnistyskodonista. Ketjussa on 2 kysteiinijäännöstä, asemissa 69 ja 101.

20

Esimerkki 3 N-päätteen kodonien muokkaaminen Plasmidissa pE4 Täysin kehittyneen proteiinin ilmentämiseksi oli edullista istuttaa ketjuun ATG-käynnistyskodoni välittömästi ennen täysin 25 kehittyneen proteiinin N-päätteen valiinia (jota merkitään numerolla 1 kuvissa 3a ja 3b) koodaavaa GTC-ketjua sekä muodostaa siihen Hindlll-kohta välittömästi ylävirran puolelle ATG-kodonista sopiviin, isäntinä toimiviin ilmentämisvektoreihin ligatointia varten. Tämä toteutettiin kohtaohjautuvalla muta-30 geneesillä, analogisesti US-patenttijulkaisun 4 578 584, joka liitetään oheen tällä viittauksella, esimerkeissä 1, 2 ja 5 kuvatun menetelmän kanssa.

DNA-kappale, joka sisälsi ylävirran puoleisen osan koodaavasta 35 ketjusta, leikattiin irti plasmidista pE4 entsyymillä PstI

pilkkomalla, eristettiin elektroforeettisesti agaroosigeelil-lä, otettiin talteen sähköisesti eluoimalla ja ligatoitiin bakteriofaagiin Ml3mpl8.

19 99015

Kykeneväksi tehdyn E. coli Kl2-kannan DG98 (ATCC n:o 39768) geno-mi muutettiin ligatoiduilla faageilla (transduktio), ja täten muutettuja soluja viljeltiin maljaamalla alustalle, joka sisälsi 5 x 10~4 M yhtiöstä Sigma Chem. (St. Louis, MO) saatua iso-propyyli-tiogalaktosidia (IPTG), sekä 40 ^ug/ml yhdistettä X-gal. Uudelle alustalle siirrettiin ei-a-täydentävät valkoiset plakit. Miniviljelmistä seulottiin odotetun kokoisia (1,1 kb) istutteita sisältävä yksijuosteinen, yhdistämällä saatu faagi-DNA. Toivotun yhdistelmätaagin, josta käytetään nimitystä klooni 4.1, rakenne varmistettiin restriktioanalyysillä.

Kemiallisesti syntetoitua, puhdistettua 33-meeristä oligodeoksi-ribonukleotidiä, jonka ketju on: 51-GAAGATGATCTGACCATAAGCTTTGCCTGGGCC-3* käytettiin Hindlll-entsyymin restriktiokohdan ja käynnistävän ATG-kodonin liittämiseksi ennen täysin kehittyneen TNF-proteii-nin ensimmäistä aminohappoa (väliini) koodaavaa GTC-kodonia.

Kymmenen pikomoolia oligonukleotidiä hybridisoitiin 2,6 mikrogrammaan ss-kloonin 4.1 DNA:ta 15 mikrolitrassa seosta, joka sisälsi 100 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl, pH 7,9, 20 mM MgCl2 ja 20 mM β-merkaptoetanolia, lämmittämällä 67°C:n lämpötilassa 5 minuuttia ja 42°C:n lämpötilassa 25 minuuttia. Kiinnitysseos jäähdytettiin jäissä, jonka jälkeen sen lopulliseksi tilavuudeksi tehtiin 25 yUl reaktioseoksella, joka sisältää 0,5 mM kutakin dNTP-molekyyliä, 17 mM Tris-HCl, pH 7,9, 17 mM MgCl2, 83 mM NaCl, 17 mM β-merkaptoetanolia, 5 yksikköä DNA-polymeraasin I Klenow-kappaletta, ja inkuboitiin 37°C:n lämpötilassa 1 tunnin ajan. Reaktiot pysäytettiin kuumentamalla 80°C:n lämpötilaan, ja reaktioseoksella transformoitiin kykenevät DG98-solut, jotka maljättiin sitten agarmaljoille, ja inkuboitiin yön yli faagiplakkien saamiseksi .

Mutagenoituja kloonin 4.1 plakkeja sisältävät maljat sekä 2 mutagenoitumattomia kloonin 4.1 faagiplakkeja sisältävää maljaa jäähdytettiin 4°C:n lämpötilaan, ja kunkin maljan faagiplakit siirrettiin 2 pyöreälle nitroselluloosasuodattimelle laittamalla 20 99015 kuiva suodatin agarmaljan päälle 5 minuutiksi ensimmäisen suodattimen tapauksessa ja 15 minuutiksi toisen suodattimen tapauksessa. Tämän jälkeen suodattimet laitettiin paksujen suodatin-papereiden päälle 5 minuutiksi, jotka suodatinpaperit oli tätä ennen kasteltu liuoksella, joka sisältää 0,2 N NaOH, 1,5 M NaCl ja 0,2 % Triton X-100, ja ne neutraloitiin asettamalla ne suodatinpapereiden päälle jälleen 5 minuutiksi, joiden suodatin-papereiden kastelemiseen käytetty liuos sisälsi 0,5 M Tris-HCl, pH 7,5 ja 1,5 M NaCl. Suodattimet pestiin samalla tavalla kahdesti laittamalla suodattimien päälle,jotka suodattimet oli kasteltu 2 x SSC-liuoksella, jonka jälkeen ne kuivattiin ja niitä lämpökäsiteltiin 80°C:n lämpötilassa vakuumiuunissa 2 tuntia. Kahtena kappaleena valmistetut suodattimet esihybridisoitiin 42°C:n lämpötilassa 4 tuntia laittamalla kullekin suodattimelle 10 ml DNA-hybridisaatiopuskuria (5 x SSC, pH 7,0, 4 x Denhardt'in liuos (polyvinyylipyrrolidiini, ficoll ja naudan seerumin albumiini , 1 x = 0,02 % kutakin), 0,1 % SDS, 50 mM natriumfosfaattipus- kuria, pH 7,0 ja 100 ,ug/ml lohen sperman denaturoitua DNA:ta).

3 2 P-merkityt koettimet valmistettiin kinasoimalla aluke merki- 32 tyllä ATP:llä. Sxiodattimet hybridisoitiin P-merkittyyn aluk-keeseen, jota käytettiin 5 x 10 cpm/ml, käyttäen suodatinta kohden 1-5 ml DNA-hybridisaatiopuskuria, 64°C:n lämpötilassa 8 tuntia.

Suodattimia pestiin kerran huoneen lämpötilassa 10 minuuttia liuoksella, joka sisälsi 0,1 % SDS, 20 mM natriumfosfaattia (puskuri) ja 6 x SSC; kertaalleen 37°C:n lämpötilassa 20 minuuttia puskurissa ja 2 x SSC-liuoksessa; kertaalleen 50°C:n lämpötilassa 20 minuuttia puskurissa ja 2 x SSC-liuoksessa; ja lopulta 60°C:n lämpötilassa 20 minuuttia puskurissa ja 1 x SSC-liuoksessa. Suodattimet kuivattiin ilmassa ja niitä autoradiografoi-tiin -70°C:n lämpötilassa 4 tuntia.

Koska oligonukleotidinen aluke oli muodostettu siten, että se muodosti uuden Hindlll-restriktiokohdan mutagenoituneisiin kloo-neihin, niin lukuisista, alukkeen kanssa hybridisoituneista 21 99015 klooneista saatu RF-DNA pilkottiin tällä restriktioentsyymiliä. Yksi mutagenoituneista kloonin 4.1 plakeista, joka sisälsi uuden Hindlll restriktiokohdan (M13-AW701) otettiin ja siirros-tettiin DG98-viljelmään, ssDNA eristettiin viljelmän superna-tantista, ja dsRF-DNA eristettiin sentrifugoimalla erotetuista soluista. Asianmukainen ketju varmistettiin määrittämällä järjestys dideoksi-menetelmällä.

Asianmukaisesti syntetoituneet juosteet eristettiin ja pilkottiin entsyymeillä PstI ja Hindlll (osittain), tai pelkällä Hindlll-entsyymillä, ilmentämisvektoreihin ligatoimista varten.

Esimerkki 4 TNF-proteiinin ilmentäminen

Prokarioottista ilmentämistä varten koodaava ketju (yhdessä muutamien lukematta jäävien 3'-nukleotidien kanssa) leikattiin irti dsM13-AW70l-ketjusta kahdella tavalla:

Ensimmäisessä menetelmässä dsMl3-AW70l pilkottiin entsyymillä PstI, jonka jälkeen se pilkottiin osittain entsyymillä Hindlll HindiII-PstI-rajoitteisen TNF-proteiinia koodaavan ketjun saamiseksi. (Osittainen Hindlll-pilkkominen on välttämätön, koska M13-AW701 sisältää useita Hindlll-kohtia) . DNA-kappaleen osittainen pilkkominen voidaan toteuttaa käyttämällä yhtä kymmenesosaa restriktioentsyymin siitä määrästä, joka tarvitaan DNA:n täydelliseen pilkkomiseen. Seosta inkuboitiin entsyymille sopivassa lämpötilassa, ja pilkottavasta seoksesta poistettiin näytteitä 10 minuutin välein 1 tunnin ajan. Näytteet laitettiin geelille, ja DNA-kappaleet analysoitiin. Sitä ajanhetkeä, jolla tarvittujen DNA-kappaleiden saanto oli suurin, käytettiin DNA:n preparatiiviseen pilkkomiseen restriktioentsyymillä, ja asianmukainen kappale puhdistettiin geeliltä sähköisesti eluoimalla.

Pstl/BamHI-kappale, joka sisältää TNF-geenin koodaamattoman 3'-ketjun (katso kuva 2), puhdistettiin plasmidista pE4 sen jälkeen, kun DNA oli pilkottu entsyymeillä PstI ja BamHI.

99015 22

Hindlll/PstI- ja Pstl/BamHI-kappaleet käsittävät yhdessä koo-daavan ketjun sekä 600 emäsparin pituisen lukematta jäävän DNA-osan. Nämä kaksi kappaletta ligatoitiin entsyymeillä Hindlll ja BamHI pilkottuun isäntävektoriin pTRP3 seuraavasti: pTRP3 (ATCC 39946) sisältää E. coli-bakteerin trp-promoottorin ja ribosomien sitoutumiskohdan. pTRP3 pilkottiin entsyymeillä Hindlll ja BamHI ja vektorikappale puhdistettiin agaroosigee-lillä. Tämän jälkeen eristetty kappale ligatoitiin edellä saatuihin Hindlll/PstI- ja Pstl/BamHI-kappaleisiin kolmisuuntaisella ligaatiolla, ja seosta käytettiin E. coli-kannan MM294, Amp , transformoimiseen, jolloin saatiin pAW70l.

Toisessa menetelmässä dsM13-AW70l pilkottiin entsyymillä Hindlll ja geenin sisältämä kappale eristettiin agaroosigeelillä. Eristetty kappale ligatoitiin entsyymillä Hindlll pilkottuun BAP-käsi-teltyyn pTRP3-plasmidiin, ja transformoitiin E. coli-kantaan MM294, jolloin saatiin pAW702.

Isäntävektoreina voidaan käyttää myös klooneja pFC54.t (ATCC 39789) tai pPLOP (ATCC 39947), jotka sisältävät P -promoottorin ja basillin positiivisen, retrosäännöstelevän ketjun. Nämä vektorit pilkotaan entsyymeillä Hindlll ja BamHI, ja säätelevät ketjut sisältävät suuret plasmidikappaleet puhdistetaan agaroosigeelillä. TNF-geenistä edellä kuvatusti saadut Hindlll/ PstI- ja Pstl/BamHI-osat ligatoidaan kolmisuuntaisella ligaatiolla näiden vektoreiden Hindlll- ja BamHI-kohtiin, jolloin saadaan plasmidit pAW711 ja pAW712, vastaavasti. Vaihtoehtoisesti, puhdistettu Hindlll-kappale mutagenoidusta plasmidista pE4 ligatoidaan entsyymillä Hindlll pilkottuun, BAP-käsiteltyyn klooniin pFC54.t tai pPLOP, jolloin saadaan pAW713 ja pAW714, vastaavasti. Plasmidi pAW711 tallennettiin kantakokoelmaan ATCC marraskuun 8. päivänä 1984, ja sen talletusnumero on 39918.

pAW701 ja pAW702 siirrettiin E. coli-kantaan MM294, ja viljelmiä kasvatettiin olosuhteissa, jotka tukahduttavat trp-promoottorin. TNF-tuotanto käynnistyi tryptofaanin ehtymisen indusoimana. Analogisella tavalla, pAW711 muodostettiin ja 99015 23 siirrettiin E. coli-kantaan MClOOO-39531, ja solut indusoitiin korkeassa lämpötilassa. Sen jälkeen, kun soluja oli viljelty useita tunteja indusoivissa olosuhteissa, ne sonikoitiin ja soni-kaattien todettiin sisältävän TNF-proteiinia L-929-sytotoksisuus-kokeella. Tulokset ovat:

Plasmidi U/ml 701 1,3 x 104 702 1,3 x 104 711 2 x 105 TNF-aktiivisuuden yksiköt määritellään jäljempänä esimerkissä 9.

Edellä cDNA-kirjastosta eristetty vektori pBll sisältää SV40-promoottorin toiminnallisesti liittyneenä TNF-proteiinia koo-daavaan ketjuun. On odotettavaa, että jokainen 28 positiivisesti hybridisoituvasta pesäkkeestä sisältää tämän liitoksen, mukaan lukien erityisesti pE4 ja pBll, joten ne kykenevät ilmentymään sopivissa nisäkäsisännissä. Näin ollen, kloonilla pBll transformoitiin apinan munuaisesta saatuja C0S-7-soluja, ja soluja viljeltiin olosuhteissa, joissa SV40-promoottori indusoituu.

Koska signaaliketju on yhä läsnä plasmidissa pBll ja toimii nisäkkään solujärjestelmissä, niin TNF erittyi alustaan. TNF

määritettiin monokerrostuneiden COS-7-solujen päällä olevasta 35 supernatantista S-vapautumisena L-929-soluista, jolloin tulokset olivat seuraavat: 3 5

Plasmidi S-vapautuminen (cpm)

Bll 22 763 E9 (neg. vertailu) 2 739 -DNA 2 565

Esimerkki 5 TNF-muteiineja koodaavan ketjun sekä ilmentämisvektoreiden muodostaminen_

Kloonissa 4.1, joka valmistettiin esimerkissä 3 kuvatusti käsittelemällä kloonia pE4 entsyymillä PstI, toteutettiin kohta- . 99015 24 spesifinen mutageneesi olennaisesti esimerkissä 23 kuvatulla tavalla, mutta käyttäen primeerinä ketjua 5’-CATGGGTGCTCGGGCTGCCTT-31, joka täydentää asemassa 69 sijaitsevan kysteiinin viereistä ketjua, mutta sen sisältämissä, tätä kodonia täydentävissä nukleotideissä saadaan aikaan muutos tripletistä TGC tripletiksi AGC. Mutagenoidut plakit tunnistettiin ja varmistettiin määrittämällä niiden järjestys edellä esitetysti. Yksi toivotun mutaation sisältävä plakki, MB-AW731, pilkottiin entsyymeillä Aval ja PstI, ja kappale ligatoitiin entsyymeillä PstI ja Aval pilkottuun klooniin pAW711. Ligaa-tioseos siirrettiin E. coli-kantaan MClOOO-39531, Amp , ja transformanteista seulottiin oikea ketju alukkeen muodostamalla koettimella. Yhtä pesäkettä, josta käytetään nimitystä pAW731, käytettiin muunnetun ketjun ilmentämiseen. pAW731 tallennettiin kantakokoelmaan ATCC tammikuun 25. päivänä 1985, ja sen talletus-numero on 53007.

Analogisesti valmistettiin pAW741, joka on ser^Q^-TNF-proteiinin ilmentämisvektori käyttäen primeeriä CAAGAGCCCCTCTCAGAGGGAG.

Esimerkki 6 TNF-muteiineja koodaavan ketjun ilmentäminen ja TNF-muteiinien aktiivisuus_

Vektorin pAW731 käsittävää E. coli-kantaa MClOOO-39531 kasvatettiin ja indusoitiin korkeassa lämpötilassa esimerkissä 24 esitetysti. Indusoiduista soluista saadut sonikaatit analysoitiin, jolloin voitiin todeta, että niiden TNF-aktiivisuus millilitraa kohden on suurin piirtein sama kuin pAW711-transformanttien tapauksessa. Kuitenkin SDS-analyysin perusteella 17 kilodaltonin TNF-proteiinin määrä näissä uutteissa oli noin 5 kertaa alhaisempi, mistä nähdään, että ser^g-TNF-proteiinin ominaisaktiivi-suus on suurempi kuin luonnollisen tai villityyppisen, yhdistel-mä-DNA-teknisen TNF-proteiinin aktiivisuus.

99015

Esimerkki 7

Ihmisen TNF-proteiinin yhdistelmä-DNA-teknistä Ser6gSerl01- muteiinia koodaavan ketjun ilmentäminen_

Plasmidi pAW731 (ser^) pilkotaan entsyymeillä Hindlll ja

Hindi, ja ser^-mutaation sisältävä pieni Hindlll-HincII- kappale puhdistetaan agaroosigeelillä. Samoin, plasmidi pAW732 (ser^0^) pilkotaan entsyymeillä Hindi ja BamHI, ja ser^0l- mutaation sisältävä HincII-BamHI-kappale puhdistetaan. Tämän jälkeen aikaisemmin vektorista pFC54.t puhdistettu Hindlll-BamHI- kappale ligatoidaan Hindlll-HincII-kappaleeseen (ser,n) ja b y

HincII-BamHI-kappaleeseen (ser. ,) ser ser -TNF-kloonin, i u j. 6 y ιοί pAW735, muodostamiseksi. Tämän dimuteiinin, ser^gSer^Q^-TNF, dimeroituminen puhdistamisen aikana on epätodennäköisempää vapaiden kysteiinien puuttumisesta johtuen.

Esimerkki 8

Kysteiinijäännökset ihmisen luonnollisessa tai villityypin TNF-proteiinissa eivät ole välttämättömiä biologiselle aktiivi-suudelle_

Puhdistettu (95 %), muuntumaton proteiini pelkistettiin ja alky-loitiin käsittelemällä DTT:llä ja iodoasetaatilla alla esitettyjä toimenpiteitä käyttäen. Käsittelemättömän proteiinin aktiivisuus yksiköissä U/ml oli 2,6 x 10 , kun taas pelkiste-tyn, tai pelkistetyn ja alkyloidun proteiinin aktiivisuus oli alueella 4,4-4,8 x lO4 U/ml: Käsittely Aktiivisuus DTT puuttuu 2,6 x lO4 0,1 mM DTT 3,3 x 104 1 mM DTT 4,8 x 104 2 mM DTT 3,9 x 104 10 mM DTT 1,2 x 104 20 mM DTT 1,7 x 104 puskuri + 2,4 mM IAA 1,5 x 104 1 mM DTT + 2,4 mM IAA 4,4 x 104

Edellä esitetyt tulokset osoittavat, että kysteiinijäännökset ihmisen yhdistelmä-DNA-teknisessä, villityyppisessä TNF-proteiinis- 99015 26 sa eivät ole välttämättömät biologiselle aktiivisuudelle, ja näin ollen yksi tai molemmat kysteiinit voidaan hävittää tai korvata muulla aminohapolla, joka kuuluu keksinnön puitteisiin .

Esimerkki 9

Koe TNF-proteiinin sytotoksisuuden määrittämiseksi L-929-soluihin perustuva koejärjestelmä on parannettu, vaivaton in vitro koe, jolla TNF-aktiivisuus voidaan määrittää nopeasti. Tällä hetkellä ei tiedetä, missä määrin se korreloi Carswell' in (edellä) esittämän in vivo kasvaimen nekroosikokeen kanssa: tämän korrelaation odotetaan kuitenkin olevan korkea, koska kokeessa käytetään spesifisesti hiiren kasvainsoluja. Lymfo-toksiiniksi kutsuttu proteiini EPO-julkaisusta n:o 0100641 tuottaa samoin aktiivisuutta tässä kokeessa. Koe on periaatteessa samankaltainen kuin US-patenttijulkaisussa 4 457 916 esitetty koe, jossa käytetään hiiren L-M-soluja ja värjäämistä metyleeni-sinisellä. Kuitenkin ohessa osoitetaan, että L-929-koe korreloi (HL-60-soluista saadun TNF-proteiinin tapauksessa) ihmisen kas-vainsolulinjän sytotoksisuuden kanssa.

L-929-koejärjestelmässä L-929-solut kasvatetaan yön aikana monokerroksiksi mikrotiitterilevyille. Koenäytteet laimennetaan 2-kertaisesti levyn poikki, UV-säteilytetään, ja lisätään sitten soluista kasvatettujen monokerrosten päälle. Koloissa oleviin viljelyalustoihin lisätään tämän jälkeen aktinomysiiniä D pitoisuudeksi 1 ^ug/ml. Levyjä inkuboidaan 18 tuntia 37°C:n lämpötilassa, ja tämän jälkeen ne arvostellaan mikroskooppises-ti, näköhavainnon perusteella. Kullekin kololle annetaan arvoksi 25, 50, 75 tai 100 %, mikä osoittaa kuolleiden solujen osuutta kolossa. TNF-aktiivisuuden yksi yksikkö määritellään 50 % soluista tappavan laimennoksen käänteisluvuksi.

Lisäksi tästä kokeesta kehitettiin herkempi versio, jolla 35 . .

voidaan seurata S-merkittyjen peptidien vapautumista etukäteen merkityistä soluista koenäytteella ja aktinomysiinillä D käsiteltäessä. Kokeen tätä versiota voidaan käyttää voimakkuuden 99015 27 kvantitointiin, esimerkiksi varhaismunasoluissa luentajärjestelmän tuottaman materiaalin suhteellisen voimakkuuden arvioimiseen. Lyhyesti, aktiivisesti kasvavia L-929-viljelmiä merkitään 35S-metioniinilla (200 ^uCi/ml) 3 tuntia metioniinia sisältämättömässä alustassa, jota on täydennetty 2 % pitoisuudeksi sikiöasteisen vasikan dialysoidulla seerumilla. Tämän jälkeen solut pestään ja maljataan 96 koloa käsittäville levyille, inkuboidaan yön yli, ja käsitellään seuraavana päivänä koenäytteiden 2-kertaisilla laimennoksilla sekä aktinomysiinillä D pitoisuutena 1 ^,ug/ml. Viljelmiä inkuboidaan sitten 37°C:n lämpötilassa 18 tuntia. 100 ^,ul kunkin kolon supernatanttia siirrettiin toiselle 96-koloiselle levylle, saostettiin hapolla (TCA), ja otettiin talteen lasikuitusuodattimille . Suodattimet pestiin 95-prosenttisella etanolilla, kuivattiin ja laskettiin. Kussakin kokeessa käytetään pinta-aktiiviseen aineeseen ΝΡ^0 perustuvaa vertailua, jolla mitataan soluista vapautuvan radio- 35 aktiivisuuden suurin mahdollinen määrä. Tämän jälkeen S-vapau-tuminen prosentteina lasketaan suhteesta, joka saadaan jakamalla käsitellyistä soluista ja käsittelemättömistä vertailuista laskemalla saatujen tulosten erotus NP^Q-käsitellyistä soluista ja käsittelemättömistä vertailuista saatujen tulosten erotuksella, siis suhteesta: .,. . . näytesolut - vertailusolut „ , prosenttinen vapautuminen = ΜΡ,'-aol'u't' - vertallusSlVt x 100· 40

Voimakkaampi TNF-proteiini johtaa tämän suhteen suurempiin arvoihin.

Tämän keksinnön mukaisista TNF-muteiineista muodostetaan edullisesti sopivia lääkinnällisiä valmisteita, jotka sisältävät tyypillisesti lääkinnällisesti tehokkaan määrän muteiinia sekä sopivaa, fysiologisesti hyväksyttävää kantajaa, joita kuvataan edellä IL-2-muteiinien yhteydessä. Vaihtoehtoisesti muita sytotoksi-sia, viruksia tai syöpäsoluja vastaan vaikuttavia aineita voidaan käyttää yhdessä keksinnön mukaisten TNF-proteiinien kanssa, ja näistä mainittakoon esimerkiksi gamma-interferoni.

99015 28 Tämän hakemuksen laatijat ovat tallettaneet lokakuun 15. päivänä 1984 kantakokoelmaan American Type Culture Collection, Rockville, MD, USA (ATCC) ohessa kuvatun plasmidin pE4, jonka talletusnumero on ATCC 39894. pAW711 talletettiin marraskuun 8. päivänä 1984, ja sen talletusnumero on ATCC 39918. pAW731 talletettiin tammikuun 25. päivänä 1985, ja sen talletusnumero on ATCC 53007. Nämä talletukset tehtiin patenttitoimenpiteitä varten talletettujen mikro-organismien kansainvälistä hyväksymistä käsittelevän Budapestin sopimuksen (Budapest Treaty on the International Recognition of the Deposit of Microorganisms for the Purposes of Patent Procedure) ja siinä esitettyjen määräysten mukaisesti. Tällä varmistetaan elävien viljelmien säilyminen 30 vuoden ajan talletuksen päivämäärästä. Organismia on saatavana kantakokoelmasta ATCC Budapestin sopimuksen perusteella, hakijoiden ja ATCC:n välisen suostumuksen ehdoilla, mikä takaa mikro-organismin rajoittamattoman saatavuuden asiaa käsittelevän US-patentin myöntämisestä lähtien. Talletettujen kantojen saatavuutta ei pidä tulkita mahdollisuudeksi toteuttaa keksintö kyseisen hallituksen alaisuudessa myönnetyt, sen patenttilakien mukaiset oikeudet rikkoen.

Seuraavien patenttivaatimusten on tarkoitus kattaa tämän keksinnön edellä kuvattuihin suoritusmuotoihin tehdyt muunnokset, jotka ovat ilmeisiä yhdistelmä-DNA-tekniikan, proteiinikemian, lääketieteen ja muiden vastaavien alojen asiantuntijoille.

Claims (5)

99015

1. Menetelmä biologisesti aktiivisen kasvaimen nekroosi-tekijä-proteiinin (TNF) muteiinin valmistamiseksi, joka TNF-proteiini käsittää vähintään yhden kysteiinijäännöksen asemassa 69 tai asemassa 101, joka jäännös on vapaa muodostamaan disulfidisidoksen, eikä ole olennainen mainitulle biologiselle aktiivisuudelle, tunnettu siitä, että menetelmä käsittää TNF-proteiinia koodaavan DNA:n mutatoimisen siten, että asemassa 69 sijaitseva kysteiinijäännös tai asemissa 69 ja 101 sijaitsevat kysteiinijäännökset korvautuvat muulla aminohapolla.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kysteiinijäännös korvautuu / kysteiinijäännökset korvautuvat seriinillä tai treoniinilla.

3. Menetelmä TNF-muteiinin, jolla muteiinilla on kysteiini-tähde asemassa 69 ja/tai 101 korvattu seriinillä, valmistamiseksi, tunnettu siitä, että valmistetaan rakennegeeni, joka koodaa biologisesti aktiivisen TNF-proteiinin synteettistä muteiinia, jolla TNF-proteiinilla on ainakin yksi kyste-iinijäännös, joka on vapaa muodostamaan disulfidisidoksen ja joka ei ole oleellinen mainitulle biologiselle aktiivisuudelle; geeni liitetään E. colin isäntäsoluun käyttämällä ilmenty-misvektoria sellaisessa muodossa, joka kykenee replikoituinaan ja ilmentymään; ja geeni ilmennetään.

4. Patenttivaatimuksen 3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että muteiini on glykosyloimaton.

5. Patenttivaatimuksen 3 tai 4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että ilmentymisvektori on vektori ATCC 53007, joka koodaa serggTNF:ää, tai ilmentymisvektori ATCC 39894 tai ATCC 39918, joka koodaa TNF:n muteiinia. 99015